Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменения ангиогенного фенотипа клеток фибросаркомы человека и формирование метастазов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изменения ангиогенного фенотипа клеток фибросаркомы человека и формирование метастазов"

г Г Б ОД - 3 МАР 1997

На правах рукописи

Вольперт Ольга Валерьевна

ИЗМЕНЕНИЯ АНГИОГЕННОГО ФЕНОТИПА КЛЕТОК ФИБРОСАКОМЫ ЧЕЛОВЕКА И ФОРМИРОВАНИЕ МЕТАСТАЗОВ.

03.00.04 - биохилшя

АВТОРЕФЕРАТ диссертации яа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1997

Работа выполнена в Институте Химической Физики Российской Академи наук (Черноголовка., Россия) и в Онкологическом Центре мемориальног госпиталя Северозападного университета (Чикаго, США).

Научные руководители:

доктор биологических наук,

ррофессор И.Н.Тодоров

доктор биологических наук,

профессор Н.П.Баук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.И.Дризе

доктор биологических наук ДА.Крамеров

Ведущая организация: - - Институт общей- генетики РАН

Зашита диссертации состоится " " 1997 в часов

на заседании диссертационного совета Д.001.45.02 в Гематологическоь научном центре РАМН, по адресу: 125167 Москва, Новозыковскш проезд, 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологической научного центра РАМН.

Автореферат разослан " "_ 1997

Ученый секретарь .' . .

диссертационного совета кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник В.Д.Реук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Огромное разнообразие опухолей, в сочетании с генетической стабильностью и связанной с ней высокой приспособляемостью опухолевых сток, осложняет проблему лечения злокачественных новообразований. В последние пы внимание ученых привлекают физиологические механизмы, воздействуя на торые препаратами, обладающими сравнительно низкой токсичностью, возможно яностью блокировать, или хотя бы замедлить рост злокачественных 1вообразовакий. Одним из таких механизмов, бесспорно, является ангиогенез.

; Ангиогенез определяется как процесс ответвления новых капилляров от нее существующих кровеносных сосудов. Ангиогенез практически не происходит в юрмировавшемся здоровом организме, однако сопровождает целый ряд тологических процессов. Наболее яркими примерами являются атеросклероз венная болезнь , некоторые аутоиммунные заболевания.

Данные, накопленные за последние несколько десятилетий, убедительно жазывают небходимость автогенеза для роста подавляющего большинства окачественных опухолей. Капиллярная система первоначально развивается в ц-иежаищх тканях; которые позднее замещаются клетками опухоли. Такая лиллярная сеть формируется из клеток нормального эндотелия, однако отличается ' нормальной по морфологии, плотности, и проницаемости сосудов. Плотная сеть пшляров снабжает растущую опухоль кислородом и необходимыми питательными ществами, позволяет выводить продукты жизнедеятельности клеток. Наличие яиллярной сети облегчает внедрение и распространение метастазирующих клеток, юм образом, для того чтобы злокачественная опухоль превысила в толщину ^сколько слоев живых клеток, необходима специализированная система капилляров. кспериментальнЫе данные последних лет позволяют предположить, что подобная тъ образуется в ответ на определенные сигналы, вырабатываемые опухолевыми 1етками. Лишенные возможности индуцировать образование новых капилляров, ;рвичные и метастатические опухоли не увеличиваются в размерах.

Механизмы индукции ангиогенеза опухолями в значительной мере ¡учены: большинство опухолей выделяет, так называемые, ангиогенные факторы, зторьтг диффундируют в направлении близлежащих кровеносных сосудов, и, ¡язываясь с рецепторами клеток эндотелия, инициирует последовательность зоцессов, приводящих к образованию новых капилляров. Несмотря на то, что не ;е клетки опухоли одинаково активно секретируют ангиогенные факторы, рагменты опухолей, также как и клонированные линии опухолевых клеток, имулируют ангиогенез в экспериментальных системах. Существует также ряд гханизмов, косвенно влияющих на ангиогенез: прогеазы, выделяемые опухолями, лсвобождают связанные ангиогенные факторы; макрофаги, привлеченные тухолями, выделяют дополнительные стимуляторы ангиогенеза.

Биологически активные вещества, не влияющие на рост клеток опухоли, но

нарушающие рост или целостность капиллярной сети, задерживают или прекращают развитие опухоли. Конъюгаты антител, направленных против опухолевых микрокатишяров, с бактериальным токсином замедляют рост опухолей у мышей, с полным излечением значительной части животных. Другим примером вещества, избирательно уничтожающего делящиеся клетки эндотелия, являются антитела, связывающиеся с интегрином альфа-5-бета-З на поверхности клеток , и приводящие к апоптозу и гибели клеток Напротив, стимуляторы ангиогенеза, в условиях, позволяющих избирательно воздействовать на клетки эндотелия, не затрагивая трансформиованных клеток, повышают скорость роста опухолей.

