Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция функционирования промотора протоонкогена C-FOS в клетках линии тератокарциномы мыши F9

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция функционирования промотора протоонкогена C-FOS в клетках линии тератокарциномы мыши F9"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

I

На правах рукописи

КИСЛЯКОВА Татьяна Витальевна

РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПРОМОТОРА ПРОТООНКОГЕНА С—Р08 В КЛЕТКАХ ЛИНИИ ТЕРАТОКАРЦИНОМЫ МЫШИ Р9

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1993

у/ '

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ дифференци-ровки клеток Института цитологии Российской Академии наук.

Научный руководитель — доктор биологических наук В. А. Поспелов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л. И. Корочкин; кандидат биологические наук О. И. Подгорная.

Ведущее учреждение — Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета.

Защита состоится 1993 г. в в часов

на заседаний Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан

1993 года.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Л. Н. Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

атаадьшсХА-ОРййлгти_Реализация клеточных программ пролиферации, дифференцнровки и гибели, составляюиих суть развития любого многоклеточного организма, происходит на основе дифференциальной экспрессии гзчокв. Непременный этап регуляции активности генов - инициация транскрипции, Смысл этого этапа состоит в регуляция функционирования комплекса РНК-лслнмеразы ДКК-связываюгшми транскрипционными факторами, специфически вэа-имодействующими с р&гуляторными элементами промотора, которые могут находиться на разном расстоянии от сайта инициации транскрипции (места сборки комплекса РЯК-полимеразм) (Hitch's 11, Tj i an, 1S89; ЛИ, Tjían, 1992 ¡ Pabo, Sauer, 1992).

Изменение транскрипционной активности генома в ответ на внешний стимул происходит в соответствии с типом клеток, на которые действует этот стимул. Поэтому специфичность транскрипционной регуляции - едва ли не самкй интересный.аспект ее изучз-яия. Особенно привлекательным предстагзляется исследование регуляции генов, продукты которых вовлечены в контроль разнообразных клеточных процессов и разных клеточных типах. Лрогоонкогеи c-fos - один иэ таких генов. Его продукт функционирует как компонент транскрипционного комплекса АР-1, который в разных типах клеток выступает как регулятор нормальной пролиферации к днффв-ргнцировки, а также может участвовать в процессе неопластической трансформации (Angel, Karin, 1SS2). Полифункциональность продукта гена o-fos определяет сложную и строгую регуляцию его экспрессии, в частности, осуществляющуюся на уровне транскрипции, В большинстве типов клеток транскрипция протоонкогена c-foa подавлена, но может быть быстро и кратковременно индуцирована большим спектром внеклеточных стимулов по типу индукции транскрипции "гонов раннего ответа".

Вполне естественно предположить,' что механизмы контроля базальноя экспрессии протоонкогена o-fos, а также способы его активации различаются в зависимости от типа клеток и функции продукта гена o-fos. ИктергсноЯ модельной системой для изучения специфичной регуляции транскрипции протоонкогена o-fos служит линия эмбриональной карциномы (тератокарциномы) ниши F9, способная к. диффсренцировке in vitro под влиянием химический индукторов. Экспрессия гена o-fos в недифференцированно* клет-

ках этой линии подав?ена, а в дифференцированных в направлении париетальной эндодерму otfa находится на високом уровкг и имеет конститутивный характер (Lockett, Sleiah, 1987). При »том ря£ экспериментальных данных указывает на то, что продукт гена 'e-fos относится к числу белков, участвующих в перекл»чении клеток ?6 на путь диффвренцировйи (Kuller, Sagner, 1SS4; Edwards et al,, 1866; Oshima et 6.1., 1360}. Поэтому механизм, поддерживающий транскрипцию гена o-fos в недифференцированных клетках F8 на низкой базаяьнои уровне, интересен И с точки »рения изучения клеточной специфичности регуляции Промотора этого гена, и с точки зрения изучения молекулярных основ дифференшровки.

состоаяа в том, чтобы выявить специфические особенности регуляции транскрипции протоонкогена c-foe в клетках линии тератокар-циномы пиши F8, В соответствии с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1.Описание клеточной модели: отработка методики культивирования клеток эмбриональной карциномы миши линии Е8 и индукции их дифферекцировки в направлении париетальной эндодермы! сравнительное изучение фенотипических характеристик недифференцированных и диффзрвнцированиых клеток линии ES.

2.Изучение функционирования промотора протоонкогена o-fos, , находвцегос» в составе индикаторной плазмиды fosCAT,1 в клетках яинии FS & различных экспериментальна условиях.

3.Анализ ядерных экстрактов клеток »ибрионадьной карциномы, линии F8 методом ретардации олигонукяеотидных проб в полиакри- ■ ламиднон геле с цель» выявления ДНК-свйаивак«их белков (или их . комплексов) - вероятиик участников рвгулйцин активности o-foa-npoMojopa в этик клетках.

tt&amaa нйейзпа.и.^аучна-практичаскаа иеинасль passta...Работа содержит новые данные, . касашиеся особенностей регуляции функционирований промотора протоонкогена с-Соа в клетках линии тератокарциномы мыши F9.

Показано, чтв промотор протоонкогена с-£ов в недифференцированных клетках F9.находится под негативным контролем со сто-, роны короткоживуиих белков.

'Обнаружено, что эти белки не связываются непосредственно с ] промотором, а негативно контролируют функции транскрипционных факторов, его активирующих, а именно, белков, способных вэаимо-

действовать а последовательностями регуяяторны» элементов« DSB, ТЯВ, CRB. Эти белки выявлены в ядерник экстрактах недифференцированных клеток F9 как образующие специфические комплексы с соответствующими оаигонукЛйотидными пробами в условиях ретардации й геле.

Таким обраа»« впервые показано, что низкий базальный уровень экспрессии Лромотора гена e-tos в недифференцированных клетках ?9 обусловлен не отсутствием транскрипционных активато-ровj а присутствием короткоживуших белков, которые негативно контролируют фуяяцив активаторов,

Показано также, что промотор протоонкогека o-fos в недифференцированных клетках Ffl не активируется агентами, которые В других типах клеток индуцируют экспрессию этого гена как "гена раннего ответа"; индукция диФФеренцировки клеток F9 ретиноевой кислотой и днбутирил-цАМФ является Физиологическим способом активации промотора гена c-fos в этих клетках, Этот факт, а также то, что обнаруженные закономерности негативного контроля промо-<ора гена o-fos специфичны для недифференцированных клеток F9 позволяют предположить значение этих закономерностей для поддержания недифференцированного состояния этих клеток.

Полученные данные углубляют поникание нормальной функции протоонкогена c-fos, . механизма регуляции его транскрипции и молекулярных основ диФФеренцировки. Материалы диссертации используется в лекционном спецкурсе кафедры эмбриологии Санкт-Петербургского Государственного университета "МолекУляр-но-генетические основы' биологии развития".

. йщшДаляя^\&й£1Ь__Материалы диссертации докладывались на двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1ЭЕ9), на совместном советско-финском симпозиуме "Signal transduction and cell differentiation" (Суздаль, 1991), на совместном советско-британском симпозиуме "Структура и Функция генома" (Лондон, 19Я1), на семинарах в Институте цитологии РАН. ;

Су^ЛЛкашии_Ло теме диссертации опубликовано 4 работы.

Сйй£М_Ей&Ш1^_Диссергаиия изложена на ,стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов ir методой исследования, результатов, обсуждения, выводов и' списка литературы, содержащего названий. Работа иллюстрирована рисунками и одной таблицей.

МАТЕРИАЛЫ ¡Í МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служили клетки линии тератокарциномы мыии F9 из Банка клеточных культур Института цитологии Российский Академии наук.

культивировали в среде DMEM (Qlbco) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крови коров на пластиковых чашкам Петри, покрытых желатином (0,1* водный раствор желатина, Sigma). Культуру пересевали каждые двое суток с исходной плотность» посева не более 5GOO клеток, на кв.см. Индукцию диФФгркнцировки в направлении париетальной эндодермы проводили по методу Стрикланда с соавторами (Strickland et el., 1078). Для этого клетки высевали в дозе 5000 клеток на кв.см и через сутки меняли среду на свежую, содержащую 1 i'H ретиноеьой кислот (РК) (Sigma). Затем меняли среду кяхдыг двое суток. На четвертые сутки кроме РК в среду добавляли 100 иН дибутирил-цДМФ (дб-цАМФ) (Serva). Общая продолжительность обработки индукторами составляла в разных опыта» е-10 суток.

кия маркера клеточной поверхности недифференцированных клеток reparo карцином гликопротеина. SSEA-1 использовали моноклональные , антитела TEC-Q1 (Dr&ber, Рокоспь, 1984), лыбезко предоставлении« д-ром П.Драбером. Для построения кривых роста клетки сеяли в исходной плотности 5000 на кв .см и ежесуточно подсчитывали, количество клеток. На отрезке времени, соответствующей логарифмической фазе роста культуры, определяли время удвоенип популяции (Shaeffer, 1978). Насыщающую плотность определяли как максимальное число клеток на кв.см поверхности после завершения логарифмической Фазы роста культуры. Исследование распределения клеток по содержанию ДНК проводили с помощью Проточного цитоф-люоримегра (Розанов, 1S87). Определение величины эффективности . клонирования клеток на субстрате проводили, высевая 100 клеток на чашку плоцадью 20 кв.см, и через 7-8 суток подсчитывали долю, которую составляло число выросших клонов от числа посеянных. клеток. Оценку эффективности клоннроьания клеток в полужидком 'afape проводили но методу Ыякфврсона-(Mnopiierson, 1073).

Анализ .экспрессии индикаторных плазмид. Трансакцию ллаз-иидной ДНК в клетки проводили кальций-фосфатным способом

(Поспелова, Í88t). йнаяиз ччгнвнас+ч проекта репортерного гена ^ЧорямФвникодяцянлтрансИРаэЧ <САТ) провалили методу Горман (Ooiriatn. 1998) чврз* 48 часов после трамсфенцйи ■ Для этого из ТраНгфвцнрованны* кяе-Гон палучаян белковые экстракты методом а»нара*нйиНик-отт*и»*нмя » o,2ím трис-HCi, рН 8,(3, тем к« буфером уравнивая« ¿¿Держание se.nw» в провч*, определенное rfo Брвя-форщг (Bradfeíd. 1983) и проводили реакцию апеллирования с'^ -хяораНФвнУкоя». Затей вкотрвгировали ее» его формы »тияацвта-том, подвергали проёы весходяи^й тонкослойной хроматографии и определяли доли ацетидирвванного клорамфеиикояа' после высушивания яроматографцчвокой пластинки н экспонирования ее с рентгеновской пленкой. 8 некоторых ¿лучаян проводили дот~гибридизаиию РНК т$анефвцйройаннь« «легок, выдвлейноп по методу Вирнбойма (Blfnboin, 1800), о меченый Р^^Фраг ментом гена CAT.

Toa- Ядерные экстракты получали по методу Шрайбера о сойвт. (Sehreiber et al., 1989) и «ранили при -70JC. содержание белка в проба* уравнивйяи, определяя его по методу Брэдфорда (Bradford, 1983). В качеств® меченых радиоактивным фосфором проб использовали синге*ически8 двуцепочечные олигонуклеоги'ды, со**ряаийе последовательности злемента двойной симметрии o-íоя-npoMafopa DS8 (-317;-288), цпМФ-зависиМого элемента o-íoS-промотора СВЕ (-62Í-54), последовательность ТРй-зависимо-to «лейвнта ТЙВ иэ промотора гена йоллагенаэы И последовательность сайта связывания транскрипционного фактора H2F иэ промотора протоонкогвнк o-ftVo. Раакиига ДНК-евйзывания проводили при комнатной температуре, используя в качестве неспецифического конкурента polyA-jolyU-cortojWMep. Образовавшиеся ДНК-белковые комплексы отделяли ot свободной меченой прозы, путем электрофореза реакционной смеси 6 4Х полиакриламнднсм геле, благодаря их снйязнноп электрофоретичсскоИ подвижности (метод ретардации в геле). I

ОСЯОВ1ШЛ РЕЗУЛЬТАТЫ II ИК ОБСУЖДЕНИЕ

8анды)и-1л_основных свойства

характеризуют клетки 9М<зрнонажьной харЦиномй как модельннй объект. Это их недиффергнцировздность, коррелирующая с признаками опухолевого Фенотипа, к способность к дпфф^реииировке, коррели-

• - в -

рующая с нормализацией (Martin, 1302). В этой части работы на« предстояло выяснить, обладают ли этими свойствами имеющиеся а .нашем распоряжении клетки линии тератокарцнномы мыши F8.

Для индукции диФФёренцировки клеток эмбриональной карциномы линии FS мы использовали известный способ обработки растущей в моносяое культуры этих, клеток ретиноевой Кислотой (PK) 1 uM) и дибутирид-цйМФ (яб-цАИ5 100 иМ); при таком способе клетки дифференцируются преимущественно в направлении париетальной эндодермы (Strickland et al., 1880).

К выбранннм нами для анализа фенотипическим признакам недифференцированных и дифференцированных клеток линии ÏS относятся изменения морфологии клеток; экспрессия поверхностного антигена клеток эмбриональной карциномы глнкопрогеина SSEA-1 (stage specific embryonic antigen); ростовые характеристики время удвоения, насыщающая плотность популяции и распределение клеток в популяции по Фазам клеточного цикла; способность клеток к размножении в полужидком агаре; а также способность клеток к пролиферации после пересева в клональной и высокой плотностях .

Б.наших опытах недифференцированное клетки F8 существенно отличались по фенотипическим характеристиками от клеток, обработанных в течение 8-10 дней индукторами дифференцировки. Клетки, прошедшие обработку PK и дб-цйКФ согласно общепринятой схеме, имели выраженные отличий в морфологии к не экспрессирйвали йа своей повёрхности маркер стволовых клеток гликопротеин SSEA-1. Лифференцирйвка сопровождалась утратой признаков опухолевых клеток: способности неограниченно долго "размножаться в культуре, и способности эффективно размножаться 'в кдональном посеве на (субстрате и в полужидкой среде. Изменение ростовых характеристик клеток и их распределения в популяции по фазам клеточного цикла в ходе обработки индукторами.говорит о прекращении пролиферации и выходе из клеточного цикла. Основным ре~ - эультатсм сравнительного изучения фенотипических признаков недифференцированных и дифференцированных клето-к линии F8 мы считаем совпадение полученных нами характеристик с данными литера-, туры, полученными на этих клетках разными авторами в аналогичных ' условиях (Kuff, Fewell, 1880; Moore et al., 1986; Huraiiatsu, 1B84; Greif, De Lu об, 1888; Sol.ter, Xnov/les, 1Э78; Linder et al., 1081; Rodriguas et al.,'lS8b; Stïickland, 188i;

- f -

А.

-íf-

•711

DSK PAP

CRH TATA

SRB

Б.

гтч

? 5 . i i

1-33 ПРОМОТОР АКТИВИРУЕТСЯ

RA + dh-cAMP

'rabera ства.

1 2 3 4 3.

ПР CMOTDP НЕ АКТИВИРУЕТСЯ

?ис.1. fl.Схема промотора протоон'когена c-fos в индикаторной тлазмиде fosCAT. SSE' - сывороточный регуляторНЫй элемент, :остояций из D3E - элемента двойной симметрии и FAP - AP-1-по-10бвого элемента; CRB - цДМФ-эавнсимкй элемент. В.Влияние обработки индукторами дифференцирован на уровень сйг-активност'и 5 клетках F8, трансфецированких плазмидой fosCAT. 1 - недифференцированные клетки F9; 2 - клетки, обработанные ратиноевой с и с л о то й з течение 48 часов после транс фикции,- 3 - дифференцированные клетки г9 (обработанные ретЯноевой кислотой (RA) и ;ибутирил-цММ (db-cAMP)) . Здесь, и далее за единицу (ось >рдинат) принят уровень САТ-активностИ, наблюдаемый в интакг-шх недифференцированных клетках F9, трансфецированных плазми-' \ои fosCAT. С.влияний ростовых факторов сыворотки, форболового >фира и Дб-цАМФ на уровень САТ-актнвности п недифференцированных клетках F9, трансфецированных плазмидой fosCAT. 1 - 10Х гыворотки; 2 - 0,5Х сыворотки (голодание)! !3-5 - стимуляция ¡ослс голодания: 3 - форболовым эфиром (ТРЛ)! 4 - ZOJi сыворот-:и (FCS); 5 - дб-цйКФ (db-oAMP).

а

- а -

Нагип, 1982). Главный вывод иэ ®той чрсти р^зотм состоит в том, что имеющаяся в наше* распоряжении линия «рвток»рциио*И мивги Ев обжадвет оснвйяими свсйстцани каете»: кар-

цяноии и нохет Ныть иейользовакЛ к Качеств» »¡«еп*>»11»1тЫ,ной моде*и.

Услоуця укт^ааиии цдоротор* протоон^огвна у кртка*

ЛАНЧИ теезт6у,арцинг?»ц.1 И*** в »НД»! ЧТО >р08Ни ¡рефля-

ции экспрессии йрйтоонкогенй в»*ов » плетка* Р9 могут 0нт1> многообразна, ми сосредоточилась на изучений закономерностей функционирований его прокотор», н а и о Д о с* в сов*айв индикаторной плазшды ГоаСАТ. ЭтА пяаэкида бкмй Любезно Г|рбйос»а»*ен& Р.Трайз^аном и содэрааяя еаитеёиальНЫй ген САТ под контролен промотора протоонкогена е^ав Ч«яо8еКЬ (-^711) +ЗВ. Н.П,) (рис.1 А). Плазмиду ?овСАТ врененко траНефёцироьаяи в к»***« в виде кальций-фосфатного преци^^ата, й 4атен обра&атййаяи клетки различными агентами, ко торне Но гут »Лйять >|Й . функций промотора c-foa, о чем суйили по активности ф^риен^» САг в экстрактах из трансф«ци£>ованни* клеток.

В. интактных недифференцированных йл»тк»*'18 ьроцо^ор г«иа с-Гов сообщал пяаэмиде {оеСАТ низ кия - бЛзаяьМЫЙ уровень экспрессии, который сильно возраста* при траНйфекцни МаамИДоЦ ¿овСАТ дифференцированных клеток (т.е. обрабоганйм* £»к И дб-цАМФ с течение 6-7 сИок перед транс&»кнййй) (рис. 1В). Обработка недкфФервкцирояанных клеток ргтиноевоо кислотой в тачвйие, 48 часйб после трансакций не приводила к аиачит*41»нс>м^ нии САТ-активкосгн (|?йе.1В>. Танин .оёрааом; актмваЦйй промотора c-foэ происходит на Поздней стадии диффергнцировки илбТок что соогветсФвует литературный данный о« »кеиресейй гена 6-?ев

ы

в этих клетка* CLook«ti« 81е1*Ь, 1867).

Следующий вопр&с - ив*но. ли активировать Промотор Г«на с-гоа в недифференцированный мет*аК ?8 как йроко1ор Нйа "раннего ответа'^

Для исследования инАуцибеЛьноетн с-1ов-проиотсэра кйк промотора гена "раннего, отвёть" мы применили общепринятую й гаки*, опита* модель сывороточного голодания. В качестве потенциальны» активаторов ?оа~ирожтра исполЬзоЬалй агенты, эвпускаюийе основные пути передачй сигнала в кйетке: форболовый 9ФИр (ТРА), активатор фосфоинозйтольного пути» эавНсйщего от про^еинкиназы

С; днвугнрц*-ЦАМ^. активатор протеиякиназы А; и Фетвльну»!сыворотку крови, вктквиргмму» Путь, яавяеящий от рецепторов факторов роста.

Промотор прогоонкогвна o-foe содержит сайты связывания транскрипционных факторов, ДЙК-связывакадя и транс-активацион-иая способность Kotopwtc напряму» регулируете« через эти пути передачи сигйвл» (рис,lft). Главная мишень активации o-foa-npo-мотора сывороткой й Форболовыи эфиром - элемент SRB (serua responaive element) (Sohontal et nl., 1980; Xonii et al., 1009; Shew et »1., 1088) Lucibello et al., 1991)» который состоит из т.н. алемента Двойной симкеТрии DSE (-9201-399) и непосредственно примыкающего к нему злвиенгл FAP (-гвв;-2вд). С »««нентом dse специфически взаимодействует сивороточно-зависимый транскрипционный Фактор S8F и р*д дополнительны* белков (treisran, 1S92). Последовательноеть Элемента ТАР имеет гомологи» одновременна <i конЫнсуеными. последовательностями регуля-торных элемейтов TRS (TPA-response elsnent, сайт связывания транскрипционного комплекса fiP-1) и CRH (cAMP-responae elenent, сайт связывания транскрипционного Фактора CREB). Кроме того, в промоторе гена c-fos есть собственный элемент CRB (-62;-34), принимающий участие в регуляции его базалькой транскрипции в некоторый типа* клеток (Lucibello et al., 1S91).

Недифференцированные клетки F9 трансфецировали пяазмидрй fosCAT и на следующие сутки меняли среду на содержащую 0,5% фатальной сыворотки. Через 49 часов культивирования клеток в среде с низким содержанием сыворотки среду меняли на свежую, либо не ?од<?ржадую добавок, либо содержащую а)20Х сыворотки; 6)0.5Х сыворотки и 100 иг/мл форболового эфира; в)0,5Х сыворотки и 100 чМ дб-цАКФ. Через 2 - .3 часа клетки собирали и определяли САТ-активность в экстрактах. Базальний'уровень СйТ-активности в этом эксперименте слабо модулировался в результате сывороточного голодания и-последующего действия ТРА, дб-цАМФ и сыворотки (рис.1В); ко мы никогда не наблюдали в этих опытах той степени активации экспрессии плазмнды fosCAT, какую наблюдали при диф-Ференцирозке клеток F9. •

Специфика действия' агентов, активирующих основные пути проведения сигнала в клетке и способных вызвать моментальную it кратковременную транскрипцию гена" с-fos/ зависит от типа клеток, на которые они действуют. Клетки эмбриональной карциномы

ь.

линии í8 - это опухолевые клетки, обладающие способностью к автономному размножению и его аугокринноВ регуляции (Heath, Bees, 1885). Эти клетки характеризуются низким содержанием рецепторов форболового эфира и низкой активность» протекнкиназы С (Snoek et al., 1986). Что касается дб-цАМФ, то для клеток F9 это индуктор дифференцировки, способность отвечать на которой он» приобретают только после длительного воздействия ретиноьвой кислоты .(Plet et al., 1882), котя и содержат функциональную протеинкинаву ft (Kaseon et al., 1392). По нашим собственным данным скорость размножения недифференцированных клеток FS и их распределение в популяции по содержанию ДНК не зависели от содержания сыаоротки . в среде и не менялись при действии ТТА, дб-цАМФ и сыворотки после сывороточного голодания. Однако, на каком бы уровне ни осуществлялся елок активации промотора про-тоонкогена c-fos Форболовым эфиром, ростовыми факторами сыворотки и дб-цйКФ, для нас важно, что в недифференцированных клетках F8 этот промотор не регулируется через основное пути передачи сигнала.

Итак, мы выяснили, что в клетках эмбриональной карциномы " линии , F8 промотор прогоонкогена c-fas, находящийся в составе индикаторной плазмидц fosCAT, сообщает гену 'CAT низкий базаль-ный уровень экспрессии, который существенно возрастает на ста- , дии терминальной дифференцировки . В недифференцированных.клетках исключена возможность сильной активации o-fos-промотора как с помощью агентов, которые в других клеточных типах вызывают, экспрессии гена c-fos как гена "раннего ответа", так и'при ■ кратковременной обработке индуктором диФФеренцировки ретиноевой кислотой. Искодя из этих данных и Физиологии клеток í'S можно заключить, что адекватных условием активации промотора гена c-fos в этих клетках является их дифференцировка ретиноевой кислотой и дибутирид-ц/ШФ.. .

Негативный контроль Функционирования промотора протоонко-

' шш_Еа_*__Пос,яедш!й рывод позволил нам предположить, что низкая, базаль'ная активность промотора протоонкогена c-fos в недифференцированных клетках F8 обусловлена специальным механизмом негативного контроля. Чтобы выяснить, не присутствуют ли в недифференцированных клетках F9 белки,.негативно регулирующие актив- 1

- и -

ность c-fо&~промотора, ми обрабатывали клетки, трансфецирован-вые плазмидой fosCAT, ингибитором синтеза белка циклогексимидом. Циклогексимид (50 мкг/мл) добавляли в среду на четыре часа, а потом меняли ее на свежу», не содержащую ингибитор. При этом синтез белка, определяемый по включению НЭ-лейцина сразу после обработки, -снижался на 902. Оказалось, что такая обработка существенно повышает уровень Ферментативной активности CAT (рис.2Д), ч?ку (по результатам дот-гибридизации) соответствует увеличение количества мРНК гена CAT в траксФецированнш клетках . В следующем варианте опыта мы обрабатывали циклогексимидом недифференцированные клетки F8, котрансфецированные.плазмидой fosCAT и 6-кратным избытком плаэмнды pUC19, содержащей последовательность промотора гена a-fos (-711; +28) (плазмида pfos). Введение избытка плазмиды pfos приводило к уменьшению как ба-зального, так и индуцированного циклогексимидом уровня САТ-ак-тивности (рис.2Л).

Из результатов этого эксперимента можно заключить, что обработка клеток циклогексимидом и блок синтеза белка приводят к исчезновению в недифференцированных клетках F9 короткоживуиин белков-репрессоров, негативно влияющих на экспрессию гена CAT, находящегося под контролен c-fos-промотора. Поскольку трансфек-ция вместе с плазмидой x'osCAT избытка o-fos-промотора в плаэмн-де, не содержащей репортэрного гена, "разбавляет" эффект возрастания САТ-активности в результате действия циклогексимид», мы считаем, что ргпрессоры действуют именно на уровне регуляции Функции промотора. С другой стороны, тот Факт, что введение избытка пл»змиды pfos само по себе не приводит к повышению САТ-активности, о.эначаат, что репрессоры не взаимодействуют с промотором непосредственно .

Ми использовали плаэмнды, содержащие последовательности D3S и CRK c-fos промотора и последовательность TRE из промотора гена коллагеназы для котрансфекции с плазмидой fosCAT в недифференцированные клетки F8 в качестве конкурентов за белки, ко-торие могут регулировать Функцию промотора гена a-fos в этих клетках , При котранефпк'.шн плаэмнды fosCAT а избыточными количествами лдазмяд, сод<гр«а'дих однокопийниа последовательности D3K, CRE или ТлН, снижался и базальныП, и индуцированный циклогексимидом уровень CAT-активности (рис.ЗБ). Однако, степень сннженил САТ-активности, индуцированной циклогексимидом,■раэли-

Го»ОАТ

Б.

йжСАТ

^ааСЛТНбхТКЕ ГояСАТ+бхРЗВ й>СЛТ+6хСЬВ

мЩ ИШ,

;||мй!;!

ь

■ " ' 4 . .

' 1

Рис.2. А.Обработка циклогексимидом недифференцированный клеток £9, трансфецировамшх плаэмидой ГобСАТ, • приводит к активации с-гое-промотора. 1,2 - трайсфвкция пдазмидой <овСАТ( 3,4 -котраксфвкция плазмидаии гойСАГ и р*о»Г 2,4 - обработка траЯсфецированних кяеюк цикяогексимидом (ЦГИ). Б^Вдиание конкурентных ПлаэмИд, содержащих последовательности регудяторньц! элементов ТЬЯ, СШ и на уровень циклогекеймиАИйй актива-

ции экзогенного с-Гав-промотора в недифференцированных клетка* 1,2 - трансфекция плаэмидой 1овСАТ( 5,4 - котрансфекция ГовСАТ и вхТЙВ1 8,8 - котраясфекция ;ГсвСАТ и 6хОЗБ{ 7,6 - кот-•.рансфекция *оаСАТ и бхСЙВ. 2,4,6,8 - обработка тране*ецирован-. них клеток циклогексяиидок (ЦГИ).

чалась в зависимости от введенной конкурентной плазмиды. Наиболее полным это снижение было в случае котрансфекции плазмиды fosCAT с плазмидой, содержащей регуляторный элемент DSE, а наименьшим - при использовании в качестве конкурента регуляторного элемента TRE.

Отсутствие повышения уровня экспрессии плазмиды fosCAT при котрансфекции с избыточными количествами плазмид, содержащих регулкторные элементы D3E, TRE и CRB, говорит о том, что в этих опытах не происходит конкуренции ме,кду o-fcs-промотором и указанными последовательностями за непосредственное связывание с негативными факторами. Однако, очевидно, что по крайней мерз между сайтами DSE и СКВ, с одной стороны, и c-fos-промотором, с другой стороны, происходит конкуренция за позитивные факторы, активирующие c-fos-промотор при действии циклогексимида. Активация o-fоа-прокотора происходит во время действия циклогекси-■мида, т.е. не требует синтеза белка de novo. Значит, позитивные Факторы транскрипции, обуславливающие в этой экспериментальной ситуации экспрессию плазмиды foeCAT, должны предсуцесгвовать в интактных недифференцированных клетках F9 в неактивном состоянии. Тогда вполне вероятно, Что неидёнтифиЦированные белки-реп-рессоры, с которыми мы имеем дело в нашим опытах, обеспечивают эту неактивность путем пост-трансляционных модификаций, ¡'сходя из многочисленных литературных данных о разнообразных способах регуляции' активности транскрипционных факторов семейств АР-1. и CREB и фактора 3RF, мохно предполагать как образование, с ними транскрипционно-неактивных комплексов, так и другие механизмы репрессии, например, фосфорилирование и дефосфорилирование (Luoibello et al., 1930; Boyle et al., 1991; Ofir et el,, 1390; Auwerx et al., 1081 { Hskabeppu, tfatliana, 1991; Treiaman, 1982).

■Итак, s недифференцированных клетках F9 промотор протоон-когена c-foe находится под негативны!« контролем корогкожипущих рвпрессоров. Они нз сиязаны непосредственно с промотором, а каким-то образом определяют неахтианость транскрипционных факторов, . првдсуцеегвухдах в клетках и обеспечИваюинх активацию o-fos-npoMOTOpa При действии циклогексимида.

Вопрос о том, как именно негативна регулируется тране-ак-тивациониая способность факторов ,АР-1, CREB и SRF » недифференцированных клетках F8, подлежит выяснению. Однако даже не зная Механизма репрессии, можно утверждать, что обнаруженные нами

особенности регуляции промотора гена с~£ов в недиффоренцирован-пих клетках J?ö специфичны для этих клеток. Б самом деле, негативный контроль функции o-îоа-прояотора - распространенное явление, однако в большиистае исслодованннх типов'клеток он подразумевает возможность транскрипционной активации гена c-fcs как гена "раннего стзста," (Angel, Karin, 1692; Ransone, Veroa, 1930); этого не происходит в недифференцированный клетках Р9. Фгномен сильной активации транскрипции гена о-Гоо цик.тогексими-дом тоже хорошо известен ((rieeriberg et el.,1888), однако это не активация еазальной транскрипции, которую мы наблюдали в недифференцированных клетках' FS, а т.н. супериндукция, т.е. предотвращение негативной авторегуляции промотора, в норке непременно следующей за его активацией при "раннем ответе".

В клетках злокачественней линии эмбриональных фибробластов Крыс EraslO, трансформированных парой онкогенов Е1А Ad5 и ,Ha-ras; как и в недифференцированных клетках F9, функция e-fоь-промотора подавлена » еэ невозможно активировать Форболо-вым эфиром, дб-цйМФ и ростовыми факторами (Поспелова и др., 1987; 1691). Однако, это клетки с принципиально другой Физиологией, и мы не подучили в ник эффекта циклогексимпдной активации баэального уровня экспрессии плаэмиды foeCAT а эксперименте, аналогичном поставленному не клетках F9. В недифференцированных клетках линии F9 циклогексимидная обработка активировала экспрессию но только .трансфецпрованной в них г.лазмидц fosCAT, на и плаэмид,. в которых ген Cfi'f находился под контролем изолированных регуяяторньи элементов ОБЕ, TBS и CRE. В линии же EraülU картина была совсем • другой. Обработка цикиогексимидом этик клеток, трансфецировакних плазмид&у.и fosCAT, TRECÄT, D3ECAT или CREC/VT, либо к tí оказывала эффекта на их экспрессию «.foaCAT), либо подавляла es- (TRECAT и DSECáT) и лись ь случае tílU-Crt? - незначительно стлмулкровада.

Ù, наконец, результат конкуренции in vivo g сочетании с ?¿i-iit>uTKOft. циклогексимидом cob*pb«khq уникальны для нсдиф;>ерен-»ирчП.аунш); клеток Fb. Конкурентно in vive проводили разные ав~ Тч;..у на клетках .Ч1ИЗТЗ как модо/и клеток, гд<; ген o-foe Функционирует к.я; ген "раннего cxt:<iTft" ü, сзотбстст^е-цно, его •г; «ikckí итоил подавлена, >ю жжет бить нцдшироаанп агентами, элг.уокгшаиш! ОСНОВКЫС nyvtl ЩОГ.О^НИЛ CUfuA.U. D ЭТИХ экспери-Ki-tiT4X получали, просто ахтиьлпю с-1'рк-прз№Тор.с.. пр» кот-

рансфекции плазмиды fosCAT с избыточными количествами плазмид, содержащих полный промотор иди его фрагмента без репсртерчого гена (Sassone-Cofüi, Versa, 1S87; Sohontal et al,, 19S9; Поспелова и др. , 1990), а результаты трактовали как "титрование" репрессоров. В нашил опытах на недифференцированных клетках F9 происходит не титрование репрессоров, а титрование активированных в результате действия цмклогексимида. факторов, позитивно регулирующих транскрипцию, зависимую от c-fоз-промотора.

Специфичность обнаруженных особенностей негативного контроля fое-промотора для недифференцированных клеток ?3, гот Факт, что индукция дифференциревки - единственное Физиологическое условие "снятия" этого контроля, а также литературные данные о роли продукта ггна a-fo« в дифференцчравке клеток F9 (Müller, Мазпаг, 1364; Edwards et al., 1338) заставляют предположить, что нвгатиачлгс регуляция промотора гена o-foa суцр.ст-■венпа для поддержании о;ойсти клаток эмбриональной карциномы.

В трех кллточних моделях: минимально-трансформированных Фибробластах Ч1НЗТЗ, злокачественных трансформантах BraslO и способной к диффвренциревке лннии тератокарциномы F9 промотор протоонкогена o-fos находится под негативным контролем. Несмотря на разную степень изученности механизмов осуществления этого контроля в каждой из трех линий, очевидно, что эти механизмы разные. Кроме того, репрессированный промотор гена o-fos в клетках NIH3T3 может бить активирован как промотор гена "раннего ответа,", в клетхаи F9 он активируется только на поздних стадиях дифференцирован, а в клетках Sr-aslO тип репрессии промотора гена c-foss, по-видимому, не подразумевает вообще никакой ин-дуцибельности. ■

Очевидно, что эти различия связаны с функцией, которую выполняет продукт гена c-fos в этих типах клеток. •В клетках ■Н1НЭТЗ при сывороточной стимуляции он участвует в реализации программы пролиферации (Kovary, Bravo, 1S92, а,б), а в клетках Е9 от него зависит экспрессия признаков дифференцировки (Müller., Wagner, 1084; Edwards et al., 19Ö8; Oshina et al,, 1990). Поэтому в недифференцированных клетках гератокарциноми должна быть строго запрещена' индукция экспрессии протоонкогена o-fos любым другим способом, кроме как со стороны индукторов дифференцировки'этих клеток, что вполне согласуется с нашими •данными (рис.1).

Если сравнивать клетки £9 и ЕгазЮ, то в данном случае мы имеем дело с двум.Ч клеточными линиями, обладающими полным набо--ром черт трансформированного фенотипа. Это отличает ик от нини-маяько-трансформированнын , клеток. Н1НЗТЭ и, по-видимому, обуславливает Нерегулируемость промотора гена о-?оа как гена раннего ответа. Однако,, трансформированный фенотип опухолевый .клеток ?9 -.регулируемый, и регуляторами здесь выступают индукторы дифференциройкиI ' коррелирующей • с нормализацией <31;г)и!1<1апс1,' .1680). клетки ?6 произошли Из плюрипотентных акб-. риональных клеток внутренней клеточной массы, способность к • дифференцировке которых; по-видимому, настолько конститутивное Их свойство,. что способно сосуществовать с опухолевым феноти-. пом. Эмбриональные же фибробласты Крысы - клетки, коммитирован-кые к определенной дкфференцировке. Их опухолевая трансформация - это,.по существу, дедиффереНцировка.

1ййИ« образом, во Есех трех рассмотренных случаях мы имеем депо с разными типами негативного контроля функционирования промотора, протоонкогена с~?ов которые находятся в соответствии с генетикой и физиологией клеточных линий, в которых . он осуществляется,. и с функцией продукта гена с-?оа,

дыдущего раздела.ясно, что транскрипционные Факторы, участвующие в активации fos-np&HoTopa> индуцированной циклогексймидом, предсущзствуют й интактньг.;- недифференцированных клетках F8. Разная степень влияния плазмид, содержащих последовательности DSE, CRE и ТйЕ, на уровень экспрессии плазмиды fosCAT в обработанных цйкло^ексимидом клетках F8 может быть связана с тем, что разные.белки, связывающиеся в условиях конкуренции in vivo с этими последовательностями, действительно, принимают разное Функциональное участие в регуляции c-fos-промотора, Однако, возможны и другие причины, например, ' разная конкурентная способность этих последовательностей, связанная с разной стабильностью ДНК-белковых комплексов. Мы исследовали взаимодействие ядерных белков недифференцированных клеток тератокар-цнномы £9 о регуляторными сайтами DS£, TRF. и CFtE in vitro - методом ретардации соответствующих синтетично г.ик олигонуклеотидов

в полиакриламидном геле. Кроме того мы использовали в качестве зонда олнгоцуклеотид, содержащий последовательность сайта связывания клеточного трянсхрипционного Фактора E2F из'промотора протоонкогена с-тус. (При дальнейшем изложений мы будем называть sty последовательность E2F - по имени фактора).

Выбор этого' зонда определялся тем, что в недифференцированных клеткак FB существует т.н. Е1Л-подоеная активность - нл-идвйтйфицйрованныв клеточные белки, функциональные аналоги белков, кодируемых раННим районом аденовирусов Е1А (leperial et al., 1884; Reichel, 1Э87; Shivjii, La Thungue, 1991). По ряду причин предполагается, что BlA-подобНая активность, являющаяся Hftpteeport недифференцированного состояний клеток F9, - важный Фактор транскрипционной регуляции дифференцировкИ этих клеток: Собственно Е1А при вирусной инфекции регулирует экспрессию клеточных и айруеныя гейов путем освобождения из комплекса с другими клеточными белками транскрипционного фактора E2F, после чего он приобретает способность связываться с ДНК и активировать транскрипцию iSagchi et &1., 1990). Среди белков, негативно регулирующих ДНК-связ!>1вакщую активность E2F, были недавно обнаружены опухолевый супрессор б.елок ВЬ, цйклин А, кинаэа cde-34 (Hevine, 1962). В недифференцированных клетках Р8 белок EiF или его эквйьаЛент также является мишенью ElA-подобной активности (Sleigh, 1692). Образование комплексов между белками ядерны* экстрактов клеток F9 и послеЛоваТвльнчетьи сайта свяаы-ваййя . транскрипционного Фактора E2F - Пока единственной критерий йссЛ<Швйний этой активности.

Прежде еевго мы подоврали условий проведения реакции Днк-связывания белков ядерных экстрактов недифференцированных клеток Г9 с указанными слигонуклвотиднымн пробами. Обычно я рйэных работах, где используется метор ретардации в геле, можно встретить разные концентрации ионов Hg в буфере для связывания - от 0»Н до 8йМ, Мы использовали две Полярные концентрации ионов M« - ОAM и вшМ.

-БеЛкй ядерным экстрактов недифференцированных клеток Р9 образует с. разными олигонуклеотидными пробами комплексы ретардации, раэние по подвижности, величине (интенсивности банда) и количеству (рисг.3). Кроме того, . для разных зондов наблюдается разная зависимость ДНК-связывания от концентрации ионов. На: связывание ■ с ' сайтом 82F совсем от нее не зависит, а наиболее

- le -

сильно зависит образование комплекса ретардации с сайтом THE. При атом содержание ионов Kg влияет только на интенсивность-банда, но никак не на подвижность иди количество образующийся комплексов. Следовательно, присутствие ионов щ в буфере для связываний мохет являться или условием образования комплекса, или его стабилизации, в,результате Чего способствует выявлению комплекса, -но не влияет на его белковый состав. Мы приняли рабочей ту концентрацию ионов при которой наблюдалось ДНК-связывание со всеми олигонуклеотидными пробами, а именно, 0ыМ. ' •

Далее мы охарактеризовали ДНК-белковые комплексы в экспериментах по •конкуренции in vitro аа- их образование между специфическими .и м&спецкфическимй синтетическими последовательностями. ' | ' • «

Мв

2+

. ЛПЕ (lii.M. йтМ

ijz:

CUE OmM 8mW

•«ai . ItsaJ Irsa

ОБЕ EZF

BmM OmM OmM BmM

¡ЫыЗ

ТПЕ: TGACTCA CRE: ' TGACGTTTA

OSe: GATGTCCATATT/lQGACATC E2F: TTGGCGGGAAAAAGAAG

Рис.3. Ретардация меченый олигонуклеотидоо ТйЕ, СИЕ, ОБЕ, Е2Р в полиакриламидном геле после образования комплексов с белками ядерник экстрактов недифференцированный клеток ?9 (схема). Связывание проводили при разном содержании ионов Мз. Стрелкой показано положат!? свободной Сне связавшейся с белками) пробы.

XRH- и СКВ-свЕ5Ш1&цца_ядй1ДЦ1^__ак-страктод_uaaiutiüiEiiiuuEür.

гомологией и могут связывать как разные, так и Ьбцие • белковые комплексы, в которые входят б'елки семейстя ftP-l и СНЯВ (Апйз1, Karin, 1S92). Мы обнаруживали отчетливый ДНК-белковый комплекс с меченой олигоиуклеотидноГС пробоя TRE в экстрактах недифференцированных клеток F9 только при концентрации ионов Кц 8шМ; образованно же ДНК-белкового комплекса с пробой CRE эффективно происходило при.оееин концентрациях Нй (рис.3). Таким образом, 'очевидно, что эти комплексы не идентичны - по составу или хотя бы По свойствам.

Это подтвердилось и при исследовании специфичности образующих комплексов в опытах по конкуренции между меченым сайтом TRE или CRE и избыточными количествами немеченых гомологичных и неГомологичных олигонуклеотидов. В первом типе экспериментов ■немеченые олигонуклеотндц добавляли в буфер для связывания, содержаний ядерный экстракт, в 5- или в 50-кратиои избытке, одновременно с меченой пробой.

Комплекс ретардации, образующийся с сайтом TRa', вполне специфичен, т.к. он исчезал уже npji б-кратном избытке немьчьно-го олигонуклеотида TRE . Однако, введение а буфер для связывания 50-кратных избытков немеченых конкурентно* олигонуклеотидов CRE, DSE и E2F также приводит к уменьшении комплекса, причем в разной степени: в большей - введение последовательности CRE, имеющей гомологию с TkS, и в меньшей - введение негомологичных меченой пробе последовательностей D33 или E2F.

В случае использования в качестве меченой пробы.сайта CRE избыток- немеченого олигонуклеотида TRE конкурировал за белки, связывающиеся с ним, точно в такой же степени, что и избыток .самого немеченого, сайта CRE. Что касается негомолстичных конкуренция, то 50-кратный избыток олигонуклеотида DSE несколько уменьшал СЙЕ-связывание, а олигонуклеотид E2F совсем не конкурировал с меченой пробой СКВ за белки ядерных экстрактов недифференцированных клеток F9.

В экспериментах второго типа проводили конкуренцию между меченым сайтом TBE или CRE и 50-кратным избытком специфического немеченого' конкурента, добавляя последний в буфер с ядерник экстрактом либо' одновременно с меченой пробой , • либо за 20 минут до ее добавления, либо через 20 минут после. Соответствен-

Последовательности сайтов TRS и CRE обладают

но, процскодила дцбо собственно конкуренция, либо предварительное насыщение конкурентом, либо вытеснение им мененрй проб*! из' комплекса. При всея способа» добавления конкурент» комплекс ретардации с неченым олигонякдеотидсм TRF, исчвэй*. Значит, »тот комплекс действительно специфичен, Но не слишком стабилен, т.к. легко выясняется убытком немеченого специфического конкурента. Что касается рВЕ-свяэм»анив, то оно в таки* опытм цс^вэаяо полностью только » случав конкуренции или насыщении. Если не конкурент добавляли > реакционную* смесь после меченого ЬлиРв-нукяеотида, то вытеснение последнего происходив ие до конца.

• Общепринягкм считается утверждение, что в недифференцированных клетках тератокарцинои не выявляется ТНЕ-овяЯываищав активность (транскрипционный комплекс АР-1) (Castres «t »1.. I88O1 luoibellq et al., 19BB), Комплекс АР-1 считается активатором дифференцировки sthk клеток к существует Представление, что его физическое отсутствие в недиФФвренцированнмЯ клетий* отчасти обеспечивает поддержание их недифференцированмости■ Согласно нашим данным, при определенных условиях (бвК Hg5 иокно получить специфичное, ho довольно нестабильное связывание балков кДерцыя экстрактов недифференцированных клеток F9 с ' олиго-йуклеотидом твв, однако, не энан белкового состава койлАекса, трудно судить о его функции, т.к. Фактор АР-1 может выть представлен набором гетеро- и Томодимзров белков-членов семейств Fob и Jun и обладать разными регулятарными свойствами (Bsrtsone, Veríia,. 19801 Angel, Kar.ln, 1992).

ванны« клеток Fg. Особенностью взаимодействий белков ядерны* экстрактов клеток Р0 с олнгонуклеотидной пробой DSE Было образование множества комплексов ретардации с разной электрафсрати-чзскоЛ подвижностью. В экспериментах с независимо приготовленными экстрактами эти комплексы выявлялись • с различной четкостью. Стабильно присутствовал на электрофореграимак только банд с нанменьиеп подвижностью, который к тону же исчезал при введении 50-кратного избытка специфического конкурента.. Поэтому' мн считаем именно его специфичным для данной олнгонуклеотидной пробы. Использование в качества конкурентов негомодогичных сайту DSE олигонуклеотидов CRE, TRE и E2F никак не влияло на образование этого ДНК-белкового комплекса. С другой стороны, добавление 50-кратного избытка немеченого олигрнуклеотида DSE прнво-

дило к уменьшению спецН'Г-ччьския комилексиь ретардашш <. .'.ачыш-ми пробами TRE, СКВ и £21'. Нескольку это конкуренции нагоиоло-гичныи последовательностей, мы предполагаем участие в ней бч-лок-евлковнк взаимодействия.

Е2Е=авлаиайШ1й_е.елкиа_11дсх)|Ш1(_ _SLKCXP.&LXGB___шиша.&одшиъок.

Сашшх-Ллетлх-^Я^-Взаимлдрлствие пдерник экстрактов недиф ; арен-цированнын клеток F0 о меченой ояпгонуклеотндноЯ пробой Ei:F ьне зависимости от концентрации ионов HS в буфере длл снизывания Приводило к образовании р.зуя комплексов ретардации с ьороио различающейся элеггрофор<?т»1ч*скои подвижность» (рис.9). Hi п комплексы отличались гаки* и по отноййпню к специфическим и неспецифическим конкурентам. При специфической конкуренции с избытком немеченого олигенукльотидд Kit оол кэкплекеп кеч» зал it, но неравномерно. Комплекс с меньшей подвижностью исчезал "быстрее", т.е. при использовании более низких кокценграцьн конкурента, В качестве негомологичник нвепецифичвеккх конкурентов меченой пробе E2F мц использовали последовательности OSE, Cl'fi п TRE. На образование вэрияего комплекса ретардаиии неспеиифи -ческие конкуренты никак не влипли. Интенсивность же нижнего банда существенно уменьшалась при введении ь буфер дчя евьлша-ния избытка синтетических олигонуклеитидоч ТЯЗ и DSE. В этой случае мы опять имеем дело с конкуренцией ««¡гомологичных последовательностей, которая может происходить за счет белик-делко-вих взаимодействий.

Упрощенно происходишь in vitro конку;.енини ме.кау негом-./-логичными последовательностями моано представить слеАуцздш образом. При введении в реакционную смесь избытка конкурентного олигонуклеотида (в на'хих опытах E2F или DSE) белки ядерного экстракта образуют с ним комплекс. Если белки, свнзывахнчнесл с присутствующей в той ¡к« смеси негоиологичнол меченой пробои имеют сродство к этому комплексу, он выступает как конкурент, a мы наблюдаем уменьшение интенсивности банда при ретардации. Возможны и другие ситуации: например, конкуренция между разными ДНК-белковыми комплексами за общий стабилизирующий Фактор. Очевидно, чго большое значение для выявления подойник ьзаима-действий in vitro имеет количественное соотношение коикурирующих проб, условия, влияющие на стабильность взаимодействия белков с ДНК, И многое другое. Тем не менее, мы считаем полученные результаты предпосылкой дли поиска и изучения регулитйрной роли

подобных явлений in vivo.

■ Известно, что в клетках разного происхождения с последовательностью D5E o-fos-npoMOTopa непосредственно взаимодействуют белки P07-SRF к Ç62-TCF и что ДНК-белковЫй комплекс, образуи-иийся в атом месте, очень стабилен и присутствует там и при активированном, и при репрессированной, состоянии промотора .(Herreta et .al., 18891 Konig, 1991). Этот комплекс - многокомпонентный и в яем обнаружена множество нг связывающихся с ДНК . белков, возможно, определяющих, клеточную специфичность регуляции c-f os-промоторе (Trsiaman, 1992). Таким образом, Весь »¡¡е-мзйт SRE (DSS+FAF) - ниоень белок-бчлковых взпимодзйствий, важнейших для регуляции функции промотора в целом. Например, такие взаимодействия, существует между комплексом АР-1 и многокомпонентным комплексом, связанным с элементом OSE промотора o-fos, в клеткак HIK3T3 и учсстзукт а негативней авторегуляции этого промотора После стимуляции сызо^откой (Xonig et al., 1Ö98).

Е опытах по конкурентному титровании ir. vivo именно после-'дорательНость DSE больше вспго влияла на уровень индуцированной циклотексимчдом САТ-акТИзносги, Поэтому тот факт, чго в наших • опятах in vitto. последовательность DSK выст-упсит как эффективны}'] НегомолсгичнШ конкурент TBS- и СКЕ-связывания ядерных белков недифференцированных клеток вполне мо.тет отражать взаимоотношения, имеющие Место in vivo, и должен быть использован для их изучения.

Что касается комплексов, взаимодействующих в недифференцированных клетках F9 с последовательностью саПта ейязыаания E2F, то до конца еже непонятно, .какие еелки н ник входят, какую они играют регулкториу» роль, к какими механизмами связаны 'с экспрессией ElА-подобной активности. Ьзаимодействия между известными белками, образующими ксмплекси с последовательностями DSE и TRE, и неизЕесгнымц белкам!, образующими нпхнип комплекс ретардации с сайтом Е2F, южно использовать для их идентификации, даже если эти взаимопс^стпия существуют только in vitro. Ведь собственно белок E2F и кчдирупо;;;,'! его геи были охарактеризованы только после того, как ста'е известна, что 32F находится в комплексе с белкам Р.ь и благедарп »тему <He*í»js, 1892).

В Ui-xom для нас важна, чго ни педучнди первичку» информацию о присутствии в нгдиф-{>«р«нцирона>1>шк клетках F8 белков, способных специфически вз-зинодеЛстнолать in vitro с олпгонукле-

отиднымм последовательностями регуляторым элементов DSH, ТИН. CR55 и E2F. Под специфичностью мы понимаем здесь не белковый состав этик комплексов, который мы не анализировали, а тот Факт, что каждый из них отличается от других собственным характером выявления и Поведения в экспериментах по специфической и неспецифической конкуренции.

вызоды

1.Низкий уровень активности промотора протоонкогеиа e-fos ь недифференцированных клетках линии терчтокарциномы мыши F3 обусловлен негативным контролем функции промотора со стороны короткоживущих белков, которые не взаимодействуют не-, посредственно с промотором.

2.Белки или их комплексы, взаимодействующие с регуляторян-ми последовательностями TRE, CRS и DSE присутствуют в недифференцированных клетках F8 и способны к специфическому ДНК-связыванию in vitro. Корогкожнвуцие негативные регуляторы обуславливают их неспособность активировать промотор гена o-fos путем пост-трансляционных модификаций.

3.Промотор Протоонкогеиа a-foa в недифференцированных клетках F9 не регулируется активаторами основных путей передачи сигналов: цАМФ-эависимого; фосфоиноэитольного (зависящего от протеинкиназы C)j зависящего от рецепторов факторов роста.

' 4 .Особенности негативного контроле промотора протоонкогеиа c-fos специфичны для клеток линии тератокарциномы мыши F9 и могут иметь непосредственное' отношение к поддержанию их недифференцированного Состояния. ДиФФеренцировка клеток линии F3 рети-ноевой кислотой и дибугирил-цАМФ является физиологическим cnoqoöort активации промотора гена c-fos в этих клетках.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

■1 .Поспелова Т.В., кислякова Т.В., Медведев а.В., Кукушкин А.Н., Волков И.В., Светликова С.Б-i Поспелов Б.А. Структурно-функциональный • анализ промоторов, регулируемых в клеточном цикле геной при' иммортализаиии, трансформации и дифференцироьке клеток. - Тез.'8-го двустороннего симпозиума СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов". Иркутск, 1S88,

C.77-7t<.

2. Кислякоьа Т.В., Поспелова Т.н., Поспелов В.ft. Ростовые и' морфологические характеристики недифференцированных и дифференцированные клеток линии тератокарииномы мысш F9. - Цитология, 1990, т.32, с.54-ЙО .

3.Кислякова Т.В., Светликова С.В., Лавровский Я.В., Поспелова Т.З., .Поспелов В.Д. Негативный контроль экспрессии промотора протоонкогена e-fos в недифференцированных клетках линии тератокарциномы мыши JP8. - Докл.АН СССР, 1890, т.310, с. 1504-:е0й. ' '

• 4.Pospelov V.A., Vikhansksya F.L., Volkov I.V., Kislyakova. Т.V., Rultushltin A.N.', ■ Pospelova T.V., Svetlikova S.B. Protoonoogene . c-fos: different models of negative control. Abstr. of Soviet-?innish symposium "Signer noleoulee and cell differentiation". Ontogenes, 1881, v.22, p.403.

¿З.Ш.ЭЗ.Шегоюяю.