Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция функционирования промотора протоонкогена С-FOS в клетках линий тератокациномы мышей F9

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция функционирования промотора протоонкогена С-FOS в клетках линий тератокациномы мышей F9"

РГ6 од

- 5 ДПР ^российская АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ цитологии

На правах рукописи

КИСЛЯКОВА Татьяна Витальевна

РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПРОМОТОРА ПРОТООНКОГЕНА С—РОБ В КЛЕТКАХ ЛИНИИ ТЕРАТОКАРЦИНОМЫ МЫШИ Г9

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1993

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ дифференци-ровки клеток Института цитологии Российской Академии наук.

Научный руководитель — доктор биологических наук В. А. Поспелов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л. И. Корочкин; кандидат биологических наук О. И. Подгорная.

Ведущее учреждение — Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета.

на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Защита состоится

1993 г. в

/3

часов

Автореферат разослан «

1993 года.

Ученый секретарь ■ „ Специализированного совета, доктор биологических наук

Л. Н. Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

flKxyiMhtt£Clii_UPCÜJji>ilL_Реализация клеточных программ пролиферации, диффереицировки и' гибели, составляющих суть развития, любого многоклеточного организма, происходит на основе дифференциальной экспрессии генома. Непременный этап регуляции активности генов - инициация транскрипции. Смысл этого этапа состоит в регуляция Функционирования комплекса РНК-нолимеразы дах-связывакмими транскрипционными факторами, специфически взаимодействующим с регулятсрными элементами промотора, которые могут находиться на разном расстоянии от сайта инициации •транскрипции (места сборки комплекса РЯК-полимеразм) (Mitchell, Tjlan, 1989; Gill, Tjian, 1992 i Pabo, Sauer, 1992 ).

Изменение транскрипционной активности генома в ответ на внесший стимул происходит в соответствии с типом клеток, на которые действует этот стимул. Поэтому специфичность транскрипционной регуляции - едва ли не самый интересный аспект ев изучения. Особенно привлекательным лрядстаплается исследование регуляции генов, продукты которых вовлечены в контроль разнообразных клеточных процессоз в разных клеточный типах. Протоонкоген c-fos - один иэ таких пзнов. Его продукт функционирует как компонент транскрипционного комплекса ДР-1, который в разных типах клеток выступает как регулятор нормальной пролиферации и диффе-ренцировки, а также может участвовать в процессе неопластической трансформации (Ansei, Karin, 1932). Полифункциональность продукта гена c-fos определяет сложную и строгую регуляцию его экспрессии, я частности, осуществляющуюся на уровне транскрипции. В большинстве типов клеток транскрипция протоонкогена c-fos подавлена, но может быть быстро и кратковременно индуцирована большим спектром внеклеточных стимулов по типу индукции транскрипции "генов раннего откета".

Вполне естественно предположить,' что механизмы контроля баэальяой экспрессии протоонкогена c-fos, а также способы его активации различаются в зависимости от типа клеток и Функции продукта гена o-fos. Интересной модельной системой для изучения специфичной регуляции транскрипции протоонкогена o-fos служит линии эмбриональной карциномы (тератокарциномы) мы ¡в и F9, способная к . дчффоренцировке in vitro под влиянием химических индукторов, экспрессия гена c-fos в недифференцированных клет-

как этой линии подавлена., а в дифференцированных в направлении париетальной эндодермы otfa находится на высоком уровне и имеет конститутивный характер (Lookett, Sleigh, 1887). При stom ряд экспериментальны!) данных указывает на то, что продукт гена c-fos относится к числу белков, участвующих в переключении клеток F8 на путь дПффереНцировКи (Huiler, Wagner, 1Б84; Edwards et al., 1008; Oshlma et al., 1990). Поэтому механизм, поддерживающий транскрипцию гена c-fos в недифференцированных клетках F9 на низком базальном уровне, интересен и с точки зрения изучения клеточной специфичности регуляции промотора этого гена, и с точки зрения изучения молекулярных основ дифференцировки.

Цедн_и_азаачи , исследований.._Цель предлагаемой работы

состояла в том, чтобы выявить специфические особенности регуляции транскрипции протоонкогена c-fos в клетках линии тератокар-циномы мыши FS. В соответствии с атим были поставлены следующие экспериментальные эаД&чи:

1.Описание клеточной модели: отработка методики культивирования клеток эмбриональной карциномы мыши линии F6 и индукции их дифференцировки s «вправлении париетальной эндодермы; сравнительное изучение фенотипичесКик характеристик недифференцированных и дифференцированных клеток линии FS,

2.Изучение функционирования промотора протоонкогена c-fos, находящегося в составе индикаторной плазмиды fosCAT,1 в клетках линии Е9 в различным экспериментальных условиях.

3.Анализ ядерны* экстрактов клеток эибриональной карциномы, линии F0 методом ретардации олигонуклеотидных проб в полиакри-ламидном геле с цель» выявления ДЯК-связывающих "белков (или их комллексрв) - вероятны* ■ участников регуляций активности o-foa-npoмотора в эти* клетках.

Научная нйвизна..д.,ьау.чьа-гпракти.чег;каа, ,ибннасть..ааботы. ..Работа содержит новые данные, .касающиеся особенностей регуляции функционирования промотора протоонкогена c-fos в Клетках линии тератокарциномы мыши F9 .

Йокаэано, что промотор протоонкогена c-fos в недифференцированный клетках F8 .находится под негативным контролем со сто-, роны хороткоживувдих белков.

'Обнаружено, что атя белки не связываются непосредственно с промотором, а негативно контролируют функцию транскрипционных Факторов, его активирующих, а именно, белков, способных взаймо-

действовать о последовательностями регуляторнык элементов« DSE, TRB, CRS. Эти белки выявлены в ядерных вкстрактах недифференцированных клеток F9 как образующие специфические комплексы с соответствующими ояигонукЛвотидными пробами в условиях ретардации й геле.

Таким образам впервые показано, что низкий базальный уровень экспрессии Промотора гена e-fos в недифференцированных клетка* ?9 обусловлен не отсутствием транскрипционных активато-

л

ров, а присутствием короткожйвуиия белков, которые негативно контролируют Функции активаторов.

Показано также, что промотор протоонкогена c-fos в недифференцированных клетках F9 не активируется агентами, которые в других типах клеток индуцируют экспрессию этого гена как "гена раннего ответа"\ индукция дифференцировки клеток F8 ретиноевой кислотой и дибутирил-ц(ШФ является физиологическим способом активации промотора гена c-fos в этик клетках. Этот факт, а также то, что обнаруженные закономерности негативного контроля промо-'ора гена c-fon специфичны для недифференцированных клеток F8 позволяют предположить значение этих закономерностей для поддержания недифференцированного состояния этих клеток.

Полученные данные углубляют понимание нормальной Функции протоонкогена c-fos, . механизма регуляции его транскрипции и молекулярных основ дифференцировки. Матерьалы диссертации используются в лекционном спецкурсе кафедры эмбриологии Санкт-Петербургского Государственного университета "МолекУляр-но-генетические основы' биологии развития".