Опухоли развиваются из нормальной, здоровой ткани сформировавшегося организма, где микрокалилляры находятся в состоянии покоя. Покой поддерживается за счет преобладания анти-ангиогенных факторов над про-ангиогенными. Среды, кондиционированные культурами клеток нормальных тканей, в большинстве случаев подавляют ангиогенез. Список ' ингибиторов антиогешшх процессов постоянно растет, причем большинство из них вызывает задержки роста экспериментальных опухолей. Так например, скорость роста клеток карциномы человека, с искусственно повышенным уровнем экспрессии ингибирующего ангиогенез тромбоспондина (TSP), in vitro не отличается от скорости роста родительской линии. В то же время, формирование опухолей и эффективность метастазирования in vivo у них существенно понижена. Аналогичный эффект был обнаружен в клетках ангиомы мышей.

При переходе от нормальной ткани к злокачественной опухоли, на определенном этапе прогрессии должно произойти переключение ангиогенного фенотипа клеток, составляющих ткань. Исходя из того, что суммарный ангаогенный потенциал клеток'есть результирующая про- 'и айти- акгиогенкых сигналов, можно предположить, что равновесиг может сместиться в сторону индукции либо за счет повышения уровня положительных стимулов либо в результате понижения уровня отрицательных.

Как правило, в результате злокачественной трансформации in vitro или in vivo, клетки приобретают способность индуцировать ангиогенез. Многие иследователи отмечают резкое поышение экспрессии как факторов широкого спектра действия, так и узко специфичных дм эндотелия. Активированные онкогены влияют на ангаогенный фенотип -трансформированных клеток хозяина через факторы, стимулирующие сборку капилляров de novo. Известно несколько возможных сценариев. Ряд онкогенов кодирует факторы роста, стимулирующие ангиогенез. Многие онкогены стимулируют синтез проангиогенных факторов. Так, например, ras повышает уровень экспрессии VEGF, IGF-I или TNF-a в различных биологачеких системах. Возможны также непрямые эффекты активации онкогенов через ферменты, разрушающие клеточный матрикс: в результате деградации матрикса высвобождаются индукторы ангиогенеза, ранее недоступные для эндотелия.

Список примеров контроля супрессоров над ингибиторами ангиогенеза постоянно растет. ' Неизвестный на сегодняшний день . опухолевый ' супрессор, регулирует синтез аналога TSP в культуре клеток ВНК. Нормальный вариант антионкогена р53 поддерживает высокий уровень экспрессии ингбитора ангиогенеза

)мбоспондина - в фибробластах и эпител)Ш молочной железы, анти-онкоген, •сализованный на коротком плече хромосомы 10 генома человека - в клетках глии. 3 регулирует также уровень неизвестного пока ингибитора, ангиогенеза, который >ачивается на ранних стадиях прогрессии астроштш человека. Аналогичный фект наблюдается в случае ретинобластомы, где анти-онкоген Rb модулирует эдукцшо неизвестного ингибитора ангиогенеза.

Цель работы и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение постепенных изменений иогенного фенотипа культивированных клеток человека в ходе развития брссаркомы. При этом особое внимание уделялось внеклеточным белкам, ;авляющим развитие кровеносных сосудов, и их влиянию на формирование тферических. метастазов- -■*••-.

В работе ставились следующие задачи: количественный анализ про- и анти- ангиогенного потенциала клеток фибросаркоиы на различных стадиях развития и определение основных белковых факторов, ответственных за кумулятивный ангиогенный фенотип, создание экспериментальной модели количественной и качественной оценки

влияния первичной опухоли на формирование удаленных метастазов, демонстрация способности анти-ангиогенного белка тромбоспондина подавлять рост метастазов в использованной модельной.системе.

Научная новизна и практическая ценность раооты.

В данной работе произведен систематический анализ последовательных ¡енений положительных и отрицательных составляющих суммарного ангиогенного ■еншала клеток в ходе прогрессии злокачественной опухоли. Выявлены основные сгоры, определяющие ангиогенный фенотип клеток на различных стадиях вития опухоли. Показано, что потеря клетками способности подавлять юзование капилляров de novo является критическим условием прогрессивного та опухоли.

Обнаружено, что акти-ангиогенный белок тромбоспондин, выделяемый псами первичной опухоли, попадая в кровоток, успешно задерживает рост периментально индуцированных метастазов на периферии организма. Несмотря все возрастающий объем информации, проблема лечения" злокачественных ообразований все еще не решена окончательно. Современные методы не воляют обнаружить и своевременно устранить единичные трансформированные пси, отделившиеся от первичной опухоли. Именно в связи с этим, исследование анизмов ангиогенеза и естественных анти-ангиогенных факторов может найти жиданно широкое применение в клинической практике. Хроническое применение ибиторов. ангиогенеза после удаления первичной опухоли, могло ' бы дотвратить прогрессивный рост микрометастазов, и, тем самым, возобновление зой стадии болезни.

Апробация работы. <

Материалы работы были представлены на секции по онтогенезу метастазированию XI Гордоновской конференции з Род Айленде в 1995г., на сесси "Опухолевые' супрессоры и метастазы" Симпозиума по количественным методам биологии в Колд Спринт Харборе в 1996 г. и на семинаре отдела кинетик химических и биологических процессов Института Химической .Физики РАН Черноголовке в 1996г. 4

N

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы,

описания использованных экспериментальных процедур, изложения и обсуждеш полученных-результатов, и списка■ цитируемой литературы. Работа изложена на 1. сгранице машинописного текста и содержит 14 рисунков и 10 таблиц. Библиограф! включает 402 названий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Переключение, ангиогенного фенотипа, необходимое для развития опухолей в ходе прогрессии фибросаркомы у больных с синдромом Ли-Фраумени происходит за счет падения уровня анти-ангиогенного фактора тромбоспонцина и пошагового повышения уровня фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), причем оба процесса контролируются анти-онкогеном р53, и активированным онкогеном ras. _ ... ... ..... .

2. Тромбоспондин, выделяемый клетками первичной опухоли, а также и препар; очищенного тромбоспондина, подавляет рост экспериментально индуцированнь метастазов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Последовательные изменения ангиогенного потенциала в ходе прогресс! опухоли,-его положительные и отрицательные составляющие.

В более ранних работах, опубликованных лабораторией N.Bouck, бы показана связь между экспрессией нормального гена, кодирующего анти-онкоп р53, и продукцией секрегируемого супрессора ангиогенеза, TSP. Было обнаружен что в отсутствие нормального р53 количество TSP-1, лрозводимого фибробласпл понижается в 8-20 раз.' Показано было также, что TSP-1 в описанной cncrei является основным фактором, контролирующим развитие капиллярной сети, и, Т( самым, кровоснабжение опухоли. В. нашем распоряжении была коллекция клеточш линий, обладающих типичными признаками фибробласгов человека на рази стадиях развития- фибросаркомы. Это- позволило- изучить постепенные -изменет спектра факторов, влияющих на ангиогенез в ходе прогресш злокачествен» опухоли. Нас особенно интересовали нормальные фибробласты, культивированш

13 сформировавшегося взрослого организма (N-Fb); фибробласты ЛиФраумени, в которых одна из нормальных копий гена р53 утрачена в результате мутации в клетках яродышевого путм (LF-early); "бессмертные" фибробласты Ли-Фраумени, где в эезультате длительного культивирования утеряна оставшаяся нормальный аллель р53 'LF-late); первичные трансформированы е фибробласты, полученные при грансфекции иммортализованных клеток онкогеном ras, не способные формировать эпухоли при подкожной инъекции инмунодефицитным мышам (Ras, Tu-); грансформированные фибробласты, образующие опухоли у "голых" мышей (Ras, Ги+).

Согласно выдвинутой гипотезе, комплексный ангиогенный фенотип :кладывается из суммы активностей всех стимуляторов и супрессоров роста сапипляров, производимых клеткой. Исходя из этой посылки, суммарный щгиогекный потенциал можно наглядно изобразить, как своего рода равновесие «ежду индукторами и ингибиторами ангиогенеза, где результат зависит от того, сакой стимул преобладает в данный момент. Очевидно, переход от анти— шгиогенного к про-ангиогенному состоянию, происходящий на определенном этапе шокачественной прогрессии, является результатом смещения подобного равновесия з направлении положительных сигналов. Такое смещение часто является критическим, хотя и не единственным условием роста опухолей in vivo.

