Новая стратегия использования генов антимикробных пептидов из яда членистоногих в качестве генотерапевтических агентов

Лазарев, Василий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новая стратегия использования генов антимикробных пептидов из яда членистоногих в качестве генотерапевтических агентов
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новая стратегия использования генов антимикробных пептидов из яда членистоногих в качестве генотерапевтических агентов"

На правах рукописи

Лазарев Василий Николаевич

«Новая стратегия использования генов антимикробных пептидов из яда членистоногих в качестве генотерапевтических агентов»

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

—Ы4163 2 5 НОЯ 2010

МОСКВА 2010

N.-3

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России

Официальные оппоненты:

академик РАН и РАСХН доктор биологических наук, профессор

Центр «Биоинженерия» РАН

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор

МГУ им. М.В.Ломоносова

доктор биологических наук, профессор

ФГУП «ГосНИИГенетика»

Говорун Вадим Маркович

Скрябин Константин Георгиевич

Донцова Ольга Анатольевна

Вейко Владимир Петрович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН

Защита диссертации состоится 2010 года в часов

на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при Федеральном государственном унитарном предприятии ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545 Россия, г. Москва, 1 -й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библ; Автореферат разослан « » О/"7-Я

еке ФГУП «ГосНИИГенетика» 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук, доцент

Воюшина Татьяна Львовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

На протяжении последних лет во всем мире отмечается значительный рост устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам. Возникновение антимикробной резистентности является естественным биологическим ответом на использование антибиотиков, которые создают селективное давление, способствующее отбору, выживанию и размножению резистентных штаммов микроорганизмов. Резистентность к антибиотикам имеет большое социально-экономическое значение и в развитых странах мира рассматривается как угроза национальной безопасности. Инфекции, вызванные резистентными штаммами, отличаются длительным течением, чаще требуют госпитализации и увеличивают продолжительность пребывания в стационаре, ухудшают прогноз для пациентов. При неэффективности препаратов выбора приходится использовать средства второго или третьего ряда, которые, зачастую, более дороги, менее безопасны и не всегда доступны. Все это увеличивает прямые и непрямые экономические затраты, а также повышает риск распространения резистентных штаммов в обществе [MacPherson, 2001].

За последние 5 лет более 30 млрд. долларов было потрачено мировой фармацевтической промышленностью на разработку новых антибиотиков. Если резистентность микроорганизмов к лекарственным средствам будет развиваться столь быстро, большинство этих инвестиций могут быть потеряны (http://www.who.int/topics/drug_resistance/en/). В связи с этим, активно обсуждается вопрос о создании альтернативных терапевтических средств, резистентность к которым будет развиваться ограниченно, или полностью отсутствовать. Такими средствами могут явиться антимикробные пептиды (АМП) - уникальная и чрезвычайно разнообразная группа соединений, являющаяся основным компонентом врожденного иммунитета.

Природные антимикробные пептиды являются неотъемлемой частью любого организма и выполняют роль либо «наступательного», либо «оборонительного» оружия [Diamond, 2009]. В настоящее время идентифицировано более 2 ООО антимикробных пептидов, выделенных из представителей всех классов растений и животных.

Несомненными преимуществами антимикробных пептидов перед антибиотиками являются: более широкий спектр антибактериального действия, функциональная активность при наномолярных концентрациях, ограниченная возможность формирования резистентности возбудителей к антимикробным пептидам, возможность синтеза аналогов природных пептидов с измененными биологическими свойствами [Palfy, 2009]. Ограниченная возможность формирования устойчивости к АМП объясняется уникальным механизмом их действия, заключающемся в формировании мембранных каналов с последующей фрагментацией мембраны бактериальной клетки [van't Hof, 2001].

Объектом исследования стали уникальные по своей биологии внутриклеточные паразиты - микоплазмы и хламидии.

В мировой лечебной практике для терапии этих инфекций используются антибиотики широкого спектра действия (тетрациклины, макролиды, фторхинолоны), однако, их действие, вследствие быстрого приобретения резистентности к ним, в редких случаях эффективно. Кроме того, уникальные особенности взаимоотношений этих внутриклеточных паразитов с иммунной системой человека часто способствуют развитию персистенции инфекционного агента в организме.

На сегодняшний день в Российской Федерации высокая заболеваемость внутриклеточными инфекциями остается одной из актуальных проблем в области практического здравоохранения. Во многом этому способствует сложившаяся в России и странах СНГ экономическая и демографическая ситуация (снижение социально-экономического уровня населения; создание рынка интимных услуг, наличие неконтролируемых миграционных потоков населения). Особое значение имеет внутриутробное инфицирование плода этими патогенами, приводящее к различным негативным последствиям, часто несовместимым с жизнью. Неконтролируемое применение антибактериальных препаратов, фальсификация лекарственных средств, и, как следствие, эскалация антибиотикорезистентности, отсутствие отечественных разработок в области создания новых антимикробных средств наносят колоссальный экономический ущерб и создают угрозу национальной безопасности страны.

Таким образом, разработка современных высокоэффективных антихламидийных и антимикоплазменных препаратов, развитие резистентности к которым будет ограничено, является чрезвычайно актуальной задачей.

Цель работы: разработать основу для реализации генотерапевтических подходов к лечению микоплазмозов и хламидиозов с использованием генов антимикробных пептидов.

Задачи исследования:

1) Сконструировать рекомбинантные плазмидные векторы, экспрессирующие гены антимикробных пептидов - мелитгина из яда пчелы и пептидов (латарцинов и оксиопининов) из яда двух видов пауков.

2) Адаптировать систему тетрациклин-зависимой регуляции экспрессии генов к полученным рекомбинантным плазмидным векторам.

3) Создать инфекционные модели микоплазмозов и хламидиозов у лабораторных животных.

4) Протестировать полученные рекомбинантные плазмидные векторы в культуре клеток и на моделях микоплазмозов и хламидиоза у лабораторных животных.

5) Установить основные механизмы действия АМП на развитие микоплазменной и хламидийной инфекций.

Научная новизна.

Впервые в качестве потенциальных генотерапевтических агентов для подавления инфекций, вызываемых внутриклеточными паразитами - микоплазмами и хламидиями, использованы антимикробные пептиды из яда членистоногих. Создана серия рекомбинантных плазмидных векторов, экспрессирующих гены мелиттина из яда пчелы и гены латарцинов и оксиопининов из яда паука.

Впервые для снижения цитотоксического эффекта антимикробных пептидов использована система тетрациклин-зависимой регуляции экспрессии генов АМП.

Впервые показана возможность элиминации М.ИоттЬ и С. 1гаскотаИ$ из линий клеток, трансфицированных полученными рекомбинантными плазмидными векторами.

Впервые, на созданных инфекционных моделях микоплазмоза и хламидиоза человека у лабораторных мышей, а также у цыплят-бройлеров, инфицированных возбудителем микоплазмоза птиц - М^аШзерНсит показано ингибирование микоплазменной и хламидийной инфекций после введения полученных рекомбинантных плазмидных векторов.

Впервые, выявлены механизмы действия АМП на внутриклеточных паразитов. Помимо прямого бактерицидного эффекта продемонстрировано снижение трансмембранного потенциала клеток, экспрессирующих ген мелиттина, изменение редокс-состояния клетки и нарушение внутриклеточного трафика, приводящих к нарушению цикла развития хламидий.

Практическая значимость.

Для практического использования разработана система точного регулирования экспрессии генов АМП, которая позволяет решать следующие задачи: 1) определять антимикробную активность кандидатных АМП без их химического синтеза - при клонировании кодирующих их генов в созданный универсальный плазмидный вектор и последующей трансфекции культуры эукариотических клеток; 2) определять степень цитотоксичности кандидатных пептидов при различном уровне экспрессии кодирущих их генов.

Созданные инфекционные модели, а именно урогенитальные микоплазмоз и хламидиоз человека у лабораторных мышей, респираторный микоплазмоз у цыплят-бройлеров, могут быть использованы для тестирования новых антимикоплазменных и антихламидийных препаратов.

Результаты исследований использовались при выполнении работ в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по соглашению с Федеральным агентством по науке и инновациям № 01.168.24.016 от 26 июня 2007 г. «Разработка методов высокопроизводительного скрининга активности антимикробных пептидов как препаратов для терапии внутриклеточных инфекций», по Государственному контракту с Федеральным агентством по науке и инновациям

№02.512.11.2202 от 12 мая 2008 г. «Новые генно-инженерные лекарственные препараты на основе антимикробных пептидов для терапии внутриклеточных инфекций».

Теоретические положения и результаты диссертационной работы используются в курсах лекций по молекулярной медицине в Московском Физико-Техническом институте (Государственном университете) и Российском государственном медицинском университете им. Н.И.Пирогова. По результатам работ поданы заявки на патенты на изобретения: «Способ раздельного выделения одно- и двунитевых нуклеиновых кислот на силикатных матрицах» (№2008137197), «Способ терапии внутриклеточных инфекций с использованием прототипов генно-инженерных лекарственных препаратов на основе генов антимикробных пептидов паука ЬасИезапа /агаЬаыч» (№2009136937), «Способ конденсации плазмидной ДНК для трансфекции эукариотических клеток» (№2009136936).

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены на научной конференции в рамках межлабораторного семинара отдела молекулярной биологии и генетики ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России и на секции "Молекулярная биология" Ученого Совета ФГУП "ГосНИИ генетика".

Результаты работы были представлены на: Международной конференции «Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века» (Москва, 2000), 10-ом и 11-ом Международных биотехнологических симпозиумах (Берлин, 2000; Мадрид, 2001), 11-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Стамбул, 2001), 8-ом Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2001), 4-ой и 5-ой Международных конференциях МАКМАХ «Антимикробная терапия» (Москва, 2001; Москва, 2002), Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002), 14-ом Международном конгрессе общества микоплазмологов (Вена, 2002), 11-ом Европейском конгрессе по биотехнологии (Базель, 2003), Международном симпозиуме «Геномика для изучения взаимоотношений паразит-хозяин» (Хинкстон, 2006), Научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), 4-ом Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), 45-й Международной конференции по медицинской химии (Орлеан, 2009).

Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 34 публикациях: 23 статьях и 11 материалах российских и международных научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 254 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 56 рисунками, библиографический указатель включает 611 публикаций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы E.colï. В работе использовали следующие штаммы E.coli:

DH5a (Invitrogen, США), генотип F" <p80/acZAM15 A(lacZY A-argT) U169 recAl endAX hsd&\7 (rk-, шк+)phoA supE44 X' ¡hi~ 1 gyrA96 re/Al,

TOP 10 (Invitrogen, США), генотип FmcrA A(mtr-hsdRMS-mcrBC) <p801acZAM15 AlacX74 nupG recAi araD139 A(ara-leu)7697galEIS galKló rpsL(St/) endAl X JM110 (Stratagene, США), генотип rpsL (Strr) ihr leu thi-1 lacYgalK galT ara tonA tsx dam dem supE44 A(lac-proAB) [F' traD36proAB lacIqZAM15]

BL21(DE3) (Novagen, США), генотип Г ompTgal dem Ion hsdSB(n mB~) X(DE3 flael laeUV5-T7gene 1 indi sam7 nin5J).

Плазмидные векторы: В работе использовали следующие плазмидные векторы pGEM-Teasy (Promega, США), pRc/CMV (Invitrogen, США), pUC19 (Сибэнзим, Россия), pTet-On (Clontech, США), pTet-Off (Clontech, США), pBI-EGFP (Clontech, США), pTRE (Clontech, США), pCR2.1 (Invitrogen, США), pEGFP-Nl (Clontech, США), pEGFP-Cl (Clontech, США), pET-15b (Novagen, США), pET-32a (Novagen, США), pQE-32 (Qiagen, Германия), pRep4 (Qiagen, Германия), pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen, США), pCMVß (Clontech, США).

Объекты исследования:

Штаммы M.hominis, выделенные от больных с неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта (штамм 1862.3, содержащий детерминанту резистентности tetM, обеспечивающую устойчивость микоплазм к антибиотикам тетрациклинового ряда (МИК доксициклина 1 мг/л) и штамм 574, не содержащий tetM детерминанту), были любезно предоставлены А.Е. Тараскиной (НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Огта РАМН, Санкт-Петербург, Россия). Лабораторный штамм M.hominis Н-34 был любезно предоставлен И.В. Раковской (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва).

Штамм C.íraehomatis (штамм D/UW-3/Cx, АТСС VR-885, МИК доксициклина 0.08 мг/л) был любезно предоставлен доктором Eva Hjelm (Университет Uppsala, Швеция).

Штамм Mycoplasma gallisepticum 1226 (МИК доксициклина 2 мкг/мл) был любезно предоставлен доктором Laszlo Stipkovits (Институт ветеринарной медицины, Венгрия).

Реакция прямой иммунофлуоресненции.

Реакцию прямой иммунофлуоресценции для детекции ингибирования инфекции C.íraehomatis проводили с использованием моноклональных антител, конъюгированных с флуоресцеином ("Orion Diagnostica", Финляндия), согласно инструкции фирмы производителя. Подсчет количества включений (не менее 50 полей зрения) проводили с использованием микроскопа Eclipse Е800 (Nikon, Япония) при увеличении х400.

Для исследования влияния экспрессии мелитина в линиях клеток HeLa/tTA и HeLa/rtTA на инфекцию M.hominis использовали также реакцию прямой иммунофлуоресценции. Учитывали результаты с помощью люминесцентной микроскопии, а также с использованием планшетного флуориметра "Multiscan Ascent" (LabSystems, Финляндия).

Учет результатов с помощью люминесцентной микроскопии.

Клетки линий HeLa/tTA и HeLa/rtTA выращивали на покровных стеклах. Через 48 ч после трансфекции и заражения ростовую среду удаляли и клетки промывали 2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS, 1.47шМ КН2РО4, 4.29mM Na2HP04x7H20, 137шМ NaCl, 2.68mM КС1, рН 7,4) и фиксировали метанолом. После фиксации клетки промывали 1 раз PBS, добавляли 30 мкл сыворотки, конъюгированной с FITC (разведение сыворотки 1:16). Стекла с клетками инкубировали во влажной камере 15 мин при 37 °С при покачивании. Затем стекла с клетками промывали 1 раз PBS, подсушивали и проводили микроскопию.

Учет результатов с использованием планшетного флуориметра.

Через 48 ч после трансфекции и заражения ростовую среду удаляли и клетки промывали 2 раза PBS. В каждую лунку добавляли 170 мкл PBS и 30 мкл сыворотки, конъюгированной с FITC (разведение сыворотки 1:16). Клетки инкубировали во влажной камере 15 мин при 37 °С при покачивании. Клетки осторожно переносили в 1,5 мл пробирку. К клеткам добавляли 600 мкл PBS. Суспензию клеток центрифугировали при 3000 об/мин 5 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость сливали, к клеткам добавляли 600 мкл PBS, клетки ресуспендировали и центрифугировали при том же режиме. Клетки ресуспендировали в 200 мкл PBS и переносили в плашку для измерения. Измерение проводилось при длине волны возбуждающего света 485 нм и эмиссии 538 нм.

Оценка жизнеспособности клеток.

Цитотоксический эффект оценивали с использованием набора LIVE/DEAD (Invitrogen, США) согласно инструкции фирмы-производителя с небольшими модификациями. Подсчет живых и мертвых клеток проводили методом конфокальной сканирующей микроскопии с использованием аргонового лазера (488 нм) и проточной цитофлуориметрии. Клетки промывали ростовой средой, не содержащей сыворотку и инкубировали с кальцеином FM (2 мкМ) и гомодимером-1 этидиума бромида (4 мкМ) в течение 20 мин. Жизнеспособность клеток оценивалась как отношение клеток, окрашенных кальцеином FM (зеленая флуоресценция), ко всем окрашенным клеткам (зеленая и красная флуоресценция).

Флуоресцентное окрашивание плазматической мембраны. ЭПР и аппарата Гольджи эукариотических клеток.

Для окрашивания аппарата Гольджи клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 5 минут при комнатной температуре и инкубировали в 0.5% Triton Х-100 в течение 10 минут при комнатной температуре. Образцы блокировали с использованием 2% козьей сыворотки либо 2% бычьего сывороточного альбумина в TNT-буфере (0.1 М Tris-HCI [рН 7.5], 0.15 М NaCl, 0.05% Tween 20) от 30 до 40 минут. Затем образцы инкубировали с антителами к анти-Гольджин-97 в течение ночи при 4°С, отмывали и инкубировали с Alexa 594-конъюгированными антителами в течение ночи при 4°С, затем препараты отмывали и просушивали перед монтированием.

Окрашивание эндоплазматического ретикулума осуществляли с использованием 2 мкМ ER-Tracker в растворе Хэнкса (Биолот, Россия) в течение 15 минут и отмывали препарат перед монтированием.

Создание экспериментальной инфекции M.hominis у лабораторных мышей.

В работе использовались самки мышей линии BALB/c 6-8 недельного возраста, вес 18-22 г. Для синхронизации эстрального цикла животным вводили гексэстрол

(«Фармадон», РФ) в дозе 0.5 мг на мышь подкожно в объеме 0.05 мл четырехкратно с недельным интервалом. Заражение производили сразу после второй инъекции гормона путем интравагинального введения суспензии микоплазм в объеме 50 мкл с использованием автоматической пипетки. Используемые для заражения микоплазмы выращивали в жидкой питательной среде, концентрировали центрифугированием, трижды отмывали забуференным физиологическим раствором (pH 7,4). Титрование взвеси микоплазм производили как описано [Семененко, 1981]. Контролем служили животные, которым вместо суспензии микоплазм вводили стерильный физиологический раствор.

Вирулентность микоплазм сравнивали, определяя IDjo для каждого исследуемого штамма по формуле Кебера (Ашмарин И.П. и Воробьев A.A., 1962). Диапазон инфицирующих доз составил от 0,5x106 до 0,5x10" КОЕ/мл на мышь. Количество животных в каждой группе - 6.

Еженедельно, начиная с 1-й недели после заражения, определяли наличие микоплазм в нижних (соскоб эпителиальных клеток со слизистой влагалища) и верхних (гомогенаты асептически выделенных яичников, фаллопиевых труб и верхней трети рога матки) отделах генитального тракта. Соскобы эпителиальных клеток со слизистой влагалища собирали у всех животных в группе (п=20) с помощью одноразовых стерильных зондов (DNC Med, Россия) и вносили в 1 мл жидкой питательной среды. Для получения гомогенатов органов, еженедельно забивали по 2 мыши. Гомогенаты органов готовили как описано (Прозоровский С.В. и др., 1995). Для определения титра М. hominis готовили серийные растворы десятикратных разведений первичного материала до конечного разведения 1: Ю10в 0,5 мл жидкой питательной среды, содержащей аргинин и индикатор феноловый красный, инкубировали при 37 °С не менее 10 суток. Наибольшее разведение инокулята, при котором наблюдался рост микоплазм и изменялся цвет индикатора, принимали за титр культуры М. hominis и выражали в CCU/мл (color-changing unit, цветоизменяющие единицы на единицу объема среды).

Создание экспериментальной инфекции С.trachomatis у лабораторных мышей.

В работе использовались самки мышей линии BALB/c 6-8 недельного возраста, вес 18-22 г. Прогестерон (Depo-Provera, Великобритания) в дозе 2.5 мг на мышь вводили подкожно в объеме 0.1 мл за четыре дня до инфицирования С. trachomatis. Фракцию элементарных телец С. trachomatis (титр 10б ifu/мл) введили мышам интравагинально в объеме 50 мкл после инъекции прогестерона. Титр С. trachomatis выражали в IFU (inclusion forming unit; единица, формирующая хламидийное включение).

Соскобы эпителиальных клеток со слизистой влагалища собирали у всех животных в группе (п=20) с помощью одноразовых стерильных зондов (DNC Med, Россия) и вносили в 1 мл жидкой среды MEM. Для определения титра С. trachomatis с использованием реакции прямой флуоресценции влагалищные смывы из инфицированных мышей (разведения до 10^) вносили в линию клеток McCoy и центрифугировали при 3000xg 1 час при комнатной температуре и затем инкубировали при 37 °С 48-72 часа. Реакцию прямой иммунофлуоресценции проводили как описано выше. Подсчет количества хламидийных включений (не менее 50 полей зрения) проводили при увеличении х900.

Создание экспериментальной инфекции M.pallisepticum у цыплят-бройлеров.

В работе использовались однодневные цыплята (п=70) бройлеров породы Ross (Babolna Agricultural Company, Венгрия). Цыпляты были сертифицированы по отсутствию M.gallisepticum и M.sinoviae с использованием реакции микроагглютинации (Antigen

Nobilis, Intervet International, Голландия) и иммуноферментного анализа (MYGA test, Diagnosztikum, Венгрия). 10 однодневных цыплят из группы были забиты и исследованы с целью обнаружения патологических изменений внутренних органов и присутствия микоплазм. 60 цыпят в возрасте 21 дня были маркировали, взвешивали и разделяли на четыре группы по 15 птиц так, чтобы средняя масса тела цыплят в каждой группе достоверно не отличалась по критерию Стьюдента.

Инфицирование цыплят проводилось как описано [Whithear, 1996] с некоторыми модификациями. Цыплята были последовательно помещены в аэрозольную камеру объемом 0.224 м3 и инфицированы 10 мл культуры M.gallisepticum в титре ЗхЮ8 КОЕ/мл. Каждый инокулят был превращен в аэрозольные частицы 7-10 мкм диаметром и распылен в течение 2 мин в камере. Цыплята выдерживались в камере в течение 20 мин после распыления M.gallisepticum.

Через 10 дней все цыплята были взвешены, забиты и вскрыты для выявления патоморфологических изменений. Фиксировалось наличие катаррального экссудата в носовых и околоносовых пазухах, трахее, бронхах, повреждения воздушного мешка, конъюнктивиты, синуситы, пневмония, перигепатит и перикардит. Степень выраженности оценивали в баллах: от 0 (нет патоморфологических изменений) до 4 (сильные двусторонние изменения).

Для гистологических исследований отобирали образцы ткани трахеи, легкого, селезенки и печени. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином и исследовали с целью обнаружения утолщения и инфильтрации лимфоцитами слизистой оболочки трахеи и наличия интерстициальной пневмонии, перибронхитов, периваскулитов и катарральной пневмонии. Гистологические изменения оценивали в баллах: 0 - нет интерстициальной пневмонии и инфильтрации, 1 - очаговая инфильтрация, 2 - диффузная инфильтрация, 3 -сильная инфильтрация.

Измерение концентрации восстановленного глутатиона в линии клеток HeLa..

Клетки были обработаны 0,01% трипсином с последующим центрифугированием 1500g в течение 5 мин. Осадок трижды промывали фосфатным буфером (ФСБ). Лизис клеток проводили путем трехкратного замораживания (при -135 °С)/оттаивания. Содержание GSH в лизате определяли с использованием малеимидного реагента ThioGlol (Invitrogen, США) [Langmuir, 1996]. Калибровочную кривую получали путем разведения препарата GSH (Invitrogen, США) (0,5-8,0 мкМ) в 100 мМ фосфатном буфере, рН 7.4, содержащим ThioGlol (10 мкМ). Содержание GSH определяли путем измерения флуоресценции сразу после добавления реагента [Kagan, 1999] с использованием планшетного флуориметра "Multiscan Ascent" (LabSystems, Финляндия) (>.сх - 390 нм, ?.ет - 500 нм). Концентрация GSH была нормализована на количество общего белка в образце. Концентрацию белка определяли с использованием Protein Assay Kit (BioRad, США).

Восстановленные тиолы в живых клетках визуализировали посредством флуоресцентной микроскопии. Клетки HeLa, выращенные на покровных стеклах (5x5 мм), промывали PBS и обрабатывали реагентом BODYPY-maleimide (2 мкМ) в течение 10 мин. Флуоресценцию измеряли непосредственно после окраски с использованием конфокальной микроскопии.

Конфокальная микроскопия.

Конфокальную лазерную сканирующую микроскопию и иммунофлоресцентный анализ осуществляли с использованием конфокального флуоресцентного микроскопа Eclipse Е800 (Nikon, Япония) с VEM Epi-Fluorescence насадкой, укомплектованного аргоновым (используемая длина волны 488 нм) и гелий-неоновым (используемая длина волны 594 нм) лазерами (Nicon Corporation, Япония), под объективом бОх, ЧА 1,4 с масляной иммерсией. Конфокальные изображения с шагом по Z -оси получали с интервалом в 0.25 мкм и записывали с помощью программы EZ-C1 2.00 Software (Nikon, Япония). Изображения обрабатывали с помощью программы Image Pro-plus 5.1 (Media Cybernetics, США). Транскрипционное профилирование.

Клетки линий HeLa или 293 промывали трехкратно раствором Хенкса (Биолот, Россия) и снимали с подложки с использованием RLT буфера (Qiagen, Германия). Тотальную РНК выделяли из клеток с использованием реагента Trizol (Invitrogen, США), согласно инструкции фирмы-производителя. Концентрацию РНК определяли с использованием спектрофотометра Nanodrop (Thermo Scientific, США). 200 нг тотальной РНК амплифицировали с использованием набора Illumina® TotalPrep™ RNA Amplification Kit (Ambion, США). Амплифицированная РНК была гибридизована на чипе WG-6 (Illumina, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Анализ результатов проводился с использованием программного обеспечения GenomeStudio (Illumina, США). Дифференциальный двухмерный гель-электрофорез.

Трансфицированные клетки HeLa или 293 обрабатывали трипсином, промывали ФБС. Клеточный осадок (10 мкл) растворяли в буфере: 7М мочевина, 2М тиомочевина, 4% CHAPS, 30 mM Tris-HCl, рН 8.5. Концентрацию белков определяли с помощью Quick start Bradford реагентов (Bio-Rad, USA) и выравнивали образцы по концентрации белка (2 мг/мл). 50 мкг образцов метили 400 пМ СуЗ или Су5 CyDye DIGE Fluor флуоресцентными красителями (Amersham Biosciences, Австрия) согласно протоколу производителя. Далее полученные образцы смешивали в равных объемах со 100 мМ DTT (Bio-Rad, USA) и 2% (о/о) Ampholine 3-10 (Bio-Rad).

В первом направлении (изоэлектрофокусирование) использовали 4% ПААГ, 9М мочевину и 4% Амфолины (Pharmacia) рН 3-10, либо ИПГ стрипы 3-10 (Bio-Rad). Изоэлектрофокусирование проводили 14 000 Вч по заданной пограмме (2 ч- 250 В, 2 ч -450 В, 14 ч - 900 В). После проведения изоэлектрофокусирования ИПГ-стрипы или гели вымачивали в растворе, содержащем 125 mM TrisHCl, 40% (w/v) глицерин, 3% (w/v) ДДС, 65 mM ДДТ, рН 6.8 в течение 15 мин. После этого гель с фокусированными белками переносили во второй полиакриламидный гель с градиентом пористости ПААГ 9-16% и разделяли белки во втором направлении в присутствии 0,1% ДСН. Далее гели сканировали с помощью Typhoon Trio Imager (Amersham Biosciences, Austria) с разрешением 200 мкм и анализировали с помощью программы PDQest (Bio-Rad, USA). Дифференциально экспрессированные белковые пятна вырезали из геля, подвергали трипсинолизу и наносили на твердую подложку чипа фирмы Bruker Daltonics, смешая их с раствором коричной кислоты в этаноле, содержащем 0.1 % ТФУ.

Идентификацию белков производили методом пептидного фингерпринта на основе программного пакета Mascout [Zgoda, 2006]. Масс-спектры пептидов снимали на приборе MALDI-TOF AUTOFLEX Bruker Daltonics.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Получение и тестирование in vitro рекомбинантных конструкций, экспрессирующих ген антимикробного пептида мелиттина.

Идея использования бактерицидного эффекта не химически синтезированных АМП, а продуктов экспрессии кодирующих их генов в инфицированной клетке, реализованная в данной работе, является оригинальной. В литературе описаны единичные случаи транзиентной трансфекции клеток эукариот векторами, экспрессирующими гены АМП. Ярким примером является использование плазмидных конструкций, экспрессирующих гены цекропина и мелиттина под контролем промотора вируса лейкемии мышей для демонстрации противоопухолевого эффекта этих пептидов в клетках человека [Winde, 1998]. Однако, ни в одном из этих случаев речь не идет о бактериальных инфекциях.

На первом этапе работы был получен плазмидный вектор, в составе которого ген мелиттина находился под контролем сильного конститутивного раннего промотора цитомегаловируса человека (HCMV). Однако, после трансфекции полученным вектором клеток линии HeLa через 24 часа наблюдалась практически 100%-ная гибель клеток.

Как известно, мелиттин неселективно индуцирует пермеабилизацию мембран как про-, так и эукариот [Раро, 2003]. Механизм его цитотоксического действия описывается моделью формирования тороидальных пор, когда мелиттин, встраиваясь в липидный бислой, соединяет внешний и внутренний липидные слои в поре [Yang, 2001]. Очевидно, что время существования пор зависит от концентрации пептида. Можно предположить, что неконтролируемая экспрессия гена мелиттина под контролем одного из самых сильных из известных на сегодняшний день промоторов - раннего промотора цитомегаловируса человека приводит к формированию перманентных пор и лизису клетки.

В связи с этим, на следующем этапе работы необходимо было решить задачу точного регулирования уровня экспрессии гена мелиттина.

Одной из наиболее прецизионных систем регуляции экспрессии генов является тетрациклиновая система регуляции (Tet-On и Tet-Off) [Gossen, 1992]. Следует отметить, что до настоящего времени данная система не применялась для регулирования экспрессии генов АМП.

Ключевым компонентом системы является ген, кодирующий трансактиваторный белок tTA или rtTA. Он представляет собой составной белок из тетрациклинового протеина-репрессора (TetR - последовательность из тетрациклин-устойчивого оперона транспозона TnlO E.coli) и активаторного домена (AD) белка VP16 вируса простого герпеса. tTA связывается с последовательностью TRE-элемента (tetracycline responsive element, тетрациклин-зависимый элемент) и активирует процесс транскрипции при отсутствии тетрациклина. TRE-элемент состоит из семи копий (по 42 п.о. каждая) последовательности тетрациклинового оператора (tetO). В качестве промотора выступает

так называемый минимальный промотор цитомегаловируса человека, который неактивен в отсутствие трансактиватора.

Нами была создана серия рекомбинантных плазмид, обеспечивающих точную регуляцию экспрессии гена мелиттина в культуре клеток (рисунок 1). Поскольку для функционирования системы необходим трансактиватор, для проверки созданных плазмидных конструкций были получены линии клеток HeLa, стабильно экспрессирующие трансактиваторные белки. Линии клеток, получившие названия HeLa/Tet-On и HeLa/Tet-Off, стабильно экспрессируют гены трансактиваторных белков rtTA и tTA.

Мелиттин является катионным, а-спиральным амфипатическим пептидом, обладающим гемолитическими свойствами. В силу мембранотропности и цитотоксичности экспрессия гена мелиттина в клетках эукариот является нетривиальной задачей. Представляется необходимым контролировать наличие продукта экспрессии гена мелиттина на двух уровнях реализации генетической информации - РНК и белка.

MCS

ро'у(А) mïGFP fcj'minCMV2)aiRE;1 PminCMVl^a^ poly(A) pBI-EGFP

пи^^д i i I m и^д i........ jffipm'i'lfr |||||,| пи pBl/mel2

PminC.W'l poly(A) '■ pBI/mel2AGFF

■ P ,. al VP16AD ■poly(A).neo^ pTet-On(Off)

Рисунок 1. Схема плазмидных конструкций системы точной регуляции экспрессии генов Tet-On и Tet-Off, использованных в работе.

Pcmv- ранний промотор цитомегаловируса человека

Р minCMv- минимальный ранний промотор цитомегаловируса человека

GFP - green fluorescent protein (ген «зеленого белка»)

TRE - тетрациклин-зависимый элемент

SV40ori - точка начала репликации вируса SV40

Melittin - ген мелиттина

Ро1у(А) - сигнал полиаденилирования

(r)TetR - последовательность из тетрациклинового оперона транспозона TnlO E.coli VP16AD - активаторный домен белка VP16 вируса простого герпеса.

На первом этапе, с использованием обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции, продемонстрирована экспрессия гена мелиттина в линии клеток HeLa/Tet-On после трансфекции ее плазмидным вектором pBI/mel2AGFP (рисунок 2А).

Таким образом, была показана экспрессия гена мелиттина в полученных клетках HeLa/Tet-On. Однако, наличие мРНК гена, в ряде случаев, автоматически не означает наличие соответствующего белкового продукта, в частности, из-за быстрой деградации молекул мРНК, особенностей ее структуры и т.д. Поэтому следующей нашей задачей стала детекция молекул пептида в трансфицированных линиях.

Для реализации этой задачи необходимо было получить поливалентную сыворотку против пептида мелиттина. Мелиттин является 100% гемолитическим агентом, поэтому получение антител к пептиду довольно затруднено. Мы решили эту проблему путем сшивки молекул мелиттина глутаровым альдегидом и оптимизации схемы введения антигена. Эмульсию пептида в полном адъюванте Фрейнда в соотношении 1:1 троекратно вводили мышам линии ВАЬВ/с подкожно с интервалом 12-14 дней. После получения, сыворотку тестировали в реакции дот-гибридизации. На рисунке 2Б видно, что полученная нами поливалентная сыворотка мышей против мелиттина, во-первых, специфически взаимодействует с очищенным препаратом мелиттина, и, во-вторых, в линии клеток НеЬа/ТеЮп, трансфицированной плазмидным вектором рВ1/ше12ДОРР, мы детектируем целевой пептид.

A. Б. В.

Рисунок 2. А. ОТ-ПЦР анализ экспрессии гена мелиттина в линии клеток HeLa/Tet-On. Линия клеток была трансфицирована плазмидным вектором pBI/mel2AGFP, выделена тотальная РНК, проведена реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция с использованием специфических олигонуклеотидов. М - маркер молекулярной массы (Gene Ruler DNA Ladder Mix, Fermentas, Литва)

1 - отрицательный контроль (в реакционную смесь не добавлялась обратная транскриптаза)

2 - ОТ-ПЦР анализ трансфицированной линии HeLa/Tet-On.

3 - положительный контроль (в качестве матрицы для ПЦР использовали плазмидный вектор pBI/mel2AGFP).

Б. Детекция мелиттина с использованием дот-блот гибридизации. Лизат (1% Тритон X-100) клеток линии HeLa/Tet-On, трансфицированной плазмидным вектором pBI/mel2AGFP, нанесен на нитроцеллюлозный фильтр (дорожка 2). Препарат мелиттина в количестве от 1 до 100 нг также нанесен на фильтр (дорожка 1).

B. Иммуноцитохимический анализ экспрессии мелиттина. Трансфицированная линия клеток была обработана полученной поливалентной сывороткой к мелиттину.

Наконец, мы детектировали мелиттин с помощью иммуноцитохимического метода. Клетки были трансфицированы тем же вектором, через 24 часа зафиксированы, обработаны полученной поливалентной сывороткой к мелиттину и конъюгатом антимышиные IgG-FITC. На рисунке 2В видно, что с использованием данного метода мы подтвердили наличие пептида в трансфицированных клетках.

Таким образом, показав наличие продукта экспрессии гена мелиттина в клетках, трансфицированных полученными рекомбинантными векторами, на уровне мРНК и белка, мы перешли к тестированию биологической активности мелиттина, а именно, к изучению влияния экспрессии гена этого АМП на развитие микоплазменной и хламидийной инфекций в клетках эукариот.

Линию клеток HeLa/Tet-Off трансфицировали плазмидным вектором pBI/mel2AGFP. Через 24 часа после трансфекции линия была инфицирована С. trachomatis. Учет результатов с помощью люминесцентной микроскопии проводили через 24 и 48 часов после заражения. По данным люминесцентной микроскопии, (таблица 1) ингибирование инфекции C.trachomatis в линии клеток HeLa/Tet-Off через 24 часа составило 60%, а через 48 часов - 75%. В качестве контроля использовали линию HeLa/Tet-Off, трансфицированную плазмидным вектором pBI/AGFP. Данный плазмидный вектор отличается от целевого отсутствием гена мелиттина.

Таблица 1. Ингибирование инфекции C.trachomatis в линии клеток HeLa/Tet-Off после

трансфекции плазмидным вектором pBI/mel2AGFP.

Время после инфекции 24 часа 48 часов Среднее количество включений в поле зрения

Линия инфицирована, трансфицирована плазмидным вектором рВ1/ДСРР 13,0+/-1,6 12,8+/-2,8

Линия инфицирована, трансфицирована плазмидным вектором рВ1/те12АОРР 5,2+/-1,1 3,2+/-1,2

Помимо уменьшения количества хламидийных включений, мы наблюдали замедление их созревания.

Подобный экспреримент был проведен и на инфекционной модели МАотшй, однако, в данном случае мы использовали линию HeLa/Tet-On. Эта линия клеток была трансфицирована плазмидным вектором рВ1/те12ДОРР. Через 24 часа после трансфекции линию инфицировали М.Ьоттк. Для индукции экспрессии гена мелитина в ростовую среду добавляли доксициклин в концентрации 0,04 мкг/мл. Минимальная ингибирующая концентрация доксициклина для М.Ао/яши (штамм Н34) составляет 0,1 мкг/мл. Учет результатов с помощью люминесцентной микроскопии и измерения интенсивности флуоресценции проводили через 48 часов после заражения. Результаты эксперимента приведены на рисунке 3.

По результатам измерения интенсивности флуоресценции видно, что ингибирование инфекции М.Иоттк составило 65%, что соответствует и данным, полученным с помощью люминесцентной микроскопии.

Необходимо отметить, что в нетрансфицированных линиях клеток, инфицированных М.коттк или СлгасЪота1'к при наличии в ростовой среде доксициклина, интенсивность флуоресценции сходна с таковой в трансфицированной

линии клеток, но без добавления доксициклина. Это означает, во-первых, отсутствие неконтролируемой экспрессии мелитина, и, во-вторых, что выбранная нами концентрация индуктора (доксициклина) не влияет на развитие инфекционного процесса.

2.2. Получение и тестирование tn vivo рекомбинанных конструкций, экспрессирующих ген антимикробного пептида мелиттина.

2.2.1. Создание инфекционной модели M.hominis.

Для создания инфекционной модели М. hominis необходимо было решить ряд задач: i) выбор лабораторного животного; ii) сравнительное изучение способности клинических штаммов М. hominis колонизировать генитальный тракт лабораторного животного; iii) описание экспериментальной инфекции и отбор штамма, с наиболее выраженными вирулентными свойствами для дальнейших исследований.

мое. ...........................................................

I 11

'LULiu

А Б В

Рисунок 3. Ингибирование инфекции M.hominis в линии клеток HeLa/Tet-On после трансфекции плазмидным вектором pBI/mel2AGFP.

А - линия клеток HeLa/Tet-On, инфицированная M.hominis, трансфицированная плазмидным вектором pBI/ÄGFP (концентрация доксициклина в ростовой среде 0.04 мкг/мл)

Б - линия клеток HeLa/Tet-On, инфицированная M.hominis и трансфицированная плазмидным вектором pBI/mel2AGFP (доксициклин в ростовой среде отсутствует). В - линия клеток HeLa/Tet-On, инфицированная M.hominis и трансфицированная плазмидным вектором pBI/mel2AGFP (концентрация доксициклина в ростовой среде 0.04 мкг/мл).

Мы выбрали 3 штамма М. hominis: лабораторный штамм Н-34 и два клинических -574 и 1862.3, последний содержал детерминанту устойчивости к тетрациклину. Перед инфицированием мы провели предварительную обработку мышей эстрадиолом. Для синхронизации эстрального цикла животным вводили гексэстрол четырехкратно с недельным интервалом.

Заражение животных на фоне гормональной обработки приводило к колонизации слизистой влагалища M.hominis. Однако, длительность выделения возбудителя и выраженность воспалительной реакции существенно отличались между испытуемыми штаммами.

Для повышения адгезивных свойств клинические штаммы были трехкратно пассированы через слизистую влагалища мышей линии Balb/c, что привело к повышению колонизационной способности испытуемых штаммов. Таким образом, длительность выделения микоплазм увеличилась для штамма 1862.3 в 7 раз (7 недель против 1), для штамма 574 - в 2 раза (6 недель против 3), 100% выявление микоплазм у инфицированных мышей наблюдалось в течение первых двух недель после заражения. Суммарные титры микоплазм для 3-го пассажа представлены в таблице 2.

2.2.2. Создание инфекционной модели C.trachomatis.

Известно, что у микоплазм, как и у хламидий, существуют штаммы, патогенные только для мышей. Однако, как и в случае с M.hominis, мы намеренно выбрали серовар хламидий, вызывающий урогенитальный хламидиоз у человека, а именно серовар D (D/UW-3/Cx, АТСС VR-885, MIC доксициклина 0.08 мкг/мл). Выбор именно лабораторного штамма, а не клинического изолята C.trachomatis, объясняется сложностью культивирования последнего даже в линии клеток McCoy. Попытки инфицировать мышей полученными нами клиническими изолятами хламидий, в том числе и устойчивыми к различным антибиотикам, не увенчались успехом.

Таблица 2. Динамика выделения штаммов М. hominis 574 и 1862.3 из влагалища мышей линии BALB/c (третий пассаж штаммов).

Титр М.Ьотта во влагалищных смывах инфицированных мышей ССи/мл) по срокам наблюдения, М + т

1 неделя 2 неделя 3 неделя 4 неделя 5 неделя б неделя 7 неделя 8 неделя

Штамм M.hominis 574 (3 пассаж) 7,9±1,1 5,9±1,3 3,5±0,9 2,4±1,1 1,2±1,1 0 0 0

Штамм M.hominis 1862.3 (3 пассаж) 8,3±0,8 6,4±1,2 4,9±1,1 4,7±1,3 7,2±1,8 3,0±1,9 1,8±1,8 0

Как и в предыдущем случае, интравагинальное заражение мышей испытуемым штаммом в различных инфицирующих дозах не приводило к колонизации генитального тракта животных хламидиями.

Для индуцирования пролонгированного диэструса (и, таким образом, увеличения скорости начальной фазы хламидийной инфекции) самкам мышей линии BALB/c 6-8 недельного возраста вводили прогестерон за четыре дня до инфицирования. Фракция элементарных телец С. trachomatis вводилась мышам интравагинально после инъекции прогестерона. Через определенные интервалы времени у мышей брались соскобы со слизистой оболочки влагалища, которыми заражались клетки линии МсСоу. После гормональной обработки длительность выделения возбудителя из организма достигала 35-ти дней (таблица 3).

Таблица 3. Динамика выделения C.trachomatis из влагалища мышей линии Balb/c.

Количество включений в поле зрения (х 400), по срокам наблюдения (дни)

2-й 6-й 9-й 13-й 16-й 20-й 27-й 34-й

3,1+0,6 2,03±0,81 1,16±0,27 1,25±0,64 0,60±0,12 0,28±0,08 0.75±0,31 0,13±0,02

Как и в случае с микоплазмами, интравагинальное введение хламидий приводило к инфицированию только нижних отделов генитального тракта. Заражение гомогенатами органов верхних отделов генитального тракта (яичники, фаллопиевы трубы и верхняя треть рога матки) линии клеток МсСоу не дало положительных результатов.

К сожалению, оказалось безуспешным и пассирование данного штамма хламидий через слизистую оболочку мышей для повышения его способности к более длительной колонизации. Это вполне можно объяснить биологическими особенностями хламидий -облигатных внутриклеточных паразитов. После первого пассажа для достижения титра хламидий, необходимого для вторичного пассирования, требуется провести более 10 пассажей в культуре клеток МсСоу. За это время вирулентные свойства материнских хламидий, видимо, нивелируются.

Таким образом, мы разработали стабильно воспроизводящиеся модели урогенитального микоплазмоза и хламидиоза, подходящие для тестирования созданных нами рекомбинантных конструкций, экспрессирующих гены АМП.

2.2.3. Получение плазмидных конструкций, экспрессирующих ген мелитина для экспериментов in vivo.

Тестирование созданных плазмидных конструкций in vivo в нашем случае осложнялось тем, что в разработанной системе точного регулирования экспрессии генов, целевой ген под контролем минимального промотора цитомегаловируса человека и трансактиваторные белки (rtTA или tTA) находятся в разных плазмидных векторах. Известно, что эффективность котрансфекции двумя и более плазмидными векторами несравнимо ниже, нежели эффективность трансфекции одним вектором. Поэтому на следующем этапе работы мы создали однокассетный вектор, который содержал все необходимые элементы системы точной регуляции экспрессии генов.

Ген, кодирующий трансактиваторный белок rtTA, был получен путем ПЦР-амплификации соответствующего участка с использованием в качестве матрицы плазмиды pTet-On с введением в олигонуклеотидные праймеры сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции. Затем, полученный ген был клонирован в полученный ранее плазмидный вектор pBI/mel2. В результате вектор, получивший название pBI/mel2/rtTA/GFP, содержал ген мелиттина под контролем тетрациклин-зависимого промотора CMV и ген трансактиваторного белка rtTA под контролем конститутивного раннего промотора CMV, а также маркерный ген gfp и все необходимые регуляторные элементы.

Таким образом, нами впервые был сконструирован плазмидный вектор, объединяющий в себе все элементы двуплазмидной системы тетрациклин-зависимой регуляции экспрессии генов. Успешное тестирование функциональной активности полученного вектора в культуре клеток позволило перейти к его применению на лабораторных животных.

2.2.4. Тестирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген мелиттина у мышей, инфицированных M.hominis, C.trachomatis и M.gallisepticum.

Мыши были разделены на несколько групп (по 6 животных в каждой группе, 2 независимых эксперимента):

Контрольная группа - мыши не инфицированы, плазмидный вектор и доксициклин не вводился.

Группа №1 - мыши инфицированы М. hominis или С. trachomatis без введения плазмидного вектора pBI/mel2/rtTA и доксициклина.

Группа №2 - мыши инфицированы М. hominis или С. trachomatis, введен доксициклин (2 мкг/мышь для М. hominis и 1 мкг/мышь для С. trachomatis).

Группа №3 - мыши инфицированы М. hominis или С. trachomatis, введен доксициклин и плазмидный вектор pBI/mel2/rtTA

Суспензии микоплазм и хламидий, а также плазмидный вектор вводились интравагинально, доксициклин - внутримышечно. Рекомбинантный вектор вводился двукратно: за 24 часа до заражения М. hominis или С. trachomatis и через 14 дней после заражения в количестве 2 мкг ДНК/мышь. Через определенные интервалы времени

делались урогенитальные мазки и определялся титр патогена. Экспрессия гена мелиттина была подтверждена с использованием реакции обратной транскрипции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией.

После введения рекомбинантного вектора pBI/mel2/rtTA и последующего инфицирования мышей мы наблюдали ингибирование инфекции M.hominis. Результаты приведены в таблице 4. Титр M.hominis во влагалищных смывах мышей в контрольной группе №1 варьировал, снижаясь от 5.9 до 2.4 logio CCU/ml в течение четырех недель. В то же время, в третьей группе мышей, которым до инфицирования вводился рекомбинантный вектор pBI/mel2/rtTA совместно с доксициклином, титр M.hominis находился в пределах от 4.1 до 1.8 logiо CCU/ml.

В случае введения плазмидного вектора pBI/mel2/rtTA и последующего инфицирования мышей С. trachomatis уровень ингибирования инфекции составлял от 45% до 80% (таблица 5).

Несмотря на то, что мы не обнаружили полного освобождения мышей от микоплазм и хламидий в пределах сроков наблюдения, скорость элиминации возбудителя в группе №3 была выше, чем в контрольных группах. Однако, более интересно оказалось проследить развитие инфекционного процесса у индивидуального животного, поскольку техническая погрешность при трансфекции может изменить картину. Так, 6 мышей из 12ти в группе 3 была свободна от возбудителя уже к 21 дню после инфицирования, в то время как в группе 1 и 2 все мыши были оставались инфицироваными. Среди мышей группы 3, инфицированных хламидиями, у 4х из бти мышей к 27му дню хламидии не детектировались.

Необходимо отметить, что мы не получили статистически достоверных отличий в титрах между группами мышей №1 и №2, инфицированных M.hominis или С. trachomatis, что говорит, во-первых, об отсутствии неконтролируемой экспрессии гена мелитина, во-вторых, выбранная нами концентрация индуктора (доксициклина) не влияет на развитие инфекционного процесса.

Кроме того, дополнительное введение вектора pBI/mel2/rtTA через 14 дней и через 28 дней после инфицирования мышей не приводило к существенному ингибированию инфекции M.hominis и С. trachomatis. Вероятно, это связано со снижением эффективности доставки вектора в инфицированную клетку.

Нами был обнаружен интересный факт, что у мышей в группе 3 воспалительная реакция на слизистой оболочке влагалища была гораздо менее выражена, нежели у мышей группы 1 и 2, что показало исследование влагалищных мазков.

Таким образом, мы впервые продемонстрировали ингибирование урогенитального микоплазмоза и хламидиоза человека in vivo после введения мышам плазмидного вектора, экспрессирующего ген мелитина под контролем тетрациклин-зависимого промотора цитомегалавируса.

На следующем этапе нам удалось показать, что созданные прототипы генно-инженерных препаратов способны подавлять рост природных патогенов животных. Для

этого мы использовали инфекционную модель Mycoplasma gallisepticum -респираторного патогена птиц, применив аэрозольное введение рекомбинантных плазмид.

Mycoplasma gallisepticum вызывает тяжелые хронические респираторные заболевания у кур и синуситы у индеек [Davidson, 1982]. Экономические потери при инфицировании M.galliseplicum обуславливаются снижением яйценоскости и массы тела на 10-20%, увеличением смертности цыплят на 5-10% [Mohammed, 1987].

Если в предыдущих случаях мы создавали инфекционную модель урогенитального микоплазмоза и хламидиоза у мышей путем гормональной обработки лабораторных животных, пассированием патогена через слизистую оболочку влагалища для достижения более длительной колонизации тканей, то, в данном случае, M.gallisepticum является естественным патогеном кур. Более того, чрезвычайно интересным кажется оценка эффективности действия плазмидных конструкций, экспрессирующих ген мелитгина, вводимых аэрозольным путем, поскольку, если говорить о практическом применении этих прототипов генно-инженерных препаратов, то такой путь кажется экономически оправданным.

Для тестирования рекомбинантных плазмид животные были разделены на несколько групп (в каждой группе по 15 птиц). Деление птиц на группы описано в таблице 6.

Первая группа цыплят не была инфицирована M.gallisepticum и рекомбинантный плазмидный вектор pBI/mel2/rtTA не вводился. Цыплята второй группы были инфицированы M.gallisepticum, рекомбинантный плазмидный вектор pBI/mel2/rtTA также не вводился. Цыплятам третьей группы был введен плазмидный вектор за 5 часов до инфицирования M.gallisepticum, а также за 24 и 5 часов до инфицирования внутримышечно вводился индуктор транскрипции гена мелитина - доксициклин. Цыплятам четвертой группы вводился доксициклин (в такой же дозе и с такими же интервалами), с последующим инфицированием M.gallisepticum. Цыплятам этой группы рекомбинантный плазмидный вектор pBI/mel2/rtTA не вводился.

Для мониторинга течения инфекции производился ежедневный осмотр, фиксировались респираторные шумы, измерялась масса тела. Перед забоем была взята кровь для проведения серологических исследований. После вскрытия были исследованы патологоанатомические изменения, характерные для этой микоплазменной инфекции, гистологические исследования внутренних органов, произведен микробиологический посев мазков из внутренних органов.

У цыплят всех групп была измерена масса тела за 24 часа до заражения и через 9 дней после заражения M.gallisepticum и введения рекомбинантного плазмидного вектора pBI/mel2/rtTA. Масса тела цыплят в группе 1 к моменту забоя составила 817,5 ± 229,0 г. В группе 2 мы наблюдали статистически достоверное снижение средней массы тела цыплят - 638 ± 124 г. Что же касается группы 3, то средняя масса тела цыплят в этой группе статистически не отличалась от таковой в группе 1, и составила 794 + 194 г.

Таблица 4. Влияние экспрессии гена мелиттина на динамику изоляции Mycoplasma hominis из урогенитального тракта инфицированных

мышей.

Титр logio CCU/ml

Дни после

инфекции 7 14 21 28

Группа/животное 1 группа 2 группа 3 группа 1 группа 2 группа 3 1 группа 2 группа 3 группа 1 группа 2 группа 3 группа

группа

al 5 6 6 5 5 6 6 5 6 5 3 5

а2 4 8 4 2 4 3 1 5 3 0 4 5

аЗ 6 6 0 4 4 0 5 4 0 6 2 0

а4 7 7 8 6 5 6 5 5 6 4 4 4

а5 7 8 5 4 4 2 6 4 0 4 5 0

аб 5 5 4 2 4 0 2 3 0 0 3 0

а7 6 7 6 3 5 5 6 6 6 4 4 3

а8 6 8 3 3 5 2 5 5 3 0 3 3

а9 8 8 0 5 5 0 6 4 0 3 0 0

а10 8 6 6 6 4 5 5 5 6 2 4 2

all 5 7 5 2 4 1 2 4 0 1 4 0

а12 4 6 3 4 3 0 1 2 0 0 1 0

M±m 5,92+0,47 6,83±0,34 4,17+0,69 3,83±0,42 4,33+0,19 2,5+0,7 4,17+0,59 4,33+0,31 2,50+0,81 2,42+0,63 3,08+0,42 1,83±0,60

Р* 0,051 0,128 0,37 0,194

р** 0,028 0,029 0,029 0,25

р*** 0,0029 0,0068 0,0055 0,0292

* Р (t test) среднего Iogio CCU U/мл для сравнения 1 группы и 2

** Р (t test) среднего logio CCU/мл для сравнения 1 группы и 3

*** Р (t test) среднего logio CCU/мл для сравнения 2 группы и 3

Таблица 5. Влияние экспрессии гена мелиттина на динамику изоляции Chlamydia trachomatis из урогенитального тракта инфицированных

мышей.

Животные Посев (IFU/ml) на указанный день после инфеции

2 6 9 13 16 20 27

группа 1

al 11275 7934 5846 3758 2297 1462 1253

а2 17539 14150 6264 3758 2506 1879 2716

аЗ 19627 14616 7934 18374 4385 2088 4178

а4 12946 8490 2506 2088 2297 626 836

а5 9187 2923 1670 2088 1879 369 418

аб 7099 2830 1253 1253 1670 0 0

М± m 12950+1974 8490+2105 4250±1138 5220+2662 2506+396 1071±350 1567±647

группа 2

al 7934 7098 1670 5011 2088 1044 1044

а2 16704 12804 6680 10750 3260 1840 3341

аЗ 8352 7517 2300 5011 1670 918 1044

а4 17539 12108 5429 4176 1670 626 960

а5 12528 10021 5011 2500 2500 835 1460

аб 12528 8977 2500 1670 1670 626 960

М± m 12597±1644 9754±959 3930±832 4853+1303 2143+261 9811184 1468±382

группа 3

al 7099 3758 2506 2506 2088 0 0

а2 5846 2088 2506 1670 835 626 418

аЗ 5220 2088 835 835 418 209 0

а4 6682 1253 1253 3341 626 209 0

а5 9605 5429 2506 2088 1253 835 1671

аб 6682 1670 1920 2088 1253 369 0

М±ш 6850±616 2710+645 1921+297 2088+341 1079+244 375+125 348+273

Р* 0,258 0,338 0,193 0,128 0,207 0,43 0,453

р** 0,018 0,029 0,045 0,156 0,009 0,063 0.027

р*** 0,01 <0,0001 0,03 0,044 0,000251 0,00064 0,046

После забивки цыплят никаких признаков инфицирования М.%аШ$ерИсит в воздушных мешках и брюшной полости у животных в группе 1 обнаружено не было (Таблица 7). В то же время, у всех цыплят второй группы обнаруживался аэросаккулит и перитонит со средним баллом 110. В группе 3, у четырех птиц отсутствовали патологические изменения, а у десяти диагностировался аэросаккулит и перитонит с общим баллом 42. В то же время, все птицы в группе 4 демонстрировали сходные патологические изменения (общий балл 100) с группой 2.

Таблица 6. Разделение цыплят бройлеров на группы.

Группа М^аИкерйсит Плазмидный вектор рВ1/ше12/г1ТА Доксициклин

Группа 1 - -

Группа 2 + - -

Группа 3 + + +

Группа 4 + - +

Таблица 7. Патологические изменения, наблюдаемые у забитых цыплят различных групп, через 9 дней после инфицирования (общий балл).__

Левый грудной Правый грудной Брюшина Общий балл

воздушный воздушный

мешок мешок

Группа 1 0 0 0 0

Группа 2 32 45 33 110

Группа 3а 12 10 20 42

Группа 4 ь 29 39 32 100

"Различия статистически достоверны между группой 3 и группами 1,2,4; Р< 0.001. 6 Различия статистически недостоверны между группой 4 и группой 2.

Еще один важный диагностический признак инфекции М.^аШзерйсит - утолщение слизистой оболочки трахеи. При гистологическом исследовании у цыплят в контрольной группе 1 толщина слизистого слоя трахеи составляла в среднем 80 мкм. У цыплят в группе 2 толщина слизистого слоя трахеи, благодаря лимфогистиоцитической инфильтрации, была статистически достоверно больше и составляла в среднем 177,1 мкм. В то же время среднее значение толщины слизистого слоя трахеи у цыплят в группе 3 статистически не отличалось от таковой в группе 1, а в группе 4 этот показатель был значительно выше (таблица 8).

У цыплят в группе 1 никаких патологических изменений при гистологическом исследовании не обнаруживалось. Выраженные клинические симптомы интерстициальной пневмонии, бронхита и перибронхита обнаруживались у птиц в группе 2 с общим баллом 29 и 25, соответственно. У 7 из 14 цыплят также наблюдалась катаральная пневмония с общим баллом 14. Значительно менее выраженные клинические симптомы бронхита, перибронхита и интерстициальной пневмонии наблюдались в группе

3 (общий балл 14 и 7, соответственно). Лишь у одного цыпленка из этой группы наблюдалась катаральная пневмония. В то же время у цыплят в группе 4 бронхит, перибронхит и интерстициальная пневмония развивались также, как и у цыплят в группе 2 (таблица 8).

Таблица 8. Гистологическое исследование тканей респираторного тракта цыплят в различных группах.

Легкие3 Трахея

Бронхит Интерстициальная Катаральная Утолщение, Инфильтрация

Перибронхит пневмония пневмония мкм

Группа 1 0 0 0 80 0

Группа 2 29 25 14 177,1 26

Группа 3 0 14 7 1 97,1 12

Группа 4" 25 23 12 133,6 23

а Общий балл

6Различия статистически достоверны между группой 3 и группами 1,2,4; Р< 0.01. * Различия статистически недостоверны между группой 4 и группой 2.

Что касается реизоляции возбудителя, то, как видно из таблицы 9, М. gallisepticum была успешно выделена из органов респираторного тракта (трахея, легкие и воздушные мешки) цыплят группы 2 в Зб-ти образцах из 42, а также в 18ти из 56 образцов внутренних органов (печень, селезенка, почки и сердце). В то же время, из органов респираторного тракта цыплят группы 3 М. gallisepticum выделялась в 30 случаях из 42, и только в 6 (!) из 56 образцов внутренних органов. Удивителен факт, что из печени, селезенки и сердца цыплят этой группы ни в одном случае М. gallisepticum не была выделена. Частота выделения М. gallisepticum из органов респираторного тракта и внутренних органов цыплят группы 4 была сходна с таковой у цыплят группы 2.

Что касается серологических исследований, то до экспериментального инфицирования у цыплят всех групп антитела к M.gallisepticum не обнаруживались в реакции микроагглютинации (SPA- тест) и ИФА. Через 9 дней после инфицирования антитела к M.gallisepticum обнаруживались у цыплят в группах 2, 3 и 4 с помощью SPA теста (таблица 10).

Заметим, что клинические, патоморфологические, гистологические и серологические показатели цыплят группы 4, которые были инфицированы M.gallisepticum и которым вводился только доксициклин, оказались сходны с таковыми у цыплят группы 2. Это означает, что выбранная нами концентрация индуктора -доксициклина (разовая доза доксициклина была в 7 раз меньше МИК для выбранного штамма M.gallisepticum) не влияет на развитие инфекционного процесса.

Таким образом, на первом этапе работы мы показали, что полученные рекомбинантные плазмидные конструкции, экспрессирующие ген мелиттина, эффективно

подавляют развитие инфекции ММоття и С. ¡гасЬотаИэ в культуре клеток. Мы также успешно протестировали полученные конструкции на созданных нами моделях урогенитального микоплазмоза и хламидиоза у лабораторных мышей. Кроме того, мы продемонстрировали эффективную элиминацию естественного патогена птиц -М^аШхерИсит из инфицированных цыплят-бройлеров после аэрозольного введения данных плазмид.

Таблица 9. Реизоляция М^аШхерИсит из органов респираторного тракта и внутренних органов.__

Орган Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4

Респираторный тракт Трахея 0/14а 14/14 14/14 14/14

Воздушные мешки 0/14 12/14 10/14 14/14

Легкие 0/14 10/14 6/14 11/14

Общее количество ре-изоляций 0 36й 30 39

Внутренние органы Печень 0/14 4/14 0/14 3/14

Селезенка 0/14 3/14 0/14 4/14

Почки 0/14 8/14 6/14 7/14

Сердце 0/14 3/14 0/14 3/14

Общее количество ре-изоляций 0 18 6" 17

Количество цыплят, из которых была выделена М^аШзерИсит относительно общего числа птиц.

6 Различия статистически недостоверны между группой 2 и группами 3, 4. в Различия статистически достоверны между группой 3 и группами 2 и 4, Р< 0.01.

Таблица 10. Серологическое исследование сыворотки крови цыплят, инфицированных

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4

24 часа до инфицирования 0а 0 0 0

9 дней после инфицирования 0 54 33° 50"

а Общий балл

6 Различия статистически достоверны между группой 3 и группами 1,2,4; Р< 0.001. 1 Различия статистически недостоверны между группой 4 и группой 2.

Основываясь на полученных результатах, можно сделать первое предположение, что одним из механизмов ингибирования микоплазменной и хламидийной инфекции при внутриклеточной экспрессии гена мелитина in vitro и in vivo является прямое бактерицидное действие. Однако, исходя из уникальных биологических свойств АМП, трудно представить, что механизм их действия ограничивается простым бактерицидным эффектом.

2.3. Исследование механизмов антибактериального действия ЛМП при экспрессии их генов в инфицированной клетке.

2.3.1. Изменение трансмембранного потенциала при экспрессии гена мелиттина.

Известно, что в мембранах мелиттин принимает а-спиральную конформацию, что подтверждается многочисленными исследованиями, выполненными на мембраномиметиках, таких как мицеллы, обратные мицеллы, липосомы. Молекулярные механизмы взаимодействия пептида с мембраной клетки достаточно хорошо изучены, однако, все исследования проводили с использованием химически синтезированных пептидов [МаИаИса, 2009]. До настоящего исследования полностью отсутствовала информация о влиянии мелиттина на мембрану клетки при его эндогенной экспрессии.

В первую очередь мы изучили изменение трансмембранного потенциала клетки при экспрессии гена мелиттина. Для измерения трансмембранного потенциала клеток Не]1а/Те1-(Ж после трансфекции плазмидным вектором рВ1/ше12АОРР, экспрессирующим ген мелитина, использовали потенциал-зависимый флуоресцентный зонд ДСМ [Коэткоу, 1991].

Измерение флуоресценции зонда проводили через 48 часов после трансфекции. Как видно на рисунке 4, экспрессия гена мелитина в трансфицированной клетке приводит к уменьшению ее трансмембранного потенциала более чем в 2 раза. При деполяризации клеток (эквимолярная замена в инкубационном буфере ионов на ионы К+) также наблюдается разница между трансмебранными потенциалами трансфицированной и нетрансфицированной линиями клеток.

Ыа+-буфер К+-буфер А В А В

Рисунок 4. Изменение трансмембранного потенциала клеток НеЬа/Те1-(Ж после трансфекции плазмидным вектором рВ1/те12ДОРР с использованием потенциал-чувствительного зонда ДСМ: А - нетрансфицированная линия клеток;

В - линия клеток, трансфицированная плазмидным вектором рВ1/те12ДОРР

- буфер - раствор Хенкса К+ - буфер - раствор Хенкса, ионы замещены на ионы К+.

Несомненно, как было сказано выше, одним их механизмов действия мелиттина, приводящим к ингибированию инфекции M.hominis и C.trachomatis в культуре клеток, является его прямое цитотоксическое действие на эти бактерии. Вместе с тем, показано [Beven, 1997], что обработка микоплазм амфипатическими пептидами, такими как цекропин А, мелиттин, маганин 2 приводит к деполяризации их плазматических мембран, изменению морфологии и уменьшению подвижности. Основываясь на этих результатах, мы можем сделать второе предположение о возможном механизме действия мелиттина. Экспрессия гена мелитина приводит к снижению трансмембранного потенциала трансфицированной клетки, что, в свою очередь, нарушает процесс адгезии микоплазм и хламидий к клетке и, таким образом, изменяет нормальный цикл их внутриклеточного развития [Razin, 1992].