. Апробация работы._Материалы диссертации докладывались на

двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989), на совместном советско-финском симпозиуме "Signal transduction and cell differentiation" (Суздаль, 1991), на совместном советско-британском симпозиуме "Структура и функция генома" (Лондон, 1391), на семинарах в Институте цитологии РАН. !

ПУЗДакации_По теме диссертации опубликовано 4 работы.

0_бЛй11_р-а&£Ш!и_Диссергация изложена на ,стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов И списка литературы, содержащего названий. Работа иллюстрирована рисунками и'одной таблицей.

МАТЕРИАЛЫ И МВТОДЦ ИССЛЕДОНАНИЙ Объектом исследования служили клетки линии тератокарциноми иыыи F9 из Банка клеточных культур Института цитологии Российской Академии наук.

к и

культивировали в среде DKEM (Oibco) с добавлением 10Х эмбриональной сыворотки крови коров на пластиковых чаыкак Петри, покрытых желатином (0,1* водный раствор желатина, Sigma). Культуру пересевали каждые двое суток с исходной плотностью посева не более 5000 клеток на кв.см. Индукцию дифференцировки в направлении париетальной эндодермы проводили по методу Стрмкланда с соавторами (Strickland et al., 1В7В). Для этого клетки высевали в дозе 5000 клеток на кв.см и через сутки меняли среду на свежую, содержащую 1 i'H ретииоввой кислоты (РК) (Sigma). Затем меняли среду каждые двое суток. На четвертке сутки кроме РК в среду добавляли 100 иН дибутнрил-иАМФ (дб-nfiMi) (Serva). Общая продолжительность обработки индукторами составляла в разных опытах 6-10 суток.

нйя маркера, клеточной поверхности недифференцированных клеток тератокарцином гликопротеина SSEA-1 Использовали моноклональные антитела ТЕС-01 (Dr&ber, Fokornsi, 1S84), любезно предоставленные д-ром П.Драбером. Для построения кривых роста клетки сеяли в исходной плотности 5000 на кв.см и ежесуточно подсчитывали, количество клеток. На отрезке времени, соответствующем логарифмической Фазе роста культуры, определяли время удвоения популяции (Shaeffer, 1978). Насыщающую плотность определяли как максимальное число клеток на кв.см поверхности после завершения

о

логарифмической фазы роста культуры, Исследование распределения клеток по содержанию ДНК проводили с помощью проточного цитоф-люориметра (Розанов, 1S87). Определение величины эффективности клонировании клеток на субстрате проводили, высевая 100 клеток на чашку площадью 20 кв.см, и через 7-Ь суток подсчитывали долю, которую составляло число выросших клонов от числа посеянных клеток. Оценку эффективности клонирования клеток в полужидком аГаре проводили по методу Млкферсона (Huopherson, 1S73).

мндной ДНК в клетки проводили кальций-Фосфатным способом

{Поспелова» 19вТ). Анмиэ активности продукта репортерноге гена Хдара*фемйколац»тн*тр&чсф«Р*эц провалили п° методу Горман

(Oorm*n. Í998) черв? часов поел» траноФенцйи• Для этого из трайвфецирз»аиних клвто» получали белковые вхстракты методом аамлражиййинд-опчивиния в 0.28К Tpvc-HCi, pH 8,0, тем же буфером ураИкиваяи евдеркани» белка в пробах, определенное rio Брвд-форду {Bíndfeid, 1993) и проводили реакции ацетияироэания с'1/ -кйорацфеиипояа. йатеи »истрагировади «с» его фо^мы »тилацета-тои, подвергали пробы восходящей тонкослойной хроматографии и определяли дол(9 ацетйлмрованного хлорамфеиикояа' после высушивания кройатограФичвакой пласгийки Н экспонировййия ее с рентгё-новской пленкой, В некоторых Сличая» проводили дот-гибридизация РЙК транефвцирэванны* кл»той| ¿«деленной по методу Вирнбойма (81*пЬо1и, 1898), о меченым Р ^ фрагментом генд CAT.

тов. Ядерные экстракты получали по методу Шрийбера с'соайт. • (5ohreibei et al., 1089) и хранили при -70"с. содержание велка s пробах уравнивали, определяя его «о методу Брэдфорда (Bradford,- 1903). 8 качестве печеных радиоактивным фосфором про? использовали синтетические двуцепочечные оДигоНуклеоти'ды, содержание последовательности элемента двойной симметрии o-íos-npoHQfopa DSE С-3 Í7;-208), цйК4-зависи«ого элемента ó-fos-промотора OBI (-82¡-64), последовательность ТРИ-эавйсимо-to «лемента ТНВ из промотора гена койлагеназы и последовательность сайта связываний транскрипционного фактора Е2? из промотора протоонкогена о-вуо. Реакцию ЛНК-свйзнвйний проводили при Комнатной температуре, используя в качестве неспецифическо^ конкурента polyA-ßolyU-сополимер. образовавшиеся ДНК-белковые комплексы отделяли ot свободной меченой пробы, путем электрофореза реакционной смеси й 4Я полиакрила'мндном геле, благодаря ик сниженной электрофоретической подвижности (Метод ретардации в геле). ' i

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ЯК ОБСУЖДЕНИИ

йаннык 'и flMtií'ÉcentinpoBannux клеток FQ, Два основный свойства, характеризуют клетки вйбриональной карциномы как модельный объект. Это их недиффергнцироээнность, коррелирующая с признаками опухолевого Фенотипа, и способность к дцффчреицировке, коррели-

рующая с нормализацией (Martin, 1882). В этой части работы нам предстояло выяснить, обладают ли этими свойствами имеющиеся s нашем распоряжении клетки линии терагокарциномы мыши F8.

Для индукции дифференцировки клеток эмбриональной карциномы линии £9 мы исполъзойали известные! способ обработки растущей в монослое культуры этих клеток ретиноевой кислотой (РК; 1 им) И дибутирид-цйМФ (дб-цАМФ; 100 иМ); при таком способе клетки диффереицируктся преимущественно в направлении париетальной эндодермы (Strickland et al., 1880),

К выбранный Нами для анализа фенотипическим признакам недифференцированных и дифференцированных клеток линии F8 относятся Изменения морфологии клеток; . экспрессия поверхностного «штигена клеток эмбриональной карциномы гликопротеина SSEA-1 (stage specific embryonic antigen); ростовые характеристики -время удвоения, насыщающая плотность популяции и распределение клеток в популяции по фазам клеточного цикла; способность клеток к размножению в полужидком агаре; а также способность клеток к пролиферации после пересева в клональной и высокой плотностях.

Б, наших опытах недифференцированные клетки F9 существенно отличались по фенотипическим характеристиками от клеток, обработанных в течение 8-10 дней индукторами диФФеренцировки. Клет- , ки, Прошедшие обработку РК и дб-цАМФ согласно общепринятой схеме, имели выраженные отличии в морфологии и не экспрессировали На своей поверхности маркер стволовых клеток гликопротеИн. SSEA-1. Дифференцировка счпровожДалвсь утратой признаков опухо- ■ левых клеток: способности неограниченно долго "размножаться в . культуре, и способности эффективно размножаться 'в клоиальном посеве на субстрате и в полужидкой среде-. Изменение ростовых

rj .'

характеристик клеток и их распределения в популяции по фазам клеточного цикла в ходе обработки индукторами гоьорит о прекращении пролиферации и выходе из клеточного цикла. Основным ре- . • эультгтом сравнительного изучения Фенотипических признаков недифференцированных и дифференцированных клеток линии F3 мы считаем совпадение полученных нами характеристик с данными литера-.

1 туры, псиученныии на зтт клетках разными авторами в аналогичных ' условиях (Ruff, Fewell, 1980; Moore et al., 1986;

: Hura»atsu, 1884; Greip, Be lues, 1ЭВ8; Sol.ter, Knowles, 1978;

; Under et al., 1881; Rodrieuas et al.,'1885; Strickland, 188i;

к.

-it-

•т

DSR FAP

иБ

CRB TATA

-2S>0

■62 -34

+1

SRB

5.

Г ■ . ¡í

. V! .

1-2 3 промотор активируется

RA + db-cAMP

¡ 2 ) ~4 5 .

TPA

промотор hs активируется

Рис.1. А. Схема промотора протоон'когена с-?ов в индикаторной Плазмиде гогСАТ. ЭЯЕ' - сывороточный рзгулягорный элемент, состоящий из ОЗЕ - элемента двойной симметрии и ?АР - АР-1-по-добного элемента; СЙЕ - цАМ4>-эягшсимый элемент. В.Влияние обработки индукторами диффэренцировки на уровень Сйт-активност'и в клетках Р9, трансфецйрованных плазмидой ГояСЛТ. 1 - недифференцированные клетки РЭ; 2 - клетки, обработанные ратиноевой кислотой в тгчэнио 48 часов посла трансф'згсции; 3 - дифференцированные клетки г9 (обработанные ретяноевой кислотой (ИА) и дибутнрил-цДМФ (йЪ-сАМР)). Здесь и далее за единицу (ось ординат) принят урозень СПТ-активностМ, наблюдаемый в интакт-нш недифференцированных клетках ?8, трансфецированних плазми-дои ГозСЛТ. С.Влияние ростовых факторов сыворотки, форболового эфира и Дб-цАМФ на уровень САТ-актианостя в недифференцирован-нцх клетках га, трансфецнрованнык плаэмидой еовСАГ. 1 - 10* сыворотки; 2 - 0,5Я сыворотки (голодание); 'Э-5 - стимуляция после голодания: 3 - форболовым эфиром (ТРД); 4 - 2ОХ сыворотки (РСй); 5 - дб-ЦМКФ (аЬ-сАМР).

Martin, IBS?), Главный suuo^t из азгой ч#ети р^бох^г состоит в тон, что иквкияаяеа в навек распоряжении линия ггвратоклрцк^риУ мыши ВВ оеякдвкт осйоЬныни сибйсгванй к лето)« »кйрнойаяьно* карциномы и йохет etatb mcrtoibsbbbhii « »шсп»рмй«нт»лы|ой «ofleiM, •

Усдоур ?КТЦ8ЙЦНИ qpofwtopa п.уотдедоогенд tg-fyg р каткам иыва. И», Ни«я « »иду; что уровни регуляции экспрессии гёротооняоГеий p-fos ж Метка« ?S ноггг вутк многообразны, ми сосредоточились ни изучений закономерностей функционирований его прочвтер», нлкодЛщвгося в составе индикаторной пдазыиды fosCAT. эта плаэмида бид& Лювеань првАосТа»*еиа Р.ГрайэИлном и солеркала Вамте^иадьный ген CAT под контролем промотора протооикогена c-foe челочка i*-'?lli +28 h.ft,) <pnc,lfi>. Плазмиду fosCAT временно тра^сфёцирсц»аяй а Кл»тии fS в виде кальций-фосфатного ирвципи^лтй. я sareM о8ра8«Т1«&али кяеткЯ различными вгййтамм, йсторие йетут «ЛИять ЪЬ Функций промотора ts-foa, о чем судиан По »кмвнвсги ф^рмбНТя CW а экстрактах из трансфвщированних клеток. .

В. интактнмя нёЦИффервнцнройакны* иявтк»*-Гй hpowofop гене c-fos сообщал плаэмид® foeCAT низкий - КазцльйЫй уровень экспрессии, который сильно йоэрас тая при трамсфвкции плазмидой , t osCAT дифференцированных МЛеток (т,«. обработайньш й

дб-цАМФ в течение efcrox перед трансакцией) (ipHt.lB). Обработка недифференцированных клеток ретиноевойинслогой £ течайие, 48 Часов после трансфвкЦпи не приводила к значительной^ noswaie- ■ ни» сйТ-активности (prtb-18)- Гакии овраэом; активаций промотор c-fos происходит на Поздней стадии дифференцироьки «лбТок что соответствует литературным данным о« skcfipfeechM гена o-iee

ы

в 9Т«х клетках (Lockfttt, sleigh, 1867).

Следующий вопрос - можно ли активировать Ьроматор гена c-fos в недифференцированным клетка* как промотор freh* "рай-, него ответа"?

Для исследования инАуцибельностй c-fos-проиотора как промотора гена "раннего.oTiferh" ия применили общепринятую в таких, опытах модель сывороточного голодания. В качестве потенциальных активаторов fos-промотора использобали агенты, запускающие Ьсновяые пути передач^ сигнала к Кйетке: форбоАовый »ФИр (ТРА), активатор фосфоинозитольного пути., эаексйщего от протеинкинйзы

С; дибутирия-чАМ*, активатор протеннкнкяэы А; и Фетальнукм сыворотку крови, «кгивирумщу» rtyffc, эавмеяиий от рецепторов фактора» роста.

Промотор протоонкогена ö-fos содержит сайты связывания, транскрипциоянмх факторов, дНК-евязывающая и тране-активацион-ная способность которых напрямуя регулируется через »ти пути передачи сигнала (рис,1А). Главная мишень активации o-fos-npo-мотора сывороткой и форволовым эфиром - элемент SRB (serum responsiva elenent} (Schontal tt ti., 1S89; Konig et al., 1989; Sha« et al., 1989j Lucibelio et al., 1091), который состоит из т.н. алемвита двойной симметрии DSE (-320;-298) и непосредственно примыкающего к иену элемента FAP (-2S8;-2S9). С 9л«ментом DS8 специфически взаимодействует сывороточно-эависи-мыЯ транскрипционный Фактор SRF , и р*д дополнительны* белков (Treisnan, 1В92). Последовательность элемента FAP имеет токологию одновременно ií конйенсусными последовательностями регуля-торных элементов TRB (TPA-responSe elsment, сайт связывания транскрипционного комплекса АР-1) и CRJ5 (cflMP-responae elenent, сайт связывания транскрипционного фактора CREB). кройе того, в промоторе гена c-fos есть собственный элемент CRE (-82;-54), прйиймающнй участив в регуляции его базальной транскрипции в некоторых типа* клеток (Luolballo et al.,,1991).

