Разработка молекулярно-генетических методов для выявления и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae

Эйдельштейн, Инна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка молекулярно-генетических методов для выявления и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка молекулярно-генетических методов для выявления и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae"

На правах рукописи

Эйдельштейн Инна Александровна

РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА СШАМУОМСЕАЕ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Смоленской государственной медицинской академии НИИ Антимикробной химиотерапии

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН Страчунский Леонид Соломонович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Шмелева Елена Александровна доктор биологических наук, Раковская Ирина Валентиновна

Ведущая организация: Московская медицинская академия имени ИМ. Сеченова

Защита диссертации состоится ифи>Я 2004 г. в "//часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.01 в НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан $ 004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микроорганизмы семейства Chlamydiaceae являются облигатными внутриклеточными паразитами. Различные представители данного семейства вызывают ряд заболеваний человека и животных, известных под общим названием «хламидиозов». Для многих хламидий характерна высокая видоспецифичность, однако некоторые виды Chlamydiaceae имеют широкий круг естественных хозяев, включающий представителей различных классов позвоночных животных. Наиболее распространенные хламидийные инфекции человека, вызываемые Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae (биовар TWAR) носят антропонозный характер. Ряд других видов хламидий является причиной зоонозных заболеваний (A. Herring et al.,1987; D. Jorgensen, 1997). Хламидиозы характеризуются разнообразием клинических симптомов, могут протекать латентно или - сопровождаться тяжелыми поражениями различных органов и систем. Характер и степень выраженности заболевания определяются принадлежностью возбудителя к определенному виду, биовару или серовару, поскольку многие штаммы хламидий проявляют тканеспецифичность, а также особенностями организма хозяина (В. Batteiger et al., 1989; С. Beaty et al., 1991; L Eckert et al., 2000; K. Everett et al., 1999; С Jantos et al., 1997).

C. trachomatis, открытая раньше других хламидий, в настоящее время рассматривается как самый распространенный бактериальный возбудитель заболеваний, передающихся половым путем. По данным ВОЗ, количество инфекций, вызываемых С. trachomatis во всем мире, ежегодно составляет около 90 млн. (С. Richey et al., 1999). При этом почти у 75% женщин и 50% мужчин урогенитальный хламидиоз протекает бессимптомно, что значительно усложняет эпидемиологический надзор за ним (А. Егоров и Ю. Сазыкин, 2000). Помимо инфекций, передающихся половым путем, С. trachomatis вызывает эндемичную трахому - заболевание, особенно широко распространенное в развивающихся странах Азии, Африки, Южной Америки и являющееся одной из наиболее распространенных причин потери зрения (Н. Зайцева, 1976).

С. pneumoniae известна в основном как возбудитель заболеваний респираторного тракта, с которым связывают от 10 до 20% случаев пневмоний и около 5% случаев бронхитов и синуситов (М. Hammerschlag, 2000). Кроме того, многие исследования, проведенные в последнее время, свидетельствуют о вероятной взаимосвязи между хронической инфекцией, вызванной С. pneumoniae, и развитием многих заболеваний, ранее не ассоциированных с инфекционной патологией, например, атеросклероза (R. Ellis, 1997; А. Сумароков и В. Панкратова 1999); бронхиальной астмы (С. Kuo et al., 1995), и некоторых заболеваний центральной нервной системы (В. Balin et al., 1998; С. Yucesan et al., 2001).

Значительно большую группу представляют

<.«.":(•>> i ¡j..- 1 " "" »—■ ■«■! . ^j!

патогенные для животных (А. Казанцев, 1973). Хламидийные инфекции наносят существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства и птицеводства, вызывая гибель. животных, аборты, рождение мертвого или нежизнеспособного приплода (П. Митрофанов, 1997). Некоторые виды возбудителей хламидиозов домашних и сельскохозяйственных- животных, например, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila felis, представляют угрозу спорадических заболеваний, людей, особенно лиц, профессионально занятых в сельском хозяйстве (A. Herring et al., 1987; D. Jorgensen, 1997). Возможные пути передачи и опасность для человека других видов хламидий, вызывающих инфекции животных, до сих пор недостаточно изучены из-за отсутствия эпидемиологических данных.

Несмотря на разнообразие существующих диагностических методов, проблема идентификации представителей семейства Chlamydiaceae остается чрезвычайно актуальной. Культуральный метод, ранее рассматриваемый как «золотой стандарт», представляет собой трудоемкий и длительный процесс, требующий использования нескольких клеточных линий для поддержания роста различных видов, и доступный лишь в немногих лабораториях (С. Kuo and J. Grayston, 1990; S. Thompson and A. Washington, 1983). Серологические методы, вследствие кросс-реактивности основных антигенных детерминант хламидий, а также особенностей формирования иммунного ответа, недостаточно специфичны (R. Gonen et al., 1993; Т. Moss et al., 1993; G. Ozanne and J. Lefebvre, 1992).

В последние годы интенсивно разрабатываются молекулярно-генетические методы обнаружения и типирования хламидий на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Значение этих методов существенно возросло в связи < с накоплением данных о биологическом разнообразии представителей семейства Chlamydiaceae и фундаментальными изменениями их классификации, в основу которой - положены принципы современной геносистематики (К. Everett and A. Andersen, 1997; К. Everett et al., 1999). ПЦР широко используется для выявления отдельных видов хламидий и, прежде всего, С. trachomatis. В то же время, известные в настоящее время универсальные методы типирования хламидий с использованием ПЦР являются недостаточно чувствительными для их прямого обнаружения в клиническом материале или требуют использования трудоемких процедур анализа ПЦР-продуктов (S. Holland et al., 1990; S. Rasmussen et al., 1992); Ни в одном из описанных в настоящее время методов ПЦР для универсального обнаружения Chlamydiaceae не предусмотрена возможность использования внутреннего стандарта, который позволяет выявлять ингибирование реакции.

Таким образом широкий спектр заболеваний, вызываемых представителями семейства Chlamydiaceae, особенности течения хламидиозов человека и животных с часто сходной, но не всегда типичной клинической картиной, а также сложность идентификации хламидий с помощью стандартных

подходов, обуславливают необходимость разработки универсальных методов обнаружения и типирования возбудителей данной группы.

Цель настоящей работы: разработать молекулярно-генетические методы для выявления и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae и оценить эффективность предложенных методов при тестировании контрольных и клинических образцов в сравнении с альтернативными методами ПЦР.

Задачи исследования:

1. Разработать протоколы ПЦР-амплификации фрагментов гена отрА, обеспечивающие возможность обнаружения всех видов семейства Chlamydiaceae в клинических образцах как с использованием электрофоретического анализа продуктов реакции, так и в режиме реального времени.

2. Создать коллекцию штаммов £ coli, несущих клонированные амплификационные фрагменты гена отрА различных видов Chlamydiaceae, для использования в качестве контрольных ПЦР-матриц.

3. Определить нуклеотидные последовательности амплифицируемых фрагментов гена отрА у штаммов Chlamydophilapecorum и Chlamydia suis.

4. Разработать систему дифференциации видов семейства Chlamydiaceae с использованием электрофореза амплификационных фрагментов отрА в присутствии сайт-специфического ДНК-лиганда - бисбензимида-ПЭГ.

5. Разработать методы выявления и дифференциации Chlamydia spp., С. pneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов (С. psittaci, С. felis, С. abortus) на основе ПЦР в режиме реального времени с использованием неспецифического флуоресцентного красителя SYBR Green I и анализа кривых плавления ПЦР-продуктов, а также мультиплексной TaqMan ПЦР со специфическими зондами.

6. Создать гетерогенный внутренний стандарт ПЦР на основе гибридной последовательности ДНК фага Хдля контроля ингибирования ПЦР.

7. Оценить чувствительность и специфичность предложенных способов выявления хламидий при тестировании контрольных и клинических образцов в сравнении с альтернативными методами на основе ПЦР.

Научная новизна и практическая значимость работы Впервые:

. Показана возможность дифференциации видов хламидий путем электрофоретического разделения ПЦР-продуктов в агарозном геле с добавлением сиквенс-слецифического ДНК-лиганда - бисбензимида-ПЭГ. . Исследованы нуклеотидные последовательности амплифицируемых

фрагментов гена отрА у штаммов С. ресотт и С. suis. . Разработан метод дифференциального выявления представителей семейства Chlamydiaceae с применением ПЦР в режиме реального времени и анализа кривых плавления ПЦР-продуктов в присутствии SYBR Green I.

• Разработаны специфические флуоресцентные зонды и предложена система дифференциального выявления патогенных для человека видов хламидий: С. trachomatis, С. pneumonias и возбудителей зоонозных инфекций с помощью мультиплексной TaqMan ПЦР.

• Создана коллекция штаммов E со//, несущих клонированные фрагменты гена отрА различных видов Chlamydiaceae, для использования в качестве системы контроля качества предложенных ПЦР методов.

• Разработанные методы могут быть использованы для определения видовой принадлежности неизвестных штаммов хламидий в медицинских и ветеринарных лабораториях проводящих диагностику хламидийных заболеваний.

- Поданы заявки на изобретение:

1. № 2003113244 от 05.05.2003 Способ дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae.

2. № 2003113132 от 05.05.2003 Способ дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae.

3. № 2003113544 от 08.05.2003 Способ дифференциальной диагностики Chlamydia spp., Chlamydophila pneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на 9 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Берлин, 1999), 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002), межкафедральном заседании СГМА (Смоленск, 2002), XXIII межобластной научно-практической конференции терапевтов Центра и Запада России, а также 14 Европейском конгрессе по клинической микробиологии- и инфекционным заболеваниям (Прага, 2004). Диссертация апробирована 12 апреля 2004 года, в НИИ антимикробной химиотерапии СГМА.

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 4 - в зарубежной печати.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 116 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения полученных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает 225 источника, из них 14 отечественных и 211 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Объект исследования. Штаммы хламидий, использованные в работе приведены в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика контрольных штаммов хламидий.

№ Вид Штамм - Материал Источник*

1 Chlamydia trachomatis L2 Очищенные ЭТ 1

2 Chlamydia muridarum MoPn ДНК 2

3 Chlamydia suis S45 ДНК 2

4 Chlamydophila pneumoniae Kajaani 7 Очищенные ЭТ 1

5 Chlamydophila psittad 6 ВС ДНК 2

6 Chlamydophila abortus B577 ДНК 2

7 Chlamydophila abortus CP 16 Очищенные ЭТ 1

8 Chlamydophila felis FEPN ДНК 2

9 Chlamydophila pecorum LW613 ДНК 2

10 Chlamydophila pecorum 66p130 ДНК 2

11 Chlamydophila pecorum L71 ДНК 2

12 Chlamydophila pecorum 1710S ДНК 2

13 Chlamydophila caviae GPIC ДНК 4

14 Chlamydophila spp. KC-93 Очищенные ЭТ 3

15 Chlamydophila spp. 250 Очищенные ЭТ 3

16 Chlamydophila spp. Ростиново-70 Очищенные ЭТ 3

17 Chlamydophila spp. ПП-87 Очищенные ЭТ 3

* Штаммы предоставлены: 1 - P. Saikku (National Public Health Institute, Финляндия); 2 -A. E. Гущиным (ЦНИИ эпидемиологии, Москва, Россия); 3 - А. Р. Садриевым (Казанский НИИ ветеринарии, Казань, Россия); 4 - В. В. Демкиным (Институт молекулярной генетики РАН, Москва, Россия).

На этапе оптимизации ПЦР в качестве модельной матрицы использовались образцы моноцитов крови, содержащие «200 нг ДНК человека, с добавлением ЭТ С. trachomatis или С. pneumoniae в титре 3 -1 0000 ЭТ/мкл. Специфичность ПЦР с выбранными праймерами оценивали на образцах ДНК следующих видов микроорганизмов: Candida parapsilosis, Candida albicans, Enterococcus faecalis, Escherichia со//, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Gardnerella vaginalis, Micrococcus luteus, Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Serratia marcescens, Salmonella typhimunum, Proteus vulgahs. Урогенитальные образцы (n=219), полученные от пациентов с воспалительными заболеваниями органов женской репродуктивной системы, использовали для сравнения чувствительности и специфичности обнаружения С. trachomatis с помощью предложенных в настоящей работе методов и коммерческой ПЦР-диагностической системы «АмплиСенс С. trachomatis» (ЦНИИ

эпидемиологии МЗ РФ). Диагностические параметры методов ПЦР в режиме реального времени определяли также путем слепого анализа контрольных образцов с заданным содержанием ДНК С. trachomatis (0, 14, 178 и 2280 геномэквивалентов), предоставленных в рамках международной программы контроля качества ПЦР-диагностики «Quality Control for Molecular Diagnostics, 2003» (QCMD, Великобритания).