2.3.2. Роль внутриклеточного восстановлено™ глутатнона в развитии инфекции Chlamydia trachomatis.

Структурная жесткость ЭТ хламидий определяется чрезвычайно сшитой природой комплекса белков наружной мембраны. Меж- и внутримолекулярные цистеиновые мостики обнаруживаются в цистеин-богатых белках наружной оболочки ЭТ, таких как OmpA, ОтсВ, ОтсА [Hatch, 1999]. Однако, восстановитель дисульфидных связей в наружной оболочке ЭТ в процессе его интернализации до сих пор остается неизвестным.

Мы предположили, что таким агентом в клетке может являться восстановленный глутатион (GSH). В эукариотических клетках концентрация глутатиона варьирует в пределах 0.1 - 10 мМ [Meister, 1983].

На первом этапе мы определили изменение уровня восстановленного глутатиона в клетке при экспрессии гена мелиттина.

Клетки линии HeLa трансфицировали плазмидным вектором pBI/mel2/rtTA, в ростовую среду был добавлен доксициклин (0,02 мкг/мл) и через 24 часа был измерен уровень глутатиона. В качестве контроля использовалась также трансфицированная линия клеток без добавления индуктора.

Как видно на рисунке 5, через 24 часа после трансфекции мы наблюдается достоверное (Р<0,05) снижение концентрации восстановленного глутатиона.

Поскольку мы наблюдаем снижение концентрации GSH в клетках, трансфицированных плазмидным вектором, экспрессирующим ген мелиттина, далее логично выяснить, как влияет изменение уровня GSH на развитие хламидийной инфекции.

прямое окисление GSH перекисью водорода, а также культивирование клеток в присутствии N- ацетил-Ь-цистеина (NAC), который является предшественником GSH.

После обработки клеток BSO через 48 часов мы измеряли концентрацию GSH с помощью малеимидного реагента ThioGlol. Концентрация BSO варьировала в пределах от 1 до 500 мкМ. На рисунке 6 представлена зависимость изменения уровня GSH от концентрации BSO.

Dox 0,02 мкг/мл

Рисунок 5. Изменение концентрации внутриклеточного восстановленного глутатиона через 24 часа после трансфекции клеток линии НеЬа плазмидным вектором рВ1/те12/пТА.

100

С? 80

BSO (мкМ)

0 100 200 500

BSO(mkm)

А. Б.

Рисунок 6. Изменение уровня GSH в линии клеток HeLa при различных концентрациях BSO и определение влияния BSO на жизнеспособность клеток HeLa. А. Клетки были обработаны BSO в концентрации от 1 до 500 мкМ и инкубировались в течение 48 часов. Измерение GSH проводилось с помощью малеимидного реагента ThioGlo 1.

Б. Определение цитотоксического эффекта различных концентраций BSO на клетки линии HeLa.

Поскольку ВЭО является необратимым ингибитором у-глутамилцистеин синтетазы, мы оценивали жизнеспособность клеток после модуляции в них концентрации

глутатиона. При концентрации BSO 250 мкМ количество живых клеток снижается на 4% по сравнению с контролем, а при концентрации BSO 500 мкМ - на 6%, причем статистически достоверных отличий в цитотоксическом эффекте BSO на клетки HeLa при его различных концентрациях не было выявлено (рисунок 6 Б).

Другой GSH - модулирующий агент, NAC (1Ч-ацетил-1.-цистеин) является тиолом, предшественником L-цистеина и восстановленного глутатиона, источником сульфгидрильных групп в клетке и «поглотителем» свободных радикалов. Мы оценивали изменение GSH в клетках линии HeLa при их инкубации в течение 48 часов с NAC (концентрация NAC составила 1 и 2 мМ). Интересно, что концентрация глутатиона, рассчитанная относительно количества внутриклеточного белка, при добавлении NAC в концентрации 1 мМ снижается по сравнению с контрольными клетками на 40%, а при концентрации 2 мМ - на 50%, причем статистически достоверных отличий в изменении уровня GSH при концентрации NAC 1 и 2 мМ не обнаружено. С другой стороны, при обработке клеток HeLa NAC мы наблюдаем почти двукратное увеличение концентрации суммарного клеточного белка. Таким образом, можно предположить, что длительное культивирование клеток в присутствии NAC приводит не столько к снижению уровня восстановленного глутатиона, сколько к активации белкового синтеза.

Исходя из предположения, что восстановленный глутатион играет важную роль в начальной стадии развития инфекционного процесса C.trachomatis, мы исследовали влияние уровня восстановленного GSH в клетке на развитие инфекции. Клетки линии HeLa были обработаны BSO (250 и 500 мкМ) или NAC ( 0.05 мМ - 10 мМ), инкубацию проводили в течение 48 часов. Перед инфицированием C.trachomatis, BSO или NAC были удалены путем трехкратной промывки монослоя клеток средой для культивирования.

По сравнению с контролем, после инкубации линии клеток HeLa с BSO в концентрации 250 мкМ наблюдается шестикратное уменьшение инфекционности C.trachomatis, а при концентрации 500 мкМ - тридцатикратное, причем, как видно из рисунка 7, общее количество клеток после инкубации с BSO достоверно не изменяется. При инкубации клеток HeLa с NAC мы наблюдали увеличение инфекционности C.trachomatis в диапазоне концентраций NAC 1-5 mM. Необходимо заметить, что предварительная инкубация в течение 24-48 часов клеток HeLa с восстановленным глутатионом, который, в отличие от NAC, не может проникать через клеточную мембрану, не приводила к повышению инфекционности C.trachomatis.

На следующем этапе для модуляции уровня GSH мы использовали перекись водорода. Клетки HeLa инкубировались с перекисью водорода в концентрации 100, 200, 500 мкМ в интервале 0 - 4 часа.

На рисунке 8 представлена зависимость изменения уровня GSH от концентрации Н2О2 и времени инкубации.

При концентрации Н2О2 100 мкМ уровень GSH достоверно снижался через 2 часа после добавления перекиси водорода. При концентрации Н2О2 200 и 500 мкМ достоверное снижение уровня GSH детектировалось уже через 1 час после обработки. Максимальное

снижение уровня СБН наблюдалось при инкубации клеток с Н2О2 в концентрации 500 мкМ в течение 2 часов.

50 -1

о;

I 40 -

I 10 -

0 250 500 0,1 1 5 ♦-♦♦-♦

В SO NAC (mM)

Рисунок 7. Определение инфекционности C.trachomalis при заражении линии клеток HeLa, инкубированных с BSO и NAC.

0ч 1ч 2ч 0 100 200 500

Н202 (мкМ)

А. Б.

Рисунок 8. Изменение уровня йЭН в линии клеток НеЬа при различных концентрациях Н2О2 и времени инкубации (А), определение влияния Н2Ог на жизнеспособность клеток НеЬа (Б).

После оценки влияния Н2О2 на жизнеспособность клеток оказалось, что количество живых клеток составляло 94% при концентрации Н202 500 мкМ и 99% в необработанных клетках.

Несмотря на то, что уровень ОЭН при обработке клеток Н2О2 максимально снижался на 30% (при концентрации Н2О25ОО мкМ и времени инкубации 2 ч) мы

наблюдали значительное снижение инфекционности С.trachomatis. Как видно из таблицы 11, происходит двукратное снижение титра С.trachomatis при инкубации клеток с Н2О2 в концентрации 100 мкМ в течение часа. При концентрации Н2О22ОО мкМ и времени инкубации 30 мин наблюдается снижение инфекционности C.trachomatis на 60%, причем различия в титре хламидий при инкубации клеток с перекисью в концентрации 200 мкм 1 час, 500 мкМ 30 мин и 500 мкМ 1 час были не достоверны.

Таблица 11. Определение инфекционности С.(гасАошо/и при заражении линии клеток НеЬа, обработанных Н2О2_

Концентрация Нг02 (мкМ), время инкубации

0,0 100, 1 час 200, ЗОмин 200, 1 час 500, ЗОмин 500, 1 час

Количество включений в поле зрения, х 400 41.4 ±4.0 23.0 ±2.8 16.3 ±2.1 12.1 ±2.0 10.1 ±1.4 10.4 ±4.1

Таким образом, исходя из предположения, что внутриклеточный глутатион является восстанавливающим агентом дисульфидных связей в белках наружной оболочки элементарного тельца хламидии на начальной фазе инфекции, мы использовали три различных подхода для изменения концентрации GSH в клетке: 1) обработку клеток BSO - ингибитором у-глугамилцистеин синтетазы, основного фермента в биосинтезе глутатиона, 2) инкубацию клеток с перекисью водорода и 3) инкубацию клеток с N-ацетил-Ь-цистеином, предшественником глутатиона. В первых двух случаях мы наблюдали достоверное ингибирование развития хламидийной инфекции.

Далее, предположив, что обработка клеток GSH-модулирующими агентами ведет к изменению белкового профиля, что, в свою очередь, влияет на течение инфекции C.trachomatis, мы провели дифференциальный двумерный электорофорез экстрагированных белков с последующей их масс-спектрометрической детекцией.

В клетках линии HeLa, инкубированных 48 часов с BSO, обнаружено 9 дифференциально экспрессирующихся белков. При этом уровень экспрессии был увеличен у семи из них (таблица 12).

На наш взгляд, только один дифференциально экспрессирующийся белок в клетках, инкубированных с BSO, может влиять на развитие инфекции C.trachomatis. Это мембрано-связанный эффектор цитоскелета Cdc42, обладающий GTFa3Hofl активностью.

Таким образом, на основании протеомного анализа можно предположить, что снижение инфекционности C.trachomatis в клетках, инкубированных с BSO и Н2О2, не связано с изменением белкового профиля, что подтверждает гипотезу о том, что внутриклеточный глутатион является основным восстановителем дисульфидных связей в наружной оболочке элементарного тельца хламидий и играет решающую роль в начальной стадии развития инфекции C.trachomatis.

Таблица 12. Дифференциально экспрессирующиеся белки в клетках линии HeLa после обработки BSO, NAC and Н2О2, идентифицированные MALDI-TOF MS. Цветом выделены белки, уровень экспрессии которых в клетках, обработанных GSH- модулирующими агентами, снижается._

Инкубация с 200 мкМ BSO, 48 часов

Gl Наименование белка Символ M.w.(Da)/pI Mascot score normalized spot volume Отношение

+ BSO контроль

1633054 Chain A, Cyclophilin А Complexed With Dipeptide Gly-Pro PPIA 17870/7,82 145 655 288 2,27

5542168 Chain A, Cdc42ACK. GTPASE-Binding Domain Complex CDC42 20403 / 5,48 121 644,3 272,8 2,36

4503513 Eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 2 beta EIF3B 36479/5,38 169 240,8 100 2,41

55663125 SET translocation (myeloid leukemia-associated) oncogene SET 31114/4,09 79 1519,1 583,1 2,61

4503729 FK506-binding protein 4 FKBP4 51772/5,35 164 385,3 125,5 2,19

6841456 HSPC117 C22or£28 55175/6,61 125 143,1 447,8 0,32

4501867 aconitase 2 precursor acnB 8537217,36 138 182 377,1 0,48

5032087 splicing factor 3a, subunit 1 SF3A1 88831 /5,15 161 2536,8 1133,2 2,24

184433 histone-binding protein RBBP4 85139/4,27 131 1067,9 473,7 2,25

Инкубация с 1мМ NAC, 48 часов

81866317 Histone H2B type 1-P Histlh2b P 13984/ 10,31 144 3428.0 1463.6 2,34

5031851 stathmin 1 STMN1 17292/5,76 148 1537.7 734.9 2,09

4506671 ribosomal protein P2 RPLP2 11658/4,42 79 1309.6 646.2 2,03

14251209 chloride intracellular channel 1 CLIC1 26906/5,09 110 376.5 151.8 2,48

825671 B23 nucleophosmin NPM1 30919/4,71 101 645.4 1730.0 0,37

189306 nucleolin NCL 76298/4,59 145 874.2 1885.0 0,46

21626466 matrin 3 MATR3 94565 /5,87 247 1491.4 534.4 2,79

27262628 nuclear autoantigenic sperm protein isoform 2 NASP 85186/4,26 102 769.3 351.9 2,19

Инкубация с 200 мкМ Н2Ог.2 часа

27262630 nuclear autoantigenic sperm protein isoform 3 NASP 48775/4,35 72 230,1 52,8 4,36

4758638 peroxiredoxin 6 PRDX6 25019/6,0 163 188,4 480,7 0,39

20127454 5-aminoimidazole-4- carboxamide ribonucleotide formyltransferase/IMP cyclohydrolase ATIC 64575/6,27 112 185,1 617,7 0,3

38327039 heat shock 70kDa protein 4 HSPA4 94271 /5,11 215 108,7 233,7 0,47

40788339 matrin-3 MATR3 94565 / 5,87 175 270,3 643,4 0,42

4503483 eukaryotic translation elongation factor 2 EEF2 95277/6,41 119 129,2 377,1 0,34

2.3.3. Транскриптомный и протеомный анализ клеток, экспрессирующих ген мелиттина.

Исходя из того факта, что экспрессия антимикробного пептида мелиттина ингибирует микоплазменную и хламидийную инфекции как в культуре клеток, так и на моделях лабораторных животных, для выяснения механизмов ингибирования мы провели дифференциальный двумерный электорофорез экстрагированных белков из клеток линии НЕК 293 с последующей их идентификацией времяпролетной масс-спектрометрией.

Клетки линии НЕК 293 трансфицировали плазмидным вектором рВ1/те12/11ТА, в ростовую среду был добавлен доксициклин (0,02 мкг/мл). Время после трансфекции составило 24 часа. В качестве контроля использовалась также трансфицированная линия клеток без добавления индуктора.

В клетках линии НЕК 293, трансфицированных плазмидным вектором рВ1/те12/г1:ТА, обнаружено 17 дифференциально экспрессирующихся белков (рисунок 9). При этом уровень экспрессии увеличен у восьми белков (таблица 13).

heal shock 7(JkDa Mtabmic translation

тюш I cloJgMipniaciaJ

hcustinck 'Hiklto ^гоп-ш I. I ^

larain £' * '

^JT * • • polyfADP-ribosc

f - • polymerase

glyceraldchydc-3-phosphatc »deliydiogeiias^

phosphoglyccn Ran-binding protein uuitase 1

progesterone receptor

membrane component 1 non-metastatic

Chain Л -'cells I

eIF-5A2 protein

Рисунок 9. Дифференциальный протеомный анализ клеток линии НЕК 293, трансфицированных плазмидным вектором рВ1/те12/ПТА. Экстрагированные белки из контрольных клеток (трансфекция в отсутствие доксициклина) были окрашены флуоресцентным красителем СуЗ (зеленая флуоресценция). Время после трансфекции составило 24 часа. Белки, выделенные из трансфицированной линии клеток в присутствии доксициклина (0,02 мкг/мл), окрашены флуоресцентным красителем Су5 (красная флуоресценция).

Во-первых, обращает на себя внимание повышение количества белка, играющего одну из ключевых ролей в организации цитоскелета клетки - статмина. Этот белок вовлечен в регуляцию организации микротрубочек - предотвращает сборку и потенцирует дестабилизацию микротрубочек [Rubin, 2004]. Нарушение нормального процесса динамической реорганизации сети микротрубочек приводит к значительным изменениям процессов мембранного трафика в клетке [Hamm-Alvarez, 1994].

Таблица 13. Дифференциально экспресеирующиеея белки в клетках линии НЕК 293, трансфицированных плазмидным вектором рВ1/те12/пТА, идентифицированные МА1Л31-ТОР МБ. Цветом выделены белки, уровень экспрессии которых в трансфицированных клетках снижается.

Gl Наименование белка Символ Mascot score M.w pi Отношение

5031851 stathmin 1 STMN1 57 17292 5,76 1,98

2982080 Chain A, Familial Als Mutant G37r Cuznsod (Human) SOD1 120 15894 5,87 1,95

38045913 non-metastatic cells 1, protein (NM23 A) expressed in isoform a NME1 159 19641 5,42 1,97

4505591 peroxiredoxin 1 PRDX1 112 22096 8,27 0,32

4505753 phosphoglycerate mutase 1 (brain) PGAM1 122 28786 6,67 4,15

5729875 progesterone receptor membrane component 1 PGRMC1 122 21658 4,56 0,12

938026 Ran-binding protein 1 RANBP1 115 23225 5,19 2

31645 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPD 161 36031 8,26 0,38

178152 poly(ADP-ribose) polymerase PARP1 89 64175 8,34 0,18

13786847 Chain A, Human Heart L-Lactate Dehydrogenase H Chain, Ternary Complex With Nadir And Oxamate LDHA 156 36484 5,72 0,49

5031877 lamin B1 LMNB1 175 66368 5,11 0,32

80474348 LEPRE1 protein LEPRE1 88 78872 5,41 2,01

38327039 heat shock 70kDa protein 4 HSPA4 286 94271 5,11 2,03

4503483 eukaryotic translation elongation factor 2 EEF2 231 95277 6,41 5,25

20149594 heat shock 90kDa protein 1, beta HSPCB 303 83212 4,97 0,32

6005942 valosin-containing protein VCP 303 89266 5,14 0,32

83699649 heat shock 90kDa protein 1, alpha HSPCA 303 98082 5,07 0,32

В то же время, известно, что хламидии активно используют цитоскелет клетки для движения. Через 2 часа после интернализации, ЭТ мигрирует в перинуклеарную область, где локализуется около аппарата Гольджи и начинает рекрутировать сфингомиелин для достройки мембраны включения [ОпевЬаЬег, 2003]. Причем движение происходит по направлению к минус-концу микротрубочки и останавливается в центре организации микротрубочек (МТОС).

Таким образом, увеличение экспрессии статмина, и, как следствие, деполимеризация микротрубочек, может нарушать внутриклеточный трафик хламидий и приводить к образованию абберантных включений и нарушению жизненного цикла. Эта гипотеза нашла свое подтверждение в дальнейших наших исследованиях. Другой интересный факт - снижение экспрессии прогестеронового мембранного рецептора при

экспрессии гена мелитгина. Известно, что предварительная обработка прогестероном мышей увеличивает колонизацию урогенитального тракта C.trachomatis [Kaushic, 2000]. Мы также при создании модели хламидиоза на мышах использовали инъекции прогестерона перед инфицированием мышей. Механизм взаимодействия ЭТ с клеткой при гормональной обработке остается неясным, однако, снижение количества прогестероновых рецепторов на поверхности мембраны клетки может приводить к снижению инфекционности C.trachomatis.

Как уже было описано выше, хламидии чрезвычайно чувствительны к редокс-балансу внутри клеток. Обработка клеток агентами, снижающими уровень GSH (BSO, Н2О2), приводит к ингибированию развития хламидийной инфекции. В этой связи обращает на себя внимание изменение экспрессии белков редокс-системы при экспрессии гена мелитгина в клетке. Мы наблюдаем (как и в случае протеомного профилирования клеток, обработанных Н2О2) снижение содержания белков, относящихся к семейству пероксиредоксинов и увеличение экспрессии супероксиддисмутазы (таблица 13)

В условиях нормального обмена Си^п-супероксиддисмутаза поддерживает стационарную концентрацию супероксидных радикалов на определенном уровне, защищая тем самым клеточные структуры от повреждающего действия как самих радикалов О", так и от появления гидроксильных радикалов, которые могут образовываться из О' и НО [Valdivia, 2009]. Показано, что инфекционная активность хламидий модулируется в том числе и активными формами кислорода [Azenabor, 2006]. Данные по изменению в экспрессии пероксиредоксинов согласуются с экспериментами по протеомному профилированию клеток HUVEC при обработке их перекисью [Mitsumoto, 2001]. Все эти факты говорят о том, что экспрессия гена мелитгина вызывает окислительный стресс (не влияющий, однако, на жизнеспособность клетки, что было продемонстрировано выше), который опосредованно может также играть роль в ингибировании хламидийной инфекции.

Транскрипционное профилирование клеток линии НЕК 293, экспрессирующих ген мелиттина осуществлялось также, как и в случае клеток, обработанных GSH-модулирующими агентами. Линия клеток НЕК 293 была трансфицирована плазмидным вектором pBI/mel2/rtTA (Dox 0,02 мкг/мл) с последующим выделением тотальной РНК и гибридизацией на чипе WG-6 (Illumina, США). В качестве контроля использовалась также трансфицированная линия клеток без добавления индуктора.

Из дифференциально экспрессирующихся генов в трансфицированной линии клеток, помимо уже описанных, обращают на себя внимание гены, кодирующие гистоны класса Н4. Мы наблюдаем почти шестикратное увеличение экспрессии этих генов. Отсутствие данного класса белков в списке дифференциально экспрессирующихся белков при протеомном профилировании объясняется тем, что изоэлектрическая точка этих белков колеблется в пределах 12-13. Факт обнаружения этих белков при транскрипционном профилировании интересен тем, что недавно появились работы, где сообщается, что белки этого класса обладают антимикробной активностью [Tsao, 2009].

Так, в частности, было показано, что гистоны класса Н4 являются основным антимикробным компонентом себоцитов человека, что было доказано путем получения рекомбинантного белка, обладающего эффективным бактерицидным действием в отношении S.aureus и Propionibacterium acnes [Lee, 2009].

Подводя итог, следует отметить, что результаты транскриптомного и протеомного профилирования клеток, экспрессирующих ген мелиттина, дают основание говорить еще о нескольких возможных механизмах антихламидийного действия этого пептида. Во-первых, нарушение внутриклеточного трафика хламидий в результате изменений в работе актннового цитоскелета приводит к остановке развития хламидийного включения и появлению абберантных форм. Во-вторых, снижение количества прогестероновых рецепторов в результате экспрессии мелиттина приводит к снижению способности ЭТ хламидий к интернализации. И, наконец, изменение редок-баланса внутри клетки также приводит к ингибированию инфекции С.trachomatis. Эти факты, обнаруженные впервые, возможно, послужат заделом как в развитии новых знаний о механизме внутриклеточного паразитизма хламидий, так и в создании нового поколения высокоэффективных антихламидийных препаратов.

2.3.4. Белки мембраны включения C.trachomatis.

Наше предположение о том, что ингибирование развития инфекции C.trachomatis происходит на ранней стадии, выдвигает на первый план вопрос: какие же хламидийные гены экспрессируются на этой стадии? Вероятнее всего, что либо напрямую, либо опосредованно, белки, кодируемые этими генами, и являются одной из мишеней для действия антимикробных пептидов.

Хламидии активно модифицируют поверхность включения с помощью собственных белков (Inc-белки, белки мембраны включения), и этот процесс начинается непосредственно после интернализации ЭТ в клетку. Эти белки в первую очередь привлекают внимание в качестве потенциальных медиаторов взаимодействия хламидий с эукариотической клеткой. Первые хламидийные белки в составе мембраны включения были обнаружены более десяти лет назад, с тех пор их число значительно увеличилось, в основном, благодаря расшифровке хламидийных геномов.

Известно, что Inc-белки располагаются в мембране включения и гидрофильные домены, по крайней мере, нескольких из них способны непосредственно взаимодействовать с цитоплазмой и органеллами эукариотической клетки [Scidmore, 2001). На основании этих фактов мы предположили, что определение локализации Inc-белков при экспрессии кодирующих их генов в эукариотической клетке может привести к обнаружению взаимосвязи данных белков с какими-либо клеточными структурами.

Полноразмерные гены incA, incB, incC, incD, incE, incF и incG C. trachomatis клонировали в плазмидные векторы pEGFP-Nl и pEGFP-Cl (Clontech, США) под контроль раннего промотора цитомегаловируса человека для последующего получения составных белков с GFP.

Для выявления ко-локализации составных Inc-белков с эукариотическими органеллами клетки линии HeLa трансфицировали этими экспрессирующими конструкциями. Полученные препараты окрашивали с использованием флуоресцентных красителей и антител, специфически связывающихся с белками цитоскелета, митохондриями, аппаратом Гольджи, ЭПР и плазматической мембраной эукариотической клетки. Ко-локализацию составных белков и флуоресцентно окрашенных клеточных структур осуществляли с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, полученные изображения обрабатывали с использованием программы Image Pro-plus 5.1.

Ни для одного EGFP- Inc - составного белка не удалось выявить ко-локализацию с митохондриями, актиновым цитоскелетом и тубулиновыми микротрубочками.

EGFP-IncA через 12 часов после трансфекции выявлялся в клетке в виде везикул и тубуло-везикулярных образований, связанных между собой разветвленной сетью. С течением времени везикулы увеличивались в размерах и принимали форму гранул разной величины, ориентированных вдоль тубулиновых микротрубочек и равномерно распределенных по всей клетке между актиновым цитоскелетом. По мере накопления белка гранулы увеличивались в размерах, четче проявлялась разветвленная сеть, идентифицированная по результатам ко-локализации как ЭПР. Крупные гранулы EGFP-IncA, где в результате локализовался весь белок, не ко-локализовались с ЭПР.

EGFP-IncD выявлялся в составе разветвленной сети и гранулах, которые полностью соотносились с ЭПР. Гранулы имели правильную округлую форму, более крупные концентрировались в околоядерной области, преимущественно в области центра организации микротрубочек.

Картина распределения белков EGFP-IncE, EGFP-IncG и EGFP-IncC менялась в зависимости от срока наблюдения после трансфекции. Через 12 часов после трансфекции область распределения EGFP-IncE и EGFP-IncG соответствовала ЭПР. К 16 часам после трансфекции ко-локализация с ЭПР снижалась ввиду компактного скопления белка в околоядерной зоне, как в препаратах EGFP-IncE, так и в препаратах EGFP-IncG. Форма скопления белка морфологически соответствовала аппарату Гольджи, что подтвердили результаты ко-локализациии с антителами против периферийного белка поверхности аппарата Гольджи, обращенной к цитоплазме, Golgin-97, как для EGFP-IncE, так и для EGFP-IncG. На поздних стадиях трансфекции очень хорошо были различимы цистерны аппарата Гольджи, система трубочек, отходящих от цистерн, образующих сложную сеть и пузырьки, преимущественно мелкие, замыкающие концевые отделы трубочек. В эти сроки после трансфекции область распределения белков соотносилась также с областью распределения маркера аппарата Гольджи - WGA-Alexa 594.

EGFP-IncC уже к 12 часам от начала трансфекции лишь в единичных клетках оставался связанным с ЭПР. Характерной картиной для этого периода наблюдения была концентрация белка в везикулах, в аппарате Гольджи и тубуло-везикулярных образованиях, расположенных вне ЭПР и направленных к периферии клетки. К 16 часам от начала трансфекции EGFP-IncC обнаруживался на периферии клетки, куда

доставлялся в составе везикул. 1псС в этот период наблюдения ко-локализовлся с наружной мембраной. Уже к 19 часам практически весь белок распределялся по поверхности клетки. Ко-локализация с наружной мембраной и концентрация белка на поверхности клетки позволили сделать нам предположение, что 1псС тропен к наружной мембране.

Все изучаемые нами белки в процессе биогенеза оказались связанными с ЭПР эукариотической клетки и их транспорт шел по секреторному пути. 1псА, 1псБ, 1псВ и 1псР на протяжении всего цикла наблюдения выявлялись в составе ЭПР. 1псв и 1псЕ выявлялись сначала в ЭПР, но очень быстро транспортировались в аппарат Гольджи. На поздних сроках трансфекции белки локализовались в аппарате Гольджи и многочисленных везикулах, связанных с транс-Гольджи ретикулумом. 1псС транспортировался от ЭПР через Гольджи до наружной мембраны и доставлялся на поверхность клетки в составе везикул. Результаты нашего исследования подтверждают способность белков мембраны включения СлгасЪотайз взаимодействовать с белками секреторного пути.

Одним из аргументов в пользу выдвинутой нами гипотезы может служить изменение распределения составного белка ОРР-1псС в клетках, обработанных таксолом и брефелдином. В отличие от колхицина, вызывающего деполимеризацию микротрубочек, таксол нарушает их функцию в результате жесткой стабилизации. Нарушение нормального процесса динамической реорганизации сети микротрубочек приводит к значительным изменениям процессов мембранного трафика в клетке, в том числе блокируя транспорт везикул секреторного пути [Аро11ош, 2000]. В нашем эксперименте обработка клеток таксолом через 4 часа после трансфекции приводила к значительному изменению распределения составного белка ОРР-1псС по сравнению с необработанными клетками (рисунок 10). Начиная с 15 часов после трансфекции данный белок накапливался в четко очерченной сети ЭПР, а также в клеточных структурах, напоминающих ЭПР-Гольджи промежуточный компартмент, и лишь к 19 часам после трансфекции начиналось накопление ОБР-1псС в области плазматической мембраны. Таким образом, не вызывает сомнений, что доставка данного составного белка к плазматической мембране клетки тесно связана с процессами мембранного трафика. Поскольку транспорт белков из ЭПР к аппарату Гольджи и затем через сеть транс-Гольджи происходит с участием микротрубочек, то нарушение доставки СГР-1псС на периферию клетки в результате обработки таксолом может косвенно свидетельствовать о осуществлении данного процесса с помощью секреторного пути. Как уже было сказано выше, при протеомном профилировании клеток НЕК 293, трансфицированных плазмидным вектором, экспрессирующим мелиттин, мы обнаружили повышенный уровень экспрессии белка, вовлеченного в процесс организации микротрубочек -статмина, он предотвращает сборку и потенцирует дестабилизацию микротрубочек. Поэтому гипотеза об изменениях во внутриклеточном трафике и, соответственно, в

секреторном пути клетки при экспрессии мелиттииа находит еще одно свое подтверждение.

Более того, мы использовали еще и другой препарат - брефелдина А, который является известным необратимым ингибитором транслокации белков из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи, благодаря связыванию белков ретроградного транспорта из аппарата Гольджи в ЭПР. В присутствии брефелдина новосинтезированные белки аккумулируются внутри ЭПР. В присутствии брефелдина А наблюдалась полная отмена доставки составного белка ЕОРР-1псС к наружной мембране. В разные сроки после трансфекции (12, 16, 19 ч) белок обнаруживался только в ЭПР, в то время как в клетках, необработанных брефелдином наблюдалось последовательное изменение локализации белка (ЭПР, аппарат Гольджи, наружная мембрана) (рисунок 10).

Рисунок 10. Локализация ЕОРР-1псС в культуре клеток НеЬа, 19 ч после трансфекции,

окраска \VGA- А1еха 494.

Верхний ряд - необработанные клетки.

Средний ряд - клетки, обработанные брефелдином.

Нижний ряд - клетки, обработанные таксолом.

2.4. Проверка универсальности разработанных генотерапсвтпческпх подходов.

В предыдущих разделах был продемонстрирован антихламидийный и антимикоплазменный эффект линейного а-спирального амфипатического пептида мелиттина в составе рекомбинантных плазмид на моделях культуры клеток и лабораторных животных (мыши, цыплята). Помимо прямого антибактериального действия, были проанализированы возможные механизмы влияния экспрессии гена меллиттина на развитие микоплазменной и хламидийной инфекции.

На следующем этапе работы логичным представлялось проведение апробации разработанной модели экспрессии генов АМП на пептидах иного происхождения. Мы остановили свой выбор на линейных катионных пептидах из яда пауков.

Ядовитые животные, среди которых особое место занимают членистоногие (скорпионы, пауки, пчелы, осы, шершни, муравьи), в ходе длительной эволюции выработали уникальные средства нападения и обороны - яды. Большинство изученных на сегодняшний день пауков производят яд с преобладанием дисульфид-содержащих пептидных нейротоксинов. Среди изученных пауков Ь. ¡агаЬаЫ оказался уникальным по составу яда или «репертуару» вырабатываемых токсинов [Василевский, 2008]. Однако, линейные катионные пептиды из ядов пауков представляют отдельный интерес.

Понятно, что в силу биологических особенностей хламидий, а именно из-за облигатного внутриклеточного паразитизма и уникального двухфазного жизненного цикла, использование химически синтезированных антимикробных пептидов для терапии хламидийной инфекции невозможно. В этом случае, как и в случае мелиттина, мы применили генотерапевтический подход, то есть использовали регулируемую экспрессию генов АМП из ядов пауков после введения в клетку рекомбинантных плазмидных конструкций.

Мы тестировали активность этих рекомбинантных конструкций, экспрессирующих гены АМП, на модели хламидийной инфекции в культуре клеток.

Для этого проводили трансфекцию линий клеток НЕК 293, через 5 часов после трансфекции добавляли индуктор в дозе 0,02 мкг/мл и через 20 часов проводили заражение СЛгасИотайз. Подсчет хламидийных включений производили через 24 часа после инфицирования. Результаты тестирования рекомбинантных плазмидных конструкций приведены на рисунке 11.