Недифференцированные клетки F9 трансфецировали плазмидой fosCAT rt на следующие сутки меняли среду на содержащую 0,SX фе-тальной сыворотки. Через 48 часов культивирования клеток в среде с низким содержанием сыворотки среду меняли иа свежую, лйбо Не Содержащую добавок, либо содержащую а)20Х сыворотки; 6)0.5Х сыворотки yt 100 иг/мл форболового эфира; в)0,5Ä сыворотки и 100 üM дб-цАКФ. Через 2 - .3 часа клетки собирали и определяли CñT-активность в экстрактах. Базальный'уровень CflT-активности в этом эксперименте слабо модулировался в результате сывороточного Голодания и.последующего действия ТРД, дб-цАМФ и сыворотки (рис.1В); -но мы никогда не наблюдали в этих опытах той степени активации экспрессии плазмиды fosCAT, какую наблюдали при дифференцировав клеток F9. •

, Специфика действия ' агентов, активирующих основные пути проведения сигнала в клетке и способных вызвать моментальную и кратковременную транскрипцию гена c-fos,' зависит от типа клеток, на которые они действуют. Клетки эмбриональной карциномы

линии F8 - это опухолевые клетки, обладающие способностью к автономному размножению и его аутокринной регуляции (Heath, Rees, 1985). Эти клетки характеризуются низким содержанием рецепторов форболового эфира и низкой активностью протекнкиназы С (Snook et al., 1886). Что касается дб-цЛМФ, то для клеток F8 это индуктор дифференцировки, способность отвечать на который они приобретают только после' длительного воздействия ретиноевой кислоты (Plet et al., 1082), хотя и содержат функциональную протеинкин&зу ft (Masaon et al., 1992). По нашим собственным данным скорость размножения недифференцированных клеток В8 и их распределение в популяции по содержанию ДНК не зависели от содержания сыворотки в среде и не менялись при действии ТРА, дб-цАМ4> и сыворотки после сывороточного голодании. Однако, на каком бы уровне ни осуществлялся блок активации промотора nvo-тоонкогена o-fos Форболовым эфиром, ростовыми факторами сыворотки и дб-цАМФ, для нас важно, что в недифференцированных клетках FS этот промотор не регулируется через основные пути передачи сигнала.

Итак, мы выяснили, что в клетках эмбриональной карциномы линии , F8 промотор протоонкогена o-fos, находящийся в составе индикаторной члазмиды fcsCAT, сообщает гену CAT низкий базаль-ный уровень экспрессии, который существенно возрастает на стадии терминальной дифференцировки. В недифференцированных .клетках исключена возможность сильной активации e-ios-промотора как с помощью агентов, которые в других клеточных типах вызывают, экспрессию гена o-fos как гена "раннего ответа", так и'при кратковременной обработке индуктором диФФеренцировки ретиноевой кислотой. Исходя из этих данных и Физиологии клеток F8 можно заключить, что адекватным условней активации промотора гена c-fos в этик клетках является их диФФеренцировка ретиноевой кислотой и дибутирил-цАМФ.. .

Негативный контроль функционирования' промотора протооцко-

мьщи F9 . Последний вывод позволил нам предположить, что низкая баэаль'ная активность промотора протоонкогена o-fos в недифференцированных клетках Ь"9 обусловлена специальным механизмом негативного контроля. Чтобы вынснить, не присутствуют-ли в недифференцированных клетках F8 белки, негативно регулирующие актив-

' - 11 -

ность e-fоа-промотора, ми обрабатывали клетки, .трансфецирован-ные плазмидой fosCAT, ингибитором синтеза белка циклогексимидом. Циклогекслмид (50 мкг/мл) добавляли в среду на четыре часа, а потом меняли ее на свежую, не содержащую ингибитор. При этом синтез белка, определяемый по включению НЗ-лейцина сразу посла обработки, -снижался на 90Ä. Оказалось, что такая обработка существенно повышает уровень ферментативной активности CAT (рис.2А), чеку (по результатам дот-гибридизации) соответствует увеличение количества мРНК гена CAT в трансфецированних клетках . В следующем варианте опыта мы обрабатывали циклогексимидом недифференцированные клетки F8, котрансфецированные плаэмидой fosCAT и 6-кратным избытком плаэмиды рЧС19, содержащей последовательность промотора гена c-fos (-711; +28) (ллазмида pfos). Введение избытка плазмиды pfos приводило к уменьшении как ба-зального, так и индуцированного циклогексимидом уровня САГ-ак-тивности (рис.2А).

Из результатов этого эксперимента можно заключить, что обработка клеток циклогексимидом и блок синтеза белка приводят к исчезновению в недифференцированных клетках F8 короткоживущих белкоз-репрессоров, негативно влияющих на экспрессию гена CAT, находящегося под контролем c-fos-лромотора. Поскольку трансфек-ций вместе с плаэмидой fosCAT избытка o-fрз-промотора в плаэми-де, не содержащей репортерного гена, "разбавляет" эффект возрастания САТ-активности в результате действия циклогексимида, мы считаем, что ргпрессори действуют именно на уровне регуляции $ункции промотора. С другой стороны, тот факт, что Введение избытка плрзмиды pfos само по себе не приводит к повышению САТ-активности, означает, что репрессоры не взаимодействуют с промотором непосредственно.

Ми использовали плазнидц, содержащие последовательности D3E ORE c-fos промотора н последовательность TBE из промотора г.>на холлагенази для котрансфекции о плазмидой fosCAT в недиф-»К'ренцйроеанные клетки F8 в качестве конкурентов за белки, которые м;т:.'т регулировать функцию промотора гена o-fos в- этих клетках . При кстрачсфектш плаэииды fosCAT о избыточными количества у Л ллазмнд, содоржаапх однокопийныо последовательности D3S, CSE или "'RH, снижался и базальный, и индуцированный циклогексимидом уровень САТ-активности (рис.2Б). Однако, степень снижения САТ-активности, индуцированной циклогексимидом,•раэли-

(огОАТ

ЛюСАТ

ЬвСАТ+о'хТКЕ

^¡САТЧбхРЗЕ ГошСАТ-^бхСКВ I........ "' ^И,»«! *

Рис,2. А.Обработка циклогексймидом недифференцирорэнныи клеток ?8, трансфецирсванних пяазмидой (обСАТ, ' приводит к активации о-1оэ-проИотора. 1,2 - трансакций плаэмидой £о«САТ| 3,4 -котрансфекция ллазмидами ГозОАТ и рГов» 2,4 - обработка трансфецироваиных клеток циклогексимидом (ЦГИ). Б,Влияние конкурентных пдазмид, содержащих последовательности регулкторнь^к элементов ТИК, СВЕ и на уровень циклогеКсинидИо» активации экзогенного о-Гов-промотора в недифференцированных клвтк&х Р8. 1,2 - трансфекция р'взмидой ГовСАТг ¡М - котЬанСфекция ГовСАГ и бхТИВ; 8,В - котр&Нсфекция ГовСАТ И бхОвБ) 7,8 - Кот-

• .рансфекция 1^оаСАТ И бнСЯВ. 2,4,8,8 - обработка транс^ецироваи-

• них клеток циклогексймидом (ЦГИ).

чалась s зависимости от введенной конкурентной плазмиды. Наиболее полным это снижение било в случае котрансфекции плазмиди fosCAT с плазмидой, содержащей регуляторный элемент DSE, а наименьшим - при использовании в качестве конкурента регуляторного элемента TRE,

Отсутствие повышения уровня экспрессии плазмиди fosCAT при котрансфекции с избыточными количествами плазмид, содержащих регулвторные элементы D3E, TRE и CRB, говорит о том, что в этих опытах не происходит конкуренции между o-fos-промотором и указанными последовательностями за непосредственное связывание с негативными Факторами. Однако, очевидно, что по крайней мере иежяУ сайтами DSE и CRE, с одной стороны, и c-fоа-промотором, с другой Стороны, происходит конкуренция за позитивные факторы, активирующие o-fos-промотор при действии циклогексимида. Активация c-ffоз-промотора происходит во время действия циклогекеи-■ мида, т.е. не требует синтеза белка de novo. Значит, позитивные Факторы транскрипции, обуславливающие в этой экспериментальной ситуации экспрессии плазмиды fosCAT, должны предсуществовать в мнтактНых недифференцированным клетках F8 в неактивном состоянии. Тогда вполне вероятно, Что неидентифицированные белки-реп-рессоры, с которыми мы имеем дело в наших опытах, обеспечивают эту неактивность путем пост-трансляционных модификаций. Исходя из многочисленных литературных данных о разнообразных способах регуляции активности транскрипционных факторов семейств АР-1,и CREB и фактора SRF, можно предполагать как образование, с ними транскрипционно-неактивных . комплексов, так и другие механизмы репрессии, например, фосфорилирование и дефосфорилирование (Luolbello et al., 1880; Boyle et al., 1891; Ofir et al., 1090; AuHsrx et al., 19Э1; Wakabeppu, Nathans, 1991; Treisoan, 1S92).

Итак, в недифференцированных клетках F9 промотор протоон-коГена e-foa находится под негативным контролем короткохипущих рвпрвссоров. Они не связаны непосредственно с промотором, а каким-то образом определяют иеактивность транскрипционных факторов, < предсуцествующих в клетках и обеспечивающих активацию o-fos-промотора при действии циклогексимида.

Вопрос о том, как именно негативно регулируется транс-ак-тивационная способность факторов АР-1, CREB и SRF в недифференцированных клетках F9, подлежит выяснению, однако даже не зная механизма репрессии, можно утверждать, что обнаруженные нами

особенности регуляции промотора гена e-foa н недифференцированных клетка* F0 специфичны дли ртих клеток. Б самом деле, нега--тивиый контроль функции o-fos-npoNoropa - распространенное явление, однако в большинстве исследованных типов•клеток он подразумевает возможность транскрипционной активации гена c-fos как гена "раннего ответа." (Angel, Karin, 1892; R&nsone, Ve roa, I960); этого не происходит в недифференцированных клетках F9. Феномен сильной активации транскрипции гена o-fos циклогексими-дом тоже хорошо известен (Greenberg et al.,1936), однако это не . активация баэальной транскрипции, которую мы наблюдали в недифференцированных клетках'F0, а v.u. супериндукция, т.е. предотвращение негативной авторегуляции промотора, в норме непременно следующей за его активацией при "рцнкем ответе".

В клетках злокачественной линии эмбриональных Фиброеластов крыс EraslO, трансформированных парой онкогенов Е1А Ad5 и .Ha-ras, как и о недифференцкроаа.чных клетках FS, функция c-fos-промотора подавлена и es невозможно активировать форболо-вым эфиром, дб-ЦАМФ и ростовыми Факторами (Поспелова и др., 1987; 1891). Однако, это клетки с принципиально другой Физиологией, и мы не Подучили в них эффекта цик.югексцу.'ддной активации базального уровня экспрессии плазииды ГовСАГ в эксперименте, аналогичном поставленному на клетках 59. В недифференцированных клетках линии F9 циклогексимпдная обработка активировала экспрессию не только .трансфецпрованной в них плазмиди fosCAT, но и гиазмид, в которых ген CAT находился под контролем изолированных рвгуляторкых элементов DEE, ÏK2 и С'.ЧЕ. В линии же Kraalü картина была совсем „-другой. Обработка циклогексимидом этих клеток, трансфецированных плазмидами fosCAT, TRECAT, DS2CAT или CRGCAT, либо не оказывала эффекта на их экспрессию (fosCAT), либо подавляла ее (TRECAT и DSECAT ) и лишь в случае СКЕСАТ - незначительно стимулировала.

!;, наконец, результат конкуренции in vivo в сочетании с c^-tарочной, ииклогексимидом совершенно уникальны для игдпфф^рен-UuWíWuiuík клеток F8. -Конкур-опции in vive проводили разные ав-тчри па клетках HIH3T3 как модели клеток. п\а ген o-fos Функционирует k¡ir ген "раннего otüotö." и, сээтветстэсшю, его •¡ !<.b'íxj¡ij:i¡j!a подавлена, не мсй.ст öuri, ш'.дуцнроаана агентами, T.-.íi-.'^KCv^anMH основные пут гцог.^динил c«ri:a.;¿. D этих акспзри-ненгд* получали . nvocfo ачтикацию c-i'cá-íipoмотора при -кот-

рансфекции плазмиды fosCAT с избыточными количествами плазмид, содержащих полны« промотор пли его Фрагменты без репортерчого гена (Sassone-Co rsi , Verita, 1S В 7; Schontal et al., 1923; Поспелова и др., 1990), а результаты трактовали как "титрование" репрессоров. В наиих опытах на недифференцированных клетках V8 происходит не титрование репрессоров, а титрование активированных в результате действия циклогексимида факторов, позитивно регулирующих транскрипцию, зависимую от o-fоз-промотора.

Специфичность обнаругевннш особенностей негативного контроля fое-промотора для недифференцированных клеток ?а, тот Факт, что индукция дифференцнровки - единственное Физиологическое условие "снятия" этого контроля, г также литературный данные о роли продукта ггн-i o-fos в дифференцчравке клеток Р9 (Muller, Wagnsr, 1ЙЙ4; Edwards et al , , 1368) заставляют предположить, что негатиацял регуляция промотора гена о-Гоа существенна для поддержании сиойстн клеток эмбриональной карциномы.

В трех клаточных моделях: минимально-трансформированная фибробластах Ч1НЗТЗ, злокачественных трансформантах KraslO и способной к дифференцировке линии тератокарциномы F9 промотор протоонкогена o-fos находится под негативным контролем. Несмотря на разную степень изученности механизмов осуществления этого контроля в каждой из трех линий, очевидно, что эти механизмы разные. Кроме того, репрессированный промотор гена o-fos в клетках HIH3T3 мохег сыть активирован как промотор гена "раннего ответу", в клетках сЭ он активируется только на поздних стадиях дифференцировки, а в клетках EraslO тип репрессии промотора гена o-fos, по-видимому, не подразумевает вообще никакой ин-дуцибельности.

Очевидно, что эти различия связаны с функцией, которую выполняет продукт гена c-fos в этих типах клеток. ö клетках NIH3T3 при сывороточной стимуляции он участвует в реализации программы пролиферации (Kovary, br&vo, 1092, а,б), а в клетках Е9 от него зависит экспрессия признаков диффоренцировки (Hüller., Hagner,' 1084; Edwards et al., 1988; Oshina fit al., 1990). Поэтому в недифференцированных клетках тератокарциномы должна быть строго запрещена- индукция экспрессии протоонкогена o-fos любым другим способом, кроме как со стороны индукторов дифференцировки этих клеток, что вполне согласуется с нашими ■ данными (рнс.1).

- 16 -

Если сравнивать клетки Р9 и ЕгаеЮ, то в данном случае мы имеем дело с двумя клеточными линиями, обладающими полный набором черт трансформированного фенотипа. Это отлкчаёт их от минимально-трансформированная , клеток ШНЗТЗ И, по-видимому, обуславливает нерегулируемость промотора гена с-?о& как гена раннего ответа. Однако,, трансформированный фенотип опухолевых .клеток -.регулируемый, и регуляторами здесь выступают индукторы дифференцнроэки, коррелирующей ■ с нормализацией <8Ьг1ок1апс1,'.18В0), Клетки ЯВ произошли Из плюрипотентных эмб-. риональных клеток внутренней клеточной массы, способность к ■ диФФеренцировке которых', по-видимому, настолько конститутивное ик свойство,- что способно сосуществовать с опухолевым фвноти-. пом. Эмбриональные фибробяасты крысы - клетки, Коммитирован-ные к определенной ДиФФеренцйровкё. Нк опухолевая трансформация - это, по еудеству, дедиффереНцировка.

Тййкм образом, во Есех трех рассмотренных случаях мы имеем дело с разный« типами негативного контроля Функционирования Промотора, протоонкогенй о'-гов которые находятся в соответствии с генетикой I! физиологией клеточных линий, в которых он осуществляется,. и с функцией продукта гена 0-1*00,

дкдуцего раздела.ясно, что транскрипционные факторы, участвующие в активации fов-промотора, индуцированной циклогексимидом, лредсуществуют в интактны.'Ч- Недифференцированных клетках F8; Разная степень влияния плазмид, содержащих последовательности OSE, CHE и ТйЕ.на уровень экспрессии плаэмиды fosCAT в обработанных циклогексимидом клетках F8 может быть связана с тем, что разные, белки, связывающиеся в услозия.х конкуренции in vivo с этими последовательностями, действительно, принимают разное Функциональное участие в регуляции o-fos-промотора, Однако, возможны и другие причины, например, разная конкурентная способность этих последовательностей, связанная с разной стабильностью ДНК-белковых комплексов. Мы исследовали бзаимо-депствие ядерных белков недифференцированных клеток тератокар-циномы F9 с регуляторными сайтами DSE, TSE и CSE in vitro - методом ретардации соответствующих синтетических олигонуклеотидов

в полиакриламидном геле. Кроме того мы использовали в качестве зонда олИгонуклеотид, содержащий последовательность сайта связывания клеточного транскрипционного Фактора E2F из'промотора прогоонкогена о-вуо. (При дальнейшем изложений мы будем называть sty последовательность E2F - по имени фактора).

Выбор этоГй зонда определялся тем, .что в недифференцированных «летках F9 существует т.н.•ElA-подобная активность - не-идантйфицнрованные клеточные белки, функциональные аналоги белков, кодируемых ранним районом аденовирусов Е1А (Imperial et al. , 1684) ftelchel, 198?! Shivjli, La Thangue,. 1991). По ряду причин предполагается, что SlA-подобНая активность, являющаяся маркером недифференцированного состояния клеток F&. - важный Фактор транскрипционной регуляции дифференцировки этих клеток; Собственно Е1А при вирусной инфекции регулирует экспрессию клеточных И вирусный rertoe путем освобождения из комплекса с другими клеточными белками транскрипционного фактора R2F, после чего он приобретает способное**, связываться с ДИК и активировать транскрипцию (Bagchi at al., 1990). Среди белков, негативно регулирующие ДНК-свяэываюяу» активность E2F, были недавно обнаружены опулола&ый супрессор б,елок ВЬ, цйклин ft, кинаэа ede-34 (Hevina, 19SZ). В недифференцированных клетках ?9 белок SiF или его эквивалент также является мишенью Ё1А-подобной активности (Sleigh, 1992). Образование комплексов между белками ядерны* экстрактов клетой ?а и посяедователъНАСтъм сайта связывания , транскрипционного Фактора E2F - Пока единственный критерий Исследований этой активности.

Прежде всего мы подобрали условий проведения реакции ДНК-связыв&иия ёелков пдерных йкстракто» недифференцированных клеток F9 с Указанными олигонуклеотидными Пробами. Обычно в разных рАвотах, где используется метод ретардации в геле, можно встретить разные концентрации ионов Mg в буфере для связывания - от ОиН до 8тН. Чы использовали две Полярные концентрации ионов Мй - OftH И 8тИ.

•БеЛкЙ Ядерных экстрактов недифференцированных клеток F9 образует е. раэными одигоМуклеотидными пробами комплексы ретардации,- разные по подвижности, величина (интенсивности банда) и количеству (рис.З). Кроме того, , для разных зондов наблюдается разная зависимость днк-свяэывания от концентрации ионов. Mgi связывание ■ с ' сайтом E2F совсем от нее не зависит, а наиболее

сильно зависит образование комплекса ретардации с сайтом TRE, При этом содержание ионов Кв влияет только на Интенсивность' банда, но никак не на подвижность или количество образующихся комплексов. Следовательно, присутствие ионов Нй в буфере для связывания может являться или условием образования комплекса, или его стабилизации, результате Чего способствует выявление комплекса, но не влияет на его белковый состав. Мы приняли рабочей ту концентрации ионов Kg, при которой наблюдалось ДНК-связывгшие со всеми олигонуклеотидными пробами, а именно, 8шН. Г •

Далее мы охарактеризовали ДНК-белковые комплексы В экспериментах по конкуренции in vitro за-их образование между спе--цифичеекими .и неспецифическими синтетическими последовательностями. j ' *

ТГЧЕ

CUE

DDE

Mfl2f lliiiW fimM OmM 8m!vi OmH ПшМ OrnM BmW

lisaJ

USi

saaJ . tcsJ Ira

гт7'

TRE: TGACTCA С RE: ' TGACGTTTA

dse: gatgtccatattasgacatc

E2P. TTGSCGGGAAAAA.GAA8

Рис.3. Ретардация меченых олигонуклеотидою ТНЕ, СВЕ, ОЗЕ, Е2Р в полиакриламидном геле после образования комплексов с белками ядерных экстрактов недифференцированных клеток (схема).

Свяэиьание проводили при разном содержании полос Мй. Стрелкой показано пололение 'свободной (не сскэави?йся с белками) пробы.

TRE- и С&Е^слаашаииа_г.дйшцkJ__акпхсакшн_палий!uuueü-

гомологией и могут сиязывать как разике, так и общие белковые комплексы, й которые входят белки семейств АР-1 и СКЕВ (Angal, Karin, 1992). KU обнаруживали отчетливый ДНК-белковый комплекс С меченой олигонуклеогидной пробой TRE в экстрактах недифференцированных клеток F9 только при концентрации ионов Hg 8шМ; образование же ДНК-белкового комплекса с пробой СНЕ эффективно происходило при,обеих концентрациях Hg (рис.'З). Таким образом, 'очевидно, что эти комплексы не идентичны - по составу или хотя бы по свойствам.

Это подтвердилось и при исследовании специфичности образующих комплексов в опытах по конкуренции мекду меченым сайтом ТЙЕ или CRE и избыточны:',и количествами немеченых гомологичных и неГомологичных олигонуклеотидов. В первом типе экспериментов ■немеченые олигонуклеотнды добавляли в буфер для связывании, содержащий ядерный экстракт, в 5- или в 50-кратНом избытке, одновременно с меченой пробой.

Комплекс ретардации, образующийся с сайтом TRîî, вполна специфичен, т.к. он исчезал ужа npjt 5-кратном избытке немеченого олигонуклеотида TRE. Однако, введение в буфер для связывания 50-кратных избытков немеченых конкурентных олигонуклеогидов CRE, DSE и E2F также приводит к уменьшении комплекса, причем в разной степени: в большей - введение последовательности CRE, имеющей гомологию с TRE, и в меньшей - введение негомологичных меченой пробе последовательностей DSE или E2F.

В случае использования в качестве меченой пробы.сайта ORE избыток- немеченого олигонуклеотида TRE конкурировал за белки, связывающиеся с ним, точно в такой же степени, что и избыток .самого немеченого сайта CRE. Что касается негомологичных конку-■ рениий, то 50-кратниГ1 избыток олигонуклеотида DSE несколько уменьшал GRE-связиаание, а олигоиуклеотид E2F совсем не конкурировал с меченой пробой CRE за белки ядерных экстрактов недифференцированных клеток FS.

В экспериментах второго типа проводили конкуренцию между мечзиым сайтом TRK или CRE и 50-кратным избытком специфического немеченого' конкурента, добавляя .последний в буфер с ядерным экстрактом либо' одновременно с меченой пробой , ■ либо за 20 кинут-до ее добавлении, либо через 20 минут после. Соответствен-

.Последовательности сайтов TBE и CRE обладают

но, происходила дцб<з собственно конкуренция, либо предвзритеяь-иое насыщение конкурентом, либо вытеснение цм меченой пробы из• комплекса. При все* способа* добавления конкурента комплекс ретардации с меченый олигонуклчогидои TPß исчеэа*. Значит, его» комплекс действительно специфичен« но не слишком стерилен, т-к. легко вытесняется ^збыткем немеченого специфического конкурента. Что хасйется рйВ-свяэмаания, то оно в таких опыт»* исчезало полностью только ^ случае конкуренции иди насыщения. Если «те конкурент добавляли * реакционную смесь после меченого Ьлир®-нуклеотида, то вытеснение посл*днего происхадиио ив до кониа.

Общепринятым считается утверждение, что в недифференцированных Кл^ткак тера.тркарцином не выявляется ТИК-овяэываюаа* активность (транскрипционный комплекс ftp*l) <с«о«г»ч «t «I., 1980j Luoibello at al., 1968). комплекс AP-1 считается активатором дифференцировкй этих клеток и с/йесгвует представление, •что его Физическое отсутствие в недифференцированных клетках отчасти обеспечивает поддержание Их недиффсренцированности. Согласно нашим данным, при определенных условиях (ВаМ На) Можно получить специфичное, но довольно нестабильное связывание белков ядерных экстрактов недиФФеренцировпйных клеток £8 с олиго-йуклеотидом TRE, однако, не энай белкового состава комплекса, трудно судить о его Функции, . т.к. Фактор • АР-1 может выть представлен набором гетеро- И гокодимеров бейков-членов семейств Fos и Jun и обладать разными регуляторными свойствами (Reneone, Verh», 1990| Angal, Kar.ln, 1992).

яанных клеток Ffi. Особвпмостьи взаимодействия белков ядерных экстрактов клеток F8 с о.лигонуклеотидиой пробой D3E Было образование множества комплексов ретардации с разной электрофорати-ческой подвижностью. 0 экспериментах с независимо приготовленными экстрактами эти комплексы выявлялись • с различной четкостью. Стабильно присутствовал на электрофорегранмах только банд с наименьшей подвижностью, который к тому же исчезал при введении 50-кратного избытка специфического конкурента. Поэтому' ми считаем именно его специфичным длй данной олигонуклеотидной пробы. Использование я качестве конкурентов негомологичныя сайту DSE олигонуклеотидов CRE, IRE и E2F никак не влияло на образование этого ЦИК-белкового комплекса. С другой стороны, добавление 50-кратного избытка немеченого олигонуклеотида DSE приво-

дило к уменьшению специфических комилексиь ретардации с .¡¿гченими пробами 7RE, СНЕ и El1.)''. Поскольку это конкуренция негомологичных последовательностей, мы предполагаем участие в utrt бе-лок-белковыи взаимодействий.

E2grcua.3 над нда^дам&а-ад&шщ__аисягАктсз___^лиЛ.Г'Л.'гииим^

caunux_JSJiaii!ji_SJ.u_Bsai!MOj.pftcTflHs ядерных экстрактов недит арен-цированиыи клеток KU о меченой олигопуклеотидной пробой ЕйР ыкз зависимости от концентрации ионов Из в буфере длл связывания Приводило к образованию двук комплексов ретардации с хорошо различающейся элегтрофоретическоп подвижностью (рнс.Э). эти комплексы отличались такий и по отношению к специфическим и неспецифическим конкурентам. При специфической конкуренции с избытком немеченого олигонукльотида E2F оба комплекса исчезали, но неравномерно. Комплекс с меньшей подвижность» исчезал 'быстрее", т.е. при ксполъзиваннл более низких концентрации конкурента. В качестве иегомологичнык носпецифическнх конкурентов меченой пробе 22F мы использовали последовательности DSB, ОРЕ и TBS. На образование верхнего комплекса ретардации несп^пифи -ческие конкуренты никак не влияли. Интенсивность же нижнего банда существенно уменьшалась при введении в буфер дчя сььзыиа-ния избытка синтетических олигонуклеотидо.ч TSE и DSE. Л этом случае ми опять имеем дело с конкуренцией негомологичпых последовательностей, которая мояег происходить за счет белок-б^лко-вых' взаимодействий.

Упрощенно происходящие in vitro конкуренции между neroMj-логичными последовательностями можно представить следуы'цим образом. При введении в реакционную смесь избытка конкурентного олигонуклеотида (в наших опытах E2F или OSE) белки ядерного экстракта образуют с ним комплекс . Если белки , связывающиеся с присутствующей в той же смеси негомологичной меченой пробои ■имеют сродство к этому комплексу, он выступает как конкурент, а мы наблюдаем уменьшение интенсивности банда при ретардации. Возможны и другие ситуации: например, конкуренция можду разными ДНК-6ел.ковыми комплексами за общий стабилизирующий Фактор. Очевидно, чго большое значение для выявления подобных взаимодействий in vitro имеет количественное соотношение конкурирующих проб, условии, влияющие на стабильность взаимодействия белков с ДНК, и многой другое. Тем не менее, мы считаем полученные результаты предпосылкой дли поиска и изучения регулиторной роли

подобных явлений in vivo.

Известно, что в клетках разного происхождения с.последовательностью D6E o-fо.ч-промотора непосредственно взаимодействуют Белки p87-SSF и P62-TCF и что ДНК-белковьЩ комплекс, образующийся в этом месте, очень стабилен и присутствует там и при активированном, и . при • репрессированном. состоянии промотора (Herret-a et.al., 1988! Konig, .1991). Этот комплекс - многокомпонентный и в нем обнаружено множество не связывающихся с ДНК белков, возможно, определяющих, клеточную специфичность регуляции c-fов-промотора (Treisman, 1902). Таким образом, весь «Ле-меит SRE (DSS+FAF) - мииень белок-бчлксаых взаимодействий, важнейших для регуляции функции промотора в целом. Например, такие взаимодействия, существуют между комплексом АР-1 и многокомпонентным комплексом, связанным с элементом DSE промотора c-fos, в клетках HIK3T3 и участвуют В негативно*» авторегуляции этого промотора после стимуляции сывороткой (Xonig et al., 1338).

В опатах по конкурентной!" титрованию in vivo именно последовательность DSE вольте всего влипла на уровень нндуцированной циклогекекммдом С'АТ-акгивности. Поэтому тот факт, что в наших опыта* in vitro, последовательность DS2 выступает как эффективный негомологичный конкурент TR3- к CRH-связыгания ядерных белков недифференцированных- клеток FS, вголне мо»ет отражать взаимоотношения, Нмегоэшг игсто in vivo, и должен быть использован для их изучения. . .

Что касается комплексов, валимо действующих в недифференцированных клетках F9'c последовательностью саПта связывания E2F, то до конца еце непонятно, какие белки в них вкодят, какую они играв г регуляторкуи роль, и какими механизмами связаны "с экспрессией Elrt-подобнсй активности. Взаимодействия между известными белками,_ образующими комплексы с последовательностями DSE и TRE, к нсизЕесткыми белками, образующими нигкнип комплекс ретардации с сайтом E2F, мохено использовать дле их идентификации, даке . если эти взаимодействия существуют только in vitro. Ведь собственно белок E2F и кодирукжнл его ген были охарактеризованы тольчо после того, как; стало известно, что K2F находится в комплексе с белком Rb и благодаря гтену (N'evihs, 1992),

в т.-лом дли нас вааш, что ми получиди первичную информацию о нрнс'гтетпни в недиффоринцированник клетках FÜ белков, способных специфически пзаикздеИствонить iri vii.ro с олигоиукле-

отидными последовательностями ригулнг-орник элементов DSB, TRB, CRB и E2F. Под специфичностью мы понимаем здесь не белковый состав этих комплексов, который ми не аналиэирозалн, а тот факт, что каждый из них отличается от других собственным характером выявления и поведения в экспериментах по специфической и неспецифической конкуренции.

5ЫВОДЫ

1.Низкий уровень активности промотора протоонкогена c-fos 'в недифференцированных клетка» линии гератокарциномы мыши F9

обусловлен негативным контролем функции промотора со ' стороны короткоживущих белкоз, который не взаимодействуют не-, посредственно с промотором.

2.Белки или их комплексы, взаимодействующие с регуляторни-ми последовательностями TRE, CRE и D3E присутствуют в недифференцированных клетках Ь"9 и способны к специфическому ДНК-связыванию in vitro. Короткокивуцие негативные регуляторы обуславливают их неспособность активировать промотор гена c-foa путем пост-трансляционных модификаций.

3.Промотор протоонкогена o-foa в недифференцированных клетках Е9 не регулируется активаторами основных путей передачи сигналов: цйМФ-зависимого; ФосФоинозитольного (зависящего от протеинкиназы С)) зависящего от рецепторов факторов роста.

4.Особенности негативного контроля промотора протоонкогена o-foa специфичны для клеток линии тератокарциномы мыши F9 и могут иметь непосредственное отношение к поддержанию их недифференцированного Состояния. ДиФФеренцировка клеток линии F9 рети-ноевой кислотой и дибутирил-цАМ$ является физиологическим способом активации промотора гена o-foa в эти* клетках.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

•1..Поспелова Т. В., Кислякова Т.В., Медведев A.B., Кукушкин А.Н.. Волков И.В., Светликова С.Б.! Поспелов В.А. Структурно-Функциональный ■ анализ промоторов, регулируемых в клеточном цикле геноЬ при" иммортализации, трансформации и дифференцировав клеток. - Тез.'8-го двустороннего симпозиума СССР-ФРГ "Организация, генома и' регуляция активности геноа". Иркутск, 1389,

с. 77-Ve.

й.кислякоьа 'f.В., Поспелова Т.Ъ., Поспелов В.а. Ростовые i-морфологические характеристики недифференцированных и дифферен-цир&ваннмх клеток линии тератокарииномы мыли F9. - Цитология, 1990, т.32, с .64-«О.

З.Кислякова Т.В., Севтликова С .Б.,. .Лавровский Я.В., Поспелова Т.З., .Поспелов В.Д. Негативный контроль экспрессии промотора протоонкогена c-fos в Недифференцированных клетках лини,-тератокарциномы мыши F6 . - Докл.АН СССР, 1990, т.310, с.1504-1506.

• 4.Poepelov V.A., Vikhanskaye F.L., Volkov I.v., Kislyekovf Т.V., Kukushkin A.N.',- Pospelova T.V., Svetlíkova S.B. Protooncogene , c-fos: different models of negative control. Abstr. of Soviat-Finn ish symposium "Signal- molecules and cal: differentiation". Ontogenas, 1991, v.22, p.403.

Pili. ТшиШ'.йса; .137. 'гш. l'üJ. 12.03.93 .Бесплотно.