Выделение ДНК из клинических образцов. Для сравнения эффективности выделения ДНК использовали: 1) метод быстрой очистки ДНК с помощью Chelex-100, 2) лизис в буфере, содержащем неионные детергенты и протеиназу К, 3) ДНК-сорбционный метод (коммерческий набор ДНК-сорбБ, ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ).

ПЦР-амплификация. Амплификацию фрагмента гена отрА проводили с использованием семейственно специфичных праймеров СМ1 (5- CAG GAC АТС TTG ТСТ GGC ТТ-31) и СМ2 (51- САА GGA TCG САА GGA ТСТ СС -3 ) (Н. Yoshida et al, 1998). Продукты ПЦР анализировали путем электрофоретического разделения в 3,5% агарозном геле с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия (2 мкг/мл). При оптимизации ПЦР подбирали концентрации компонентов реакционной смеси и температурный режим амплификации, обеспечивающие максимальную чувствительность и специфичность обнаружения ДНК хламидий.

Клонирование и определение нуклеотидных последовательностей 5'-концевых фрагментов отрА. Для получения панели контрольных штаммов амплификационные фрагменты отрА 12 хламидийных штаммов: С. trachomatis L2, С. muridarum МоРп, С. suis S45, С. pneumoniae Kajaani 7, С. psittaci 6BC, С. abortus B577, С. felis FEPN, C.pecorum LW613, 66p130, L71, 171 OS и С. cavia GPIC клонировали в составе вектора pGEM-T в реципиентный штамм Ecoli ТОРЮ. Клонированные фрагменты ДНК пяти хламидийных штаммов: С. suis S45, C.pecorum LW613, 66р130, L71 и 171 OS секвенировали с использованием 0,5 -0,7 мкг каждой плазмиды в качестве матрицы, праймеров M13F-20 и M13R (5-GTA ААА CGA CGG CCA G-3' и 5-CAG GAA АСА GCT ATG АС-3"), наборов CEQ DTCS и автоматического флуоресцентного секвенатора CEQ-2000 (Beckman Coulter, США) в лаборатории Евроген (Москва, Россия).

Получение гетерогенного внутреннего стандарта ПЦР. Для создания гетерогенного внутреннего стандарта (ВС) ПЦР использовали фрагмент ДНК фага X с заданной длиной (301 пн), G/C-насыщенностью (50,4%) и отсутствием прямых или инвертированных повторяющихся последовательностей. Выбранный сегмент фланкировали сайтами связывания праймеров СМ1 и СМ2 путем ПЦР-амплификации ДНК с помощью гибридных праймеров, содержащих З'-концевые - специфические последовательности и участки, гомологичные СМ1 и СМ2 на 5' концах XHYB1 (5 - CAG GAT АТС TTG ТСТ GGC ТТА TCG GGA TGA ТТА CGG

ТСС-31) и (51- САА GGA TCG САА GGA TCT CCG CAT GGA ТТС TGT CGA

СС-3'). Результирующий ПЦР-фрагмент (341 пн) клонировали в составе вектора pCR2.1 в реципиентный штамм Е.со//ТОРЮ. Для подтверждения клонирования заданного фрагмента проводили выделение и рестрикционный анализ полученной плазмиды (plS3.2) с помощью эндонуклеаз Avail и Pvull. Оптимальную концентрацию plS3.2, используемой в качестве ВС ПЦР, подбирали путем тестирования последовательных разведений плазмиды в реакциях с минимальным детектируемым количеством ДНК хламидий.

ЭлектроФоретическое разделение ПЦР-продуктов в ПРИСУТСТВИИ бисбензимида-ПЭГ. Для дифференциации различных видов хламидий использовали электрофоретическое разделение специфических продуктов амплификации в присутствии сайт-специфического ДНК лиганда - бисбензимида-ПЭГ (Би-ПЭГ; HAYellow, Hanse Analytic, Германия). Лиганд добавляли в предварительно расплавленный и охлажденный до 50°С агарозный гель (3,5% в 0,5х ТВЕ буфере) до конечной концентрации 1 ед/мл.

ПЦР в режиме реального времени. ПЦР в режиме реального времени проводили на системе Rotor-Gene 2000 (Corbett Research, Австралия) с использованием двух подходов. В первом случае накопление продуктов амплификации отрА в последовательных циклах ПЦР наблюдали по нарастанию флуоресценции SYBR Green I, а разделение патогенных для человека видов: С. trachomatis, С. pneumoniae и возбудителей зоонозов, осуществляли на основании анализа кривых плавления продуктов ПЦР.

Во втором варианте использовали мультиплексную TaqMan ПЦР с четырьмя разработанными зондами, содержащими различные флуоресцентные метки на 5' конце и гасители флуоресценции BHQ-типа на 3' конце: IS 146 - 6FAM-5-CGG AAC GAT GCC ATT CTG CTT AT-3 -BHQ-1, CTR - JOE-5 -ATC CTG CTG AAC CAA GCC TTA TGA T-3 -BHQ-1, CPN - ROX-5 -ACC CTT CTG АТС САА GCT TAT TAA TTG AT-3 -BHQ-2 и CPS - Cy5-5'-CCA GCT GAA CCA AGT TTA TTA АТС GAT G-3'-BHQ-3, для селективного детектирования ВС, амплификационных фрагментов отрА Chlamydia spp., С. pneumoniae и возбудителей зоонозных инфекций (С. psittaci, С. felis, С. abortus), соответственно.

В процессе оптимизации различных вариантов ПЦР подбирали температурный режим, число и продолжительность циклов амплификации, соотношение зондов и праймеров, концентрацию обеспечивающие

максимальную чувствительность и специфичность обнаружения ДНК хламидий в присутствии ВС и избытка ДНК человека (200 нг).

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей. Выравнивание и анализ гомологии нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программы ClustalX в. 1.64b (EMBL). Выбор и анализ

олигонуклеотидных зондов и праймеров, а также дизайн ВС ПЦР проводили с помощью программ Gene Runner в 3 05 (Hastings Software, США) и MeltCalc в 99 (Е Schutz & N Von Ahsen, Германия) Проверку на наличие в различных нуклеотидных последовательностях сайтов неспецифической гомологии для выбранных праймеров и зондов проводили с использованием поисковой системы BLAST (httpV/www ncbi nlm nih gov/blast/, NCBI, США)

Результаты и обсуждение nUP-амплиФикация и анализ фрагмента последовательности отоА различных видов хламидий. ПЦР с использованием выбранных праймеров позволила амплифицировать ДНК-фрагменты с ожидаемой молекулярной массой (245-249 пн) у всех контрольных штаммов хламидий (Рис 1) Представители родов Chlamydia и Chlamydophila могут быть дифференцированы с помощью электрофоретического разделения амплификационных фрагментов отрА в обычном агарозном геле, благодаря различиям в их молекулярной массе

М 1234 56789 ЮМ

Рис. 1. Электрофоретическое разделение ПЦР-фрагментов отрА

М-маркер молекулярной массы (pUC 18-Hae III), 1 -С trachomabs L2. 2-С mundarum МоРп, 3 - С suis S45, 4 - С рпеитотав Kajaani 7, 5 - С psittaa 6BC; 6 - С abortus B577, 7 - С felis FEPN, 8 - С pecorum LW613,9 - С cavia GPIC, 10 - отрицательный контроль

В результате тщательной оптимизации состава ПЦР-смеси и протокола амплификации выбраны условия, обеспечивающие воспроизводимое, специфическое детектирование 2-5 копий ДНК любого из 9 видов хламидий в присутствии избытка ДНК человека (200 нг) и 600 копий плазмиды plS32, используемой в качестве внутреннего стандарта (Рис. 2)

До проведения данного исследования полные нуклеотидные последовательности амплифицируемого участка отрА были получены для всех видов хламидий, за исключением С ресогит и С suis В связи с этим, нами исследованы последовательности клонированных фрагментов отрА у штаммов С ресогит LW613,66р130, L71,1710S и С suis S45

М1234567М М 1 234 56789M

Рис. 2. Чувствительность обнаружения ВС и ДНК С. рпеитотав с помощью электрофоретического анализа продуктов ПЦР

А: Титрование plS3 2 в ПЦР с фиксированным количеством ДНК С рпеитотае (13 геном-эквивалентов). Дорожка М - маркер молекулярной массы (pUC 18-Нае III); 1 - 6x105 копий ВС; 2-6x104копий ВС; 3-6000копий ВС; 4-600копий ВС; 5-60копий ВС; 6-6копий ВС; 7 - 600 копий ВС без хламидийной ДНК

Б: Чувствительность детектирования ДНК С рпеитотае в присутствии фиксированного количества ВС (600 копий) и ДНК человека (200 нг). Дорожка 1 - ДНК человека; 2 - 46875,

3 - 9375; 4 -1875, 5 - 375,6 - 75; 7 -15,8 - 3; 9 - 0 геном-эквивалентов

Согласно проведенному нами анализу, различия в последовательностях исследуемого фрагмента составляют от 24,6 до 30% между видами Chlamydia и Chlamydophila. При этом, различия между видами внутри рода Chlamydia не превышают 6,1%. Установленная нами нуклеотидная последовательность С. suis S45 полностью совпадает с короткими (127-157 пн) З'-концевыми последовательностями анализируемого участка у штаммов S45, Н5, R19, рт220, PCLH296, pmd1340, pmsh47 и рт197 (GenBank № AF269274, AF269275, AF269270, AJ005616, AJ004880, AJ004879, AJ004878, AJ004877), описанными ранее. Межвидовые различия в пределах рода Chlamydophila выражены в большей степени - до 20,6% между С. cavia и С. ресогит. Следует однако отметить, что все штаммы C.psittaci и С. abortus проявляют 100% идентичность по нуклеотидной последовательности 5'-концевого фрагмента отрА, вследствие чего не могут быть дифференцированы на основании анализа исследуемого участка генома. Два других вида - С. fete и С. cavia, ранее входивших в группу Chlamydia psittaci, проявляют, соответственно, 97,6 и 98% гомологии со штаммами, относящимися к C.psittaci согласно новой классификации. C.pneumoniae отличается от видов данной группы приблизительно на 15,5%, а штаммы С. ресогит формируют наиболее генетически удаленную группу, в среднем отличаясь по последовательности фрагмента отрА от С. рпеитотае и 4 видов, выделенных из С. psittaci, соответственно на 17,5 и 19,7%. Различия между

4 исследованными штаммами C.psittaci составили 0,4-1,6%. При этом установлено полное совпадение коротких (131 пн) З'-концевых фрагментов

последовательности описанных ранее (GenBank № AF269280, AF269279) и полученных нами для штаммов L71 и 171OS. Два других штамма: 66р130 и LW613, последовательности которых были исследованы впервые, отличаются делецией одного нуклеотида и наиболее близки по структуре З'-концевого фрагмента изоляту Р787 (GenBank № Z18756). В целом, результаты филогенетического анализа, проведенного на основании сравнения последовательностей 5'-концевого участка отрА, хорошо коррелируют с данными К. Everett и соавт. (1999) по сравнению последовательностей генов 16S рРНК, положенными в основу современной систематики хламидий. Выбранный фрагмент генома отличается высокой внутривидовой консервативностью (98,3-100% гомологии для каждого вида). В то же время, выраженные различия в его структуре между видами позволяют рассматривать его в качестве перспективной мишени для детектирования и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae.

Дифференциация представителей семейства Chlamvdiaceae путем электрофоретического разделения в геле с добавлением Би-ПЭГ. Гельэлектрофорез в присутствии сайт-специфических ДНК-лигандов является простым и, в то же время, эффективным методом разделения ДНК фрагментов, обладающих одинаковой молекулярной массой, но отличающихся по нуклеотидной последовательности (С. Wawer et al., 1995). Известно, что бисбензимид, связанный с высокомолекулярным полиэтиленгликолем, при добавлении в агарозный гель позволяет эффективно разделять ПЦР-фрагменты, даже незначительно отличающиеся по числу и структуре участков связывания данного лиганда - тетра-АЛ" сайтов (М. Muller et al., 1997).

Предварительный анализ последовательностей отрА показал относительно высокую консервативность структуры сайтов связывания Би-ПЭГ в амплифицируемых последовательностях каждого вида хламидий. Вместе с тем, различия в числе и характере А/Т-повторов между видами позволили нам разработать метод их дифференциации с помощью электрофореза ПЦР-фрагментов отрА в геле с Би-ПЭГ. На рисунке 3 представлены результаты электрофоретического разделения амплификационных фрагментов отрА различных видов хламидий в стандартном агарозном геле, а также в геле содержащем ДНК-лиганд. Незначительные различия в молекулярной массе ПЦР-фрагментов не позволяют дифференцировать отдельные виды в пределах рода Chlamydia и рода Chlamydophila при разделении в агарозном геле (Рис. ЗА, ЗВ). В то же время, добавление в гель Би-ПЭГ приводит к четкой дифференциации по подвижности амплификационных фрагментов, полученных от разных видов, за счет различий в их нуклеотидной последовательности и эффективности связывания с лигандом. Электрофоретическая подвижность фрагментов отрА возрастает для рода Chlamydia в следующем порядке: С. frachomatis (D-K) < С. trachomatis L2 < С. muridarum = С. suis (Рис. ЗБ), а для рода Chlamydophila:

С. ресогит < С. pneumoniae < С. felis < С. psittaci - С. abortus < С. caviae (Рис. ЗГ). ВС обладает наименьшей подвижностью. Результаты многократного повторного тестирования свидетельствуют о высокой воспроизводимости разделения амплификационных фрагментов отрА в геле, содержащем Би-ПЭГ.