Уникальная коллекция линий фибробластов человека, ; обладающих <аракгерными особенностями фибросаркомы на разных этапах развития, позволяла проследить за изменениями положительных и отрицательных стимулов образования капилляров, вырабатываемых клетками, и, соответственно, изменениями их общего шгиогенного потенциала. Основным фактором, отвечающим за способность нормальных, и LF-early .фибробластов человека подавлять, ангиогенез in vivo и in vitro, является полифункшшальный белок громбоспондин. В среде, кондиционированной этими клетками, по данным Western блоггинта, тромбоспондин составлял до 10% общего содержания белка. В ходе злокачественной трансформации, уровень декретируемого тромбоспондина понижался в 8-20 раз. Для того, чтобы проследить за изменением общего ангиогенного потенциала клеток, на каждой стадии развития, набор последовательных разведений кондишкированных сред исследовали на способность подавлять миграцию клеток эндотелия in vitro. Концентрацию белка, необходимую для сокращения вдвое миграции в направлении положительного стимула, например, bFGF, определяли как EDjo, и использовали в качестве количественной характеристики данной клеточной линии. Аналогичную процедуру использовали для получения количественных характеристик клеточных лилий, обладающих про-ангногенным фенотипом: концентрация белка, необходимая для индукции 1/2 максимальной миграции определялась как ED50. Анализ индукции проводили в присутствии моноклональных антител, нейтрализующих активность тромбоспондина. Оказалось, что при последовательном переходе от нормального к трансформированному состоянию, способность подавлять ангиогенез утрачивается уже на стали иммортзлизации фибробластов! Факторы, стимулирующие ангиогенез, вырабатываются клетками на всех изученных нами ступенях прогрессии опухоли, но количество стимула возрастает в 3-5 раз при иммортализации клеток, и дополнительно увеличивается в"2-3 раза на стадии злокачественной трансформации.

Чтобы оценить относительный масштаб полученных величин, среды, кондиционированные нормальными и LF-ep фибробластами, исследовали на способность подавлять ангиогенез, вызванный клетками Ras, Tu+, обладающими максимальным ангиогенным потенциалом. Для тою, чтобы полностью блокировать миграцию клеток эндотелия в направлении среды, кондащионирвшной (Ras, Tu+)-клетками, достаточно было 1/2 - 1/4 количества белка, выделяемого нормальными фибробластами. Изменение уровней секреции индукторов/ингибиторов ангиогенеза в ходе прогресии фибросаркомы, с поправкой на относительный масштаб показано на Рис.1

Рис. 1. Относительное изменение стимулирующей и ингибиторной активностей в ходг прогрессии фибросаркомы. Стандартизованные единицы активности отображают величину, обратную ЕВ50, с учетом относительного масштаба величин, оцененного по способности ЬР-саг1у, блокировать ангиогенез, вызванный газ-трансформированными фибробластами.

Интересно было определить, какой именно фактор, выделяемый фибробластами и клетхами фибросаркомы, играет основную роль в стимуляции образования капиллярной сети. С помощью набора нейтралюухшцк антител, обладающих специфичностью к различным факторам роста, выяснили, что на всех ступенях' злокачественной прогрессии основным положительным сигналом служит фактор роста сосудистого эндотелия УБвР (Рис.2).

Количественный анализ содержания VEGF в кондиционированной среде показал резкое увеличение уровня секреции, параллельное росту про-ангиогенной активности. Northern анализ РНК, выделенной из соответствующих клеточных линий, показал, что уровень транскрипции гена VEGF возрастает аналогичным образом от нормальных клеток к опухолевым. Это можно-было предположить, в свете данных групп Keibel и Marme, демонстрирующих положительную регуляция транскрипции и активности VEGF онкогеном ras. Увеличение содержания VEGF, предшествующее злокачественной трансформации, можно приписать потере на этом этапе гена дикого типа, кодирующего антионкоген р53.

см см

I. , I madia only ЕЕБЗ media ♦ antl-VEGF

,-L,

U. U. U.

а а И

Ш ш п.

> > а

+ Î

—L гЧ

д.

Л,

Controls

LF-lp Ras.tu- Ras.tu-i-

i

'ис.2. VEGF - основной фактор, составляющий про-ангиогенный компонент

кумулятивного сигнала в фибробластах Ли-Фраумени. Данные представлены как % максимальной'миграции в направлении градиента концентрации bFGF. Анализ проводили в присутствии нейтрализующих антител к TSF, А4.1. TGF-b и bFGF не играют существенной роли в стимуляции ангиогенеза этими клетками.

Действительно, в иммортализовнных фибробласггах Ли-Фраумени транскрипция и секреция белка сравнительно высоки. При трансфекции температурочувствигельным мутантом р53, принимающем нормальную конформацию при температуре 32°С, уровень РНК и белка резко падал, если трансфектанты инкубировали при 32°С, и оставался неизменным при 38°С (Рис.3).

VEGF primers

3S° 32° 38° 32° й g- -Э- о' IT ~ qr < LP(neo) LP(p53) iuL^gb^^o

о о с

о "V + +

о 3 3

с 1—■ f—

о. о < со

_1 <л in (П

10 со

СС cr 1 а.

