Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование молекулярных механизмов дерегуляции супрессора опухолевого роста PDCD4 в опухолевых клетках

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование молекулярных механизмов дерегуляции супрессора опухолевого роста PDCD4 в опухолевых клетках"

На правах рукописи

ВИХРЕВА Полина Никитична

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ДЕРЕГУЛЯЦИИ СУПРЕССОРА ОПУХОЛЕВОГО РОСТА РРСР4 В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

"! С С !~> ?П1К I /,ПО ¿и 1з

Москва 2014

005557279

Работа выполнена в лаборатории молекулярной онкогенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук.

Научный руководитель: Коробко Игорь Викторович,

доктор биологических наук

Официальные оппоненты: Лагарькова Мария Андреевна,

доктор биологических наук, зав. лабораторией генетических основ клеточных технологий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Зиновкин Роман Алексеевич,

кандидат биологических наук, научный сотрудник кафедры вирусологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита диссертации состоится «./О » С/?(?сЫ 2015 года в '¡Я- часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д.34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук по адресу:

http://www.genebiology.ru/dissertation/dis-3/Vihreva-dissertation.pdf

Автореферат разослан « ¿У» ^¿ftfJAl 2014

Ученый секретарь диссертационного совета канд. фарм. наук

года.

Р ГГ l-Vciftc-t o .Я

v~y Р С V' С- & ' /С С? ¿У^ .,— Грабовская Любовь Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Одной из главных причин смертности в мире остаются онкологические заболевания. Природа каждой раковой опухоли с молекулярной точки зрения всегда уникальна. Возникновение и прогрессия опухоли определяется многочисленными и разнообразными факторами и процессами, среди которых, однако, общепринятым является представление об онкогенах и генах-супрессорах опухолевого роста, играющих противоположные роли в процессе опухолевой трансформации. Повышенное внимание к белкам-супрессорам опухолевого роста связано с их ключевой ролью в защите от возникновения и прогрессии онкологических заболеваний. Дерегуляция супрессоров опухолевого роста играет важную роль в процессах возникновения и прогрессии опухолей. Знание особенностей функционирования супрессоров опухолевого роста позволяет на рациональной основе разрабатывать способы восстановления и регулирования их функций, тем самым расширяя спектр методов борьбы с онкологическими заболеваниями. Так, изменения уровня экспрессии или мутации супрессоров опухолевого роста в процессе злокачественной трансформации клеток могут служить диагностическими (так как являются характерными чертами именно опухолевых клеток) и прогностическими (так как могут коррелировать с дальнейшим течением заболевания) маркерами опухолей. Дерегуляция супрессоров опухолевого роста также может коррелировать с чувствительностью опухолевых клеток к различным анти-неопластнческим препаратам. Понимание молекулярных механизмов функционирования супрессоров опухолевого роста необходимо для выявления способов восстановления их активности, создания рациональных способов диагностики онкологических заболеваний, выбора оптимальной стратегии лечения, а так же для создания препаратов, характеризующиеся высокой эффективностью и специфичностью воздействия, тем самым способствуя расширению спектра методов борьбы с онкологическими заболеваниями.

В настоящее время известно большое количество генов и кодируемых ими белков, обладающих свойствами супрессоров опухолевого роста. Несмотря на общность в способности ингибировать возникновение и прогрессию опухолей, механизмы действия супрессоров опухолевого роста чрезвычайно разнообразны. Объектом настоящего исследования является один из супрессоров опухолевого роста, Programmed Cell Death 4 (Pdcd4). Опухолевые клетки различного происхождения часто характеризуются сниженным, вплоть до полной потери, уровнем белка Pdcd4. На сегодняшний день известно, что в основе снижения уровня белка Pdcd4 лежат усиленная деградация белка, его сниженная продукция и деградация кодирующей белок мРНК, обусловленная повышенной активностью проонкогенных процессов. При этом, как показали проведенные ранее исследования, потеря Pdcd4 способствует прогрессии опухолей. Все это делает исследование свойств, функций и механизмов дерегуляции Pdcd4 в опухолевых клетках

актуальной задачей, решение которой позволит глубже понять молекулярные процессы, определяющие прогрессию опухолей, и выделить критические мишени для воздействия на опухолевые клетки.

В связи с тем, что каждая раковая опухоль с молекулярной точки зрения уникальна, наиболее перспективной и актуальной в последние годы является тенденция к разработке противоопухолевых препаратов направленного действия, против определенных молекулярных мишеней. Известно, что белок Рс1сс!4 является мишенью для многих сигнальных каскадов, которые активированы в опухолевых клетках и приводят к снижению его уровня в клетке. Таким образом, белок РсЫ4 может быть использован как маркер суммарного воздействия на многочисленные про-онкогенные процессы.

Данная работа посвящена исследованию молекулярных механизмов, ответственных за супрессию Рс1с<14 в клетках рака легких и меланомы. Несмотря на то, что есть литературные данные, свидетельствующие о возможной роли белка Р(1с<14 как фактора, препятствующего развитию и прогрессии рака кожи, меланома, являющаяся одним из наиболее агрессивных видов онкозаболеваний, остается неизученной в отношении изменения уровня экспрессии Рс1сс14. Что касается опухолей легкого, то для них снижение уровня транскрипта Р&(14 является значимым прогностическим фактором, и опухоли легкого рассматриваются как одна из перспективных мишеней для генной терапии с использованием Р<1сс14. Однако молекулярные механизмы дерегуляции Р<1сс14 в клетках рака легкого остаются неизученными.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование молекулярных механизмов, ответственных за супрессию Рёсс14 в клетках рака легких и меланомы. Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Исследовать характер продукции белка Р(1сс14 в клетках меланом человека по сравнению с нормальными меланоцитами.

2. Исследовать характер экспрессии Р(Ы4 в клетках рака легких по сравнению с клетками нормального бронхиального эпителия.

3. Установить вклад протеолитической деградации белка в супрессию Рс1сс14 в клетках рака легких.

4. Исследовать роль протеинкиназы СЭКЗР в регуляции экспрессии супрессора опухолевого роста Р(1сс14 в клетках рака легких.

5. Исследовать роль микроРНК в рапамицин-зависимой регуляции транскрипта Рс1сс14 в клетках рака легких.

6. Исследовать тТСЖ-зависи.мое ингибирование активности промотора гена Рс!сс14 в клетках линий рака легких.

Положения, выдвигаемые для защиты

1. Уровень супреесора опухолевого роста Рс1сс14 снижен в -25% исследованных меланом. Снижение уровня супрессора опухолевого роста в клетках меланом частично опосредовано активностью Ак1-сигнального пути.

2. Уровень супрессора опухолевого роста Р(М4 значительно понижен во всех восьми исследованных клеточных линий рака легких. Изменение уровня белка Рс)с<14 не коррелирует с аналогичными изменениями в уровне транскрипта Р&с14.

3. Активность протеинкиназы ОЭКЗР необходима для поддержания уровня РсЫ4 в клетках рака легких.

4. Протеолитическая деградация не является единственным молекулярньм механизмом снижения уровня супрессора опухолевого роста Рс1сс14 в клетках рака легкого, опосредованного активацией АИ-сигнального пути.

5. МикроРНК, в частности, микроРНК тШ-21 и тШ-183, сайты узнавания которых находятся в З'-нетранслируемой области транскрипта Рс1ес14, не опосредуют рапамицин-зависимую супрессию транскрипта Рс1а14 в клетках линии Са1и-1.

6. Активация АЙ-сигнального пути приводит к опосредованной сигнальным комплексом тТОЯС 1 супрессии транскрипции с промотора гена Рс1сс!4.

Научная новизна исследования. В работе впервые был проанализирован характер экспрессии Рёсё4 в клетках меланом. Полученные данные указывают на то, что потеря Рс)с(М при меланоме не такое частое событие, но, тем не менее, статус экспрессии Рёсс14 позволяет выделить подгруппу меланом, и может быть использован для их молекулярного типирования. Кроме того, было показано, что активированные А1а-сигнальный путь и, в меньшей степени, МЕК/ЕЯК-сигнальный путь, способствуют супресии Рёс<34 при меланоме.

В работе была впервые выявлена роль протеинкиназы ОБКЗр в регуляции Рс1сс14 в опухолевых клетках. Впервые было показано, что активация протеинкиназы вБКЗр, активность которой ингибируется в результате активации Ак^сигнального пути, необходима для поддержания уровня Рс1сс14 в клетках рака легких.

Было продемонстрировано, что ЛкЬсигнальный путь действительно играет существенную роль в супрессии Р(Ы4 в клетках рака легкого. Однако, в отличие от ранее описанных механизмов, не только за счет индукции деградации белка Рс1с114. Было продемонстрировано, что АкКигнальный путь тТОЯ-зависимо супрессирует транскрипционную активность промотора гена Р(1сс14, в то время как ингибирование Ак^шТОЯ-сигнальной оси отменяет эту супрессию. Таким образом, в работе выявлен новый механизм супрессии Р<1сс14 в опухолевых клетках,

состоящий в тТСЖ-зависимом иигибировании транскрипции гена Рс1сс14, что может являться одним из механизмов реализации про-онкогенной активности АкЬсигнального пути.

Теоретическая и практическая значимость работы. Представленные результаты работы вносят вклад и существенно расширяют понимание сложных молекулярных механизмов, ответственных за супрессию Рс1сс14 в опухолях. Результаты работы способствуют более полному пониманию молекулярных механизмов прогрессии опухоли и идентификации новых рациональных путей воздействия на опухолевые клетки. Обнаруженная вариабельность уровня экспрессии белка Р<1сс14 в клетках меланомы человека может быть использована как один из параметров молекулярного типирования меланом. Описанный новый механизм А1а-зависимого транскрипционного ингибирования экспрессии супрессора опухолевого роста Рс1сс14 может быть потенциально использован в практических приложениях для мониторинга эффективности действия существующих или с целью поиска новых таргетных противоопухолевых препаратов, используя транскрипционную активность промотора гена Рс1с<]4 в качестве индикатора супрессии АкЬсигнального пути, являющегося признанной мишенью в области создания противоопухолевых препаратов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, Россия, 28 сентября - 1 октября 2009 года), на VII международном симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, Россия, 1 -4 июня 2011 года), на конференции молодых ученых «Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты» (Москва, Россия, 13 апреля 2012 года), в финале программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК») (Москва, Россия, 27 апреля 2012 года), на 38-м ежегодном конгрессе Федерации европейских биохимических обществ РЕВ5-2013 (Санкт-Петербург, Россия, 6-11 июля 2013 года).

Личный вклад соискателя. Автором самостоятельно выполнен основной объем исследований, проведены обработка и анализ полученных экспериментальных данных, подготовлен иллюстративный материал, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость, а также подготовлены материалы публикаций в научных журналах. Эксперименты по картированию минимального фрагмента промотора гена Рс1с<]4, ответственного за влияние АкЬсигнального пути на транскрипционную активность промотора гена Р(1с^14, выполнены совместно с М.В. Шепелевым (ИБГ РАН, Москва). Антитела против белка РёссМ были получены ранее С.В. Калиниченко (ИБГ РАН, Москва). Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

{

\ Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Из них 4 статьи

в рецензируемых научных журналах и 5 тезисов докладов и сообщений на российских и международных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 109 страницах, содержит 30 рисунков и 4 таблицы, включает следующие разделы: «Введение», «Цели и задачи», «Положения, выдвигаемые для защиты», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Личный вклад автора», «Благодарности» и «Список литературы» (203 цитируемых источника).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Анализ экспрессии Р(1с{14 в клетках меланомы человека

Впервые функциональная роль Р<1с(14 как супрессора опухолевого роста была показана на примере рака кожи. Меланома - одна из наиболее агрессивных форм опухолей. Способность быстро метастазировать на ранних стадиях заболевания обуславливает высокую смертность больных, а также часто наблюдаемую неэффективность проводимого лечения, что делает актуальным поиск новых способов терапии меланомы, в том числе с учетом индивидуальных молекулярных особенностей опухоли.

Рис. 1. Экспрессия Рс1с(14 в клеточных линиях меланомы человека. Показаны результаты анализа уровня белка Рс1сё4 с помощью Вестерн-блоттинга лизатов клеток меланом и нормальных меланоцитов (НЕМ) с антителами против Р(1сс14 (Рс1сс14). Для нормирования общего уровня белка мембрану также окрашивали антителами против а-тубулина.

гр ч <Г Ч- Чг* # Я

Экспрессия супрессора опухолевого роста Рс1сс14 часто снижена в опухолевых клетках. Известно, что потеря белка Рс1сс14 в большинстве случаев связана с их прогрессией. Однако изменение уровня экспрессии Р(Ы4 в клетках меланом остается малоизученным. Нами был проведен анализ экспрессии Р<1с<14 на панели клеточных линий меланом человека. Статус

продукции Pdcd4 в клетках мелаиомы человека в сравнении с его продукцией в нормальных эпидермальных меланоцитах был определен для 23 первичных клеточных линий, полученных из резецированных меланом человека. В 6-ти клеточных линиях (Mel_253, Mel_Ch, Mel_82, Mel_R, MelKsen и Mel E) уровень белка Pdcd4 был значительно ниже, чем в нормальных меланоцитах (снижение уровня белка в 2.5 раза и более по сравнению с уровнем белка в нормальных меланоцитах). В 3-ех клеточных линиях (MelKor, Mel_Cher и Mel_259) уровень Pdcd4 был умерено понижен (снижение уровня белка в диапазоне от 2.5 до 1.5 раз) (Рис. 1). В остальных 14-ти клеточных линиях уровень продукции белка Pdcd4 был схож или, в некоторых случаях, даже повышен по сравнению с его уровнем в нормальных меланоцитах (Рис. 1). Таким образом, снижение уровня белка Pdcd4 наблюдалось в четверти исследованных клеточных линий меланомы. Тот факт, что все клеточные линии были получены на стадии прогрессирующей меланомы, указывает на то, что снижение уровня белка Pdcd4, по всей видимости, не является решающим фактором в её прогрессии.

Выявленная вариабельность продукции белка Pdcd4 в линиях клеток меланом человека может отражать известное разнообразие клинических форм меланомы. Как показали последние исследования, отличительная черта меланомы - это её высокая вариабельность на молекулярном уровне, определяющая чувствительность к действию различных препаратов. Необходимым условием для проведения эффективного лечения меланомы является диагностика ее подтипа. Классифицикация злокачественной меланомы на молекулярные подтипы позволит персонализировать лечение за счет возможности выбора оптимальных терапевтических подходов. Поэтому выявленная вариабельность уровня продукции белка Pdcd4 в клетках меланомы человека можно рассматривать как параметр, пригодный для молекулярного типирования меланом, который позволяет выделить группу опухолей со сниженным уровнем супрессора опухолевого роста Pdcd4. Такие опухоли, в свою очередь, могут характеризоваться специфическими молекулярными особенностями, существенными для выбора оптимального способа лечения. Таким образом, нами установлено, что экспрессия супрессора опухолевого роста Pdcd4 снижена в ~ 25% меланом по сравнению с нормальными меланоцитами, и статус экспрессии Pdcd4 позволяет выделять по этому молекулярному параметру группу опухолей.

2. Роль Akt Ii MEK/ERK сигнальных путей в супрессии Pdcd4 в клетках

меланомы

К настоящему времени описаны два основных механизма, ответственных за супрессию Pdcd4 в опухолевых клетках - это микроРНК-зависимая деградация транскрипта Pdcd4 и ингибирование трансляции с него, а также Akt/mTOR/S6K.l-зависимая протеолитическая деградация белка Pdcd4. Литературные данные указывают на то, что микроРНК не всегда является

причиной супрессии Pdcd4 в клетках меланомы, а активация Akt-сигнального пути может являться ранним предвестником прогрессии меланомы и в значительной степени способствует прогрессии опухоли.