Рис. 3. Разделение ПЦР-фрагментов отрА представителей семейства Chlamydiaceae в обычном геле (А, В) и в геле с добавлением Би-ПЭГ (Б, Г)

А и Б: Дорожка М-маркер молекулярной массы (pUC 18-Hae III); 1 -C.trachomatisE; 2 - С. trachomatis L2; 3 - С. muridarvm MoPn; 4 - С. suis S45; ВС - внутренний стандарт

В и Г: 1 - С. ресогит LW613; 2 - С. pneumoniae Kajaani 7; 3 - С. felis FEPN; 4 - С. psittaci6BC; 5 - С. abortus B577; 6 - С. caviae GPIC

Полученные результаты хорошо согласуются с данными анализа числа и структуры тетра-АЯ повторов в амплифицируемых последовательностях и подтверждают теоретические положения о механизмах связывания Би-ПЭГ с ДНК (М. MQIIer et al., 1997). Метод Би-ПЭГ электрофореза был использован нами для типирования штаммов КС-93, 250, Ростиново-70, ПП-87, выделенных из паренхиматозных органов абортированного плода или плаценты различных животных: собаки, песца, коровы и овцы, и предоставленных Казанским НИИ

ветеринарии. Фрагменты ДНК, полученные в результате амплификации этих изолятов, а также контрольных штаммов С. psittad и С. abortus с помощью праймеров СМ1-СМ2, обладали одинаковой электрофоретической подвижностью в геле с Би-ПЭГ (Рис. 4). Согласно новой классификации к виду С. psittad принадлежат только штаммы, вызывающие заболевания птиц Таким образом, исследованные нами изоляты были отнесены к С. abortus.

Рис. 4. Типирование штаммов С ресогит, С. abortus и неизвестных хламидийных изолятов из коллекции Казанского НИИ ветеринарии с помощью Би-ПЭГ электрофореза П ЦР-фрагментов отрА

Дорожка М-маркер (pUC 18-Нае III), 1 -С ресогит LW613, 2-С ресогит 66р130, 3 - С ресогит L71; 4 - С ресогит 171 OS. 5 - С abortus B577, 6 - Ростиново-70, 7 - ПП -87, 8 • КС-93,9 • 250, ВС - внутренний стандарт

Предложенный подход позволяет дифференцировать все виды Chlamydiaceae, за исключением С. mundarum и С. suis, а также С. psittad и С. abortus, которые, однако, вызывают заболевания у разных животных. Обладая высокой воспроизводимостью, он является значительно менее длительным, трудоемким и дорогостоящим по сравнению с методами рестрикционного анализа ПЦР-продуктов и не требует применения сложного оборудования и дорогостоящих реактивов.

Выявление и типирование представителей семейства Chlamvdiaceae с помощью ПЦР в режиме реального времени и анализа кривых плавления с SYBR Green I. Параллельно с разработкой метода электрофоретического анализа амплификационных фрагментов отрА нами была исследована возможность выявления и типирования представителей семейства Chlamydiaceae с помощью методов ПЦР в режиме реального времени Введение в состав ПЦР-смеси интеркалирующего флуоресцентного красителя - SYBR Green I и модификация температурного режима реакции позволили разработать протокол одновременной амплификации и анализа продуктов ПЦР в формате закрытой пробирки

Чувствительность и специфичность окончательного варианта

М123456789 ВС

амплификации с SYBR Green I были идентичны таковым для стандартного метода ПЦР с электрофоретическим детектированием продуктов. Наличие неспецифических продуктов амплификации ДНК человека и неродственных микроорганизмов не было обнаружено. Сравнение значений пороговых циклов (Ct) свидетельствует об одинаковой эффективности амплификации клонированных фрагментов отрА всех 9 видов хламидий с помощью праймеров СМ1 и СМ2 при равной стартовой концентрации плазмид. На рисунке 5 представлены нормализованные кривые изменения флуоресценции SYBR Green I в последовательных циклах ПЦР.

Рис. 5. ПЦР-амплификация фрагментов гена отрА различных видов Chlamydiaceae и ВС в режиме реального времени с SYBR Green I

Постамплификационный анализ кривых плавления ПЦР-фрагментов отрА позволяет проводить их дифференциацию за счет различий в температурах плавления ВС и различных видов Chlamydiaceae (88'С против 82,6-86,1'С). При этом кривые плавления хламидийных ампликонов характеризуются наличием двух пиков, отражающих двухэтапную диссоциацию цепей ДНК в участках с разной А/Т-насыщенностъю, а их принадлежность к определенной группе может быть установлена путем сравнения пиков плавления: 84,1°С и 86,1°С - для С. trachomatis, С. suis, С. muridarunr, 82,6°С и 85,1°С - для С. pneumonias, С. ресошпг, 84,4°С И 85,5°С (неразделенные или частично разделенные пики) -С. psittaci, С. abortus, С. felis и С. caviae (Рис. 6).

Анализ кривых плавления амплификационных фрагментов отрА не является способом видовой идентификации хламидий, поскольку некоторые виды характеризуются сходными или неразличимыми профилями плавления. К их числу относятся виды Chlamydia (Рис. 6Б), С. pneumoniae и С. ресогит (Рис. 6В), а также виды, ранее входившие в группу Chlamydia psittaci (Рис. 6Г). Тем не менее,

данный подход позволяет дифференцировать основные группы патогенных для человека хламидий: 1) С. trachomatis, 2) С. рпвитотав и 3) возбудителей зоонозных инфекций (С. psittaci, С. abortus, С. felis).

Рис. 6. Анализ кривых плавления Продуктов ПЦР с SYBR Green I

А: Основные патогенные для человека виды; Б: Chlamydia spp.. В: С рпеитотав и С. ресотт; Г: с группа С. psittaa»; CTR - С trachomabs; CMU - С mundarvm; CSU - С suis; CPN - С рпеитотае; CPS - С psittacr, CAB - С abortus; CFE - С. felis; CPE - С. ресогит; ВС - внутренний стандарт

Метод ПЦР в режиме реального времени с SYBR Green I обладает достаточной чувствительностью и специфичностью для прямого обнаружения различных видов хламидий в образцах клинического материала, полученного от человека и животных. Благодаря детектированию в формате закрытых пробирок и отсутствию необходимости постамплификационных манипуляций с продуктами ПЦР, этот подход позволяет существенно сократить продолжительность и трудоемкость исследований, практически исключает риск появления ложноположительных результатов вследствие контаминации продуктами ПЦР.

Идентификация Chlamvdia SPP.. Chtamvdophila pneumonlae и возбудителей зоонозных хламидиозов с помощью мультиплексной ТаgМаn ПЦР, С целью дифференциального обнаружения представителей семейства Chlamydiaceae, включая все патогенные для человека виды, разработан альтернативный метод ПЦР в режиме реального времени на основе технологии мультиплексной TaqMan ПЦР (5'-экзонуклеазный метод). Предложенный подход

предполагает возможность универсальной амплификации фрагмента гена отрА, фланкированного участками связывания праймеров СМ1-СМ2, и селективного выявления в одной пробирке Chlamydia spp., С. pneumoniae, возбудителей зоонозных инфекций (С. psittaci, С. abortus, С. felis) и ВС с помощью зондов, содержащих различные флуоресцентные метки. Анализ большого числа известных к началу исследования нуклеотидных последовательностей отрА позволил выбрать участки связывания зондов в районе первого консервативного домена отрА, обладающие 100% идентичностью и, одновременно, специфичностью для каждой группы выявляемых видов (Таб. 2).

Таблица 2. Характеристика разработанных зондов

Мишень Зонд ^J^vnt Число Идентичность,

HM послед-тей* %

ВС 5' 6-FAM-d(N)23-BHQ-1 3' 470/510

Chlamydia spp.: С. trachomatis С. muridarum 5' JOE-d(N)25-BHQ-1 3' 530/555 83 63 5 100 100 100

С. suis 15 100

С. pneumoniae 5' ROX-d(N)29-BHQ-2 3' 585/610 8 100

Зоонозная группа: С. psittaci С. abortus 5' Cy5-d(N)2rBHQ-3 3' 625/660 38 21 14 100 100 100

С. felis 3 100

* Число последовательностей отрА, найденных в BLAST.

Выбранные зонды удовлетворяют следующим основным требованиям: 1)не проявляют случайную гомологию с неродственными нуклеотидными последовательностями; 2) не превышают по длине 29 нуклеотидов, что обеспечивает эффективное гашение флуорофоров в интактных зондах; 3) характеризуются G/C-насыщенностью от 35 до 48% и расчетной температурой плавления (Тт) на 7-8°С выше Тт праймеров; 4) отличаются высоким содержанием С и отсутствием 5'-концевых G-нуклеотидов, что способствует эффективному разгоранию флуорофоров при 5'-экзонуклеазном расщеплении зондов; 5) обладают меньшей тугоплавкостью на З'-конце; 6) не содержат поли-G/C повторов и участков, формирующих нежелательные вторичные структуры или допускающих комплементарное связывание зондов друг с другом и с праймерами, что позволяет использовать их в мультиплексной ПЦР.

Результаты амплификации ДНК 9 видов хламидий (в виде очищенных ЭТ или плазмид, несущих клонированные фрагменты отрА, в концентрации млн. копий/ПЦР) в присутствии ВС (600 копий) и ДНК человека (200 нг) свидетельствуют об отсутствии перекрестного выявления Chlamydia spp.,

С.рпеитоПае и возбудителей зоонозных хламидиозов с помощью соответствующих зондов (Рис. 8).

Рис. 8. Дифференциальное обнаружение различных видов хламидий с помощью мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

Дифференциальное обнаружение этих видов оказывается возможным благодаря различиям в 2-7 нуклеотидных позициях в участках связывания зондов

и отсутствию спектрального перекрывания флуоресцентных сигналов с используемыми светофильтрами. Неспецифическое взаимодействие зондов с ДНК неродственных микроорганизмов не установлено.

Аналитическая чувствительность TaqMan ПЦР исследована путем тестирования серии последовательных разведений плазмид, несущих клонированные фрагменты отрА С. trachomatis (pGEM-T-CTR), С. pneumoniae (pGEM-T-CPN) и С. psittaci (pGEM-T-CPS). Зависимость значений Ct от логарифма начального числа копий плазмид была линейной в диапазоне от 7 до 7 млн. копий pGEM-T-CTR и pGEM-T-CPS и от 70 до 7 млн. копий pGEM-T-CPN (Рис. 9). Предел детектирования составил 1-2 копии для всех плазмид.

hem f*icn

4ö *ts 5 5s 5 5 55 *s с ус*

Рис. 9. Определение числа копий отрА С. trachomatis с помощью TaqMan ПЦР

Таким образом, метод TaqMan ПЦР может быть использован для количественного или полуколичественного определения хламидийной ДНК в анализируемых образцах. Дополнительным преимуществом TaqMan ПЦР по сравнению с другими предложенными нами методами является большая точность и воспроизводимость детектирования низких концентраций ДНК хламидий.

Анализ чувствительности и специфичности разработанных методов ПРИ исследовании клинических образцов. Эффективность выявления С. trachomatis с помощью разработанных методов по сравнению с коммерческой ПЦР-диагностической системой «АмплиСенс С. trachomatis* (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ) была оценена путем параллельного тестирования 219 образцов клинического материала. Применение внутреннего стандарта позволило

выявить ингибирование амплификации в 2 образцах при исследовании в формате TaqMan ПЦР и 6 образцах при исследовании с помощью ПЦР в режиме реального времени с SYBR Green I и ПЦР с последующим электрофоретическим детектированием продуктов (Таб. 3). В связи с невозможностью оценки наличия хламидийной ДНК в этих образцах результаты их тестирования не учитывались при расчете показателей чувствительности и специфичности разработанных методов. Для оставшихся образцов совпадение результатов тестирования с помощью коммерческой тест-системы и TaqMan ПЦР было отмечено в 215 (99,1%) из 217 случаев; коммерческой тест-системы и ПЦР с SYBR Green I в 207 (97,2%) из 213 случаев. При использовании коммерческого метода в качестве референтного диагностическая чувствительность TaqMan ПЦР и ПЦР с SYBR Green I составила 97,8% и 84,4%, соответственно. В шести положительных образцах, не выявленных с помощью ПЦР с SYBR Green I или электрофоретического детектирования исходная концентрация ДНК-мишени по данным TaqMan ПЦР не превышала 100 копий/мл. Таким образом, более высокая стабильность детектирования низких концентраций хламидийной ДНК в формате TaqMan ПЦР по сравнению с другими разработанными методами подтверждается результатами исследования клинических образцов.

Таблица 3. Сравнение результатов тестирования урогенитальных образцов с помощью тест-системы «АмплиСенс С. trachomatis» и разработанных методов ПЦР

Количество образцов*

АмплиСенс С. trachomatis TaqMan ПЦР «♦» «-» «ИНГ.» ПЦР с Sybr Green I и ПЦР-электрофорез «+» «-» «ИНГ.»

«+» п=46 «-» п=173 44 1 1 1 171 1 38 7 1 1 167 5

Относительная чувствительность:** специфичность:** 97,8% 99,4% 84,4% 99,4%

* (+) - положительные, с-» - отрицательные, синг.» - ингибированные образцы ** исключая ингибированные образцы

Учитывая, что копийность критической плазмиды С. trachomatis, которая является мишенью для АмплиСенс и ряда других коммерческих тест-систем, в 7-10 раз превосходит копийность отрА, теоретическая чувствительность методов, основанных на выявлении плазмидных локусов, может быть почти на порядок выше по сравнению с методами обнаружения однокопийных хромосомных генов. Тем не менее, разработанный нами вариант TaqMan ПЦР с праймерами к отрА незначительно уступал в диагностической чувствительности системе АмплиСенс. Интересно отметить, что один из образцов, охарактеризованный как отрицательный по данным тестирования с помощью «АмплиСенс- С. trachomatis*, показал

положительный результат амплификации фрагмента отрА во всех предложенных нами вариантах ПЦР. Одним из возможных объяснений данного факта может быть ранее описанное у отдельных штаммов С. trachomatis отсутствие плазмиды. С учетом этого случая, относительная диагностическая чувствительность разработанных методов составила 99,4%.

Разработанные методы ПЦР в режиме реального времени использованы также для слепого анализа контрольных образцов, предоставленных в рамках международной программы контроля качества ПЦР-диагностики «Quality Control for Molecular Diagnostics, 2003» (QCMD, Великобритания). Результаты двукратного тестирования 10 контрольных образцов с заданным содержанием ДНК С. trachomatis с помощью разработанных методов представлены в таблице 4. Положительные результаты амплификации ВС и/или хламидийной ДНК свидетельствовали об отсутствии ингибирования во всех реакциях. Правильные результаты оценки наличия или отсутствия С. trachomatis получены нами для 9 образцов. Один образец, содержащий 14 копий ДНК-мишени («2 копии на реакцию) был расценен нами как «вероятно отрицательный», поскольку не обнаружил амплификации отрА при двукратном тестировании с помощью ПЦР с SYBR Green I, а также в одной из двух реакций TaqMan ПЦР. Для двух других образцов с таким же содержанием хламидийной ДНК положительные результаты были получены не менее чем в одном из двух тестов с использованием каждого метода, а для образцов с более высоким содержанием ДНК-мишени - во всех повторах. Таким образом, полученные при анализе контрольных образцов результаты хорошо согласуются с данными об аналитической чувствительности разработанных методов.

Таблица 4. Сравнение результатов тестирования контрольных образцов с помощью разработанных методов ПЦР в режиме реального времени и коммерческих систем

Образец Материал Ожидаемое число копий ДНК в образце Результаты тести рое (амплификац парных аний ия отрА) % правильных результатов при тестировании с помощью коммерческих систем*

TaqMan SYBR Green Интерпретация Roche Ampficor (n=72) Abbott LCx (n=13) BD Probe TEC (n=11)

СТ03-1 ТЕ буфер 14 + - — «-» 81 85 27

СТОЗ-2 ТЕ буфер 2280 + + + + 97 100 100

СТОЗ-З ТЕ буфер 14 + + + - 81 92 45

СТОЗ-4 ТЕ буфер 0 — — 97 100 91

СТОЗ-5 ТЕ буфер 178 ++ + + 96 100 82

СТОЗ-6 моча 178 ++ + + €+1 100 100 73

СТОЗ-7 моча 14 + ♦ +- 81 62 27

СТОЗ-8 моча 0 — — 99 100 100

СТОЗ-9 моча 2280 + + + + 97 100 100

СТ03-10 моча 14 + — +— «+1 64 62 27

* Суммарные данные из отчета QCMD по тестированию контрольных образцов с помощью коммерческих систем в различных лабораториях (общее число тестов указано в скобках).

Сопоставление полученных нами результатов с данными из отчета QCMD по анализу идентичных контрольных образцов в других лабораториях, использующих наиболее известные коммерческие системы обнаружения С. trachomatis на основе ДНК-амплификационных методов, также свидетельствует о высокой чувствительности и специфичности разработанных методов ПЦР в режиме реального времени (Таб. 4).

ВЫВОДЫ

1. Разработанные методы ПЦР с использованием семейственно-специфических праймеров к 5-концевому участку гена отрА обеспечивают чувствительное и специфическое детектирование всех 9 видов семейства Chlamydiaceae, что позволяет рассматривать их как перспективные подходы для диагностики хламидийных инфекций человека и животных.

2. Анализ нуклеотидных последовательностей амплифицируемого фрагмента отрА, включая впервые описанные в данной работе последовательности штаммов С. suis и С. ресогит, свидетельствует об их высокой внутривидовой консервативности (98,3-100% гомологии для каждого вида). В то же время, выраженные различия в структуре данного участка генома у разных видов обеспечивают возможность их дифференциации в соответствии с современной системой классификации хламидий.

3. Созданная панель штаммов E соН, несущих клонированные фрагменты отрА и гетерогенный внутренний стандарт, может быть использована для контроля качества ПЦР-диагностики и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae.

4. Благодаря различиям в структуре сайтов связывания бисбензимида в ПЦР-фрагментах отрА различных видов хламидий, электрофорез в агарозном геле с добавлением бисбензимида-ПЭГ может быть использован для определения видовой принадлежности неизвестных штаммов хламидий.

5. Разработанные методы выявления и дифференциации Chlamydia spp., С. pneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов (С. psittaci, С. abortus и С. felis) на основе ПЦР в режиме реального времени с использованием SYBR Green I и анализа кривых плавления ПЦР-продуктов, а также мультиплексной TaqMan ПЦР со специфическими зондами отличаются высокой чувствительностью, специфичностью и производительностью по сравнению с ранее предложенными методами универсального обнаружения представителей семейства Chlamydiaceae на основе ПЦР.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Метод электрофоретического разделения амплификационных фрагментов отрА в агарозном геле с добавлением сайт-специфического ДНК-лиганда -бисбензимида-ПЭГ может быть рекомендован в качестве простого и экономически эффективного метода определения видовой принадлежности как культивированных, так и выделенных из клинического материала штаммов хламидий.

2. Использование рекомбинантных штаммов E.coli, несущих клонированные фрагменты отрА девяти видов Cblamydiaceae и гетерогенный внутренний стандарт, рекомендуется для контроля качества выявления и дифференциации хламидий с помощью ПЦР с семейственно-специфическими праймерами СМ1 и СМ2.

3. Предложенные методы идентификации Chlamydia spp., С. pneumonias и возбудителей зоонозных хламидиозов (С. psittaci, С. abortus и С. felis) на основе ПЦР в режиме реального времени могут быть рекомендованы для использования в медицинских и ветеринарных лабораториях, проводящих диагностику хламидийных заболеваний.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации -

1. Эйдельштейн И А Фундаментальные изменения в классификации хламидий и родственных им микроорганизмов порядка Chlamydiales II Клин. Микробиол. и антимикроб, химиотер. -1999. - №1. -Том 1.

2. Demkin V. V., Zimin A. L, Edelstein M. V., Edelstein I. A., Suvorov M. M. Identification of Chlamydia Species by Electrophoretic Separation of omp2 Gene PCR Products in the Presence of Bisbenzimide-PEG // 9th European Congress of Clinical Microbiology and Infection Diseases (ECCMID). - Berlin, -1999. - P. 196.

3. Demkin V. V., Edelstein M. V., Zimin A. L, Edelstein I. A., Suvorov M. M. Detection of sequence variation in PCR-amplified fragments of omp2 gene from three species of the family Chlamydiaceae using agarose gel electrophoresis containing bisbenzimide-PEG // FEMS Microbiol Lett - 2000. -V. 15. - P. 215-218.

4. Эйдельштейн И А, Эйдельштейн М.В., Нарезкина А.Д. Метод дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae с помощью мультиплексной ПЦР в режиме реального времени // 4-я Всероссийская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных заболеваний». - Москва, - 2002 г. - С. 194.

5. Эйдельштейн И А, Эйдельштейн М.В., Нарезкина АД Разработка метода дифференциальнойдиагностики Chlamydia trachomatis, Chlamydiapneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов с помощью ПЦР в режиме реального

времени и анализа кривых плавления ДНК // 4-я Всероссийская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных заболеваний». -Москва, - 2002 г. - С. 193.

6. Эйдельштейн ИА, Эйдельштейн М.В., Нарезкина АД. Создание панели рекомбинантных штаммов для контроля качества ПЦР-диагностики и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae // 4-я Всероссийская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных заболеваний». - Москва, - 2002 г. - С. 421.

7. Эйдельштейн ИА, Эйдельштейн М.В., Нарезкина АД. Способ универсальной диагностики и дифференциации видов семейства Chlamydiaceae с помощью ПЦР и электрофореза в геле с ДНК-связывающим лигандом (бисбензимидом-ПЭГ) // 4-я Всероссийская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных заболеваний». - Москва, - 2002 г. - С. 97.

8. Метод дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae с помощью мультиплексной ПЦР в режиме реального времени // И А Эйдельштейн, А.Д. Нарезкина // Методические рекомендации МЗ РФ. 2003.

9. Tuuminen Т., Edelstein I, Punin A, Kislova N.. Stratchounski L Use of quantitative and objective enzyme immunoassays to investigate the possible association between Chlamydia pneumonias and Mycoplasma pneumoniae antibodies and asthma // Clin Microbiol Infect - 2004. - V. 10. - P. 345-348.

10. Edelstein I. A, Edelstein M. V., Narezkina A D. Development of a multiplex realtime PCR for detection and differentiation of Chlamydiaceae species which are pathogenic for humans // 14th European Congress of Clinical Microbiology and Infection Diseases (ECCMID). - Prague, -2004. - P. 173.

11. Эйдельштейн ИА, Эйдельштейн М.В., Нарезкина АД. Способ дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae. Заявка на изобретение № 2003113244 от 05.05.2003.

12. Эйдельштейн И А, Эйдельштейн М.В., Нарезкина АД. Способ дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae. Заявка на изобретение № 2003113132 от 05.05.2003.

13. Эйдельштейн И А, Эйдельштейн М.В., Нарезкина АД. Способ дифференциальной диагностики Chlamydia spp., Chlamydophila pneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов. Заявка на изобретение № 2003113544 от 08.05.2003.

Подписано в печать 13 04 2004 г. Формат 60x84 1/16 Объем 1 п л Заказ 403. Тираж 100 экз.

Отпечатано на оборудовании Смоленского ЦНТИ 214013. г. Смоленск, ул. Кирова, 22-Б Тел. (0812) 3-95-75

ill 8 1 4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Эйдельштейн, Инна Александровна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Разнообразие и классификация хламидий.

1.1. Общая характеристика представителей семейства СМатусИасеае.

1.2. Систематика хламидий.

1.2.1. Развитие классификации.

1.2.2. Современная классификация и таксономия представителей семейства СМатусИасеае и их роль в развитии заболеваний.

Глава 2. Современные методы выявления и типирования хламидий.

2.1. Немолекулярные методы.

2.1.1. Морфологические методы.

2.1.2. Культивирование.

2.1.3. Иммунологические методы.

2.2. Молекулярно-генетические методы.

2.2.1. Выбор генетических локусов для выявления представителей семейства СЫатусИасеае.

2.2.2. Молекулярно-генетические методы, используемые для дифференциации видов СЫатусИасеае.

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. Материалы и методы исследования.

3.1. Характеристика штаммов.

3.2. Модельные и клинические образцы, использованные для оптимизации ПЦР и выявления хламидий.

3.3. Выделение ДНК для ПЦР.

3.3.1. Быстрое выделение ДНК с использованием СЬе1ех-100.

3.3.2. Выделение ДНК с использованием протеиназы К.

3.3.3. Выделение ДНК с помощью сорбционного метода.

3.4. ПЦР-амплификация фрагмента гена отрА.

3.5. Клонирование и определение нуклеотидных последовательностей амплификационных фрагментов отрА различных видов Chlamydiaceae.

3.6. Получение гетерогенного внутреннего стандарта ПЦР.

3.7. Электрофоретическое разделение амплификационных фрагментов отрА в присутствии бисбензимида-ПЭГ.

3.8. ПЦР в режиме реального времени с SYBR Green I и анализ кривых плавления.

3.9. Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени с использованием зондов TaqMan-THna (5'-экзонуклеазный метод).

3.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

Глава 4. Результаты и обсуждение.

4.1. ПЦР-амплификация и анализ фрагмента последовательности отрА различных видов хламидий.

4.1.1. Выбор праймеров и оптимизация ПЦР.

4.1.2. Клонирование амплификационных фрагментов отрА и характеристика их нуклеотидных последовательностей.

4.2. Разработка и получение внутреннего стандарта ПЦР.

4.3. Дифференциация представителей Chlamydiaceae путем электрофоретического разделения в геле с добавлением бисбензимида-ПЭГ

4.4. Выявление и типирование представителей семейства Chlamydiaceae с помощью ПЦР в режиме реального времени и анализа кривых плавления с SYBR Green I.

4.5. Идентификация Chlamydia spp., Chlamydophilapneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов с помощью мультиплексной TaqMan ПЦР в режиме реального времени.

4.6. Анализ чувствительности и специфичности разработанных методов при исследовании клинических образцов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка молекулярно-генетических методов для выявления и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae"

Микроорганизмы семейства Chlamydiaceae являются облигатными внутриклеточными паразитами и вызывают ряд заболеваний человека и животных, известных под общим названием «хламидиозы». Для многих хламидий характерна высокая видоспецифичность, однако некоторые виды Chlamydiaceae имеют широкий круг естественных хозяев, включающий представителей нескольких классов позвоночных животных. Наиболее распространенные хламидийные инфекции человека, вызываемые Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae (биовар TWAR) носят антропонозный характер. Другие виды хламидий являются причиной зоонозных заболеваний [99, 111]. Хламидиозы характеризуются разнообразием клинических симптомов, могут протекать латентно или сопровождаться тяжелыми поражениями различных органов и систем. Характер и степень выраженности заболевания определяются принадлежностью возбудителя к определенному виду, биовару или серовару, поскольку многие штаммы хламидий проявляют тканеспецифичность, а также особенностями организма хозяина [29, 31, 66, 73, 107].

С. trachomatis, открытая раньше других хламидий, в настоящее время рассматривается как самый распространенный бактериальный возбудитель заболеваний, передающихся половым путем. По данным ВОЗ, количество инфекций, вызываемых С. trachomatis во всем мире, ежегодно составляет около 90 млн. случаев [84, 170]. При этом почти у 75% женщин и 50% мужчин урогенитальный хламидиоз протекает бессимптомно, что значительно усложняет эпидемиологический надзор за ним [2, 48]. В то же время данное заболевание является частой причиной бесплодия, невынашивания беременности и может сопровождаться различными экстрагенитальными поражениями [6, 204]. Помимо инфекций, передающихся половым путем, С. trachomatis вызывает эндемичную трахому (хронический кератоконъюнктивит) - заболевание, особенно широко представленное в развивающихся странах Азии, Африки, Южной Америки и являющееся одной из наиболее частых причин потери зрения [3, 105].

С. pneumoniae известна в основном как возбудитель заболеваний респираторного тракта, на долю которого приходится от 10 до 20% пневмоний и 5%-15% случаев бронхитов и синуситов [И, 89]. Кроме того, многие исследования, проведенные в последнее время, свидетельствуют о вероятной взаимосвязи между хронической инфекцией, вызванной С. pneumoniae, и развитием некоторых неинфекционных заболеваний, например, атеросклероза [10, 67], бронхиальной астмы [121] и некоторых заболеваний центральной нервной системы [26, 220].

Значительно большую группу представляют виды семейства Chlamydiaceae, патогенные для животных [5]. Хламидийные инфекции наносят существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства и птицеводства, вызывая гибель животных, аборты, рождение мертвого или нежизнеспособного приплода [7]. Так, ежегодные потери от хламидиозов в сфере животноводства в Великобритании составляют 25 млн. евро [23]. Некоторые виды возбудителей хламидиозов домашних и сельскохозяйственных животных, например, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila felis, представляют угрозу спорадических заболеваний людей, особенно лиц, профессионально занятых в сельском хозяйстве [99, 111]. Возможные пути передачи и опасность для человека других видов хламидий, вызывающих инфекции животных, до сих пор недостаточно изучены из-за отсутствия эпидемиологических данных. В связи с этим программа «Хламидиозы животных и опасность зоонозных заболеваний» Европейского сотрудничества в области научных и технических исследований (COST) уделяет первостепенное внимание разработке эффективных методов выявления хламидий [23].

Несмотря на разнообразие существующих диагностических методов, проблема идентификации представителей семейства Chlamydiaceae остается чрезвычайно актуальной. Культуральный метод, ранее рассматриваемый как золотой стандарт», представляет собой трудоемкий и длительный процесс, требующий использования нескольких клеточных линий для поддержания роста различных видов, и доступный лишь немногим лабораториям [120, 204]. Серологические методы, вследствие перекрестной реактивности основных антигенных детерминант хламидий, а также особенностей формирования иммунного ответа, недостаточно специфичны [85, 141, 154].

В последние годы интенсивно разрабатываются молекулярно-генетические методы обнаружения и типирования хламидий на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Значение этих методов существенно возросло в связи с накоплением данных о биологическом разнообразии представителей семейства Chlamydiaceae и фундаментальными изменениями их классификации, в основу которой положены принципы современной геносистематики [71, 73, 74, 210]. ПЦР широко используется для выявления отдельных видов хламидий и, прежде всего, С. trachomatis. В то же время, известные в настоящее время универсальные методы типирования хламидий с использованием ПЦР являются недостаточно чувствительными для их прямого обнаружения в клиническом материале или требуют использования трудоемких процедур анализа продуктов ПЦР [100, 165, 218]. Ни в одном из описанных в настоящее время методов ПЦР для универсального обнаружения представителей семейства Chlamydiaceae не предусмотрена возможность использования внутреннего стандарта, который позволяет выявлять ингибирование реакции.

Таким образом, широкий спектр заболеваний, вызываемых представителями семейства Chlamydiaceae, особенности течения хламидиозов человека и животных с часто сходной, но не всегда типичной клинической картиной, а также сложность идентификации хламидий с помощью стандартных подходов, обуславливают необходимость разработки универсальных методов обнаружения и типирования возбудителей данной группы.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработать молекулярно-генетические методы для выявления и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae и оценить эффективность предложенных методов при тестировании контрольных и клинических образцов в сравнении с альтернативными методами ПЦР.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. Создать коллекцию штаммов Е. coli, несущих клонированные амплификационные фрагменты гена отрА различных видов Chlamydiaceae, для использования в качестве контрольных ПЦР-матриц.

3. Определить нуклеотидные последовательности амплифицируемых фрагментов гена отрА у штаммов С. ресогит и С. suis.

5. Разработать методы выявления и дифференциации Chlamydia spp., С. pneumoniae и возбудителей зоонозов (С. psittaci, С. felis, С. abortus) на основе ПЦР в режиме реального времени с использованием неспецифического флуоресцентного красителя SYBR Green I и анализа кривых плавления ПЦР-продуктов, а также мультиплексной TaqMan ПЦР.

6. Создать гетерогенный внутренний стандарт ПЦР на основе гибридной последовательности ДНК фага X для контроля ингибирования ПЦР.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые:

1. Показана возможность видовой дифференциации хламидий путем электрофоретического разделения продуктов ПЦР в агарозном геле с добавлением сиквенс-специфического ДНК-лиганда - бисбензимида-ПЭГ.

2. Исследованы нуклеотидные последовательности амплифицируемых фрагментов гена отрА у штаммов С. ресогит и С. suis.

3. Разработан метод дифференциального выявления представителей семейства Chlamydiaceae с применением ПЦР в режиме реального времени и анализа кривых плавления продуктов ПЦР в присутствии SYBR Green I.

4. Разработаны специфические флуоресцентные зонды и предложена система дифференциального выявления патогенных для человека видов хламидий: Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae и возбудителей зоонозных инфекций с помощью мультиплексной TaqMan ПЦР.

5. Создана коллекция штаммов Е. coli, несущих клонированные фрагменты гена отрА различных видов Chlamydiaceae, для использования в качестве системы контроля качества предложенных ПЦР методов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Амплификация 5'-концевого участка гена отрА с последующим разделением продуктов ПЦР в агарозном геле с добавлением ДНК-лиганда - бисбензимида-ПЭГ позволяет определить видовую принадлежность неизвестных штаммов хламидий.

2. ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров к 5'-концевому фрагменту отрА и TaqMan зондов или неспецифического флуоресцентного красителя SYBR Green I в сочетании с анализом кривых плавления продуктов ПЦР является высокоэффективным и быстрым методом обнаружения и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

Результаты исследования доложены на 9 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Берлин, 1999), на конкурсе молодых ученых СГМА (Смоленск, 2000), 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002), XXIII межобластной научно- практической конференции терапевтов Центра и Запада России (Смоленск, 2003), межкафедральном заседании СГМА (Смоленск, 2003), 14 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Прага, 2004).

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 4 — в зарубежной печати.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Эйдельштейн, Инна Александровна

ВЫВОДЫ

1. Разработанные методы ПЦР с использованием семейственно-специфических праймеров к 5'-концевому участку гена отрА обеспечивают чувствительное и специфическое детектирование всех видов семейства Chlamydiaceae, что позволяет рассматривать их как перспективные подходы для диагностики хламидийных инфекций человека и животных.

2. Анализ нуклеотидных последовательностей амплифицируемого фрагмента отрА, включая впервые описанные в данной работе последовательности штаммов С. suis и С. ресогит, свидетельствует об их высокой внутривидовой консервативности (98,3-100% гомологии для каждого вида). В то же время, выраженные различия в структуре данного участка генома у разных видов обеспечивают возможность их дифференциации в щ соответствии с современной системой классификации хламидий.

3. Созданная панель штаммов Е. coli, несущих клонированные фрагменты отрА и гетерогенный внутренний стандарт, может быть использована для контроля качества ПЦР-диагностики и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae.

5. Разработанные методы выявления и дифференциации Chlamydia spp., С. pneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов (С. psittaci, С. abortus

• ' и C.felis) на основе ПЦР в режиме реального времени с использованием

SYBR Green I и анализа кривых плавления продуктов ПЦР, а также мультиплексной TaqMan ПЦР со специфическими зондами отличаются высокой чувствительностью, специфичностью и производительностью по сравнению с ранее предложенными методами универсального обнаружения представителей семейства Chlamydiaceae на основе ПЦР.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Метод электрофоретического разделения амплификационных фрагментов ^ ошрА в агарозном геле с добавлением сайт-специфического ДНК-лиганда бисбензимида-ПЭГ может быть рекомендован в качестве простого и экономически эффективного метода определения видовой принадлежности как культивированных, так и выделенных из клинического материала штаммов хламидий.

2. Использование рекомбинантных штаммов E.coli, несущих клонированные фрагменты ошрА девяти видов Chlamydiaceae и гетерогенный внутренний стандарт, рекомендуется для контроля качества выявления и дифференциации хламидий с помощью ПЦР с семейственно-специфическими праймерами СМ1 и СМ2.

3. Предложенные методы идентификации Chlamydia spp., С. pneumoniae и • возбудителей зоонозных хламидиозов (С. psittaci, С. abortus и С. felis) на основе ПЦР в режиме реального времени могут быть рекомендованы для использования в медицинских и ветеринарных лабораториях, проводящих диагностику хламидийных заболеваний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Эйдельштейн, Инна Александровна, Смоленск

1. Брагина Е.Е., Дмитриева Г.А., Кисина В.И. Структурно-функциональные особенности жизненного цикла хламидий in vivo. // Вестник дерматологии. - 1995. - № 6. - С. 18-21.

2. Егоров A.M., Сазыкин Ю.О. Хламидии. Молекулярная организация клетки и некоторые особенности патогенеза инфекций. // Антибиотики и химиотерапия. 2000. - № 45. - С. 3-5.

3. Зайцева Н.С. Трахома. Москва: МНИИГБ, 1976. -130 с.

4. Казанцев А.П. Орнитоз. Ленинград: Медицина, 1973. -216 с.

5. Кротов С.А., Кротова В.А., Юрьев С.Ю. Хламидиозы: эпидемиология, характеристика возбудителя, методы лабораторной диагностики, лечение генитального хламидиоза. Барнаул: Алтайский центр по борьбе со СПИД, 1995. - 34 с.

6. Митрофанов П.М. Паталого-анатомическая диагностика малоизвестных инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. Саранск.: 1997. - 58-65 с.

7. Обухов И.П., Шипулин Г.А., Груздев К.Н., Панин А.Н. Использование полимеразной цепной реакции для определения видов хламидий // Доклады Россельхозакадемии. 1997. - № 1. - С. 1-3.

8. Савичева A.M., Башмакова М.А. Урогениталльный хламидиоз у женщин и его последствия / Под ред. Э.К. Айламазяна. Н. Новгород: Издательство НМГА, 1998. -10-12 с.

9. Сумароков А.Б., Панкратова В.Н. Изучение титров специфических IgG, IgA- и IgM-антител к микроорганизму Chlamydia pneumoniae убольных с начальным атеросклерозом сонных артерий // Практикующий врач. 1999. - № 15. -С. 10-12.

10. И. Тартаковский И.С. Современные подходы к диагностике атипичных пневмоний // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. - № 2. - С.60-68.

11. Шаткин A.A., Попов B.JL, Бескина С.Р. Урогенитальные гальпровиозы (хламидиозы). Морфологические и ультраструктурные особенности возбудителя. // Вестн. дерматол. и венерол. 1981. - № 1. - С.24-28.

12. Шаткин A.A. Персистенция хламидийной инфекции в культуре клеток. // Вест. Академ. Мед. Науки СССР. 1985. - № 3. - С.51-55.

13. Шипицина Е.В. Микробиологические аспекты устойчивости Chlamydia trachomatis к антибиотикам: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.07 / СПбГМУ. СПб., 2003. - 10 с.

14. Alakarppa Н., Surcel Н.М., Laitinen К., Juvonen Т., Saikku P., Laurila A. Detection of Chlamydia pneumoniae by colorimetric in situ hybridization // APMIS. 1999. - Vol.107, No 4. - P.451-454.

15. An Q., Olive D.M. Molecular cloning and nucleic acid sequencing of Chlamydia trachomatis 16S rRNA genes from patient samples lacking the cryptic plasmid // Mol. Cell Probes. 1994. - Vol.8, No 5. - P.429-435.

16. Andersen A.A. Serotyping of Chlamydia psittaci isolates using serovar-specific monoclonal antibodies with the microimmunofluorescence test // J.Clin.Microbiol. 1991. - Vol.29, No 4. - P.707-711.

17. Andersen A.A. Two new serovars of Chlamydia psittaci from North American birds // J.Vet.Diagn.Invest. 1997. - Vol.9, No 2. - P.l59-164.

18. Andersen A.A., Grimes J.E., Shivaprasad H.L. Serotyping of Chlamydia psittaci isolates from ratites // J.Vet.Diagn.Invest. 1998. - Vol. 10, No 2. -P.186-188.

19. Andersen A.A., Rogers D.G. Resistance to tetracycline and sulfadiazine in swine C. trachomatis isolates. San Francisco, CA. International Chlamydia Symposium. // Ninth International Symposium on Human Chlamydial Infections, 1998. P.313-316.

20. Animal Chlamydioses and the Zoonotic Implications. Electronic citation.: European Cooperation in the field of Scientific and Technical Research, COST. 11-3-2002. // http://cost.cordis.lu/src/pdf/855-e.pdf.

21. Baghian A., Kousoulas K., Truax R., Storz J. Specific antigens of Chlamydia pecorum and their homologues in C. psittaci and C. trachomatis II Am.J.Vet.Res. 1996. - Vol.57, No 12. - P.1720-1725.

22. Batteiger B.E. The major outer membrane protein of a single Chlamydia trachomatis serovar can possess more than one serovar-specific epitope // Infect.Immun. 1996. - Vol.64, No 2. - P.542-547.

23. Batteiger B.E., Lennington W., Newhall W.J., Katz B.P., Morrison H.T., Jones R.B. Correlation of infecting serovar and local inflammation in genital Chlamydial infections // J.Infect.Dis. 1989. - Vol.160, No 2. - P.332-336.

24. Beatty W.L., Morrison R.P., Byrne G.I. Reactivation of persistent Chlamydia trachomatis infection in cell culture // Infect.Immun. 1995. -Vol.63, No 1.- P. 199-205.

25. Beaty C.D., Grayston J.T., Wang S.P., Kuo C.C., Reto C.S., Martin T.R. Chlamydia pneumoniae, strain TWAR, infection in patients with chronic obstructive pulmonary disease // Am.Rev.Respir.Dis. 1991. - Vol.144, No 6.- P.1408-1410.

26. Bedson S.P., Bland J.O. The developmental forms of the psittacosis virus // British Journal of Experimental Pathology. 1934. - Vol.15 P.243-247.

27. Black P.N., Scicchitano R., Jenkins C.R., Blasi F., Allegra L., Wlodarczyk J., Cooper B.C. Serological evidence of infection with Chlamydia pneumoniae is related to the severity of asthma // Eur.Respir.J. 2000. -Vol.15, No 2.- P.254-259.

28. Bush R.M., Everett K.D. Molecular evolution of the Chlamydiaceae II Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 2001. - Vol.51, No Pt 1. - P.203-220.

29. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays // J Mol.Endocrinol. 2000. -Vol.25, No 2.- P.169-193.

30. Byrne G.I., Lehmann L.K., Landry G.J. Induction of tryptophan catabolism is the mechanism for gamma-interferon-mediated inhibition of intracellular Chlamydia psittaci replication in T24 cells // Infect.Immun. 1986. - Vol.53, No 2.- P.347-351.

31. Caldwell H.D., Hitchcock P.J. Monoclonal antibody against a genus-specific antigen of Chlamydia species: location of the epitope on chlamydial lipopolysaccharide // Infect.Immun. 1984. - Vol.44, No 2. - P.306-314.

32. Campbell L.A., Kuo C.C., Grayston J.T. Characterization of the new Chlamydia agent, TWAR, as a unique organism by restriction endonuclease analysis and DNA-DNA hybridization // J.Clin.Microbiol. 1987. - Vol.25, No 10.- P.1911-1916.

33. Campbell S., Richmond S.J., Yates P. The development of Chlamydia trachomatis inclusions within the host eukaryotic cell during interphase and mitosis II J.Gen.Microbiol. 1989. - Vol.135 ( Pt 5) P.l 153-1165.

34. Chae C., Cheon D.S., Kwon D., Kim O., Kim B., Suh J., Rogers D.G., Everett K.D., Andersen A.A. In situ hybridization for the detection andlocalization of swine Chlamydia trachomatis II Vet.Pathol. 1999. - Vol.36, No 2.- P.133-137.

35. Chernesky M., Jang D., Chong S., Sellors J., Mahony J. Impact of urine collection order on the ability of assays to identify Chlamydia trachomatis infections in men // Sex Transm.Dis. 2003. - Vol.30, No 4. - P.345-347.

36. Chernesky M.A. Nucleic acid tests for the diagnosis of sexually transmitted diseases // FEMS Immunol.Med.Microbiol. 1999. - Vol.24, No 4. - P.437-446.

37. Chlamydia. Disease Information. Electronic citation.: National Center for HIV, STD and TB Prevention Division of Sexually Transmitted Diseases. 2003. // http://www.cdc.gov/nchstp/dstd/Fact Sheets/C/7/a/wvc//afacts.htm.

38. Clarkson M.J., Philips H.L. Isolation of faecal Chlamydia from sheep in Britain and their characterization by cultural properties // Vet J. 1997. -Vol.153, No 3.- P.307-310.

39. Cles L.D., Stamm W.E. Use of HL cells for improved isolation and passage of Chlamydia pneumoniae II J Clin.Microbiol. 1990. - Vol.28, No 5. -P.93 8-940.

40. Comanducci M., Ricci S., Cevenini R., Ratti G. Diversity of the Chlamydia trachomatis common plasmid in biovars with different pathogenicity // Plasmid. 1990. - Vol.23, No 2. - P.149-154.

41. Comanducci M., Ricci S., Ratti G. The structure of a plasmid of Chlamydia trachomatis believed to be required for growth within mammalian cells // Mol.Microbiol. 1988. - Vol.2, No 4. - P.531-538.

42. Corsaro D., Valassina M., Venditti D. Increasing diversity within Chlamydiae II Crit.Rev.Microbiol. 2003. - Vol.29, No 1. - P.37-78.

43. Corsaro D., Venditti D., Le Faou A., Guglielmetti P., Valassina M. A new Chlamydia-like 16S rDNA sequence from a clinical sample I I Microbiology. -2001.-Vol.147, No Pt3.- P.515-516.

44. Corsaro D., Venditti D., Valassina M. New chlamydial lineages from freshwater samples // Microbiology. 2002. - Vol.148, No Pt 2. - P.343-344.

45. Creelan J.L., McCullough S.J. Evaluation of strain-specific primer sequences from an abortifacient strain of ovine Chlamydophila abortus (iChlamydia psittaci) for the detection of EAE by PCR // FEMS Microbiol.Lett. 2000. - Vol.190, No 1. - P. 103-108.

46. Danesh J., Whincup P., Walker M., Lennon L., Thomson A., Appleby P., Wong Y., Bernardes-Silva M., Ward M. Chlamydia pneumoniae IgG titres and coronary heart disease: prospective study and meta-analysis // BMJ. -2000. Vol.321, No 7255. - P.208-213.

47. Darougar S., Forsey T., Brewerton D.A., Rogers K.L. Prevalence of antichlamydial antibody in London blood donors // Br.J.Vener.Dis. 1980. -Vol.56, No 6. - P.404-407.

48. DeGraves F.J., Gao D., Kaltenboeck B. High-sensitivity quantitative PCR platform // Biotechniques. 2003. - Vol.34, No 1. - P. 106-5.

49. Demkin V.V., Zimin A.L. Family specific PCR detection and genus specific differentiation of Chlamydiaceae species // Proc 4th Meet Eur Soc Chlam Res, Helsinki, Finland, Aug.20. 2000. P.82.

50. Dreses-Werringloer U., Padubrin I., Jurgens-Saathoff B., Hudson A.P., Zeidler H., Kohler L. Persistence of Chlamydia trachomatis is induced by ciprofloxacin and ofloxacin in vitro II Antimicrob.Agents Chemother. -2000. Vol.44, No 12. - P.3288-3297.

51. Dwyer R.S., Treharne J.D., Jones B.R., Herring J. Chlamydial infection. Results of micro-immunofluorescence tests for the detection of type-specific antibody in certain chlamydial infections // Br.J.Vener.Dis. 1972. - Vol.48, No 6.- P.452-459.

52. Eckert L.O., Suchland R.J., Hawes S.E., Stamm W.E. Quantitative Chlamydia trachomatis cultures: correlation of chlamydial inclusion-forming units with serovar, age, sex, and race // J.Infect.Dis. 2000. -Vol.182, No 2.- P.540-544.

53. Ellis R.W. Infection and coronary heart disease // J.Med.Microbiol. 1997. -Vol.46, No 7. - P.535-539.

54. Engel J.N., Ganem D. Chlamydial rRNA operons: gene organization and identification of putative tandem promoters // J.Bacteriol. 1987. - Vol.169, No 12. - P.5678-5685.

55. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. Recent advances in the polymerase chain reaction//Science. 1991. - Vol.252, No 5013. - P.1643-1651.

56. Escalante-Ochoa C., Ducatelle R, Haesebrouck F. Dynamics of the development of Chlamydophila psittaci inclusions in epithelial andfibroblast host cells // J Vet.Med.B Infect.Dis.Vet.Public Health. 2000. -Vol.47, No 5.- P.343-349.

57. Everett K.D., Andersen A.A. The ribosomal intergenic spacer and domain I of the 23 S rRNA gene are phylogenetic markers for Chlamydia spp. // Int.J.Syst.Bacteriol. 1997. - Vol.47, No 2. - P.461-473.

58. Everett K.D., Andersen A.A. Identification of nine species of the Chlamydiaceae using PCR-RFLP // Int.J Syst.Bacteriol. 1999. - Vol.49 Pt 2 P.803-813.

59. Everett K.D., Hornung L.J., Andersen A.A. Rapid detection of the Chlamydiaceae and other families in the order Chlamydiales: three PCR tests // J.Clin.Microbiol. 1999. - Vol.37, No 3. - P.575-580.

60. Evolution of Chlamydiaceae. Electronic citation.: The comprehensive reference and education site to Chlamydia and the Chlamydiae. 2004. // http://www.Chlamydiae.com/docs/Chlamydia\es/evgenseqs.htm.

61. Fitch W.M., Peterson E.M., de la Maza L.M. Phylogenetic analysis of the outer-membrane-protein genes of Chlamydiae, and its implication for vaccine development // Mol.Biol.Evol. 1993. - Vol.10, No 4. - P.892-913.

62. Forsey T., Darougar S. Acute conjunctivitis caused by an atypical chlamydial strain: Chlamydia IOL 207 // Br.J.Ophthalmol. 1984. - Vol.68, No 6.- P.409-411.

63. Frost E.H., Deslandes S., Bourgaux-Ramoisy D. Sensitive detection and typing of Chlamydia trachomatis using nested polymerase chain reaction // Genitourin.Med. 1993. - Vol.69, No 4. - P.290-294.

64. Fukushi H., Hirai K. Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia strains derived from ruminants // Int.J.Syst.Bacteriol. 1992. -Vol.42, No 2. - P.306-308.

65. Fukushi H., Hirai K. Restriction fragment length polymorphisms of rRNA as genetic markers to differentiate Chlamydia spp. // Int.J.Syst.Bacteriol. -1993.-Vol.43, No 3.- P.613-617.

66. Garrett A.J. Some properties of the polysaccharide from cell cultures infected with TRIC agent (Chlamydia trachomatis) II J.Gen.Microbiol. -1975.-Vol.90, No 1.- P.133-139.

67. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections. Electronic citation.: WHO department of HIV/AIDS. 2004. // http://www.who.int/docstore/hiv/GRSTI/003.htm.

68. Grayston J.T. Chlamydia pneumoniae, strain TWAR // Chest. 1989. -Vol.95, No 3. - P.664-669.

69. Hackstadt T., Fischer E.R., Scidmore M.A., Rockey D.D., Heinzen R.A. Origins and functions of the chlamydial inclusion // Trends Microbiol. -1997.-Vol.5, No 7.- P.288-293.

70. Halberstaedter L., Prowazek S. Uber Zelleinschlusse Parasitärer Nature beim Trachom II Arbeiten aus dem Kaiselichen Gesundheitsamke. 1907. -Vol.26 P.44-47.

71. Hammerschlag M.R. The Role of Chlamydia in Upper Respiratory Tract Infections I I Curr.Infect.Dis.Rep. 2000. - Vol.2, No 2. - P. 115-120.

72. Hammerschlag M.R. The intracellular life of Chlamydiae II Semin.Pediatr.Infect.Dis. 2002. - Vol.13, No 4. - P.239-248.

73. Hartley J.C., Kaye S., Stevenson S., Bennett J., Ridgway G. PCR detection and molecular identification of Chlamydiaceae species // J.Clin.Microbiol. -2001.-Vol.39, No 9.- P.3072-3079.

74. Hatch T.P., Vance D.W., Jr., AI Hossainy E. Identification of a major envelope protein in Chlamydia spp. // J.Bacteriol. 1981. - Vol.146, No 1. -P.426-429.

75. Hatt C., Ward M.E., Clarke I.N. Analysis of the entire nucleotide sequence of the cryptic plasmid of Chlamydia trachomatis serovar LI. Evidence for involvement in DNA replication // Nucleic Acids Res. 1988. - Vol.16, No 9. - P.4053-4067.

76. Helps C., Reeves N., Egan K., Howard P., Harbour D. Detection of Chlamydophila felis and feline herpesvirus by multiplex real-time PCR analysis // J Clin.Microbiol. 2003. - Vol.41, No 6. - P.2734-2736.

77. Helps C., Reeves N., Tasker S., Harbour D. Use of real-time quantitative PCR to detect Chlamydophila felis infection // J.Clin.Microbiol. 2001. -Vol.39, No 7. - P.2675-2676.

78. Hermann C., Graf K., Groh A., Straube E., Härtung T. Comparison of eleven commercial tests for Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin G in asymptomatic healthy individuals // J.Clin.Microbiol. 2002. - Vol.40, No 5. - P.1603-1609.

79. Holland S.M., Gaydos C.A., Quinn T.C. Detection and differentiation of Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, and Chlamydia pneumoniae by DNA amplification // J.Infect.Dis. 1990. - Vol.162, No 4. - P.984-987.

80. Horn M., Wagner M. Evidence for additional genus-level diversity of Chlamydiales in the environment // FEMS Microbiol.Lett. 2001. - Vol.204, No 1.- P.71-74.

81. Hsieh Y.H., Bobo L.D., Quinn T.C., West S.K. Determinants of trachoma endemicity using Chlamydia trachomatis ompA DNA sequencing // Microbes.Infect. 2001. - Vol.3, No 6. - P.447-458.

82. Huang J., DeGraves F.J., Gao D., Feng P., Schlapp T., Kaltenboeck B. Quantitative detection of Chlamydia spp. by fluorescent PCR in the LightCycler//Biotechniques. 2001. - Vol.30, No 1. - P. 150-157.

83. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. - Vol.96, No 1. - P.23-28.

84. International trachoma initiative. Electronic citation.: Applied Research. 2003. // http ://www.trachoma. org/apply. asp.

85. Jackson L.A., Campbell L.A., Schmidt R.A., Kuo C., Cappuccio A.L., Lee M.J., Grayston J.T. Specificity of detection of Chlamydia pneumoniae incardiovascular atheroma // J.Infect.Dis. 2000. - Vol.181. Suppl. 3. -P.S447-S448.

86. Jantos C.A., Heck S., Roggendorf R., Sen-Gupta M., Hegemann J.H. Antigenic and molecular analyses of different Chlamydia pneumoniae strains // J.Clin.Microbiol. 1997. - Vol.35, No 3. - P.620-623.

87. Johnson W.D., Moses J., Kipshidze N. Absence of Chlamydia pneumoniae in surgical specimens of coronary and carotid arteries by polymerase chain reaction // Cardiovasc.Radiat.Med. 2001. - Vol.2, No 4. - P.221-224.

88. Johnston S.L. The role of viral and atypical bacterial pathogens in asthma pathogenesis//Pediatr.Pulmonol.Suppl. 1999. - Vol.18 P.141-143.

89. Jones H., Rake G., Stearns B. Studies on L. G. V. Ill // Journal of Infectious Diseases. 1945. - Vol.76 P.55-69.

90. Jorgensen D.M. Gestational psittacosis in a Montana sheep rancher // Emerg.Infect.Dis. 1997. - Vol.3, No 2. - P. 191-194.

91. Kalman S., Mitchell W., Marathe R., Lammel C., Fan J., Hyman R.W., dinger L., Grimwood J., Davis R.W., Stephens R.S. Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis II Nat.Genet. 1999. - Vol.21, No 4. - P.385-389.

92. Kaltenboeck B., Kousoulas K.G., Storz J. Two-step polymerase chain reactions and restriction endonuclease analyses detect and differentiate ompA DNA of Chlamydia spp. // J Clin.Microbiol. 1992. - Vol.30, No 5. -P. 1098-1104.

93. Kaltenboeck B., Kousoulas K.G., Storz J. Structures of and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (<ompA) genes of the four chlamydial species // J.Bacteriol. 1993. - Vol.175, No 2. - P.487-502.

94. Kazuyama Y. An isolation procedure of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia trachomatis 11 Kansenshogaku Zasshi. 1992. - Vol.66, No 2. -P.189-193.

95. Klein M., Kotz A., Bernardo K., Kronke M. Detection of Chlamydia pneumoniae-specific antibodies binding to the VD2 and VD3 regions of the major outer membrane protein // J Clin.Microbiol. 2003. - Vol.41, No 5. -P. 1957-1962.

96. Koh W.P., Taylor M.B., Chew S.K., Phoon M.C., Kang K.L., Chow V.T. Chlamydia pneumoniae IgG seropositivity and clinical history of ischemic heart disease in Singapore // J Microbiol Immunol.Infect. 2003. - Vol.36, No 3. - P. 169-174.

97. Korner I., Blatz R., Wittig I., Pfeiffer D., Ruhlmann C. Serological evidence of Chlamydia pneumoniae lipopolysaccharide antibodies in atherosclerosis of various vascular regions // Vasa. 1999. - Vol.28, No 4. - P.259-263.

98. Kuo C.C., Grayston J.T. A sensitive cell line, HL cells, for isolation and propagation of Chlamydia pneumoniae strain TWAR // J.Infect.Dis. 1990. - Vol.162, No 3.- P.755-758.

99. Kuo C.C., Jackson L.A., Campbell L.A., Grayston J.T. Chlamydia pneumoniae (TWAR) // Clin.Microbiol.Rev. 1995. - Vol.8, No 4. - P.451-461.

100. Kuoppa Y., Boman J., Scott L., Kumlin U., Eriksson I., Allard A. Quantitative detection of respiratory Chlamydia pneumoniae infection by real-time PCR // J.Clin.Microbiol. 2002. - Vol.40, No 6. - P.2273-2274.

101. Lampe M.F., Wong K.G., Kuehl L.M., Stamm W.E. Chlamydia trachomatis major outer membrane protein variants escape neutralization by both monoclonal antibodies and human immune sera // Infect.Immun. 1997. -Vol.65, No 1.- P.317-319.

102. Laroucau K., Souriau A., Rodolakis A. Improved sensitivity of PCR for Chlamydophila using pmp genes // Vet.Microbiol. 2001. - Vol.82, No 2. -P.155-164.

103. Larsen F.O., Norn S., Mordhorst C.H., Skov P.S., Milman N., Clementsen P. Chlamydia pneumoniae and possible relationship to asthma. Serum immunoglobulins and histamine release in patients and controls // APMIS. -1998. Vol.106, No 10. - P.928-934.

104. Liu W., Saint D.A. Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics // Biochem.Biophys.Res Commun. 2002. - Vol.294, No 2. - P.347-353.

105. Lovett M., Kuo K.-K., Holmes K., Falkow S. Plasmids of the genus Chlamydia II Current chemotherapy and infectious diseases. Washington DC: American Society of Microbiology, 1980. - P.1250-1252.

106. McElnea C.L., Cross G.M. Methods of detection of Chlamydia psittaci in domesticated and wild birds // Aust.Vet.J. 1999. - Vol.77, No 8. - P.516-521.

107. Messmer T.O., Skelton S.K., Moroney J.F., Daugharty H., Fields B.S. Application of a nested, multiplex PCR to psittacosis outbreaks // J.Clin.Microbiol. 1997. - Vol.35, No 8. - P.2043-2046.

108. Meyer K.F. Psittacosis group II Ann.N.Y.Acad.Sci. 1953. - Vol.56, No 3. -P.545-556.

109. Miyashita N., Matsumoto A., Fukano H., Niki Y., Matsushima T. The 7.5kb common plasmid is unrelated to the drug susceptibility of Chlamydia trachomatis II J.Infect.Chemother. 2001. - Vol.7, No 2. - P.l 13-116.

110. Miyashita N., Matsumoto A., Matsushima T. In vitro susceptibility of 7.5-kb common plasmid-free Chlamydia trachomatis strains // Microbiol.Immunol. 2000. - Vol.44, No 4. - P.267-269.

111. Miyashita N., Matsumoto A., Soejima R., Kubota Y., Kishimoto T., Nakajima M., Niki Y., Matsushima T. Evaluation of a direct fluorescent antibody assay for detection of Chlamydia pneumoniae II Kansenshogaku Zasshi. 1996. - Vol.70, No 3. - P.224-231.

112. Morrissey I., Salman H., Bakker S., Farrell D., Bebear C.M., Ridgway G. Serial passage of Chlamydia spp. in sub-inhibitory fluoroquinoloneconcentrations // J.Antimicrob.Chemother. 2002. - Vol.49, No 5. - P.757-761.

113. Moulder J.W., Hatch T.P., Byrne G.I., Kellogg K.R. Immediate toxicity of high multiplicities of Chlamydia psittaci for mouse fibroblasts (L cells) // Infect.Immun. 1976. - Vol.14, No 1. - P.277-289.

114. Moulder J.W., Hatch T.P., Kuo C.C., Schachter J. Genus Chlamydia II Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 1984. - P.729-739.

115. Moulder J.W., Levy N.J., Schulman L.P. Persistent infection of mouse fibroblasts (L cells) with Chlamydia psittaci: evidence for a cryptic chlamydial form // Infect.Immun. 1980. - Vol.30, No 3. - P.874-883.

116. Muller M., Kruse L., Tabrett A.M., Barbara D.J. Detection of a single base exchange in PCR-amplified DNA fragments using agarose gel electrophoresis containing bisbenzimide-PEG //Nucleic Acids Res. 1997. -Vol.25, No 24. - P.5125-5126.

117. Mygind T., Birkelund S., Falk E., Christiansen G. Evaluation of real-time quantitative PCR for identification and quantification of Chlamydia pneumoniae by comparison with immunohistochemistry // J.Microbiol.Methods. 2001. - Vol.46, No 3. - P.241-251.

118. Nurmi J., Ylikoski A., Soukka T., Karp M., Lovgren T. A new label technology for the detection of specific polymerase chain reaction products in a closed tube // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol.28, No 8. - P.28.

119. Orfila J.J. Seroepidemiological evidence for an association between Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis. // Atherosclerosis. 1998. -Vol.140. Suppl. 1.-P.11-15.

120. Ossewaarde J.M. Extreme diversity of the Order Chlamydiales / 2002. -P.123.

121. Ossewaarde J.M., Meijer A. Molecular evidence for the existence of additional members of the order Chlamydiales I I Microbiology. 1999. -Vol.145 (Pt 2). - P.411-417.

122. Ostergaard L. Diagnosis of urogenital Chlamydia trachomatis infection by use of DNA amplification // APMIS. Suppl. 1999. - Vol.89. - P.5-36.

123. Ozanne G., Lefebvre J. Specificity of the microimmunofluorescence assay for the serodiagnosis of Chlamydia pneumoniae infections // Can.J.Microbiol. 1992. - Vol.38, No 11. - P. 1185-1189.

124. Page L.A. Interspecies transfer of psittacosis-LGV-trachoma agents: pathogenicity of two avian and two mammalian strains for eight species of birds and mammals // Am.J.Vet.Res. 1966. - Vol.27, No 117. - P.397-407.

125. Page L.A. Proposal for the recognition of two species in the genus Chlamydia I I International Journal of Systematic Bacteriology. 1968. -Vol.18.-P.51-66.

126. Peeling R.W., Wang S.P., Grayston J.T., Blasi F., Boman J., Clad A., Freidank H., Gaydos C.A., Gnarpe J., Hagiwara T., Jones R.B., Orfila J.,

127. Persson K., Puolakkainen M., Saikku P., Schachter J. Chlamydia pneumoniae serology: interlaboratory variation in microimmunofluorescence assay results // J Infect.Dis. 2000. - Vol.181. Suppl 3. - P.S426-S429.

128. Pham D.G., Madico G.E., Quinn T.C., Enzler M.J., Smith T.F., Gaydos C.A. Use of lambda phage DNA as a hybrid internal control in a PCR-enzyme immunoassay to detect Chlamydia pneumoniae II J.Clin.Microbiol. 1998. -Vol.36, No 7.- P.1919-1922.

129. Pollard D.R., Tyler S.D., Ng C.W., Rozee K.R. A polymerase chain reaction (PCR) protocol for the specific detection of Chlamydia spp. // Mol.Cell Probes. 1989. - Vol.3, No 4. - P.383-389.

130. Poppert S., Essig A., Marre R., Wagner M., Horn M. Detection and differentiation of Chlamydiae by fluorescence in situ hybridization // Appl.Environ.Microbiol. 2002. - Vol.68, No 8. - P.4081-4089.

131. Pudjiatmoko, Fukushi H., Ochiai Y., Yamaguchi T., Hirai K. Phylogenese analysis of the genus Chlamydia based on 16S rRNA gene sequences // Int.J.Syst.Bacteriol. 1997. - Vol.47, No 2. - P.425-431.

132. Raeymaekers L. Basic principles of quantitative PCR // Mol.Biotechnol. -2000.-Vol.15, No 2.- P. 115-122.

133. Rasmussen S.J., Douglas F.P., Timms P. PCR detection and differentiation of Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis //Mol.Cell Probes. 1992. - Vol.6, No 5. - P.389-394.

134. Read T.D., Brunham R.C., Shen C. Genome sequences of Chlamydia trachomatis MoPn and Chlamydia pneumoniae AR39 // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol.28, No 6. - P.1397-1406.

135. Read T.D., Myers G.S., Brunham R.C. Genome sequence of Chlamydophila caviae {Chlamydia psittaci GPIC): examining the role of niche-specific genes in the evolution of the Chlamydiaceae II Nucleic Acids Res. 2003. -Vol.31, No 8.- P.2134-2147.

136. Reeve P. The inactivation of Chlamydia trachomatis by povidone-iodine // J.Antimicrob.Chemother. 1976. - Vol.2, No 1. - P.77-80.

137. Rekiki A., Sidi-Boumedine K., Souriau A., Jemli J., Hammami S., Rodolakis A. Isolation and characterization of local strains of Chlamydophila abortus {Chlamydia psittaci serotype 1) from Tunisia // Vet.Res. 2002. - Vol.33, No 2. - P.215-222.

138. Richey C.M., Macaluso M., Hook E.W. Determinants of reinfection with Chlamydia trachomatis II Sex Transm.Dis. 1999. - Vol.26, No 1. - P.4-11.

139. Rodolakis A., Bernard F., Lantier F. Mouse models for evaluation of virulence of Chlamydia psittaci isolated from ruminants // Res.Vet.Sci. -1989. Vol.46, No 1. - P.34-39.

140. Rodolakis A., Souriau A. Restriction endonuclease analysis of DNA from ruminant Chlamydia psittaci and its relation to mouse virulence // Vet.Microbiol. 1992. - Vol.31, No 2-3. - P.263-271.

141. Rogers D.G., Andersen A.A., Hunsaker B.D. Lung and nasal lesions caused by a swine chlamydial isolate in gnotobiotic pigs // J.Vet.Diagn.Invest. -1996.-Vol.8, No 1.- P.45-55.

142. Sachse K., Grossmann E., Jager C., Diller R., Hotzel H. Detection of Chlamydia suis from clinical specimens: comparison of PCR, antigen ELISA, and culture // J.Microbiol.Methods. 2003. - Vol.54, No 2. - P.233-238.

143. Saikku P., Wang S.P., Kleemola M., Brander E., Rusanen E., Grayston J.T. An epidemic of mild pneumonia due to an unusual strain of Chlamydia psittaci II J Infect.Dis. 1985. - Vol.151, No 5. - P.832-839.

144. Samra Z., Rosenberg S., Soffer Y., Dan M. In vitro susceptibility of recent clinical isolates of Chlamydia trachomatis to macrolides and tetracyclines // Diagn.Microbiol Infect.Dis. 2001. - Vol.39, No 3. - P.177-179.

145. Schachter J. Chlamydial infections (first of three parts) // N.Engl.J Med. -1978.-Vol.298, No 8.- P.428-435.

146. Schachter J., Ostler H.B., Meyer K.F. Human infection with the agent of feline pneumonitis // Lancet. 1969. - Vol.1, No 7605. - P.1063-1065.

147. Schiller I., Koesters R., Weilenmann R. Mixed infections with porcine Chlamydia trachomatislpecorum and infections with ruminant Chlamydia psittaci serovar 1 associated with abortions in swine // Vet.Microbiol. -1997. Vol.58, No 2-4. - P.251-260.

148. Schirm J. The QCMD 2003 Chlamydia trachomatis proficiency panel // Quality Control for Molecular Diagnostics. 2004. - Vol.2. - P.3-9.

149. Scieux C., Grimont F., Regnault B., Grimont P.A. DNA fingerprinting of Chlamydia trachomatis by use of ribosomal RNA, oligonucleotide and randomly cloned DNA probes // Res.Microbiol. 1992. - Vol.143, No 8. -P.755-765.

150. Sheehy N., Markey B., Gleeson M., Quinn P.J. Differentiation of Chlamydia psittaci and C. pecorum strains by species-specific PCR // J.Clin.Microbiol.- 1996.-Vol.34,No 12.- P.3175-3179.

151. Shen L., Shi Y., Douglas A.L., Hatch T.P., O'Connell C.M., Chen J.M., Zhang Y.X. Identification and characterization of promoters regulating tuf expression in Chlamydia trachomatis serovar F // Arch.Biochem.Biophys. -2000. Vol.379, No 1. - P.46-56.

152. Shi Y., Tokunaga O. Chlamydia pneumoniae and multiple infections in the aorta contribute to atherosclerosis I I Pathol.Int. 2002. - Vol.52, No 12. -P.755-763.

153. Shirai M., Hirakawa H., Kimoto M. Comparison of whole genome sequences of Chlamydia pneumoniae J138 from Japan and CWL029 from USA//Nucleic Acids Res.-2000.-Vol.28, No 12.- P.2311-2314.

154. Sriprakash K.S., MacAvoy E.S. Characterization and sequence of a plasmid from the trachoma biovar of Chlamydia trachomatis II Plasmid. 1987. -Vol.18, No 3.- P.205-214.

155. Stary A., Gene M., Heller-Vitouch C., Mardh P.A. Chlamydial antigen detection in urine samples by immunofluorescence tests // Infection. 1992. - Vol.20, No 2. - P.101-104.

156. Stephens R.S. Chlamydia. Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Washington: 1999. - 143-146 p.

157. Stepien E., Pieniazek P., Branicka A., Bozek M. Chlamydia pneumoniae infections-diagnostic methods // Przegl.Lek. 2002. - Vol.59, No 3. - P. 142146.

158. Stratton C.W., Sriram S. Association of Chlamydia pneumoniae with central nervous system disease // Microbes.Infect. 2003. - Vol.5, No 13. - P. 12491253.

159. Suchland R.J., Geisler W.M., Stamm W.E. Methodologies and cell lines used for antimicrobial susceptibility testing of Chlamydia spp. // Antimicrob.Agents Chemother. 2003. - Vol.47, No 2. - P.636-642.

160. Sykes J.E., Studdert V.P., Anderson G., Browning G.F. Comparison of Chlamydia psittaci from cats with upper respiratory tract disease by polymerase chain reaction analysis of the ompA gene // Vet.Rec. 1997. -Vol.140, No 12.- P.310-313.

161. Szeredi L., Schiller I., Sydler T., Guscetti F., Heinen E., Corboz L., Eggenberger E., Jones G.E., Pospischil A. Intestinal Chlamydia in finishing pigs // Vet.Pathol. 1996. - Vol.33, No 4. - P.369-374.

162. Tabrizi S.N., Lees M.I., Garland S.M. Comparison of polymerase chain reaction and culture techniques for detection of Chlamydia trachomatis II Mol.Cell Probes. 1993. - Vol.7, No 5. - P.357-360.

163. Takashima I., Imai Y., Itoh N., Kariwa H., Hashimoto N. Polymerase chain reaction for the detection of Chlamydia psittaci in the feces of budgerigars // Microbiol Immunol. 1996. - Vol.40, No 1. - P.21-26.

164. Tam J.E., Davis C.H., Thresher R.J., Wyrick P.B. Location of the origin of replication for the 7.5-kb Chlamydia trachomatis plasmid // Plasmid. 1992. -Vol.27, No 3.- P.231-236.

165. Thomas N.S.&.C.I.N. Revised map of the Chlamydia trachomatis L1/440/LN plasmid. // Proceedings of the 2nd meeting of the European

166. Society for chlamydial research. Bologna Italy: Societa Editrice Esculapio, 1992.-P.42.

167. Thomas N.S., Lusher M., Storey C.C., Clarke I.N. Plasmid diversity in Chlamydia II Microbiology. 1997. - Vol.143 ( Pt 6). - P. 1847-1854.

168. Thompson S.E., Washington A.E. Epidemiology of sexually transmitted Chlamydia trachomatis infections // Epidemiol.Rev. 1983. - Vol.5 P.96-123.

169. Tong C.Y., Sillis M. Detection of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci in sputum samples by PCR // J.Clin.Pathol. 1993. - Vol.46, No 4. -P.313-317.

170. Tuuminen T., Palomaki P., Paavonen J. The use of serologic tests for the diagnosis of chlamydial infections // J.Microbiol.Methods. 2000. - Vol.42, No 3. - P.265-279.

171. Uyeda C.T., Welborn P., Ellison-Birang N., Shunk K., Tsaouse B. Rapid diagnosis of chlamydial infections with the MicroTrak direct test // J.Clin.Microbiol. 1984. - Vol.20, No 5. - P.948-950.

172. Wang S.P., Grayston J.T. Chlamydia pneumoniae elementary body antigenic reactivity with fluorescent antibody is destroyed by methanol // J Clin.Microbiol. 1991.-Vol.29, No 7.- P.1539-1541.

173. Watson M.W., Clarke I.N., Everson J.S., Lambden P.R. The CrP operon of Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae II Microbiology. 1995. -Vol.141 (Pt 10) P.2489-2497.

174. Watson M.W., Lambden P.R., Clarke I.N. Genetic diversity and identification of human infection by amplification of the chlamydial 60-kilodalton cysteine-rich outer membrane protein gene // J.Clin.Microbiol. -1991.-Vol.29, No 6.- P.l 188-1193.

175. Wawer C., Ruggeberg H., Meyer G., Muyzer G. A simple and rapid electrophoresis method to detect sequence variation in PCR-amplified DNA fragments // Nucleic Acids Res. 1995. - Vol.23, No 23. - P.4928-4929.

176. Wessely S., Mall G. No detection of Chlamydia pneumoniae in normal and atherosclerotic femoral arteries by polymerase chain reaction (PCR)-an autopsy study II Z.Kardiol. 2003. - Vol.92, No 3. - P.229-235.

177. Wong Y.K., Gallagher P.J., Ward M.E. Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis // Heart. 1999. - Vol.81, No 3. - P.232-238.

178. Yoshida H., Kishi Y., Shiga S., Hagiwara T. Differentiation of Chlamydia species by combined use of polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis // Microbiol.Immunol. 1998. - Vol.42, No 5. -P.411-414.

179. Yucesan C., Sriram S. Chlamydia pneumoniae infection of the central nervous system // Curr.Opin.Neurol. 2001. - Vol.14, No 3. - P.355-359.

180. Zhao Q., Schachter J., Stephens R.S. Lack of allelic polymorphism for the major outer membrane protein gene of the agent of guinea pig inclusion conjunctivitis (Chlamydia psittaci) II Infect.Immun. 1993. - Vol.61, No 7. -P.3078-3080.

Информация о работе

Эйдельштейн, Инна Александровна
кандидата биологических наук
Смоленск, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка молекулярно-генетических методов для выявления и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы