Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика устойчивых к патогенам трансгенных растений с повышенной биобезопасностью

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика устойчивых к патогенам трансгенных растений с повышенной биобезопасностью"

005011764

Лебедева Анна Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА УСТОЙЧИВЫХ К ПАТОГЕНАМ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ С ПОВЫШЕННОЙ БИОБЕЗОПАСНОСТЬЮ

03.01.03 - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 У АР Ш

Пущино - 2012

005011764

Работа выполнена в Филиале Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Бурьянов Ярослав Иванович

кандидат биологических наук Захарченко Наталья Сергеевна

Официальные оппоненты: Озолинь Ольга Николаевна,

доктор биологических наук, профессор, ИБК РАН, заведующая лабораторией

Кузнецова Лидия Геннадьевна,

кандидат биологических наук,

ИФПБ РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук.

Защита диссертации состоится 29 марта 2012 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан 29 февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современные методы генетической инженерии позволяют придавать растениям новые свойства, способствующие повышению устойчивости растений к фитопатогенным микроорганизмам. Устойчивые трансгенные растения повышают качество сельскохозяйственной продукции и одновременно снижают расход пестицидов, улучшая экологическую обстановку. Трансгенные растения имеют перспективы стать одним из самых дешевых биореакторов, позволяющих получать неограниченный набор биомолекул фармацевтического, медицинского и промышленного назначения.

Традиционный способ получения трансгенных растений основан на применении конститутивно экспрессируемых селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам или генов-репортеров. Однако после завершения скрининга трансгенных растений присутствие в их геноме маркерных генов становится бесполезным и даже потенциально опасным. За счет переопыления и горизонтального переноса генетического материала возможно неконтролируемое распространение селективных генов в природных популяциях растений или микроорганизмов. Такая возможность переноса селективных генов в последние годы воспринимается как основная проблема потенциальной биологической опасности генетически модифицированных растений. В связи с этими рисками разработка эффективных подходов к созданию безмаркерных трансгенных растений с повышенной биобезопасностью представляет собой актуальную задачу генетической инженерии растений.

Таким образом, получение биобезопасных растений с устойчивостью к фитопатогенным грибам и бактериям, а также для производства антимикробных веществ для терапии человека является актуальной задачей современной биоинженерии.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы - получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных растений рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, в том числе с повышенной биобезопасностью, экспрессирующих искусственный ген зрелой формы антимикробного пептида цекропинаР1.

Для достижения указанной цели решали следующие задачи:

1. Создание векторных конструкций для переноса искусственного гена зрелой формы антимикробного пептида цекропина Р1 в растения.

2. Получение трансгенных растений рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1.

А :

3. Сравнение уровня экспрессии цекропина PI в трансгенных растениях под контролем различных промоторов.

4. Получение биобезопасных трансгенных растений с повышенной устойчивостью к микробным фитопатогенам без применения селективных генов для скрининга трансформантов.

5. Молекулярно-генетический и физиолого-биологический анализ полученных трансгенных растений.

6. Исследование экологической безопасности полученных трансгенных растений.

Научная новизна работы. Созданы генетические конструкции с целевым геном цекропина PI под различными промоторами: рекомбинантный вектор pPCV91::cecPl, в котором ген cecPl клонирован под модифицированный промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S с четырьмя энхансерами, и рекомбинантный вектор рВМ::сесР1, не содержащий селективных генов для скрининга трансформантов, в котором ген cecPl клонирован под контролем одинарного промотора CaMV 35S.

Получены трансгенные растения рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, экспрессирующие искусственный ген, кодирующий зрелую форму антимикробного пептида цекропина Pl. Уровень синтеза цекропина PI в растениях с геном cecPl под 4-х кратным промотором CaMV 35S был более чем в 10 раз выше, чем под этим одинарным промотором и составил 0,03% от общего содержания белка листьев.

С целью повышения биобезопасности трансгенных растений разработан способ получения безмаркерных трансгенных растений, содержащих ген cecPl. Скрининг трансгенных растений проведен на основе прямой иммунологической детекции цекропина PI в клеточных экстрактах, что значительно сокращает время получения трансгенных растений. Показан стабильный синтез цекропина PI в растениях поколения Т1.

Трансгенные растения рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, экспрессирующие искусственный ген цекропина PI, обладали повышенной устойчивостью против бактериальных - Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae и грибных - Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium sporotrich, Phytophthora infestons фитопатогенных микроорганизмов. Показано, что трансгенные растения, экспрессирующие зрелую форму антимикробного пептида цекропина PI сохраняют способность к колонизации полезными ассоциативными микроорганизмами.

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования вносят новый вклад в развитие методологии получения биобезопасных трансгенных растений. Полученные безмаркерные трансгенные

растения, экспрессирующие искусственный ген зрелой формы антимикробного пептида цекропина Р1, перспективны для повышения продуктивности растений и экологически безопасны. Трансгенные растения каланхоэ могут быть использованы в медицине как продуцент лечебного сока с антимикробной активностью. Разработанная методология получения безмаркерных трансгенных растений, лишенных экспрессируемых селективных и репортерных генов, позволит проводить с ними чистые эксперименты в фундаментальной биологии. Результаты работы могут найти применение в научных исследованиях в областях молекулярной биологии, биохимии и физиологии растений, в том числе в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, МГУ им. М.В. Ломоносова и Всесоюзной академии сельскохозяйственных наук.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на II Международной научно-практической конференции «Перспективы развития биотехнологии в России» (Пущино, 2005); IV съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006); VI съезде Общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007); VIII, X чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2006, 2011); Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009); IX-XV Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 20052011); III Российском Симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007);

IV съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на II, III Международном симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2008, 2010); XVIII, XXII Зимней молодежной научной школе (Москва, 2006, 2010); IX конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); Всероссийской конференции «Экотоксикология» (Пущино-Тула, 2009); Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятым факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008, 2010); Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. A.M. Горького (Екатеринбург, 2010);

V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Инновационное развитие

профессионального образования в условиях университетского комплекса» (Бузулук, 2010); Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010); Всероссийском симпозиуме «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии» (Москва, 2011).

Конкурсная поддержка работы. Исследования проводились в лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН. На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований, Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека», Госконтрактом № 02.512.11.2337 по теме «Получение модифицированных растений и растительно-микробных ассоциаций для биоремедиационных технологий защиты окружающей среды».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах, 3 патента на изобретение, 17 статей в научных сборниках и других изданиях (без тезисов докладов).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего -//СЗ источников. Работа изложена на У страницах, иллюстрационный материал включает 3 рисунка и € таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе использовали растительный материал: рапс масличный (Brassica napus L.) сорта Галант, картофель (Solanum tuberosum L.) сортов Ветрязь и Одиссей, каланхоэ перистое (Kalanchoe pinnata L.). После поверхностной стерилизации гипохлоритом натрия семена растений проращивали в культуре in vitro на агаризованной безгормональной среде MC (Murashige a. Skoog, 1962) при температуре 2224°С, 16-часовом дне, влажности 65% и освещенности 2 клк. Для получения семян растения выращивали в закрытом грунте на станции искусственного климата «Биотрон».