Actin primers

Рвс.З. Результаты КГ-РСЛ последовательностей УЕвр в РНК. клеток линий, соошетствутошях различным, ступеням прогрессии фибросаркомы у больных с синдромом Ли-Фраумени. На первых 4 дорожках - результаты КГ-РСЯ РНК иммортализованных клеток после трансфекции р53 содержащим веюором или его -гемяературо-чувствительным мутантом р53.

2. Природа ангиогенного сигнала, выделяемого клетками фибросаркомы человека НТ1080. 1

\ .

В подавляющем большинстве клеточных культур злокачественных опухолей, нормальная копия анти-онкогена р53 утрачена, так что в клетках продукт этого гена либо полностью отсутствует, либо экспрессируется мутантный белок.

• Одним из немногочисленных исключений является культура клбток фибросаркомы • человека НТ1030, в которой сохранены обе функцональные когаш гена дикого типа, кодирующего нормальный белок р53. Клетки НТ1080 отличаются сравнительно высоким уровнем секреции Т5Р-1, хотя кондиционированные ими среды индуцируют

югенез, как in vitro (миграция клеток капиллярного эндотелия), так и in vivo плантация под роговицу глаза крысы).

Грубое фракционирование по размеру белков, секретируемых клетками !OSO, приводит к ■ физическому рааделешто положительных и отрицательных 1алов роста и новообразования капилляров. Высокомолекулярная фракция (мол.

более 30 кДа)' с успехом' подавляла миграцию клеток эндотелия в мфицированной камере Бойдена в направлении положительного сигнала (bFGF), о время как низкомолекулярная (мол. вес менее ЗОкДа) фракция вызывала гвное перемещение клеток эндотелия через поры покрытой желатином мембраны, онструкция кондиционированной среды приводила к восстановлению исходного ттипа (Рис.3).

Reconstruction

ТОО pfr M ад-

Г" ч r±-

rS- & it i-î* i* '•H? ■w ¡a

O Media, alone

□ DFGF

.4.

Разделение и реконструкция комплексного аншогенного сигнала, выделяемого клетками фибросаркомы НТ1080.-

Полученные результаты полностью подтверждались in vivo, мм образом, было показано, что в случае НТ1080 общий ситная, выделяемый тками в окружающую среду, складывается из положительного и отрицательного шонентов таким образом, что равновесие сдвинуто в сторону образования щлляров de aovo. Естественно было предположить, что существенную роль в >собности высокомолекулярной фракции подавлять ангиогенез играет TSP. гавительно, нейтрализующие моноклональные антитела к TSP, А4.1, в читальной мере восстанавливали первоначальный уровень миграции в гравлешог положительного стимула, например, bFGF.

Чтобы выяснить природу возможных дополнительных отрицательных тавляющих кумулятивного сигнала, секретаруемого клетками фибросаркомы 1080, и, по возможности, определить стимулирующие ангиогенез белки, вводимые, клетками этой линии,, использовали аффинную хроматографию, с ариншированной Sepharose CL-6B. При злгоции белков градиентом концентрации >ристого натрия, был обнаружен единственный пик ингабиторной активности, два )екрывающихс'я пика, обладающих способностью стимулировать направленное смешение клеток капиллярного эндотелия и положительный сигнал в

несвязавшсйся фракции (Рис. 5а). Добавляя нейтрализующие антитела к белк: составляющим тот или иной пик, и анализируя результаты миграционного - анали удалось установить, что тромбоспондин является основным негативным регулятор ангиогенеоа в клетках НТ1080. Перекрывающимися пиками про-ангиогенн активности оказались ЬРОИ и УЕОК Молекулярный компонент, ицдуцирующ ангиогенез в несвязывающейся фракции, удалось успешно нейтрализовать помощью антител специфичных для УЕвР. Разделение УЕСР на две фракц объясняется существованием двух биологически активных форм этого фактора рос 165 и 169 Ша, образующихся в результате альтернативного сплайсинга мРН причем в более легкой производной отсутствуем гепарин-связывающий домен.

^»мг, «в » а*м > —

(Рис.5Ь).

Рис.5а. Хроматография белков еррды, кондиционированной клетками фиоросаркоиы НТ1080 с_. БерКагоке С1_-4В. Верхняя кривая - поиски фракций, блокирующих миграцию клеток эндотелия в направлении ЬБОЕ Под ней - поиски стимуляторных фракций. Нижняя кривая - профиль элюции белка.

inhibitory Inducing inducing Antibody activity «cllvity activity controls («Г.12-1Ц «ОМ« tbreuih)

Рис.5Ь.

Природа положительного и сттршшельного-хомпонента аигиогеиного сигнала, секретируемых клетками НТ1 080.

3. Тромбоспондин, как фактор, контролирующий формирование периферических метастазов.

ласно гипотезе, впервые выдвинутой J. Folkniaiv в 1990, первичные опухоли в ряде пев выделяют ингибиторы аншогенеза, которые, хотя и не в состоянии сдвинуть иьное равновесие между про- и анти- ангиогенными сигналами вблизи опухоли, адают в кровоток, в котором отсутствуют короткоживущие стимуляторы гогенеза, и сдержтают рост метастазов на периферии. Было естественно m о л ожить, что в случае фибросаркомы НТ1080, такой способностью гролировать процесс развития метастатических опухолей обладает TSP. Для зерки этого предположения были созданы варианты родительской линии НТ1080, абатывающие пренебрежимо малые количества TSP. При подкожном введении унодефицитным мышам, клетки как родительской линии НТ1080, так и гсенс-производные, лишенные TSP, образовывали прогрессивно растущие соли. Латентный период TSP(-) линий значительно короче, чем у родительской ли НТ1080, выделяющей полноценные количества TSP.

.Чтобы показать экспериментально влияние тромбоспондина, абатываемого клетками опухоли и циркулирующего в кровотоке, на развитие енных метастазов, использовали гетерогенную систему, в которой роль ¡ичной опухоли выполняли родительская линия НТ1080 или ее TSP(-) антисенс-«водные, в то время как роль легочных метастазов выполняли клетки мышиной шомы B16F10, введенные в хвостовую вену имиунодефишпных мышей (См.

6).

НТ1080 TSP(+)

НТ-23-TSP(-)

Схема эксперимента по влиянию первичной опухали на эффективность формирования метастазов.

Параметрами сравнения служили количество пигментированных метастазов I поверхности легкого и средний размер метастатической опухоли, экспериментальных группах мышей, не имеющих первичной опухоли, или несуш опухоли, ■ образованные Т5Р(-) производными клеток фибросаркомы НТ108 количество легочных метастазов превышало количество метастазов у мышей с ТБР(-опухолями, образованными клетками родительской линии, приблизительно в 20 раз Средний размер метастатических опухолей также существенно различался меж; группами животных с ТБР(+) опухолями и мышами, не несущими "первично! опухоли, или имеющими ТЗР(-) опухоли (Рис.7).

Рнс.7. Коррелляцня между фенотипом первичной опухоли и формированием экспериментальга легочных метастазов.

Интересно, что первичные опухоли с промежуточной продукцией тромбоспондш имели промежуточный эффект на формирование легочных метастазов в даннс экспериментальной системе Относительным преимуществом использованной наь гетерогенной системы была возможность отличить человеческий тромбоспощш циркулирующий в кровеносной системе мыши, от эндогенного, с помощью антите обладающих высокой специфичностью к человеческому "белку МА-1. Бы. исследована плазма крови, взятая у мышей каждой из экспериментальных групп, крови животных были обнаружены количества человеческого тромбоспондин приблизительно соответствующие количествам, выделяемым клетками первичне опухоли (Рис.8). При этом количество эндогенного белка не изменялось мех группами, оставаясь сравнительно низким.

■ Чтобы 'установить причинно-следственную связь.между уровнем ТБР крови экспериментальных животных и количеством легочных метастазов, плаз> крови, взятую у мышей каждой из, групп, исследовали на способность стимулирова

НТ1080 НТ-13 НТ-23

(ТЭР+) (ТвРн-/-) (ТЭР-)

и подавлять миграцию эндотелиальных клеток в камере Бойдена. Оказалось, что лки плазмы, взятой у мышей, несущих опухоли, развившиеся из клеток щительской линии фибросаркомы НТЮ80, подавляли миграцию, вызванную ЬЯСР, дипазоне концентраций от 20 мкг/мл до ЮО мкг/мл. Плазма крови мышей, не 4евших опухолей, не стимулировала и не подавляла миграции клеток эндотелия, в | время как плазма мышей, имевших, в качестве первичной, тромбоспондин :гативной опухоли производные фибросаркомы НТ1080, стимулировала 1ределенный уровень миграции, хотя и не высокий в сравнении с индуцированным -ХтР (Рис.9 а,Ь).

НТ-13, НТЮЗО,

ТЗР(+/-) ТЭР(+)

НТ-23

по (итог ТБР(-)

ДИИ^- -«ф». цири-

НС.8.

ТБР, секретируемый клетками первичной опухали, циркулирует в кровотоке экспериментальных животных. Стрелками ограничены группы мышей с первичными опухолями, развившимися из клеток обозначенного фенотип!

I t • plasma from tumor , Miring mi» j tr *'4 »bFGF_ _I

Primary HT108Q tumor (TSP+)

no tumor

BSA CO

HT-23 (TSP - )

Рис.9а. Плазма крови мышей с TSP(+) опухолями обладает анта-аншогенными свойствами.

(mouse 1) (mause 2)

Рнс.9Ь. TSP - освовной анти-алгиогешшй фактор в плазме мышей с замедленным формированием экспериментальных метастазов. "" "

Результаты, полученные in vitro, полностью подтвердились in vivo в экспериментах по имплантации под роговицу глаза крысы.

Анализ плазмы показал, что при наличии первичной, опухоли, клетки которой секретируют громбосповдин, некоторое количество выделяемого опухолью тромбосповдин попадает в кровоток, определяя при этом антн-ангиогенный потенциал плазмы. Для того чтобы продемонстрировать непосредственную связь

¡еду тромбоспондином, попадаюшм из первичной опухли в кровоток, ангиогенным •ешгиалом плазмы и формированием метастазов, иммунодефшпггным мышам была шита подкожно тромбоспондин положительная родительская линия эросаркомы HT10S0. После того, как "первичные" опухоли достигли 4-6 мм в метре, в хвостовую вену каждому животному ввели 1 млн клеток меланомы 5F10. Через сутки мышей поделили на 2 группы, в одной из которых жюотные :даевно получали в брюшную полость инъекции нейтрализующих антител к мбоспондашу. В качестве 'дополнительного контроля использовали мышей, не :юших "первичной" опухоли. Неожиданно оказалось, что размеры первичной аоли у животных, получавших инъекции антител, превышали размеры опухоли у вотных контрольной группы в 4-5 раз. Это, видимо, повлияло на количество мбоспондина, попадающего из опухоли в кровоток, так что ежедневная доза тел оказалась недостаточной, чтобы полностью нейтрализовать его анти-иогенную активность. В результате, количество метастазов у мышей, не имевших )вичной опухоли, мало отличалось от группы с первичной опухолью, получавших ьекции антител, и существенно (в 10-20 раз) превышало количество "вторичных" оголей у животных с тромбоспондин положительными опухолями, не получавших ггрализующих антител. Однако, метастазы в группе мышей, не имевших /вичной опухоли оказались существенно крупнее .

4. Обсуждение

В одном из наиболее убедительных экспериментов по изучению роли иогенеза в развитии злокачественных новообразований фрагменты качественной зпителиомьг -были подсажены в.-лишенный кровеносных, сосудов . сталик глаза крысы. В течение 30 дней фрагменты опухоли находились в шешенном состоянии, не увеличиваясь в размере. Немедленно после пересадки эого.из них в богатую капиллярами область лимбуса, начиналось интенсивное ение опухолевых клеток, и прогрессивный рост опухоли. Не менее элегантный перимент, подтверждающий важную роль ангиогенеза в развитии сромегастазов представлен в работе O'Reilly, где показано, что в случае карциномы оиса, присутствие в кровотоке белка антиостатина, подавляющего образование 1ЫХ капилляров, задерживало рост метастатических опухолей.

Эти эксперименты убедительно показывают необходимость ангиогенеза для ешного роста опухоли. В нашей работе была предпринята попытка ответить на дующие вопросы: (1) на каком этапе развития опухоли происходит переключение ютила" нормальных, анти-аншогенных клеток-предшественников; (2) каковы тавдяющие ангиогенного сигнала, посылаемого в окружающий организм тками, формирующими растущую опухоль; (3) как изменяются индивидуальные шоненты кумулятивного сигнала в ходе злокачественной прогрессии; (4) может ли естный супрессор ангиогенеза, тромбоспондин, выделяемый в избытке клетками вичной опухоли, задерж\шать рост метастатических опухолей на периферии. .

Как видно из результатов анализа 'клеточных лйний, соответствующих ледовательным стадиям развития фибросаркомы, кумулятивный сигнал, 1еляемый клетками, есть сумма положительного и отрицательного стимулов, в

данном случае тромбоспондина и VEGF. В ходе злокачественной прогресси наблюдается резкое падение уровня тромбоспондина, и, одновременно, постепенно возрастание количеств секретируемого VEGF. Поскольку клетки-предшественник вьщеляют тромбоспондин в количестве, более чем достаточнее для того, чтоб: блокировать ангиогенез, вызванный клетками фибросаркомы на терминально стадии развития, утрата негативного регулятора тромбоспондина представляется на критическим моментом в формировании фибросарком у больных с синдромом Ли Фраумени: . -

Возрастание уровня индуктора ангиогенеза VEGF в изученной систем просходит по меньшей мере в два этапа, и регулируется на уровне транскрипцш Первый скачок происходит после утраты гена дикого типа, кодирующего- анти онкоген р53, предположительно, вследствие дерегуляции активности фактор транскрипции АР-1. Второй скачок является непосредственным следствие] экспрессии активированного онкогена ras.