Необходимо отметить, что пептид С1Т 1а демонстрировал ингибирующий эффект даже больший (около 80%) по сравнению с мелиттином (75%).

5 40

С1Т 1а

Ис1

1Лс2 исЗа Ис4Ь ис5

пептиды

Рисунок 11. Ингибирование формирования хламидийных включений в клетках, трансфицированных плазмидными векторами, экспрессирующими гены латарцинов, относительно контроля. В качестве контроля использовали клетки, трансфицированные плазмидными векторами, однако, доксициклин в среду не добавляли.

Таким образом, разработанная нами регулируемая система экспрессии генов АМП эффективно работает на модели мелитгина, антимикробного пептида из яда пчелы, и может эффективно использоваться для экспрессии генов АМП любого происхождения, что и было продемонстрировано на пептидах из яда пауков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании, используя современные представления о врожденном иммунитете, и, в частности, об одной из основных его частей - антимикробных пептидах, впервые удалось создать генотерапевтические подходы для лечения инфекций, вызываемых внутриклеточными паразитами. Оригинальность разработанных подходов состоит в применении рекомбинантных плазмидных конструкций, экспрессирующих гены антимикробных пептидов, а не искусственно синтезированных пептидных препаратов. Это, с одной стороны, снижает стоимость терапии, а, с другой стороны, системное применение АМП заменяется локальным воздействием.

В практическом отношении выделим тот факт, что созданная в работе система регуляции экспрессии генов АМП позволила снять два основных ограничения применения АМП в терапевтических целях - токсичность для эукариотической клетки и низкую селективность. Используемые «гомеопатические» дозы индуктора (доксициклина), во-первых, не влияли на развитие хламидийной и микоплазменной инфекций, следовательно, отсутствовал селективный пресс антибиотика, способный вызывать появление резистентных штаммов. Во-вторых, уровень экспрессии АМП был достаточен для элиминации патогена из инфицированной клетки.

Созданный подход был успешно апробирован на инфекционных моделях микоплазмозов и хламидиозов человека у лабораторных мышей, а также на модели естественного патогена птиц - M.gallisepticum, Стоит отметить, что применение разработанных прототипов генно-инженерных препаратов возможно различными путями - интравагинально для урогенитальных патогенов и аэрозольно для респираторных патогенов.

Фундаментальные аспекты данной работы сфокусированы в области расшифровки механизмов влияния эндогенной экспрессии генов АМП на жизненный цикл внутриклеточных паразитов. С привлечением геномных, протеомных и транскриптомных технологий мы показали, что механизм действия антимикробных пептидов при экспрессии их генов в инфицированной клетке не сводится лишь к прямому бактерицидному действию. Механизм этот многогранен: изменение внутриклеточного трафика, транс-мембранного потенциала, редокс-баланса ситемы, нарушение способности интернализации внутриклеточных паразитов в клетку-мишень являются основными составляющими частями этого механизма.

Уникальность разработанных подходов заключается также в их универсальности: проведя успешные исследования способности к ингибированию развития микоплазмозов и хламидиозов модельного пептида мелиттина, мы также показали возможность использования в этой системе пептидов различного происхождения.

Таким образом, в настоящей работе с использованием генов антимикробных пептидов, впервые разработаны и реализованы генотерапевтические подходы для лечения инфекций, вызываемых внутриклеточными паразитами. Результаты применения этих подходов in vitro и in vivo позволяют надеяться на успешное их внедрение в медицинскую практику.

выводы

1. Получена серия рекомбинантных плазмидных векторов, экспрессирующих гены антимикробных пептидов: мелиттина из яда пчелы, латарцинов и оксиопининов из яда пауков. Впервые в состав этих векторов включены элементы для регулируемой тетрациклин-зависимой экспрессии генов АМП в клетке.

2. Впервые показана эффективная элиминация M.hominis и С.trachomatis из культуры клеток HeLa и НЕК 293, трансфицированных полученными рекомбинантными конструкциями.

3. Разработаны инфекционные модели микоплазмозов (M.hominis у мышей и M.gallisepticum у цыплят-бройлеров) и хламидиозов (C.trachomatis у мышей). Показана элиминация M.hominis и C.trachomatis у мышей после интравагинального, a M.gallisepticum после аэрозольного введения рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген мелиттина.

4. Доказана роль внутриклеточного восстановленного глутатиона в развитии инфекции C.trachomatis. Снижение его уровня после химической обработки клеток и при экспрессии гена мелиттина приводит к ингибированию развития инфекции C.trachomatis.

5. Впервые с использованием транскриптомного и протеомного анализов выявлен спектр механизмов действия АМП на внутриклеточных паразитов. Помимо прямого бактерицидного эффекта продемонстрировано снижение трансмембранного потенциала клеток, экспрессирующих ген мелиттина, изменение редокс-состония клетки и нарушение внутриклеточного трафика, приводящее к нарушению цикла развития хламидий.

6. Впервые с использованием колокализации с репортерным геном и применением селективных ингибиторов секреторного пути показана связь белков мембраны включения C.trachomatis с секреторным путем клетки.

7. Благодаря применению регулируемой экспрессии генов антимикробных пептидов, сопряженной с различными схемами инфицирования C.trachomatis, впервые установлено, что максимальный антимикробный эффект полученных прототипов генно-инженерных препаратов наблюдается на ранней фазе развития инфекции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации. Статьи:

1. Лазарев В.Н., Говорун В.М. Антимикробные пептиды и их применение в медицине. И Обзор. Биотехнология. - 2010. - №3. - С. 11 - 25.

2. Лазарев В.Н. Гены антимикробных пептидов для терапии внутриклеточных инфекций. // Acta Naturae. - 2009. - № 1. - С. 121 - 123.

3. Шкарупета М.М., Кострюкова Е.С., Лазарев В.Н.. Левицкий С.А., Басовский Ю.И., Говорун В.М. Локализация Inc-белков С. trachomatis при экспрессии их генов в культуре клеток линии HeLa. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - 2008. - Т. 145. - № 8. - С. 204-210.

4. Басовский Ю.И., Шкарупета М.М., Левицкий С.А., Кострюкова Е.С., Лазарев В.Н.. Говорун В.М. Гидрофобные домены определяют локализацию полноразмерных белков IncC, IncG C.trachomatis при экспрессии их генов в культуре клеток HeLa. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - 2008. - Т. 145. - № 4. - С. 402 - 408.

5. Кострюкова Е.С., Лазарев В.Н.. Говорун В.М. Белки мембраны включения CHLAMYDIACEAE. // Биомед. Химия. - 2008. Т. 54. - № 1. - С. 24-41.

6. Шкарупета М.М., Лазарев В.Н.. Акопиан Т.А.,.Африканова Т.С, Говорун В.М. Анализ маркеров антибиотикорезистентности у клинических изолятов Chlamydia trachomatis, выделенных после неэффективной антибиотикотерапии. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - 2007. - Т. 143. - № 6. - С. 655 - 659.

7. Лазарев В.Н.. Филатова Е.В., Левицкий С.А.,. Николаев Е.Н, Лейпунский И.О., Жигач А.Н., Кусков М.Л., Говорун В.М.. Разработка метода очистки рекомбинантных белков с использованием наночастиц никеля. // Российские нанотехнологии. - 2007. - Т.2. - № 5-6. - С. 133-140.

8. Лазарев В.Н.. Шкарупета М.М., Кострюкова Е.С., Левицкий С.А., Титова Г.А., Акопиан Т.А., Говорун В.М. Рекомбинантные плазмидные конструкции, экспрессирующие ген антимикробного пептида мелитгина для терапии микоплазмозов и хламидиозов. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - 2007. - Приложение 2. С. 82 - 87.

9. Пичужкин К.В., Григоренко В.Г., Колясников О.В., Гаврилова Е.М., Упоров И.В., Писарев В.В., Егоров A.M., Финашутина Ю.П., Лазарев В.Н.. Говорун В.М. Изучение антигенных свойств МОМР (основной белок наружной оболочки мембраны) Chlamydia pneumoniae и его эпитопов. // Иммунология. - 2006. - № 4. -С. 226-234.

10. Кострюкова Е.С., Лазарев В.Н.. Титова Г.А., Акопиан Т.А., Левицкий С.А., Говорун В.М.. Экспрессия генов белков мембраны включения IncB и IncC Chlamydia trachomatis в Escherichia coli. 11 Биохимия. - 2006. - T. 71. - № 3. - С. 333340.

11. Lazarev V.N.. Shkarupeta M.M., Titova G.A., Kostrjukova E.S., Akopian T.A., Govorun V.M. Effect of induced expression of an antimicrobial peptide melittin on Chlamydia trachomatis and Mycoplasma hominis infections in vivo. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2005. - V. 338. - P. 946-950.

12. Шаркеев В.И., Торшин И.Ю., Шкарупета M.M., Акопиан Т.А., Лазарев В.H.. Говорун В.М.. Определение сероварспецифичных однонуклеотидных полиморфизмов гена ompl С. trachomatis. II Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - 2005. - Т. 140.-№ 8.-С. 192- 198.

13. Кострюкова Е.С., Коробова Ф.В., Лазарев В.Н.. Шкарупета М.М., Титова Г.А., Акопиан Т.А., Говорун В.М. Локализация Inc-белков С. trachomatis при экспрессии их генов в культуре клеток линии HeLa. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - 2005. - Т. 139. -№5.-С. 562-567.

14. Лазарев В.Н.. Шкарупета М.М., Костркжова Е.С., Титова Г.А., Акопиан Т.А., Говорун В.М. Разработка подходов к генной терапии микоплазмозов и хламидиозов с использованием генов антимикробных пептидов. Н Мол. Медицина. -2005. -№ 1.-С. 60-64.

15. Кубанова A.A., Васильев М.М., Говорун В.М., Лазарев В.Н.. Терман O.A. Современные подходы к диагностике и терапии латентной хламидийной инфекции урогенитального тракта. // Вест. Дермат. Венерол. - 2004. - № 3. - С. 6-10.

16. Lazarev V.N.. Stipkovits L., Biro J., Miklodi D., Shkarupeta M.M., Titova G.A., Akopian T.A., Govorun V.M.. Induced expression of the antimicrobial peptide melittin inhibits an experimental infection by Mycoplasma gallisepticum in chickens. // Microb. Infect. -2004.-V.6.-P. 536-541.

17. Misyurina O.Y., Chipitsyna E.V., Finashutina Y.P., Lazarev V.N., Akopian T.A., Savicheva A.M., Govorun V.M.. Mutations in a 23S rRNA Gene of Chlamydia trachomatis Associated with Resistance to Macrolides. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2004. - V.48. - P. 1347-1349.

18. Мисюрина О.Ю., Шипицина E.B., Финашутина Ю.П, Лазарев В.Н.. Акопиан Т.А., Савичева A.M. Говорун В.М. Анализ точечных мутаций в 3' -области rena>'geD и Quinolone-Resistance-Determining- Region генов gyrA и рагС клинических изолятов Chlamydia trachomatis, устойчивых к фторхинолонам in vitro. И Мол. Ген. Микробиол. Вир. - 2004. - № 3. - С. 3-7.

19. Шкарупета М.М., Лазарев В Н.. Говорун В.М. Экспериментальная инфекция М. hominis генитального тракта у мышей линии Balb/c. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. -2004.-Т. 137. -№ 1.-С. 62-66.

20. Мисюрина О.Ю., Шипицина Е.В., Парфенова Т.М., Лазарев В.Н.. Савичева A.M., Говорун В.М. Применение метода ОТ-ПЦР для определения чувствительности Chlamydia trachomatis к антибиотикам. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - 2002. - Т. 133. -№ 3. - С. 357-360.

21. Lazarev V.N.. Parfenova Т.М., Gularyan S.K., Misyurina O.Y., Akopian Т.A., Govorun V.M. Induced expression of melittin, an antimicrobial peptide, inhibits infection by Chlamydia trachomatis and Mycoplasma hominis in a HeLa cell line. // Int. J. Antimicrob. Agents. - 2002. - V.19. - P. 133-137.

22. Лазарев B.H.. Говорун B.M., Парфенова T.M., Акопиан Т.А., Лопухин Ю.М.. Влияние регулируемой экспрессии гена мелитина на инфекцию Mycoplasma hominis в культуре клеток. // Докл. Акад. Наук. - 2001. - Т. 378. - № 4. - С. 542-543.

23. Лазарев В.Н.. Говорун В.М., Александрова Н.М., Парфенова Т.М., Лопухин Ю.М. Генная терапия хронических инфекционных заболеваний урогенитального тракта с использованием цитотоксических пептидов. Обзор. // Вопр. Мед. Химии. - 2000. -Т. 46. -№3. -С. 324-331.

Материалы всероссийских и международных конференций:

1. Lazarev V.N.. Shkarupeta М.М., Kostrjukova E.S., Polina N.F., Levitskii S.A., Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Grishin E.V., Govorun V.M. Expression latarcins genes coding antimicrobial peptides from the venom of the spider Lachesana tarabaevi inhibits infections by Chlamydia trachomatis in a HEK293 cell line. // 45th International Conference on Medical Chemistry "Drug Discovery and Selection." - 2009. - Orleans, France. P. 137.

2. Полина Н.Ф., Костркжова E.C., Левицкий C.A., Мазур A.M., Шкарупета М.М., Лазарев В Н. Транскрипционный анализ клеток линии НЕК293, экспрессирующих ген антимикробного пептида мелиттина. // Материалы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». - 2009. - Казань. - С. 215.

3. Лазарев В.Н.. Кострюкова Е.С., Демина И.А., Серебрякова М.В., Шкарупета М.М., Полина Н.Ф., Рогова М.А., Говорун В.М. Экспрессия гена антимикробного пептида мелитина приводит к изменению белкового состава клеток линии HeLa // Материалы научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии.» - 2008. - Казань. - С. 70.

4. Borisenko G., Lazarev V.. Shkarupeta М., Govorun V. Glutathione and N-acetylcysteine promote chlamydial infection in human epithelial cells. // SFRBM's 13th Annual Meeting, Denver, USA. Free Rad. Biol. Med. - 2006. - V. 41. - Supll. - P.-145.

5. Lazarev V.N.. Shkarupeta M.M., Kostryukova E.S., Levitskii S.A., Basovskii Yu.I., Govorun V.M. Analysis of Clamydia trachomatis Inc-proteins cellular localization during expression of their genes in HeLa cell line. // Genomic Perspectives to Host Pathogen Interactions. - 2006. - Hinxton, UK. - P.- 47.

6. Lazarev V.N.. Stipkovits L., Shkarupeta M.M., Akopian T.A., Govorun V.M. Study of efficacy of melittin gene expression in chickens challenged with Mycoplasma gattisepticum. // Abst. 11 th European Congress on Biotechnology. - 2003. - Basel, Switzerland. - P. 186.

7. Lazarev V.N.. Shkaroupeta M.M., Titova G.A., Akopian T.A., Govorun V.M.. Induced expression of melittin, an antimicrobial peptide, inhibits infection by Mycoplasma hominis in vitro and in vivo. // 14th International congress of the International organization for mycoplasmology. - 2002. - Vienna, Austria. - P. 55.

8. Лазарев B.H.. Шкарупета M.M., Мисюрина О.Ю., Кострюкова Е.С., Акопиан Т.А., Говорун В.М. Разработка подходов к генной терапии инфекционных заболеваний урогенитального тракта.// Материалы Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины». - 2002. - Москва. - С. 234-235.

9. Lazarev V.N.. Parfenova N.M., Govorun V.M., Akopian T.A. Inhibition of Chlamydia trachomatis infection by melittin expression in cell culture. // 10th European Congress on Biotechnology. - 2001. - Madrid, Spain. - P. 57.

10. Lazarev V.N.. Govorun V.M., Momynaliev K.T. Alexandrova N.M., Parfenova T.M., Akopian T.A. The influence of melittin expression on the M.hominis infection in cell culture. // 11th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. -2001. - Istanbul, Turkey. - P. 321.

11. Lazarev V.N.. Govorun V.M., Alexandrova N.M., Parfenova T.M., Akopian T.A. Effect of melittin on intracellular parasites. // 11th International Biotechnology Symposium and Exhibition. - 2000. - Berlin, Germany, P. 58.

Список сокращений

АМП - антимикробные пептиды ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДСН - додецилсульфат натрия ДТТ - 1,4-дитиотреитол

ИПТГ - изопропил-ß-D-1 -тиогалактопиранозид

JIKCM - лазерная конфокальная сканирующая микроскопия

КОЭ - колониеобразующая единица

МИК - минимальная ингибирующая концентрация

МПК - минимальная подавляющая концентрация

MC - масс-спектрометрия

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТ - ретикулярное тельце

ФСБ - фосфатный солевой буфер

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭК50 - концентрация, вызывающая 50% лизис эритроцитов

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ЭТ - элементарное тельце

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

BSO - бутионин сульфоксимин

dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфаты

Dox - доксициклин

FITC - изотиоцианат флуоресцеина

GSH - восстановленный глутатион

GSSG - окисленный глутатион

NAC - N- ацетил-Ь-цистеин

CCU - цветоизменяющие единицы

IFU - единица, формирующая хламидийное включение

HCMV - промотор цитомегаловируса человека

GFP - зеленый флуоресцирующий белок

мРНК - матричная РНК

Заказ № 163-аЛО/Ю Под писано в печать 22.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maihinfo@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лазарев, Василий Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ.

1.1.1. Классификация антимикробных пептидов.

1.1.2. Механизм действия АМП.

1.1.2.1. Альтернативные механизмы действия АМП.

1.1.2.2. Иммуномодулирующая активность АМП.

1.1.3. Резистентность микроорганизмов к АМП.

1.1.4. Терапевтическое применение АМП.

1.1.4.1. Индукция экспрессии АМП.

1.1.4.2. АМП в воспалительном процессе.

1.1.4.3. АМП в терапии инфекционных заболеваний.

1.1.5. Линейные амфипатические а-спиральные пептиды из ядов членистоногих.

1.2. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ.

1.2.1. Генная терапия инфекционных заболеваний.

1.2.1.1. Генотерапевтические агенты - нуклеиновые кислоты.

1.2.1.2. Генотерапевтические агенты — белки.

1.2.1.3. Мишени для генетической терапии инфекционных заболеваний.

1.2.2. Системы доставки генетического материала.

1.2.2.1. Барьеры на пути ДНК в ядро клетки.

1.2.2.2. Липидные векторы.

1.2.2.3. Другие невирусные системы доставки генетического материала.

1.2.3. Генетическая терапия с использованием генов антимикробных пептидов.

1.2.4. Системы регуляции экспрессии генов.

1.2.4.1. Молекулярные механизмы тетрациклин-зависимой регуляции экспрессии.

1.2.4.2. Фармакология доксициклина.

1.3. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТА ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.3.1. Микоплазмы.

1.3.2.Хламиди и.

1.3.3. Белки мембраны включения хламидий.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Конструирование рекомбинантных илазмид, экспрессирующих гены антимикробных пептидов.

2.2. Тестирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих гены антимикробных пептидов в инфицированных Mycoplasma hominis и Chlamydia trachomatis линиях клеток эукариот.

2.3. Транскриптомное и протеомное профилирование.

2.4. Тестирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих гены антимикробных пептидов на инфицированных лабораторных животных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. СОЗДАНИЕ И ИСПЫТАНИЯ ПРОТОТИПОВ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ. ФОРМИРОВАНИЕ МОДЕЛИ.

3.1.1. Получение и тестирование in vitro рекомбинанных конструкций, экспрессирующих ген антимикробного пептида мелиттииа.

3.1.1.1. Плазмидные конструкции с конститутивной экспрессией гена.

3.1.1.2. Плазмидные конструкции с регулируемой экспрессией гена.

3.1.1.3. Тестирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген мелиттина в инфицированных Mycoplasma hominis и Chlamydia trachomatis линиях клеток HeLa/Tet-On и HeLa/Tet-Off.

3.1.2. Получение и тестирование in vivo рекомбинанных конструкций, экспрессирующих ген антимикробного пептида мелиттина.

3.1.2.1. Создание инфекционной модели M.hominis.

3.1.2.2. Создание инфекционной модели C.trachomatis.

3.1.2.3. Получение плазмидных конструкций, экспрессирующих ген мелитина для экспериментов in vivo.

3.1.2.4. Тестирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген мелиттина у мышей, инфицированных M.hominis и C.trachomatis.

3.1.2.5. Тестирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген мелиттина у цыплят-бройлеров, инфицированных M.gallisepticum.

3.2. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТОТИПОВ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ.

3.2.1. Влияние экспрессии гена мелиттина на транс-мембранный потенциал и состояние редокс-системы клетки.

3.2.1.1. Изменение трансмембранного потенциала при экспрессии гена мелиттина.

3.2.2. Роль внутриклеточного восстановленого глутатиона в развитии инфекции Chlamydia trachomatis.

3.2.2.1. Начальная фаза инфекции Chlamydia trachomatis и глутатион.

3.2.2.2. Влияние экспрессии гена мелиттина на концентрацию глутатиона в клетке.

3.2.2.3. Определение концентрации GSH после обработки клеток бутионин сульфоксимином (BSO).

3.2.2.4. Влияние NAC (]Ч-ацетил-Ь-цистеина) на уровень внутриклеточного восстановленного глутатиона.

3.2.2.5. Влияние BSO и NAC на развитие инфекции C.trachomatis.

3.2.2.6. Концентрация GSH, жизнеспособность клеток и развитие хламидийной инфекции при обработке клеток перекисью водорода.

3.2.2.7. Дифференциальный протеомный анализ клеток линии HeLa при обработке GSH-модулирующими агентами.

3.2.2.8. Транскрипционное профилирование клеток при обработке GSH-модулирующими агентами.

3.3. ТРАНСКРИПТОМНЫЙ И ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОК,

ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН МЕЛИТТИНА.

3.3.2. Протеомное профилирование клеток, экспрессирующих ген мелиттина.

3.3.1. Транскриптомное профилирование клеток, экспрессирующих ген мелиттина.

3.4. БЕЛКИ МЕМБРАНЫ ВКЛЮЧЕНИЯ С. TRA СНОМ A TIS.

3.4.1. Получение рекомбинантных конструкций, экспрессирующих гены Inc-белков для определения их локализации внутри клетки.

3.4.2. Определение локализации Inc-белков С. trachomatis при экспрессии их генов в клетках линии HeLa.

3.4.3. Ко-локализации Inc-белков С. trachomatis с эукариотическими органеллами при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa.

3.4.4. Определение влияния таксола и брефелдина А на распределение составного белка GFP-IncC при экспрессии кодирующего его гена в клетках линии

HeLa.

3.5. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТОТИПОВ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ. ПРИМЕНЕНИЕ МОДЕЛИ ДЛЯ НОВЫХ АМП.

3.5.1. Исследование антимикробного действия пептидов из яда пауков на ЭТ C.trachomatis.

3.5.2. Получение рекомбинантных конструкций, экспрессирующих гены АМП из яда пауков и тестирование их активности в культуре клеток.

3.5.3. Тестирование активности рекомбинантных конструкций, экспрессирующих гены АМП из яда пауков на различных стадиях инфекции

C.trachomatis.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новая стратегия использования генов антимикробных пептидов из яда членистоногих в качестве генотерапевтических агентов"

За последние 5 лет более 30 млрд. долларов было потрачено мировой фармацевтической промышленностью на разработку новых антибиотиков. Если резистентность микроорганизмов к лекарственным средствам будет развиваться столь быстро, большинство этих инвестиций могут быть потеряны (http://www.who.int/topics/drugresistance/en/). В связи с этим, активно обсуждается вопрос о создании альтернативных терапевтических средств, резистентность к которым будет развиваться ограниченно, или полностью отсутствовать. Такими средствами могут явиться антимикробные пептиды (АМП) - уникальная и чрезвычайно разнообразная группа соединений, являющаяся основным компонентом врожденного иммунитета.

Природные антимикробные пептиды являются неотъемлемой частью любого организма и выполняют роль либо «наступательного», либо «оборонительного» оружия [30, 133, 538]. В настоящее время идентифицировано более 2 ООО антимикробных пептидов, выделенных из представителей всех классов растений и животных. Это пептиды продуцируются различными тканями и типами клеток беспозвоночных, растений и животных [168, 296, 601], а также представляют собой результат процессинга высокомолекулярных белков.

Несомненными преимуществами антимикробных пептидов перед антибиотиками являются более широкий спектр антибактериального действия, функциональная активность при наномолярных концентрациях, ограниченная возможность формирования резистентности возбудителей к антимикробным пептидам, возможность синтеза аналогов природных пептидов с измененными биологическими свойствами [380]. Ограниченная возможность формирования устойчивости к АМП объясняется уникальным механизмом их действия, заключающемся в формировании мембранных каналов с последующей фрагментацией мембраны бактериальной клетки. Однако, многие АМП, как выделенные из природных источников, так и синтезированные искусственно, часто обладают выраженной гемолитической и цитотоксической активностью для клетки-хозяина [410]. Изменение биологических свойств пептидов, выделенных из природных источников является сейчас самой актуальной задачей при использовании АМП в качестве терапевтических агентов.

Рынок антимикробных пептидных лекарств оценивается в 1 млрд долларов, с ежегодным прогнозируемым приростом 10%. Ведущими в этой области фармацевтическими компаниями (Magainin Pharmaceuticals, Micrologix Biotech, Entomed S.A.) разрабатываются препараты на основе антимикробных пептидов для лечения различных заболеваний. АМП сегодня являются основой для создания новейших антибактериальных, антигрибковых и антивирусных препаратов [83, 479, 311], препаратов для лечения паразитарных инфекций [349], лечения онкологических заболеваний [177, 504]. Некоторые из АМП находятся на третьей стадии клинических испытаний.

Однако, несмотря на очевидные преимущества антимикробных пептидов, применение искусственно синтезированных или выделенных из природных источников препаратов пептидов в медицинской практике в настоящее время ограничено. Основными препятствиями в этом, как уже было сказано выше, являются дороговизна производства, высокая цитотоксическая активность для человека и животных и низкая селективность АМП. Сложившаяся ситуация требует разработки современных эффективных методов применения АМП в медицинской практике.

Первым таким подходом стал метод применения АМП в качестве генотерапевтических агентов, описанный в настоящей работе. Метод основан на введении в инфицированную клетку рекомбинантных конструкций и векторных систем, программированно экспрессирующих гены антимикробных пептидов. Таким образом, концентрационное воздействие АМП на мишень заменяется локальным адресным действием. Впервые реализованная в работе система регуляции экспрессии генов АМП позволила снизить цитотоксическое действие пептидов. Необходимо отметить, что аналогов данной разработки не существует.

В качестве мишени для применения АМП были выбраны две клинически значимые группы микроорганизмов — микоплазмы и хламидии. Выбор объекта основан на безусловной актуальности изучения этих патогенов для практического здравоохранения

России. Микоплазмы и хламидии остаются самыми распространенными бактериальными агентами, передающимися половым путем. Так, хламидии обнаруживаются у 5% здоровых людей и более чем у 20% пациентов кожно-венерологических клиник (Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2007 году»). Кроме того, уникальные особенности взаимоотношений этих внутриклеточных паразитов с иммунной системой человека часто способствуют развитию персистенции инфекционного агента в организме.

Цель работы: разработать основу для реализации генотерапевтических подходов к лечению микоплазмозов и хламидиозов с использованием генов антимикробных пептидов. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) Сконструировать рекомбинантные плазмидные векторы, экспрессирующие гены антимикробных пептидов - мелиттина из яда пчелы и пептидов (латарцинов) из яда паука-¿.¿агабаеш.

3) Создать инфекционные модели микоплазмозов и хламидиозов у лабораторных животных.

5) Установить основные механизмы действия АМП на развитие микоплазменной и хламидийной инфекций.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Лазарев, Василий Николаевич

выводы.

1. Получена серия рекомбинантных плазмидных векторов, экспрессирующих гены антимикробных пептидов: мелиттина из яда пчелы, латарцинов из яда паука. Впервые в состав этих векторов включены элементы для регулируемой тетрациклин-зависимой экспрессии генов АМП в клетке.

2. Впервые показана эффективная элиминация M.hominis и С.trachomatis из культуры клеток HeLa и НЕК 293, трансфицированных рекомбинантными конструкциями, экспрессирующими гены АМП.

3. Разработаны инфекционные модели микоплазмозов {M.hominis у мышей и M.gallisepticum у цыплят-бройлеров) и хламидиозов {С.trachomatis у мышей). Показана элиминация M.hominis и С.trachomatis у мышей после интравагинального, a M.gallisepticum после аэрозольного введения рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген мелиттина.

4. Доказана роль внутриклеточного восстановленного глутатиона в развитии инфекции С.trachomatis. Снижение его уровня после химической обработки клеток и при экспрессии гена мелиттина приводит к ингибированию развития инфекции С.trachomatis.

5. Впервые с использованием транскриптомного и протеомного анализов выявлен спектр механизмов действия АМП на внутриклеточных паразитов. Помимо прямого бактерицидного эффекта продемонстрировано снижение трансмембранного потенциала клеток, экспрессирующих ген мелиттина,'изменение редокс-состония клетки и нарушение внутриклеточного трафика, приводящее к нарушению цикла развития хламидий.

6. Впервые с использованием колокализации с репортерным геном и применением селективных ингибиторов секреторного пути показана связь белков мембраны включения С. trachomatis с секреторным путем клетки.

7. Благодаря применению регулируемой экспрессии генов антимикробных пептидов, сопряженной с различными схемами инфицирования С. trachomatis, впервые установлено, что максимальный антимикробный эффект полученных прототипов генно-инженерных препаратов наблюдается на ранней фазе развития инфекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Задолго до появления адаптивного иммунитета, с присущими ему специфичностью, памятью и комплексностью, около 2.6 миллионов лет тому назад уже существовала простейшая, неспецифичная система врожденного иммунитета, которая и сейчас является основным «защитным барьером», а иногда и «наступательным оружием» всех живых организмов. Врожденный иммунитет, непременно, должен обладать несколькими основными характеристиками: быстротой, «избыточностью» и мультифункциональностью. Если говорить об антимикробной функции врожденного иммунитета, то она реализуется, в частности, с помощью коротких катионных пептидов (антимикробных пептидов), активных в отношении как Грам-положительных, так и Грам-отрицательных бактерий, грибов и некоторых вирусов. Механизмом действия АМП, практически во всех случаях, является разрушение клеточной мембраны микроорганизмов, однако, наши знания о точных путях этого процесса остаются далеко неполными [601].

Сегодня антимикробные пептиды являются одними из самых перспективных антиинфекционных агентов. Сложилась парадоксальная ситуация — после нескольких десятилетий бурного развития химии антибиотиков, мы опять возвращаемся к древнейшим биологическим соединениям - антимикробным пептидам. Движущей силой поиска новых антимикробных соединений, безусловно, является появление многочисленных случаев резистентности микроорганизмов к используемым сейчас антибиотикам [547]. Фармацевтические фирмы непрерывно модифицируют существующие антибиотики и создают новые. К сожалению, сейчас уже можно признать, что скорость синтеза новых антибиотиков ниже скорости появления резистентных, а в ряде случаев, и мультирезистентных штаммов микроорганизмов.

Несомненно, антимикробные пептиды имеют множество преимуществ по сравнению с антибиотиками. К этим преимуществам относятся: ограниченная возможность формирования резистентности к АМП в силу особенностей механизма антимикробного действия; локальное введение препарата; более широкий спектр антимикробного действия; действие в наномолярных концентрациях; неограниченная возможность химического синтеза аналогов АМП с измененными биологическими свойствами, в том числе и со сниженной токсичностью для эукариотической клетки.

Теоретически, возможна реализация нескольких стратегий применения антимикробных пептидов [186]: i) как отдельных антимикробных препаратов; ii) в комбинации с традиционными антибиотиками для достижения аддитивного или синергетического эффекта; iii) как иммуностимулирующих агентов для стимуляции системы врожденного иммунитета; iv) как эндотоксин-нейтрализующих субстанций для предотвращения потенциальных осложнений, вызванных факторами вирулентности бактерий и приводящих к септическому шоку. Наиболее перспективным сегодня считается применение АМП в качестве отдельных препаратов, хотя возможность применения этих пептидов как эндотоксин-нейтрализующих агентов также рассматривается.

Уникальность АМП как антиинфекционных препаратов заключается в механизме их действия. В общем случае, для гибели бактерии из-за повреждения мембраны, необходимо три шага: связывание АМП с бактериальной мембраной, аггрегация внутри мембраны и формирование каналов, что ведет к утечке внутреннего содержимого клетки и ее гибели. Интересно, что в случае нелитического действия пептида, он взаимодействует с мишенью внутри клетки. На первом этапе АМП должны преодолеть отрицательно заряженную внешнюю мембрану Грам-отрицательных бактерий, которая содержит липополисахариды или наружную мембрану Грам-положительных бактерий, содержащую кислые полисахариды [205]. Известно, что некоторые пептиды могут реализовывать антимикробные свойства сразу по нескольким механизмам [380]. Вне зависимости от модели, результатом действия антимикробных пептидов является гибель клетки.