Нами была исследована роль Akt-сигнального пути в супрессии уровня Pdcd4 в клетках меланомы. Для этого были использованы ингибитор киназ PI3K, активирующих иротеинкиназу Akt, и также ингибитор комплекса mTORCl, который в сигнальном пути стоит "ниже" киназы Akt. Р13К-киназы ингибировали при помощи ингибитора LY294002, а активность комплекса mTORCl - при помощи рапамицина. Обработка клеток обоими ингибиторами, как правило, приводила к повышению уровня белка Pdcd4 (Рис. 2). Следовательно, Р13 /Akt/m ТО R-сигнальный путь вовлечен в супрессию Pdcd4 в клетках меланомы, и ингибирование разных этапов этого сигнального пути приводит к явному повышению уровня Pdcd4 не только в тех клетках, которые характеризовались сниженным уровнем белка Pdcd4, но и в клеточных линиях, где уровень белка Pdcd4 оставался неизменным (см. Рис. 1).

A MelR Mel_253 Рис. 2. Эффект ингибиторов Akt и

- ly Rap PD - ly Rap Po MEK/ERK сигнальных путей на уровень продукции

— ат » Pdcd4 —~ —" Pdcd4 . ,. т, с

^^^^ белка Pdcd4 в клетках меланом. Лизаты были

вИРИ*** о-тубулин »в —"а-тубулнн прцГОтовлены из клеток указанных линий,

Mel Ch обработанных 10 мкМ ингибитора LY294002 (LY),

- LY Rap PD рапамицином в концентрации 20 нг/мл (Rap), 20

И1ЩгуЩя#'.' Pdcd4 мкМ ингибитора PD098059 (PD), или из

■■■■■ а-тубулин необработанных клеток (-). Уровень продукции

белка Pdcd4 определяли Вестерн-блот анализом с Б MelCher Mcl_Kor помощью антител к белку Pdcd4 (Pdcd4). Для

LY Rap PD -I.) Rap PD нормирования общего уровня белка в клеточных

— «■» т Pdcd4 — — mm — pdcd4 е

лизатах образцы окрашивали антителами против а-

~~~ ^^ а-тубулмн в— и-тувулин (д) _ клеточные линии со значительно

С.. . ... .. сниженным уровнем Pdcd4; (Б) - клеточные линии

Mcl Si Mel Me

LY Rap PD IY ~Rap PD c УмеРенно пониженным уровнем Pdcd4; (В) -

«и» Pdcd4 __- pdcd4 клеточные линии в которых уровень Pdcd4 сравним

._____с уровнем Pdcd4 в нормальных эпидермальных

--^^ а-тубулмм --— — о-тубулин J r r г

меланоцитах; (Г) - клеточные линии с повышенным

уровнем Pdcd4 по сравнению с нормальными

Д _ pi) эпидермальными меланоцитами.

-- — а-тубулин (t-тубулин

Akt-сигнальный путь рассматривается как перспективная мишень в лечении меланомы, и восстановление уровня продукции Pdcd4 в результате его ингибирования может являться одним из молекулярных механизмов противоопухолевого действия препаратов, воздействующих на этот сигнальный каскад.

Известно, что помимо Akt-сигнального пути, активация каскада MEK/ERK усиливает протеасомную деградацию убиквитинилированного Pdcd4, что также вносит вклад в понижение уровня опухолевого супрессора Pdcd4 в опухолевых клетках. Нами был исследован эффект ингибирования MEK/ERK-сигнального пути на уровень белка Pdcd4 в клетках меланом.

Ингибирование МЕК1/2 при помощи ингибитора PD098059 привело к увеличению уровня Pdcd4 в ' тех клетках, в которых Pdcd4 был практически потерян (Mel_253, Mel_Ch и Mel_R). Клетки линии Ме1_335.2 и MelP, в которых был отмечен высокий уровень Pdcd4 в сравнении с другими клеточными линиями, оказались практически нечувствительны к действию PD098059, так же как и к действию ингибиторов Akt-сигнального пути (LY294002 и рапамицина) (Рис. 2Г). Таким образом, полученные результаты указывают, что супрессия Pdcd4 в клетках меланом человека может быть частично обусловлена MEK/ERK-зависимым усилением его протеасомной

деградации. I

i

Резюмируя, восстановление уровня экспрессии Pdcd4 в клетках меланом можно достичь с | помощью ингибирования активностей Akt- и MEK/ERK-сигнальных путей, активность которых вносит вклад в супрессию Pdcd4 при меланоме. !

3. Анализ уровней белка и транскрипта Pdcd4 в клетках линий рака легких

Немелкоклеточный рак легких (HMKPJI) представляет собой тип опухолей, в которой часто j наблюдается супрессия транскрипта Pdcd4. При этом, как было продемонстрировано ранее, потеря !, Pdcd4 коррелирует с прогрессией опухолей легких, что указывает на возможное непосредственное участие Pdcd4 в сдерживании прогрессии опухоли. Однако механизмы, за счет которых 1 происходит супрессия Pdcd4 в клетках рака легких, остаются малоисследованными.

Ранее в нашей лаборатории впервые было показано отсутствие корреляции между уровнем ) транскрипта Pdcd4 и уровнем его продукта, белка Pdcd4. Мы продолжили детальное исследование уровней транскрипта и белка Pdcd4 в опухолевых клетках рака легкого.

Анализ уровня белка в 8 клеточных линиях НМКРЛ (NCI-H1299, Calu-I, NCI-H23, NCI- J Н460, NCI-H358, А549, NCI-596 и NCI-H292) и в нормальных человеческих бронхиальных эпителиальных клетках (НВЕрС) показал, что опухолевый супрессор Pdcd4 практически утрачен j (понижен более чем в 10 раз) во всех исследованных нами опухолевых клеточных линиях по сравнению с клетками НВЕрС (Рис. ЗА, Б). В то же время, при анализе уровня мРНК Pdcd4 наблюдалась другая картина (Рис. ЗВ). В клетках линий NCI-H460 и А549 уровень транскрипта Pdcd4 достоверно не отличим от контрольного уровня в клетках линии НВЕрС, а уровень белка \ Pdcd4 в них понижен, как и во всех исследованных клеточных линиях. На рисунке 3 видно несоответствие уровня транскрипта Pdcd4 и уровня белка Pdcd4.

Наши данные указывают на то, что уровень продукции белка Pdcd4 сильно понижен по сравнению с его уровнем в нормальных клетках бронхиального эпителия НВЕрС, даже в тех клеточных линиях, в которых не наблюдалось существенной супрессии транскрипта Pdcd4 (Рис.3). !

Полученные результаты несоответствия между уровнем белка и уровнем мРНК Pdcd4 указывают !

!

на то, что, по всей видимости, существуют пост-транскрипционные механизмы, которые обуславливают супрессию Рс1сс14 в клетках рака легкого.

iP

с»4

äCv

Pdcd4

i 1 : i : в А 1

I

■ ■

1

Рис. 3. Экспрессия Рс1сс14 в клеточных линиях рака легких. (А) Репрезентативные результаты Вестерн-блот анализа лизатов указанных клеточных линий рака легкого и а-тубулин нормальных человеческих бронхиальных эпителиальных клеток НВЕрС с антителами против Рс1с<14 (Р(кс)4). Для нормирования общего уровня белка мембрану окрашивали антителами против о-тубулина. (Б)

Денситометрический анализ результатов Вестерн-блотгинга с антителами против Рс)сс14. Данные представлены как средние значения трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение, нормированные

относительно содержания белка Рс1сс14 в клетках линии НВЕрС, которое было принято за 1,0. (В) Относительное содержание транскрипта Рс1сс14 в указанных клеточных линиях рака легких, определенное методом ПЦР в реальном времени. Данные

представлены как средние значения трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение. Содержание транскрипта Рс!сс14 в опухолевых клеточных линиях нормировано относительно содержания транскрипта Р<1сс14 в клетках линии НВЕрС, которое было принято за 1,0. н.д. - различия не являются статистически достоверными. *-Р< 0.05.

4. Роль Лkt/mTOR/S6КI-сигнального пути в супрессии Pdcd4 в опухолевых клетках рака легких

Как уже упоминалось, активация Akt-сигнального пути, являющаяся характерной особенностью опухолевых клеток, приводит, в свою очередь, к активации 56-киназы-1 (S6K1). Протеолитическая деградация Pdcd4 зависит от S6K1-зависимого фосфорилирования серина-67. Серин-67 белка Pdcd4 также является сайтом фосфорилирования и самой протеинкиназы Akt, что предполагает ее непосредственное участие в индукции деградации Pdcd4. Кроме того, протеинкиназа Akt может регулировать экспрессию Pdcd4 опосредованно, через микроРНК miR-21, поскольку активация Akt-сигнального пути может приводить к усиленной экспрессии

микроРНК miR-21. Таким образом, протеинкииаза Akt, видимо, играет ключевую роль в посттрансляционной регуляции белка Pdcd4.

Для исследования роли Akt/mTOR/S6Kl-сигнального пути в супрессии Pdcd4 сначала необходимо было исследовать, действительно ли Pdcd4 является мишенью для супрессии через Akt-сигнальный путь в клетках линий рака легких. Для этого был проведен анализ влияния ингибирования некоторых компонентов Akt/mTOR/S6Kl-сигнального пути на уровень Pdcd4 в клетках линий NCI-HI299 (немелкоклеточный рак легкого) и Calu-I (эпидермоидная карцинома легкого). Клетки обрабатывали следующими ингибиторами: рапамицин (ингибитор сигнального комплекса mTORCl); LY294002 (ингибитор Р13К-киназ) и Akt-inhibitor X (высокоспецифичный ингибитор протеинкиназы Akt).

На рис. 4 хорошо видно, что в клетках обеих линий обработка ингибитором Akt-inhibitor X, так же как и обработка LY294002 и рапамицином, приводит к повышению уровня белка Pdcd4. Эти данные указывают на то, что активированный Akt-сигнальный путь действительно играет существенную роль в супрессии Pdcd4 в исследованных линиях клеток рака лёгкого.

Рис. 4. Изменения статуса активации компонентов Akt/mTOR/S6K 1 -сигнального пути при обработке ингибиторами Akt-сигнального пути. Представлены результаты Вестерн-блот анализа лизатов необработанных клеток (-) и клеток, обработанных рапамицином (Rap; 20 нг/мл), ингибитором LY294002 (LY; 10 мкМ) или ингибитором протеинкиназы Akt, Akt inhibitor X (AktX; 20 мкМ) с антителами против белка Pdcd4 (А и Б), а для клеток линии NCI-H1299 (А) приведены результаты детекции суммарных уровней протеинкиназы Akt (Akt) и S6K1 (S6K1), и их активных фосфорилированных форм (P-Akt и P-S6K1). Для контроля суммарного количества белка в дорожках проводили детекцию а-тубулина.

Далее был проведен анализ изменения статуса активации компонентов Akt/mTOR/S6Kl-сигнального пути в клетках линии NCI-H1299 при их обработке ингибиторами Akt-сигнального пути, для чего использовался метод иммуноблоттинга лизатов клеток с антителами, позволяющими детектировать активированные формы протеинкиназ Akt и S6K1. Для этого использовали антитела против протеинкиназы Akt, фосфорилированной по серину-473, и антитела против протеинкиназы S6K1, фосфорилированной по треонину-389. Параллельно проводили детекцию суммарного количества протеинкиназ Akt и S6K1 с использованием соответствующих антител, узнающих белки независимо от статуса их фосфорилирования. Как и ожидалось.

А " LY Rap AktX

— — — Pdcd4

—~ а-тубулин

mm mm Akt

mm mm P-Akt

mm mm — mm S6K1

mm. P-S6K1

Rap LY AktX

— — — Pdcd4

—» а-тубулин

ингибиторы LY294002 и Akt-inhibitor X действительно приводят к инактивации протеинкиназ Akt и S6K1 в клетках линии NCI-H1299, о чем свидетельствует отсутствие их фосфорилированных форм (Рис.4). Рапамицин, мишенью которого является сигнальный комплекс mTORCl, находящийся ниже протеинкиназы Akt в сигнальном пути, вызывал только инактивацию S6K1, но не Akt (Рис. 4). Следует отметить, что все три ингибитора обладали сходной способностью восстанавливать уровень экспрессии Pdcd4 в клетках (Рис. 4). Эти данные указывают, что в непосредственной индукции деградации Pdcd4 в исследуемых клеточных линиях ключевую роль играет именно mTORCl и, вероятно, его мишень, протеинкиназа S6K1. но не непосредственно протеинкиназа Akt.

5. Роль протеинкиназы GSK3ß в регуляции экспрессии супрессора опухолевого

роста Pdcd4 в клетках линии рака легких

Помимо Akt/mTOR/S6K 1-сигнальной ветви, протеинкиназа Akt является компонентом и других сигнальных каскадов в клетке. В частности, одной из непосредственных мишеней Akt является протеинкиназа GSK3ß, фосфорилирование которой по серину-9 приводит к ее инактивации. В свою очередь, канонический Wnt-сигнальный путь, в котором инактивация протеинкиназы GSK3ß играет ключевую роль, часто является одним из аномально активированных про-онкогенных сигнальных путей, в том числе и при раке легкого. Принимая во внимание роль GSK3ß в процессах онкогенеза и ключевую роль протеинкиназы Akt в регуляции экспрессии супрессора опухолевого роста Pdcd4, нами была исследована возможная роль GSK3ß в Akt-зависимой супрессии Pdcd4 в опухолевых клетках.

А 0 0,05 0,2 0,5 2 10 0 МкМ Рис. 5. Влияние обработки клеток линий

— Pdcd4 NCI-111299 (А) и Calu-1 (Б) ингибитором

протеинкиназы GSK3ß (GSK3ß-inhibitor VIII) в а» щш — — а-тубулин указанных (мкМ) концентрациях на уровень

супрессора опухолевого роста Pdcd4. Уровень продукции белка Pdcd4 определяли Вестерн-блот Б 0 5 2 0 МКМ анализом лизатов клеток, обработанных

ингибитором, с помощью антител к белку Pdcd4 ** (Pdcd4). Для нормирования общего уровня белка

в клеточных лизатах образцы окрашивали """""" " а-туоулин антителами против а-тубулина.

В ходе работы выяснилось, что в клетках линии NCI-H1299 и Calu-I активированный Akt-сигнальный путь приводит к снижению уровня белка Pdcd4. Поскольку протеинкиназа GSK3ß является одной из прямых мишеней протеинкиназы Akt и ее Akt-зависимое фосфорилирование приводит к инактивации GSK3ß, мы исследовали эффект прямого ингибирования активности протеинкиназы GSK3ß на уровень белка Pdcd4. Обработка клеток линии NCI-H1299 ингибитором протеинкиназы GSK3ß (GSK3ß-inhibitor VIII) в течение 18 часов привела к дозо-зависимому

снижению уровня белка Pdcd4 (Рис. 5А). Аналогичный эффект ингибирования GSK3ß наблюдался и в клетках линии Calu-I (Рис. 5Б).

Таким образом, нами впервые выявлена роль протеинкиназы GSK3ß в регуляции супрессора опухолевого роста Pdcd4. Полученные экспериментальные данные предполагают, что активация протеинкиназы GSK3ß является необходимой для поддержания уровня Pdcd4 в клетках. Поскольку протеинкиназа Akt супрессирует активность GSK3ß, казалось бы, следовало ожидать, что из-за кумулятивного эффекта Akt на активность протеинкиназ S6K.1 и GSK3ß, ингибирование протеинкиназы Akt должно было бы привести к более существенному увеличению уровня Pdcd4 по сравнению с эффектом в клетках, обработанных рапамицином. Но это оказалось не так. Отсутствие такого эффекта в клетках линий NCI-H1299 и Calu-I может быть обусловлено тем, что существующий эндогенный уровень активности GSK3ß в них достаточен для того, чтобы поддержать С5КЗр-зависимый уровень Pdcd4. Однако дополнительные про-онкогенные сигналы, получаемые клеткой извне, которые могут приводить к супрессии активности протеинкиназы GSK3ß, могут приводить к дальнейшему снижению уровня Pdcd4 в опухолевых клетках. Принимая во внимание дозо-зависимый противоопухолевый эффект Pdcd4, открытый нами новый механизм супрессии Pdcd4 в опухолевых клетках может являться существенным фактором, вносящим вклад в дальнейшую малигнизацию опухоли и ее резистентность к терапии. В частности, одним из часто аномально активированных про-онкогенных сигнальных путей, в том числе и при раке легкого, является канонический Wnt-сигнальный путь, в котором инактивация протеинкиназы GSK3ß играет ключевую роль. Действительная же роль GSIGß-зависимой регуляции Pdcd4 в канцерогенезе и ее значимость в процессе прогрессии опухоли остаются предметом дальнейших исследований.

6. Вклад протеолитической деградации белка Pdcd4 в супрессию Pdcd4 в клетках

опухолей легких

Белок Pdcd4 подвержен S6K.1-зависимому фосфорилированию, которое ведет к последующему убиквитинилированию белка и далее к его деградации. Для того чтобы установить вклад протеолитической деградации белка в супрессию Pdcd4 в клетках рака легких мы провели анализ влияния ингибиторов компонентов Akt/S6K 1 /mTOR-сигналыюго пути (LY294002 и рапамицина), а так же ингибитора протеасом (MG132), на уровень Pdcd4 в клетках линий рака легких. Полученные результаты показали, что супрессия активности PI3K при помощи ингибитора LY294002, а так же ингибирование mTOR сигнального комплекса - 1 (mTORCl) при помощи рапамицина, приводит к повышению уровня белка Pdcd4. Этот эффект наблюдался во всех исследованных клеточных линиях рака легких за исключением только одной, NCI-H460 (Рис. 6). Следует отметить, что выявленное нами повышение уровня белка Pdcd4 в ответ на ингибирование

Akt-сигнального пути имело существенно более выраженный характер в клетках линий NCI-HI 299, Calu-I и NCI-H23 по сравнению с действием ингибитора протеасом MG132 (Рис. 6).

Таким образом, нами показано, что в большинстве исследованных клеточных линиях НМКРЛ, PBK/Akt/mTOR-сигнальный путь вносит существенный вклад в супрессию Pdcd4. Но, кроме того, значимость протеасомной деградации в супрессии Pdcd4 при НМКРЛ вариабельна. Это позволяет сделать вывод о существовании иных молекулярных механизмов, приводящих к снижению уровня белка Pdcd4 в опухолевых клетках в результате активации Akt-сигнального пути, отличных от описанной ранее протеасома-зависимой деградации белка Pdcd4.

NCI-H1299 Calul NCI-H292 NCI-H596

- LY Rap MG - LY Rap MG - LY Rap MG - LY Rap MG

NC1-H23 A549 NCI-H3S8 NC1-H46Q

- LY Rap MG - LY Rap MG - LY Rap MG - LY Rap MG

Рис. 6. Влияние обработки указанных клеточных линий рака легкого ингибиторами ЬУ294002 (ЬУ) (10 мкМ), рапамицином (Яар) (20 нг/мл ) или МвШ (МО (10 мкМ) в течение 18 часов на уровень белка продукции Pdcd4. (-) - необработанные клетки. Показан результат Вестерн-блот анализа с антителами к белку Pdcd4 (Pdcd4). Для нормирования общего уровня белка в клеточных лизатах образцы окрашивали антителами против а-тубулина.

7. Влияние ингибиторов Лк(/тТОК/86К1-сигнального пути рапамицина и

ЬУ29002 на уровень транскрипта Риа14

Если РВК/АЫтТСЖ-зависимая супрессия Pdcd4 не всегда обусловлена только протеасомной деградацией, то мы предположили, что Ак1-сигнальный путь может регулировать экспрессию микроРНК с последующей супрессией Pdcd4 через деградацию гранскриита РЫсс14 или супрессию трансляции с него. На первом этапе проверки этой гипотезы было исследовано влияние рапамицина и ЬУ294002 на уровень транскрипта Рс!сс14. Обработка клеток ингибиторами действительно приводила к повышению уровня мРНК Рс1сс14 во всех трех исследованных клеточных линиях (ЫСТ-Н1299, Са1и-1 и ^1-Н23), «чувствительных» к действию ингибиторов Ак^шТОЯ-сигнального пути в части Pdcd4 (Рис. 7), для которых нами ранее было показано различие эффекта обработки рапамицином, ЬУ294002 и Мй132 на уровень белка Pdcd4 (см. Рис. 6). Повышение уровня транскрипта Р<1сс14 при действии ЬУ294002 и рапамицина на компоненты РБК/Ак^тТОЯ-сигнального пути наблюдалось в чувствительных к этим ингибиторам клеточных линиях, таких как ЫС1-Н1299, Са1и-1 и NCI-H23. Таким образом, нами был установлен факт влияния Акьсигнального пути на уровень транскрипта Рс1сс14 в опухолевых клетках рака легкого,

которое опосредовано активностью сигнального комплекса тТ(ЖС1 в силу присутствия эффекта обработки клеток рапамицином.

8

*

■ необработанные клетки

■ LY294002

■ Рапамицин

Рис. 7. Ингибиторы компонентов PI3K/Akt/mTOR-сигнального пути LY294002 (LY) (10 мкМ) и рапамицин (Rap) (20 нг/мл) повышают уровень транскрипта Pdcd4 в клеточных линиях NCI-H1299, Calu-I и NCI-Н23. Уровень транскрипта Pdcd4 определяли при помощи ПЦР в

реальном времени и 1

нормализовали по уровню

[ по уровню вАРОН. данные трех экспериментов как значения трех

измерений 1. отклонение.

транскрипта

Представлены

независимых

NCI-H1299 Calu-I NCI-H460 NC1-H358 NCI-H23

средние независимых

значения

стандартное

Содержание транскрипта Pdcd4 в клетках, обработанных ингибиторами, было нормировано относительно содержания транскрипта Pdcd4 в необработанных клетках, которое было принято за 1,0. * - Р<0.05.

8. Вклад микроРНК пи И-21 в рапамицин-зависимую супрессию Рс1сс14 в опухолевых клетках линии рака легких

Литературные данные указывают на то, что микроРНК т\В.-21 играет значительную роль в супрессии Рс1сс14 в опухолевых клетках и ее уровень часто повышен при НМКРЛ. Было показано, что супрессия тИ1-21 часто приводит к повышению уровня экспрессии Pdcd4 и. кроме того, приводит к снижению интенсивности пролиферации и повышению проапоптотической активности клеток НМКРЛ. Нас интересовал вопрос: вовлечена ли микроРНК тг'Д-2/ в рапамицин-зависимое повышение уровня Рс1сс14 в клетках НМКРЛ? Для проверки гипотезы о том, что А к (-сигнальный путь регулирует тг'Я-2/ и за счет этого супрессирует РсЫ4, нами был исследован относительный уровень этой микроРНК в клетках линий рака легких и в клетках нормального легочного эпителия НВЕрС. Результаты показали, что в 6 из 8 исследованных клеточных линии рака легких не ! наблюдается повышенного уровня микроРНК тШ-21 по сравнению с клетками НВЕрС (Рис. 8).

Далее нами было исследовано влияние ингибиторов Ак1-сигнального пути 11^294002 и

рапамицина, приводящих к увеличению уровня транскрипта Pdcd4, на уровень микроРНК т¡11-21 в опухолевых клетках. Полученные результаты показали отсутствие влияния обработки опухолевых клеток указанными ингибиторами на уровень микроРНК (Рис. 9). Это

позволяет сделать вывод, что, микроРНК т/Д-2/ не является посредником в наблюдаемом эффекте повышения уровня транскрипта в ответ на ингибирование тТСЖС 1 рапамицином.

«; 0.5

I

Рис. 8. Относительное содержание микроРНК пи[1-21 в указанных клеточных линиях рака легких и контрольных клетках НВЕрС определяли методом ПЦР в реальном времени. Уровень микроРНК тИ<-2 / нормализовали по уровню транскрипта КЫибВ. Содержание микроРНК тШ-21 в опухолевых клеточных линиях нормировано относительно содержания микроРНК тМ-21 в клетках линии НВЕрС, которое было принято за 1,0. Представлены данные трех независимых экспериментов как средние значения трех независимых измерений ± стандартное отклонение.

— 4 '

|з.5-ы

к 3

0

1 2,5

■ необработанные клетки »1Л294002 ■Рапамицин

Рис. 9. Относительное содержание микроРНК от/Л-2/ в указанных клеточных линиях рака легких обработанных ингибиторами ЬУ294002 (10 мкМ) и рапамицином (20 нг/мл) определяли методом ПЦР в реальном времени. Уровень микроРНК тШ-21 нормализовали по уровню транскрипта ЧИибВ. Содержание микроРНК т'1Я-21 в клетках, обработанных ингибиторами, было нормировано относительно

необработанных клеток, в которых содержание микроРНК т1Я-21 было принято за 1,0. Представлены данные трех независимых экспериментов как средние значения трех независимых измерений ± стандартное отклонение.

- 13 1 0.5

о

11111111II

ЫС1-Н1299

Са1и-1 ЫС1-Н460 ЫС1-Н358 ЫС1-Н23

Для дальнейшего выявления роли микроРНК в Ак1-зависимом снижении уровня транскрипта Рс1сс14 в клетках рака легкого было решено исследовать влияние Ак1-сигнального пути на уровень экспрессии репортерного гена, сшитого с З'-НТО мРНК Рс1сс14. Как уже было сказано, в З'-НТО транскрипта Рс!с<]4 находится сайт связывания микроРНК тШ-21, а так же других микроРНК, регулирующих Рёсё4. Анализ влияния обработки клеток линии Са1и-1 рапамицином на активность репортерного гена люциферазы, сшитого с З'-НТО транскрипта Рс1сс14, показал, что, в отличие от увеличения уровня эндогенного транскрипта Рг1с(14, как нами было показано ранее (см. Рис. 7), рапамицин не влияет на уровень активности репортерного гена, сшитого с З'-НТО мРНК Рс1сс14 (Рис. 10А). В качестве контроля нами была использована аналогичная конструкция с сигналом терминации транскрипции и полиаденилирования вируса 8У40 вместо З'-НТО транскрипта Р<1сс14, для которой так же не наблюдалось эффекта обработки

рапамицином на активность репортерного гена. Таким образом, полученные результаты указывают на то, что наблюдаемый эффект рапамицина и ЬУ294002 на уровень транскрипта Р(1а14 не опосредуется цис-действующими детерминантами в З'-НТО мРНК Рс1с:с/4.

■3SV40 З'-НТО Pdcd4

необработанные

Рнс. 10. Влияние З'-НТО гена Pdcd4 на уровень продукции репортерного гена люциферазы ReniUa под контролем CMV промотора в клетках линии Calu-1 при их обработке рапамицином (А). кДНК люциферазы ReniUa под контролем CMV-промотора была сшита с З'-НТО Pdcd4 дикого типа (wt), или к З'-НТО Pdcd4 с мутированным (miR-21 (mut)) или делегированным (miR-21 (del)) сайтом связывания miR-21, или к З'-НТО Pdcd4 с мутированным сайтом связывания miR-183 (miR-183 (mut)) (Б). Активность люциферазы ReniUa нормализовали на активность люциферазы светлячка. Представлены данные трех независимых экспериментов в виде относительных единиц люминесценции (OEJI), как среднее значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение, н.д. - различия не являются статистически достоверными, * - Р<0.05.

Для исчерпывающего подтверждения отсутствия роли микроРНК miR-21 и miR-183, для которых ранее было продемонстрировано участие в регуляции Pdcd4, в рапамицин-зависимом увеличении уровня транскрипта Pdcd4 в клетках рака легкого нами был проведен сравнительный анализ активности репортерного гена люциферазы, сшитого с З'-НТО транскрипта Pdcd4 «дикого типа» или с введенными точечными мутациями, нарушающими связывание микроРНК miR-21 и miR-183, или с удаленным сайтом связывания микроРНК miR-21. Клетки линии Calu-I, трансфицированные репортерными конструкциями инкубировали в присутствии рапамицина и без него, после чего определяли активность репортерного гена. Как видно из результатов анализа, внесение мутаций или делеция сайтов связывания микроРНК также не приводила к изменению уровня репортерного гена в ответ на обработку рапамицином, что подтверждает отсутствие роли этих микроРНК в рапамицин-индуцированном увеличении уровня транскрипта Pdcd4 в клетках рака легкого (Рис. 10Б). Таким образом, повышение уровня Pdcd4 в присутствии рапамицина происходит не за счет снижения его микроРНК-зависимой пост-транскрипционной супрессии. Сделанный вывод справедлив для всех известных и потенциальных г/гге-регуляторных сайтов

18

узнавания микроРНК, находящихся в З'-НТО гена Рс1сс14, включая т1К-21 л тЖ-182, пйК-183 и тШ-499-5р.

9. шТОЯ-зависимая супрессия активности промотора гена Рс1а14 в клетках линии

рака легких

Как показали результаты наших исследований, известные механизмы посттранскрипционной регуляция Р<1«14 не могут полностью объяснить пониженный уровень Р(1сс14, который наблюдается в клетках рака легких. Литературные данные указывают на то, что изменение уровня транскрипции гена Рс1сс14 может вносить вклад в общую супрессию Рс1ес14 в опухолевых клетках. Не так давно было показано, что изменения содержания транскрипционного фактора гВР-89 может приводить к изменению уровня экспрессии Рс1сс14. Факт корреляции уровня Рс1сс!4 и мРНК ZBP-89 в опухолевых клеточных линиях дает основание полагать, что понижение уровня экспрессии гВР-89 в опухолевых клетках может вносить заметный вклад в снижение экспрессии Рс1сё4 в клетках рака легких на стадии транскрипции. Поэтому, для дальнейшего исследования механизма супрессии Р<1с114 в клетках линии рака легких, был проведен анализ влияния ингибирования Р13К/Ак1/тТ(Ж-сигнального пути на транскрипцию гена Рс1а14.

9.1. Способность ингибитора тТСЖ рапамицина оказывать действие на активность

промотора гена Р(1сА4

Нами была исследована возможность реализации эффекта рапамицина на уровень транскрипта Рс1сс14 через регуляцию транскрипции гена Рс1сс14. Для этого мы проанализировали влияние действия рапамицина на активность репортерного гена люциферазы светлячка под контролем 5'-фланкирующего участка гена Р<1сс14 размером около 3 т.п.н. (от позиции -2851 до +550 нт). В исследованных клеточных линиях, Са1и-1 и N0-111299, рапамицин приводил к индукции транскрипции с промотора гена Рс1с<М (Рис. 11). Таким образом, нами выявлен новый ранее неизвестный механизм, при котором активация АкЮТгналыюго пути приводит к ингибированию транскрипции гена Р<1сс14 в опухолевых клетках, и ингибитор тТСЖС 1 рапамицин способен усиливать транскрипцию гена Р(1сс14 через 1/г/с-регуляторный элемент(ы), локапизованный(ые) на участке гена Рс1сс!4 между нуклеотидами -2851 и +550.

Способность рапамицина ингибировать активность тТОЯС 1, в результате чего происходит повышение транскрипции Рс1с<14, говорит о том, что активация проонкогенного тТСЖ-сигнального пути способна воздействовать на уровень продукции Рс1сс14 на транскрипционном уровне. Схожие данные, свидетельствующие о том, что рапамицин повышает уровень мРНК Рс1сс14, были недавно получены и на клетках гепатоклеточной карциномы линии НиЬ7, что

подтверждает открытый нами феномен. Таким образом, АкУтТСЖУЗбК 1 -сигнальный путь может контролировать как деградацию белка Рс1сс14, так и транскрипцию гена Рс1сЛ4.

Рис. 11. Анализ активности репортерного гена люциферазы светлячка под контролем фрагмента 5'-области гена РаЫ4 в клетках линии Са1и-1 и N0-111299, обработанных (светлые столбцы) или необработанных (темные столбцы) рапамицином (20 нг/мл в течение 18 часов). Представлены данные трех независимых экспериментов в виде относительных единиц люминесценции (ОЕЛ), как среднее значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение. Значение ОЕЛ в клетках, обработанных рапамицином, нормировали относительно необработанных клеток, в которых значение ОЕЛ было принято за 1,0. * - Р<0.05.

9.2. Картирование минимального фрагмента промотора гена Рйа14, ответственного

за влияние АН-сигнального пути на транскрипционную активность промотора гена

РскиЫ

После установления того, что область от позиции -2851 до +550 нт гена Р<1с(14 человека обеспечивает способность рапамицина вызывать увеличение транскрипционной активности, нами было проведено исследование, направленное на установление минимальной области использованного нами фрагмента 5'-области гена Рс/сЛ, обуславливающего этот эффект. Для этого из 5'-области гена Рскх14 от позиции -2851 до +550 нт была получена серия из семи делеционных мутантов, сшитых с репортерным геном люциферазы светлячка (Рис. 12, левая панель). Анализ действия рапамицина на активность репортерного гена в клетках линии Са1и-1 под контролем различных делеционных мутантов 5'-области гена Рс1сс14 между нуклеотидами -2851 и +550 показал, что участок, обуславливающий чувствительность к рапамицину, расположен внутри фрагмента от нуклеотидов в позиции -53 до позиции +196 (Рис. 12). Данный участок гена, содержащий нетранслируемый экзон 1 (от нт +1 до нт +182) и часть интрона А, сохраняет способность к увеличению транскрипции репортерного гена при обработке клеток рапамицином, в то время как дальнейшая 5-концевая делеция и удаление экзона 1 приводила и к потере транкрипционной активности репортерного гена в целом, и к потере ее зависимости от обработки рапамицином.

Таким образом нами было показано, что экзон 1 гена Рс1сс!4 человека содержит цис-действующий элемент(ы), определяющие рапамицин-зависимое увеличение транскрипционной активности гена Рс!сс!4 в клетках рака легкого.

-И1 w.l

-ШЯ Hi ^ I S3/*'96

-9S —► Ll/C -225^550

-Ml—► LUC jg -599/.550

- u. —V LUC -W1H660

— «-' —► Luc

Luc

■-раламииин □+рапашцш|

0,2 0,3 0.4 0.5 0,6 0.7 AlcTiiBHOcrb люциферазы (OEJl)

0,8

Рис. 12. Картирование рапамицин-чувствительного элемента промотора гена Pdcd4 человека. Клетки линии Calu-1 были трансфицированы плазмидами, содержащими кДНК люциферазы светлячка под контролем указанных фрагментов промотора гена Pdcd4. Активность люциферазы светлячка нормализовали на активность люциферазы Renilla. Данные представлены в виде относительных единиц люминесценции (OEJI) как среднее значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение. pGL3-Basic - активность люциферазы при экспрессии с безпромоторной конструкции; Luc - репортерный ген люциферазы светлячка; Ех1 - экзон 1 гена Pdcd4. * - Р<0.05.

9.3. Анализ участков связывания потенциальных транскрипционных факторов с делеционным мутантом промотора гена Pdcd4

Для анализа участка промотора гена Pdcd4 на наличие потенциальных участков связывания транскрипционных факторов была использована база данных эукариотических факторов транскрипции TRANSFAC (TRANScription FACtor database). In silico анализ показал, что на участке гена, начиная от позиции -53 нт от сайта старта транскрипции и заканчивая положением + 196 нт, находятся потенциальные сайты связывания для нескольких транскрипционных факторов, включая регуляторную последовательность чувствительную к барбитуратам, ССААТ бокс и сайты связывания для СОМР1, рецепторов эстрогена, v-MAF и транскрипционных факторов семейства FOX (forkhead box). Существенно отметить, что из двух предсказанных сайтов связывания транскрипционных факторов семейства forkhead box на участке гена -53 нт - +196 нт (Рис. 13), один (расположенный "выше") является высококонсервативным в эволюционном контексте среди млекопитающих и птиц (анализ проводился в геномном браузере UCSC при Калифорнийском университете, Санта Круз, США). Это позволяет предположить, что транскрипционные факторы семейства forkhead box могут принимать участие в рапамицин-индуцированном повышении уровня транскрипта Pdcd4.

+48.. .ttactgggtagaagAAAACAAAAACAAACAGAgcgagaaggg.. .+89

Рис. 13. Фрагмент участка гена Pdcd4 (от нуклеотида в положении +48 до нуклеотида в положении +89 от сайта инициации транскрипции). Коровые последовательности двух предсказанных сайтов связывания транскрипционных факторов семейства forkhead box подчеркнуты. 18 нуклеотидов, которые были удалены из фрагмента -225 - +550 нуклеотидов от сайта начала транскрипции, представлены заглавными буквами.

Известно, что члены семейства FOX - транскрипционные факторы FoxA2 и FoxO, негативно регулируются протеинкиназой Akt. Было показано, что указанные транскрипционные факторы содержат сайты фосфорилирования протеинкиназой Akt. Фосфорилирование по этим сайтам приводит к инактивации транскрипционных факторов FoxA2 и FoxO за счет их секвестрирования в цитоплазме. Интересно отметить, что ортолог FoxA у дрозофилы и нематоды негативно регулируются TOR (мишень рэпамицина/target of rapamycin) также за счет их секвестирования в цитоплазме. Более того, у нематоды TOR-опосредованная регуляция ортолога фактора FoxA непосредственно зависит от ортолога нематоды S6 киназы, активность которой регулируется киназой TOR. Так как протеинкиназа Akt и S6 киназа 1 имеют одинаковые консенсусные сайты фосфорилирования, можно предположить, что транскрипционный фактор млекопитающих FoxA2 так же возможно негативно регулируется mTORCl-S6 киназой 1. Более того, не так давно было установлено, что еще один член семейства транскрипционных факторов forkhead box - FOXO связывается с нетранслируемым экзоном 1 ортолога гена Pdcd4 у дрозофилы и регулирует его транскрипцию.

9.4. Анализ активности репортерного гена под контролем делеционного мутанта

минимального фрагмента промотора гена Pdcd4, опосредующего эффект рапамицина

Далее нами было исследовано потенциальное участие сайтов связывания транскрипционных факторов семейства forkhead box в рапамицин-индуцируемом повышении уровня транскрипции Pdcd4. Для этого 18 нуклеотидов, содержащие консервативные сайты связывания транскрипционных факторов семейства forkhead box в 5-области гена Pdcd4, были удалены в контексте фрагмента гена -225 нт - +550 нт от начала транскрипции (Рис. 13). Далее был проанализирован ответ мутированного участка промотора на воздействие рапамицина методом измерения активности репортерного гена.

Такая делеция привела к отмене стимулирующего эффекта рапамицина на активность репортерного гена (Рис. 14). Таким образом, то, что консервативный сайт связывания транскирипционных факторов семейства forkhead box несет ответственность за рапамицин-зависимую регуляцию активности промотора Pdcd4, получило экспериментальное подтверждение.

■-рапамицин □ + рапамицин

-СЩрГг

Luc -225Î+550

H. Д.

Exon 1

¿ЯсЩ -225/+550

О 0.1 0,2 0.3 0,4 0,5 0.6 0,7 0.8 Активность люциферазы (ОЕЛ)

Рис. 14. Анализ активности репортерного гена люциферазы светлячка под контролем промотора гена Pdcd4 дикого типа или содержащая 18-ти нуклеотидную лелецию на участке, который содержит предполагаемые сайты связывания транскрипционных факторов семейства forkhead box, в клетках линии Calu-1, обработанных (светлые столбцы) или необработанных (темные столбцы) рапамицином. Активность люциферазы светлячка нормализовали на активность люциферазы Renilla. Данные являются репрезентативными, по меньшей мере, для трех независимых экспериментов и представлены в виде относительных единиц люминесценции (OEJI) как среднее значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение. Luc - репортерный ген люциферазы светлячка; Exonl - экзон 1 гена Pdcd4. н.д. -различия не являются статистически достоверными. * - Р<0.05.

За счет выявленного непосредственного влияния на активность нескольких транскрипционных факторов, сигнальный комплекс тТ(ЖС1 сегодня рассматривается не только как регулятор трансляции, но и как регулятор транскрипции. Тем не менее, ни один из транскрипционных факторов, которые, по данным на сегодняшний день, регулируются тТ(ЖС1, не имели предсказанных сайтов связывания на минимальном участке промотора Pdcd4,

способного обеспечивать mTOR-зависимую регуляцию транскрипции. Более того, единственными консервативными межвидовыми сайтами связывания на этом участке были сайты связывания транскрипционных факторов семейства forkhead box. Как оказалось, делеция этого мотива способна отменять mTOR-зависимое ингибирование транскрипции с промотора гена Pdcd4. Важно отметить, что член семейства транскрипционных факторов forkhead box белок FOXO недавно был идентифицирован как транскрипционный регулятор ортолога Pdcd4 у дрозофилы. Кроме того, было показано, что FOXO связывается с нетранслируемым экзоном 1 гена Pdcd4 у дрозофилы, фактически в том месте, где и расположен потенциальный участок связывания транкрипционных факторов семейства forkhead box в гене Pdcd4 человека, и делеция которого отменяла эффект рапамицина на транскрипцию Pdcd4. Эти данные в совокупности подтверждают предположение о том, что транскрипционные факторы семейства forkhead box могут быть вовлечены в рапамицин-зависимое повышение уровня Pdcd4. Несмотря на то, что некоторые транскрипционные факторы семейства forkhead box и были определены как мишени для регуляции протеинкиназой Akt, активность протеинкиназы Akt не ингибируется рапамицином. При этом, ортолог FoxA у дрозофилы и нематоды определены как мишени для протеинкиназы TOR, в последнем случае через ортолог киназы S6. В связи с этим, вполне вероятно, что mTOR (или непосредственно его мишени) может регулировать активность транскрипционных факторов

семейства forkhead box в клетках млекопитающих, тем самым оказывая прямое влияние на транскрипцию Pdcd4.

PI3K >- LY294002

Рис. 15. Обобщенная схема возможного участия Akt-сигнального пути в регуляции уровня Pdcd4 с учетом описанных нами новых молекулярных механизмов, предполагающего участие транскрипционных факторов семейства forkhead box и протеинкиназы GSK3p. Pdcd4 - белок Pdcd4; Pdcd4 - транскрипт Pdcd4.

С другой стороны, картированные рапамицин-чувствительные участки цис-действующего элемента промотора Pdcd4 могут опосредовать действие тех транскрипционных факторов, которые еще не выявлены в качестве мишеней для регуляции протеинкиназой mTORC 1. Потенциальный интерес в этой связи представляет, в частности, транскрипционный фактор PPARy, активность которого стимулируется за счет mTORCl. Так, агонист PPARy - пиоглитазон, приводил к снижению уровня бежа Pdcd4. Следовательно, возможно, что mTORC 1-сигнальный путь способен косвенно влиять на транскрипцию Pdcd4 через транскрипционный фактор PPARy. Указанные возможные варианты снижения уровня белка Pdcd4 являются перспективными для дальнейших исследований.

На рисунке 15 представлена обобщенная схема участия Akt-сигнального пути в регуляции уровня Pdcd4 с учетом описанных нами новых молекулярных механизмов, предполагающего участие транскрипционных факторов семейства forkhead box и протеинкиназы GSK3|3.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что снижение уровня супрессора опухолевого роста Pdcd4 происходит в -25% исследованных меланом и опосредовано активностью Akt-сигнального пути. Статус продукции Pdcd4 может быть использован для молекулярного типирования меланом.

2. Показано, что уровень супрессора опухолевого роста Pdcd4 значительно понижен во всех восьми исследованных клеточных линий рака легких. При этом изменение уровня белка Pdcd4 не коррелирует с аналогичными изменениями в уровне транскрипта Pdcd4.

24

3. Установлено, что протеолитическая деградация не является единственным молекулярным механизмом снижения уровня супрессора опухолевого роста Pdcd4 в клетках рака легкого, опосредованного активацией Akt-сигнального пути.

4. Впервые выявлена роль протеинкиназы GSK3P в контроле уровня супрессора опухолевого роста Pdcd4 в опухолевых клетках. Показано, что активность протеинкиназы GSK3P необходима для поддержания уровня Pdcd4 в клетках рака легких.

5. Установлено, что в клетках линии Calu-I рапамицин-зависимая супрессия транскрипта Pdcd4 не опосредуется микроРНК, в частности, микроРНК miR-21 и miR-183, сайты узнавания которых находятся в З'-нетранслируемой области транскрипта Pdcd4.

6. Описан новый молекулярный механизм Akt-зависимой супрессии Pdcd4, состоящий в mTORC 1 -опосредованном ингибировании транскрипции гена Pdcd4 в клетках рака легких. В промоторе гена Pdcd4 локализован цис-действующий элемент, опосредующий этот эффект.

Список опубликованных работ по теме диссертации

Статьи в научных журналах:

1. Вихрева ПН. Шепелев MB, Коробко ЕВ, Коробко ИВ.. Свойства и функции супрессора опухолевого роста PDCD4 и возможности их использования в онкологии. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010; (2):3-11. Обзор.

2. Вихрева ПН. Коробко ЕВ, Коробко ИВ. Регуляция супрессора опухолевого роста Pdcd4 протеинкиназой GSK3P в клетках рака легкого. Доклады Академии Наук. 2012; 442(6):825-827.

3. Vikhreva PN. Shepelev MV, Korobko IV. mTOR-dependent transcriptional repression of Pdcd4 tumor suppressor in lung cancer cells. Biochim Biophys Acta. 2014;1839(l):43-49.

4. Vikhreva PN. Korobko IV. Expression of Pdcd4 tumor suppressor in human melanoma cells. Anticancer Res. 2014; 34(5):2315-2318.

Тезисы конференций:

1. Вихрева ПН. Коробко ЕВ, Коробко ИВ. Роль протеолитической деградации в супрессии Pdcd4 в опухолевых клетках рака легких и меланомах. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, Россия, Москва, 28 сентября - 1 октября 2009, с. 162-163

2. Вихрева ПН. Шепелев MB, Коробко ЕВ, Коробко ИВ. Akt/mTOR-зависимое ингибирование супрессора опухолевого роста Pdcd4 в клетках рака легкого и его молекулярные механизмы. VII Российский симпозиум «Биологические основы терапии

онкологических и гематологических заболеваний», Россия, Москва, 1-4 июня, 2011. Онкогематология, 2011, (2), с.41

3. Внхрева ПН. Шепелев MB, Коробко ЕВ, Коробко ИВ. Молекулярные механизмы дерегуляции супрессора опухолевого роста Pdcd4 в клетках рака легких. Конференции молодых ученых «Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты». Россия, Москва, 13 апреля 2012, с. 31

4. Вихрева ПН. Коробко ИВ. Молекулярные механизмы дерегуляции супрессора опухолевого роста Pdcd4 в клетках рака легких (Системы высокопроизводительного скрининга веществ с противоопухолевой активностью на основе Pdcd4). Программа «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК»), Россия, Москва, 27 апреля, 2012, с.9

5. Vikhreva PN. Shepelev MV, Korobko EV, Korobko IV. Novel molecular mechanism of Akt-dependent down-regulation of Pdcd4 tumor suppressor in lung cancer cells. 38th FEBS Congress, Russia, St Petersburg, July 6-11,2013,280 (Suppl. 1); 379

Подписано в печать 10.12.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 120 Экз. Заказ № 6883-12-14 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39