В случае фибросаркомы человека НТ1080, кумулятивный сигнал, выделяемы клетками опухоли, состоит из анги-ангиогекного компонента - тромбоспондина двух про-ангиогенных факторов, bFGF и VEGF, таким образом, что, несмотря н относительно высокий уровень секреции ингибиторного тромбоспондина, локально равновесие сдвинуто в сторону положительного сигнала. Поскольку перио полужизни в кровотоке для bFGF, также как. и VEGF, не превышает 3-5 мин, отличие от 7-8 часов для тромбоспондина, на сколько-нибудь значительно] расстоянии от первичной опухоли происходит перевес в 1 пользу сигнал; блокирующего образование капиллярной сети, которая бы поддерживал формирование метастатических опухолей. Существенную разницу в количеств визуально обнаруженных метастатических опухолей на фоне тромбоспондин положительных -и тромбоспошшн-отрицательных первичных опухолей можн объяснить двояко: с одной стороны, размер формирующихся метастазов жестк ограничен отсутствием снабжения питательными веществами и отвода продукте клеточного метаболизма. С другой стороны, тромбоспондин подавляет рост новы микрокапилляров, в частности, индуцируя гибель делящихся клеток эндогели вследствие апоптоза.

Полученные результаты могут впоследствии оказать существенное влияние н развитие методов лечения злокачественных опухолей. Хотя тромбоспондин слишком крупный белок, для того, чтобы непосредственно применять его клинической практике, картированы минимальные фрагменты тромбоспондин; сохраняющие биологическую активность, размер которых не превышает. 1 аминокислот. Такие короткие пептидные молекулы пригодны для начальных стади фармакологических исследований, и могут лечь в основу нового типа препаратов дл лечения злокачественных новобразований. Результаты первых попыток применени интерфсрона-а.2, миноциклина и фумагиллина, обладающих актиангиогенно активностью выглядят обнадеживающе. По-видимому, наиболее успешным можс оказаться рациональное сочетание . анти-ангиогенных '.- и традиционы химиотерапевтических и хирургических методов лечения.

выводы

1. На культурах клеток фибробластов, зятых на разных стадиях прогрессии фибросаркомы больных с синдромом Ли - Фраумени, показано, что постепенное переключение ангиогенного фенотипа клеток-предшественников происходит за счет падения- уровня антиангиогенного фактора тромбоспондина и пошагового повышения уровня VEGF.

2. Создана гетерологичная система для анализа влияния тромбоспондина, выделяемого клетками первичной опухоли, на формирование метастазов: показано что тромбосповдин, выделяемый клетками опухоли, попадает в кровоток и ограничивает количество' и размер экспериментальных метастазов.

3. Применение тромбоспондина успешно подавляло рост экспериментальных метастазов. Полученные результаты позволяют надеяться на получение противоопухолевых препаратов на основе биологически активных пептидов -производных тромбоспондина.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации.

1. Tolsma, S. S., Volpert, О. V., Good, D. J., Frazier, W. A., Polverini, P. J., and Bouck, N. (1993). Peptide derived from two separate domains of the matrixj protein thrombospondin-l have anti-angiogenic activity: J Cell Biol. 122, 497-5lb

2. Dameron, К. M., Volpert, О. V., TsLnsky, M. A., and Bouck, N. (1954a). Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 tumor-suppressor gene. Science 265, 1582-1584.

3. Dameron, К. M., Volpert, О. V., Tainsky, M. A., and Bouck, N. (1994b). The p53 tumor-suppressor gene inhibits angjogenesis by stimulating the production of thrornbospondin. Cold Spring Harbor Svmt>. Quant Biol. LIX, 483-489.

4. Volpert, О. V., Stellmach, V., and Bouck, N. (1995). Breast Cancer Res. Treat.. 36, 119126.

5. Volpert, O.V., Tolsma S.S., Pellcrin, S., Feige, JJ., Chen, H., Moslier, D.F.,

Bouck N. (1995) Inhibition of angiogenesis by tliTom'ocspondin-2. Biochem. Biophvs. Res. Commun. 217, 326-332.