Рынок антимикробных пептидных лекарств оценивается в 1 млрд $, с ежегодным прогнозируемым приростом 10.5%. Ведущими в этой области фармацевтическими компаниями (Magainin Pharmaceuticals, Micrologix Biotech, Entomed S.A.) разрабатываются препараты для лечения инфекционных заболеваний различной этиологии [83, 311, 479]. Однако, несмотря на очевидные преимущества АМП перед традиционными антибиотиками, применение этих пептидов в медицине ограничено. Во-первых это связано с дороговизной химического пептидного синтеза. Во-вторых, синтезированные АМП обладают цитотоксичностью по отношению к эукариотической клетке.

В данной работе впервые реализован подход к применению АМП для терапии инфекционных заболеваний, позволяющий снять эти ограничения. Вместо химически синтезированных пептидов, предложено использовать гены, кодирующие различные АМП. Нуклеотидные последовательности, кодирующие эти гены клонируются в плазмидные веторы, которые потом доставляются в инфицированные клетки, где экспрессия генов АМП приводит к элиминации патогенов. Также, в данной работе впервые предложена система точной регуляции экспрессии генов АМП, что позволяет снять ограничение, касающееся токсичности АМП для эукариотической клетки. Таким образом, концентрационное воздействие АМП на мишень заменяется локальным адресным действием.

Объектом исследования стали уникальные по своей биологии внутриклеточные паразиты - микоплазмы и хламидии.

Лечение микоплазменных и хламидийных инфекций в настоящее время представляет довольно серьезную проблему. Так, например, в США, микоплазмозы и хламидиозы, вызываемые определенными штаммами возбудителя, относятся к самым распространенным заболеваниям, передающимся половым путем; согласно оценкам, заболеваемость ими составляет 3-4 млн. человек в год, а прямые и косвенные расходы, связанные с осложнениями данных заболеваний, достигают 1 млрд. долларов (www.who.intV В России проблема инфицирования данными возбудителями стоит еще острее. На сегодняшний день в Российской Федерации высокая заболеваемость внутриклеточными инфекциями остается одной из актуальных проблем в области практического здравоохранения. Во многом этому способствует сложившаяся в России и странах СНГ экономическая и демографическая ситуация (снижение социально-экономического уровня населения; создание рынка интимных услуг, наличие неконтролируемых миграционных потоков населения). Особое значение имеет внутриутробное инфицирование плода этими патогенами, приводящее к различным негативным последствиям, часто несовместимым с жизнью. Неконтролируемое применение антибактериальных препаратов, фальсификация лекарственных средств, и, как следствие, эскалация антибиотикорезистентности, отсутствие отечественных разработок в области создания новых антимикробных средств наносят колоссальный экономический ущерб и создают угрозу национальной безопасности страны. Таким образом, разработка современных антихламидийных и антимикоплазменных препаратов, развитие резистентности к которым будет ограничено, является чрезвычайно актуальной задачей.

В настоящей работе впервые реализован генотерапевтический подход к лечению инфекций, вызываемых микоплазмами и хламидиями. С целью подтверждения возможности использования генов антимикробных пептидов для элиминации этих внутриклеточных паразитов, мы использовали ген одного из самых изученных антимикробных пептидов - мелиттина. Мелиттин является основным токсическим компонентом пчелиного яда европейской пчелы Apis mellifera. Это катионный, линейный, a-спиральный амфипатический пептид состоящий из 26 аминокислотных остатков [128, 197]. Содержание мелиттина составляет почти 50% от сухого веса пчелиного яда. Этот пептид обладает гемолитической, антимикробной, антигрибковой, антипротозойной и противоопухолевой активностями [404].

На первом этапе работы нами были сконструированы плазмидные векторы, в состав которых входил ген мелиттина под контролем конститутивного раннего промотора цитомегаловируса человека. Однако, благодаря силе промотора, экспрессия гена в клетках линии HeLa приводила к практически 100%-ной их гибели. Очевидно, что экспрессия генов АМП, в силу особенностей механизма их действия должна быть прецизионно регулируемой. При этом, уровень экспрессии целевых генов должен: а) быть достаточным для элиминации возбудителя из инфицированной клетки; б) не оказывать цитотоксического действия на эту клетку.

Нами была выбрана тетрацин-зависимая система регуляции экспрессии генов как наиболее гибкая [187]. Эта система включает в себя оперон тетрациклиновой устойчивости TnlO E.coli (TetR) и последовательность Tet оператора (ТеЮ). В отсутствие тетрациклина или его производного (доксициклина) белок TetR связывается с последовательностью ТеЮ, в то время как в присутствии индуктора, TetR меняет свою конформацию, что приводит к дестабилизации комплекса [93, 155, 492].

Были сконструированы плазмидные векторы, экспрессирующие ген мелиттина под контролем тетрациклин-зависимого минимального промотора цитомегаловируса человека. Однако, для функционирования этой системы регуляции генов необходим еще и трансактиватор, который экспрессировался в специально полученной нами стабильно-трансфицированной линии клеток HeLa. Для тестирования аткивности полученных плазмидных конструкций мы использовали два варианта системы регуляции экспрессии гена мелиттина - Tet-On и Tet-Off [537]. После трансфекции этих линий клеток полученными векторами мы наблюдали ингибирование микоплазменной и хламидийной инфекции.

Таким образом, нами впервые была продемонстрирована возможность использования регулируемой экспрессии гена АМП для элиминации внутриклеточных паразитов из инфицированной клетки. Заметим, что удалось и реализовать возможность снижения токсичности мелиттина для эукариотической клетки, что подтверждено цитологическим анализом. Это явилось первым шагом для реализации генотерапевтических подходов для лечения инфекций, вызываемых микоплазмами и хламидиями.

Испытание полученных рекомбинантных плазмидных векторов на инфекционной модели микоплазмозов и хламидиозов у лабораторных животных стало следующим шагом.

Данная задача осложняется тем, что и Mycoplasma hominis и Chlamydia trachomatis являются патогенами человека и создать адекватный инфекционный процесс у лабораторных животных не всегда представляется возможным. Как правило, создание инфекционной модели подразумевает последовательное выполнение следующих действий: i) выбор лабораторного животного; и) сравнительное изучение способности клинических штаммов колонизировать определенные ткани лабораторного животного; iii) описание экспериментальной инфекции и отбор штамма, с наиболее выраженными вирулентными свойствами для дальнейших исследований [39, 152, 310, 507, 515].

Нам удалось создать адекватные, стабильно воспроизводящиеся инфекционные модели микоплазмоза и хламидиоза у лабораторных мышей путем пассирования возбудителя через слизистую оболочку урогенитального тракта мышей (для микоплазм) и предварительной гормональной обработки (для микоплазм и хламидий) [513].

На следующем этапе предстояло установить принципиальную возможность использования рекомбинантных плазмидных векторов, экспрессирующих гены АМП (на примере мелиттина) для элиминации микоплазм и хламидий из урогенитального тракта инфицированных лабораторных мышей. Однако, тестирование созданных плазмидных конструкций in vivo осложнялось тем фактом, что в разработанной системе точного регулирования экспрессии генов, целевой ген под контролем минимального промотора цитомегаловируса человека и трансактиваторные белки находятся в разных плазмидных векторах. Известно, что эффективность котрансфекции двумя и более плазмидными векторами несравнимо ниже, нежели эффективность трансфекции единственным вектором. С целью преодоления этого ограничения мы впервые получили однокассетный вектор, который содержал все необходимые элементы системы точной регуляции экспрессии генов - ген мелиттина под контролем тетрациклин-зависимого промотора CMV и ген трансактиваторного белка rtTA под контролем конститутивного раннего промотора CMV, а также маркерный ген gfp и все необходимые регуляторные элементы.

С использованием липофекции мы вводили сконструированный вектор мышам интравагинально (доксициклин вводился внутримышечно) с последующим инфицированием их микоплазмами и хламидиями. Несмотря на то, что мы не обнаружили полного освобождения мышей от микоплазм и хламидий в пределах сроков наблюдения

4 недели), скорость элиминации возбудителей у мышей которым вводился- вектор и индуктор была выше, чем в контрольных группах (у двух третей животных к концу наблюдения микоплазмы и хламидии не детектировались). У этих же мышей воспалительная реакция на слизистой оболочке влагалища была гораздо менее выражена, что было подтверждено гистологическим анализом.

Фактически, настоящая работа является пионерской в области применения прототипов генно-инженерных препаратов для терапии микоплазмозов и хламидиозов. Но, как уже было сказано, Mycoplasma hominis и Chlamydia trachomatis являются патогенами человека и все вышеприведенные исследования будут неполными без ответа на вопрос: способны ли созданные генно-инженерные конструкции подавлять рост природных патогенов? Для этого мы использовали инфекционную модель Mycoplasma gallisepticum - респираторного патогена птиц. В настоящее время микоплазмозы, вызванные Mycoplasma gallisepticum, наряду с вирусными инфекциями, наносят самый ощутимый экономический ущерб в промышленном птицеводстве, вызывая тяжелые хронические респираторные заболевания у кур [345].

Необходимо отметить, что на этой модели инфекции мы применили аэрозольное введение рекомбинантных плазмид. Если говорить о практическом применении этих прототипов генно-инженерных препаратов, то такой путь введения кажется экономически более оправданным.

В группе птиц, которым вводился рекомбинантный вектор и индуктор не наблюдалась потеря веса у цыплят, отсутствовали респираторные признаки инфекции, патологоанатомические изменения внутренних органов, а частота ре-изоляции возбудителя была значительно ниже по сравнению с контрольными группами.

Необходимо отметить, что как в случае инфекционных моделей Mycoplasma hominis и Chlamydia trachomatis, так и в случае Mycoplasma gallisepticum вводимые дозы индуктора не влияли на развитие инфеции.

На этом этапе мы вправе уже выдвигать гипотезы о механизме действия антимикробных пептидов при их экспрессии в эукариотической клетке. Одной из пионерских работ в области действия АМП на микоплазмы стала работа Beven и Wroblewski [57]. Была исследована активность десяти амфипатических пептидов против представителей трех родов молликут: Acholeplasma, Mycoplasma и Spiroplasma. Пептиды животного происхождения (цекропин А и PI, магайнин) оказались менее эффективными, чем мелиттин из пчелиного яда и пептиды, продуцируемые бактериями (глобомицин, грамицидин S, сурфактин и валиномицин) или грибами (аламетицин). Все эти пептиды изменяли мембранный потенциал клеток молликут, независимо от структуры молекулы линейная или циклическая). Пептиды также индуцировали снижение подвижности и формы клеток спироплазм, подтверждая факт, что подвижность и форма клеток сопряжена с трансмембранным электрохимическим градиентом.

Эти данные подтверждают наше предположение, что одним из механизмов ингибирования микоплазменной и хламидийной инфекции при внутриклеточной экспрессии гена мелитина in vitro и in vivo является прямое бактерицидное действие. Однако, исходя из уникальных биологических свойств АМП, трудно представить, что механизм их действия ограничивается простым бактерицидным эффектом.

На следующих этапах работы мы попытались более полно охарактеризовать ранее неизученный спектр биологической активности антимикробных пептидов, гены которых экспрессируются внутри клетки.

Нами было показано, что экспрессия гена мелитина в трансфицированной клетке приводит к уменьшению ее трансмембранного потенциала более чем в 2 раза. В вышеупомянутой работе [57] продемонстрировано, что обработка микоплазм амфипатическими пептидами, такими как цекропин А, мелитин, маганин приводит к деполяризации их плазматических мембран, изменению морфологии и уменьшению подвижности. Мы можем предположить, что второй составляющей механизма действия мелиттина, возможно, является нарушение процесса адгезии микоплазм и хламидий к клетке, вследствие снижения трансмембранного потенциала, что, в свою очередь, приводит к измению нормального цикла их внутриклеточного развития [150, 417]. В любом случае, одним из ключевых моментов, на который влияет экспрессия антимикробных пептидов в клетке, нам представляется начальная фаза инфекции.

Несмотря на значительные успехи в изучении молекулярных основ внутриклеточного паразитизма хламидий, до сих пор остается до конца не выясненной начальная стадия инфекционного процесса, а именно, прикрепление и интернализация элементарного тельца в клетку. Недавние исследования указывают на то, что взаимодействие ЭТ с клеткой-хозяином — двустадийный процесс. Считалось, что начальная стадия прикрепления происходит за счет электростатического взаимодействия бактерии с гепаран сульфатом, содержащим гликозаминогликаны [497, 511], однако, в недавней работе [490], эта гипотеза не подтвердилась.

Этот процесс, опосредованный через белок ОтрА, экспонированный на поверхности ЭТ, обратим, и может различаться у разных видов и сероваров хламидий [497]. Вторая, необратимая, стадия прикрепления ЭТ была описана с использованием химически мутированных линий клеток [82], однако, специфического рецептора найдено не было. Известно, что структурная жесткость ЭТ хламидий определяется чрезвычайно сшитой природой комплекса белков наружной мембраны. Меж- и внутримолекулярные цистеиновые мостики обнаруживаются в цистеин-богатых белках наружной оболочки ЭТ, таких как ОтрА, ОтсВ, ОтсА [209]. Необходимость восстановления дисульфидных связей в течении начальной стадии хламидийной инфекции была впервые показана с использованием тиол-алкилирующего агента DTNB [414]. Наличие DTNB при заражении в течении 1 и 2 часов после начала инфекции снижало инфекционность хламидий на 30% при 4 °С и на 10% при 35 °С. Эти данные согласуются с экспериментами Abell and Brown [10], в которых показано, что в клетках ВНК-1 DTNB снижает инфекционность вируса Синдбис, белки вирусного капсомера которого также связаны внутри- и межмолекулярными дисульфидными связями. Однако, источники редуктазной активности, которые вызывают конформационные изменения в оболочке ЕВ в начальной стадии инфекции, остаются" пока неизвестными.

Мы предположили, что таким агентом в клетке может являться восстановленный глутатион (GSH). Нами было показано, что при трансфекции плазмидным вектором, экспрессирующим ген мелиттина клеток линии НЕК 293, мы наблюдаем достоверное снижение уровня клеточного GSH. Далее, логичным представляется определить, как влияет изменение уровня GSH на развитие хламидийной инфекции.

Для модуляции уровня GSH в клетке мы использовали три различных подхода: обработка клеток бутионин сульфоксимином (BSO), который является необратимым ингибитором у -глутамилцистеин синтетазы, ключевого фермента в биосинтезе GSH, прямое окисление GSH перекисью водорода, а также культивирование клеток в присутствии N- ацетил-Ь-цистеина (NAC), который является предшественником GSH. B первых двух случаях мы наблюдали 4-6-кратное ингибирование хламидийной инфекции.

Основываясь на этих результатах, мы можем сделать другое предположение о возможном механизме действия мелиттина при его экспрессии внутри клетки. Экспрессия гена мелитина приводит к снижению уровня GSH в клетке. Мы полагаем, что одним из возможных механизмов ингибирования хламидийной инфекции в этом случае является критическое уменьшение концентрации внутриклеточного GSH, что не позволяет эффективно восстанавливать дисульфидные связи в течении начальной стадии инфекции. Эти предположения косвенно подтверждаются в экспериментах с другими инфекционными агентами, в частности, вирусами. Так, снижение в клетке уровня GSH ведет к ингибированию репликации эховируса человека типа 9, ВИЧ-1, вируса гриппа А, и, как следствие, к снижению циотоксического эффекта [337, 362, 445]. Однако, для для изучения вопроса, приводит ли к изменению белкового состава клетки обработка GSH-модулирующими агентами, мы использовали дифференциальный протеомный анализ и транскрипционное профилирование клеток при воздействии на них BSO, NAC и Н2О2. После проведения дифференциального двухмерного электрофореза белков, экстрагированных из клеточных линий, обработанных вышеуказанными агентами, мы обнаружили, что снижение инфекционности С.trachomatis в клетках, инкубированных с BSO и Н2О2 не связано с изменением белкового профиля, что подтверждает гипотезу о том, что внутриклеточный глутатион является основным восстановителем дисульфидных связей в наружной оболочке элементарного тельца хламидий и играет решающую роль в начальной стадии развития инфекции С. trachomatis.

Как уже говорилось выше, экспрессия гена мелиттина в клетке приводит к снижению концентрации GSH. Поскольку в первой части работы мы показали возможность использования мелиттина как генотерапевтического агента и потенциального генно-инженерного средства для терапии микоплазмозов и хламидиозов, возникает вопрос - а как влияет экспрессия гена этого АМП на протеомный и транскрипционный профили клетки? Другими словами - по каким механизмам происходит ингибирование микоплазменной и хламидийной инфекций?

Использовав транскриптомное и протеомное профилирование клеток, экспрессирующих ген мелиттина, мы предложили еще несколько возможных механизмов антихламидийного действия этого пептида. Во-первых, нарушение внутриклеточного трафика хламидий в результате изменений в работе актинового цитоскелета приводит к остановке развития хламидийного включения и появлению абберантных форм. Во-вторых, снижение количества прогестероновых рецепторов в результате экспрессии мелиттина приводит к снижению способности ЭТ хламидий к интернализации. И, наконец, изменение редок-баланса внутри клетки также приводит к ингибированию инфекции С. trachomatis. Эти факты, полученные впервые, возможно, послужат заделом как в развитии новых знаний о механизме внутриклеточного паразитизма хламидий, так и в создании нового поколения высокоэффективных антихламидийных препаратов.

Наше предположение о том, что ингибироване развития инфекции С.trachomatis происходит на ранней стадии, выдвигает на первый план вопрос: какие же хламидийные гены экспрессируются на этой стадии? Вероятнее всего, что либо напрямую, либо опосредованно, белки, кодируемые этими генами и являются одной из мишеней для действия антимикробных пептидов.

Хламидии активно модифицируют поверхность включения с помощью собственных белков, и этот процесс начинается непосредственно после интернализации ЭТ в клетку. Эти белки прежде других привлекают внимание в качестве потенциальных медиаторов взаимодействия хламидий с эукариотической клеткой. Первые хламидийные белки в составе мембраны включения (Inc-белки) были обнаружены более десяти лет назад, с тех пор их число значительно увеличилось, в основном благодаря расшифровке хламидийных геномов.

Нами была сконструирована серия плазмидных векторов, в которых гены, кодирующие Inc-белки, экспрессировались в виде составных белков с GFP. Мы исходили из предположения, что определение локализации Inc-белков при экспрессии кодирующих их генов в эукариотической клетке может привести к обнаружению взаимосвязи данных белков с клеточными структурами.

Все изучаемые нами белки в процессе биогенеза оказались связанными с ЭПР эукариотической клетки и их транспорт шел по секреторному пути. IncA, IncD, IncB и IncF на протяжении всего цикла наблюдения выявлялись в составе ЭПР. IncG и IncE выявлялись сначала в ЭПР, но очень быстро транспортировались в аппарат Гольджи. На поздних сроках трансфекции белки локализовались в аппарате Гольджи и многочисленных везикулах, связанные с транс-Гольджи ретикулумом. IncC транспортировался от ЭПР через Гольджи до наружной мембраны и доставлялся на поверхность клетки в составе везикул. Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные указывают на то, что хламидийные белки могут вступать во взаимодействие с белками секреторного пути либо выполнять их функцию. Hackstadt с соавт. убедительно продемонстрировали, что 40-50% синтезируемого сфингомиелина из добавленного извне NBD-церамида транспортируется из аппарата Гольджи в хламидийное включение и впервые выдвинули предположение, что С. trachomatis обладает уникальным инструментом, осуществляющим процесс распознавания и перехвата экзоцитарных везикул [199].

Результаты нашего исследования подтверждают способность белков мембраны включения С. trachomatis взаимодействовать с белками секреторного пути, что и было успешно нами доказано с использованием препаратов таксола (подавляет деполимеризацию микротрубочек) и брефелдина (необратимый ингибитор транслокации белков из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи). Поэтому гипотеза об изменениях во внутриклеточном трафике и, соответственно, в секреторном пути клетки при экспрессии мелиттина находит еще одно свое подтверждение.

Подводя предварительный итог всему вышесказанному, мы можем заключить, что выбранный нами ген модельного пептида мелиттина и созданная система прецизионной регуляции его экспрессии могут использоваться для генетической терапии инфекций, вызываемых микоплазмами и хламидиями. Однако, для подтверждения достоверности этого утверждения, необходимо выяснить эффективность работы этого подхода на других антимикробных пептидах. Мы остановили свой выбор на линейных катионных пептидах из яда пауков.

Ядовитые животные, среди которых особое место занимают членистоногие (скорпионы, пауки, пчелы, осы, шершни, муравьи), в ходе длительной эволюции выработали уникальные средства нападения и обороны - яды. Большинство изученных на сегодняшний день пауков производят яд с преобладанием дисульфид-содержащих пептидных нейротоксинов. Среди изученных пауков, L. tarabaevi и O.kitabensis оказались уникальными по составу яда или «репертуару» вырабатываемых токсинов [3]. Однако линейные катионные пептиды из ядов пауков представляют отдельный интерес.

Также как и в случае с мелиттином, были получены плазмидные конструкции, экспрессирующие гены латарцинов и цитоинсектотоксин CIT 1а (из яда паука L. tarabaevi). Полученными плазмидами были трансфицированы клетки линии НЕК 293. Условия экспериментов были аналогичны таковым с плазмидными конструкциями, экспрессирующими ген мелиттина. Необходимо отметить, что пептид CIT 1а демонстрировал ингибирующий эффект даже больший (около 80%), по сравнению с мелиттином (75%).

Таким образом, разработанная нами регулируемая система экспрессии генов АМП, эффективно работает на модели мелиттина, антимикробного пептида из яда пчелы, и может эффективно использоваться для экспрессии генов АМП любого происхождения, что и было продемонстрировано на пептидах из яда паука.

И, наконец, на последнем этапе, применяя различные схемы индукции экспрессии генов АМП, сопряженной с заражением С. trachomatis мы доказали, что АМП при внутриклеточной экспрессии их генов действуют именно на ранней стадии инфекции, а не на средней и, тем более, не на поздней.

В практическом отношении выделим тот факт, что созданная в работе система регуляции экспрессии генов АМП позволила снять два основных ограничения применения АМП в терапевтических целях - токсичность для эукариотической клетки и низкую селективность. Используемые «гомеопатические» дозы индуктора (доксициклина) во-первых, не влияли на развитие хламидийной и микоплазменной инфекций, таким образом, отсутствовал селективный пресс антибиотика, способный вызывать появление резистентных штаммов. Во-вторых, уровень экспрессии АМП был достаточен для элиминации патогена из инфицированной клетки.

Созданный подход был успешно апробирован на инфекционных моделях микоплазмозов и хламидиозов человека у лабораторных мышей, а также на модели естественного патогена птиц - M.gallisepticum. Стоит отметить, что применение разработанных прототипов генно-инженерных препаратов возможно различными путями - интравагинально для урогенитальных патогенов и аэрозольно для респираторных патогенов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Лазарев, Василий Николаевич, Москва

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях, Москва, Медицина, 1962.

2. Борхсениус С.Н., Чернова О.А., Чернов В.М., Вонский М.С., 2002: Микоплазмы. Санкт-Петербург, НАУКА.

3. Василевский А.А. 2008. Цитолитические и антимикробные пептиды из яда паука Lachesana tarabaevi. Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук. Москва.

4. Василевский А.А.,. Козлов С.А, Жмак М.Н., Куделина И.А., Дубовский П.В.,. Шатурский О.Я, Арсеньев А.С., Гришин Е.В. 2007. Синтетические аналоги антимикробных пептидов из яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi. Биоорганическая химия, 33:405-412.

5. Кнорре Д.Г., Власов В.В. 1992. Клеточные мембраны как барьер при биологических применениях антисмысловых олигонуклеотидов, их производных и аналогов. Биоорган, химия 18:1330-1340.

6. Прозоровский С.В., Раковская И.В., Вульфович Ю.В. Медицинская микоплазмология, Москва, «Медицина», 1995, с.288.

7. Семененко Т.А., Готвянская Т.П., Васильева В.И. 1981. Сравнительное изучение смешанной микоплазменной и пневмококковой инфекции у хомяков. ЖМЭИ 12:62-66.

8. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. 2005. Глутатион у бактерий. Биохимия 70:14591473.

9. Abdelrahman Y.M., Belland R.J. 2005. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiol Rev 29:949-959.

10. Abell B.A., Brown D. 1993. Sindbis virus membrane fusion is mediated by reduction of glycoprotein disulfide bridges at the cell surface. J Virol 67:5496-5501.

11. Adler H.T., Nallaseth F.S., Walter G., Tkachuk D.C. 1997. HRX leukemic fusion proteins form a heterocomplex with the leukemia-associated protein SET and protein phosphatase 2A. J Biol Chem 272:28407-28414.

12. Agerberth B., Gunne H., Odeberg J., Kogner P., Boman H.G., G.H. Gudtnundsson. 1995. Fall-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine- free and expressed in bone marrow and testis. Proc Natl Acad Sci USA 92:195-199.

13. Agwuh K.N., MacGowan A. 2006. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the tetracyclines including glycylcyclines. J Antimicrob Chemother 58:256-265.

14. Akey C.W., Luger K. 2003. Histone chaperones and nucleosome assembly. Curr Opin Struct Biol 13:6-14.

15. Alberola J., Rodriguez A., Francino O., Roura X., Rivas L., Andreu D. 2004. Safety and efficacy of antimicrobial peptides against naturally acquired leishmaniasis. Antimicrob Agents Chemother 48:641-643.

16. Allaker R.P., Kapas S. 2003. Adrenomedullin and mucosal defence: interaction between host and microorganism. Regul Pept 112:147-152.

17. Allan I., Pearce J.H. 1983. Amino acid requirements of strains of Chlamydia trachomatis and C. psittaci growing in McCoy cells: relationship with clinical syndrome and host origin. J Gen Microbiol 129:2001-2007.

18. Allen J.E., Cerrone M.C., Beatty P.R., Stephens R.S. 1990. Cysteine-rich outer membrane proteins of Chlamydia trachomatis display compensatory sequence changes between biovariants. Mol. Microbiol 4:1543-1550.

19. Allende D., Mcintosh T.J. 2003. Lipopolysaccharides in bacterial membranes act like cholesterol in eukaryotic plasma membranes in providing protection against melittin-induced bilayer lysis. Biochemistry 42:1101-1108.

20. Allende D., Simon S.A., Mcintosh T.J. 2005. Melittin-induced bilayer leakage depends on lipid material properties: evidence for toroidal pores. Biophys J 88:1828-1837.

21. Altman H. Steinberg D., Porat Y., Mor A., Fridman D., Friedman M., Bachrach G. 2006. In vitro assessment of antimicrobial peptides as potential agents against several oral bacteria. J Antimicrob Chemother 58:198-201.

22. Amsterdam D. 1996. Susceptibility testing of antimicrobials in liquid media. In Antibiotics in laboratory medicine (Lorian, V., ed.), pp. 52-111, Williams & Wilkins, Baltimore.

23. Anchordoquy T.J., Carpenter J.F., Kroll D.J. 1997. Maintenance of transfection rates and physical characterization of lipid/DNA complexes after freeze-drying and rehydration. Arch Biochem Biophys 348:199-206.

24. Apolloni A., Prior I.A., Lindsay M., Parton R.G., Hancock J.F. 2000. H-ras but not K-ras traffics to the plasma membrane through the exocytic pathway. Mol Cell Biol 20:24752487.

25. Aranha C., Manjramkar D.D., Reddy IC.V.R. 2004. Preclinical evaluation of Magainin-A as a contraceptive antimicrobial agent. Fertil Steril 81:1357-1365.

26. Aruoma O.I., Halliwell B., Hoey B.M., Butler J. 1989. The antioxidant action of N-acetylcysteine: its reaction with hydrogen peroxide, hydroxyl radical, superoxide, and hypochlorous acid. Free Radic Biol Med 6: 593-597.

27. Arya O.P., Tong C.Y., Hart C.A., Pratt B.C., Hughes S., Roberts P., Kirby P., Howel J., McCormick A., Goddard A.D. 2001. Is Mycoplasma hominis a vaginal pathogen? Sex Transm Infect 77:58-62.

28. Asthana N., Yadav S.P., Ghosh J.K. 2004. Dissection of antibacterial and toxic activity of melittin: a leucine zipper motif plays a crucial role in determining its hemolytic activity but not antibacterial activity. J Biol Chem 279:55042-55050.

29. Auvynet C., Rosenstein Y. 2009. Multifunctional host defense peptides: antimicrobial peptides, the small yet big players in innate and adaptive immunity. FEBS J 276:64976508.

30. Azenabor A.A., Chaudhry A.U. 2003. Chlamydia pneumoniae survival in macrophages is regulated by free Ca2+ dependent reactive nitrogen and oxygen species. J Infect 46:120128.

31. Azenabor A.A., Muili K., Akoachere J.F., Chaudhry A. 2006. Macrophage antioxidant enzymes regulate Chlamydia pneumoniae chronicity: evidence of the effect of redox balance on host-pathogen relationship. Immunobiology 211:325-339.

32. Bachar M., Becker O.M. 2000. Protein-induced membrane disorder: a molecular dynamics study of melittin in a dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer. Biophys J 78:1359-1375.

33. Bai Y., Trang P., Li H., Kim K., Zhou T., Liu F. 2008. Effective inhibition in animals of viral pathogenesis by a ribozyme derived from RNase P catalytic RNA. Proc Natl Acad Sei US A 105:10919-10924.

34. Ballweber L.M., Jaynes J.E., Stamm W.E., Lampe M.F. 2002. In vitro microbicidal activitites of cecropin peptides D2A21 and D4E1 and gel formulations containing 0.1% to 2% D2A21 against Chlamydia trachomatis. Antimicrob Agents Chemother 46:34^11.

35. Bals R. 2000. Epithelial antimicrobial peptides in host defense against infection. Respir Resl: 141-50.

36. Bals R., Weiner D.J., Moscioni A.D., Meegalla R.L., Wilson J.M. 1999. Augmentation of innate host defense by expression of a cathelicidin antimicrobial peptide. Infect Immun 67:6084-6089.

37. Bals R., Wilson J.M. 1999. Cystic fibrosis, antimicrobial peptides and gene therapy. Neth J Med 54: S10-1.

38. Banerjee A.K., Angulo A.F., Polak-Vogelzang A.A., Kershof A.M. 1985. Naturally occurring genital mycoplasmosis in mice. Lab Anim 19:275-256.

39. Bannantine J.P., Griffiths R.S., Viratyosin W., Brown W.J., Rockey D.D. 2000. A secondary structure motif predictive of protein localization to the chlamydial inclusion membrane. Cell Microbiol 2:35-47.

40. Bannantine J.P., Rockey D.D., Hackstadt T. 1998. Tandem genes of Chlamydia psittaci that encode proteins localized to the inclusion membrane. Mol Microbiol 28:1017-1026.

41. Barnham K.J., Monks S.A., Hinds M.G., Azad A.A., Norton R.S. 1997. Solution structure of a polypeptide from the N-terminus of the HIV protein Nef. Biochemistry 36:5970-5980.

42. Barnor J.S., Habu Y., Yamamoto N., Miyano-Kurosaki N., Ishikawa K., Takaku H. 2009. Inhibition of HIV-1 replication by long-term treatment with a chimeric RNA containing shRNA and TAR decoy RNA. Antiviral Res 83:156-164.

43. Baron U., Gossen M., Bujard H. 1997. Tetracycline-controlled transcription in eukaryotes novel transactivators with graded transactivation potential. Nucleic Acids Res 25:27232729.

44. Barroso-DelJesus A., Puerta-Fernandez E., Tapia N., Romero-Lopez C., Sanchez-Luque F.J., Martinez M.A., Berzal-Herranz A. 2005. Inhibition of HIV-1 replication by an improved hairpin ribozyme that includes an RNA decoy. RNA Biol 2:75-79.

45. Batenburg A.M., van Esch J.H., de Kruijff B. 1988. Melittin-induced changes of the macroscopic structure of phosphatidylethanolamines. Biochemistry 27:2324-2331.

46. Bechinger B. 1997. Structure and functions of channel-forming peptides: magainins, cecropins, melittin and alamethicin. J Membr Biol 156:197-211.

47. Bechinger B. 1997. Structure and functions of channel-forming peptides: magainins, cecropins, melittin and alamethicin. J Membr Biol 156:197-211.

