Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клонирование и экспрессия генов, кодирующих белки мембраны включения IncA-IncG Chlamydia trachomatis
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия генов, кодирующих белки мембраны включения IncA-IncG Chlamydia trachomatis"
На правах рукописи
Кострюкова Елена Сергеевна
Клонирование и экспрессия генов, кодирующих белки мембраны включения IncA-IncG Chlamydia trachomatis
03 00 04 - Биохимия 03 00 03 - Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА-200
003066933
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Научно-исследовательском институте физико-химической медицины Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор
Говорун Вадим Маркович кандидат биологических наук, доцент Лазарев Василий Николаевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Соколов Николай Николаевич, ГУ НИИ биомедицинской химии им В Н Ореховича РАМН доктор биологических наук Чернов Владислав Моисеевич, Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН
Ведущая организация: Государственное учреждение Гематологический научный центр Российской Академии Медицинских Наук
Защита диссертации состоится «
// » 2007 года в ^ часов на
заседании Диссертационного Совета Д 001 010 01
при ГУ НИИ биомедицинской химии им В Н Ореховича РАМН по адресу 119121, Москва, ул Погодинская, 10
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ БМХ РАМН Автореферат разослан « » 2007 года
Ученый секретарь Диссертационного Совета
кандидат химических наук Карпова Е А
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Chlamydia trachomatis - облигатный внутриклеточный паразит, вызывающий у человека такие заболевания, как трахома, паховый лимфогранулематоз и урогенитальные хламидиозы, особенно опасные для репродуктивного здоровья женщин Хламидии отлично адаптированы к условиям существования внутри эукариотической клетки благодаря уникальному двухфазному жизненному циклу, который представляет собой последовательную смену метаболических состояний микроорганизма — инфекционного и вегетативного Внутриклеточный этап развития хламидий происходит внутри мембранной вакуоли, называемой включением
Располагаясь внутри обособленного мембранного компартменга, хламидии не только формируют собственное комфортное жизненное пространство, но и сохраняют способность активно влиять на клеточные процессы инфицированной клетки, исключительно искусно подавляя и направляя их вплоть до завершения собственного цикла развития Механизм подобного взаимодействия остается загадкой, поскольку мембрана включения непроницаема для молекул крупнее 520 Да, а в настоящее время известны только три белка хламидийной природы, секретируемые в цитоплазму инфицированной клетки В составе мембраны включения не обнаружено эукариотических белков, характерных для эндосом и лизосом, при этом хламидии активно модифицируют поверхность включения с помощью продуктов собственного белкового синтеза, абсолютно необходимого для успешного развития инфекции Предполагается, что именно белки мембраны включения являются медиаторами, опосредующими взаимодействия хламидий с эукариотической клеткой
В первую очередь внимание исследователей привлекают представители семейства уникальных хламидийных белков, располагающихся в мембране включения, называемых Inc-белками (inclusion proteins). Inc-белки обнаружены у всех видов хламидий, причем их гомологи отсутствуют у каких-либо других известных организмов Данные белки значительно отличаются между собой
аминокислотными последовательностями, однако для всех Inc-белков характерно наличие двудольного гидрофобного домена, состоящего из 50-80 аминокислот, который, возможно, и определяет их локализацию в мембране включения Кроме того, в геномах хламидий обнаружено значительное число открытых рамок считывания, кодирующих белки со сходным гидрофобным профилем, причем подобные гены полностью отсутствуют во всех остальных известных сегодня геномах Гидрофильные домены некоторых Inc-белков располагаются на цитоплазматической поверхности мембраны включения и фосфорилируются киназами клетки-хозяина, а экспрессия большей части генов, кодирующих Inc-белки, начинается в течение первых часов после заражения культуры клеток — все эти факты позволяют предположить, что данные белки могут играть ключевые роли в процессах развития хламидийной инфекции
Цель работы. Цель работы - клонирование и экспрессия генов, кодирующих белки мембраны включения IncA-IncG С trachomatis Задачи исследования.
1 Определение генетического полиморфизма генов, кодирующих белки мембраны включения IncA-IncG С trachomatis
2. Клонирование генов, кодирующих белки мембраны включения IncA-IncG С trachomatis, в плазмидные векторы с репортерными генами для получения составных белков при экспрессии в линиях клеток млекопитающих
3 Определение локализации белков мембраны включения IncA-IncG С trachomatis при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa
4 Выявление ко-локализации белков мембраны включения IncA-IncG С trachomatis с органеллами эукариотической клетки при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa
5 Клонирование генов, кодирующих белки мембраны включения IncB и IncC С trachomatis в плазмидные векторы для последующей экспрессии в клетках Е coli
6. Получение и очистка полноразмерных рекомбинантных белков IncB и IncC С trachomatis и специфических антител к ним.
Научная новизна и практическая значимость работы. Несмотря на то, что первые белки семейства Inc были открыты десять лет назад, функции их остаются загадкой. На сегодняшний день обнаружены некоторые биологические свойства только трех из них Показано, что IncG С trachomatis может взаимодействовать с эукариотическим белком 14-3-3ß, СТ229 взаимодействует с Rab4A GTP-азой, IncA С trachomatis принимает участие в формировании единого включения, ассоциирован со вторичными включениями, и так же, как IncA С psittaci, ингибирует развитие хламидийной инфекции при экспрессии кодирующего его гена в зараженной клетке Кроме того, на основе данных о секреции IncA, IncB, IncC С pneumoniae, а так же IncC С trachomatis в гетерологичных системах принято считать, что Inc-белки являются эффекторами системы секреции III типа у хламидий Функции остальных Inc-белков до сих пор неизвестны. Их уникальность не позволяет делать предположения о возможной биологической роли на основании данных о гомологах, а невозможность применения к хламидиям большинства классических методов молекулярной биологии заставляет исследователей искать обходные пути для выявления функций Inc-белков Одним из таких путей может стать изучение поведения Inc-белков в гетерологичных системах
В настоящей работе реализован один из походов к выявлению функций белка и обнаружению его потенциальных белков-партнеров путем определения его локализации при гетерологичной экспрессии в эукариотической клетке В результате впервые показана локализация шести Inc-белков С trachomatis при экспрессии кодирующих их генов в эукариотической клетке с образованием составных белков с GFP (green fluorescent protein, зеленый флуоресцентный белок) С использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии впервые показана ко-локализация данных белков С trachomatis с известными органеллами эукариотической клетки, относящимися к ее секреторному пути Так же впервые получены рекомбинантные полноразмерные белки мембраны включения С trachomatis IncB и IncC, которые в дальнейшем могут быть использованы для выявления собственных белков-партнеров в реакциях белок-
белкового взаимодействия Кроме того, в результате определения
3
генетического полиморфизма генов, кодирующих Inc-белки С trachomatis, была показана высокая консервативность incB и тсС, относящихся к числу генов ранней фазы, что может служить подтверждением значимости кодируемых ими белков для развития хламидийной инфекции Полученные данные могут в дальнейшем найти применение при разработке альтернативных методов лечения хламидийной инфекции, в том числе с использованием генной терапии
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на расширенном межлабораторном заседании Отдела молекулярной биологии и генетики ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава (Москва, 22 марта 2007 года), а так же в ходе конференций «Genomic Perspectives to Host Pathogen Interactions» (Hinxton, UK, 2006), «Международная школа-конференциия молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, 2005)
Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 4 публикациях (2 - в рецензируемых журналах, 2 - материалы конференций)
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 29 рисунков Состоит из следующих глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который насчитывает 213 источников
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клеточные линии, бактериальные штаммы и плазмидные векторы. В работе были использованы клетки линии HeLa229 (АТСС, США) и бактериальные штаммы Е coli DH5a (Life Technologies, Великобритания), B834 (DE3) и BL21 TrxB (DE3) [pLysS] (Novagen, США) Референс штамм С trachomatis D/UW-3/Cx (АТСС VR-885) был любезно предоставлен доктором Eva Hjelm, Уппсальский университет, Швеция Клинические изоляты С trachomatis были выделены из соскобов слизистой цервикального канала пациенток Института Акушерства и Гинекологии Д О Отга РАМН (Санкт-Пигербург, Россия) в 19981999 гг В процедурах клонирования и экспрессии использовались плазмидные векторы
pGEM-T/easy (Promega, США), pET-15b и рЕГ-32а(+) (Novagen, США), pEGFP-Nl и pEGFP-C1 (Clontech, США)
Антитела и флуоресцентные красители. В работе использовались моноклональные антитела мыши к бычьему а-тубулину, моноклональные антитела мыши к Гольджин-97 человека, Alexa 594-конъюгирсванные антитела козы к иммуноглобулинам мыши, Alexa 594-конъюгиршанный фаллоидин, MitoTracker Red CMXRos, глибенкламид BODIPY TR (dipyrromethene boron difluonde, дипирометен бор дифлуорид) Alexa 594-конъюгированный WGA (wheat gam agglutinin^ пшеничный зародышевый агглютинин) (Molecular Probes Inc, США)
Определение генетического полиморфизма генов incA - incG. Последовательности генов incA - mcG амшшфицировали методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров в программируемом термостате Thermal Cycler Abbott LCX Probe System (Великобритания) с помощью Pfu-полимеразы (MBI Fermentas, Лшва) согласно инструкции производителя Нуклеотидные последователшости генов incA - irtcG определяли с использованием набора дня термоциклического секвенирования Big DyeTM Termmator V 3 1 Cycle Sequencmg (Applied Biosystem, США) Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержавшем 10 нг плазмидной или геномной ДНК, 3,2 пМ специфического праймера и реакционную смесь (Termmator Ready Reaction Mix), предоставленную производителем Продукты реакции анализировали с использованием автоматического секвенагора ABI Pnsm Genetic Analyzer 3100 (Applied Biosystem, США, Hitachi, Япония)
Клонирование полноразмерных генов тсЛ - utcG. Полноразмерные гены incA - incG амшшфицировали с использованием специфических праймеров, в состав которых вводили сайты узнавания эндонукпеаз рестрикции (HindHI, EcoRL, BamHI, Ncol, Ndel либо Xhol (MBI Fermentas, Литва)), как указано выше Продукты амплификации очищали с помощью набора Wizard PCR Pieps DNA Purification System (Promega, США) и клонировали в плазмиду pGEM-T/easy (Promega, США) согласно инструкции производителя Далее гены Inc-белков субклонировали в плазмидные векторы pEGFP-Nl, pEGFP-Cl, pET-15b и рЕТ-32а согласно стандартным протоколам с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции и Т4 ДНК-лигазы (MBI Fermentas, Литва)
Экспрессия генов incB и тсС в клетках E.colt. Культуру клеток Е coli В834 (DE3) либо BL21 (DE3) [pLysS] Тгх В трансформировали плазмидными конструкциями pET-15b/IncB и рЕТ-15ЬЛпсС, либо рЕТ-32а/1псВ и рЕТ-32аЯпсС Несколькими рекомбинантными колониями инокулировали 100 мл среды ТВ (1,2% бактотриптш, 2,4% дрожжевой экстракт, 4% глицерин, 17 мМ КН2Р04, 72 мМ К2НРО4), содержащей ампициллин (50 мкг/мл) либо ампициллин (50 мкг/мл), хлорамфеиикол (34 мкг/мл) и канамицин (15 мкг/мл) для штаммов
В834 [pLysS] и BL21 TrxB (DE3) [pLysS], соответственно, и растили при температуре 37°С и постоянном встряхивании до достижения культурой оптической плотности OD«k>=1,2 Экспрессию гена целевого бежа индуцировали добавлением изопропил-Р-О-тиогалакгозида до конечной концентрации 0,1 мМ. Культуры инкубировали от 2,5 до 17 часов при 30°С и постоянном встряхивании, центрифугировали при 6000g 30 мин, осадки замораживали при -75°С Наличие целевого белка подтверждали с помощью денатурирующего электрофореза в 12-15% полиакриламидном геле согласно стандартной методике
Выделение рекомбинантных белков из клеток Kcoli Осадки культур Ecoh размораживали при 0°С и суспендировали в 10 мл буфера (20мМ Na3P04j 20% глицерина 0,5М NaCl, ЮмМ имидазола) Смесь подвергали ультразвуковой дезинтеграции (22 кГц 15x10 с) до образования гомогенной суспензии Далее добавляли 0,5% Emulgen 913, инкубировали 30 минут во льду при перемешивании и центрифугировали при 45000g 1,5 часа Наличие рекомбинангюго белка в осадке и надосадочной жидкости определяли с помощью денатурирующего электрофореза в 12-15% полиакриламидюм геле Для выделения рекомбинантного белка из растворимой фракции клеточного лизата осадки культур Е coli суспендировали в 10мл буфера (20мМ Na3P04, 20% глицерина, 0,5М NaCl, ЮмМ имидазола), для выделения рекомбинантного белка из нерастворимой фракции клеточного лизата - в 10мл буфера (20мМ Na3PC>4, 20% глицерина, 0,5М NaCl, ЮмМ имидазола, 8М мочевина), суспензии центрифугировали при 45000g 1,5 часа Полученный супернатант фильтровали через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0,45 мкм) и подвергали металло-хелагной аффинной хроматографии на хроматографической системе АКТА FPLC (Amersham Biosciences, США), используя колонку Tncom 10/50 (Amersham Biosciences, США), содержавшую Змл Ni-Sepharose FastFlow (Amersham Biosciences, США) В качестве стартового буфера использовали буферные растворы того же состава, что и для фракционирования, элюцию проводили ступенчатым градиентом концентрации имидазола (20мМ, ЮОмМ, 200мМ, ЗООмМ) в буфере аналогичного состава В ходе хроматографии собирали фракции элюата, имевшие А2го > 0,05 Собранные фракции анализировали с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле Разделение составных белков TrxA-IncB и TrxA-IncC. Гидролиз составных белков проводили при +4°С в течение 22 часов Реакционная смесь содержала 20 мМ натрий-фосфатного буфера 0,5 М NaCl, 20% глицерина, 1мМ CaCfe, 2 мг составного бежа и 2 единицы рекомбинантной легкой цепи энтеропегсщдазы человека (Invitrogen, США) Полученные белки разделяли с использованием набора HisTrap™ Kit (Amersham Biosciences AB, Швеция) согласно инструкции производителя
Иммунизация лабораторных животных Иммунизация кроликов препаратами белков IncB и IncC и отбор крови осуществлялись в лаборатории цитологии опухолевого роста Института
6
цитологии РАН под руководством д б н В А Иванова 30-50 мкг рекомбинятного белка в объеме 100 мкл фосфатного буфера (1,7мМ NaCl, 17мМ NaH2P04, 170мМ Na2HP04) инъецировали кроликам троекратно с интервалом в 3 недели, после чего через 14 дней отбирали 50 ми крови
Выделение н очистка поликлональныхантител к рекомбинантным белкам IncB и IncC.
К S мп сыворотки крови кролика добавляли сухой сульфат аммония до концентрации -40% от насыщения, тщательно перемешивали и выдержали на льду 30 минут Образовавшуюся суспензию центрифугировали при 5000g 20 минут, осадок иммуноглобулинов промывали 40% от насыщения раствором сульфата аммония и повторно центрифугировали при 5000g 20 минут Осадок растворяли в 5 мл 25мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,5) Полученную фракцию иммуноглобулинов хроматографировали на DEAE-Sepharose FF на колонке Tncorn 10/50 на хроматографической системе АКТА FPLC (Amersham Biosciences, США), после чего истощали против лизата клеток Е сок
Трансфекция клеток линии HeLa. Клетки HeLa культивировались в среде ДМЕМ (Sigma, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (HyClone, США), 10 мкг/мл гентамицина при 37°С в атмосфере 5% С02 на стерильных стеклах в течение 24 часов до достижения 50-70% монослоя Трансфекцию клеток линии HeLa плазмидной ДНК проводили с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogea, США) согласно рекомендациям производителя Анализ экспрессии генов осуществляли через 20 часов после трансфекции Преператы промывали фосфатным буфером (1,7 мМ NaCl, 17шМ NaH2P04, 170шМ Na2HP04), фиксировала 2% параформальдегидом 30 минут, затем повторно промывали фосфатным буфером Жизнеспособность клеток линии HeLa, экспрессирующих гены Inc-белков С. irachomatts, оценивали с помощью набора LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (for animal cells) (Molecular Probes Inc, США) согласно инструкции производителя
Конфокальная микроскопия. Конфокальную лазерную сканирующую микроскопию и иммунофлоресцентный анализ осуществляли с использованием конфокального флуоресцентного микроскопа Eclipse Е800 (Nikon, Япония) с VEM Epi-Fluorescence насадкой, укомплектованного аргоновым (используемая длина волны 488 им) и гелий-неоновым (используемая длина волны 594 нм) лазерами (Nicon Corporation, Япония), под объективом бОх, ЧА 1,4 с масляной иммерсией. Конфокальные изображения с шагом по Z -оси получали с интервалом в 0,25 мкм и записывали с помощью программы EZ-C1 2 00 Software (Nikon, Япония) Изображения обрабатывали с помощью программ Image Pro-plus 5 1 (Media Cybernetics, США) и Adobe Photoshop v 6 0 software (Adobe Systems) Флуоресцентное окрашивание органелл эукариотических клеток Окрашивание митохондрий, эндоплазматичесюго ретикулума и плазматической мембраны проводили в препарате живых клеток с использованием проникающих флуоресцентных красителей через
12, 18, 20, 24 и 36 часов после трансфекции Окрашивание митохондрий осуществляли с помощью 500 нМ MitoTracker в D-MEM в течение 15 минут и отмывали препарат перед монтированием Окрашивание эндоплазматического регикулума осуществляли с использованием 2 мкМ ER-Tracker в HBSS течение 15 минут и отмывали препарат перед монтированием Окрашивание плазматической мембраны осуществляли с помощью 5 мкг/мл Alexa Fluor 594 WGA в HBSS в течение 15 минут и отмывали препарат перед монтированием Для окрашивания F-актина, а-тубулина и аппарата Гольджи клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 5 минут при комнатной температуре и пермеабилизировали в 0,5% Tnton-X-100 в течение 10 минут при комнатной температуре Образцы блокировали с использованием 2% козьей сыворотки либо 2% бычьего сывороточного альбумина в TNT-буфере (ОД М Tns-HCl [pH 7,5], 0,15 М NaCl, 0,05% Tween 20) от 30 до 40 минут Затем образцы инкубировались с соответствующими антителами либо с фалловдином в течение ночи при 4°С, отмывались и инкубировались с Alexa 594-конъюгированными антителами в течение ночи при 4°С (за исключением фаллоидина), затем отмывались и просушивались перед монтированием
Для визуализации С trachomatis в клетках линии HeLa использовали набор «ХлаМоноСкрин» («Ниармедик Плюс», Россия) согласно инструкции производителя, а так же поликлональные кроличьи антитела к белкам IncB и IncC С trachomatis, с использованием вторичных флюоресцеинизотиоцианат-меченных антител осла к иммуноглобулинам кролика
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Определение генетического полиморфизма генов, кодирующих Inc-белки С. trachomatis.
С целью определения генетического полиморфизма генов, кодирующих Inc-белки С trachomatis, были определены нуклеотидные последовательности генов incA, incB, incC, incD, incE, incF и incG восьми клинических изолятов С trachomatis Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями генов, кодирующих аналогичные Inc-белки лабораторного штамма С trachomatis D/UW-3/Cx и аннотированными в Gene Bank (АЕ001296) Нами были выявлены ряд нуклеотидных замен, в том числе приводящих к аминокислотным (таб 1), наличие которых не удалось связать ни с сероваром исследуемых клинических изолятов, ни с их устойчивостью к
Таблица 1. Нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные замены, обнаруженные в последовательностях генов, кодирующих Inc-белки, по сравнению с последовательностями штамма С trachomatis D/UW-S/Cx, представленными в Gene Bank Нуклеотидные последовательности mcG изолята 1309 и incD изолятов 1553 и 4873 не определялись
Ген Нукпеотидная замена Клинический изолят
тс А 665G—»A (Ser—»Lys), 231A—G 190,5736
тсС 366A—»G, 390C—>T, 477T—»C 553
tncD 78T—>C, 80Г—»C (Leu—»Pro 26), 113C->T (Ala—>Val 37), 142A—»G (üe-»Val 47), 205G—>T (Val—>Leu68), 406 вставка А (ТЬт—>Пе) 190,309,378,2103,2293, 5736
303G—>А 2103,2293
incE 37С—>Т (Arg—»Cysl2), 47 A—G (Asn—Serl5), 337G—»A (Ala—»Thrl 12) 190,378,1309,2103,2293,4873, 5736
56A—»G (Asp-»Gly 18), 79 А—С (Lys-431n 26), 110,111CA—»TG (Ala—»Val 36), 113C—»T (Ala^Val 37), 116G-»C (Cys—Ser 38), 190G-^A (Gly—»Ser 63), 202C—>A (Leu-»He 67), 214A-»G (lie—> Val 71), 251C—>T (Thr—Ile 83), 274А-Ю (Asn—>Asp 91) 190,378,1309,1553,2103,2293, 4873,5736
376 делеция С 378,1309,4873
44A—»C (Asn—»Ala 14), 243G->A, 278A—G (His—»Arg 92) 1553
incF 59A—»G 190,378,1309,2103,2293,4873, 5736
65G—>T (Lys—»Asn 21) 190,378,1553,2103,2293,4873, 5736
51T—»C (Trp—»Glyl7), 82T—>C (Nfet-»Thr 27), 251T—»C, 257A—»G 190,378,1309,1553,2293,2103, 4873,5736
61G—»A, 90G—A (Arg—»His 30) 1553
incG 9T—»C, 230G—»T (Cys—»Phe76), 236A-»G (Tyr—>Cys78), 260G—»A (Ser-»Asn 86), 405G-»T (Leu—*Phel35), 406C-»G (Arg->Glyl35), 423T—»G (Phe—»Vall41) 190,378,1553,2103,2293,4873, 5736
98T—»C (Val—»Ala 32), 406C-»G (Aig-»Glyl35) 190,378,1553,2103,2293,4873
антибиотикам Согласно полученным нами данным, наиболее вариабельными являются гены, принадлежащие DEFG-оперону С trachomatis - для них было обнаружено наибольшее число нуклеотидных замен, в том числе приводящих к аминокислотным Для тсА были обнаружены две нуклеотидные замены, ранее описанные в литературе Наиболее консервативными оказались тсВ и incC -для incB не было показано ни одной нуклеотидной замены среди восьми клинических изолятов, для тсС только у одного из них были обнаружены три
незначащие нуклеотидные замены Проведенное нами сравнение последовательностей IncB и IncC штаммов AR39, CWL029, J138 и TW-183 С pneumoniae, опубликованных в GeneBank (AAF38304, AAD18440, ВАА9850, ААР98233, NP 876577, ВАА502, Н7 2095), также показало консервативность этих белков внутри данного вида Полученные результаты могут свидетельствовать о высокой значимости IncB и IncC для физиологии хламидий, поскольку консервативность характерна прежде всего для белков, принимающих участие в реализации ключевых клеточных процессов
Клонирование полноразмерных генов, кодирующих Inc-белки С. trachomatis, в экспрессирующие плазмидные векторы.
Полноразмерные нуклеотидные последовательности генов, кодирующих белки IncA, IncB, IncC, IncD, IncE, IncF и IncG С trachomatis, амплифицировали с использованием специфических праймеров, в последовательности которых были введены сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции Продукты амплификации клонировали в плазмиду pGEM-T/easy, отбор рекомбинантных клонов осуществляли методом бело-голубой селекции Соответствие клонированных последовательностей целевым подтверждали с помощью определения их нуклеотидной последовательности Далее гены Inc-белков субклонировали в плазмидные векторы pEGFP-Nl, pEGFP-Cl, pET-15b и рЕТ-32а согласно стандартным протоколам с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции Рекомбинантные клоны отбирали в результате контрселекции на твердом LB-arape с соответствующими антибиотиками (30 мкг/мл канамицина для pEGFP-Ши pEGFP-Cl либо 50 мкг/мл ампициллина для рЕТ-15Ь и рЕТ-32а), сохранность рамки считывания так же подтверждали путем определения нуклеотидной последовательности
Определение локализации Inc-белков С. trachomatis при экспрессии их генов в клетках линии HeLa.
Для определения локализации Inc-белков при экспрессии кодирующих их генов в эукариотических клетках мы воспользовались репортерной системой на
основе GFP - белка, способного к видимой флуоресценции (Х„сп 508 нм) в ультрафиолетовых лучах (^погл 395-498 нм) GFP широко используется в молекулярной биологии для получения составных белков, поскольку в большинстве случаев не оказывает существенного влияния на конформацию исследуемого белка и его функцию. Обычно при выборе расположения GFP учитывают возможное влияние репортера на сигнальные последовательности и активные центры изучаемого белка Поскольку у Inc-белков отсутствуют явные сигнальные последовательности, мы определяли локализацию обоих возможных составных белков для каждого из исследуемых Inc-белков
Полноразмерные гены тс А, тсВ, incC, incD, incE, incF и incG С trachomatis клонировали в плазмидные векторы pEGFP-Nl и pEGFP-Cl, полученные конструкции были названы pNl-IncX и рС1-1псХ (рис 1 а, б), а образующиеся составные белки - IncX-GFP и GFP-IncX, соответственно Данными конструкциями трансфицировали эукариотические клетки линии HeLa путем липофекции, локализацию образующихся составных белков определяли с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. В качестве контроля использовали исходные векторы pEGFP-Nl и pEGFP-Cl.
а-ДЯ8В»-» ine У—» feto» >-^~ШГ>—-
б-«МЯМЙ»^ юя. »-У—В5--
»-mc i >-
г-М—D«» ' "V»HU.ian>r? Sc >-
| «ацммннщящНу» 1
Рисунок 1. Схема рекомбинантных конструкций для экспрессии генов, кодирующих Inc-белки С. trachomatis, на основе плазмидных векторов PEGFP-Nl (а), pEGFP-Cl (б), рЕТ-15Ь (в) и рЕТ-32а(+) (г) Стрелкой указан сайт гидролиза энтерокиназой человека.
По результатам конфокальной микроскопии нами было показано, что для трех из семи выбранных нами белков - IncA, IncB и IncF - локализация
составных белков практически совпадала для парных конструкций, то есть не зависела от расположения молекулы GFP При этом составные белки формировали густую сеть, заполняющую внутреннее пространство клетки за исключением ядра и плазматической мембраны (рис 2, а, б, е) Помимо этого, рекомбинантные белки IncA-GFP и GFP-IncA формировали гранулы, которые с течением времени увеличивались в размерах (рис 2, а)
Для IncC, IncD, IncE и IncG была показана различная локализация составных белков, в зависимости от расположения молекулы GFP Составные белки IncC-GFP, IncD-GFP, IncE-GFP и IncG-GFP гомогенно распределялись по
Рисунок 2 Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия клеток НеЬа, трансфицированных экспрессирующими векторами, через 20 часов после трансфекции Показана локализация белков а - СРРЛпсА, б - ОРР-1псВ, в - ОРР-1псС, г - СРР-1псО, д -ОБР-ЬюЕ, е - СБР-ГисР, ж - ОРР-1псС, з - ТпсС-СРР, и - вБР (вектор рЕСРР-С1)
всей клетке, включая ядро (рис 2, з), подобно свободному GFP (рис 2, и), что может быть вызвано экранированием молекулой GFP гидрофобных доменов и/или сигнальных последовательностей, определяющих специфическую локализацию этих белков Однако в отличие от свободного GFP, данные составные белки так же демонстрировали связь с мембранными органеллами клетки, которая может объясняться выраженной гидрофобностью Inc-белков и являться неспецифичной
Парные им составные белки демонстрировали иную локализацию Распределение в клетке составного белка GFP-IncD (рис 2, г) было очень похоже на морфологические картины, наблюдаемые для IncA-GFP и GFP-IncA Составные белки GFP-IncE и GFP-IncG формировали крупные скопления в полярной околоядерной области клетки, что может свидетельствовать о их взаимодействиях с аппаратом Гольджи (рис 2, д, ж) Составной белок GFP-IncC практически полностью локализовался в области плазматической мембраны клетки, четко очерчивая ее поверхностные образования (рис 2, в)
Таким образом, полученные нами данные о локализации составных белков показали их предположительную взаимосвязь с мембранными органеллами клетки, входящими в состав секреторного пути, через который проходит адресная доставка белков в эукариотической клетке
Выявление ко-локализации Inc-белков С. trachomatis с эукариотическими органеллами при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa.
Согласно полученным нами данным специфическую локализацию в клетке прежде всего демонстрировали белки, полученные на основе вектора pEGFP-Cl, поэтому для уточнения локализации составных Inc-белков и наблюдения за динамикой их накопления в эукариотической клетке мы использовали экспрессирующие конструкции на основе данного вектора Клетки линии HeLa трансфицировали экспрессирующими конструкциями рС1-IncX, полученные препараты окрашивали с использованием флуоресцентных красителей и антител, специфически связывающихся с белками цитоскелета, митохондриями, аппаратом Гольджи, ЭПР и плазматической мембраной
эукариотической клетки Ко-локализацию составных белков и флуоресцентно окрашенных клеточных структур осуществляли с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии Ни для одного из семи 1пс-белков, исследуемых в данной работе, не удалось выявить ко-локализацию с митохондриями, актиновым цитоскелетом и тубулиновыми микрофиламентами, что служит подтверждением специфичности полученных нами результатов.
Поскольку у эукариот синтез белка связан с шероховатым ЭПР, мы прежде всего проверили возможность ко-локализации изучаемых составных белков с данной органеллой. И, действительно, все семь составных 1пс-белков ко-локализовались с ЭПР через 12 часов после трансфекции, хотя дальнейшая судьба этих белков различалась
Составные белки ОРР-1псВ и ОРР-1псР на протяжении всего цикла наблюдения выявлялись только в составе ЭПР (рис 3 - а, б, в) Подобная локализация может быть объяснена либо нарушением свертывания данных белков при их синтезе в эукариотической клетке, либо, наоборот, их специфической тропностью к эндоплазматическому ретикулуму.
Составной белок ОБР-ЬюА с течением времени так же накапливался в четко очерченной сети ЭПР Остальная масса белка располагалась в гранулах, которые ориентированы вдоль тубулиновых микротрубочек и равномерно распределялась по всей клетке между актиновым цитоскелетом (рис 3 - г, д, е) Отсутствие ко-локализации гранул, формируемых СРР-1псА, с ЭПР может служить подтверждением гипотезы о их формировании в условиях избыточной продукции данного составного белка за счет склонности 1псА к димеризации и олигомеризации
Составной белок ОРР-ЬгсЭ, подобно ОЕР-1псА, начиная с 12 часов и до поздних сроков трансфекции оставался связан с ЭПР. Вероятно, синтез ОРР-1псБ сопровождался его транспортом до зон выхода из ЭПР, и заканчивался в ЭПР-Гольджи промежуточном компартменте Формируемые данным белком крупные гранулы неравномерно распределялись в клетке и ко-локализовались с ЭПР, что отличает их от аналогичных гранул ОРР-1псА (рис 3 - ж, з, и)
14
Рисунок 3. Локализация составных белков ОРР-1псА (а, б. в), СРР-1псВ (г, д, е), ОРР-1псО (ж, з, и), ОРР-1псО (к, л, м) и вРР-1псС (н, о, п). Клетки окрашены на ЭПР (а, б, в, г, д, с. ж, з, и), аппарат Гольджи (к, л, м) и плазматическую мембрану (н, о, п); а, г, ж. к, н - наложение каналов; б, д, з, л, о - зеленый канал; в, е, и, м, п - красный канал.
Составные белки GFP-IncE и GFP-IncG через 12 часов после трансфекции ко-локализовались с маркером ЭПР, но к 16 часам наблюдалось перераспределение белков в результате компактного скопления в области аппарата Гольджи, что было подтверждено окраской соответствующими антителами (рис. 3 - к, л, м). На поздних стадиях трансфекции составные белки GFP-IncE и GFP-IncG практически не обнаруживались в ЭПР, ко-локализуясь с цистернами аппарата Гольджи и отходящими от них пузырьками, что было показано с помощью красителя WGA-Alexa 594
Составной белок GFP-IncC к 12 часам от начала трансфекции ко-локализовался с ЭПР, но к этому времени так же выявлялся в везикулах, аппарате Гольджи и тубуло-везикулярных образованиях, направленных к периферии клетки К 15 часам от начала трансфекции флюоресценция GFP-IncC регистрировалась большей частью на периферии клетки, ко-локализуясь с WGA, связанным с Alexa Fluor 594 - маркером пост-Гольджи сети. К 19 часам практически весь белок GFP-bicC распределялся в области плазматической мембраны клетки (рис 3 - н, о, п) Возможно, подобное распределение в клетке определяется вторичной структурой IncC - в отличие от остальных белков, изучаемых в нашей работе, его гидрофобный домен располагается в карбоксигерминальной части молекулы, остающейся свободной именно в составном белке GFP-IncC Не исключено так же, что в области этого домена располагается специфическая сигнальная последовательность, обеспечивающая тропность IncC к плазматической мембране, а возможно и встраивание данного белка в ее состав; однако эта гипотеза требует дополнительного подтверждения
С целью уточнения механизма доставки составного белка GFP-IncC в область плазматической мембраны клетки линии HeLa трансфицировали рекомбинантным плазмидным вектором рС1-1псС, инкубировали 4 часа, после чего добавляли таксол - препарат, блокирующий деполимеризацию микротрубочек. Локализацию составного белка GFP-IncC определяли с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии через 15, 16, 17, 18,19 и 22 часа после трансфекции, клетки окрашивали на наружную мембрану
16
и пост-Гольджи. По результатам конфокальной микроскопии, начиная с 15 часов после трансфекции в культуре клеток, обработанных таксолом, составной белок GFP-IncC обнаруживался в области эндоплазматического ретикулума, а так же формировал нерегулярные полиморфные структуры, напоминающие ЭПР - Гольджи промежуточный компартмент (ERGIC) (рис. 4, а). Данная морфологическая картина наблюдалась на протяжении нескольких часов, и только к 19 часам после трансфекции данный белок обнаруживался в области плазматической мембраны клетки, причем большая его часть оставалась связана с ЭПР и ERGIC-подобными структурами. Полученный результат существенно отличался от морфологической картины, наблюдаемой в те же сроки в культуре трансфицированных клеток, не обработанных таксолом, когда к 15 часам после трансфекции основная масса белка обнаруживается на периферии клетки (рис. 4, б). Таким образом, присутствие таксола в ростовой среде приводит к нарушению распределения составного белка GFP-IncC в клетке, что свидетельствует о необходимости нормального процесса динамической реорганизации сети микротрубочек для обеспечения доставки данного белка к плазматической мембране эукариотической клетки.
Таким образом, обнаруженная в результате нашего исследования взаимосвязь lnc-белков С. trachomatis с ЭПР, аппаратом Гольджи и плазматической мембраной позволяет предположить, что по крайней мере
Рисунок 4. Влияние таксола на локализацию составного белка GFP-IncC. Клетки линии Hela, трансфицированные вектором pCl-IncC и окрашеные на наружную мембрану и пост-Гольджи через 15 часов после трансфекции; а - с добавлением таксола через 4 часа после трансфекции, б - без добавления таксола.
некоторые из них могут включаться в секреторный путь эукариотической клетки. Одним из аргументов в пользу данной гипотезы может служить изменение распределения составного белка GFP-IncC в клетках, обработанных таксолом, поскольку транспорт белков из ЭПР к аппарату Гольджи и затем через транс-Гольджи сеть в составе секреторного пути происходит с участием микротрубочек Данное наблюдение особенно интересно, поскольку секреторный путь часто вовлекается в реализацию воздействия патогенных микроорганизмов на эукариотическую клетку - с его помощью бактерии осуществляют доставку собственных секретируемых токсинов к их клеточным мишеням, а Inc-белки относят к числу возможных эффекторов системы секреции Ш типа у хламидий Кроме того, обнаружение GFP-bicC в составе везикул, циркулирующих от аппарата Гольджи до наружной мембраны, а IncG и IncE в составе везикул транс-Гольджи сети позволяет предположить участие этих белков в распознавании и перехвате экзоцитарных пузырьков, которые транспортируются из аппарата Гольджи к наружной мембране, в результате чего хламидии получают различные липиды, необходимые им для построения мембраны включения и обеспечения собственного размножения
В нашей работе мы не только достигли эффективной экспрессии генов, кодирующих семь Inc-белков С trachomatis, в эукариотической клетке, но и показали их ко-локализацию с известными клеточными структурами Чтобы подтвердить достоверность полученных нами результатов, мы решили определить локализацию полноразмерных Inc-белков при экспрессии их генов в эукариотической клетке без введения в состав белка дополнительных репортерных последовательностей, но с использованием классических методов иммуногистохимии Поскольку в нашей работе по изучению составных белков с GFP для четырех из них локализация в клетке зависела от расположения молекулы репортера, а для трех - нет, мы решили включить в дальнейшее исследование по одному из белков из каждой группы Нами были выбраны IncB и IncC, как наиболее консервативные не только у С trachomatis, но и у Chlamydiaceae Гены, кодирующие данные белки, относятся к числу экспрессируемых хламидиями на самых ранних этапах внутриклеточного
18
развития, что может свидетельствовать о значимости роли этих белков в процессе развития хламидийной инфекции.
Получение и очистка полноразмерных рекомбинантных белков IncB и IncC С. trachomatis и специфических антител к ним.
Первоначально дня получения конструкций, экспрессирующих гены белков мембраны включения IncB и IncC С trachomatis в Е colt, мы клонировали полноразмерные гены тсВ и тсС в плазмидный вектор рЕТ-15Ь для получения составных белков с последовательностью из шести остатков гистидинов, позволяющей осуществлять быструю и эффективную очистку рекомбинантного белка металлохелатной аффинной хроматографией Полученные конструкции, названные pET-15b/IncB и рЕТ-15МпсС (рис 1, в), и исходный вектор были использованы для трансформации Е coli штамма В834 (DE3) Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле показал в лизатах клеток, несущих рекомбинантную плазмиду, наличие белковых фракций с молекулярными массами, соответствующими предсказанным для рекомбинантных His-IncB и His-IncC (15,1 и 22,1 кДа соответственно). В лизатах клеток, трансформированных конструкцией рЕТ-15ЪЯпсС, они появлялись после добавления изопропил-Р-О-тиогалактозида, достигали наибольшей концентрации ко второму часу после индукции экспрессии и практически полностью исчезали через 18 часов, что соответствовало литературным данным о нерастворимости Inc-белков и токсичности дня клеток при экспрессии их полноразмерных генов в гетерологичных системах. В лизатах клеток, трансформированных конструкцией рЕТ-15ЬДпсВ, содержание His-IncB достигало максимума через 18 часов после индукции Выделение и очистку рекомбинантных белков His-IncB и His-IncC из клеток Е coli осуществляли методом металлохелатной аффинной хроматографии, предварительно определив растворимость рекомбинантных белков в буфере для нанесения образца, рекомендованном производителем По результатам фракционирования рекомбинантные белки выделяли из 2,5-часовой культуры Е coli, содержавшей His-bicC, и 18-часовой культуры Е coli, содержавшей His-
IncB, в буфере с 8М мочевиной. Однако нам не удалось добиться чистоты образцов, необходимой для дальнейшего использования Наличие в элюате значительного количества белковых примесей не менялось при ужесточении условий очистки, что может объясняться высокой способностью белков IncB и ЬпсС к образованию надмолекулярных белковых комплексов
Поскольку попытки оптимизировать условия выделения His-IncB и His-IncC не привели к повышению чистоты получаемого образца, нами были получены аналогичные рекомбинантные конструкции на основе плазмиды рЕТ-32а, позволяющие получить составные белки с тиоредоксином А (ТгхА). Наличие ТгхА в составе химерного белка значительно увеличивает его растворимость в цитоплазме Е coli, особенно при использовании штаммов, дефектных по ТгхВ (тиоредоксин редуктаза В) Данные плазмидные векторы, получившие названия рЕТ-32а/1псВ и рЕТ-32а/1псС (рис 1, г), и исходный вектор были использованы для трансформации Е coli штамма BL21 ТгхВ (DE3) [pLysS] Максимальное содержание рекомбинантных Inc-белков наблюдалось в лизатах 18-часовой культуры клеток Е coli Соответствие данных фракций на полиакриламидном геле целевым составным белкам было подтверждено с помощью масс-спектрометрического анализа
Выделение и очистку рекомбинантных белков TrxA-IncB и TrxA-IncC из клеток Е coli осуществляли аналогичным методом из 2,5-часовых культур Е coli в буфере без 8М мочевины В результате очистки нами были получены электрофоретически чистые составные белки TrxA-IncB и TrxA-IncC При этом выход рекомбинантных белков из 2,5-часовых культур клеток Е coli составил 6 мг/л для TrxA-IncB и 3 мг/л для TrxA-IncC Очищенные составные белки ТгхА-IncB и TrxA-IncC были подвергнуты гидролизу рекомбинантной легкой цепью энтерокиназы человека (рис 1, г), в результате чего были получены смеси Inc-белка (IncB - 12,88 кДа, IncC - 19,87 кДа) и тиоредоксина А (17,43 кДа), связанного с последовательностью из шести гистидинов (рис 5) Окончательную очистку рекомбинантных Inc-белков осуществляли методом металлохелатной аффинной хроматографии
Рисунок 5. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза составных белков TrxA-lncB (а) и TrxA-lncC (б) рекомбинантной легкой цепью энтерокиназы человека. 1 - составной белок, 2 - продукты гидролиза, 3 - маркер молекулярной массы, кДа.
С целью получения поликлональных антител к рекомбинантным белкам IncB и IncC С. trachomatis мы иммунизировали кроликов препаратами данных рекомбинантных белков троекратно с интервалом в 3 недели. После чего из сыворотки крови кроликов была выделена общая фракция иммуноглобулинов, которая в дальнейшем истощалась против лизата клеток Е. coli штамма BL21 TrxB (DE3) [pLysS], который использовался для получения исходных составных белков TrxA-lncB и TrxA-lncC. Полученные поликлонапьные антитела тестировали иммуноблоттингом против исходных антигенов и в 24 часовой культуре клеток HeLa, зараженных С. trachomatis (рис. 6).
Рисунок 6. Окрашивание включений С. trachomatis специфическими антителами. Препараты 24 часовой культуры клеток HeLa, зараженных С. trachomatis; а - окраска WGA (красный) и поликлональными антителами кролика к IncC С. trachomatis (зеленый), б - окраска Эванс Блю (красный) и моноклональными антителами к липополисахариду хламидий (зеленый), набор «ХлаМоноСкрин» («Ниармедик Плюс», Россия).
Таким образом, нами впервые получены полноразмерные белки мембраны включения С. trachomatis IncB и IncC, которые будут использованы
для выявления белков-партнеров в реакциях белок-белкового взаимодействия, а так же антитела к ним, что предоставляет в наше распоряжение дополнительный эффективный инструмент для дальнейших исследований Мы предполагаем, что обнаружение белков-партнеров может внести существенные изменения в понимание ранних процессов развития хламидийной инфекции, которые сегодня остаются одной из интереснейших загадок современной внутриклеточной паразитологии
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
С trachomatis - наиболее часто передающийся половым путем возбудитель, вызывающий у человека трахому, паховый лимфогранулематоз и урогенитальные инфекции, часто сопровождающиеся серьезными осложнениями Механизмы взаимодействия данного облигатного внутриклеточного паразита с клеткой-хозяином на сегодняшний день остаются практически неизвестными. Согласно принятой точке зрения, главная роль в реализации данных взаимодействий может принадлежать уникальным хламидийным белкам, среди которых особенно пристальное внимание исследователей привлекают белки мембраны включения
В настоящей работе впервые показана локализация шести Inc-белков С trachomatis при экспрессии кодирующих их генов в эукариотической клетке с образованием составных белков с GFP, а так же ко-локализация данных белков с известными органеллами эукариотической клетки, относящимися к ее секреторному пути Для IncA С trachomatis подтверждена ранее описанная локализация в области ЭПР Показанная нами зависимость распределения составных белков в клетке от расположения репортера предполагает наличие у данных белков С trachomatis специфических последовательностей, обеспечивающих их взаимодействие с эукариотическими органеллами. Влияние таксола на распределение составного белка GFP-IncC в клетке может считаться аргументом в пользу гипотезы об его адресной доставке к плазматической мембране с помощью секреторного пути клетки Мы предполагаем, что разработанная нами модельная система экспрессии Inc-
22
белков в эукариотической клетке может бьггь использована в дальнейшем для изучения как функций Inc-белков, так и основных аспектов взаимодействий хламидий с клеткой-хозяином
Так же разработана методика получения и очистки полноразмерных рекомбинангных белков мембраны включения С trachomatis Впервые получены рекомбинантные полноразмерные IncB и IncC, а так же специфические антитела к ним, которые в дальнейшем могут быть использованы для выявления белков-партнеров в экспериментах in vitro При исследовании генетического полиморфизма генов, кодирующих Inc-белки С trachomatis, показана высокая консервативность тсВ и тсС, что может служить подтверждением значимости кодируемых ими белков для развития хламидийной инфекции
ВЫВОДЫ
1 Изучен полиморфизм генов incA, incB, incC, incD, incE, incF и incG у 8 клинических изолятов С trachomatis В кодирующих последовательностях генов тсВ и тсС не обнаружено значащих нуклеотидных замен В последовательности гена incA у 2 изолятов обнаружена одна значащая нуклеотидна замена (665 G—>А), ранее описанная в литературе В последовательностях генов incD, incE, incF и incG было обнаружено от 2 до 13 значащих нуклеотидных замен у различных клинических изолятов
2 Клонированы гены incA, incB, incC, incD, incE, incF и incG С trachomatis в плазмидные векторы pEGFP-Nl и pEGFP-Cl для получения составных белков с GFP при их экспрессии в линиях клеток млекопитающих
3 Впервые определена локализация белков IncA, IncB, IncC, IncD, IncE, IncF и IncG C. trachomatis при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa
4 Впервые определена ко-локализация белков мембраны включения IncC, IncD, IncE, IncF и IncG С trachomatis с клеточными органеллами при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa и показана ее
зависимость от времени после трансфекции Для IncA подтверждена ко-локализация с эндоплазматическим ретикулумом.
5 Показано изменение распределения составного белка GFP-IncC под воздействием таксола, что свидетельствует о вовлечении микротрубочек в процесс транспорта данного белка.
6 Клонированы гены тсВ и incC С trachomatis в плазмидные векторы рЕТ-15Ъ и рЕТ-32а для последующей экспрессии в клетках Е coli.
7 Подобраны и оптимизированы условия получения составных рекомбинантных белков TrxA-IncB и TrxA-IncC в клетках Е coli, процедура их выделения, очистки и разделения
8 Впервые получены полноразмерные рекомбинантные белки IncB и IncC С trachomatis и специфические кроличьи поликлональные антитела к ним.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1 Кострюкова Е С, Коробова Ф В, Лазарев В.Н., Шкарупета М М, Титова Г А., Акопиан Т.А., Говорун В М Локализация Inc-белков С trachomatis при экспрессии их генов в культуре клеток линии HeLa // Бюлл. экспер биол мед -2005 - Т 139, №5, С. 562 - 567
2 Кострюкова Е.С., Коробова Ф В , Лазарев В.Н., Шкарупета М М, Титова Г А, Акопиан Т А., Говорун В.М Клонирование и экспрессия генов белков мембраны включения С trachomatis в культуре клеток HeLa // Материалы международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» - 2005, Москва - С. 182.
3 Кострюкова Е С , Лазарев В Н., Титова Г А, Акопиан Т.А, Левицкий С.А , Говорун ВМ. Экспрессия генов белков мембраны включения IncB и IncC Chlamydia trachomatis в Escherichia coli Н Биохимия - 2006 - Т 71, №3, С. 333340
4 Lazarev V.N, Shkarupeta М М, Kostryukova E.S, Levitskn S А, Basovskn Yul, Govorun V.M Analysis of Clamydia trachomatis Inc-protems cellular localization during expression of their genes m HeLa cell lme // Genomic Perspectives to Host Pathogen Interactions - 2006, Hmxton, UK - P 47
24
Список используемых сокращений
ERGIC - ER-Golgi intermediate compartment, ЭПР-Гольджи промежуточный компартмент
GFP - green fluorescent protem, зеленый флуоресцирующий белок Inc-белки - inclusion membrane protein, белки мембраны включения ТгхА - тиоредоксин А
WGA - wheat germ agglutmnie, пшеничный зародышевый агглютинин
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
пн - пара нуклеотидов
ЭПР - эндоплазматический ретикулум
Подписано в печать 04 09 2007 г Исполнено 06 09 2007 г Печать трафаретная
Заказ № 674 Тираж 75экз
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ш
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кострюкова, Елена Сергеевна
Список сокращений.
Введение.
Глава I. Обзор литературы.
1.1. Общая характеристика хламидий.
1.1.1. Классификация хламидий, вызывающих патологии у человека.
1.1.2. Молекулярные основы внутриклеточного паразитизма хламидий.
1.1.2.1. Жизненный цикл хламидий.
1.1.2.2. Особенности хламидийного включения.
1.1.2.3. Взаимодействия хламидий с клеткой-хозяином.
1.1.3. Структурно-функциональная организация генома хламидий.
1.1.3.1. Общая геномика хламидий.
1.1.3.2. Сравнительная геномика хламидий.
1.1.4. Транскриптом хламидий.
1.2. Система секреции III типа хламидий.
1.2.1. Строение системы секреции III типа у хламидий.
1.2.2. Поиск белков-эффекторов системы секреции III типа у хламидий.
1.3. Белки мембраны включения хламидий.
1.3.1. Общая характеристика семейства.
1.4. Поиск хламидийных белков мембраны включения in silico.
1.3.1. Транскрипционный анализ генов, кодирующих Inc-белки хламидий.
1.3.2. Связь Inc-белков с системой секреции III типа.
1.3.3. Взаимодействия Inc-белков с эукариотическими органеллами при экспрессии кодирующих их генов в клетках Saccharomyces cerevisiae.
1.3.4. IncA.
1.4.4.1. Роль IncA в формировании единого включения у С. trachomatis.
1.4.4.2. Взаимосвязь IncA с вторичными включениями С. trachomatis.
1.4.4.3. Особенности строения IncA.
1.4.4.4. Влияние экспрессии incA на развитие хламидийной инфекции.
1.3.5. IncG.
1.3.6. СТ229.
1.3.7. Белки мембраны включения, не принадлежащие семейству
Глава II. Материалы и методы.
2.1. Материалы.
2.1.1. Клеточные линии, бактериальные штаммы и плазмидные векторы.
2.1.2. Реактивы и антибактериальные препараты.
2.1.3. Антитела и флуоресцентные красители.
2.1.4. Олигонуклеотиды.
2.2. Методы.
2.2.1. Выделение геномной ДНК С. trachomatis.
2.2.2. Полимеразная цепная реакция.
2.2.3. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов генов, кодирующих Inc-белки С. trachomatis.
2.2.4. Реакция рестрикции.
2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.
2.2.6. Реакция лигирования.
2.2.7. Культивирование клеточных культур Е. coli.
2.2.8. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.
2.2.9. Выделение плазмидной ДНК.
2.2.10. Экспрессия генов incB и incC в клетках
E.coli.
2.2.11. Масс-спектрометрический анализ рекомбинантных белков TrxA-IncB и TrxA-IncC.
2.2.12. Выделение рекомбинантных белков IncB, IncC, TrxA-IncB и TrxA-IncC из клеток E.coli.
2.2.13. Разделение составных белков TrxA-IncB и TrxA-IncC.
2.2.14. Иммунизация кроликов препаратами белков IncB и IncC С. 69 trachomatis и отбор крови.
2.2.15. Выделение и очистка поликлональных антител к 69 рекомбинантным белкам IncB и IncC С. trachomatis.
2.2.16. Иммуноблот.
2.2.17. Трансфекция клеток линии HeLa.
2.2.18. Определение жизнеспособности клеток линии HeLa, экспрессирующих гены Inc-белков С. trachomatis.
2.2.19. Конфокальная микроскопия.
2.2.20. Флуоресцентное окрашивание эукариотических клеток.
2.2.21. Подсчет параметров ко-локализации.
Глава III. Результаты исследования.
3.1. Определение генетического полиморфизма генов, кодирующих Inc-белки С. trachomatis.
3.2. Клонирование полноразмерных генов, кодирующих Inc-белки С. trachomatis, в экспрессирующие плазмидные векторы.
3.3. Определение локализации Inc-белков С. trachomatis при экспрессии их генов в клетках линии HeLa.
3.4. Определение жизнеспособности клеток линии HeLa, экспрессирующих гены Inc-белков С. trachomatis.
3.5. Выявление ко-локализации Inc-белков С. trachomatis с эукариотическими органеллами при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa.
3.6. Определение влияния таксола на распределение составного белка GFP-IncC при экспрессии кодирующего его гена в клетках линии HeLa.
3.7. Получение и очистка полноразмерных рекомбинантных белков
IncB и IncC С. trachomatis.
3.8. Получение и анализ поликлональных антител к рекомбинантным белкам IncB и IncC С. trachomatis.
Глава IV. Обсуждение результатов исследования.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование и экспрессия генов, кодирующих белки мембраны включения IncA-IncG Chlamydia trachomatis"
Актуальность проблемы: Chlamydia trachomatis - облигатный внутриклеточный паразит, вызывающий у человека такие заболевания, как трахома, паховый лимфогранулематоз и урогенитальные хламидиозы, особенно опасные для репродуктивного здоровья женщин (Stamm et al, 1999). Хламидии отлично адаптированы к условиям существования как во внешней среде, так и внутри эукариотической клетки благодаря уникальному двухфазному жизненному циклу, который представляет собой последовательную смену метаболических состояний микроорганизма - инфекционного и вегетативного. Внутриклеточный этап развития хламидий происходит внутри мембранной вакуоли, называемой включением.
Располагаясь внутри обособленного мембранного компартмента, хламидии не только формируют собственное комфортное жизненное пространство, но и сохраняют способность активно влиять на клеточные процессы инфицированной клетки, исключительно искусно подавляя и направляя их вплоть до завершения собственного цикла развития. Механизм подобного взаимодействия остается загадкой, поскольку мембрана включения непроницаема для молекул крупнее 520 Да (Heinzen et al, 1997), а в настоящее время известны только три белка хламидийной природы, секретируемые в цитоплазму инфицированной клетки (Zhong et al, 2001, Fan et al, 2002, Subtil et al, 2005). В составе мембраны включения не обнаружено эукариотических белков, характерных для эндосом и лизосом, при этом хламидии активно модифицируют поверхность включения с помощью продуктов собственного белкового синтеза, абсолютно необходимого для успешного развития инфекции. Предполагается, что именно белки мембраны включения являются медиаторами, опосредующими взаимодействия хламидий с эукариотической клеткой.
В первую очередь внимание исследователей привлекают представители семейства уникальных хламидийных белков, располагающихся в мембране включения, называемых Inc-белками (inclusion proteins) (Rockey et al, 2002). Inc-белки обнаружены у всех видов хламидий, причем их гомологи отсутствуют у каких-либо других известных организмов. Данные белки значительно отличаются между собой аминокислотными последовательностями, однако для всех Inc-белков характерно наличие двудольного гидрофобного домена, состоящего из 50-80 аминокислот, который, возможно, и определяет их локализацию в мембране включения (Bannantine et al, 2000). Кроме того, в геномах хламидий обнаружено значительное число открытых рамок считывания, кодирующих белки со сходным гидрофобным профилем, причем подобные гены полностью отсутствуют во всех остальных известных сегодня геномах (Toh et al, 2003). Гидрофильные домены некоторых Inc-белков располагаются на цитоплазматической поверхности мембраны включения и фосфорилируются киназами клетки-хозяина, а экспрессия большей части генов, кодирующих Inc-белки, начинается в течение первых часов после заражения культуры клеток - все эти факты позволяют предположить, что данные белки могут играть ключевые роли в процессах развития хламидийной инфекции (Rockey et al, 2002).
Научная новизна и практическая значимость: несмотря на то, что первые белки семейства Inc были открыты десять лет назад, функции их остаются загадкой. На сегодняшний день обнаружены некоторые биологические свойства только трех из них. Показано, что IncG С. trachomatis может взаимодействовать с эукариотическим белком 14-З-ЗР (Scidmore et al, 2001), СТ229 взаимодействует с Rab4A GTP-азой (Rzomp et al, 2006), IncA C. trachomatis принимает участие в формировании единого включения, ассоциирован со вторичными включениями, и так же, как IncA С. psittaci, ингибирует развитие хламидийной инфекции при экспрессии кодирующего его гена в зараженной клетке для IncA (Hackstadt et al, 19996, Delevoye et al, 2004, Suchland et al, 2005). Кроме того, на основе данных о секреции в гетерологичных системах IncA, IncB, IncC С pneumoniae, а так же IncC С. trachomatis, принято считать, что Inc-белки являются эффекторами системы секреции III типа у хламидий. Функции остальных Inc-белков до сих пор неизвестны. Их уникальность не позволяет делать предположения о возможной биологической роли на основании данных о гомологах, а невозможность применения к хламидиям большинства классических методов молекулярной биологии, заставляет исследователей искать обходные пути для выявления функций Inc-белков. Одним из таких путей может стать изучение поведения Inc-белков в гетерологичных системах.
В настоящей работе реализован один из походов к выявлению функций белка и обнаружению его потенциальных белков-партнеров путем определения его локализации при гетерологичной экспрессии в клетке. В результате впервые показана локализация шести Inc-белков С. trachomatis при экспрессии кодирующих их генов в эукариотической клетке с образованием составных белков с GFP (green fluorescent protein, зеленый флуоресцирующий белок). С использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии впервые показана ко-локализация данных белков С. trachomatis с известными органеллами эукариотической клетки, относящимися к ее секреторному пути. Так же впервые получены рекомбинантные полноразмерные белки мембраны включения С. trachomatis IncB и IncC, которые в дальнейшем могут быть использованы для выявления белков-партнеров в реакциях белок-белкового взаимодействия, а так же специфические поликлональные антитела к ним. Кроме того, в результате определения генетического полиморфизма генов, кодирующих Inc-белки С. trachomatis, была показана высокая консервативность incB и incC, относящихся к числу генов ранней фазы, что может служить подтверждением значимости кодируемых ими белков для развития хламидийной инфекции.
Цель работы: клонирование и экспрессия генов, кодирующих белки мембраны включения С. trachomatis
Задачи:
1. Определение генетического полиморфизма генов, кодирующих белки мембраны включения IncA-IncG С. trachomatis.
2. Клонирование генов, кодирующих белки мембраны включения IncA-IncG С. trachomatis, в плазмидные векторы с репортерными генами для получения составных белков при экспрессии в линиях клеток млекопитающих.
3. Определение локализации белков мембраны включения IncA-IncG С. trachomatis при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa.
4. Выявление ко-локализации белков мембраны включения IncA-IncG С. trachomatis с эукариотическими органеллами при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa.
5. Клонирование генов, кодирующих белки мембраны включения IncB и IncC С. trachomatis в плазмидные векторы для последующей экспрессии в клетках Е. coli.
6. Получение и очистка полноразмерных рекомбинантных белков IncB и IncC С. trachomatis и специфических антител к ним.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кострюкова, Елена Сергеевна
Выводы.
1. Изучен полиморфизм генов incA, incB, incC, incD, incE, incF и incG у 8 клинических изолятов С. trachomatis. В кодирующих последовательностях генов incB и incC не обнаружено значащих нуклеотидных замен. В последовательности гена incA у 2 изолятов обнаружена одна значащая нуклеотидна замена (665 G—*А), ранее описанная в литературе. В последовательностях генов incD, incE, incF и incG было обнаружено от 2 до 13 значащих нуклеотидных замен у различных клинических изолятов.
2. Клонированы гены incA, incB, incC, incD, incE, incF и incG C. trachomatis в плазмидные векторы pEGFP-Nl и pEGFP-Cl для получения составных белков с GFP при их экспрессии в линиях клеток млекопитающих.
3. Впервые определена локализация белков IncA, IncB, IncC, IncD, IncE, IncF и IncG C. trachomatis при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa.
4. Впервые определена ко-локализация белков мембраны включения IncB, IncC, IncD, IncE, IncF и IncG С. trachomatis с клеточными органеллами при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa и показана ее зависимость от времени после трансфекции. Для IncA подтверждена ко-локализация с эндоплазматическим ретикулумом.
5. Показано изменение распределения составного белка GFP-IncC под воздействием таксола, что свидетельствует о вовлечении микротрубочек в процесс транспорта данного белка.
6. Клонированы гены incB и incC С. trachomatis в плазмидные векторы рЕТ-15Ь и рЕТ-32а для последующей экспрессии в клетках coli.
7. Оптимизированы условия получения составных рекомбинантных белков TrxA-IncB и TrxA-IncC в клетках Е. coli, процедура их выделения, очистки и разделения.
8. Впервые получены полноразмерные рекомбинантные белки IncB и IncC С. trachomatis и специфические кроличьи поликлональные антитела к ним.
Заключение
С. trachomatis - наиболее часто передающийся половым путем возбудитель, вызывающий у человека трахому, паховый лимфогранулематоз и урогенитальные инфекции, часто сопровождающиеся серьезными осложнениями (Stamm et al, 1999). Механизмы взаимодействия данного облигатного внутриклеточного паразита с клеткой-хозяином на сегодняшний день остаются практически неизвестными. Согласно принятой точке зрения, главная роль в реализации данных взаимодействий может принадлежать уникальным хламидийным белкам, среди которых особенно пристальное внимание исследователей привлекают белки мембраны включения (Rockey et al, 2002).
В настоящей работе впервые показана локализация шести Inc-белков С. trachomatis при экспрессии кодирующих их генов в эукариотической клетке с образованием составных белков с GFP, а так же ко-локализация данных белков с известными органеллами эукариотической клетки, относящимися к ее секреторному пути. Для IncA С. trachomatis подтверждена ранее описанная локализация в области ЭПР (Delevoye et al, 2004). Показанная нами зависимость распределения составных белков в клетке от расположения репортера предполагает наличие у данных белков С. trachomatis специфических последовательностей, обеспечивающих их взаимодействие с эукариотическими органеллами. Влияние таксола на распределение составного белка GFP-IncC в клетке может считаться аргументом в пользу гипотезы об его адресной доставке к плазматической мембране с помощью секреторного пути клетки. Мы предполагаем, что разработанная нами модельная система экспрессии Inc-белков в эукариотической клетке может быть использована в дальнейшем для изучения как функций Inc-белков, так и основных аспектов взаимодействий хламидий с клеткой-хозяином.
Так же разработана методика получения и очистки полноразмерных рекомбинантных белков мембраны включения С. trachomatis и антител к ним. Впервые получены рекомбинантные полноразмерные IncB и IncC, которые в дальнейшем могут быть использованы для выявления собственных белков-партнеров в экспериментах in vitro. При исследовании генетического полиморфизма генов, кодирующих Inc-белки С. trachomatis, показана высокая консервативность incB и incC, что может служить подтверждением значимости кодируемых ими белков для развития хламидийной инфекции.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кострюкова, Елена Сергеевна, Москва
1. Allan I., Pearce J.H. Amino acid requirements of strains of Chlamydia trachomatis and С. psittaci growing in McCoy cells: relationship with clinical syndrome and host origin // J. Gen. Microbiol., 1983, vol. 129(7), pp. 2001-2007.
2. Allan V.J., Thompson H.M., McNiven M.A. Motoring around the Golgi // Nat. Cell. Biol.,2002, vol. 4, pp. E236-E242.
3. Allaoui A., Sansonetti P.J., Parsot C. MxiD, an outer membrane protein necessary for the secretion of the Shigella jlexneri lpa invasins // Mol. Microbiol., vol. 1993(7), pp. 59-68.
4. Allaoui A., Sansonetti P.J., Parsot C. MxiJ, a lipoprotein involved in secretion of Shigella lpa invasins, is homologous to YscJ, a secretion factor of the Yersinia Yop proteins //J. Bacterid., 1992, vol. 174, pp. 7661-7669.
5. Alzhanov D., Barnes J., Hruby D.E., Rockey D.D. Chlamydial development is blocked in host cells transfected with Chlamydophila caviae incA. // BMC Microbiol., 2004, vol. 4, pp. 24-34.
6. Anderson D.M., Schneewind O. A mRNA signal for the type III secretion of Yop proteins by Yersinia enterocolitica II Science, 1997, vol. 278, pp. 1140-1143.
7. Anderson D.M., Schneewind O. Yersinia enterocolitica type III secretion: an mRNA signal that couples translation and secretion of YopQ // Mol. Microbiol., 1999a, vol. 31, pp. 1139-1148.
8. Aoe Т., Cukierman E., Lee A., Cassel D., Peters P.J., Hsu V.W. The KDEL receptor, ERD2, regulates intracellular traffic by recruiting a GTPase-activating protein for ARF1 // EMBO J. 1997, vol. 16, pp. 7305-7316.
9. Apolloni A., Prior I.A., Lindsay M., Parton R.G., Hancock J.F. H-ras but not K-ras traffics to the plasma membrane through the exocytic pathway // Mol. Cell. Biol., 2000, vol. 20(7), pp. 2475-2487.
10. Banik U., Wang G.-A., Wagner P.D., Kaufman S. Interaction of phosphorylated tryptophan hydroxylase with 14-3-3 proteins // J. Biol. Chem., 1997, vol. 22, pp. 26219-26255.
11. Bannantine J.P., Griffiths R.S., Viratyosin W., Brown W.J., Rockey D.D. A secondary structure motif predictive of protein localization to the chlamydial inclusion membrane. // Cell. Microbiol., 2000, vol. 2, pp. 35-47.
12. Bannantine J.P., Rockey D.D., Hackstadt T. Tandem genes of Chlamydia psittaci that encode proteins localized to the inclusion membrane // Mol. Microbiol., 1998a., vol. 28, pp. 1017-1026.
13. Bannantine J.P., Stamm W.E., Suchland R.J., Rockey D.D. Chlamydia trachomatis IncA is localized to the inclusion membrane and is recognized by antisera from infected humans and primates // Infect. Immun., 19986, vol. 66, pp. 6017-6021.
14. Barr F.A. A novel Rab6-interacting domain defines a family of Golgi-targeted coiled-coil proteins // Curr. Biol., 1999, vol. 9(7), pp. 381-384.
15. Bavoil P. M., R. Hsia. Type III secretion in Chlamydia: a case of dejY vu? // Mol. Microbiol., 1998, vol. 28, pp. 859-862.
16. Bavoil P., Ohlin A., Schachter J. Role of disulfide bonding in outer membrane structure and permeability in Chlamydia trachomatis II Infect. Immun., 1984, vol. 44, pp. 479-485.
17. Birkelund S., Johnsen H., Christiansen G. Chlamydia trachomatis serovar L2 induces protein tyrosine phosphorylation during uptake by HeLa cells // Infect. Immun., 1994, vol. 62, pp. 4900-4908.
18. Black M.W., Pelham H.R. A selective transport route from Golgi to late endosomes that requires the yeast GGA proteins // J. Cell. Biol., 2000, vol.151, pp. 587-600.
19. Blocker A., Jouihri N., Larquet E., Gounon P., Ebel F., Parsot C., Sansonetti P, Allaoui A. Structure and composition of the Shigella flexneri 'needle complex', a part of its type III secreton // Mol. Microbiol. 2001, vol. 39, pp. 652-663.
20. Blyth W.A., Taverne J. Some consequences of the multiple infection of cell cultures by TRIC organisms // J. Hyg., 1972, vol. 70, pp. 33-37.
21. Brown W.J., Skeiky Y.A., Probst P., Rockey D. D. Chlamydial antigens colocalize within IncA-laden fibers extending from the inclusion membrane into the host cytosol // Infect. Immun. 2002, vol. 70(10), pp. 5860-5864.
22. Byrne G.I., Moulder J.W. Parasite-specified phagocytosis of Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis by L and HeLa cells // Infect. Immun., 1978, vol. 19, pp. 598-606.
23. Caldwell H.D., Kromhout J., Schachter J. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis II Infect. Immun., 1981, vol. 31,pp. 1161-1176.
24. Carabeo R. A., Grieshaber S. S., Fischer E. Hackstadt T. Chlamydia trachomatis induces remodeling of the actin cytoskeleton during attachment and entry into HeLa cells // Infect. Immun., 2002, vol. 70, pp. 3793-3803.
25. Carabeo R.A., Grieshaber S.S., Hasenkrug A., Dooley C., Hackstadt T. Requirement for the Rac GTPase in Chlamydia trachomatis invasion of non-phagocytic cells // Traffic, 2004, vol. 5(6), pp. 418-425.
26. Carlson J.H., Porcella S.F., McClarty G., Caldwell H.D. Comparative genomic analysis of Chlamydia trachomatis oculotropic and genitotropic strains // Infect. Immun., 2005, vol. 73(10), pp. 6407-6418.
27. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science, 1994, vol. 263(5148), pp. 802805.
28. Christoforidis S., McBride H. M., Burgoyne R. D.Zerial M. The Rab5 effector EEA1 is a core component of endosome docking // Nature, 1999, vol. 397, pp. 621-625.
29. Clausen J.D., Christiansen G., Hoist H.U., Birkelund S. Chlamydia trachomatis utilizes the host cell microtubule network during early events of infection // Mol. Microbiol., 1997, vol. 25, pp. 441-449.
30. Collingro A., Toenshoff E.R., Taylor M.W., Fritsche T.R., Wagner Horn M. 'Candidatus Protochlamydia amoebophila', endosmbiont of Acanthamoeba spp II Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, vol. 55, pp. 1863-1866.
31. Dong F., Su H., Huang Y., Zhong Y., Zhong G. Cleavage of host keratin 8 by a Chlamydiasecreted protease // Infect. Immun., 2004, vol. 72, pp. 3863-3868.
32. Douglas A. L. Hatch T. P. Expression of the transcripts of the sigma factors and putative sigma factor regulators of Chlamydia trachomatis L2 // Gene, 2000, vol. 247, pp. 209-214.
33. Emre U., Sokolovskaya N., Roblin P.M., Schachter J., Hammerschlag M.R. Detection of anti-Chlamydia pneumoniae IgE in children with reactive airway disease // J. Infect. Dis., 1995, vol. 172(1) pp. 265-267.
34. Everett K.D., Bush R.M., Andersen A.A. Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family
35. Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms // Int. J. Syst. Bacteriol., 1999, vol. 2, pp. 415-440.
36. Fan H.Z., McClarty G., Brunham R.C., Biochemical evidence for the existence of thymidylate synthase in the obligate intracellular parasite Chlamydia trachomatis II J. Bacteriol., 1991, vol. 173(21), pp. 6670-6677.
37. Fan Т., Lu H., Ни H., Shi L., McClarty G.A., Nance DM, Greenberg AH, Zhong G. Inhibition of apoptosis in chlamydia infected cells: blockade of mitochondrial cytochrome С release and caspase activation // J. Exp. Med., 1998, vol. 187, pp. 487-496.
38. Fantl W.J., Muslin A.J., Kikuchi A., Martin J.A., MacNicol A.M., Gross R.W., Williams L.T. Activation of Raf-1 by 14-3-3 proteins //Nature, 1994, vol. 371, pp. 612-614.
39. Fasshauer D., Sutton R. В., Brunger А. Т., Jahn R. Conserved structural features of the synaptic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, vol. 95, pp. 15781-15786.
40. Fawaz F.S., van Ooij C., Homola E., Mutka S.C., Engel J.N. Infection with Chlamydia trachomatis alters tyrosine phosphorylation and/or localization of several host cell proteins including cortactin // Infect. Immun., 1997, vol. 65, pp. 5301-5308.
41. Feilmeier B.J., Iseminger G., Schroeder D., Webber H., Phillips G.J. Green fluorescent protein functions as a reporter for protein localization in Escherichia coli II J. Bacteriol., 2000, vol. 182(14), pp. 4068-4076.
42. Feldman M. F., G. R. Cornelis. The multitalented type III chaperones: all you can do with 15 kDa// FEMS Microbiol. Lett., 2003, vol. 219, pp. 151-158.
43. Fields К.A., Fischer E.R., Hackstadt T. Inhibition of fusion of Chlamydia trachomatis inclusions at 32 degrees С correlates with restricted export of IncA // Infect. Immun., 20026, vol. 70(7), pp. 3816-3823.
44. Fields K.A., Hackstadt T. Evidence for the secretion of Chlamydia trachomatis CopN by a type III secretion mechanism Mol. Microbiol., 2000, vol. 38, pp. 1048— 1060.
45. Fields K.A., Hackstadt T. The chlamydial inclusion: Escape from the Endocytic Pathway// Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2002a, vol. 18, pp. 221-245
46. Fields K.A., Mead D.J., Dooley C.A. Hackstadt T. Chlamydia trachomatis type III secretion: evidence for a functional apparatus during early-cycle development // Mol. Microbiol., 2003, vol. 48 (3), pp. 671-683.
47. Fischer S.F., Schwarz C., Vier J., Hacker G. Characterization of antiapoptotic activities of Chlamydia pneumoniae in human cells // Infect. Immun., 2001, vol. 69, pp. 7121-7129.
48. Fischer S.F., Vier J., Kirschnek S., Klos A., Hess S., Ying S., Hacker G. Chlamydia inhibit host cell apoptosis by degradation of proapoptotic BH3-only proteins // J. Exp. Med., 2004, vol. 200(7), pp. 905-916.
49. Fox A., Rogers J.C., Gilbart J., Morgan S., Davis C.H., Knight S., Wyrick P.B. Muramic acid is not detectable in Chlamydia psittaci or Chlamydia trachomatis by gas chromatography-mass spectrometry // Infect. Immun., 1990, vol. 58(3), pp. 835-837.
50. Friis R.R. Interaction of L cells and Chlamydia psittaci: entry of the parasite and host responses to its development // J. Bacteriol., 1972, vol. 110, pp. 706-721.
51. Fu H., Subramanian R.R., Masters S.C. 14-3-3 Proteins: Structure, Function and Regulation // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2000, vol. 40, 617-647.
52. Garcia-del Portillo F., Zwick M.B., Leung K.Y., Finlay B.B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, pp. 10544-10548.
53. Geisler W.M., Suchland R.J., Rockey D.D., Stamm W.E. Epidemiology and clinical manifestations of unique Chlamydia trachomatis isolates that occupy nonfusogenic inclusions // J. Infect. Dis., 2001, vol. 184(7), pp. 879-884.
54. Gelperin D., Weigle J., Nelson K., Roseboom R., Irie K., Matsumoto K., Lemmon S. 14-3-3 proteins: potential roles in vesicular transport and ras signalling in Saccharomyces cerevisiae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, pp. 1153911543.
55. Gibellini D., Panaya R., Rumpianesi F. Induction of apoptosis by Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis infection in tissue culture cells // Zentralbl. Bakteriol., 1998, vol. 288, pp. 35^43.
56. Giles D.K., Whittimore J.D., LaRue R.W., Raulston J.E., Wyrick P.B. Ultrastructural analysis of chlamydial antigen-containing vesicles everting from the Chlamydia trachomatis inclusion // Microbes Infect., 2006, vol. 8(6), pp. 1579-1591.
57. Grayston J.T., Aldous M.B., Easton A., Wang S.P., Kuo C.C., Campbell L.A., Altman J. Evidence that Chlamydia pneumoniae causes pneumonia and bronchitis //J. Infect. Dis., 1993, vol. 168(5), pp. 1231-1235.
58. Grebenok R.J., Pierson E., Lambert G.M., Gong F.C., Afonso C.L., Haldeman-Cahill R., Carrington J.C., Galbraith D.W. Green-fluorescent protein fusions for efficient characterization of nuclear targeting // Plant J., 1997, vol. 11(3), pp. 573586.
59. Grieshaber S. S., Grieshaber N. A., Hackstadt T. Chlamydia trachomatis utilizes host cell dynein to traffic to the microtubule-organizing center in a p50 dynamitin-independent process // J. Cell. Sci., 2003, vol. 116, pp. 3793-3802.
60. Grieshaber S., Swanson J.A., Hackstadt T. Determination of the physical environment within the Chlamydia trachomatis inclusion using ion-selective ratiometric probes // Cell. Microbiol., 2002, vol. 4, pp. 273-284
61. Griffiths E., Ventresca M.S., Gupta R.S. BLAST screening of chlamydial genomes to identify signature proteins that are unique for the Chlamydiales, Chlamydiaceae, Chlamydophila and Chlamydia groups of species // BMC Genomics, 2006, vol. 7, pp. 14-34.
62. Grystone J.T. Infections caused by Chlamydia pneumoniae strain TWAR // Clin. Infect. Dis., 1992, vol. 15(5), pp. 757-761.
63. Hackstadt T. Redirection of host vesicle trafficking pathways by intracellular parasites // Traffic, 2000, vol. 1, pp. 93-99.
64. Hackstadt T. The diverse habitats of obligate intracellular parasites // Curr. Opin. Microbiol., 1998, vol.1, pp. 82-87.
65. Hackstadt Т., Fischer E.R., Scidmore M.A., Rockey D.D., Heinzen R.A. Origins and functions of the chlamydial inclusion // 1997, Trends Microbiol., vol. 5, pp. 288-293.
66. Hackstadt Т., M. Scidmore-Carlson A., Dooley C. A. Chlamydia trachomatis inclusion membrane protein required for intracellular development // Mol. Biol. Cell., 1999a, 10(Suppl. S):182A.
67. Hackstadt Т., Scidmore M.A., Rockey D.D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids tothe chlamydial inclusion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, pp. 48774881.
68. Hackstadt Т., Scidmore-Carlson M.A., Shaw E.I., Fischer E.R. The Chlamydia trachomatis IncA protein is required for homotypic fusion // Cell. Microbiol., 19996, vol. l,pp. 119-130.
69. Hahn D.L., Dodge R.W., Golubjatnicov R. Association of Chlamydia pneumoniae (strain TWAR) infection with wheezing, asthmatic bronchitis, and adult-onset asthma // JAMA, 1991, vol. 266(2), pp. 225-230.
70. Hambrock A., Loffler-Walz C., Quast U. Glibenclamide binding to sulphonylurea receptor subtypes: dependence on adenine nucleotides // Br. J. Pharmacol., 2002, vol. 136(7), pp. 995-1004.
71. Hamm-Alvaxrez S.F., Alayof В., Himmel H., Kim P.Y., Crews A.L., Strauss H.C., Sheetz M.P. Coordinate depression of bradykinin receptor recycling and microtubule-dependent transport by taxol // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, vol. 91, pp. 7812-7816.
72. Hanahan D.G. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // J. Mol. Biol., 1983, vol. 166(4), pp. 557-580.
73. Hansen-Wester I., Hensel M. Salmonella pathogenicity islands encoding type III secretion systems // Microbes Infect. 2001, vol. 3, pp. 549-559.
74. Hanson M.R., Kohler R.H. GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants // J. Exp. Bot., 2001, vol. 52(356), pp. 529-539.
75. Haraguchi T. Live cell imaging: approaches for studying protein dynamics in living cells // Cell. Struct. Funct., 2002, vol. 27(5), pp. 333-334.
76. Hatch G.M., McClarty G. Phospholipid composition of purified Chlamydia trachomatis mimics that of the eucaryotic host cell // Infect. Immun., 1998, vol. 66, pp. 3727-3735.
77. Hatch T.P. Utilization of exogenous thymidine by Chlamydia psittaci growing in the thymidine kinase-containing and thymidine kinase-deficient L cells // J. Bacteriol., 1976, vol. 125(2), pp. 706-712.
78. Hatch T.P., Allan I., Pearce J.H. Structural and polypeptide differences between envelopes of infective and reproductive life cycle forms of Chlamydia spp // J. Bacteriol., 1984, vol. 157, pp. 13-20.
79. Hatch T.P., Miceli M., Sublett J.E. Synthesis of disulfide-bonded outer membrane proteins during the developmental cycle of Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis II J. Bacteriol. 1986, vol. 165, pp. 379-385.
80. Heinzen R. A., Hackstadt T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecularweight compounds // Infect. Immun., 1997, vol. 65, pp. 1088-1094.
81. Heinzen R.A., Scidmore M.A., Rockey D.D., Hackstadt T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis II Infect. Immun., 1996, vol. 64, pp. 796-809.
82. Ho T.D., Starnbach M.N. The Salmonella enterica serovar typhimurium-encoded type III secretion systems can translocate Chlamydia trachomatis proteins into the cytosol of host cells // Infect. Immun., 2005, vol. 73(2), pp. 905-911.
83. Hsia R., Ohayon H., Gounon P., Dautry-Varsat A., Bavoil P.M. Phage infection of the obligate intracellular bacterium, Chlamydia psittaci strain guinea pig inclusion conjunctivitis // Microbes Infect., 2000a, vol.2(7), pp. 761-772.
84. Hsia R.C., Pannekoek Y., Ingerowski E., Bavoil P.M. Type III secretion genes identify a putative virulence locus of Chlamydia II Mol. Microbiol., 1997, vol. 25, pp. 351-359.
85. Hsia R.C., Ting L.M., Bavoil P.M. Microvirus of Chlamydia psittaci strain guinea pig inclusion conjunctivitis: isolation and molecular characterization // Microbiology, 20006, vol. 146, pp. 1651-1660.
86. Hueck C.J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1998, vol. 62(2), pp. 379-433.
87. Huh W.K., Falvo J.V., Gerke L.C., Carroll A.S., Howson R.W., Weissman J.S., O'Shea E.K. Global analysis of protein localization in budding yeast // Nature, 2003, vol. 425, pp. 686-691.
88. Ibba M., Curnow A.W., Soli D. Aminoacyl-tRNA synthesis: divergent routes to a common goal // Trends Biochem. Sci., 1997, vol. 22(2), pp. 39-42.
89. Jackson M.W., Piano G.V. Interactions between type III secretion apparatus components from Yersinia pestis detected using the yeast two-hybrid system // FEMS Microbiol. Lett., 2000, vol. 186, pp. 85-90.
90. Kalman S., Mitchell W., Marathe R., Lammel C., Fan J., Hyman R.W., Olinger L., Grimwood J., Davis R.W., Stephens R.S. Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis II Nat. Genet., 1999, vol. 21(4), pp. 385-389.
91. Kim J.F. Revisiting the chlamydial type III protein secretion system: clues to the origin of type III protein secretion // Trends. Genet., 2001, vol. 17(2), pp. 65-69.
92. Knudsen K., A. S. Madsen, P. Mygind, G. Christiansen, S. Birkelund. Identification of two novel genes encoding 97- to 99-kilodalton outer membrane proteins of Chlamydia pneumoniae И Infect. Immun., 1999, vol. 67, pp. 375-383.
93. Kubori Т., Matsushima Y., Nakamura D., Uralil J., Lara-Tejero M., Sukhan A., Galan J.E., Aizawa S.I. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system // Science, 1998, vol. 280, pp. 602605.
94. Kubori Т., Sukhan A., Aizawa S.I., Galan J.E. Molecular characterization and assembly of the needle complex of the Salmonella typhimurium type IIIprotein secretion system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, pp. 1022510230.
95. Lang Т., Hellio R., Kaye P.M., Antoine J.C. Leishmania donovani-infected macrophages: characterization of the parasitophorous vacuole and potential role of this organelle in antigen presentation // J. Cell Sci., 1994, vol. 107, pp. 2137-2150.
96. Laurila A.L., Von Hertzen L., Saikku P. Chlamydia pneumoniae and chronic lung diseases // Scand. J. Infect. Dis. Suppl., 1997, vol. 104, pp. 34-36.
97. Li S., Janosch P., Tanji M., Rosenfeld G.C., Waymire J.C., Mischak H., Kolch W., Sedivy J.M. Regulation of Raf-1 kinase activity by the 14-3-3 family of proteins // EMBO J., 1995, vol. 14, pp. 685- 696.
98. Liu B.L., Everson J.S., Fane В., Giannikopoulou P., Vretou E., Lambden P.R. Clarke I.N. Molecular characterization of a bacteriophage (Chp2) from Chlamydia psittaci II J. Virol., 2000, vol. 74, pp. 3464-3469.
99. Liu H.S., Jan M.S., Chou C.K., Chen P.H., Ke N.J. Is green fluorescent protein toxic to the living cells? // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, vol. 260(3), pp. 712-717.
100. Liu S.L., Sanderson K.E. Rearrangements in the genome of the bacterium Salmonella typhi II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92(4), pp. 1018-1022.
101. Longbottom D., J. Findlay, E. Vretou, S. M. Dunbar. Immunoelectron microscopic localisation of the OMP90 family on the outer membrane surface of Chlamydia psittaci И FEMS Microbiol. Lett., 1998, vol. 164, pp. 111-117.
102. Longbottom D., Russell M., Jones G.E., Lainson F.A., Herring A.J. Identification of a multigene family coding for the 90 kDa proteins of the ovine abortion subtype of Chlamydia psittaci II FEMS Microbiol. Lett., 1996, vol. 142(2-3), pp. 277-281.
103. Lu H., Shen C., Brunham R.C. Chlamydia trachomatis infection of epithelial cells induces the activation of caspase-1 and release of mature IL-18// J. Immunol., 2000, vol. 165, pp. 1463-1469.
104. Lugert R., Kuhns M., Polch Т., Gross U. Expression and localization of type III secretion-related proteins of Chlamydia pneumoniae И Med. Microbiol. Immunol. (Berl)., 2004, vol. 193(4), pp. 163-171.
105. Majeed M., Kihlstrom E. Mobilization of F-actin and clathrin during redistribution of Chlamydia trachomatis to an intracellular site in eucaryotic cells // Infect. Immun., 1991, vol. 59, pp. 4465-4472.
106. Manders E.M.M, Verbeek F.J. Aten J.A. Measurement of co-localization of object in dual-colour confocal images // J. Microscop., 1993, vol. 169, pp. 375382.
107. Matsumoto A. Electron microscopic observations of surface projections and related intracellular structures of Chlamydia organisms // J. Electron Microsc., 1981, vol. 30, pp. 315-320.
108. McClarty G. Chlamydiae and the biochemistry of intracellular parasitism // Microbiology, 1994, vol. 2, pp. 157-164.
109. Melgosa M.P., Kuo C.C., Campbell L.A. Outer membrane complex proteins of Chlamydia pneumoniae // FEMS Microbiol. Lett., 1993, vol. 112, pp. 199-204.
110. Menard R., Sansonetti P.J., Parsot C. Nonpolar mutagenesis of the ipa genes defines IpaB, IpaC, and IpaD as effectors of Shigella jlexneri entry into epithelial cells // J. Bacteriol, 1993, vol. 175(18), pp. 5899-5906.
111. Michiels Т., Vanooteghem J.C., Lambert de Rouvroit C., China В., Gustin A., Boudry P., Cornelis G.R. Analysis of virC, an operon involved in the secretion of Yop proteins by Yersinia enterocolitica И J. Bacteriol., 1991, vol. 173, pp. 4994-5009.
112. Mott J., Barnewall R.E., Rikihisa Y. Human granulocytic ehrlichiosis agent and Ehrlichia chajjeensis reside in different cytoplasmic compartments in HL-60 cells // Infect. Immun., 1999, vol. 67, pp. 1368-1378.
113. Moulder J.W. Interaction of chlamydiae and host cells in vitro // Microbiol. Rev., 1991, vol. 55, pp.143-190.
114. Navarre W.W., Zychlinsky A. Pathogeninduced apoptosis of macrophages: a common end for different pathogenic strategies // Cell. Microbiol., 2000, vol. 2, pp.265-273.
115. Newhall W.J.V., Jones R.B. Disulfidelinked oligomers of the major outer membrane protein of chlamydiae // J. Bacteriol., 1983, vol. 154, pp. 998-1001.
116. Nichols B.A., P.Y. Setzer, F. Pang, C.R. Dawson. New view of the surface projections of Chlamydia trachomatis II J. Bacteriol., 1985, vol. 164, pp. 344-349.
117. Nicholson T.L., Olinger L., Chong K., Schoolnik G., Stephens R.S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis II J. Bacteriol., 2003, vol. 185(10), pp. 3179-3189.
118. Ojcius D.M., Degani H., Mispelter J., Dautry-Varsat A. Enhancement of ATP levels and glucose metabolism during an infection by Chlamydia. NMR studies of living cells // J. Biol. Chem., 1998, vol. 273(12), pp. 7052-7058.
119. Parsot C., Hamiaux C., Page A.L. The various and varying roles of specific chaperones in type III secretion systems // Curr. Opin. Microbiol., 2003, vol. 6, pp. 7-14.
120. Peeleng R.W., Brunham R.C. Chlamydiae as pathogens: new species and new issues // Emerg. Infect. Dis., 1996, vol. 2(4), pp. 307-319.
121. Perfettini J.L., Reed J.C., Israel N., Martinou J.C., Dautry-Varsat A., Ojcius D.M. Role of Bcl-2 family members in caspaseindependent apoptosis during Chlamydia infection // Infect. Immun., 2002, vol. 70, pp. 55-61.
122. Ridderhof J.C., Barnes R.C. Fusion of inclusions following superinfection of HeLa cells by two serovars of Chlamydia trachomatis // Infect. Immun., 1989. vol. 57, pp. 3189-3193.
123. Rockey D.D., Fischer E.R., Hackstadt T. Temporal analysis of the developing Chlamydia psittaci inclusion by use of fluorescence and electron microscopy // Infect. Immun., 1996, vol. 64(10), pp. 4269-4278.
124. Rockey D.D., Heinzen R.A., Hackstadt T. Cloning and characterization of a Chlamydia psittaci gene coding for a protein localized in the inclusion membrane of infected cells // Mol. Microbiol., 1995, vol. 15, pp. 617-626.
125. Rockey D.D., Lenart J., Stephens R.S., 2000, Genome sequencing and our understanding of chlamydiae. Infect. Immun. 68(10): 5473-5479.
126. Rockey D.D., Marci A. Scidmore M. A., John P. Bannantine J. P., Wendy J. Brown W. J. Proteins in the chlamydial inclusion membrane // Microb. Infect., 2002a, vol. 4, pp. 333-340.
127. Rockey D.D., Rosquist J.L. Protein antigens of Chlamydia psittaci present in infected cells but not detected in the infectious elementary body // Infect. Immun., 1994, vol. 62, pp. 106-112.
128. Rockey D.D., Viratyosin W., Bannantine J.P., Suchland R.J., Stamm W.E. Diversity within inc genes of clinical Chlamydia trachomatis variant isolates that occupy non-fusogenic inclusions //Microbiology, 20026, vol. 148, pp. 2497-2505.
129. Rosqvist R., Hakansson S., Forsberg A., Wolf-Watz H. Functional conservation of the secretion and translocation machinery for virulence proteins of yersiniae, salmonellae and shigellae // EMBO J., 1995, vol. 14, pp. 4187-4195.
130. Rzomp K. A., Scholtes L. D., Briggs B. J., Whittaker G. R., Scidmore M. A. Rab GTPases are recruited to chlamydial inclusions in both a species-dependent and species-independent manner // Infect. Immun., 2003, vol. 71, pp. 5855-5870.
131. Rzomp К.A., Moorhead A.R., Scidmore M.A. The GTPase Rab4 interacts with Chlamydia trachomatis inclusion membrane protein CT229 // Infect. Immun., 2006, vol. 74(9), pp. 5362-5373.
132. Salcedo S.P., Holden D.W. Bacterial interactions with the eukaryotic secretory pathway // Curr. Opin. Microbiol., 2005, vol. 8, pp. 92-98
133. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
134. Schiff P.B., Tant J., Horwitz S.B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol // Nature, 1979, vol. 22, pp. 665-667.
135. Schmid M.B., Roth J.R. Selection and endpoint distribution of bacterial inversion mutations // Genetics, 1983, vol. 105(3), pp. 539-557.
136. Schramm N., Wyrick P.B. Cytoskeletal requirements in Chlamydia trachomatis infection of host cells // Infect. Immun., 1995, vol. 63, pp. 324-332.
137. Scidmore M. A., Hackstadt T. Mammalian 14-3-3beta associates with the Chlamydia trachomatis inclusion membrane via its interaction with IncG // Mol. Microbiol., 2001, vol. 39(6), pp.1638-1650.
138. Scidmore M.A., Fischer E.R., Hackstadt T. Restricted fusion of Chlamydia trachomatis vesicles with endocytic compartments during the initial stages of infection // Infect. Immun., 2003, vol. 71(2), pp. 973-984.
139. Scidmore-Carlson M. A., Shaw E. I., Dooley C.A., Fischer E. R., Hackstadt T. Identification and characterization of a Chlamydia trachomatis early operon encoding four novel inclusion membrane proteins // Mol. Microbiol., 1999, vol. 33(4), pp. 753-765.
140. Segall A., Mahan M.J., Roth J.R. Rearrangement of the bacterial chromosome: forbidden inversions // Science, 1988, vol. 241(4871), pp. 13141318.
141. Shastri N., Gonzalez F. Endogenous generation and presentation of the ovalbumin peptide/Kb complex to T cells // J. Immunol., 1993, vol. 150, pp. 2724-2736.
142. Shaw E.I., Dooley C.A., Fischer E.R., Scidmore M.A., Fields K.A., Hackstadt T. Three temporal classes of gene expression during the Chlamydia trachomatis developmental cycle // Mol. Microbiol., 2000, vol. 37, pp. 913-925.
143. Shor A., Kuo C.C., Patton D.L. Detection of Chlamydia pneumoniae in coronary arterial fatty streaks and atheromatous plaques // S. Afr. Med. J., 1992, vol. 82(3), pp. 158-161.
144. Simonsen A., Lippe R., Christoforidis S., Gaullier J.M., Brech A., Callaghan J., Toh B.H., Murphy C., Zerial M., Stenmark H. EEA1 links PI(3)K function to Rab5 regulation of endosome fusion // Nature, 1998, vol. 394(6692), pp. 494-498.
145. Sisko J.L., Spaeth K., Kumar Y., Valdivia R.H. Multifunctional analysis of Chlamydia -specific genes in a yeast expression system // Mol. Microbiol., 2006, vol. 60(1), pp. 51-66.
146. Slepenkin A., Motin V., de la Maza L. M., Peterson E. M. Interaction between components of the type III secretion system of Chlamydiaceae II J. Bacteriol., 2005, vol. 187(2), pp. 473-479.
147. Stamm W.E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems // J. Infect. Dis., 1999, vol. 179, pp. 380-383.
148. Starnbach M.N., Bevan M.J., Lampe M.F. Protective cytotoxic T lymphocytes are induced during murine infection with Chlamydia trachomatis II J. Immunol., 1994., vol. 153, pp. 5183-5189.
149. Stenner-Liewen F., Liewen H., Zapata J.M., Pawlowski K., Godzik A., Reed J.C. CADD, a Chlamydia protein that interacts with death receptors // J. Biol. Chem., 2002, vol. 277(12), pp. 9633-9636.
150. Stewart E.J., Aslund F., Beckwith J. Disulfide bond formation in the Escherichia coli cytoplasm: an in vivo role reversal for the thioredoxins // EMBO J., 1998, vol. 17, pp. 5543-5550.
151. Storey C.C., Lusher M., Richmond S.J. Bacon J. Further characterization of a bacteriophage recovered from an avian strain of Chlamydia psittaci II J. Gen. Virol., 1989, vol. 70, pp. 1321-1327.
152. Sturgill-Koszycki S., Schaible U.E., Russell D.G. Mycobacterium-containing phagosomes are accessible to early endosomes and reflect a transitional state in normal phagosome biogenesis // EMBO J., 1996, vol. 15, pp. 6960-6968.
153. Subtil A., Blocker A., Dautry-Varsat A. Type III secretion system in Chlamydia species: identified members and candidates // Microbes Infect., 2000, vol. 2(4), pp. 367-369.
154. Subtil A., Parsot C., Dautry-Varsat A. Secretion of predicted Inc proteins of Chlamydia pneumoniae by a heterologous type III machinery // Mol. Microbiol., 2001, vol. 39(3), pp. 792-800.
155. Suchland R. J., Rockey D. D., Bannantine J. P. Stamm W. E. Isolates of Chlamydia trachomatis that occupy nonfusogenic inclusions lack IncA, a protein localized to the inclusion membrane // Infect. Immun., 2000, vol. 68, pp. 360-367.
156. Suchland R.J., Rockey D.D., Weeks S.K., Alzhanov D.T., Stamm W.E. Development of Secondary Inclusions in Cells Infected by Chlamydia trachomatis II Infect. Immun., 2005, vol. 73(7), pp. 3954-3962.
157. Swanson M.S., Isberg R.R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum // Infect. Immun., 1995, vol. 63, pp. 36093620.
158. Tavare J.M., Fletcher L.M., Welsh G.I. Using green fluorescent protein to study intracellular signalling // J. Endocrinol., 2001, vol. 170(2), pp. 297-306.
159. Thorn D.H., Grayston J.T., Siskovick D.S., Wang S.P.,Weiss N.S., Daling J.R. Association of prior infection with Chlamydia pneumoniae and angiographically demonstrated coronary artery disease // JAMA, 1992, vol. 268(1), pp. 68-72.
160. Tipples G., McClarty G. Cloning and expression of the Chlamydia trachomatis gene for CTP synthetase // J. Biol. Chem., 1995, vol. 270(14), pp. 7908-7914.
161. Tipples G., McClarty G. The obligate intracellular bacterium Chlamydia trachomatis is auxotrophic for three of the four ribonucleoside triphosphates // Mol. Microbiol., 1993, vol. 8(6), pp. 1105-1114.
162. Toh H., Miura K., Shirai M., Hattori M In silico Inference of Inclusion Membrane Protein Family in Obligate Intracellular Parasites Chlamydiae I I DNA Research, 2003, vol. 10, pp. 9-17.
163. Van Ooij C., Apodaca G., Engel J.N. Characterization of the Chlamydia trachomatis vacuole and its interaction with the host endocytic pathway in HeLa cells // Infect. Immun., 1997, vol. 65, pp.758-766.
164. Van Ooij C., Homola E., Kincaid E., Engel J. Fusion of Chlamydia trachomatis-containing inclusions is inhibited at low temperatures and requires bacterial protein synthesis // Infect. Immun., 1998, vol. 66, pp. 5364-5371.
165. Waldo G.S., Standish B.M., Berendzen J., Terwilliger T.C. Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein // Nat. Biotechnol., 1999, vol. 17(7), pp. 691-695.
166. Walker J.E., Saraste M., Runswick M.J., Gay N.J. Distantly related sequences in the alpha- and betasubunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATPrequiring enzymes and a common nucleotide binding fold // EMBO J. 1982, vol. l,pp. 945-951.
167. Ward M.E., Murray A. Control mechanisms governing the infectivity of Chlamydia trachomatis for HeLa cells: mechanisms of endocytosis // J. Gen. Microbiol., 1984, vol. 130, pp. 1765- 1780.
168. Wattiau P., Bernier В., Desle, P., Michiel, Т., Cornelis G.R. Individual chaperones required for Yop secretion by Yersinia II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, vol. 91, pp. 10493-10497.
169. Wieland T. Phallotoxins Springer-Verlag, New York. 1986.
170. Williamson L.R., Piano G.V., Winkler H.H., Krause D.C., Wood D.O. Nucleotide sequence of the Rickettsia prowazekii ATP/ADP translocase-encoding gene // Gene, 1989, vol. 80(2), pp. 269-278.
171. Woestyn S., Allaoui A., Wattiau P., Cornelis G.R. YscN, the putative energizer of the Yersinia Yop secretion machinery // J. Bacteriol., 1994, vol. 176, pp. 1561-1569.
172. Wolf K., Hackstadt T. Sphingomyelin trafficking in Chlamydia pneumoniae-miQcXed cells // Cell. Microbiol., 2001, vol. 3, pp. 145-152.
173. Wright C.S. Structural comparison of the two distinct sugar binding sites in wheat germ agglutinin isolectin II // J. Mol. Biol., 1984, vol. 178(1), pp. 91-104.
174. Wylie J.L., Hatch G.M., McClarty G. Host cell phospholipids are trafficked to and then modified by Chlamydia trachomatis II J. Bacteriol., 1997, vol. 179, pp. 7233-7242.
175. Wyrick P.B., Choong J., Davis C.H., Knight S.T., Royal M.O., Maslow A.S., Bagnell CR. Entry of Chlamydia trachomatis into polarized human epithelial cells // Infect. Immun., 1989, vol. 57, pp. 2378-2389.
176. Wyrick P.B., Intracellular survival by Chlamydia II Cell. Microbiol., 2000, vol. 2(4), pp. 275-282.
177. Yang F., Moss L.G., Phillips Jr. The molecular structure of green fluorescent protein // Nat. Biotechnol., 1996, vol. 14, pp. 1246-1251.
178. Zhong G., Fan P., Ji H., Dong F., Huang Y. Identification of a chlamydial protease-like activity factor responsible for the degradation of host transcription factors // J. Exp. Med., 2001, vol. 193, pp.935-942.
179. Zhong G., Fan Т., Liu L. Chlamydia inhibits interferon y-inducible major histocompatibility complex class II expression by degradation of upstream stimulatory factor 1 // J. Exp. Med., 1999, vol. 189, pp. 1931-1938.1. Благодарности.
180. А так же сотрудникам лаборатории цитологии опухолевого роста Института цитологии РАН за помощь в иммунизации лабораторных животных и получении сывороток крови.
181. И огромнейшее спасибо Марине Михайловне Шкарупете за неоценимый вклад в представленную работу без которой ее было бы невозможно завершить.
-
Кострюкова, Елена Сергеевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2007
-
ВАК 03.00.04
- Структурно-функциональная характеристика белков мембраны включения Chlamydia trachomatis
- Биологическая активность антимикробных пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi на модели инфекции Chlamydia trachomatis
- Гематогенный путь распространения C.trachomatis у пациентов с урогенитальным хламидиозом
- Новая стратегия использования генов антимикробных пептидов из яда членистоногих в качестве генотерапевтических агентов
- Микробиологические аспекты устойчивости Chlamydia Trachomatis к антибиотикам