В экспериментах использовали бактериальные штаммы Е. coli: HB 101 (Маниатис и др., 1984), D22 (Normark et al., 1969), DH5a (Hanahan, 1983); штаммы Agrobacterium tumefaciens: LBA4404 (pAL4404) (Hoekema et al., 1984), GV3101 (pMP90RK) (Koncz a. Schell, 1986), а также плазмиды pGA482::cecPl с селективным геном устойчивости к канамицину (nptll), pRT103::cecPl (Захарченко и др. 2005), рВМ (Рукавцова и др., 2009) и pPCV91 с селективным геном устойчивости к гигромицину (hph) (Strizhov et. al., 1996). В качестве фитопатогенных штаммов использовали: бактерии Erwinia carotovora subsp.

carotovora B15 (Horticulture Centre (Канада)) и Pseudomonas syringae B-1546 (BKM ИБФМ РАН); грибные фитопатогены Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium sporotrich (ВНИИ масличных культур им. B.C. Пустовойта, г. Краснодар) и Phytophthora infestons (МГУ им. М.В. Ломоносова). Для микробной колонизации растений использовали ассоциативный штамм Pseudomonas putida KT 2242: :gfp (pNF142::TnMorf) (Smalla et al„ 2000).

Молекулярно-генетические методы. Получение генетических конструкций и клонирование фрагментов ДНК в плазмидные векторы осуществляли по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984). Эндонуклеазы рестрикции, ДНК-лигазу фага Т4, ДНК-полимеразу Taq использовали согласно рекомендациям фирмы-производителя («СибЭнзим», Россия). Приготовление компетентных клеток Е. coli и A. tumefaciens проводилось согласно описанным методикам (Маниатис и др., 1984). Перенос плазмид в А. tumefaciens осуществляли методом прямой трансформации клеток очищенной плазмидной ДНК (An et al., 1988). ДНК-ДНК гибридизацию проводили на нейлоновых фильтрах по методу Gerden (Gergen et al., 1979), получение радиоактивно меченых препаратов ДНК для гибридизации на фильтрах получали с помощью набора "Multiprim DNA Labelling System" ("Amersham", Англия) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя с использованием отечественного препарата (а32Р) dATP с удельной активностью 5000 Ки/моль.

ПЦР-амплификацию проводили с использованием праймеров к генам цекропина PI (cecPl). Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали амплификатор MJ Mini (Bio-Rad, США). Для ПЦР-анализа ДНК выделяли из листьев растений двумя методами - модифицированным методом (Edwards et. al., 1991) и с использованием СТАВ (Doyle a. Doyle, 1987). Продукты реакции разделяли в 6% полиакриламидном и 0,8% агарозном гелях.

Генетическую трансформацию растений проводили двумя методами -инокуляцией растительных эксплантов, как описано (Draper et al., 1988) и вакуумной агроинфильтрацией семян. Частоту трансформации определяли в процентах как отношение числа побегов, регенерировавших из эксплантов на селективной среде, к общему числу культивируемых эксплантов.

Концентрацию белка в экстрактах растительных тканей определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976). Химический синтез пептида цекропина PI проведен к.х.н. И.Л. Родионовым. Вестерн-блот анализ проводили с использованием поликлональных антител к цекропину PI, предоставленных к.х.н. А.Г. Ламаном. Для электрофоретического разделения белков трансгенных растений использовали SDS-трициновую систему в 16%-ном ПААГе. Для переноса белков использовали PVDF мембрану ("Porablot", Macherey-Nagel,

Германия), иммунодетекцию проводили с помощью набора реактивов ECL ("Amersham", Великобритания).

Определение уровня экспрессии цекропина Р1 в экстрактах трансгенных растений проводили методом ингибирования роста клеток Е. coli D22 в жидкой среде (Normark et al. 1969). Для определения антибиотической активности экстрактов трансгенных растений по отношению к фитопатогенному штамму Е. carotovora использовали метод радиальной диффузии (Ohshima et al., 1999). Биотесты по определению устойчивости трансгенных растений к фитопатогенам проводили, используя стандартные методы инфицирования (Захарченко и др., 2005). Колонизацию трансгенных растений ассоциативными микроорганизмами проводили в условиях in vitro (Захарченко и др., 2012).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение генетических конструкций с искусственным геном антимикробного пептида цекропина Р1

Для создания трансгенных растений были получены плазмидные конструкции, в том числе и безмаркерный вектор, содержащие ген цекропина PI (cecPl) под различными промоторами.

С целью повышения уровня экспрессии цекропина Р1 в трансгенных растениях нами получена конструкция с геном cecPl на основе бинарного вектора pPCV91 (Strizhov et al., 1996). Вектор pPCV91 был создан на основе плазмиды pPCV720 (Koncz et al., 1994). Этот вектор содержит промотор CaMV35S с четырьмя энхансерами и нетранслируемую лидерную последовательность АО тРНК вируса табачной мозаики (Gallie a. Kado, 1989). Для встраивания в вектор pPCV91 ген cecPl предварительно фланкировали сайтами рестрикции Ват\\\, проводя ПЦР с использованием праймеров:

5'-ATGGTGGATCCTAGCGCGGGCCGCCCTGAATCGC-3'f

5'-ACTGAGGATCCACCATGGGCTCTTGGCTGTCTAAA-3'r

Амплифицированный ген клонировали в бинарный вектор pPCV91 по сайту рестрикции ВатШ. Полученной генетической конструкцией трансформировали штамм Е. coli DH5a. Для проверки ориентации гена cecPl относительно промотора выделяли плазмидную ДНК из отдельных колоний и проводили рестрикционный анализ по сайтам ВатШ и Atol. Гидролиз плазмиды показал наличие вставки гена cecPl размером 102 п.н. и его прямую ориентацию относительно промотора. Полученную векторную конструкцию pPCV91::cecPl (Рис. 1), содержащую ген цекропина Р1 под контролем четырехкратного промотора CaMV 35S, переносили в штамм агробактерий

А. Ште/ас1ет вУЗКИ (рМР9(ЖК). Трансформацию растений проводили двумя методами: кокультивацией эксплантов с суспензионной культурой агробактерий и с помощью вакуумной агроинфильтрации семян.

BimHI Xbal ВатШ

LB

—1»М>1

нж

RB

PCiMV35S

AQ cecPl pA35S ряes hfh

pAg4

Рис. 1. Схема рекомбннантной плазмиды рРСУ91::сесР1.

СаМУ 358 - промотор 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты с четырьмя энхансерами; А£2 - нетранслируемая лидерная последовательность тРНК вируса табачной мозаики; рпоэ -промотор гена нопалинсинтазы агробактерий; рА355, рЛ§4 - сигналы полиаденилирования 358 РНК вируса мозаики цветной капусты и гена 4 агробактерий; сесР1 - ген цекропина Р1; ИрИ - ген гигромицинфосфотрансферазы; ИВ, ЬВ - правая и левая границы Т-ДНК.

Безмаркерную конструкцию для экспрессии гена цекропина PI получали на основе вектора рВМ (Рукавцова и др., 2009). Искусственный ген cecPl с промотором CaMV 35S выщепляли путем рестрикции плазмиды pRT103::cecPl по сайтам Sphl и встраивали в вектор, гидролизованный по этому же сайту (Рис.2). Полученной конструкцией трансформировали штамм Е. coli HB 101. Выросшие клоны проверяли на наличие вставки методом гибридизации на чашках с геном cecPl в качестве зонда. В результате анализа было обнаружено 24 клона с положительным сигналом. Полученную конструкцию рВМ::сесР1, содержащую ген цекропина PI, и не содержащую селективных маркерных генов для скрининга трансформантов, переносили в штамм А. tumefaciens LBA4404 (pAL4404) методом прямой трансформации. Полученный штамм бактерий использовали для генетической трансформации растений.

Кроме плазмид pPCV91::cecPl и рВМ::сесР1 в работе для трансформации растений использовали ранее полученную в лаборатории конструкцию pGA482::cecPl, содержащую ген cecPl под промотором CaMV 35S и маркерный ген неомицинфосфотрансферазы II (nptll) (Захарченко и др., 2005).

SphI Cain" 35 S сесИ pACaMY SphI

Рис. 2. Схема конструирования рекомбинантной плазмиды рВМ::сесР1 для получения безмаркерных растений, содержащих ген cecPl. CaMV 35S - промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; pACaMV - сигнал полиаденилирования вируса мозаики цветной капусты; cecPl - ген цекропина PI; KmR - ген устойчивости к антибиотику канамицину для селекции бактерий; oriV - начало репликации; TL, TR - левая и правая границы Т-ДНК; ColEl - начало репликации из плазмиды ColEl; R, К, Sm, В, SI, S - сайты рестрикции EcoRl, Kpnl, Smal, BamW\, Sal I, Sphl.

2. Получение трансгенных растений с рекомбинантным вектором pGA482::cecPl и их молекулярно-генетический анализ

Для генетической трансформации геном cecPl выбрали важные сельскохозяйственные культуры - рапс масличный и картофель. Эти культуры подвержены заражению грибными и бактериальными патогенами, поэтому актуальна задача повышения их устойчивости. Еще одним объектом нашей работы было каланхоэ перистое (Kalanchoe pinnata L.), которое широко

применяется в медицинской практике в качестве наружного ранозаживляющего средства. Синтез в нем цекропина Р1 может усилить бактерицидные свойства этого растения и повысить его ценность для фармакологии. Методы генетической трансформации различных видов каланхоэ недостаточно разработаны, а для вида Kalanchoe pinnata вообще отсутствовали.

Перед проведением генетической трансформации растений оптимизировали состав сред для регенерации побегов. В качестве эксплантов использовали сегменты гипокотилей 10-дневных проростков рапса и листовые диски картофеля и каланхоэ. По некоторым имеющимся в литературе данным для регенерации рапса использовали сложный процесс с несколькими средами (Damgaard et al., 1996). В нашем случае удалось упростить эту процедуру. Наиболее подходящей оказалась среда с добавлением 1 мг/л 6-бензиламинопурин (БАП) и 0,1 мг/л нафтилуксусной кислоты (НУК), на которой наибольшая частота регенерации достигала 26%.

Регенерацию побегов из листовых дисков стерильных растений картофеля проводили по методике (Rocha-Sosa et al., 1989; Захарченко и др., 2007). По трансформации каланхоэ перистого сведения в литературе отсутствуют. Мы впервые разработали систему эффективной регенерации и трансформации для данного вида каланхоэ. В качестве эксплантов использовали фрагменты листьев, полученные из выращенных in vitro 4-х недельных растений (Рис. 3 А). Среда для регенерации была подобрана опытным путем и частота регенерации на ней составила 37%.

Трансформацию растений проводили методом кокультивации эксплантов с агробактериями A. tumafaciens GV3101 (pMP90RK, pGA482::cecPl). Органогенез наблюдали через 5-8 недель культивирования. Побеги, выросшие на селективной среде, отделяли от эксплантов и переносили на среду для укоренения с половинной концентрацией солей МС, содержащую 0,05 мг/л НУК (Рис. 3 Б). Полученные регенеранты сохраняли все фенотипические характеристики исходных родительских форм.

Для подтверждения трансгенной природы полученных растений проводили молекулярно-генетический анализ методом ПЦР с праймерами для гена cecPl. Размер образующихся в результате амплификации фрагментов ДНК (102 п.н.) соответствовал полноразмерному гену cecPl (Рис. 3 В; 4).

Максимальная частота трансформации рапса методом инокуляции эксплантов агробактериями составила 7%, а при агроинфильтрации - 14%. Каланхоэ и картофель трансформировали одним методом инокуляции эксплантов агробактериями, и максимальная частота трансформации картофеля составила 20%, каланхоэ - 24%.

Рис. 3. Трансформация растений каланхоэ перистого вектором pGA482:: cecPl и их молекулярно-генетнческий анализ. А - регенерация побегов каланхоэ после трансформации через 4 недели культивирования; Б - трансгенные растения каланхоэ через 8 недель культивирования; В - ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений каланхоэ: 1 - ДНК маркер; 2-5 - ДНК трансгенных растений разных линий; 6 - ДНК нетрансформированного растения; 7 - ПЦР без ДНК; 8 - ДНК плазмиды pRT-103::cecPl; Г - Вестерн-блот анализ белковых экстрактов из трансгенных растений каланхоэ: 1 - 20 нг синтетического цекропинаР1; 2 - нетрансформированное растение; 3-5 - трансгенные растения каланхоэ разных линий.

Рис. 4. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений рапса и картофеля, содержащих ген cecPl. 1 - ДНК маркер молекулярного веса; 2 - (контроль +) ДНК плазмиды pRT-103::cecPl;

3 - (контроль -) ДНК нетрансформированного растения; 4-7 - ДНК трансгенных растений рапса разных линий;

8-10 - ДНК трансгенных растений картофеля разных линий.

Экспрессия пептида цекропина Р1 в трансгенных растениях рапса, картофеля (Рис. 5) и каланхоэ (Рис. 3 Г) была подтверждена методом вестерн-блот анализа. Наличие одной полосы с молекулярной массой 3,4 кДа у исследуемых образцов соответствует зрелой форме цекропина Р1 (Рис. 5). В контрольных растениях сигнал, соответствующий цекропину Р1 отсутствовал.

3,4 кДа —►

123456789

Рис. 5. Вестерн-блот анализ белковых экстрактов из трансгенных растений рапса и картофеля, синтезирующих пептид цекропин PI. 1 - контроль (+) 20 нг синтетического цекропина PI; 2 - контроль (-) нетрансформированное растение; 3-6 - трансгенные растения рапса разных линий; 7-9 - трансгенные растения картофеля разных линий.

„

Полученные трансгенные растения тестировали на устойчивость к некоторым патогенным микроорганизмам. Анализ проводили как на отдельных листьях (по 10 штук каждой линии), так и на целых растениях через 2 месяца после высадки в закрытый грунт. Результаты биотестирования устойчивости листьев и целых трансгенных растений картофеля к фитопатогенам Erwinia carotovora и Fusarium sporotrich представлены на рисунке 6.

контроль pGA482::cecPl контроль pGA482::cecPl

контроль pGA482::cecPl

через месяц после заражения

Рис. 6. Устойчивость целых растений и листьев трансгенного картофеля сорта Ветрязь (линия В-12) по сравнению с нетрансформированными растениями (контроль) к патогенам: А, В — Е. сагоЮгога В15; Б - /*. .\porolrich.

Для подтверждения природы антибиотических свойств трансгенного картофеля и определения молекулярной массы синтезируемого в нем пептида цекропина Р1 проводили гельфильтрацию экстракта трансгенных растений

4 суток

7 суток

картофеля, очищенного от пигментов и низкомолекулярных веществ (Рис. 7). Антимикробную активность полученных фракций анализировали методом радиальной диффузии в агаровых блоках на культуре Е. сагокпот. Антимикробная активность была обнаружена преимущественно в одной фракции. С помощью аналитической гельфильтрации молекулярная масса пептида цекропина Р1, синтезируемого в трансгенных растениях, определена равной 3,4 кДа, что соответствует молекулярной массе синтетического цекропина Р1.

Рис. 7. Гельфильтрация на колонке Superdex Peptide (НК 10/30) экстракта трансгенных растений картофеля, синтезирующих цекропии Р1.

Сплошная линия - оптическое поглощение при 280 нм. Штриховая линия - детекция цекропина Р1 по антимикробной активности. А - цитохром С (мол. вес 12,4 кДа); В - цекропин В (мол. вес 3,8 кДа); С - глицин (мол. вес 75 Да).

Выражаю глубокую благодарность к.х.н. И.А. Кашпарову за помощь в проведении экспериментов по гельфильтрации.

л и

с

100 -

10 20 30 40 50 60 Время удержания, мин

3. Получение трансгенных растений с рекомбинантным вектором pPCV91::cecPl с четырехкратным промотором CaMV35S

Трансформацию рапса ночной культурой А. tumefaciens GV3101 (pMP90RK, pPCV91::cecPl) с геном cecPl под четырехкратным промотором (CaMV4x35S) и А. tumefaciens GV3101 (pMP90RK, pGA482::cecPl) с геном cecPl под одинарным промотором (CaMV 1x35S) проводили методом агроинфильтрации семян. Этот метод снимает зависимость от морфогенетического потенциала растений, устраняет возможность появления сомаклональных вариантов и значительно ускоряет процедуру трансформации (Bechtold et al., 1993). Наличие и экспрессия гена цекропина PI в трансгенных растениях рапса были подтверждены методами ПЦР и вестерн-блот анализа.

Нами был проведен сравнительный физиолого-биологический анализ трансгенных растений рапса, трансформированных разными конструкциями - с геном cecPl под контролем промоторов CaMVl*35S и CaMV4x35S. Антибактериальную активность тестируемых экстрактов оценивали по диаметру зоны ингибирования роста бактерий Е. carotovora В15. Диаметр зоны ингибирования бактериального роста у экстрактов рапса с геном cecPl под промотором CaMV 4x35S был значительно выше, чем у экстрактов рапса с геном cecPl под промотором CaMV lx35S (Рис. 8). Максимальный уровень синтеза цекропина PI под промотором CaMV 1 x35S составил 0,005% от общего растворимого белка листьев, а под промотором CaMV 4x35S синтез пептида был выше примерно в 10 раз и составил 0,03% от общего растворимого белка.

Полученные данные коррелируют с результатами эксперимента по ингибированию роста бактериальных клеток Е. coli Д22 в жидкой среде экстрактами трансгенного рапса с геном cecPl под промоторами CaMV 4><35S и CaMV 1X35S. Минимальная ингибирующая концентрация цекропина PI на рост Е. coli Д22 — 0,4 мкМ (Lee et al., 1989). При добавлении экстрактов контрольных растений рапса, в количестве 1 мг общего белка к растущим клеткам Е. coli в жидкой среде, вырастало 1200 колоний (Рис. 9, контроль), в то время как в результате добавления такого же количества белкового экстракта трансгенных растений, экспрессирующих ген cecPl под промотором CaMV 1X35S вырастало только 40 колоний (Рис. 9, кривая pGA482::cecPl), что указывает на значительное ингибирование роста бактериальных клеток экстрактами трансгенных растений. При анализе антибиотической активности растений, экспрессирующих ген cecPl под промотором CaMV4x35S, 40 колоний вырастало при добавлении 0,065 мг/мл белкового экстракта (Рис. 9, кривая pPCV91::cecPl).

pGA482xl pPCV91x4 контроль

Рис. 8. Антимикробная активность по отношению к Е. саго1оуога В15 экстрактов трансгенных растений рапса, экспрессирующих ген сесР1 под разными промоторами.

Лунки: 1 - синтетический цекропин Р1 (1 мкМ); 2 - растительный экстракт с сесР1 под СаМУ 1x355; 3 - растительный экстракт с сесР1 под СаМУ 4*358; 4 - контроль (экстракт ^трансформированного растения); 5 - синтетический цекропин Р1 (10 мкМ); 6 - экстракционный буфер.

О 0,03 0,04 0,05 0,1 0,5 1

Концентрация общего белка, мг/мл

Рис. 9. Чувствительность клеток Е. coli Д22 к действию экстрактов трансгенных растений рапса. Линия 1 - экстракт трансгенного растения с геном cecPl под промотором CaMV 1 ><35S; линия 2 - контроль (нетрансформированное растение); линия 3 - экстракт трансгенного растения с геном cecPl под промотором CaMV 4X35S.

Расчеты показали, что уровень экспрессии антимикробного пептида под разными промоторами отличался в 15 раз. В наших экспериментах некоторой

антибиотической активностью обладали экстракты нетрансформированных контрольных растений, что может быть связано с активностью их эндогенных защитных соединений.

Полученные трансгенные растения рапса, содержащие искусственный ген цекропинаР1 под разными промоторами, тестировали на устойчивость к бактериальным и грибным патогенам. Показано, что растения с геном сесР1 под промотором СаМV 4x358 проявляют большую устойчивость по сравнению с растениями с геном сесРI под промотором СаМУ 1><358 (Рис. 10). Наибольшая степень поражения листьев была отмечена в контрольных (нетрансформированных) растениях.

А Б В

Рис. 10. Устойчивость листьев трансгенных растений рапса к патогенным бактериям Е. carotovora В15. Представлены листья растений через 4 суток после заражения. А - контрольное растение (полное отмирание тканей); Б - трансгенное растение с геном cecPl под промотором CaMV 1*35S (у листа незначительно поврежден черешок, небольшие очаги пожелтения); В - трансгенное растение с геном cecPl под промотором CaMV 4*35S (лист полностью сохраняет первоначальную плотность и зеленую окраску).

Трансгенные растения (по 10 линий каждого типа) были высажены в теплицу и доведены до цветения. Семена (по 100 семян каждой линии), полученные при самоопылении первичных трансформантов, проращивали в асептических условиях и тестировали на устойчивость к канамицину и гигромицину. Наблюдаемое расщепление по экспрессии генов nptll и hph в условиях in vitro, составило приблизительно 3:1. Это свидетельствует о том, что в указанных растениях находится одна копия генов nptll и hph. Семена трансформантов отличались всхожестью в условиях in vitro, сравнимой с семенами контрольных растений.

4. Получение безмаркерных трансгенных растений с геном цекропина Р1

В традиционном методе скрининга трансгенных растений в растительный геном переносится не только целевой, но и маркерный ген. Нами разработан метод получения безмаркерных трансгенных растений, основанный на прямом скрининге трансформантов по детекции продукта экспрессии целевого гена пептида цекропина Р1 при помощи вестерн-блот анализа (Бурьянов и др., 2009; Рукавцова и др., 2009).

Для получения безмаркерных трансгенных растений рапса с повышенной устойчивостью к микробным фитопатогенам использовали полученную плазмиду рВМ::сесР1. Для трансформации применяли метод агроинфильтрации семян. Для поиска трасформированных растений методом вестерн-блот анализа брали по одному листовому экспланту у каждого из 10 регенерировавших проростков, их объединяли в группы (всего 50 групп) и использовали для приготовления исходных тестируемых образцов растительного экстракта.

Для прямого поиска индивидуальных растений, синтезирующих антимикробный пептид цекропин Р1, растения трех таких групп пересаживали в отдельные пробирки, подращивали в течение 3 недель и проводили вестерн-блот анализ экстракта из листьев, содержащего около 30 мкг общего белка. В экстрактах некоторых растений был обнаружен искомый пептид с молекулярной массой 3,4 кДа, соответствующий зрелой форме цекропина Р1 (Рис. 11).

В каждой из трех исследованных групп с положительным иммунным сигналом было выявлено от одного до трех цекропин Р1-растений. В группах с антибактериальной активностью в количестве 30 индивидуальных растений их прямой анализ на присутствие цекропина Р1 выявил 5 таких растений. Присутствие гена сесР1 в трансгенных растениях подтверждено методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Размер амплифицированных фрагментов ДНК (102 п.н.) соответствовал полному размеру гена цекропина Р1 (Рис. 12).

Учитывая результаты исходного анализа 30 регенерантов растений на присутствие в их экстрактах антибактериальной активности, максимальная частота трансформации этим методом составляет 17,6%. Чувствительность этого метода позволяет детектировать в образцах экстрактов трансгенных растений цекропин Р1 в количестве от 10 нг и выше.

Методом ингибирования роста бактериальных клеток при добавлении растительных экстрактов определили, что полученные нами сесР1 -растения, синтезировали цекропин Р1 на среднем уровне около 0,008% от общего растворимого белка листьев, что делает возможным надежное применение

использованных нами методов обнаружения таких растений в выборке из нескольких сотен регенерантов.

% ----

123456789 10

Рис. 11. Вестерн-блот анализ экстрактов различных групп растений рапса.

1 - 20 нг синтетического цекропина Р1 (контроль +);

2 - экстракт нетрансформированного растения (контроль -);

3-10 - экстракты исследуемых групп трансформированных растений (30 мкг общего белка).

Рис. 12. ПЦР - анализ безмаркерных трансгенных растений рапса, содержащих ген cecPl. 1 - ДНК маркер молекулярного веса; 2 - ДНК нетрансформированного растения

(контроль -); 3-8 - ДНК безмаркерных трансгенных растений рапса разных

Частота трансформации безмаркерным вектором рВМ с геном цекропина Р1 выше, чем при трансформации другими векторами (Табл. 2). Вероятно, это связано с тем, что переносимая в растения область Т-ДНК рекомбинантного вектора рВМ::сесР1 укорочена на 2600 п.н. за счет элиминации гена nptll вместе с его промотором и сигналом полиаденилирования, что дает преимущества при трансформации растений, так как может снизить нежелательный эффект длинных векторных последовательностей на плотность их упаковки в хроматин и, соответственно, на экспрессию целевого гена. Имеются данные о повышении экспрессии трансгенов в случае трансформации клеток безвекторными генетическими конструкциями (Etchberger a. Hobert, 2008).

Разработанная нами стратегия прямого скрининга безмаркерных растений по продуктам экспрессии целевых генов обладает важными преимуществами перед другими методами (Рис. 13). В этом методе отобранные трансгенные растения изначально не содержат селективных маркеров, что не требует трудоемких операций по их удалению. При этом сокращается время получения растений с целевыми генами.

12345678

Таблица 2

Зависимость эффективности трансформации от свойств генетической конструкции и способа трансформации рапса.

Метод Кокультивация с агробактериями Агроинфильтрация

Вектор pGA482r.cecPl pGA482::«?cW pPCV91 wcecPl рЪМ::сесР1

Максимальная частота трансформации, % 1 14 13 17,6

Максимальный уровень экспрессии, % 0,003 0,005 0,03 0,008

Этот метод позволяет снизить продолжительную антибиотическую или гербицидную стрессовую нагрузку на растения в процессе отбора трансформантов на селективных средах. У растений, подвергнутых селективному стрессу, ДНК подвергается гиперметилированию, что может приводить к "замолканию" или снижению экспрессии целевых генов (Shmit et al., 1997; Захарченко Н.С. и др., 2000). Известно, что процесс генетической трансформации растений с отбором трансформантов в условиях селективного стресса сопровождается "замолканием" трансгенов с частотой до 30-60% (Kirnet, al., 1998). Скрининг трансгенных растений на бесстрессовой среде создает условия для нормального роста и развития растений без аномального изменения метилирования их генома. Следует отметить, что при использовании метода прямой детекции целевого продукта в трансгенных растениях возможен одновременный отбор линий растений с его максимальным синтезом. Это подтверждалось наследованием признака в Т1-поколении с расщеплением 3:1, что свидетельствует о встраивании одной копии гена. Кроме того, данный метод не требует удаления селективных маркерных генов в потомстве, поэтому он пригоден для получения растений, размножающихся вегетативно, а также для древесных растений с длительным циклом развития.

бегмаркерный вектор с

целевым генам

растительная клетка

неселективная среда

анализ растении

прямая детекция целевого продукта, скрининг линий с максимальным синтею.м

вестерн-блат анализ

Рис. 13. Прямая детекция синтезируемых целевых продуктов в трансгенных растениях с помощью вестерн-блот анализа.

5. Исследование совместимости цекропин Р1-содержащих растений с полезными ассоциативными микроорганизмами

Растения в природных условиях существуют в ассоциации с комплексом различных полезных микроорганизмов, оказывающих положительное влияние на рост и развитие растений за счет их способности к азотфиксации, подавления роста патогенов, образования физиологически активных веществ и мобилизации питательных элементов из почвы. Нарушение связи растений с микроорганизмами может привести к гибели природных агробиоценозов. Нами исследовано взаимодействие трансгенных растений, экспрессирующих ген

антимикробного пептида цекропина PI, с полезными ассоциативными микроорганизмами. Для изучения ассоциации псевдомонад с растениями, использовали штамм Pseudomonas putida KT 2442::gfp (pNF142::TnMod), содержащий в хромосоме маркерный ген зеленого флуоресцентного белка GFP. Разведенную суспензию Р. putida (104-106 КОЕ/мл) наносили на листья стерильных растений. Через 1-5 недель проверяли установление ассоциативной связи бактерий с растениями (Табл. 3). Колонии бактерий были обнаружены в первоначально колонизированных контрольных и трансгенных растениях и сохранялись при их клональном микроразмножении. Больше всего бактерий содержалось в корнях колонизированных растений, что подтверждает их ризосферную природу (Кочетков и др., 1997). Микроскопический анализ колонизированных тканей трансгенных растений подтвердил присутствие в них бактерий Р. putida.

Таблица 3

Эффективность колонизации растений рапса штаммом Pseudomonas putida KT 2AA2\:gfp после инокуляции lxlO6 КОЕ /мл.

Вариант Кол-во недель после колонизации Корни Стебли Листья

Контроль (не трансг.) 1 5.66±0.51 2.53±0.42 4.47±0.41

Трансген (cecPl) (7-1) 1 5.98±0.47 2.46±0.63 4.26±0.59

Контроль (не трансг.) 5 6.12±0.58 3.77±0.29 4.00±0.37

Трансген (cecPl) (7-1) 5 6.34±0.62 3.54±0.39 4.21±0.36

Примечание. Значение логарифма (logio КОЕ/мл) числа колоний Pseudomonas putida KT 2442::gfp было определено в корнях, стеблях и листьях колонизированных растений. Представлены средние арифметические и их стандартные отклонения из 3 опытов, каждый из которых проведен в пятикратной биологической повторности (п=15).

Таким образом, трансгенные растения, экспрессирующие ген цекропина PI, и проявляющие устойчивость к фитопатогенам, сохраняют способность к колонизации полезными ассоциативными микроорганизмами. Это может быть связано с ненарушением ассоциативными микроорганизмами живых клеток растений и отсутствием их контакта с цекропином PI, локализованным внутри клеток.

выводы

1. Сконструирован рекомбинантный вектор pPCV91::cecPl для экспрессии зрелой формы пептида цекропина PI под промотором 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S) с четырьмя энхансерами.

2. Получены трансгенные растения рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, экспрессирующие ген антимикробного пептида цекропина PI под различными промоторами CaMV 35S.

3. В растениях уровень экспрессии гена цекропина PI под промотором CaMV 35S с четырьмя энхансерами был более чем в 10 раз выше, чем под этим одинарным промотором.

4. С целью повышения биобезопасности трансгенных растений получен рекомбинантный вектор рВМ::сесР1 и разработан метод получения безмаркерных растений, основанный на иммунологической детекции пептида цекропина Pl.

5. Проведен молекулярно-генетический и физиолого-биологический анализ полученных трансгенных растений. Показана повышенная устойчивость трансгенных растений к бактериальным (Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae) и грибным {Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium sporotrich, Phytophthora infestons) фитопатогенам.

6. Проведено исследование экологической безопасности полученных трансгенных растений. Показано сохранение способности трансгенных растений к колонизации полезными ассоциативными микроорганизмами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации СТАТЬИ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ ЖУРНАЛАХ

1. Захарченко Н.С., Георгиевская Е.Б., Школьная Л.А., Юхманова A.A., Кашпаров И.А., Бурьянов Я.И., Маслиенко Л.В., Шепиевская Е.Ю., Шевелуха B.C. Выделение и характеристика полипептида Bacillus subtillis Kl-1 - ингибитора роста фитопатогенных грибов и бактерий // Биотехнология. 2007. № 3. С. 21-26.

2. Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Юхманова A.A., Школьная Л.А., Кадо К.И., Бурьянов Я.И. Экспрессия искусственного гена антимикробного пептида цекропина PI повышает устойчивость растений картофеля к фитофторозу и белой гнили // Доклады Академии наук. 2007. Т. 415. № 1.С. 129-131.

3. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Юхманова A.A., Бурьянов Я.И. Использование гена антимикробного пептида цекропина PI для получения безмаркерных трансгенных растений // Генетика. 2009. Т. 45. № 8. С. 10611066.

4. Рукавцова Е.Б., Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Юхманова A.A.. Чеботарева E.H., Бурьянов Я.И. Получение безмаркерных трансгенных растений //Доклады Академии наук. 2009. Т. 426. № 2. С. 261-264.

5. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Кочетков В.В., Чепурнова М.А., Дьяченко О.В., Лебедева A.A., Захарченко A.B., Пунтус И.Ф., Воронин A.M., Бурьянов Я.И. Влияние ассоциативных псевдомонад и метилобактерий на рост и устойчивость растений к фитопатогенам и ксенобиотикам // Физиология растений. 2012. № 1. Т. 59. С. 89-98.

ПАТЕНТЫ

1. Захарченко Н.С., Лебедева A.A.. Бурьянов Я.И. Способ получения генетически модифицированных растений каланхоэ, экспрессирующих ген цекропина Pl. Заявка на изобретение № 2010130041 от 21.07.2010 г. Опубл. 27.01.2011.№3.

2. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Юхманова A.A., Пиголева C.B., Рукавцова Е.Б., Чеботарева E.H., Гаязова А.Р. Рекомбинантная плазмида рВМ и способ получения с ее использованием безмаркерных трансгенных растений, синтезирующих целевые продукты. Патент № 2410433 (РФ) // Б.И. 2011. №3.

3. Захарченко Н.С., Кочетков В.В., Анохина Т.О., Сизова О.И., Сиунова Т.В., Лебедева A.A., Захарченко A.B., Бурьянов Я.И., Воронин A.M. Способ получения растительно-микробных ассоциаций для фиторемедиации на основе микроразмножаемых растений и плазмидосодержащих ризосферных бактерий. Заявка на изобретение № 2010130036.

СТАТЬИ В НАУЧНЫХ СБОРНИКАХ H ДРУГИХ ИЗДАНИЯХ

1. Георгиевская Е.Б., Захарченко Н.С., Юхманова A.A.. Чернышев С.А., Бурьянов Я.И. Повышение устойчивости растений к фитопатогенам и ксенобиотикам с помощью колонизации трансформированными микроорганизмами // Материалы Международной научно-практической конференции 25-28 мая Минск-Нарочь. Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества. Республика Беларусь. 2005. С. 49.

2. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Георгиевская Е.Б., Чернышев C.B., Юхманова A.A.. Школьная Л.А. Трансгенные растения или альтернативные

микробные биотехнологии защиты растений? // Международная научная конференция «Микробные биотехнологии». Украина. Одесса. 11-15 сентября 2006. С. 41.

3. Маслиенко J1.B., Шепиевская Е.Ю., Захарченко Н.С., Георгиевская Е.Б., Школьная JI.A., Юхманова A.A., Бурьянов Я.И. Выделение белкового фактора Bacillus sp. - ингибитора роста фитопатогенных грибов и бактерий // Международная научная конференция «Микробные биотехнологии». Украина. Одесса. 11-15 сентября 2006. С. 85.

4. Юхманова A.A.. Георгиевская Е.Б., Захарченко Н.С., Школьная JI.A., Голубев В.И., Бурьянов Я.И. Дрожжи Pseudazyma fusiformata защищают растения от возбудителя белой гнили Sclerotinium sclerotiorum // Международная научная конференция «Микробные биотехнологии». Украина. Одесса. 11-15 сентября 2006. С. 109.

5. Георгиевская Е.Б., Захарченко Н.С., Юхманова A.A.. Школьная JI.A., Бурьянов Я.И. Колонизация ассоциативными метилобактериями повышает устойчивость растений к фитопатогенам // Международная научная конференция «Микробные биотехнологии». Украина. Одесса. 11-15 сентября 2006. С. 46.

6. Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Школьная J1.A., Юхманова A.A.. Гудков А.Т., Волотовский И.Д., Гапеева Т.А., Бурьянов Я.И. Получение и анализ трансгенных растений картофеля, экспрессирующих синтетический ген пептидного антибиотика цекопина PI // Материалы Четвертого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Пущино. 6-7 декабря 2006. С. 80.

7. Захарченко Н.С., Школьная Л.А., Юхманова A.A.. Маслиенко Л.В., Шепиевская Е.Ю., Кашпаров И.А., Бурьянов Я.И., Шевелуха B.C. Белковый фактор Bacillus subtillis K-l-1 - ингибитор роста фитопатогенных грибов и бактерий // Материалы Четвертого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Пущино. 6-7 декабря. 2006. С. 81.

8. Захарченко Н.С., Юхманова A.A.. Бурьянов Я.И. Колонизация растений ассоциативными микроорганизмами стимулирует их морфогенез и повышает устойчивость к фитопатогенам // VI Съезд Общества физиологов растений России. Сыктывкар. 18-24 июня 2007. С. 151 (ч.2).

9. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Юхманова A.A. Трансгенные растения нового поколения и альтернативные экологически безопасные биотехнологии защиты растений // VI Съезд Общества физиологов растений России. Сыктывкар. 18-24 июня. 2007. С. 227 (ч.З).

10. Гапеева Т.А., Захарченко Н.С., Юхманова A.A.. Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Бурьянов Я.И., Волотовский И.Д. Получение трансгенных растений картофеля (Solanum tuberosum L.), экспрессирующих ген антибактериального пептида цекропинаPI //Вести HAH Беларуси. 2008. № 4. С. 57-61.

11. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Юхманова A.A.. Захарченко A.B., Чепурнова М.А., Бурьянов Я.И. Влияние ассоциативных микроорганизмов на

повышение устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды // Всероссийская конференция «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды». 24-28 августа 2009. СИФИБР. Иркутск. С. 170-173.

12. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Юхманова A.A.. Пунтус И.Ф., Кочетков В.В., Бурьянов Я.И. Колонизация растений ассоциативными штаммами микроорганизмов повышает устойчивость растений к фитопатогенам // Международная научная конференция «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Белоруссия. Минск-Раков. 2-4 июня 2008. С. 352.

13. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Лебедева A.A., Фуре О.В., Чепурнова М.А., Захарченко A.B., Карнова Л.С., Лебедева A.A., Бурьянов Я.И. Разработка способов защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов // Всероссийская научно-практическая конференция «Инновационное развитие профессионального образования в условиях университетского комплекса». Бузулук. 23 апреля 2010. С. 1-6.

14. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Лебедева A.A.. Фуре О.В., Захарченко A.B., Чепурнова М.А., Звонарев А.Н., Бурьянов Я.И. Физиологические и экологические эффекты колонизации растений ассоциативными микроорганизмами // Сборник трудов II Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологи». МГОУ. Москва. 5-8 октября 2010. С. 65-66.

15. Лебедева A.A.. Захарченко Н.С., Бурьянов Я.И. Получение и анализ безмаркерных трансгенных растений // Материалы Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. A.M. Горького «Биология будущего: традиции и инновации» Екатеринбург. 25-28 октября 2010. С. 93-94.

16. Захарченко Н.С., Лебедева A.A.. Гапеева Т.А., Бурьянов Я.И., Волотовский И.Д. Специфичность взаимодействия цекропин-содержащих растений рапса с полезными ассоциативными и фитопатогенными микроорганизмами // Международная научная конференция «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», посвященную 35-летию Института микробиологии HAH Беларуси. 31 мая -4 июня 2010. С. 235-237.

17. Лебедева A.A.. Захарченко A.B., Чепурнова М.А., Захарченко Н.С., Бурьянов Я.И. Колонизация растений ассоциативными микроорганизмами in vitro повышает устойчивость растений к биотическим и абиотическим факторам окружающей среды // V Всероссийская конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». Саратов. 28 сентября - 1 октября 2010. С. 60.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лебедева, Анна Александровна, Пущино

61 12-3/850

Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

На правах рукописи

Лебедева Анна Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА УСТОЙЧИВЫХ К ПАТОГЕНАМ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ С ПОВЫШЕННОЙ

БИОБЕЗОПАСНОСТЬЮ

03.01.03 - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Бурьянов Ярослав Иванович

кандидат биологических наук Захарченко Наталья Сергеевна

Пущино - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................5

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................8

1.1. Структура и механизм действия антимикробных пептидов...................8

1.1.1. Классификация антимикробных пептидов......................................9

1.1.2. Механизм действия антимикробных пептидов...............................15

1.1.3. Терапевтическое применение антимикробных пептидов..................19

1.1.4. Некоторые особенности антимикробного пептида цекропина Р1.......20

1.2. Применение генов антимикробных пептидов для создания трансгенных растений......................................................................................23

1.3. Стратегии создания биобезопасных безмаркерных растений...............26

1.3.1. Котрансформация маркерного и целевого генов............................30

1.3.2. Получение безмаркерных растений с использованием транспозонов...35

1.3.3. Применение систем сайт-специфической рекомбинации для эксцизии маркерных генов из генома трансгенных растений.................................37

1.3.4. Методы трансформации без использования селективных

маркеров......................................................................................43

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................45

2.1. Объекты исследования и оборудование..........................................45

2.2. Реактивы, растворы и ферменты...................................................45

2.3. Микробиологические среды........................................................49

2.4. Среда для культивирования растений............................................49

2.5. Бактериальные штаммы и плазмиды..............................................51

2.6. Получение генетических конструкций для трансформации растений.. ..52

2.7. Регенерация побегов рапса....................... ...................................53

2.8. Клональное микроразмножение и регенерация побегов каланхоэ..........54

2.9. Агробактериальная трансформация растений..................................54

2.10. Трансформация растений методом вакуумной агроинфильтрации......55

2.11. Контроль наследования трансгенов.............................................56

2.12. Выделение и очистка плазмидной ДНК........................................57

2.13. Приготовление компетентных клеток А^оЪа^епит Ште/аЫет

и их трансформация.......................................................................57

2.14. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле...............................58

2.15. Электрофорез ДНК в агарозном геле............................................58

2.16. Выделение суммарной растительной ДНК для ПЦР-анализа.............58

2.17. Анализ геномной ДНК трансгенных растений методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)....................................................................59

2.18. Выделение белка из растений....................................................59

2.19. Электрофорез белка в трицин/8Б8 ПААГе....................................59

2.20. Вестерн-блот анализ................................................................60

2.21. Элюция ДНК из агарозного геля.................................................61

2.22. Элюция ДНК из полиакриламидного геля.....................................61

2.23. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр из колоний на чашках..............62

2.24. Получение радиоактивно меченых препаратов ДНК........................62

2.25. Гибридизация на фильтрах по Саузерну.......................................62

2.26. Колонизация трансгенных растений ассоциативными микроорганизмами........................................................................63

2.27. Тестирование растений на стабильность присутствия ассоциативных микроорганизмов после колонизации.................................................63

2.28. Определение уровня экспрессии цекропина Р1 методом ингибирования роста клеток в жидкой среде............................................................64

2.29. Определение антибиотической активности экстрактов трансгенных растений методом радиальной диффузии............................................64

2.30. Биотесты по определению устойчивости трансгенных растений к фитопатогенным микроорганизмам....................................................65

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ....................................66

3.1. Получение генетических конструкций с искусственным геном антимикробного пептида цекропина Р1...............................................66

3.2. Получение трансгенных растений с рекомбинантным вектором рОА482::сесР1 и их молекулярно-генетический анализ............................73

3.2.1. Получение и анализ трансгенных растений рапса и картофеля...........73

3.2.2. Получение и анализ трансгенных растений каланхоэ перистого с геном цекропина Р1.................................................................................79

3.3. Получение трансгенных растений рапса с рекомбинантным вектором рРСУ91::сесР1 с четырехкратным промотором СаМУ 358.......................86

3.4. Получение безмаркерных трансгенных растений

с геном цекропина Р1......................................................................93

3.5. Исследование совместимости цекропин Р1-содержащих растений

с полезными ассоциативными микроорганизмами..................................99

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................102

ВЫВОДЫ..................................................................................107

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................108

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМП - антимикробные пептиды

Ы350 - половинная летальная доза (доза, приводящая к гибели 50%

испытуемых организмов за определенный срок)

кДа - килодальтон

ПААГ - полиакриламидный гель

п.н. - пара нуклеотидов

т.п.н., кЬ - тысяча пар нуклеотидов

ОПбоо - оптическая плотность при длине волны 600 нм

ПЦР - полимеразная цепная реакция

сесР1 - ген цекропина Р1

прШ - ген неомицинфосфотрансферазы II

МС - среда Мурасиге-Скуга

ЬВ - среда Ьина-ВеПаш

8Э8 - додецилсульфат натрия

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ДТТ - дитиотреитол

РМ8Б - фенилметилсульфонилфторид

БФС - бромфеноловый синий

ВМЦК - вирус мозаики цветной капусты

БСА - бычий сывороточный альбумин

ИУК - индолилуксусная кислота

ИМК - (З-индолил-З-масляная кислота

БАП - 6-бензиламинопурин

НУК - нафтилуксусная кислота

Тг - тиракциллин

Кш - канамицин

К^ - гигромицин

СГ - цефотаксим

ВВЕДЕНИЕ

Современные методы генетической инженерии позволяют придавать растениям новые свойства, способствующие повышению устойчивости растений к фитопатогенным микроорганизмам. Устойчивые трансгенные растения повышают качество сельскохозяйственной продукции и одновременно снижают расход пестицидов, улучшая экологическую обстановку. Создавая такие растения необходимо, с одной стороны, обеспечить специфичность действующего начала и избежать развития

и и /П

устойчивости к нему у организмов-мишенеи. С другой стороны, вводимые в растения защитные факторы не должны снижать жизнеспособности и биологической продуктивности растений и тем самым нарушать агротехнические характеристики сортов. Эти задачи, являясь во многом взаимоисключающими, заставляют постоянно расширять спектр исследуемых генов, предназначенных для введения в растения путём трансгенеза. Поэтому создание трансгенных растений, экспрессирующих гены новых антимикробных пептидов, остается актуальной задачей. Цекропин Р1 никогда ранее не применялся для исследования возможности создания трансгенных растений устойчивых к микробным патогенам. В нашей работе впервые был использован искусственный ген, кодирующий зрелую форму цекропина Р1, для трансформации важных сельскохозяйственных культур рапса и картофеля, а также каланхоэ перистого, применяемого в фармакологии.

В развитии биотехнологий создания трансгенных растений остается немало нерешенных проблем. Наиболее серьезной из них является озабоченность широкой общественности проблемой биобезопасности трансгенных растений. Традиционный способ получения трансгенных растений основан на применении конститутивно экспрессируемых селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам или генов-репортеров. Однако после завершения скрининга трансгенных растений

присутствие в их геноме маркерных генов становится бесполезным и даже потенциально опасным. За счет переопыления и горизонтального переноса генетического материала возможно неконтролируемое распространение селективных генов в природных популяциях растений или микроорганизмов. Такая возможность переноса селективных генов в последние годы воспринимается как основная проблема потенциальной биологической опасности генетически модифицированных растений. В связи с этими рисками разработка эффективных подходов к созданию безмаркерных трансгенных растений с повышенной биобезопасностью представляет собой актуальную задачу генетической инженерии.

Целью настоящей работы явилось получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных растений рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, в том числе с повышенной биобезопасностью, экспрессирующих искусственный ген зрелой формы антимикробного пептида цекропина Р1.

Для достижения указанной цели решали следующие задачи:

1. Создание векторных конструкций для переноса искусственного гена зрелой формы антимикробного пептида цекропина Р1 в растения.

2. Получение трансгенных растений рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1.

3. Сравнение уровня экспрессии цекропина Р1 в трансгенных растениях под контролем различных промоторов.

4. Получение биобезопасных трансгенных растений с повышенной устойчивостью к микробным фитопатогенам без применения селективных генов для скрининга трансформантов.

5. Молекулярно-генетический и физиолого-биологический анализ полученных трансгенных растений.

6. Исследование экологической безопасности полученных трансгенных растений.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Структура и механизм действия антимикробных пептидов

Антимикробные пептиды (АМП) являются неотъемлемой частью врожденной иммунной системы всех многоклеточных организмов, включая человека (Ganz et al., 1999). Они обладают широким спектром активности в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, грибов и некоторых вирусов. К АМП относятся пептиды небольшого размера - от 12 до 70 аминокислотных остатков в длину. Для большинства из них характерно наличие не менее 4 остаков Lys и/или Arg, придающих им положительный заряд (Vaara, 2009). Кроме того, на повышение основных свойств этих пептидов оказывает влияние амидирование карбоксильной группы С-концевого остатка (Diamond et al., 2009). Антимикробные пептиды разнообразны по своей первичной структуре. По происхождению и особенностям пространственной организации все известные АМП могут быть разделены на два класса, каждый из которых включает неколько неродственных друг другу семейств.

1) Класс а-спиральных АМП (цекропиноподобные пептиды), не содержащих цистеина, представляет собой линейные пептиды с а-спиральной укладкой цепи. Существенно, что часть петидов этой группы не имеет характерной жесткой структуры в водных растворах, принимая спиральную конформацию только в момент взаимодействия с мембраной. Класс, обозначаемый по наиболее изученному представителю, включает три основных семейства цекропина, дермасептина и плевроцидина (Tamang & Saier, 2006).

2) Класс АМП с преобладанием ß-слоев - пептиды, формирующие в растворе параллельные ß-слои, и содержащие одну или более дисульфидные связи. В этот класс входят три основных семейства, наиболее обширное из которых получило название семейства дефензинов.

Механизм действия обоих классов АМП основан на свойстве этих пептидов нарушать проницаемость мембран, устранять мембранный потенциал и стимулировать формирование ион-зависимых каналов. Характерные для АМП различных типов величины Ы}50 варьируют в диапазоне от 0.1 до 5 мкМ. Классификация АМП внутри каждого семейства основана на сравнении их аминокислотных последовательностей.

1.1.1. Классификация антимикробных пептидов

В настоящее время известно множество АМП из самых разнообразных источников (более 3000 последовательностей). Первые представители классов цекропинов и дефензинов были выделены из гемолимфы насекомых и макрофагов млекопитающих. В дальнейшем пептиды с антимикробным действием были выделены из кожи земноводных, кишечника, семянной жидкости, кожи и легких млекопитающих, а также из тканей растений различной таксономической принадлежности. Как правило, АМП обладают достаточно широким спектром антибактериальной активности. Большинство АМП получаются в результате протеолитического созревания предшественников, зачастую не обладающих бактерицидными свойствами.

В течение многих лет с момента своего открытия АМП обозначали и подразделяли на группы, исходя из таксономической принадлежности организма - источника их происхождения. По мере расширения объема знаний о структуре АМП из самых различных организмов появилась необходимость добиться унификации номенклатуры. Однако построить естественную классификацию антимикробных пептидов, основанную на общности происхождения структур, пока не удается, так как, несмотря на все возрастающее число открываемых пептидов, фактического материала еще недостаточно. Слишком мал список изученных в этом отношении видов живых организмов, чтобы делать обобщения, касающиеся больших систематических групп. Требуется сравнение спектров антимикробных пептидов из разных видов, принадлежащих к разным таксонам, а также

9

изучение специфичности их действия в отношении спектра микробов, контактирующих с данным видом организмов в естественных условиях.

Одной из первых получивших признание классификаций АМП стала классификация Ганса Бомана (Вотап, 1995), основанная на анализе данных о схожести аминокислотных последовательностей, пространственных структур и функциональных особенностей. Большое значение в этой системе придавалось наличию, количеству и аранжировке дисульфидных связей в молекуле пептида. В соответствии с ней выделялось пять структурных классов. Позже были предприняты попытки упростить систему до трех классов, но такое упрощение не отражало всей полноты вновь описываемых структур. К настоящему моменту снова говорят о пяти группах АМП (Вотап, 2000; Лазарев и Говорун, 2010). Предложен подход к созданию всеобъемлющей номенклатуры АМП на основании их последовательностей с учётом физико-химических и биохимических характеристик, прежде всего, характера вторичной и третичной структуры. Этот признак выбран потому, что именно вторичная структура пептидов является наиболее консервативным признаком, нередко сохраняющимся при отсутствии видимого сходства аминокислотных последовательностей (Лазарев и Говорун, 2010).

1) Семейство цекропина (линейные а-спиралъные пептиды, не содержащие цистеина).

Эта группа включает в себя около 300 пептидов длиной не более 40 а.о. Для цекропиноподобных АМП не характерно присутствие в молекуле остатков Суз. В водных растворах эти пептиды чаще всего имеют неупорядоченную структуру, однако в присутствии трифторэтанола, додецилсульфата натрия или липосом вся молекула или ее часть образует си-спираль (Оеппаго & Zanetti, 2000). К данной группе пептидов относятся, в первую очередь, все виды цекропинов. Они распространены у насекомых, причем, встречаются практически у всех представителей этого класса, что

показано прямым выделением этих пептидов из множества источников и анализом последовательностей геномной ДНК (Boman, 1994).

В пределах группы цекропиноподобных АМП наблюдается значительная гомология аминокислотных последовательностей: доля совпадающих остатков составляет в среднем 60-70%. Все цекропиноподобные АМП имеют положительно заряженную N-концевую часть и протяженный гидрофобный участок на С-конце. Оба функциональных центра соединяются друг с другом линкером, обогащенным Gly и Pro. С-концевой а.о. у всех цекропинов насекомых амидирован, что однако, не является характерным для цекропинов из млекопитающих. Обилие консервативных а.о. в первичной структуре цекропинов позволяет вывести их консенсусную последовательность:

-W-K-KKI-E------R—I-G-ША—G-------

L V AV А

Цекропины активны преимущественно против грамотрицательных, поражая лишь незначительную часть грамположительных бактерий. При этом в некоторых случаях их молярная LD50 оказывается ниже, чем у классических антибиотиков, например, тетрациклина (Boman, 1995).

Проведена систематизация современных знаний о последовательностях генов цекропинов из различных организмов, полученных, в том числе, и за счет развития методов геномики. Она свидетельствует о широкой представленности генов, родственных генам цекропинов, в достаточно отдаленных друг от друга отрядах (Tamang & Saier, 2006).

Несомненными структурными и эволюционными родственниками цекропинов являются схожи