48. Behr J.P., Demeneix B., Loeffler J.P., Perez-Mutul J. 1989. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 86:6982-6986.

49. Belland R.J., Zhong G., Crane D.D., Hogan D., Sturdevant D., Sharma J., Beatty W.L., Caldwell H.D. 2003. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proc Natl Acad Sci U S A 100:8478-8483.

50. Benachir T., Lafleur M. 1996. Osmotic and pH transmembrane gradients control the lytic power of melittin. Biophys J 70:831-840.

51. Ben-Efraim I., Shai Y. 1997. The structure and organization of synthetic putative membranous segments of ROMK1 channel in phospholipid membranes. Biophys. J. 72:85-96.

52. Berkhout B. and ter Brake O. 2009. Towards a durable RNAi gene therapy for HIVAIDS. Expert Opin Biol Ther 9:161-170.

53. Berman B., Perez O.A., Zell D. 2007. Update on rosacea and anti-inflammatory-dose doxycycline, Drugs Today (Bare.) 43:27-34.

54. Beschiaschvili G., Seelig J. 1990. Melittin binding to mixed phosphatidylglycerol/ phosphatidylcholine membranes. Biochemistry 29:52-58.

55. Beven L., Wroblewski H. 1997. Effect of natural amphipathic peptides on viability, membrane potential, cell shape and motility of mollicutes. Res Microbiol 148:163-175.

56. Bieber T., Meissner W., Kostin S., Niemann A., Elsasser H.P. 2002. Intracellular route and transcriptional competence of polyethylenimine-DNA complexes. J Control Release 82:441-454.

57. Blondelle S.E., Houghten R.A. 1991. Hemolytic and antimicrobial activities of twenty-four individual omission analogues of melittin. Biochemistry 30:4671-4678.

58. Boeckle S., Fahrmeir J., Roedl W., Ogris M., Wagner E. 2006. Melittin analogs with high lytic activity at endosomal pH enhance transfection with purified targeted PEI polyplexes. J Control Release 112:240-248.

59. Boeckle S., Wagner E., Ogris M. 2005. C- versus N-terminally linked melittin-polyethylenimine conjugates: the site of linkage strongly influences activity of DNA polyplexes. J Gene Med 7:1335-1347.

60. Boman H.G., Agerberth B., Boman A. 1993. Mechanisms of action on Escherichia coli of cecropin PI and PR-39, two antibacterial peptides from pig intestine. Infect Immun 61:2978-2984.

61. Bonner W.M. 1975. Protein migration into nuclei. I. Frog oocyte nuclei in vivo aCCUmulate microinjected histones, allow entry to small proteins, and exclude large proteins. J Cell Biol 64:421-430.

62. Borenstein L.A., Ganz T., Sell S., Lehrer R.I., Miller J.M. 1991. Contribution of rabbit leukocyte defensins to the host response in experimental syphilis. Infect Immunol 59:1368-1377.

63. Boussif O., Zanta M.A., Behr J.P. 1996. Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold. Gene Ther 3:1074-1080.

64. Bove J.M. 1993. Molecular features of mollicutes. Clin Infect Dis 17 SuppI 1:S10-31.

65. Bradshaw J. Cationic antimicrobial peptides: issues for potential clinical use. 2003. BioDrugs 17:233-240.

66. Braff M.H., Zaiou M., Fierer J., Nizet V., Gallo R.L. 2005. Keratinocyte production of cathelicidin provides direct activity against bacterial skin pathogens. Infect Immun 73:6771-6781.

67. Broekaert I., Lee H. I., Kush A., Chua N.H., Raikhel N. 1990. Wound-induced accumulation of mRNA containing a hevein sequence in laticifers of rubber tree (Hevea brasiliensis). Proc Natl Acad Sci U S A 87:7633-7637.

68. Brogden K.A. 2005. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol 3:238-250.

69. Brogden K.A., Ackermann M., Huttner K.M. 1997. Small, anionic, and charge-neutralizing propeptide fragments of zymogens are antimicrobial. Antimicrob Agents Chem 41:1615-1617.

70. Brogden K.A., De Lucca, A.J., Bland J., Elliott S. 1996. Isolation of an ovine pulmonary surfactant-associated anionic peptide bactericidal for Pasteurella haemolytica. Proc Natl Acad Sci USA 93:412-416.

71. Bulet P., Dimarcq J.L., Hetru C., Lagueux M., Charlet M., Hegy G., Van Dorsselaer A., Hoffmann J.A. 1993. A novel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries an O-glycosylated substitution. J Biol Chem 268:14893-14897.

72. Buonocore L. and Rose J.K. 1990. Prevention of HIV-1 glycoprotein transport by soluble CD4 retained in the endoplasmic reticulum. Nature 345:625-628.

73. Buonocore L. and Rose J.K. 1993. Blockade of human immunodeficiency virus type 1 production in CD4+ T cells by an intracellular CD4 expressed under control of the viral long terminal repeat. Proc Natl Acad Sci U S A 90:2695-2699.

74. Burke R.S., Pun S.H. 2010. Synthesis and characterization of biodegradable HPMA-oligolysine copolymers for improved gene delivery. Bioconjug Chem 21:140-150.

75. Carabeo R.A., Grieshaber S.S., Fischer E., Hackstadt T. 2002. Chlamydia trachomatis induces remodeling of the actin cytoskeleton during attachment and entry into HeLa cells. Infect Immun 70:3793-803.

76. Carabeo R.A., Grieshaber S.S., Hasenkrug A., Dooley C., Hackstadt T. 2004. Requirement for the Rae GTPase in Chlamydia trachomatis invasion of non-phagocytic cells. Traffic 5:418-425.

77. Carabeo R.A., Hackstadt T. 2001. Isolation and characterization of a mutant Chinese hamster ovary cell line that is resistant to Chlamydia trachomatis infection at a novel step in the attachment process. Infect Immun 69:5899-5904.

78. Carriel-Gomes M.C., Kratz J.M., Barracco M.A., Bachere E., Barardi C.R., Simöes C.M. 2007. In vitro antiviral activity of antimicrobial peptides against herpes simplex virus 1, adenovirus, and rotavirus. Mem Inst Oswaldo Cruz. 102:469-472.

79. Castano S., Cornut I., Buttner K, Dasseux J.L., Dufourcq J. 1999. The amphipathic helix concept: length effects on ideally amphipathic LiK,(i=2j) peptides to acquire optimal hemolytic activity. Biochim Biophys Acta 1416:161-175.

80. Cazzola M., Sanduzzi A., Matera M.G. 2003. Novelties in the field of antimicrobial compounds for the treatment of lower respiratory tract infections. Pulm Pharmacol Ther 16:131-145.

81. Chan D.I., Prenner E.J., Vogel H.J. 2006 Tryptophan- and arginine-rich antimicrobial peptides: structures and mechanisms of action. Biochim Biophys Acta 1758:1184-1202.

82. Charity J.C., Blalock L.T., Costante-Hamm M.M., Kasper D.L., Dove S.L. 2009. Small molecule control of virulence gene expression in Francisella tularensis. PLoS Pathog 5(10):e 1000641.

83. Charpentier S., Amiche M., Mester J., Vouille V., Le Caer J.P., Nicolas P., Delfour A. 1998. Structure, synthesis, and molecular cloning of dermaseptins B, a family of skin peptide antibiotics. J Biol Chem 273:14690-14697.

84. Chen C.P., Kim J.S., Liu D., Rettig G.R., McAnuff M.A., Martin M.E., Rice K.G. 2007. Synthetic PEGylated glycoproteins and their utility in gene delivery. Bioconjug Chem 18:371-378.

85. Chen H.Q., Veluthakal R., Palanivel R., Kowluru A. 2004. GTP-binding protein-independent potentiation by mastoparan of IL-1 beta-induced nitric oxide release from insulin-secreting HIT-T15 cells. Apoptosis 9:145-148.

86. Chen J., Small-Howard A., Yin A., Berry M.J. 2005. The responses of Ht22 cells to oxidative stress induced by buthionine sulfoximine (BSO). BMC Neurosci 6:10.

87. Cherng J.Y., Talsma H., Crommelin D.J., Hennink W.E. 1999. Long term stability of poly((2-dimethylamino)ethyl methacrylate)-based gene delivery systems. Pharm Res 16: 1417-1423.

88. Chertov O, et al. 1996. Identification of defensin-1, defensin-2, and CAP37/azurocidin as T-cell chemoattractant proteins released from interleukin-8- stimulated neutrophils. J Biol Chem 271:2935-2940.

89. Chicharro C., Granata C., Lozano R., Andreu D., Rivas L. 2001. N-terminal fatty acid substitution increases the leishmanicidal activity of CA(l-7)M(2-9), a cecropin-melittin hybrid peptide. Antimicrob Agents Chemother 45:2441-2449.

90. Chiou H.C., Lucas M.A., Coffin C.C., Banaszczyk M.G., 111 C.R., Lollo C.P. 2001. Gene therapy strategies for the treatment of chronic viral hepatitis. Expert Opin Biol Ther 1:629-639.

91. Chong-Cerrillo C., Selsted M.E., Peterson E.M., de la Maza L.M. 2003. Susceptibility of human and murine Chlamydia trachomatis serovars to granulocyte- and epithelium-derived antimicrobial peptides. J Pept Res 61:237-242.

92. Chowdhury E.H. 2009. Nuclear targeting of viral and non-viral DNA. Expert Opin Drug Deliv. 6:697-703.

93. Christian A.E., Haynes M.P., Phillips M.C., Rothblat G.H. 1997. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J Lipid Res 38:2264-2272.

94. Clague M.J., Cherry R.J. 1988. Comparison of p25 presequence peptide and melittin. Red blood cell haemolysis and band 3 aggregation. Biochem J 252:791-794.

95. Clausen J.D., Christiansen G., Hoist H.U., Birkelund S. 1997. Chlamydia trachomatis utilizes the host cell microtubule network during early events of infection. Mol Microbiol 25:441-449.

96. Clifton D.R., Dooley C.A, Grieshaber S.S., Carabeo R.A., Fields K.A., Hackstadt T. 2005. Tyrosine phosphorylation of the chlamydial effector protein Tarp is species specific and not required for recruitment of actin. Infect Immun 73:3860-3868.

97. Cole A.M. 2005. Antimicrobial Peptide Microbicides Targeting HIV. Prot and Pept Lettl2:41-47.

98. Cole A.M., Ganz T., Liese A.M., Burdick M.D., Liu L., Strieter R.M.2001. Cutting edge: IFN-inducible ELR-CXC chemokines display defensin-like antimicrobial activity. J Immunol 167:623-627.

99. Constantinescu I., Lafleur M. 2004. Influence of the lipid composition on the kinetics of concerted insertion and folding of melittin in bilayers. Biochim Biophys Acta 1667:2637.

100. Corzo G. and Escoubas P. 2003. Pharmacologically active spider peptide toxins. Cell Mol Life Sci 60:2409-2426

101. Cudic M, Otvos Jr L. 2002. Intracellular targets of antibacterial peptides. Curr Drug Targets 3:101-106.

102. Culver K.W. Gene Therapy: A Handbook for Physicians. N.Y.: May Ann Liebert Inc. Publ., 1994. 117 c.

103. Cuppoletti J., Abbott A.J. 1990. Interaction of melittin with the (Na+ + K+)ATPase: evidence for a melittin-induced conformational change. Arch Biochem Biophys 283:249257.

104. Dagan A., Efron L., Gaidukov L., Mor A., Ginsburg H. 2002. In vitro antiplasmodium effects of dermaseptin S4 derivatives. AntimicrobAgents Chemother 46:1059-1066.

105. Dalle-Donne I., Rossi R., Milzani A., Di Simplicio P., Colombo R. 2001. The actin cytoskeleton response to oxidants: from small heat shock protein phosphorylation to changes in the redox state of actin itself. Free Radic Biol Med 31:1624-1632.

106. Dash P.R., Read M.L., Barrett L.B., Wolfert M.A., Seymour L.W. 1999. Factors affecting blood clearance and in vivo distribution of polyelectrolyte complexes for gene delivery. Gene Ther 6:643-650.

107. Dauty E., Remy J.S., Blessing T., Behr J.P. 2001. Dimerizable cationic detergents with a low cmc condense plasmid DNA into nanometric particles and transfect cells in culture. J Am Chem Soc 26 123:9227-9234.

108. Davidson W.R., Nettles V.F., Couvillion C.E., Yoder H.W. Jr. 1982. Infectious sinusitis in wild turkeys. Avian Diseases 26:402-405.

109. Davis B.J. 1964. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci 121:404-427.

110. Davis C.H., Raulston J.E., Wyrick P.B. 2002. Protein disulfide isomerase, a component of the estrogen receptor complex, is associated with Chlamydia trachomatis serovar E attached to human endometrial epithelial cells. Infect Immun 70:3413-3348.

111. Dawson R.M., Liu C.Q. 2008. Properties and applications of antimicrobial peptides in biodefense against biological warfare threat agents. Crit Rev Microbiol 34:89-107.

112. D'Costa J., Mansfield S.G., Humeau L.M. 2009. Lentiviral vectors in clinical trials: Current status. Curr Opin Mol Ther 11:554-564.

113. DeGrado W.F., Musso G.F., Lieber M., Kaiser E.T., Kezdy F.J. 1982. Kinetics and mechanism of hemolysis induced by melittin and by a synthetic melittin analogue. Biophys J 37:329-338.

114. Dempsey C.E. 1990. The actions of melittin on membranes. Biochim Biophys Acta 1031:143-161.

115. Dempsey C.E. The actions of melittin on membranes. 1990. Biochim Biophys Acta 1031:143-161.

116. Bechinger B., Lohner K. Detergent-like actions of linear amphipathic cationic antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta. 2006. 1758:1529-1539.

117. Deuschle U., Meyer W.K., Thiesen H.J. 1995. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol 15:1907-1914.

118. DeVincenzo J.P. 2008. RNA interference strategies as therapy for respiratory viral infections. Pediatr Infect Dis J 27:S118-122.

119. Diamond G., Beckloff N., Weinberg A., Kisich K.O. 2009. The roles of antimicrobial peptides in innate host defense. Curr Pharm Des 15:2377-2392.

120. Diaz-Achirica P., Ubach J., Guinea A., Andreu D., Rivas L. 1998. The plasma membrane of Leishmania donovani promastigotes is the main target for CA(1—8)M(1-18), a synthetic cecropin A-melittin hybrid peptide. Biochem J 330:453-460.

121. Dowty M.E., Williams P., Zhang G., Hagstrom J.E., Wolff J.A. 1995. Plasmid DNA entry into postmitotic nuclei of primary rat myotubes. Proc Natl Acad Sci USA 92:4572-4576.

122. Droge W. 2002. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev 82:47-95.

123. Duan X., Kelsen S.G., Merali S. 2008. Proteomic analysis of oxidative stress-responsive proteins in human pneumocytes: insight into the regulation of DJ-1 expression. J Proteome Res 7:4955-4961.

124. Duan Y., Zhang S., Wang B., Yang B., Zhi D. 2009. The biological routes of gene delivery mediated by lipid-based non-viral vectors. Expert Opin Drug Deliv 6:13511361.

125. Dufton M.J., Hider R.C., Cherry R.J. 1984. The influence of melittin on the rotation of band 3 protein in the human erythrocyte membrane. Eur Biophys J 11:17-24.

126. Dupuy L.C., Schmaljohn C.S. DNA vaccines for biodefense. 2009. Expert Rev Vaccines 8:1739-1754.

127. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W„ Yalcin A., Weber K., Tuschl T. 2001. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411:494-498.

128. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. 2001. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev 15:188-200.

129. Elouahabi A., Ruysschaert J.M. 2005. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Mol Ther 11:336-347.

130. English J.J., Mueller E., Baulcombe D.C. 1996. Suppression of Virus Accumulation in Transgenic Plants Exhibiting Silencing ofNuclear Genes. Plant Cell 8:179-188.

131. Erbacher P., Remy J.S., Behr J.P. 1999. Gene transfer with synthetic virus-like particles via the integrin-mediated endocytosis pathway. Gene Ther 6:138-145.

132. Erno H., Stipkovits L. 1973. Bovine mycoplasmas: cultural and biochemical studies. 1. Acta Veterinaria Scandinavica. 14:436-449.

133. Escalante-Ochoa C., Ducatelle R., Haesebrouck F. 1998. The intracellular life of Chlamydia psittaci: how do the bacteria interact with the host cell? FEMS Microbiol Rev 22:65-78.

134. Escoubas P., Diochot S., Corzo G. 2000. Structure and pharmacology of spider venom neurotoxins. Biochimie 82:893-907.

135. Essig A., Heinemann M., Schweitzer R., Simnacher U., Marre R. 2000. Decontamination of a Mycoplasma-infected Chlamydia pneumoniae strain by pulmonary passage in SCID mice. Int J Med Microbiol 290:289-292.

136. Fassi Fehri L., Wroblewski H., Blanchard A. 2007. Activities of antimicrobial peptides and synergy with enrofloxacin against Mycoplasma pulmonis. Antimicrob Agents Chemother 51:468-474.

137. Fehri L.F., Sirand-Pugnet P., Gourgues G., Jan G., Wroblewski H., Blanchard A. 2005. Resistance to antimicrobial peptides and stress response in Mycoplasma pulmonis. Antimicrob Agents Chemother 49:4154-4165.

138. Felgner P.L. and Ringold G.M. 1989. Cationic liposome-mediated transfection. Nature 337, 387-388.

139. Felgner P.L., Gadek T.R., Holm M., Roman R., Chan H.W., Wenz M., Northrop J.P., Ringold G.M., Danielsen M. 1987. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sei U S A 84:7413-7417.

140. Fernie-King B.A., Seilly D.J., Lachmann P.J. 2004. The interaction of streptococcal inhibitor of complement (SIC) and its proteolytic fragments with the human beta defensins. Immunology 111:444-452.

141. Fields K.A., Hackstadt T. 2002. The chlamydial inclusion: Escape from the Endocytic Pathway. Annu Rev Cell Dev Biol 18:221-245.

142. Finlay B.B., Hancock R.E. 2004. Can innate immunity be enhanced to treat microbial infections? Nature Rev. Microbiol. 2:497-504.

143. Florack D.E. and Stiekema W.J. 1994. Thionins: properties, possible biological roles and mechanisms of action. Plant Mol Biol 26:25-37.

144. Frey S., Tamm L.K. 1991. Orientation of melittin in phospholipid bilayers. A polarized attenuated total reflection infrared study. Biophys J 60:922-930.

145. Fu J., Bian G., Zhao B., Dong Z., Sun X., Chen F., Ou L., Song H. 2009. Enhancing efficacy and mucosa-tropic distribution of an oral HIV-PsV DNA vaccine in animal models. J Drug Target 17:803-812.

146. Fukushima N., Kohno M., Kato T., Kawamoto S., Okuda K., Misu Y., Ueda H. 1998. Melittin, ametabostatic peptide inhibiting Gs activity. Peptides 19:811-819.

147. Furth P.A., St Onge L., Boger H., Grass P., Gossen M., Kistner A., Bujard H., Hennighausen L. 1994. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proc Natl Acad Sei USA 91:9302-9306.

148. Ganz T. 2002. Immunology. Versatile defensins. Science 298:977-979.

149. Ganz T. 2003. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nature Rev Immunol. 3: 710-720.

150. Ganz T. 2003. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat Rev Immunol 3:710-720.

151. Ganz T., Selsted M.E., Lehrer R.I. 1990. Defensins. Eur J Haematol 44:1-8.

152. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations. Editor: Anthony Meager. 1999 John Wiley & Sons, Ltd., 235 c.

153. Gennaro R., Skerlavaj B., Romeo D. 1989. Purification, composition, and activity of two bactenecins, antibacterial peptides of bovine neutrophils. Infect. Immun. 57:3142—3146.

154. Gennaro R., Zanetti M. 2000. Structural features and biological activities of the cathelicidin -derived antimicrobial peptides. Biopolymers 55:31-49.

155. Gennaro R., Zanetti M., Benincasa M., Podda E., Miani M. 2002. Pro-rich antimicrobial peptides from animals: structure, biological functions and mechanism of action. Curr Pharm Des 8:763-778.

156. Georgiou G. 2002. How to flip the (redox) switch. Cell 111:607-610.

157. Gevod V.S., Birdi K.S. 1984. Melittin and the 8-26 fragment. Differences in ionophoric properties as measured by monolayer method. Biophys J 45:1079-1083.

158. Ghosh A.K., Rukmini R., Chattopadhyay A. 1997. Modulation of tryptophan environment in membrane bound melittin by negatively charged phospholipids: implications in membrane organization and function. Biochemistry 36:14291-14305.

159. Ghosh A.K., Rukmini R., Chattopadhyay A. 1997. Modulation of tryptophan environment in membrane bound melittin by negatively charged phospholipids: implications in membrane organization and function. Biochemistry 36:14291-14305.

160. Giles D.K., Whittimore J.D., LaRue R.W., Raulston J.E., Wyrick P.B. 2006. Ultrastructural analysis of chlamydial antigen-containing vesicles everting from the Chlamydia trachomatis inclusion. Microbes Infect. 8:1579-1591.

161. Gomara M.J., Nir S., Nieva J.L. 2003. Effects of sphingomyelin on melittin pore formation. Biochim Biophys Acta 1612:83-89.

162. Gonçalves E., Kitas E., Seelig J. 2006. Structural and thermodynamic aspects of the interaction between heparan sulfate and analogues of melittin. Biochemistry 45:30863094.

163. Gonzalez-Aseguinolaza G., Crettaz J., Ochoa L., Otano I., Aldabe R., Paneda A. 2006. Gene therapy for viral hepatitis. Expert Opin Biol Ther 6:1263-1278.

164. Gordon Y.J., Romanowski E.G., McDermott A.M. 2005. A review of antimicrobial peptides and their therapeutic potential as anti-infective drugs. Curr Eye Res 30:505-515.

165. Gossen M., Bujard H. 1992. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA 89:5547-5551.

166. Gossen M., Freundlieb S., Bender G., Muller G., Hillen W., Bujard H. 1995. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science 268:1766-1769.

167. Gregoriadis G. 1977. Targeting of drugs. Nature 265:407-411.

168. Grenfell B.T., Pybus O.G., Gog J.R., Wood J.L., Daly J.M., Mumford J.A., Holmes E.C. Unifying the epidemiological and evolutionary dynamics of pathogens. 2004. Science 303:327-332.

169. Grieshaber S.S., Grieshaber N.A., Hackstadt T. 2003. Chlamydia trachomatis uses host cell dynein to traffic to the microtubule-organizing center in a p50 dynamitin-independent process. J Cell Sci. 116:3793-3802.

170. Grishin E. 1999. Polypeptide neurotoxins from spider venoms. Eur J Biochem 264:276280.

171. Gromova I.A., Molokovsky J.G., Bergelson L.D. 1992. Anthrylvinyl-labeled phospholipids as fluorescent membrane probes. The action of melittin on multilipid systems. Chem Phys Lipids 60:235-246.

172. Grosse S., Aron Y., Thévenot G., François D., Monsigny M., Fajac I. 2005. Potocytosis and cellular exit of complexes as cellular pathways for gene delivery by polycations. J Gene Med 7:1275-1286.

173. Gryllos I., Tran-Winkler H.J., Cheng M.F., Chung H., Bolcome R. 3rd, Lu W., Lehrer R.I., Wessels M.R. 2008. Induction of group A StreptocoCCUs virulence by a human antimicrobial peptide. Proc Natl Acad Sci U S A 105:16755-16760.

174. Haberman R.P.,. McCown T.J, Samulski R.J. 1998. Inducible long-term gene expression in brain with adeno-associated virus gene transfer. Gene Ther 5:1604-1611.

175. Habermann E. Bee and wasp venoms. 1972. Science 177:314-322.

176. Hackstadt T. 1998. The diverse habitats of obligate intracellular parasites. Curr Opin Microbiol 1:82-87.

177. Hackstadt T., Rockey D.D., Heinzen R.A., Scidmore M.A. 1996. Chlamydia trachomatis interrupts an exocytic pathway to acquire endogenously synthesized sphingomyelin in transit from the Golgi apparatus to the plasma membrane. EMBO J 15:964-977.

178. Hackstadt T., Todd W.J., Caldwell H.D. 1985. Disulfide-mediated interactions of the chlamydial major outer membrane protein: role in the differentiation of chlamydiae? J. Bacteriol. 161:25-31.

179. Hafkemeyer P., Brinkmann U., Brinkmann E., Pastan I., Blum H.E., Baumert T.F. 2008. Pseudomonas exotoxin antisense RNA selectively kills hepatitis B virus infected cells. World J Gastroenterol 14:2810-2817.

180. Hagemeyer C.E., von Zur Muhlen C., von Elverfeldt D., Peter K. 2009. Single-chain antibodies as diagnostic tools and therapeutic agents. Thromb Haemost. 101:1012-1019.

181. Hallamaa K.M., Tang S.L., Ficorilli N., Browning G.F. 2008. Differential expression of lipoprotein genes in Mycoplasma pneumoniae after contact with human lung epithelial cells, and under oxidative and acidic stress. BMC Microbiol. 8:124.

182. Hamm-Alvaxrez S.F., Alayof B., Himmel H., Kim P.Y., Crews A.L., Strauss H.C., Sheetz M.P. 1994. Coordinate depression of bradykinin receptor recycling and microtubule-dependent transport by taxol. Proc Natl Acad Sci USA 91:7812-7816.

183. Hancock R.E. 1997. Antibacterial peptides and the outer membranes of gram-negative bacilli. J Med. Microbiol. 46:1-3.

184. Hancock R.E., Patrzykat A. 2002. Clinical development of cationic antimicrobial peptides: from natural to novel antibiotics. Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2:79-83.

185. Han S., Bishop B.M., van Hoek M.L. 2008. Antimicrobial activity of human beta-defensins and induction by Francisella. Biochem Biophys Res Commun 371:670-674.

186. Hatch T.P. 1996. Disulfide cross-linked envelope proteins: the functional equivalent of peptidoglycan in chlamydiae? J. Bacteriol 178:1-5.

187. Hatch T.P. Infection and disease epidemiology. In: Stephens, R. S., ed. Chlamydia, Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity, Washington, DC: ASM Press; 1999: 29-67.

188. Heinrich J., Mathur S., Matskevich A.A., Moelling K. 2009. Oligonucleotide-mediated retroviral RNase H activation leads to reduced HIV-1 titer in patient-derived plasma. AIDS 23:213-221.

189. Herbst R., Marciano-Cabral F., Leippe M. 2004. Antimicrobial and pore-forming peptides of free-living and potentially highly pathogenic Naegleria fowleri are released from the same precursor molecule. J Biol Chem 279:25955-25958.

190. Herwaldt B.L. 1999. Leishmaniasis. Lancet 354:1191-1199.

191. Hider R.C., Khader F., Tatham A.S. 1983. Lytic activity of monomeric and oligomeric melittin. Biochim Biophys Acta 728:206-214.

192. Higashijima T., Buraier J., Ross E.M. 1990. Regulation of Gi and Go by mastoparan, related amphiphilic peptides, and hydrophobic amines. Mechanism and structural determinants of activity. J Biol Chem 265:14176-14186.

193. Higashijima T., Uzu S., Nakajima T., Ross E.M. 1988. Mastoparan, a peptide toxin from wasp venom, mimics receptors by activating GTP-binding regulatory proteins (G proteins). J Biol Chem 263:6491-6494.

194. Hirsch J.G. 1956. Phagocytin: a bactericidal substance from polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med 103:589-611.

195. Hoekstra D., Rejman J., Wasungu L., Shi F., Zuhorn I. 2007. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochem Soc Trans 35(Pt 1):68-71.

196. Holle L„ Song W„ Holle E., Wei Y„ Li J., Wagner T.E., Yu X. 2009. In vitro- and in vivo-targeted tumor lysis by an MMP2 cleavable melittin-LAP fusion protein. Int J Oncol 35:829-835.

197. Hu K-S., Dufton M.J., Morrison I., Cherry R.J. 1985. Protein rotational diffusion measurements on the interaction of bee venom melittin with bacteriorhodopsin in lipid vesicles. Biochim Biophys Acta 816:358-364.

198. Huang H.J., Ross C.R., Blecha F. 1997. Chemoattractant properties of PR-39, a neutrophil antibacterial peptide. J Leukoc Biol 61:624-629.

199. Huang H.W. 2000. Action of antimicrobial peptides: two-state model. Biochemistry 39:8347-8352.

200. Huang X., Yang Y. 2009. Innate immune recognition of viruses and viral vectors. Hum GeneTher 20:293-301.

201. Huh W.K., Falvo J.V., Gerke L.C., Carroll A.S., Howson R.W., Weissman J.S., O'Shea E.K. 2003. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature 425:686-691.

202. Hui S.W., Stewart C.M., Cherry R.J. 1990. Electron microscopic observation of the aggregation of membrane proteins in human erythrocyte by melittin. Biochim Biophys Acta 1023:335-340.

203. Hung W.C., Lee M.T. 2006. The interaction of melittin with E. coli membrane: the role of cardiolipin. Chinese J Phys 44:137-149.

204. Huttner K.M. 1999. Differences in the concentrations of small, anionic, antimicrobial peptides in bronchoalveolar lavage fluid and in respiratory epithelia of patients with and without cystic fibrosis. Infect Immun 67:4256-4259.

205. Altman H., Steinberg D., Porat Y., Mor A., Fridman D., Friedman M., Bachrach G. In vitro assessment of antimicrobial peptides as potential agents against several oral bacteria. J. Antimicrob. Chemother 58:198-201.

206. Isaacson R.E. 2003. MBI-226. Micrologix/Fujisawa. Curr. Opin. Investig. Drugs 4:9991003.

207. Ito J.I., Lyons J.M. 1999. Role of gamma interferon in controlling murine chlamydial genital tract infection. Infect Immun 67:5518-5521.

208. James C.M., Bartlett E.J., Mansfield J.P., Cull V.S. 2005. Interferon subtype gene therapy for regulating cytomegalovirus disease. Methods Mol Med. 116:207-219.

209. Johansson J., Gudmundsson G. H., Rottenberg M. E., Berndt K. D., Agerberth B. 1998. Conformation-dependent antibacterial activity of the naturally oCCUrring human peptide LL-37. J Biol Chem 273:3718-3724.

210. Jones D.P. 2002. Redox potential of GSH/GSSG couple: assay and biological significance. Methods Enzymol 348:93-112.

211. Jordan F.T.W. 1979. Avian mycoplasmas. In J.G. Tully & R.F. Whitcomb (Eds.), The Mycoplasmas. Vol II Human and Avian Mycoplasmas (pp. 1-48). Academic Press, New York.

212. Juvvadi P., Vumman S., Merrifield R.B. 1996. Synthetic melittin, its enantio, retro, and retroenantio isomers, and selected chimeric analogs: their antibacterial, hemolytic, and lipid bilayer action. J Am Chem Soc 118:8989-8997.

213. Kale A.A., Torchilin V.P. 2010. Environment-responsive multifunctional liposomes. Methods Mol Biol 605:213-242.

214. Kaiman S., Mitchell W., Marathe R., Lammel C., Fan J., Hyman R.W., Olinger L., Grimwood J., Davis R.W., Stephens R.S. 1999. Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis. Nat Genet 21:385-389.

215. Kanazawa T., Takashima Y., Shibata Y., Tsuchiya M., Tamura T., Okada H. 2009. Effective vaginal DNA delivery with high transfection efficiency is a good system for induction of higher local vaginal immune responses. J Pharm Pharmacol 61:1457-1463.

216. Kang Y., Chen A., Wang B., Zheng G. 2009. Protein transfer enhances cellular immune responses to DNA vaccination against SARS-CoV. Viral Immunol 22:417-422.

217. Kaushic C., Zhou F., Murdin A.D., Wira C.R. 2000. Effects of estradiol and progesterone on susceptibility and early immune responses to Chlamydia trachomatis infection in the female reproductive tract. Infect Immun 68:4207-4216.

218. Kavanagh K, Dowd S. 2004. Histatins: antimicrobial peptides with therapeutic potential. J Pharm Pharmacol 56:285-289.

219. Kawasaki M., Nakayama K., Wakatsuki S. 2005. Membrane recruitment of effector proteins by Arf and Rab GTPases. Curr Opin Struct Biol 15:681-689.

220. Kennedy M.T., Pozharski E.V., Rakhmanova V.A., MacDonald R.C. 2000. Factors governing the assembly of cationic phospholipid-DNA complexes. Biophys J. 78:16201633.

221. Khalil I.A., Kogure K., Akita H., Harashima H. 2006. Uptake pathways and subsequent intracellular trafficking in nonviral gene delivery. Pharmacol Rev 58:32-45.

222. Khalil I.A., Kogure K., Futaki S., Harashima H. 2006. High density of octaarginine stimulates macropinocytosis leading to efficient intracellular trafficking for gene expression. J Biol Chem 281:3544-3551.

223. Kim S.I., Shin D., Lee H., Ahn B.Y., Yoon Y., Kim M. 2009. Targeted delivery of siRNA against hepatitis C virus by apolipoprotein A-I-bound cationic liposomes. J Hepatol 50:479-488.

224. Kircheis R., Kichler A., Wallner G., Kursa M., Ogris M., Felzmann T., Buchberger M., Wagner E. 1997. Coupling of cell-binding ligands to polyethylenimine for targeted gene delivery. Gene Ther 4:409-418.

225. Kistner A., Gossen M., Zimmermann F., Jerecic J., Ullmer C., Lubbert H., Bujard H. 1996. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 93:10933-10938.

226. Kleinschmidt J.H., Mahaney J.E., Thomas D.D., Marsh D. 1997. Interaction of bee venom melittin with zwitterionic and negatively charged phospholipid bilayers: a spinlabel electron spin resonance study. Biophys J 72:767-778.

227. Klostermeier D. and Millar D.P. 2001. Tertiary structure stability of the hairpin ribozyme in its natural and minimal forms: different energetic contributions from a ribose zipper motif. Biochemistry 40:11211-11218.

228. Klostermeier D. and Millar D.P. 2002. Energetics of hydrogen bond networks in RNA: hydrogen bonds surrounding G+l and U42 are the major determinants for the tertiary structure stability of the hairpin ribozyme. Biochemistry 41:14095-14102.

229. Kojima Y., Honda K., Hamada H., Kobayashi N. 2009. Oncolytic Gene Therapy Combined with Double Suicide Genes for Human Bile Duct Cancer in Nude Mouse Models. J Surg Res.

230. Kolls J.K., McCray P.B. Jr., Chan Y.R. 2008. Cytokine-mediated regulation of antimicrobial proteins. Nat Rev Immunol 8:829-835.

231. Koltover I., Salditt T., Radler J.O., Safinya C.R. 1998. An inverted hexagonal phase of cationic Iiposome-DNA complexes related to DNA release and delivery. Science 281:7881.

232. Kopatz I., Remy J.S., Behr J.P. 2004. A model for non-viral gene delivery: through syndecan adhesion molecules and powered by actin. J Gene Med 6:769-776.

233. Kosnikov V.V., Dobretsov G.E. 1991. Depolarizing action of allergens on passive sensitized lymphocytes. Int Arch Allergy Appl Immunol 95:42-47.

234. Kouzayha A., Nasir M.N., Buchet R., Wattraint O., Sarazin C., Besson F. 2009. Conformational and interfacial analyses of K3A18K3 and alamethicin in model membranes. J Phys Chem B. 113:7012-7019.

235. Kowalska K., Carr D. B., Lipkowski A. W. 2002. Direct antimicrobial properties of substance P. Life Sci 71:747-750.

236. Kozlov S. and Grishin E. 2005. Classification of spider neurotoxins using structural motifs by primary structure features. Single residue distribution analysis and pattern analysis techniques. Toxicon 46:672-686.

237. Kozlov S.A., Grishin E.V. 2007. The universal algorithm of maturation for secretory and excretory protein precursors. Toxicon 49:721-726.

238. Kramer A., Ferfoglia F., Huang C.J., Mulhaupt F., Nesic D., Tanackovic G. 2005. Structure-function analysis of the U2 snRNP-associated splicing factor SF3a.Biochem Soc Trans 33:439-442.

239. Kuhn-Nentwig L. 2003. Antimicrobial and cytolytic peptides of venomous arthropods. Cell Mol Life Sci 60:2651-2668.

240. Kuwano K., Tanaka N., Shimizu T., Kida Y. 2006. Antimicrobial activity of inducible human beta defensin-2 against Mycoplasma pneumoniae. Curr Microbiol. 52:435-438.

241. Kuwata H., Yip T.T., Yip C.L., Tomita M., Hutchens T.W. 1998. Bactericidal domain of lactoferrin: detection, quantitation, and characterization of lactoferricin in serum by SELDI affinity mass spectrometry. Biochem Biophys Res Commun 245:764-773.

242. Ladokhin A.S., Selsted M.E., White S.H. 1997, Sizing membrane pores in lipid vesicles by leakage of coencapsulated markers: pore formation by melittin. Biophys J 72:17621766.

243. Ladokhin A.S., White S.H. 2001. 'Detergent-like' permeabilization of anionic lipid vesicles by melittin. Biochim Biophys Acta 1514:253-260.

244. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.

245. Lai R., Liu H., Hui Lee W.,Zhang Y. 2002. An anionic antimicrobial peptide from toad Bombina maxima. Biochem Biophys Res Commun 295:796-799.

246. Lam Y.H., Wassail S.R., Morton C.J., Smith R., Separovic F. 2001. Solid-state NMR structure determination of melittin in a lipid environment. Biophys J 81:2752-2761.

247. Langer R. 1998. Drug delivery and targeting. Nature 392(6679 Suppl):5-10.

248. Langmuir M.E., Yang J-R., LeCompte K.A., Durand R.E. 1996. New thiol active fluorophores for intracellular thiols and glutathione measurement, in Fluorescence Microscopy and Fluorescent Probes (Slavik J ed), Plenum, New York.I

249. Laragione T., Bonetto V., Casoni F., Massignan T., Bianchi G. 2003. Redox regulation of ! surface protein thiols: identification of integrin alpha-4 as a molecular target by usingredox proteomics. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 14737-14741.

250. Lavignac N., Lazenby M., Franchini J., Ferruti P., Duncan R. 2005. Synthesis and preliminary evaluation of poly(amidoamine)-melittin conjugates as endosomolytic polymers and/or potential anticancer therapeutics. Int J Pharm 300:102-112.

251. Lazarev V.N., Shkarupeta M.M., Titova G.A., Kostrjukova E.S., Akopian T.A., Govorun

252. V.M. 2005. Effect of induced expression of an antimicrobial peptide melittin on

253. Chlamydia trachomatis and Mycoplasma hominis infections in vivo. Biochem Biophys Res Commun 338:946-950.

254. Lechardeur D., Sohn K.J., Haardt M., Joshi P.B., Monck M., Graham R.W., Beatty B., Squire J., O'Brodovich H., Lukacs G.L. 1999. Metabolic instability of plasmid DNA in thecytosol: a potential barrier to gene transfer. Gene Ther 6:482-497.

255. Lederman L. 2009. siRNA and microRNA. Biotechniques. 46:257-259.

256. Lee D.Y., Huang C.M., Nakatsuji T., Thiboutot D., Kang S.A., Monestier M., Gallo R.L. 2009. Histone H4 is a major component of the antimicrobial action of human sebocytes. J Invest Dermatol 129:2489-2496.

257. Lee J., Park C., Park S.C., Woo E.R., Park Y., Hahm K.S., Lee D.G. 2009. Cell selectivity-membrane phospholipids relationship of the antimicrobial effects shown by pleurocidin enantiomeric peptides. J Pept Sci 16: 103-109.

258. Lee P.H., Ohtake T., Zaiou M., Murakami M., Rudisill J.A., Lin K.H., Gallo R.L. 2005. Expression of an additional cathelicidin antimicrobial peptide protects against bacterial skin infection. Proc Natl Acad Sci USA 102:3750-3755.

259. Lee S.K., Harris J., Swanstrom R. 2009. A strongly transdominant mutation in the human immunodeficiency virus type 1 gag gene defines an Achilles heel in the virus life cycle. J Virol 83:8536-8543.

260. Lee T.H., Mozsolits H., Aguilar M.I. 2001. Measurement of the affinity of melittin for zwitterionic and anionic membranes using immobilized lipid biosensors. J Pept Res 58:464-476.

261. Lee W.H., Li Y., Lai R., Li S., Zhang Y. Wang W. 2005. Variety of antimicrobial peptides in the Bombina maxima toad and evidence of their rapid diversification. Eur J Immunol 35:1220-1229.

262. Lee W.H., Zhang J., Zhang Y.X., Jin Y., Lai R., Zhang Y. 2005. Maximin 9, a novel free thiol containing antimicrobial peptide with antimycoplasma activity from frog Bombina maxima. FEBS Lett 579:4443-4448.

263. Lehrer R.I. 2004. Primate defensins. Nature Rev Microbiol 2:727-738.

264. Lehrer R.I., Barton A., Daher K.A., Harwig S.S., Ganz T., Selsted M.E. 1989. Interaction of human defensins with Escherichia coli. Mechanism of bactericidal activity. J Clin Invest 84:553-561.

265. Leopold P.L., Kreitzer G., Miyazawa N., Rempel S., Pfister K.K., Rodriguez-Boulan E., Crystal R.G. 2000. Dynein- and microtubule-mediated translocation of adenovirus serotype 5 oCCUrs after endosomal lysis. Hum Gene Ther 11:151-165.

266. Li J., Post M., Volk R., Gao Y., Li M., Metais C., Sato K., Tsai J., Aird W., Rosenberg R.D., Hampton T.G., Sellke F., Carmeliet P., Simons M. 2000. PR39, a peptide regulator of angiogenesis. Nat Med 6:49-55.

267. Li M., Lai Y., Villaruz A.E., Cha D.J., Sturdevant D.E., Otto M. 2007. Gram-positive three-component antimicrobial peptide-sensing system. Proc Natl Acad Sci U S A 104:9469-9474.

268. Liepke C., Baxmann S., Heine C., Breithaupt N., Standker L., Forssmann W.G. 2003. Human hemoglobin-derived peptides exhibit antimicrobial activity: a class of host defense peptides. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 791:345-356.

269. Ling C.Q., Li B., Zhang C., Zhu D.Z., Huang X.Q., Gu W., Li S.X. 2005. Inhibitory effect of recombinant adenovirus carrying melittin gene on hepatocellular carcinoma. Ann Oncol. 16:109-115.

270. Lippincott-Schwartz J., Roberts T.H., Hirschberg K. 2000. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annu Rev Cell Dev Biol 16:557-589.

271. Liu J., Lewin A.S., Tuli S.S., Ghivizzani S.C., Schultz G.S., Bloom D.C. 2008. Reduction in severity of a herpes simplex virus type 1 murine infection by treatment with a ribozyme targeting the UL20 gene RNA. J Virol 82:7467-7474.

272. Liu S.I., Cheng H.H., Huang C.J., Chang H.C., Chen W.C., Chen I.S., Hsu S.S., Chang H.T., Huang J.K., Chen J.S., Lu Y.C., Jan C.R. 2008. Melittin-induced Ca2+.i increases and subsequent death in canine renal tubular cells. Hum Exp Toxicol 27:417-424.

273. Lori F., Trocio J., Bakare N., Kelly L.M., Lisziewicz J. 2005. DermaVir, a novel HIV immunisation technology. Vaccine 23:2030-2034.

274. Luby-Phelps K., Castle P.E., Taylor D.L., Lanni F. 1987. Hindered diffusion of inert tracer particles in the cytoplasm of mouse 3T3 cells. Proc Natl Acad Sci U S A 84:49104913.

275. Luo W., Yu H., Cao Z., Schoeb T.R, Marron M., Dybvig K. 2008. Association of Mycoplasma arthritidis mitogen with lethal toxicity but not with arthritis in mice. Infect Immun 76:4989-4998.

276. Lupetti A., van Dissel J.T., Brouwer C.P., Nibbering P.H. 2008. Human antimicrobial peptides' antifungal activity against Aspergillus fumigatus. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 27:1125-1129.

277. Luque-Ortega J.R., Saugar J.M., Chiva C., Andreu D., Rivas L. 2003. Identification of new leishmanicidal peptide lead structures by automated real-time monitoring of changes in intracellular ATP. Biochem J 375:221-230.

278. Ma K., Hu M.X., Qi Y., Zou J.H., Qiu L.Y., Jin Y., Ying X.Y., Sun H.Y. 2009. PAMAM-triamcinoloneacetonide conjugate as a nucleus-targeting gene carrier for enhanced transfer activity. Biomaterials 30:6109-6118.

279. Mahato R.I., Smith L.C., Rolland A. 1999. Pharmaceutical perspectives of nonviral gene therapy. Adv Genet 41:95-156.

280. MacPherson D.W., Gushulak B.D., Baine W.B., Bala S., Gubbins P.O., Holtom P., Segarra-Newnham M. 2009. Population mobility, globalization, and antimicrobial drug resistance. Emerg Infect Dis 15:1727-1732.

281. Mahaney J.E., Kleinschmidt J., Marsh D., Thomas D.D. 1992. Effects of melittin on lipid-protein interactions in sarcoplasmic reticulum membranes. Biophys J 63:15131522.

282. Mahaney J.E., Thomas D.D. 1991. Effects of melittin on molecular dynamics and Ca-ATPase activity in sarcoplasmic reticulum membranes: electron paramagnetic resonance. Biochemistry 30:7171-7180.

283. Mannick J.B., Hausladen A., Liu L., Hess D.T., Zeng M., Miao Q.X., Kane L.S., Gow A.J., StamlerJ.S. 1999. Fas-induced caspase denitrosylation. Science 284:651-654.

284. Mantovani H.C., Russell J.B. 2001. Nisin resistance of StreptocoCCUs bovis. Appl Environ Microbiol 67:808-813.

285. Marchini C., Montani M., Amici A., Amenitsch H., Marianecci C., Pozzi D., Caracciolo G. 2009. Structural stability and increase in size rationalize the efficiency of lipoplexes in serum. Langmuir 25:3013-3021.

286. Marcos J.F., Beachy R.N., Houghten R.A., Blondelle S.E., Pe'rez-Paya' E. 1995. Inhibition of a plant virus infection by analogs of melittin. Proc Natl Acad Sci USA 92:12466-12469.

287. Marcus J.P., Green J.L., Goulter K.C., Manners J.M. 1999. A family of antimicrobial peptides is produced by processing of a 7S globulin protein in Macadamia integrifolia kernels. Plant J 19:699-710.

288. Martin L.A. and Lemoine N.R. 1996. Direct cell killing by suicide genes. Cancer Metastasis Rev 15:301-316.

289. Maslow A.S., Davis C.H., Choong J., Wyrick P.B. 1988. Estrogen enhances attachment of Chlamydia trachomatis to human endometrial epithelial cells in vitro. Am J Obstet Gynecol 159:1006-1014.

290. Matsuzaki K., Yoneyama S., Miyajima K. 1997. Pore formation and translocation of melittin. Biophys J 73:831-838.

291. Mayer L.D., Bally M.B., Hope M.J., Cullis P.R. 1986. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chem Phys Lipids 40:333-345.

292. Mebs D. 2002. Venomous and poisonous animals: a handbook for biologists, toxicologists and toxinologists, physicians and pharmacists. Medpharm; CRC Press, Stuttgart; Boca Raton, FL, USA.

293. Meister A., Anderson M.E. 1983. Glutathione. Annu Rev Biochem 52:711-760.

294. Meng Z., Xu Y., Wu J., Tian Y., Kemper T., Bleekmann B., Roggendorf M., Yang D., Lu M. 2008. Inhibition of hepatitis B virus gene expression and replication by endoribonuclease-prepared siRNA. J Virol Methods. 150:27-33.

295. Meyer J.E., Harder J. 2007. Antimicrobial peptides in oral cancer. Curr Pharm Des 13:3119-3130.

296. Meyer M., Zintchenko A., Ogris M., Wagner E. 2007. A dimethylmaleic acid-melittin-polylysine conjugate with reduced toxicity, pH-triggered endosomolytic activity and enhanced gene transfer potential. J Gene Med 9:797-805.

297. Midoux P., Pichon C., Yaouanc J.J., Jaffres P.A. 2009. Chemical vectors for gene delivery: a current review on polymers, peptides and lipids containing histidine or imidazole as nucleic acids carriers. Br J Pharmacol 157:166-178.

298. Miller S.I., Ernst R.K., Bader M.W. 2005. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol 3:36-46.

299. Mikami T., Satoh N., Hatayama I., Nakane A. 2004. Buthionine sulfoximine inhibits cytopathic effect and apoptosis induced by infection with human echovirus 9. Arch Virol 149:1117-11128.

300. Mintzer M.A., Simanek E.E. 2009. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev 109:259-302.

301. Mislick K.A., Baldeschwieler J.D. 1996. Evidence for the role of proteoglycans in cation-mediated gene transfer. Proc Natl Acad Sci U S A 93:12349-12354.

302. Mitchell D.C., Litman B.J. 1998. Effect of cholesterol on molecular order and dynamics in highly polyunsaturated phospholipid bilayers. Biophys J 75:896-908.

303. Miteva M., Andersson M., Karshikoff A., Otting G. 1999. Molecular electroporation: a unifying concept for the description of membrane pore formation by antibacterial peptides, exemplified with NK-lysin. FEBS Lett 462:155-158.

304. Mitsumoto A., Nakagawa Y., Takeuchi A., Okawa K., Iwamatsu A., Takanezawa Y. 2001a. Oxidized forms of peroxiredoxins and DJ-1 on two-dimensional gels increased in response to sublethal levels of paraquat. Free Radic Res 35:301-310.

305. Mitsumoto A., Takanezawa Y., Okawa K., Iwamatsu A., Nakagawa Y. 200lb.Variants of peroxiredoxins expression in response to hydroperoxide stress. Free Radic Biol Med 30:625-635.

306. Mohammed H.O., Carpenter T.E., Yamamoto R. 1987. Economic impact of Mycoplasma gallisepticum and M.synoviae in commercial layer flocks. Avian Diseases 31:477 -482.

307. Molas M., Gomez-Valades A.G., Vidal-Alabro A., Miguel-Turu M., Bermudez J., Bartron R., Perales J.C. 2003. Receptor-mediated gene transfer vectors: progress towards genetic pharmaceuticals. Curr Gene Ther 3:468-485.

308. Monette M., Lafleur M. 1995. Modulation of melittin-induced lysis by surface charge density of membranes. Biophys J 68:187-195.

309. Moorhead A.R., Rzomp K.A., Scidmore M.A. 2007. The Rab6 effector Bicaudal D1 associates with Chlamydia trachomatis inclusions in a biovar-specific manner. Infect Immun 75:781-791.

310. Moreira C.K., Rodrigues F.G., Ghosh A., Varotti Fde P., Miranda A., Daffre S., Jacobs-Lorena M., Moreira L.A. 2007. Effect of the antimicrobial peptide gomesin against different life stages of Plasmodium spp. Exp Parasitol 116:346-353.

311. Morre S.A., Lyons J.M., Ito J.I. Jr. 2000. Murine models of Chlamydia trachomatis genital tract infection: use of mouse pneumonitis strain versus human strains. Infect Immun 68:7209-7211.

312. Morris K.V., Chung C.H., Witke W., Looney D.J. 2005. Inhibition of HIV-1 replication by siRNA targeting conserved regions of gag/pol. RNA Biol 2:17-20.

313. Moulder J.W. 1991. Interaction of chlamydiae and host cells in vitro. Microbiol Rev 55:143-190.

314. Moulder J.W. Interaction of chlamydiae and host cells in vitro. 1991. Microbiol Rev 55:143-190.

315. Mounkes L.C., Zhong W., Cipres-Palacin G., Heath T.D., Debs R.J. 1998. Proteoglycans mediate cationic liposome-DNA complex-based gene delivery in vitro and in vivo. J Biol Chem 273:26164-26170.

316. Mukherjee A.B., Orloff S., Butler J.D., Triche T., Lalley P., Schulman J.D. 1978. Entrapment of metaphase chromosomes into phospholipid vesicles (lipochromosomes): carrier potential in gene transfer. ProcNatl Acad Sci U S A 75:1361-1365.

317. Munoz A, Lopez-Garcia B, Marcos JF. Studies on the mode of action of the antifungal hexapeptide PAF26. Antimicrob Agents Chemother. 2006 Nov;50(ll):3847-55.

318. Murata Y. 2009. Respiratory syncytial virus vaccine development. Clin Lab Med 29:725739.

319. Naito A., Nagao T., Norisada K., Mizuno T., Tuzi S., Saito H. 2000. Conformation and dynamics of melittin bound to magnetically oriented lipid bilayers by solid-state 31P and ,3C NMR spectroscopy. Biophys J 78:2405-2417.

320. Nazari R. and Joshi S. 2009. HIV-1 gene therapy at pre-integration and provirus DNA levels. Curr Gene Ther 9:20-25.

321. Nazari R., Ma X.Z., Joshi S. 2008. Inhibition of human immunodeficiency virus-1 entry using vectors expressing a multimeric hammerhead ribozyme targeting the CCR5 mRNA. J Gen Virol 89:2252-2261.

322. Nencioni L., Iuvara A., Aquilano K., Ciriolo M.R., Cozzolino F., Rotilio G., Garaci E., Palamara A.T. 2003. Influenza A virus replication is dependent on an antioxidant pathway that involves GSH and Bcl-2. FASEB J 17:758-760.

323. Neuhaus F.C., Baddiley J. 2003. A continuum of anionic charge: structures and functions of D-alanyl-teichoic acids in gram-positive bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 67:686723.

324. Newhall W.J., Jones R.B. 1983. Disulfide-linked oligomers of the major outer membrane protein of Chlamydiae. J Bacteriol 154:998-1001.

325. Nicholson T.L., Olinger L., Chong K., Schoolnik G., Stephens R.S. 2003. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. J Bacteriol 185:3179-3189.

326. Nir S., Nieva J.L. 2000. Interactions of peptides with liposomes: pore formation and fusion. Prog Lipid Res 39:181-206.

327. Nishitsuji H., Tamura Y., Fuse T., Habu Y., Miyano-Kurosaki N., Takaku H. 2001. Inhibition of HIV-1 replication by 5'LTR decoy RNA. Nucleic Acids Res Suppl 141-142.

328. Niu W., Wu Y., Sui S.F. 2000. Orientation of membrane-bound melittin studied by a combination of HPLC and liquid secondary ion mass spectrometry (LSIMS). IUBMB Life 50:215-219.

329. Ogris M., Brunner S., Schüller S., Kircheis R., Wagner E. 1999. PEGylated DNA/transferrin-PEI complexes: reduced interaction with blood components, extended circulation in blood and potential for systemic gene delivery. Gene Ther 6:595-605.

330. Ohtani Y., Irie T., Fukunaga K., Pitha J. 1989. Differential effects of alpha-, beta- and gammacyclodextrins on human erythrocytes. Eur J Biochem 186:17-22.

331. Ohya K.,Handa Y., Ogawa M., Suzuki M., Sasakawa C. 2005. IpgBl Is a Novel Shigella Effector Protein Involved in Bacterial Invasion of Host Cells. J Biol Chem 280:2402224034

332. Opanasopit P., Rojanarata T., Apirakaramwong A., Ngawhirunpat T., Ruktanonchai U. 2009. Nuclear localization signal peptides enhance transfection efficiency of chitosan/DNA complexes. Int J Pharm 382:291-295.

333. Oren Z., Shai Y. 1997. Selective lysis of bacteria but not mammalian cells by diastereomers of melittin: structure-function study. Biochemistry 36:1826-1835.

334. Ornstein L. 1964. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci 121:321-349.

335. Ostberg N., Kaznessis Y. 2005. Protegrin structure-activity relationships: using homology models of synthetic sequences to determine structural characteristics important for activity. Peptides 26:197-206.

336. Ostro M.J., Giacomoni D., Lavelle D., Paxton W., Dray S. 1978. Evidence for translation of rabbit globin mRNA after liposome-mediated insertion into a human cell line. Nature 274:921-923.

337. Otvos L. and Cudic M. 2007. Broth microdilution antibacterial assay of peptides. Methods Mol Biol 386:309-320.

338. Otvos L., Jr. 2002. The short proline-rich antibacterial peptide family. Cell Mol Life Sci 59: 1138-1150.

339. Oupicky D., Manickam D.S., Oupicky D., Mao G. 2000. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. J Control Release 65:149-171.

340. Palffy R, Gardlik R, Behuliak M, Kadasi L, Turna J, Celec P. On the physiology and pathophysiology of antimicrobial peptides. 2009. Mol Med 15:51-59.

341. Palli S.R., Kapitskaya M.Z., Kumar M.B., Cress D.E. 2003. Improved ecdysone receptorbased inducible gene regulation system. Eur J Biochem 270:1308-1315.

342. Pannekoek Y., van der Ende A. 2006. Inclusion proteins of Chlamydiaceae. Drugs Today (Bare) 42 Suppl A:65-73.

343. Papo N., Shai Y. 2003a. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry 42:458-466.

344. Papo N., Shai Y. 2003b. New lytic peptides based on the D,L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells. Biochemistry 42:9346-9354.

345. Park C.H., Valore E.V., Waring A.J., Ganz T. 2001. Hepcidin, a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver. J Biol Chem 276:7806-7810.

346. Parker A.L., Newman C., Briggs S., Seymour L., Sheridan P.J. 2003. Nonviral gene delivery: techniques and implications for molecular medicine. Expert Rev Mol Med. 5:115.

347. Peeleng R.W., Brunham R.C. 1996. Chlamydiae as pathogens: new species and new issues. Emerg Infect Dis 2:307-319.

348. Percot A., Lecomte S., Vergne J., Maurel M.C. 2009. Hairpin ribozyme catalysis: a surface-enhanced Raman spectroscopy study. Biopolymers 91:384-390.

349. Peschel A. 2002. How do bacteria resist human antimicrobial peptides? Trends Microbiol 10:179-186.

350. Peschel A., Sahl H.G. 2006. The co-evolution of host cationic antimicrobial peptides and microbial resistance. Nat Rev Microbiol 4:529-536.

351. Pokorny A., Almeida P.F. 2004. Kinetics of dye efflux and lipid flip-flop induced by delta-lysin in phosphatidylcholine vesicles and the mechanism of graded release by amphipathic, alpha-helical peptides. Biochemistry (Mosc.) 43:8846-8857.

352. Pollard H., Remy J.S., Loussouarn G., Demolombe S., Behr J.P., Escande D. 1998. Polyethylenimine but not cationic lipids promotes transgene delivery to the nucleus in mammalian cells. J Biol Chem 273:7507-7511.

353. Portsmouth D., Hlavaty J., Renner M. 2007. Suicide genes for cancer therapy. Mol Aspects Med 28:4-41.

354. Pott T., Maillet J.C., Abad C., Campos A., Dufourcq J., Dufourc E.J. 2001. The lipid charge density at the bilayer surface modulates the effects of melittin on membranes. ChemPhys Lipids 109:209-223.

355. Pucadyil T.J., Chattopadhyay A. 2004. Cholesterol modulates ligand binding and G-protein coupling to serotonin 1A receptors from bovine hippocampus. Biochim Biophys Acta 1663:188-200.

356. Quellette A.J., Selsted M.E. 1996. Paneth cell defensins: endogenous peptide components of intestinal host defense. FASEB J 10:1280-1289.

357. Qu X., Harwig S.L., Oren A., Shafer W.M., Lehrer R.I. 1996. Susceptibilty of Neisseria gonorrhoeae to protegrins. Infect Immunol 65:636-639.

358. Rabel D., Charlet M., Ehret-Sabatier L., Cavicchioli L., Cudic M., Otvos L., Jr., Bulet P. 2004. Primary structure and in vitro antibacterial properties of the Drosophila melanogaster attacin C Pro-domain. J Biol Chem 279:14853-14859.

359. Radler J.O., Koltover I., Salditt T., Safmya C.R. 1997. Structure of DNA-cationic liposome complexes: DNA intercalation in multilamellar membranes in distinct interhelical packing regimes. Science 275:810-814.

360. Raghuraman H. and Chattopadhyay A. 2007. Melittin: a membrane-active peptide with diverse functions. Biosci Rep. 27:189-223.

361. Raghuraman H., Chattopadhyay A. 2003. Organization and dynamics of melittin in environments of graded hydration: a fluorescence approach. Langmuir 19:10332-10341.

362. Raghuraman H., Chattopadhyay A. 2003. Organization and dynamics of melittin in environments of graded hydration: a fluorescence approach. Langmuir 19:10332-10341.

363. Raghuraman H., Chattopadhyay A. 2004a. Effect of micellar charge on the conformation and dynamics of melittin. Eur Biophys J 33:611-622.

364. Raghuraman H., Chattopadhyay A. 2004b. Influence of lipid chain unsaturation on membrane-bound melittin: a fluorescence approach. Biochim Biophys Acta 1665:29-39.

365. Raghuraman H., Chattopadhyay A. 2004c. Interaction of melittin with membrane cholesterol: a fluorescence approach. Biophys J 87:2419-2432.

366. Raghuraman H., Chattopadhyay A. 2005. Cholesterol inhibits the lytic activity of melittin in erythrocytes. Chem Phys Lipids 134:183-189.

367. Raghuraman H., Ganguly S., Chattopadhyay A. 2006. Effect of ionic strength on the organization and dynamics of membrane-bound melittin. Biophys Chem 124:115-124.

368. Rash L.D. and Hodgson W.C. 2002. Pharmacology and biochemistry of spider venoms. Toxicon 40:225-254.

369. Raulston J.E., Davis C.H., Paul T.R., Hobbs J.D., Wyrick P.B. 2002. Surface accessibility of the 70-kilodalton Chlamydia trachomatis heat shock protein following reduction of outer membrane protein disulfide bonds. Infect Immun 70:535-543.

370. Razin S. 1992. Mycoplasma taxonomy and ecology, p. 3-22. In J. Maniloff, R. N. McElhaney, L. R. Finch, and J. B. Baseman (ed.), Mycoplasmas:molecuIar biology and pathogenesis. American Society for Microbiology,Washington, D.C.

371. Razin S., Jacobs E. Mycoplasma adhesion. 1992. J Gen Microbiol 138:407-422.

372. Razin S., Yogev D., Naot Y. 1998. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiol Mol Biol Rev 62:1094-1156.

373. Rejman J., Bragonzi A., Conese M. 2005. Role of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis in gene transfer mediated by lipo- and polyplexes. Mol Ther 12:468-474.

374. Rejman J., Oberle V., Zuhorn I.S., Hoekstra D. 2004. Size-dependent internalization of particles via the pathways of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis. Biochem J 377(Pt 1): 159-169.

375. Remy J.S., Sirlin C., Vierling P., Behr J.P. 1994. Gene transfer with a series of lipophilic DNA-binding molecules. Bioconjug Chem 5:647-654.

376. Resina S., Prevot P., Thierry A.R. 2009. Physico-chemical characteristics of lipoplexes influence cell uptake mechanisms and transfection efficacy. PLoS One. 4:e6058.

377. Rex S. 1996. Pore formation induced by the peptide melittin in different lipid vesicle membranes. Biophys Chem 58:75-85.

378. Rex S. 2000. A Pro fi Ala substitution in melittin affects self-association, membrane binding and poreformation kinetics due to changes in structural and electrostatic properties. Biophys Chem 85:209-228.

379. Richardson R.T., Alekseev O.M., Grossman G., Widgren E.E.,Thresher R., Wagner E.J., Sullivan K.D., Marzluff W.F., O'Rand M.G. 2006. Nuclear autoantigenic sperm protein

380. NASP), a linker histone ehaperone that is required for cell proliferation. J Biol Chem 281:21526-21534.

381. Rivera V.M., Clackson T., Natesan S., Pollock R., Amara J.F., Keenan T., Magari S.R., Phillips T., Courage N.L., Cerasoli F. Jr., Holt D.A., Gilman M. 1996. A humanized system for pharmacologic control of gene expression. Nat Med 2:1028-1032.

382. Rivett D.E., Kirkpatrick A., Hewish D.R., Reilly W., Werkmeister J.A. 1996. Dimerization of truncated melittin analogues results in cytolytic peptides. Biochem J 316:525-529.

383. Rivett D.E., Kirkpatrick A., Hewish D.R., Reilly W., Werkmeister J.A. 1996. Dimerization of truncated melittin analogues results in cytolytic peptides. Biochem J 316:525-529.

384. Robbins M., Judge A., MacLachlan I. 2009. siRNA and innate immunity. Oligonucleotides 19:89-102.

385. Rockey D.D., Rosquist J.L. 1994. Protein antigens of Chlamydia psittaci present in infected cells but not detected in the infectious elementary body. Infect Immun 62:106112.

386. Roscilli G., Rinaudo C.D., Cimino M., Sporeno E., Lamartina S., Ciliberto G., Toniatti C. 2002. Long-term and tight control of gene expression in mouse skeletal muscle by a new hybrid human transcription factor. Mol Ther 6:653-663.

387. Ross E.M., Higashijima T. 1994. Regulation of G-protein activation by mastoparans and other cationic peptides. Methods Enzymol 237:26-37.

388. Ross P.C., Hui S.W. 1999. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Ther 6:651-659.

389. Rossi J.J., June C.H., Kohn D.B. 2007. Genetic therapies against HIV. Nat Biotechnol 25:1444-1454.

390. Rottem, S., Kahane I. 1993. Mycoplasma cell membranes. Subcell Biochem 20:1-314.

391. Rubin C.I., Atweh G.F. 2004. The role of stathmin in the regulation of the cell cycle. J Cell Biochem. 93:242-250.

392. Rudenko S.V., Patelaros S.V. 1995. Cation-sensitive pore formation in rehydrated erythrocytes. Biochim Biophys Acta 1235:1-9.

393. Rudolph M.G., Wittinghofer A., Vetter I.R. 1999. Nucleotide binding to the G12V-mutant of Cdc42 investigated by X-ray diffraction and fluorescence spectroscopy: two different nucleotide states in one crystal. Protein Sci 8:778-87.

394. Ruponen M., Honkakoski P., Tammi M., Urtti A. 2004. Cell-surface glycosaminoglycans inhibit cation-mediated gene transfer. J Gene Med 6:405-414.

395. Rzomp K.A., Moorhead A.R., Scidmore M.A. 2006. The GTPase Rab4 interacts with Chlamydia trachomatis inclusion membrane protein CT229. Infect Immun 74:5362-5373.

396. Rzomp K.A., Scholtes L.D., Briggs B.J., Whittaker G.R., Scidmore M.A. 2003. Rab GTPases are recruited to chlamydial inclusions in both a species-dependent and species-independent manner. Infect Immun 71:5855-5870.

397. Saikolappan S., Sasindran S.J., Yu H.D., Baseman J.B., Dhandayuthapani S. 2009. The Mycoplasma genitalium MG454 gene product resists killing by organic hydroperoxides. J Bacteriol 191:6675-6682.

398. Samad A., Sultana Y., Aqil M. 2007. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv 4:297-305.

399. Sambri V., Marangoni A., Giacani L. 2002. Comparative in vitro activity of five cathelicidin-derived synthetic peptides against Leptospira, Borrelia and Treponema pallidum. J Antimicrob Chemother 50:895-902.

400. Sandstrom P.A., Murray J., Folks T.M., Diamond A.M. 1998. Antioxidant defenses influence HIV-1 replication and associated cytopathic effects. Free Radic Biol Med 24:1485-1491.

401. Sanes J.R., Rubenstein J.L., Nicolas J.F. 1986. Use of a recombinant retrovirus to study post-implantation cell lineage in mouse embryos. Emb J 5:3133-3142.

402. Sansom M.S.P.1991. The biophysics of peptide models of ion channels. Prog Biophys Mol Biol 55:139-235.

403. Santerre R.F., Walls J.D., Grinnel B.W. 1991. Use of vectors to confer resistance to antibiotics G-418 and hygromycin in stably transfected cell lines. Methods Mol Biol 7: 245-256.

404. Skarnes R.C., Watson D.W. 1957. Antimicrobial factors of normal tissues and fluids. Bacteriol Rev 21:273-294.

405. Schachter J., Wyrick P.B. 1994. Culture and isolation of Chlamydia trachomatis. Methods Enzymol. 236:377-390.

406. Scherer L., Rossi J.J., Weinberg M.S. 2007. Progress and prospects: RNA-based therapies for treatment of HIV infection. Gene Ther 14:1057-1064.

407. Schiff P.B., Tant J., Horwitz S.B. 1979. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature 22:665-667.

408. Schiffer M., Edmundson A.B. 1967. Use of helical wheels to represent the structures of proteins and to identify segments with helical potential. Biophys J 7:121-135.

409. Schittek B., Hipfel R., Sauer B., Bauer J., Kalbacher H., Stevanovic S., Schirle M., Schroeder K., Blin N., Meier F., Rassner G., Garbe C. 2001. Dermcidin: a novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands. Nature Immunol 2:1133-1137.

410. Schlee M., Wehkamp J., Altenhoefer A., Oelschlaeger T.A., Stange E.F., Fellermann K. 2007. Induction of human beta-defensin 2 by the probiotic Escherichia coli Nissle 1917 is mediated through flagellin. Infect Immun 75:2399-2407.

411. Schmitz V., Qian C., Ruiz J., Sangro B., Melero I., Mazzolini G., Narvaiza I., Prieto J. 2002. Gene therapy for liver diseases: recent strategies for treatment of viral hepatitis and liver malignancies. Gut 50:130-135.

412. Schwyzer R.1992. Conformations and orientations of amphiphilic peptides induced by artificial lipid membranes: correlations with biological activity. Chemtracts-Biochem Mol Biol 3:347-379.

413. Scidmore M. A., D. D. Rockey, E. R. Fischer, R. A. Heinzen, T. Hackstadt. 1996. Vesicular interactions of the Chlamydia trachomatis inclusion are determined by chlamydial early protein synthesis rather than route of entry. Infect Immun 64:53665372.

414. Scidmore M. A., Hackstadt T. 2001. Mammalian 14-3-3beta associates with the Chlamydia trachomatis inclusion membrane via its interaction with IncG. Mol Microbiol 39:1638-1650.

415. Scidmore M.A., Hackstadt T. 2001. Mammalian 14-3-3beta associates with the Chlamydia trachomatis inclusion membrane via its interaction with IncG. Mol Microbiol 39:1638-1650.

416. Seow Y., Wood M.J. 2009. Biological gene delivery vehicles: beyond viral vectors. Mol Ther 17:767-777.

417. Shafer W.M., Qu X., Waring A.J., Lehrer R.I. 1998. Modulation of Neisseria gonorrhoeae susceptibility to vertebrate antibacterial peptides due to a member of the resistance/nodulation/division efflux pump family. Proc Natl Acad Sci USA. 95:18291833.

418. Sharma S.V. 1992. Melittin resistance: a counterselection for ras transformation. Oncogene 7:193-201.

419. Sharma S.V. 1993. Melittin-induced hyperactivation of phospholipase A2 activity and calcium influx in ras-transformed cells. Oncogene 8:939-947.

420. Sharma U., Singh S. 2009. Immunobiology of leishmaniasis. Indian J Exp Biol 47:412423.

421. Shaw E.I., Dooley C.A., Fischer E.R., Scidmore M.A., Fields K.A., Hackstadt T. 2000. Three temporal classes of gene expression during the Chlamydia trachomatis developmental cycle. Mol Microbiol 37:913-925.

422. Shaw E.I., Dooley C.A., Fischer E.R., Scidmore M.A., Fields K.A., Hackstadt T. 2000. Three temporal classes of gene expression during the Chlamydia trachomatis developmental cycle. Mol Microbiol 37:913-925.

423. Shea L.D., Smiley E., Bonadio J., Mooney D.J. 1999. DNA delivery from polymer matrices for tissue engineering. Nat Biotechnol 17:551-554.

424. Sheynis T., Sykora J., Benda A., Kolusheva S., Hof M., Jelinek R. 2003. Bilayer localization of membraneactive peptides studied in biomimetic vesicles by visible and fluorescence spectroscopies. Eur Biophys J 270:4478-4487.

425. Shin S.Y., Kang S.W., Lee D.G., Eom S.H., Song W.K., Kim J.I. 2000. CRAMP analogues having potent antibiotic activity against bacterial, fungal, and tumor cells without hemolytic activity. Biochem Biophys Res Commun 275:904-909.

426. Shinnar, A. E. et al. in Peptides; Chemistry and Biology. Proc. 14th Am. Peptide Symp. (eds Kaumaya, P., Hodges, R.) 189-191 (Mayflower Scientific, Leiden, 1996).

427. Shiraishi T., Hamzavi R., Nielsen P.E. 2008. Subnanomolar antisense activity of phosphonate-peptide nucleic acid (PNA) conjugates delivered by cationic lipids to HeLa cells. Nucleic Acids Res 36:4424-4432.

428. Shlyapnikov Y.M., Andreev Y.A., Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Grishin E.V. 2008. Bacterial production of latarcin 2a, a potent antimicrobial peptide from spider venom. Protein Expr Purif 60:89-95.

429. Simmaco M., Mignogna G., Barra, D. 1998. Antimicrobial peptides from amphibian skin: what do they tell us? Biopolymers 47:435-450.

430. Sinha S., Cheshenko N., Lehrer R.I., Herold B.C. 2003. NP-1, a rabbit alphadefensin prevents the entry and intracellular spread of herpes simplex virus type 2. Antimicrob Agents Chemother 47:494-500.

431. Sisko J.L., Spaeth K., Kumar Y., Valdivia R.H. 2006. Multifunctional analysis of Chlamydia-specific genes in a yeast expression system. Mol Microbiol 60:51-66.

432. Sit C.S., Vederas J.C. 2008. Approaches to the discovery of new antibacterial agents based on bacteriocins. Biochem Cell Biol 86:116-123.

433. Skerlavaj B., M. Benincasa, A. Risso, M. Zanetti, and R. Gennaro. 1999. SMAP-29: a potent antibacterial and antifungal peptide from sheep leukocytes. FEBS Lett. 463:58-62.

434. Smith J.J., Travis S.M., Greenberg E.P., Welsh M.J. 1996. Cystic fibrosis airway epithelia fail to kill bacteria because of abnormal airway surface fluid. Cell 85:229-236.

435. Sommer B., Rinsch C., Payen E., Dalle B., Schneider B., Deglon N., Henri A., Beuzard Y., Aebischer P. 2002. Long-term doxycycline-regulated secretion of erythropoietin by encapsulated myoblasts. Mol Ther 6:155-161.

436. Sonnex C. 1998. Influence of ovarian hormones on urogenital infection. Sex Transm Infect 74:11-19.

437. Sorin M., Cano J., Das S., Mathew S., Wu X., Davies K.P., Shi X., Cheng S.W., Ott D., Kalpana G.V. 2009. Recruitment of a SAP18-HDAC1 complex into HIV-1 virions and its requirement for viral replication. PLoS Pathog 5 :e 1000463.

438. Stamm W.E. 1999. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. J Infect Dis 179:380-383.

439. Steck T.L., Ye J., Lange Y. 2002. Probing red cell membrane cholesterol movement with cyclodextrin. Biophys J 83:2118-2125.

440. Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G. 1981. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity. Nature 292:246248.

441. Steinmetz M.O., Kammerer R.A., Jahnke W., Goldie K.N., Lustig A., van Oostrum J. 2000. Opl8/stathmin caps a kinked protofilament-like tubulin tetramer. EMBO J 19:572580.

442. Stephens R.S., Poteralski J.M., dinger L. 2006. Interaction of Chlamydia trachomatis with mammalian cells is independent of host cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans. Infect Immun 74:1795-1799.

443. Sternberg B., Sorgi F.L., Huang, L. 1994. New structures in complex formation between DNA and cationic liposomes visualized by freeze-fracture electron microscopy. FEBS Lett 356:361-366.

444. Stieger K., Belbellaa B., Le Guiner C,. Moullier P., Rolling F. 2009. In vivo gene regulation using tetracycline-regulatable systems. Adv Drug Deliv Rev 61:527-541.

445. Sturgeon B.E., Sipe H.J. Jr., Barr D. P., Corbett J.T., Martinez J.G., Mason R.P. 1998. The fate of the oxidizing tyrosyl radical in the presence of glutathione and ascorbate. Implications for the radical sink hypothesis. J Biol Chem 273:30116-30121.

446. Su H., Raymond L., Rockey D.D., Fischer E., Hackstadt T., Caldwell H.D. 1996. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proc Natl Acad Sei USA 93:11143-11148.

447. Subbalakshmi C., Nagaraj R., Sitaram N. 1999. Biological activities of C-terminal 15-residue synthetic fragment of melittin: design of an analog with improved antibacterial activity. FEBS Lett 448:62-66.

448. Subbalakshmi C., Sitaram N. 1998. Mechanism f antimicrobial action of indolicidin. FEMS Microbiol Lett. 160:91-96.

449. Subtil A., Wyplosz B., Balanä M.E., Dautry-Varsat A. 2004. Analysis of Chlamydia caviae entry sites and involvement of Cdc42 and Rae activity. J Cell Sei 117:3923-3933.

450. Sui H.Y., Zhao G.Y., Huang J.D., Jin D.Y., Yuen K.Y., Zheng B.J. 2009. Small interfering RNA targeting m2 gene induces effective and long term inhibition of influenza A virus replication. PLoS One. 4:e5671.

451. Sullenger B.A., Gallardo H.F., Ungers G.E., Gilboa E. 1990. Overexpression of TAR sequences renders cells resistant to human immunodeficiency virus replication. Cell 63:601-608.

452. Suttmann H.5 Retz M., Paulsen F., Harder J., Zwergel U., Kamradt J., Wullich B., Unteregger G., Stockle M., Lehmann J. 2008. Antimicrobial peptides of the Cecropin-family show potent antitumor activity against bladder cancer cells. BMC Urol 8:5.

453. Szczepanowska J. 2009. Involvement of Rac/Cdc42/PAK pathway in cytoskeletal rearrangements. Acta Biochim Pol. 56:225-234.

454. Szulc J., Wiznerowicz M., Sauvain M.O., Trono D., Aebischer P. 2006. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat Methods 3:109-116.

455. Tan H.H. 2004. Topical antibacterial treatments for acne vulgaris: comparative review and guide to selection. Am J Clin Dermatol 5:79-84.

456. Tang M.X., Szoka F.C. 1997. The influence of polymer structure on the interactions of cationic polymers with DNA and morphology of the resulting complexes. Gene Ther 4:823-832.

457. Tang Y. Q., Yuan J., Osapay G., Osapay K., Tran D., Miller C.J., Ouellette A.J., Selsted M.E. 1999. A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated a-defensins. Science 286:498-502.

458. Taraktchoglou M., Pacey A.A., Turnbull J.E., Eley A. 2001. Infectivity of Chlamydia trachomatis serovar LGV but not E is dependent on host cell heparan sulfate. Infect Immun 69:968-976.

459. Taylor-Robinson D., Davies H.A., Sarathchandra P., Furr P.M. 1991. Intracellular location of mycoplasmas in cultured cells demonstrated by immunocytochemistry and electron microscopy. Int J Exp Pathol 72:705-714.

460. Taylor-Robinson D., Furr P.M. 1993. Models of infection due to mycoplasmas, including Mycoplasma fermentans, in the genital tract and other sites in mice. Clin Infect Dis 17 Suppl l:S280-282.

461. Taylor-Robinson D., Furr P.M. 1998. Update on sexually transmitted mycoplasmas. Lancet 351 Suppl 3:12-15.

462. Sullenger B.A., Gallardo H.F., Ungers G.E., Gilboa E. 1990. Overexpression of TAR sequences renders cells resistant to human immunodeficiency virus replication. Cell 63:601-608.

463. Suttmann H., Retz M., Paulsen F., Harder J., Zwergel U., Kamradt J., Wullich B., Unteregger G., Stockle M., Lehmann J. 2008. Antimicrobial peptides of the Cecropin-family show potent antitumor activity against bladder cancer cells. BMC Urol 8:5.

464. Szczepanowska J. 2009. Involvement of Rac/Cdc42/PAK pathway in cytoskeletal rearrangements. Acta Biochim Pol. 56:225-234.

465. Szulc J., Wiznerowicz M., Sauvain M.O., Trono D., Aebischer P. 2006. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat Methods 3:109-116.

466. Tan H.H. 2004. Topical antibacterial treatments for acne vulgaris: comparative review and guide to selection. Am J Clin Dermatol 5:79-84.

467. Tang M.X., Szoka F.C. 1997. The influence of polymer structure on the interactions of cationic polymers with DNA and morphology of the resulting complexes. Gene Ther 4:823-832.

468. Tang Y. Q., Yuan J., Osapay G., Osapay K., Tran D., Miller C.J., Ouellette A.J., Selsted M.E. 1999. A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated a-defensins. Science 286:498-502.

469. Taraktchoglou M., Pacey A.A., Turnbull J.E., Eley A. 2001. Infectivity of Chlamydia trachomatis serovar LGV but not E is dependent on host cell heparan sulfate. Infect Immun 69:968-976.

470. Taylor-Robinson D., Davies H.A., Sarathchandra P., Furr P.M. 1991. Intracellular location of mycoplasmas in cultured cells demonstrated by immunocytochemistry and electron microscopy. Int J Exp Pathol 72:705-714.

471. Taylor-Robinson D., Furr P.M. 1993. Models of infection due to mycoplasmas, including Mycoplasma fermentans, in the genital tract and other sites in mice. Clin Infect Dis 17 Suppl 1 :S280-282.

472. Taylor-Robinson D., Furr P.M. 1998. Update on sexually transmitted mycoplasmas. Lancet 351 Suppl 3:12-15.

473. Taylor-Robinson D., Gilroy C.B., Keane F.E. 2003. Detection of several Mycoplasma species at various anatomical sites of homosexual men. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 22:291-293.

474. Templeton N.S., Lasic D.D., Frederik P.M., Strey H.H., Roberts D.D., Pavlakis G.N. 1997. Improved DNA: liposome complexes for increased systemic delivery and gene expression. Nat Biotechnol 15:647-652.

475. Terry A.S., Poulter L., Williams D.H., Nutkins J.C., Giovannini M.G., Moore C.H., Gibson B.W. 1988. The cDNA sequence coding for prepro-PGS (prepro-magainins) and aspects of the processing of this prepro-polypeptide. J Biol Chem 263:5745-5751.

476. Terwilliger T.C., Eisenberg D. 1982a. The structure of melittin. I. Structure determination and partial refinement. J Biol Chem 257:6010-6015.

477. Terwilliger T.C., Eisenberg D. 1982b. The structure of melittin. II. Interpretation of the structure. J Biol Chem 257:6016-6022.

478. Terwilliger T.C., Weissman L., Eisenberg D. 1982. The structure of melittin in the form I crystals and its implication for melittin's lytic and surface activities. Biophys J 37:353361.

479. Tilley L.D., Mellbye B.L., Puckett S.E., Iversen P.L., Geller B.L. 2007. Antisense peptide-phosphorodiamidate morpholino oligomer conjugate: dose-response in mice infected with Escherichia coli. J Antimicrob Chemother 59:66-73.

480. Tomasinsig L. and Zanetti M. 2005. The cathelicidins—structure, function and evolution. Curr Protein Pept Sci 6:23-34.

481. Toney J.H. 2002. Iseganan (IntraBiotics pharmaceuticals). Curr Opin Investig Drugs 3:225-228.

482. Toraya S., Nishimura K., Naito A. 2004. Dynamic structure of vesicle-bound melittin in a variety of lipid chain lengths by solid-state NMR. Biophys J 87:3323-3335.

483. Tossi A., Sandri L., Giangaspero A. 2000. Amphipathic, alpha-helical antimicrobial peptides. Biopolymers 55:4-30.

484. Tossi A., Scocchi M., Skerlavaj B., Gennaro R. 1994. Identification and characterization of a primary antibacterial domain in CAP 18, a lipopolysaccharide binding protein from rabbit leukocytes. FEBS Lett 339:108-112.

485. Tosteson M.T., Alvarez O., Tosteson D.C. 1985a. Melittin is able to form anion-seletive channels in lipid bilayers. Regul Pept 13:39^45.

486. Tosteson M.T., Holmes S.J., Razin M., Tosteson D.C. 1985b. Melittin lysis of red cells. J Membr Biol 87:35-44.

487. Tosteson M.T., Tosteson D.C. 1981. The sting. Melittin forms channels in lipid bilayers. Biophys J 36:109-116.

488. Travis S.M., Anderson N.N., Forsyth W.R., Espiritu C., Conway B.D., Greenberg E.P., McCray P.B. Jr, Lehrer R.I., Welsh M.J., Tack B.F. 2000. Bactericidal activity of mammalian cathelicidin-derived peptides. Infect Immun 68:2748-2755.

489. Tsai H., Bobek L.A. 1998. Human salivary histatinspromising anti-fungal therapeutic agents. Crit Rev Oral Biol Med 9:480^97.

490. Tsao H.S., Spinella S.A., Lee A.T., Elmore D.E. 2009. Design of novel histone-derived antimicrobial peptides. Peptides 30:2168-2173.

491. Tsygankov A.Y. 2009. Current developments in anti-HIV/AIDS gene therapy. Curr Opin Investig Drugs 10:137-149.

492. Turek J., Dubertret C., Jaslin G., Antonakis K., Scherman D., Pitard B. 2000. Formulations which increase the size of lipoplexes prevent serum-associated inhibition of transfection. J Gene Med 2:32-40.

493. Tytler E.M., Anantharamaiah G.M., Walker D.E., Mishra V.K., Palgunachari M.N., Segrest J.P. 1995. Molecular basis for prokaryotic specificity of magainin induced lysis. Biochemistry 34:4393^1401.

494. Urlinger S., Baron U., Thellmann M., Hasan M.T., Bujard H., Hillen W. 2000. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci USA 97:7963-7968.

495. Vaara M. 2009. New approaches in peptide antibiotics. Curr Opin Pharmacol 9:571-576.

496. Valdivia A., Pérez-Alvarez S., Aroca-Aguilar J.D., Ikuta I., Jordan J. 2009. Superoxide dismutases: a physiopharmacological update. J Physiol Biochem 65:195-208.

497. Vassilevski A.A., Kozlov S.A., Grishin E.V. 2008. Antimicrobial peptide precursor structures suggest effective production strategies. Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov 2:58-63.

498. Vassilevski A.A., Kozlov S.A., Samsonova O.V., Egorova N.S., Karpunin D.V., Pluzhnikov K.A., Feofanov A.V., Grishin E.V. 2008. Cyto-insectotoxins, a novel class of cytolytic and insecticidal peptides from spider venom. Biochem J 411:687-696.

499. Vegeto E., Allan G.F., Schrader W.T., Tsai M.J., McDonnell D.P., O'Malley B.W. 1992. The mechanism of RU486 antagonism is dependent on the conformation of the carboxy-terminal tail of the human progesterone receptor. Cell 69:703-713.

500. Verdel A., Vavasseur A., Le Gorrec M., Touat-Todeschini L. 2009. Common themes in siRNA-mediated epigenetic silencing pathways. Int J Dev Biol. 53:245-257.

501. Verhoef J. 2003. Antibiotic resistance: the pandemic. Adv Exp Med Biol 531:301-313.

502. Vilaboa N., Voellmy R. 2006. Regulatable gene expression systems for gene therapy. Curr Gene Ther 6:421^138.

503. Vogel H. 1987. Comparison of the conformation and orientation of alamethicin and melittin in lipid membranes. Biochemistry 26:4562-4572.

504. Vogel H. 1987. Comparison of the conformation and orientation of alamethicin and melittin in lipid membranes. Biochemistry 26:4562-4572.

505. Vogel H., Jahnig F. 1986. The structure of melittin in membranes. Biophys J 50:573-582.

506. Voss J., Birmachu W., Hussey D.M., Thomas D.D. 1991. Effects of melittin on molecular dynamics and Ca-ATPase activity in sarcoplasmic reticulum membranes: time-resolved optical anisotropy. Biochemistry 30:7498-7506.

507. Voulgarakis N.K., Rasmussen K.0., Welch P.M. 2009. Dendrimers as synthetic gene vectors: cell membrane attachment. J Chem Phys 130:155101.

508. Wachinger M., Saermark T., Erfle V. 1992. Influence of amphipathic peptides on the HIV-1 production in persistently infected T lymphoma cells. FEBS Lett 309:235-241.

509. Waites K.B., Balish M.F., Atkinson T.P. 2008. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiol 3:635-648.

510. Wakefield D.H., Klein J.J., Wolff J.A., Rozema D.B. 2005. Membrane activity and transfection ability of amphipathic polycations as a function of alkyl group size. Bioconjug Chem 16:1204-1208.

511. Wall J., Golding C.A., Van Veen M., O'Shea P. 1995. The use of fluoresceinphosphatidylethanolamine (FPE) as a real-time probe for peptide-membrane interactions. MolMembrBiol 12:183-192.

512. Wang Q.M., Kang L., Wang X.H. 2009. Improved cellular immune response elicited by a ubiquitin-fused ESAT-6 DNA vaccine against Mycobacterium tuberculosis. Microbiol Immunol 53:384-390.

513. Watson M.W., Lambden P.R., Ward M.E., Clarke I.N. 1989. Chlamydia trachomatis 60 kDa cysteine rich outer membrane protein: Sequence homology between trachoma and LGV biovars. FEMS Microbiol Lett 53:293-297.

514. Wehkamp J., Koslowski M., Wang G., Stange E.F. 2008. Barrier dysfunction due to distinct defensin deficiencies in small intestinal and colonic Crohn's disease. Mucosal Immunol Suppl l:S67-74.

515. Weisser N.E. and Hall J.C. 2009. Applications of single-chain variable fragment antibodies in therapeutics and diagnostics. Biotechnol Adv 27:502-520.

516. Wen Y., Pan S., Luo X., Zhang X., Zhang W., Feng M. 2009. A biodegradable low molecular weight polyethylenimine derivative as low toxicity and efficient gene vector. Bioconjug Chem 20:322-332.

517. Werkmeister J.A., Hewish D.R., Kirkpatrick A., Rivett D.E. 2002. Sequence requirements for the activity of membrane-active peptides. J Pept Res 60:232-238.

518. Whithear K.G., Harrigan K.E., Kleven, S.H. 1996. Standardised method of aerosol challenge for testing the efficacy of Mycoplasma gallisepticum vaccines. Avian Diseases 40, 654-660.

519. Wiegand I., Hilpert K., Hancock R.E. 2008. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc 3:163-175.

520. Wilson T.J. and Lilley D.M. 2009. Biochemistry. The evolution of ribozyme chemistry. Science 323:1436-1438.

521. Wimley W.C., White S.H. 2000. Determining the membrane topology of peptides by fluorescence quenching. Biochemistry 39:161-170.

522. Winder D., Gunzburg W.H., Erfle V., Salmons B. 1998. Expression of antimicrobial peptides has an antitumour effect in human cells. Biochem Biophys Res Commun 242:608-612.

523. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P., Chong W., Ascadi G., Jani A., Feigner. P.L. 1990. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247:1465-1468.

524. Wong T.K., Nicolau C., Hofschneider P.H. 1980. Appearance of beta-lactamase activity in animal cells upon liposome-mediated gene transfer. Gene 10:87-94.

525. Wu G.Y., Wu C.H. 1987. Receptor-mediated in vitro gene transformation by a soluble DNA carrier system. J Biol Chem 262:4429-4432.

526. Wussow F., Fickenscher H., Tischer B.K. 2009. Red-mediated transposition and final release of the mini-F vector of a cloned infectious herpesvirus genome. PLoS One 4(12):e8178.

527. Wylie J.L., Hatch G.M., McClarty G. 1997. Host cell phospholipids are trafficked to and then modified by Chlamydia trachomatis. J Bacteriol 179:7233-7242.

528. Xia H., Fitzgerald J., Bredt D.S., Forsayeth J.R. 1997. Detection of mycoplasma infection of mammalian cells. Biotechniques 22:934-936.

529. Xie L., Pandey R., Xu B., Tsaprailis G., Chen Q.M. 2009. Genomic and proteomic profiling of oxidative stress response in human diploid fibroblasts. Biogerontology 10:125-151.

530. Xu G., Zhang N. 2009. Nanoparticles for gene delivery: a brief patent review. Recent Pat Drug Deliv Formul 3:125-136.

531. Xu Y., Hui S.W., Frederik P., Szoka F.C. Jr. 1999. Physicochemical characterization and purification of cationic lipoplexes. Biophys J 77:341-353.

532. Xu Y., Szoka F.C. Jr. 1996. Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection. Biochemistry 35:5616-5623.

533. Yang D., Chen Q., Hoover D.M., Staley P., Tucker K.D., Lubkowski J., Oppenheim J.J. 2003. Many chemokines including CCL20/MIP-3a display antimicrobial activity. J Leukoc Biol 74:448^155.

534. Yang D., Biragyn A., Hoover D.M., Lubkowski J., Oppenheim J.J. 2004. Multiple roles of antimicrobial defensins, cathelicidins, and eosinophil-derived neurotoxin in host defense. Annu Rev Immunol 22:181-215.

535. Yang L., Cui F., Shi K., Cun D., Wang R. 2009. Design of High Payload PLGA Nanoparticles Containing Melittin/Sodium Dodecyl Sulfate Complex by the Hydrophobic Ion-Pairing Technique. Drug Dev Ind Pharm 9:1-9.

536. Yang L., Harroun T. A., Weiss T. M., Ding L., Huang H. W. 2001. Barrel-stave model or toroidal model? A case study on melittin pores. Biophys J 81:1475-1485.

537. Yang Y.H., Wu W.K., Tai E.K., Wong H.P., Lam E.K., So W.H., Shin V.Y., Cho C.H. 2006. The cationic host defense peptide rCRAMP promotes gastric ulcer healing in rats. J Pharmacol Exp Ther 318:547-554.

538. Yasin B., Harwig S.L., Lehrer R.I., Wagar E.A. 1996. Susceptibility of Chlamydia trachomatis to protegrins and defensins. Infect Immun 64:709-713.

539. Yasin B., Pang M., Wagar E.A. 2004. A cumulative experience examining the effect of natural and synthetic antimicrobial peptides vs. Chlamydia trachomatis. J Pept Res. 64:65-71.

540. Yeagle P.L. 1985. Cholesterol and the cell membrane. Biochim Biophys Acta 822:267287.

541. Yeaman M.R., Yount N.Y. 2003. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacol Rev 55:27-55.

542. Yim S., Dhawan P., Ragunath C., Christakos S., Diamond G. 2007. Induction of cathelicidin in normal and CF bronchial epithelial cells by 1,25-dihydroxyvitamin D(3). J Cyst Fibros 6:403-410.

543. Yu Y.Q., Zhao F„ Chen J. 2009. Activation of ERK1/2 in the primary injury site is required to maintain melittin-enhanced wind-up of rat spinal wide-dynamic-range neurons. Neurosci Lett 459:137-141.

544. Zabner J., Fasbender A.J., Moninger T., Poellinger K.A., Welsh M.J. 1995. Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid. J Biol Chem 270:18997-19007.

545. Zasloff M. 1987. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor. Proc Natl Acad Sci USA 84:5449-5453.

546. Zasloff M. 2002. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415:389-395.

547. Zelphati O., Uyechi L.S., Barron L.G., Szoka F.C. Jr. 1998. Effect of serum components on the physico-chemical properties of cationic lipid/oligonucleotide complexes and on their interactions with cells. Biochim Biophys Acta 1390:119-133.

548. Zhang L., Tu W., He T. Contribution of human alpha-defensin 1, 2 and 3 to the anti-HIV-l activity of CD8 antiviral factor. 2002. Science 298:995-1000.

549. Zhang Z. and Burke J.M. 2005. Inhibition of viral replication by ribozyme: mutational analysis of the site and mechanism of antiviral activity. J Virol. 79:3728-3736.

550. Zhao Y., Feng J., Wang Z., Liang A., Yang B. 2008. Characterization of melittin binding to Euplotes octocarinatus centrin. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 70:884887.

551. Zhou C., Plashkevych O., Chattopadhyaya J. 2009. Double sugar and phosphate backbone-constrained nucleotides: synthesis, structure, stability, and their incorporation into oligodeoxynucleotides. J Org Chem 74:3248-3265.

552. Zhou K., He H., Wu Y., Duan M. 2008. RNA interference of avian influenza virus H5N1 by inhibiting viral mRNA with siRNA expression plasmids. J Biotechnol. 135:140-144.

553. Zou G., de Leeuw E., Lubkowski J., Lu W. 2008. Molecular determinants for the interaction of human neutrophil alpha defensin 1 with its propeptide. J Mol Biol 381:1281-1291.

554. Zou J. and Gong Z.X. 2003. Inhibition of replication of goose paramyxovirus SF02 by hammerhead ribozyme targeting to the SF02 F mRNA in chicken embryo fibroblasts. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai) 35:801-805.

555. Zuhorn I.S., Bakowsky U., Polushkin E., Visser W.H., Stuart M.C., Engberts J.B., Hoekstra D. 2005. Nonbilayer phase of lipoplex-membrane mixture determines endosomal escape of genetic cargo and transfection efficiency. Mol Ther 11:801-810.

556. Zuhorn I.S., Visser W.H., Bakowsky U„ Engberts J.B., Hoekstra D. 2002. Interference of serum with lipoplex-cell interaction: modulation of intracellular processing. Biochim Biophys Acta 1560(l-2):25-36.e

Информация о работе

Лазарев, Василий Николаевич
доктора биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Новая стратегия использования генов антимикробных пептидов из яда членистоногих в качестве генотерапевтических агентов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Новая стратегия использования генов антимикробных пептидов из яда членистоногих в качестве генотерапевтических агентов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы