Влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани

Ефименко, Анастасия Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани"

На правах рукописи

Ефименко Анастасия Юрьевна

ВЛИЯНИЕ ВОЗРАСТА НА АНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ

03.01.04-Биохимия 14.01.05 - Кардиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 5 ДВГ 2011

Москва-2011

4852323

Работа выполнена на кафедре биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Парфенова Елена Викторовна

кандидат биологических наук, доцен Калинина Наталья Игоревна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Панченко Елизавета Павловна

доктор медицинских наук, профессор Ивков Николай Николаевич

Ведущая организация:

ФГУ «Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины» Минздравсоцразвития РФ

Защита диссертации состоится 23 сентября 2011 года в 14.00 на заседаш диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружС народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, Медицинсю факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан «¿3? » СТ^С 2011 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор биологических наук, профессор

Е.В. Лукаше

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания, в том числе ишемическая болезнь сердца (ИБС), занимают первое место в структуре причин смертности в большинстве стран, несмотря на значительный прогресс в развитии медикаментозных методов лечения и хирургической и эндоваскулярной реваскуляризации. Одним из перспективных подходов к их лечению является терапевтический ангиогенез, основанный на введении в ишемизированные ткани генетических конструкций с генами факторов роста или стволовых/прогениторных клеток. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выделенные из костного мозга или жировой ткани (МСК-ЖТ), считаются перспективным инструментом для терапевтического ангиогенеза благодаря своей способности стимулировать рост кровеносных сосудов, в частности путем секреции ангиогенных факторов роста. Причем МСК-ЖТ, обладающие теми же свойствами, что и МСК костного мозга, значительно легче получить в достаточно большом количестве при малоинвазивной процедуре ограниченной липосакции. На моделях ишемии конечностей и миокарда у животных показано, что локальное и системное введение МСК-ЖТ способствует увеличению количества сосудов в тканях с нарушенным кровоснабжением и улучшению перфузии тканей кровью [Трактуев, 2005; Парфенова, 2006; Rehman, 2004; Miyahara, 2006; Nakagami, 2006; Gimble, 2007; Zhang, 2007; Cai, 2009; Kondo, 2009]. Восстановление кровотока в ишемизированной ткани при трансплантации МСК-ЖТ обусловлено несколькими механизмами. Во-первых, эти клетки секретируют широкий набор ангиогенных факторов роста, которые способствуют миграции и пролиферации эндотелиальных клеток и их предшественников, а также формированию новых сосудов [Rehman, 2004; Gimble, 2007; Kondo, 2009; Rubina, 2009; Madonna, 2010]. Во-вторых, МСК-ЖТ секретируют активаторы плазминогена и матриксные протеазы, что способствует локальному разрушению внеклеточного матрикса и миграции клеток, участвующих в образовании сосудистой стенки, а также высвобождению связанных с матриксом ангиогенных факторов [Kachgal, 2011]. В-третьих, МСК-ЖТ могут дифференцироваться в гладкомышечные и эпдотелиальные клетки, встраивающиеся в растущие сосуды, а также стабилизировать вновь образованные сосуды, выполняя функцию перицитов [Miranville, 2004; Planat-Benard, 2004; Miyahara, 2006; Sumi, 2007]. Это согласуется с данными, демонстрирующими, что во всех тканях организма МСК являются компонентами сосудистой стенки и, по-видимому, играют важную роль в развитии и поддержании сосудистой сети как в норме, так и при патологическом ремоделировании тканей [Nombella-Arietta, 2011].

регенеративных свойств МСК-ЖТ человека, получено на клетках, выделенных из жировой ткани относительно здоровых молодых доноров. В то же время известно, что старение и само заболевание может оказывать негативное влияние на состояние МСК [Fehrer, 2005; Sethe, 2006; Stolzing, 2008; Katsara, 2011; Madonna, 2011; Sun, 2011]. В единичных работах показано, что при старении снижается пролиферативный потенциал МСК-ЖТ и их способность к дифференцировке [Zhu, 2009; Huang, 2010], а также ухудшаются их ангиогенные свойства [El-Ftesi, 2009; Huang, 2010]. Поскольку МСК входят в состав сосудистой стенки и принимают участие в процессах ее репарации при повреждении, изменения, происходящие с ними при старении, могут являться важным патогенетическим фактором заболеваний, ассоциированных с возрастом, включая атеросклероз, сахарный диабет и артериальную гипертонию. Изменения свойств МСК, в том числе их способности стимулировать рост сосудов, могут снижать эффективность аутологической клеточной терапии у пожилых пациентов с ИБС или хронической ишемией нижней конечностей - наиболее вероятных кандидатов для клеточной терапии. Для повышения эффективности клеточной терапии собственными клетками пациента, а также для разработки методов стимуляции эндогенных регенеративных процессов необходимо изучение молекулярных механизмов, обусловливающих снижение терапевтических свойств клеток, в частности, их способности стимулировать васкуляризацию ишемизированных тканей.

Цель работы: Оценить влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани пациентов без кардиологических заболеваний и больных ишемической болезнью сердца.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить иммунофенотип, пролиферативную активность и накопление маркеров старения в МСК-ЖТ пациентов разного возраста с ИБС и без нее.

2. Оценить содержание ангиогенных факторов (VEGF, PIGF, HGF, ангиопоэтина-1, ангиогенина и тромбоспондина-1) в кондиционированной среде и ангиогенную активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ пациентов разного возраста с ИБС и без нее.

3. Проанализировать профиль экспрессии генов, кодирующих факторы, которые участвуют в регуляции ангиогенеза, в МСК-ЖТ пациентов разного возраста с ИБС и без нее.

4. Определить влияние возраста на пролиферацию, жизнеспособность, способность к дифференцировке и продукцию активных форм кислорода в МСК-ЖТ мышей.

5. Сравнить способность МСК-ЖТ мышей разного возраста стимулировать ангиогенез на моделях in vitro и in vivo.

6. Проанализировать профиль экспрессии генов, кодирующих факторы, которые участвуют в регуляции ангиогенеза, в МСК-ЖТ мышей разного возраста.

7. Определить влияние гипоксии на ангиогенные свойства МСК-ЖТ.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование морфофункциональных и молекулярных характеристик МСК, выделенных из жировой ткани пациентов разного возраста с ИБС и без нее. Установлено, что в МСК-ЖТ с возрастом происходит укорочение теломер и снижается доля активно пролиферирующих клеток. Это указывает на развитие процессов клеточного старения в МСК-ЖТ пожилых пациентов, что особенно выражено у больных ИБС. Впервые показано, что при старении снижается секреция этими клетками важнейших проангиогенных факторов, таких как VEQF, P1GF, HGF, ангиопоэтин-1, ангиогенин, и ангиогенная активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ, оцененная по способности кондиционированной среды от МСК-ЖТ стимулировать образование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками. Впервые установлено, что при старении МСК-ЖТ снижается вклад VEGF в ангиогенную активность суммарных продуктов секреции. Впервые обнаружено, что в МСК-ЖТ, полученных от пациентов в возрасте старше 60 лет, происходит активация системы внеклеточного протеолиза: увеличение экспрессии PAI-1, урокиназы и урокиназного рецептора, что особенно выражено в группе кардиологических больных, а также увеличение экспрессии и активности матриксных металлопротеиназ 2 и 9 типов.

Вклад возрастного фактора в ухудшение ангиогенных свойств МСК-ЖТ подтвержден на клетках мышей с использованием моделей ангиогенеза in vitro и in vivo. Показано, что при введении МСК-ЖТ in vivo в составе подкожного имплантата Матригеля степень васкуляризации имплантата зависит как от возраста донора клеток, так и от возраста реципиента.

Изучено влияние гипоксии на ангиогенные свойства МСК-ЖТ мыши. На модели васкуляризации подкожных имплантатов Матригеля впервые показано, что гипоксия усиливает способность МСК-ЖТ не только стимулировать прорастание кровеносных сосудов в имплантат, но и способствовать их стабилизации. С помощью полногеномного скрининга МСК-ЖТ человека установлено, что при культивировании в условиях гипоксии преимущественно активируется экспрессия генов факторов, стимулирующих ангиогенез, по сравнению с ингибиторами ангиогенеза. Обнаружены различия в ответе МСК-ЖТ на гипоксию в зависимости от возраста доноров.

Результаты данной работы помогают также расширить представление о молекулярных механизмах снижения регенеративного потенциала стволовых и прогениторных клеток с возрастом, в том числе их ангиогенной активности.

подготовки МСК-ЖТ пожилых пациентов, способствующих усилению способности клеток стимулировать рост кровеносных сосудов. К таким методам может относиться генетическая модификация МСК-ЖТ конструкциями, несущими гены факторов роста, продукция которых снижена у пожилых больных. Мишени для этой модификации определены в данной работе. Другим методом, согласно полученным в работе данным, может быть предтрансплантационное культивирование МСК-ЖТ в условиях гипоксии.

Внедрение в практику. Результаты работы внедрены в научно-исследовательскую и педагогическую деятельность ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова: используются в материалах лекций для студентов по курсу «Молекулярная медицина».

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на совместном заседании кафедры биохимии и молекулярной медицины, научно-исследовательской лаборатории генных и клеточных технологий факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова и лаборатории ангиогенеза Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗСР РФ (31 мая 2011г.), на заседании кафедры биохимии медицинского факультета РУДН (2 июня 2011г.), а также на научных конференциях: Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" (Москва, 2007), 32ом Международном конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (РЕВБ) (Вена, Австрия, 2007), конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2008), Международном форуме аспирантов Тихоокеанского региона (Омаха, США, 2008), Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2010), Международной конференции Международного общества изучения стволовых клеток (КЗСЯ) (Сан-Франциско, США, 2010), Международной конференции «Биология старения» (Лес Диаблеретс, Швейцария, 2010), Всероссийской школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010), Международной конференции «Ангиогенез-2011» (Амстердам, Голландия, 2011), Международной конференции Международного общества тканевой инженерии и регенеративной медицины (ТЕКМК) (Гранада, Испания, 2011).

Работа выполнялась в рамках Государственных контрактов №02.527.11.0007 от 30 апреля 2009 года (договор № 02.527.11.0007-1) по ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2007 - 2012 годы и №02.740.11.0093 от 15 июня 2009 года в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 8 статей, 11 тезисов докладов, 2 главы в сборнике статей.

Структура работы. Диссертация содержит 186 страниц и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения,

выводов и списка литературы, включающего 323 источника. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 19 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование.

В исследование были включены 62 пациента, у которых были выделены образцы подкожной жировой ткани в ходе хирургических операций. В первую группу (п=31) вошли пациенты, у которых жировая ткань была выделена в ходе операции по поводу эндо протезирования бедренного или коленного сустава (ПКБ №31), общей хирургической (аппендицит, паховая грыжа) или гинекологической (миома матки) патологии (ГКБ №29), травмы верхней или нижней конечности (Центральный институт травматологии и ортопедии им. И.О. Приорова).

Вторую группу (п=31) составили пациенты с ишемической болезнью сердца, стенозирующим коронарным атеросклерозом по данным коронароангиографии, стабильной стенокардией II-III функционального класса (по классификации Канадского общества по изучению сердечно-сосудистых заболеваний), которым проводилось аортокоронарное шунтирование в Отделе сердечно-сосудистой хирургии Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГУ РКНПК МЗСР РФ (рук. академик РАМН P.C. Акчурин).

Все исследования, связанные с образцами ткани, выполнялись на основании разрешения Этического комитета ФГУ РКНПК МЗСР РФ.

Критериями исключения, общими для обеих групп пациентов, считали: наличие аутоиммунных патологий; наличие злокачественных новообразований, в том числе в анамнезе; наличие острых или хронических воспалительных заболеваний; декомпенсированного сахарного диабета (СД); длительную гормональную или антибиотикотерапию; анемию (гемоглобин <10 г/дл) и гематологические заболевания; острые нарушения мозгового кровообращения или черепно-мозговые травмы в предшествующие 12 месяцев. Специальными критериями исключения для первой группы больных считали наличие сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе инфаркта миокарда (ИМ) или миокардита в анамнезе, клиники стенокардии, клинических признаков сердечной недостаточности, нарушений ритма сердца, таких как пароксизмальная или постоянная форма мерцательной аритмии, частая желудочковая экстрасистолия, пароксизмальная желудочковая тахикардия, блокада левой ножки пучка Гиса, выраженных гиперлипидемий.

Пациенты были разделены на подгруппы по возрасту, согласно классификации ВОЗ (1963). В первой группе пациентов, условно обозначенной нами как пациенты без ИБС. выделяли детей 2-12 лет (подгруппа I, средний возраст 7,3±5,4 лет, п=4), пациентов 3555 лет (подгруппа II, средний возраст 42,3±7,1 лет, п=14) и пациентов старше 60 лет (подгруппа III, средний возраст 66,2±6,8 лет, п=13), а во второй группе пациентов с

ИБС - больных в возрасте 44-48 лет (подгруппа А, средний возраст 46,0±1,67 лет, п=6), 52-58 лет (подгруппа Б, средний возраст 55,4±1,9 лет, п=10) и старше 60 лет (подгруппа В, средний возраст 68,9±4,2 лет, п=15). По основным клинико-анамнестическим признакам, а именно по полу, индексу массы тела, функциональному классу стенокардии, частоте ИМ в анамнезе, наличию ожирения, артериальной гипертонии, СД 2 типа и нарушения толерантности к глюкозе, дислипидемии подгруппы больных ИБС разного возраста статистически значимо не различались между собой.

Следует отметить, что группы пациентов с ИБС и без ИБС различались по полу (р<0,001): в группе пациентов без ИБС было 77,4% женщин, а в группе больных ИБС почти все пациенты были мужского пола (87,1%). Учитывая, что пол пациента может оказывать существенное влияние на свойства МСК-ЖТ, в частности, было показано, что МСК-ЖТ мужчин обладают большим остеогенным потенциалом, чем МСК-ЖТ женщин [Aksu, 2008], мы не сравнивали между собой группы пациентов с ИБС и без ИБС. Все сравнения касались только разных возрастных подгрупп внутри двух основных групп пациентов.

Экспериментальные животные. Часть работы была выполнена на мышах линии С57/В16 (самцы), предоставленных питомником г. Пущино. В эксперимент были включены 4 группы животных: возраст мышей первой группы составлял 1-2 месяца (п=16), второй - 12 месяцев (п=6), третьей - 18 месяцев (п=9) и четвертой группы -24 месяца (п=7).

Выделение и культивирование МСК-ЖТ. Для выделения МСК-ЖТ использовали фрагменты жировой ткани, отсекаемые при проведении абдоминальных операций, операций по поводу травм и заболеваний суставов, а также при выделении сосудов и постановке шунтов при АКШ. Выделение МСК из подкожной жировой ткани проводили с помощью ферментативной обработки [Zuk, 2001]. Выделенные клетки высаживали на чашки Петри в концентрации 5х104/см3 и инкубировали при 37°С, 5% С02. На следующий день в чашках меняли среду. Выход клеток при использованном нами методе выделения составлял 4-7х104 'прикрепившихся клеток на 1 мл ткани. Полученные клетки выращивали на стандартном пластике для культивирования клеток (Corning Costar) в С02 — инкубаторе (5% С02; 95% воздуха; 37°С), используя среду, поддерживающую рост недифференцированных мезенхимальных прогениторных клеток (Advance Stem Cell Basal Medium, HyClone), содержащую 10% смеси факторов роста (Advance Stem Cell Growth Supplement, HyClone) (МСК-ЖТ человека) или среду DMEM (HyClone), содержащую 10% ФБС (МСК-ЖТ мыши). Среды роста также содержали 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина/фунгизона (HyClone). При достижении 70-80% конфлуента клетки рассаживали в соотношении 1:3 с использованием 0,25% раствора трипсина/0,02% ЭДТА. Для получения кондиционированной среды клетки 2-ого пассажа в течение 24 часов депривировали в среде роста, не содержащей сыворотку, затем меняли среду на свежую, также не содержащую сыворотку, и культивировали

клетки в течение 48 часов. После этого среду собирали, центрифугировали при 200g 5 мин, добавляли коктейль ингибиторов протеаз (1:500, Sigma, кат. № Р1860), аликвоты по 1,5 мл замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.

Для изучения влияния гипоксии на МСК-ЖТ клетки 2-ого пассажа в течение 24 часов инкубировали в среде роста, не содержащей сыворотку, а затем помещали в условия 1% (гипоксия) или 20% (нормоксия) содержания кислорода на 48 часов [Ohnishi, 2007; Potier, 2007]. Клетки анализировали немедленно после изъятия из гипоксического инкубатора, чтобы предотвратить влияние оксидативного стресса, вызванного реперфузией.

Характеристика МСК-ЖТ. Для того чтобы оценить содержание МСК в популяции культивируемых клеток, МСК-ЖТ 2-ого пассажа окрашивали антителами против CD14 (eBioscience, кат. N214-0141-81), CD34 (BD Pharmingen, кат. №>555824), CD45 (BD Pharmingen, кат. №340953), CD73 (BD Pharmingen, кат. №550257), CD90 (BD Pharmingen, кат. №555597), CD105 (BD Pharmingen, кат. X» 560819), NG2 (Chemicon, кат. №аЬ5320) и PDGFRB (BD Pharmingen, кат. №558821), конъюгированными с различными флуорохромами, и анализировали с помощью проточного сортера клеток MoFlo (Dako Cytomation, Дания).

Для анализа способности к адипогенной и остеогенной дифференцировке МСК-ЖТ культивировали в индукционных средах, используя наборы реагентов (Invitrogen, США), по методике, приложенной к набору. В качестве отрицательного контроля использовали фибробласты кожи и МСК-ЖТ того же донора, культивируемые в обычной среде роста.

Количество МСК-ЖТ на разных стадиях апоптоза оценивали с помощью проточной цитофлуорометрии по связыванию аннексина V, конъюгированного с фикоэритрином (AnnexinV-PE, BD Pharmingen, кат. №556422), и накоплению красителя 7-аминоактиномицина D (7-AAD, BD Pharmingen, кат. №559925) как популяцию AnnexinV+ 7-AAD' клеток.

Для анализа изменений пролиферативной активности МСК-ЖТ человека клетки окрашивали 25мкМ раствором карбоксилфлуоресцеин диацетата сукцинимидильного эфира (CFSE, Molecular Probes, США) перед вторым пассированием. Окрашенные клетки культивировали в течение 5 дней, после этого оценивали процентное соотношение активно и слабо пролиферирующих клеток по степени снижения содержания CFSE относительно исходного уровня с помощью проточного сортера клеток MoFlo (Dako Cytomation, Дания). Пролиферацию МСК-ЖТ мыши оценивали при помощи МТТ теста (Invitrogen, США).

Анализ продукции активных форм кислорода (АФК) в МСК-ЖТ проводили с помощью анализа инкубированных с H2DCF-DA (5 Од M) клеток на флуоресцентном спектрофотометре.

Относительную длину теломер в МСК-ЖТ оценивали методом ПЦР в реальном времени, нормируя значения по длине теломер в клетках линии HeLa [Cawthon, 2002].

Анализ экспрессии генов в МСК-ЖТ. Содержание мРНК исследуемых факторов, участвующих в регуляции ангиогенеза, проводили методом ПЦР в реальном времени. Для этого из клеток выделяли РНК при помощи набора реагентов RNeasy Miny Kit (50) (QIAGEN, США), затем на матрице РНК строили кДНК, используя набор Fermentas Reverse Transcription Reagents (Fermentas, Литва). Далее проводили ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I («Синтол», Россия) в амплификаторе BIO-RAD iQ5 Multicolor Real-time PCR detection system (Biorad, США). Данные для каждого образца нормировали по экспрессии генов 17, b-actin и gapdh.

Оценку дифференциальной экспрессии генов в МСК-ЖТ человека, культивированных в стандартных или гипоксических условиях (п=5), проводили с помощью набора HumanRef-8 (Illumina, США), согласно протоколу производителя. Для анализа полученных данных использовали программное обеспечение GenomeStudio software (Illumina, США) и базы данных по классификации генов он-лайн (The Gene-Ontology database, GO: http://www.geneontology.org. http://gostat.wehi.edu.au/cgi-bin/goStat.pl).

Оценка экспрессии урокиназного рецептора (uPAR) на поверхности МСК-ЖТ человека. Уровень экспрессии uPAR на поверхности МСК-ЖТ человека оценивали с использованием моноклональных антител кролика против uPAR человека (AmD, кат. №399R, США) и вторичных антител осла, конъюгированных с флуорохромом DyLight649 (Jackson, США), на проточном сортере клеток MoFlo (Dako Cytomation, Дания).

Анализ содержания факторов роста в кондиционированной среде. Содержание VEGF, P1GF, HGF, ANGPT1, TBS1 и Ang в среде культивирования МСК-ЖТ человека оценивали с помощью наборов реагентов для иммуноферментного анализа (ELISA) компании R&D Systems (США). Уровень поглощения раствора в лунках определяли при длине волны 450 нм с корректировкой при 620 нм. Полученные значения концентрации исследуемого белка в образцах кондиционированных сред нормировали на количество клеток.

Оценка активности металлопротеиназ 2 и 9 типов (ММП-2 и ММП-9) в кондицнонированной среде. Содержание латентной и активной форм матриксных металлопротеиназ (ММП-2 и ММП-9) в образцах кондиционированной среды от МСК-ЖТ человека (п=4), не содержащих коктейль ингибиторов протеаз, исследовали методом прямой желатиновой зимографии с предварительным вертикальным электрофорезом [Laemmli, 1970].

Формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле. Ангиогенную активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ в среду культивирования оценивали с помощью методики образования капилляроподобных структур на Матригеле, обедненном ростовыми факторами (Growth factors reduced

Matrigel, BD Biosciences), эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC) или эндотелиальными клетками линии EA.hy926 [Aranda, Owen, 2009] в присутствии кондиционированной среды от МСК-ЖТ. Для блокирования действия VEGF добавляли антитела против VEGF (Abeam, кат. № аЬ9570) в концентрации

0.1.кг/мл. Суммарную длину образованных трубчатых структур в 5 случайно выбранных полях зрения в лунке подсчитывали на изображениях, полученных при использовании объектива хЮ, с помощью программы MetaMorph 5.0 (Universal Imaging).

Анпгогенез в подкожном нмплантате Матригеля. Влияние МСК-ЖТ мыши на рост кровеносных сосудов in vivo оценивали на модели ангиогенеза в подкожном имплантате Матригеля. Для этого 7х105 МСК-ЖТ 2-ого пассажа вводили подкожно сингенным мышам линии Balb/c в виде суспензии в Матригеле, обедненном факторами роста, инсулиновым шприцем с иглой толщиной 23G таким образом, чтобы Матригель успевал полимеризоваться под кожей и образовывал желеобразный имплантат неправильной формы.

Были сформированы следующие экспериментальные группы:

1. Мышам (возраст 1-2 мес) вводили МСК-ЖТ мышей в возрасте 1-2 мес, культивированные в стандартных условиях или в условиях гипоксии (п = 8).

2. Мышам (возраст 18 мес) вводили МСК-ЖТ мышей в возрасте 1-2 мес или 18 мес (п=3)

Через 10 дней после подкожного введения суспензии клеток в Матригеле мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации, полностью изымали имплантаты и замораживали их в жидком азоте в среде для заморозки тканей Tissue-Tek (Sakura, Япония) для последующего приготовления срезов (6 мкм). Оценку плотности кровеносных сосудов на срезах Матригеля проводили с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием моноклональных антител крысы против маркерного антигена эндотелия сосудов CD31 (BD Pharmigen, кат. №550274, США) и антител кролика против маркера перицитов NG2 мыши (Chemicon, кат. №аЬ5320, США). Ядра клеток докрашивали флуоресцентным красителем DAPI. Полученные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа ZeissAxiovert200M. Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRc (Zeiss, Германия) и обработки в программе Axiovisíon. Размер сосудов и их плотность оценивали с помощью программного обеспечения MetaMorph 5.0 (Universal Imaging) и ClickCounter. Подсчет сосудов проводили в 5 полях зрения на срезе (по 12 срезов на каждый имплантат) при 20-кратном увеличении, отдельно выделяя капилляры (CD31-положительные образования без просвета или длиной менее 20 мкм), сосуды среднего диаметра (CD31-положительные образования диаметром или длиной 20-50 мкм) и крупные сосуды (диаметром более 50 мкм). Полученное число сосудов нормировали на единицу площади среза.

Статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ SigmaStat 9.0. При подтверждении нормальности распределения признака методами Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилксона для сравнения двух независимых групп использовали t-критерий Стьюдента, для сравнения зависимых групп - парный t-критерий Стьюдента, для анализа данных в нескольких независимых группах - метод ANOVA, в случаях малочисленных выборок и ненормальных распределений для тех же целей использовали U-критерий Манна-Уитни, парный критерий Уилкоксона и ANOVA по методу Крускал-Уоллиса, соответственно. Для сравнения распределений порядковых и номинальных признаков применяли тест х2-Корреляционный анализ проводили с использованием метода Пирсона для нормально распределенных выборок и метода Спирмена - в остальных случаях. Для оценки тесноты связи по значению коэффициента корреляции использовали шкалу Чеддока. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р<0,05. Данные в тексте и на графиках представлены в виде среднее±стандартное отклонение (SD) или как медиана (25-й и 75-й процентили), если не указано иначе.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние возраста на морфологию, иммунофенотип, пролиферативную активность и накопление маркеров старения в МСК-ЖТ. Клетки, выделяемые из жировой ткани с помощью обработки ферментами, представляют собой смешанную популяцию различных клеточных типов, однако при культивировании в среде, поддерживающей рост недифференцированных МСК, ко 2-ому пассажу в культуре остаются клетки, имеющие фибробластоподобную морфологию, причем заметных различий по морфологии клеток, полученных от пациентов разных возрастных групп, выявлено не было.

Анализ иммунофенотипа культивированных до 2-ого пассажа МСК-ЖТ с помощью метода проточной цитофлуориметрии показал, что эти клетки несут мезенхимальные маркеры CD73 (>85%), CD90 (>95%) и CD 105 (>99%), но не экспрессируют или экспрессируют в малом количестве CD14 (<10%), CD19 (<10%), CD34(<5%), CD45 (<2%), CD79 (<10%). Такой профиль экспрессии является типичным для МСК, согласно определению Международного общества клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy Statement) [Dominici, 2006]. МСК-ЖТ также экспрессируют маркеры, характерные для перицитов, такие как NG2 (>99%) и PDGFRB (>80%), что свидетельствует в пользу принадлежности этих клеток к периваскулярным прогениторным клеткам. Доля клеток, несущих мезенхимальные маркеры, была одинаковой в разных возрастных группах.

Одной из определяющих характеристик МСК является их мультипотентность, т.е. способность к направленной дифференцировке в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях [Zuk, 2001; Dominici, 2006; Gimble, 2007]. Мы

культивировали выборочные образцы клеток в соответствующих индукционных средах и показали, что МСК-ЖТ и молодых, и пожилых пациентов способны к адипогенной и остеогенной дифференцировке.

Важным маркером старения клеток, напрямую связанным с их пролиферативной активностью, является длина теломерных участков хромосом. С помощью ПЦР в реальном времени мы оценили относительную длину теломер в МСК-ЖТ и показали наличие статистически значимой обратной связи между длиной теломер и возрастом пациентов как без ИБС (г = -0,47, р = 0,03), так и с ИБС (г = -0,6, р = 0,006). Интересно отметить, что в подгруппах пациентов старше 60 лет средняя длина теломер в МСК-ЖТ больных ИБС была значительно снижена по сравнению со средней длиной теломер в клетках пациентов без ИБС той же возрастной группы (р = 0,01). По-видимому, МСК-ЖТ больных ИБС старели быстрее, не пропорционально возрасту организма. Это может свидетельствовать об активном участии МСК в патогенезе хронических ишемических заболеваний, что приводит к ускоренному клеточному старению и снижению их пролиферативного потенциала.

Для того чтобы оценить пролиферацию МСК-ЖТ, мы окрашивали клетки флуоресцентным красителем CFSE. С каждым клеточным делением количество красителя в клетке уменьшалось вдвое. Методом проточной цитофлуорометрии мы определяли, какое количество клеток поделилось определенное число раз за 5 дней. Анализ кривых распределения клеток в популяции по количеству делений не выявил статистически значимой зависимости пролиферации МСК-ЖТ от возраста. Однако мы обнаружили, что доля активно делящихся клеток (прошедших более 10 делений за 5 дней) в популяции МСК-ЖТ, выделенных от пациентов группы II (35-55 лет), в среднем в 3,6 раз больше, чем в группе III (старше 60 лет): 5 (3; 6)% vs. 1,4 (0; 5,1)%, соответственно (р = 0,07). Возможно, это связано со снижением активности теломеразы, особенно в клетках с высоким пролиферативным потенциалом. Ожидаемым результатом оказалось выявление сильной положительной связи между длиной теломер в МСК-ЖТ и пролиферативной активностью клеток (г = 0,8, р = 0,006).

Таким образом, МСК-ЖТ, полученные от пациентов разного возраста, сходны по морфологии и иммунофенотипу, характерному для МСК, обладают способностью дифференцироваться в адипогенном и остеогенном направлениях, значимо не различаются по пролиферативной активности, однако доля активно делящихся клеток и средняя длина теломер в МСК-ЖТ снижаются с возрастом пациентов.

Влияние возраста на ангногенные свойства МСК-ЖТ человека. Способность МСК-ЖТ стимулировать рост кровеносных сосудов обусловлена в значительной степени продукцией ими широкого набора ангиогенных факторов [Rehman, 2004; Gimble, 2007; Kondo, 2009; Rubina, 2009; Madonna, 2010]. Учитывая это, мы проанализировали ангиогенную активность суммарных продуктов секреции клеток в среду культивирования, содержание основных ангиогенных факторов в кондиционированной

среде от этих клеток и экспрессию мРНК факторов, регулирующих ангиогенез, в МСК-ЖТ пациентов разного возраста. Было обнаружено, что способность кондиционированной среды от МСК-ЖТ стимулировать образование тубулярных структур эндотелиальными клетками на Матригеле in vitro снижается с возрастом как в группе пациентов без ИБС, так и в группе кардиологических больных, что выражалось в обратной корреляции между общей длиной тубулярных структур и возрастом пациентов (г = -0,68, р=0,01 и г = -0,53, р=0,03, соответственно). Кондиционированная среда от клеток, выделенных из жировой ткани пациентов старшего возраста (старше 60 лет), стимулировала образование тубулярных структур достоверно менее выражено, чем среда от клеток, полученных от более молодых пациентов (Табл. 1).

Таблица 1. Формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле в присутствии кондиционированной среды от МСК-ЖТ.

Пациенты без ИБС Пациенты с ИБС

Группа I Группа И Группа III Р Группа А Группа Б Группа В Р

2-12 лет 35-55 лет >60 лет II vs. 42-48 лет 52-58 лет >60 лет A vs. В

п=1 п=9 п=9 Ill л=4 п=9 п=13

одт*/ 107518 99003 89134 64171 55879

млн. кл., 139795,8 (98302; (89519; 0,056 (79153; (37887; (40258; 0,041

отп.ед. *** 113163) 100813) 188711) 104482 64734

-0,68, р=0,01 -0,53, р=0,03

Примечание. * - общая длина трубочек; - коэффициент корреляции показателя общей длины трубочек и возраста пациентов; *** - в группе I результат был получен только для одного образца (ребенок К., 2,5 года) и не был включен в корреляционный анализ.

Помимо этого, была выявлена прямая корреляционная связь между ангиогенной активностью суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ и длиной теломер в этих клетках (г = 0,49, р=0,01; п=45), что позволяет предлагать оценку длины теломер в качестве клеточного маркера возраст-ассоциированного снижения ангиогенной активности МСК-ЖТ.

Основным ангиогенным фактором, играющим центральную роль в стимуляции пролиферации и миграции эндотелиальных клеток, является УЕОИ. Было показано, что МСК жировой ткани секретируют значительное количество УЕСР, и этот фактор является одним из ключевых во взаимодействии МСК и эндотелиальных клеток [ТгакШеу, 2008]. Мы проанализировали вклад УЕСЗР в ангиогенную активность кондиционированной среды от МСК-ЖТ. Добавление блокирующих УЕОИ антител приводило к подавлению стимуляции образования тубулярных структур на Матригеле в среднем на 57 (40; 65)%, причем этот эффект был тем больше, чем выше было содержание УЕСР в среде культивирования (г = 0,94, р = 0,02; п=18). Мы отметили наличие тенденции к положительной корреляционной связи между степенью подавления ангиогенной активности среды культивирования антителами к УЕйР и длиной теломер в

МСК-ЖТ (г = 0,46, р = 0,09; п=18), что может свидетельствовать о снижении вклада VEGF в ангиогенный потенциал продуктов секреции МСК-ЖТ при клеточном старении.

Роль конкретных факторов, секретируемых МСК-ЖТ, в паракринных эффектах этих клеток изучена лишь в единичных работах [Casteilla, 2010]. Для того чтобы установить, изменение продукции каких именно ангиогенных факторов лежит в основе снижения ангиогенной активности МСК-ЖТ пациентов старшего возраста, мы оценили содержание VEGF, P1GF, HGF, ангиопоэтина-1 (Angptl), ангиогенина и тромбоспондина-1 (TBS1) в кондиционированных средах от МСК-ЖТ пациентов разного возраста (Табл. 2).

Таблица 2. Содержание ангиогенных факторов роста в кондиционированной

среде от МСК-ЖТ (нг/млн. клеток), измеренное с помощью ИФА.

Пациенты без ИБС Пациенты с ИБС

Фактор Группа I Группа II Группа III Р Группа А Группа Б Группа В Р

2-12 лет 35-55 лет >60 лет I VS. 42-48 лет 52-58 лет > 60 лет А

п=4 п= 14 п= 13 III п=4 п=6 п= 13 vs.B

VEGF 30,1 11,0 5,7 0,07 23 22 16 0,14

(12,4;68,3) (4,0; 17,1) (3,2; 12,4) (19; 28) (19; 25) (8; 22)

г* -0,42, р=0,02 -0,37, р=0,09

P1GF 1,08*** 0,04 0,04 нд** 0,5 0,2 0,14 0,08

(0,03; 0,04) (0,02; 0,08) (0,2; 1,0) (0,1;0,22) (0,06; 0,2)

г -0,59, р=0,01 -0,59, р=0,004

Angptl 1,72*** 0,7 0,4 нд 1,0 0,8 0,5 нд

(0,4; 1,2) (0,1; 0,8) (0,9; 3,0) (0,5;1,3) (0,2; 1,7)

г -0,38, р=0,11 -0,40, р=0,06

TBS1 122,81*** 202,9 143,6 нд 159 19 112 нд

(120,8;438,9) (47,8;511,4) (71; 656) (12; 80) (64; 265)

г нд нд

Ang 13,53*** 2,4 1,2 нд 6,8 4,3 1,9 0,04

(1,9; 2,9) (0,3; 1,9) (4,0; 9,0) (2,9; 5,2) (1,2; 3,0)

г -0,66, р=0,005 -0,72, р=0,001

HGF 4,5 2,2 1,1 0,07 20,0 11,8 13,1 нд

(3,5; 17,7) (1,7; 4,3) (0,6; 2,8) (18,7; 42) (9,5; 21,7) (3,3; 23,5)

г -0,59, р=0,03 -0,44, р=0,07

Примечание. * - коэффициент корреляции между содержанием фактора роста и возрастом пациентов; ** - уровень значимости р>0,15; *** - в группе I содержание всех факторов, кроме VEGF и HGF, было проанализировано только в одном образце (ребенок К., 2,5 года), показатели которого приведены в таблице, статистически значимых различий между группами II и III для всех факторов не наблюдали. VEGF - фактор роста эндотелия сосудов, P1GF - плацентарный фактор роста, Angptl — ангиопоэтин-1, TBS1 -тромбоспондин-1, Ang - ангиогенин.

Несмотря на то, что средние значения содержания ангиогенных факторов в среде культивирования МСК-ЖТ были в несколько раз ниже в старших возрастных подгруппах, чем в более молодых подгруппах, достоверных различий для большинства факторов из-за выраженного разброса показателей не получено. Исключение составляет уровень ангиогенина, который у больных ИБС старше 60 лет был достоверно снижен

более чем в три раза по сравнению с пациентами более молодой подгруппы (42-48 лет) (Табл. 2). Четкие тенденции к снижению секреции УЕОР и НОР с возрастом (р=0,07) наблюдались в группе больных без ИБС. Однако корреляционный анализ показал наличие достоверных или близких к достоверным обратных связей между содержанием проангиогенных факторов УЕОР, РЮР, НОР, А^рН и ангиогенина в кондиционированной среде от МСК-ЖТ и возрастом пациентов как в группе больных ИБС, так и в группе пациентов без кардиологических заболеваний (Табл. 2, Рис. 1).

Следует отметить, что ангиогенная активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ коррелировала с содержанием ангиогенина в группе больных без ИБС (1=0,66, р=0,05; п=18) и ангиопоэтина-1 в группе кардиологических больных (г=0,79, р=0,004; п=23), но не с уровнем УЕвР в среде культивирования, что указывает на существенный вклад других ангиогенных факторов, возможно, модулирующих эффект УЕСБ, в

ангиогенную активность МСК-ЖТ. ® ^

ш о. 5

<» ° 5 « *

5 Е 5

ю X I

® Я "Ё

5 т т=

О) § ^

5 5

Возраст пациентов

Рисунок 1. Обратные корреляции между содержанием ангиогенных факторов (УЕСР и ангиогенина) в кондиционированной среде от МСК-ЖТ и возрастом больных ИБС (г = -0,37, р = 0,09 и г = -0,72, р = 0,001, соответственно).

Таким образом, снижение при старении продукции основных ангиогенных факторов (VEGF, P1GF, HGF, Angptl, ангиогенина) может лежать в основе ухудшения ангиогенных свойств МСК-ЖТ пожилых пациентов.

Для того чтобы выявить механизмы снижения секреции ангиогенных факторов МСК-ЖТ, мы проанализировали содержание мРНК генов основных регуляторов ангиогенеза в клетках пациентов разных возрастных групп. Мы наблюдали статистически значимое снижение содержания мРНК P1GF и HGF в МСК-ЖТ пациентов старшего возраста из обеих групп, в то время как содержание мРНК других про- и антиангиогенных факторов с возрастом изменялось незначительно. Как и в случае паспортного возраста пациентов, содержание мРНК различных ангиогенных факторов слабо коррелировало с длиной теломер в соответствующих клетках. При сопоставлении уровня мРНК в клетках и белка соответствующего фактора в кондиционированной среде, обнаружено, что только содержание VEGF (г=0,31, р=0,03; n=53), P1GF (г=0,54,

р=0,001; п=41) и НОГ (г=0,39, р=0,09; п=53) коррелировало с содержанием мРНК этих факторов в клетках. Таким образом, снижение секреции РЮР и НОР может быть обусловлено снижением экспрессии соответствующих генов. Однако содержание мРНК других ангиогенных факторов в клетках меняется с возрастом незначительно, что позволяет предполагать наличие посттрансляционных механизмов снижения секреции проангиогенных факторов МСК-ЖТ при старении.

Влияние возраста на экспрессию и активность протеаз в МСК-ЖТ. Важную роль в процессах роста сосудов играют системы протеаз, регулирующих направленную миграцию и инвазию клеток и ремоделирование внеклеточного матрикса. К ним относится урокиназная система, представленная активатором плазминогена урокиназного типа, или урокиназой (иРА), ее рецептором (иРАК) и ингибитором активаторов плазминогена (РА1-1), а также система матриксных металлопротеаз. С помощью ПЦР в реальном времени мы показали, что с возрастом в МСК-ЖТ пациентов с ИБС значимо возрастает содержание мРНК РА1-1 и иРАЯ (Табл. 3). Для пациентов без ИБС эта тенденция менее заметна, тем не менее, отмечена положительная корреляция между содержанием мРНК РА1-1 и возрастом пациентов и обратная связь между содержанием мРНК иРАЯ и длиной теломер в клетках (г = -0,55, р = 0,06; п=31).

Таблица 3. Содержание мРНК компонентов урокнназном системы н матриксных металлопротеаз в МСК-ЖТ (отн.ед.), оцененное методом ПЦР в

реальном времени.

Пациенты без ИБС Пациенты с ИБС

Фактор Группа I 2-12 лет Группа 11 35-55 лет Группа III >60 лет Р I VS. Группа А 42-48 лет Группа Б 52-58 лет Группа В >60 лет Р А vs.

п=4 п=14 п=13 III п=6 п=10 п=15 В

иРА 2,7 2,6 1,4 нд** 4,3 6,4 6,3 0,07

(2,6; 2,9) (2,2; 3,6) (1,0; 3,0) (3,6; 4,9) (5,4; 8,6) (4,1; 7,7) 0,02*

uPAR 0,9 0,3 1,0 нд 1,9 1,8 3,8 0,01

(0,6; 1,4) (0,3; 1,5) (0,3; 1,9) (1,5; 2,0) (1,1; 2,4) (2,5; 4,9)

нд 0,46, р=0,001

PAI-1 1,9 2,3 3,4 нд 4,3 6,5 11,7 0,03

(1,2; 2,7) (1,2; 3,0) (1,7; 5,1) (3,6; 11,6) (3,0; 8,1) (6,7; 20,4)

г 0,32, р=0,08 0,47, р= 0,001

ММП- 27,4 16,0 34,3 нд 25,1 37,7 31,3 нд

2 (23; 36) (13;46) (7,4; 64,1) (9,6; 42,4) (30; 66) (18; 50)

ммп- 2,9 0,9 1,9 нд 1,8 2,1 4,7 нд

9 (1,1; 5,3) (0,2; 5,5) (0,1;7,3) (0,8; 2,5) (1,4; 2,8) (0,2; 5,9)

Примечание. * - уровень значимости различий между группами А и Б; ** - статистически незначимый коэффициент корреляции или недостоверная разница между группами; *** -

коэффициент корреляции между содержанием мРНК фактора и возрастом пациентов. иРА -урокиназа, иРАК -урокиназный рецептор, РА1-1 - ингибитор активатора плазминогена 1 типа, ММП-2 — металлопротеиназа 2 типа, ММП-9 - металлопротеиназа 9 типа.

CE " <

До 45 лет 54-57 лет Старше 60 лет

г= 0,65, р=0,01 Возраст пациентов

Анализ части образцов МСК-ЖТ (п=19) на содержание иРАК на поверхности клеток с помощью проточной цитометрии (Рис. 2) показал, что с возрастом экспрессия этого рецептора на поверхности МСК-ЖТ значимо увеличивается (г= 0,65, р=0,01; п=19).

Рисунок 2. Увеличение экспрессии урокиназного рецептора на поверхности МСК-ЖТ пожилых

пациентов. Уровень

экспрессии рассчитывали как разницу средней интенсивности флуоресценции при окраске клеток специфическими антителами против иРАР. и средней интенсивности флуоресценции при окраске неспецифическими иммуноглобулинами. Данные приведены в виде медиана (25-й, 75-й процентили). г - коэффициент корреляции между уровнем экспрессии иРАЯ и возрастом пациентов.* -р =0,046, **-р = 0,039.

Была обнаружена тенденция к увеличению содержания мРНК ММП-2 и ММП-9 в МСК-ЖТ пациентов старшей возрастной группы (Табл. 3). Исследование содержания и активности ММП-2 и ММП-9 в кондиционированной среде от МСК-ЖТ четырех пациентов разного возраста показало, что активные формы ММП-2 и ММП-9 обнаруживались только в кондиционированной среде от МСК-ЖТ одной пациентки 73 лет, и у нее же было повышено содержание неактивных про-ММП-2 и -9 по сравнению с молодыми пациентами (Рис. 3).

Рисунок 3. Увеличение активности ММП-2 и ММП-9 в кондиционированной среде от МСК-ЖТ, оцененное с помощью прямой желатиновой зимографии с предварительным вертикальным электрофорезом. А - ребенок К., 2,5 года; Б - пациент П., 52 года; В -пациенткаД., 73 года.

92 кДа - ММП-9 84 кДа - ММП-9а

72 кДа - ММП-2 64 кДа - ММП-2а

Таким образом, мы обнаружили, что в МСК-ЖТ, полученных от пациентов старшего возраста, происходит активация компонентов системы внеклеточного протеолиза, что связано, возможно, с участием этих клеток в процессах ремоделирования внеклеточного матрикса, происходящих при старении [Wang, 2010]. Так, активация с возрастом ММП-2, необходимой для деградации коллагена [Moses, 1997], может происходить в ответ на накопление коллагена во внеклеточном

пространстве [Eto, 2008; Wang, 2010]. Повышение экспрессии TGFß при старении стимулирует экспрессию NADPH-оксидазы Nox4 и продукцию АФК, что может привести к увеличению продукции PAI-1 [Liu, 2010].

Влияние возраста на ангиогенные свойства МСК-ЖТ мышей. При анализе ангиогенных свойств МСК-ЖТ пациентов разного возраста и с различными патологиями необходимо отметить, что подбор хорошо сопоставимых друг с другом групп больных, различающихся только по возрасту, вызывает серьезные затруднения. В связи с этим, часть экспериментов была проведена на мышах. Мы подобрали группы животных, примерно соответствующие по возрасту детям (возраст мышей 1-2 мес., МСК-ЖТмол), людям 30-50 лет (возраст мышей 12 мес.), людям 50-70 лет (возраст мышей 18 мес., МСК-ЖТстар) и людям старше 70 лет (возраст мышей 24 мес.) [Austad, 1997].

Мы обнаружили, что в МСК-ЖТ старых животных наблюдаются признаки, характерные для стареющих клеток [Sethe, 2006; Stolzing, 2008; Dasgupta, 2010; Flores, 2010; Wang, 2010]. Так, в МСК-ЖТстар по сравнению с МСК-ЖТмол в 3 раза были укорочены теломеры (р<0,001), в 3 раза снижена скорость пролиферации клеток (р<0,05), в 3 раза увеличена доля апоптозных клеток в популяции (р<0,001), в 4 раза повышена продукция АФК (р<0,001) и на 30% снижена экспрессия глутатион-пероксидазы, одного из компонентов антиоксидантной защиты клеток (р<0,05). Кроме того, активность ALP, отражающая уровень остеогенной дифференцировки клеток после культивирования в остеоиндуктивной среде роста, была выше в МСК-ЖТ старых животных по сравнению с молодыми (р<0,05).

На модели образования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле in vitro мы показали, что кондиционированная среда от МСК-ЖТ старых мышей (возраст 18 мес.) стимулировала формирование тубулярных структур достоверно менее выражено, чем среда от клеток молодых животных (возраст 1-2 мес.) (21052±285 отн.ед. vs. 22781±412 отн.ед., соответственно, р = 0,01).

Для оценки ангиогенного потенциала МСК-ЖТ, полученных от молодых (1-2 мес.) и старых (18 мес.) животных, in vivo мы имплантировали подкожно мышам Матригель, содержащий эти клетки. С помощью двойного иммунофлуоресцентного окрашивания срезов Матригеля антителами против маркеров эндотелия сосудов CD31 и перицитов NG2 было установлено, что МСК-ЖТ старых животных в среднем в полтора раза слабее стимулировали васкуляризацию имплантатов, чем МСК-ЖТ молодых мышей, хотя различия не достигали статистической значимости (средняя плотность всех сосудов 47,7 (41,2; 49,9) vs. 69,0 (60,0; 73,6), соответственно, р=0,09; средняя плотность капилляров -36,2 (31,9; 36,2) vs. 59,0 (54,3; 62,6), соответственно, р=0,06).

Реализация ангиогенного потенциала стволовых и прогениторных клеток после трансплантации во многом определяется микроокружением, в которое попадают клетки, и состоянием организма-реципиента. Для того чтобы оценить, зависит ли эффект стимуляции роста кровеносных сосудов с помощью МСК-ЖТ от возраста реципиента,

мы сравнили васкуляризацию имплантатов Матригеля, содержащих МСК-ЖТ молодых мышей (возраст 1-2 мес.), введенных мышам разного возраста. Оказалось, что клетки молодых мышей слабее стимулировали прорастание кровеносных сосудов в имплантат у старых мышей, чем у молодых (средняя плотность сосудов 69,0 (60,0; 73,6) уя. 80,1 (75,9; 82,0), соответственно, р=0,09; средняя плотность капилляров 59,0 (54,3; 62,6) уя. 72,3 (67,5; 78,8), соответственно, р=0,048).

Для выявления механизма ослабления ангиогенной активности МСК-ЖТ с возрастом, мы проанализировали в клетках экспрессию генов факторов, регулирующих ангиогенез, и обнаружили, что в МСК-ЖТ старых мышей происходит снижение содержания мРНК УЕвР и РЮР и повышение - НОР, ТОРР1 и ТВ81, а также компонентов внеклеточного протеолиза (иРАЯ, ММП-2 и 9, РА1-1) (Табл. 4), что соответствует данным, полученным на МСК-ЖТ человека.

Таблица 4. Содержание мРНК генов факторов, регулирующих ангиогенез, в МСК-ЖТ мыши (отн.ед.), оцененное с помощью ПЦР в реальном времени.

Возраст 1-2 мес. 12 мес. 18 мес. 24 мес.

мышей n=16 n=6 п=9 п=7

VEGF 3,45 1,98* 1,65* 1,47*

(2,83; 4,08) (2,17; 1,80) (2,30; 1,01) (1,83; 1,10)

PIGF 8,64 4,20* 1,25*# 2,03*#

(5,90; 11,4) (4,10; 4,30) (1,05; 1,46) (1,37; 2,70)

HGF 5,61 15,17* 14,18* 14,18*

(3,71; 7,50) (13,57;16,76) (11,51;16,64) (5,25;23,10)

TGFpi 2,63 0,92* 1,38 2,63

(2,24; 3,02) (0,80; 1,10) (1,13; 1,62) (1,16; 4,10)

TBS1 7,88 4,51 17,6*# 4,04

(6,10; 9,67) (2,13; 6,88) (13,3; 21,90) (2,91; 5,16)

ENDS 3,37 0,75 1,16 9,5

(1,73; 5,01) (0,64; 0,86) (0,87; 1,44) (2,1; 17,0)

PAI-1 15,10 3,47* 33,7*# 42,1*#

(12,60; 17,70) (2,26; 4,68) (27,2; 40,2) (24,1; 60,2)

uPA 10,82 0,82* 7,12 4,07

(6,88; 14,76) (0,53; 1,12) (5,93; 8,31) (1,18; 6,97)

uPAR 2,77 0,67* 5,91*# 4,04*#

(2,15; 3,40) (0,58; 0,75) (5,69; 6,14) (2,91; 5,16)

ММП-2 3,64 3,26 9,65 *# 0,79*

(2,68; 4,59) (2,28; 4,24) (7,48; 11,71) (0,23; 1,36)

ММП-9 1,21 1,80 6,36*# 0,97

(0,87; 1,55) (1,53; 2,08) (5,28; 7,43) (0,57; 1,88)

Примечание. * - статистически значимые различия с группой молодых мышей (возраст 1-2 мес.), р<0,05; # - статистически значимые различия с группой мышей в возрасте 12 мес., р<0,05. Тврр - трансформирующий фактор роста бета.

Полученные на клетках мышей данные подтвердили вклад возрастного фактора в ухудшение ангиогенных свойств МСК-ЖТ. С возрастом в МСК-ЖТ накапливаются маркеры клеточного старения, снижается продукция ангиогенных факторов и увеличивается активность системы компонентов внеклеточного протеолиза. По-видимому, МСК-ЖТ пожилых доноров приобретают ассоциированный со старением секреторный фенотип, описанный для стареющих фибробластов [Сорре, 2008] и гладкомышечных клеток сосудов [Wang, 2010], к признакам которого относятся повышение продукции провоспалительных цитокинов, ангиопоэтина-2, TGFßl, PAI-1, ММП-2, укорочение теломер, накопление АФК, увеличение экспрессии ингибиторов клеточного цикла (р16, р21, р53) и др. Полученные нами данные позволяют добавить к этим признакам снижение продукции ангиогенных факторов роста (VEGF, P1GF, HGF, ангиогенина, ангиопоэтина-1).

Влияние кратковременной гипоксии на ангиогеиные свойства МСК-ЖТ при старении. Гипоксия является мощным стимулятором роста кровеносных сосудов. Культивирование клеток при низком содержании кислорода (1%) является' одним из способов стимуляции ангиогенных свойств МСК-ЖТ ex vivo [Rehman, 2004; Thangarajah, 2008; Rubina, 2009; Калинина, 2009], поэтому в нашей работе МСК-ЖТ, полученные от молодых и старых доноров, были культивированы как в стандартных, так и гипоксических условиях.

Используя микрочипы (Illumina), мы проанализировали транскриптом МСК-ЖТ человека (п=5), культивированных при стандартном (нормоксия) или пониженном (гипоксия) содержании кислорода и обнаружили, что в гипоксических условиях преимущественно активировалась экспрессия генов, отвечающих за клеточный метаболизм, передачу внутриклеточных сигналов, межклеточные взаимодействия, а также генов факторов роста и хемокинов, что хорошо соотносится с данными Буравковой и соавт. (2011).

Среди всех проанализированных генов с помощью базы данных GeneOntology были выделены 240 генов, принимающих участие в процессе ангиогенеза (гены про- и антиангиогенных факторов роста и их рецепторов, факторов, опосредующих инвазию и миграцию клеток в процессе ветвления и созревания сосудистой сети, участвующих в ремоделировании внеклеточного матрикса и др.). Анализ этих групп генов показал, что большая часть генов, экспрессия которых в МСК-ЖТ повышается при гипоксии, относится к факторам, стимулирующим ангиогенез (31 ген, например, VEGF, ангиогенин, uPAR), а меньшая - к ингибиторам ангиогенеза (8 генов, например, фактор морфогенеза кости (ВМР4), гистоновая ацетилаза-5 (HDAC5)).

Влияние гипоксии на способность МСК-ЖТ стимулировать рост кровеносных сосудов in vivo мы оценивали на модели васкуляризации подкожных имплантататов Матригеля. С помощью двойного иммунофлуоресцентного окрашивания срезов Матригеля было установлено, что МСК-ЖТ, культивированные в условиях гипоксии,

сильнее стимулировали васкуляризацию, чем клетки, культивированные в стандартных условиях (плотность сосудов 150,8 (143,6; 169,5) и 80,1 (75,9; 82,0), соответственно, р=0,06). Различия в эффекте МСК-ЖТ, культивированных в гипоксических или стандартных условиях, наблюдались для капилляров (средняя плотность 143,3 (136,1 160,0) и 72,3 (67,5; 78,8), р=0,05), сосудов среднего калибра (средняя плотность 5,3 (5,1 5,6) и 3,0 (2,9; 3,5), р=0,002) и зрелых сосудов (средняя плотность 2,3 (2,1; 2,4) и 0,8 (0,6. 1,0), р=0,026) (Рис. 4). Это позволяет предполагать, что МСК-ЖТ, культивированные в условиях гипоксии, не только лучше стимулируют рост сосудов, чем клетки, культивированные в стандартных условиях, но и способствуют стабилизации новообразованных сосудов и формированию в имплантатах зрелых сосудов.

в \

Рисунок 4. Гипоксия усиливает способность МСК-ЖТ стимулировать рост кровеносных сосудов. Выявление эндотелия и перицитов с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания замороженных срезов Матригеля антитепами против СОЗ! (зеленая флуоресценция) и антигена ЬЮ2 (красная флуоресценция), увеличение х20 (А, Б) или х40 (В, Г). Ядра клеток окрашены ЭАР1 (синяя флуоресценция). А, В - Матригель, содержащий МСК-ЖТ, культивированные в стандартных условиях; Б, Г - Матригель, содержащий МСК-ЖТ, культивированные в гипоксических условиях. Капилляры указаны одинарными стрелками, сосуды среднего калибра - двойными стрелками, крупные сосуды - острием стрелки.

Гипоксия стимулировала экспрессию генов проангиогенных факторов (УЕОР, РЮГ, 1ЮР) в МСК-ЖТ, причем ответ клеток зависел от возраста доноров (Рис. 5). Экспрессия генов урокиназы и ММП-2 и -9 снижалась при культивировании МСК-ЖТ в гипоксических условиях, а экспрессия иРАК. повышалась в МСК-ЖТ самых молодых

мышей и слабо менялась в других группах. Содержание мРНК ингибиторов ангиогенеза снижалось при гипоксии во всех возрастных группах.

Таким образом, мы показали, что в условиях гипоксии в МСК-ЖТ изменяется баланс экспрессии генов факторов, подавляющих и активирующих ангиогенез, в пользу последних, что обусловливает повышение способности этих клеток стимулировать рост кровеносных сосудов, а также стабилизировать новообразованные сосуды. Усиление экспрессии генов ангиогенных факторов в МСК-ЖТ старых доноров в ответ на гипоксию меньше выражено по сравнению с молодыми животными. Это может быть связано с уменьшением содержания [Шуагс!, 2000], нарушением стабилизации [Ноеш§, 2008] и внутриклеточного транспорта [АЫиугаПа, 2010] фактора, индуцируемого гипоксией (НПМа), при старении.

ГипоксияГнормоксия

г|10

2 I 8

0) а с зоб

|1 4

О- О о 2

О | 0

т *

Т] г

— + —*—

ВАМ ТиГ

□ 1-2 мес Ш12 мес Ш18 мес ■ 24 мес

УЕСР

РЮР

НСЯ

Рисунок 5. Изменения содержания мРНК проангиогенных факторов роста в МСК-ЖТ в ответ на гипоксию различаются у мышей разных возрастных групп.

Данные представлены в виде среднее^ЕМ. * - р<0,05.

В то же время мы обнаружили, что кондиционированная среда, полученная от МСК-ЖТ, культивированных в условиях гипоксии, стимулировала образование эндотелиальными клетками капилляроподобных структур в одинаковой степени для клеток старых и молодых животных (13±3% 11±4%, соответственно, р=0,49). Это позволяет предлагать гипоксическое прекондиционирование для стимуляции ангиогенных свойств МСК-ЖТ пожилых пациентов.

ВЫВОДЫ

1. МСК-ЖТ, полученные от пациентов разного возраста, не различаются по морфологии и иммунофенотипу, способности к дифференцировке в адипогенном и остеогенном направлениях и пролиферативной активности, однако доля активно делящихся клеток и средняя длина теломер в МСК-ЖТ уменьшаются с возрастом пациентов, что особенно выражено у больных ИБС и может свидетельствовать об ускоренном клеточном старении при данном заболевании.

2. Секреция УЕОИ, РЮР, РЮР, ангиопоэтина-1 и ангиогенина, а также ангиогенная активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ снижаются с возрастом, как у

пациентов без кардиологических заболеваний, так и у больных ИБС, что сопровождается снижением содержания мРНК P1GF и HGF, но не других ангиогенных факторов. Блокирование VEGF в кондиционированной среде приводит к подавлению ангиогенной активности суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ в среднем на 57%, и степень подавления тем меньше, чем короче теломеры в клетках.

3. В МСК-ЖТ пациентов в возрасте старше 60 лет, особенно в группе кардиологических больных, происходит активация системы компонентов внеклеточного протеолиза (повышение содержания мРНК урокиназы, урокиназного рецептора и PAI-1, увеличение экспрессии урокиназного рецептора на поверхности клеток, а также содержания и активности матриксных металлопротеиназ 2 и 9 типов).

4. В МСК-ЖТ старых мышей наблюдаются признаки, характерные для стареющих клеток: укорочение теломер, снижение скорости пролиферации, увеличение доли апоптотических клеток, усиление оксидативного повреждения, а также повышается их способность к остеогенной дифференцировке.

5. Способность МСК-ЖТ стимулировать ангиогенез in vitro и in vivo снижается с возрастом.

6. В МСК-ЖТ старых мышей происходит снижение экспрессии генов VEGF и P1GF и повышение HGF, TGF|31 и TBS1, а также генов некоторых компонентов внеклеточного протеолиза (uPAR, ММП-2 и 9, PAI-1).

7. Гипоксия повышает экспрессию генов ангиогенных факторов, подавляет экспрессию ингибиторов ангиогенеза в МСК-ЖТ и усиливает способность этих клеток, как молодых, так и старых животных, стимулировать рост кровеносных сосудов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах:

1. Rubina К.A., Kalinina N.I., Efimenko A.Y., Lopatina T.V., Melikhova V.A., Tsokolaeva Z.N., Sysoeva V.Y., Tkachuk V.A., Parfyonova Ye.V. Adipose Stromal Cells Stimulate Angiogenesis via Promoting Progenitor Cell Differentiation, Secretion of Angiogenic Factors, and Enhancing Vessel Maturation. Tissue Eng Part A. 2009; 15(8):2039-50.

2. Efimenko A. Yu., Starostina E. E., Rubina K. A., Kalinina N. I., Parfenova E. V. Viability and Angiogenic Activity of Mesenchymal Stromal Cells from Adipose Tissue and Bone Marrow under Hypoxia and Inflammation in vitro. Cell and Tissue Biology. 2010; 4; 2: 117-127.

3. Efimenko A., Starostina E., Kalinina N, Stolzing A. Angiogenic properties of aged adipose derived mesenchymal stem cells after hypoxic conditioning. Journal of Translational Medicine. 2011; 9(l):10-22.

4. Ефименко А.Ю., Калинина Н.И., Парфенова E.B., Ткачук В.А. Жизнеспособность мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани и костного мозга и изменения их экспрессионного профиля при культивировании в условиях гипоксии и

действия воспалительных факторов. Вестник молодых ученых «Ломоносов» выпуск IV. М.: изд. А.В.Воробьев, СП Мысль, 2007. - С. 359-363.

5. Калинина Н.И., Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Гипоксия как основной активатор ангиогенеза и роста жировой ткани. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2009; 95(3):283-9.

6. Рубина К.А., Калинина Н.И., Ефименко А.Ю., Лопатина Т.В., Мелихова В.А., Цоколаева З.И., Сысоева В.Ю., Ткачук В.А., Парфенова Е.В. Механизм стимуляции ангиогенеза в ишемизированном миокарде с помощью стромальных клеток жировой ткани. Кардиология. 2010; 50(2): 51-61.

7. Кочегура Т.Н., Ефименко АЛО., Акопян Ж.А., Парфенова Е.В. Клеточная терапия сердечной недостаточности: клинический опыт, проблемы и перспективы. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010; 5(2): 11-18.

8. Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е., Рубина К.А., Калинина Н.И., Парфенова Е.В. Влияние гипоксии и воспалительных факторов на жизнеспособность и ангиогенную активность мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани и костного мозга. Цитология. 2010; 52(2): 144-154.

Тезисы конференции:

1. Ефименко А.Ю., Калинина Н.И., Парфенова Е.В., Ткачук В.А.Функциональная активность стромальных клеток-предшественников из жировой ткани и костного мозга в условиях гипоксии и воспаления in vitro. Сборник тезисов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов". Москва, 12-15 апреля 2007 г. С. 187.

2. Efimenko A., Kalinina N., Parfyonova Е., Tkachuk V. Functional activity of adipose- and bone marrow derived mesenchymal stromal cells under hypoxia and inflammation in vitro. Сборник тезисов 32 Международного FEBS Конгресса, Вена, Австрия, 7-12 июля 2007 г. С. 39.

3. Ефименко А.Ю., Калинина Н.И., Старостина Е.Е., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Влияние гипоксии на ангиогенную активность стромальных клеток-предшественников жировой ткани и костного мозга. Сборник тезисов конференции «Молодые ученые в медицине-2008», Казань, 23-26 апреля 2008 г. С. 203.

4. Efimenko A.Yu., Kalinina N.I., Parfyonova E.V., Tkachuk V.A. Angiogenic activity of mouse mesenchymal stromal cells is stimulated by hypoxia in vitro and in vivo. Сборник тезисов международного форума аспирантов Тихоокеанского региона, Омаха, США, 2-6 июня 2008 г. С.25.

5. Ефименко А.Ю., Калинина Н.И., Старостина Е.Е., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Влияние возраста на ангиогенную активность стромальных клеток-предшественников из жировой ткани. Сборник тезисов всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения», Москва, 9-11 июня 2008 г. С. 38.

6. Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е., Калинина Н.И. Влияние возраста на ангиогенные свойства стромальных клеток-предшественников жировой ткани. Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы медицинской науки», Ярославль, 21-23 апреля 2010 г. С. 23.

7. Efimcnko A., Starostina Е., Kalinina N., Stolzing A. Angiogenic properties of aged adipose derived mesenchymal stem cells after hypoxic conditioning. Сборник тезисов 8-ой ежегодной международной конференции ISSCR, Сан-Франциско, США, 16-19 июня 2010 г. С. 183.

8. Starostina ЕЕ, Efimenko AYu, Kalinina N1, Parfenova EV, Tkachuk VA. Ageing inhibits proliferation, viability and angiogenic potential of adipose-derived stem cells. Сборник тезисов международной конференции Biology of Aging; Determinants of Health-Span: From Cells to Humans, Gordon Research Conference, Лес Диаблеретс, Швейцария, 22-27 авг. 2010 г. С. 39.

9. Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е., Калинина Н.И., Парфенова Е.В. Изменение функциональных свойств мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани при старении. Сборник тезисов Всероссийской школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина», Москва, 25-28 октября 2010 г. С. 26.

10. A.Yu. Efimenko, Е.Е. Starostina, N.I. Kalinina, E.V. Parfyonova, A. Stolzing. Angiogenic properties of aged adipose derived mesenchymal stem cells after hypoxic conditioning. Сборник тезисов международной конференции Angiogenesis 2011, Амстердам, Голландия, 2-4 марта 2011 г. С. 92.

11. Efimenko A.Yu., Dzhoyashvili N.A., Starostina E.E., KalininaN.I., Parfyonova E.V. Age-dependent impairment of human adipose-derived mesenchymal stem cells angiogenic properties. Histology and Histopathology. 2011; 26(1): 14.

Подписано в печать:

01.08.2011

Заказ № 5763 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56

www.autorcferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Ефименко, Анастасия Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1-ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 .Терапевтический ангиогенез: основные подходы.

1 ^.Использование МСК жировой ткани для стимуляции ангиогенеза.

1.3. Старение МСК.

1.4.Персонализированный подход к клеточЕЮЙ терапии с использованием аутологичных

МСК-ЖТ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани"

Сердечно-сосудистые заболевания, в том числе ишемическая болезнь сердца (ИБС), занимают первое место в структуре причин смертности в большинстве стран, несмотря на значительный прогресс в развитии медикаментозных методов лечения, а также хирургической и эндоваскулярной реваскуляризации. Одним из перспективных подходов к лечению пациентов, страдающих от ишемии тканей, является терапевтический ангиогенез. Этот подход основан на стимуляции роста и ветвления кровеносных сосудов в ишемизированных тканях с помощью введения генетических конструкций с генами факторов роста или стволовых/прогениторных клеток, обеспечивающих высокую локальную продукцию ангиогенных факторов роста [Zachaiy, 2011].

Перспективным инструментом для терапевтического ангиогенеза являются мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выделенные из костного мозга или жировой ткани (МСК-ЖТ). Так, локальное и системное введение МСК-ЖТ экспериментальным животным способствует увеличению количества сосудов в ишемизированных конечностях и миокарде и улучшению перфузии этих тканей кровью [Парфенова, 2006; Rehman, 2004; Miyahara, 2006; Nakagami, 2006; Gimble, 2007; Zhang, 2007; Cai, 2009; Kondo, 2009]. Восстановление кровотока в ишемизированной ткани при трансплантации МСК-ЖТ обусловлено несколькими механизмами. Во-первых, эти клетки секретируют широкий набор ангиогенных факторов роста, которые способствуют миграции и пролиферации эндотелиальных клеток и их предшественников, а также формированию новых сосудов [Rehman, 2004; Gimble, 2007; Kondo, 2009; Rubina, 2009; Madonna, 2010]. Во-вторых, МСК-ЖТ секретируют активаторы плазминогена и матриксные протеазы, что способствует локальному разрушению внеклеточного матрикса и миграции клеток, участвующих в образовании сосудистой стенки, а также высвобождению связанных с матриксом ангиогенных факторов [Kachgal, 2011].

В-третьих, МСК-ЖТ могут дифференцироваться в гладкомышечные и эндотелиальные клетки, встраиваясь в растущие сосуды, а также стабилизировать вновь образованные сосуды, выполняя функцию перицитов [Miranville, 2004; Planat-Benard, 2004; Miyahara, 2006; Sumi, 2007]. Это согласуется с данными, демонстрирующими, что во всех тканях организма МСК являются компонентами сосудистой стенки и, по-видимому, играют важную роль в развитии и поддержании сосудистой сети как в норме, так и при патологическом ремоделировании тканей [Nombella-Arietta, 2011].

МСК могут быть получены практически из любых тканей человека, однако наименее травматичным является выделение МСК из жировой ткани, которую можно получить в достаточном количестве при малоинвазивной процедуре липосакции [Zuk, 2001; Yamamoto, 2007; Bieback, 2008; Fraser, 2008; Bailey, 2010].

Хотя МСК-ЖТ уже используются в ранних фазах клинических исследований по клеточной терапии заболеваний ишемического генеза [Madonna, 2009; Murohara, 2009; Bailey, 2010; Gimble, 2011], их свойства у больных с этими заболеваниями практически не изучены. Подавляющее большинство результатов, касающихся ангиогенных и регенеративных свойств МСК-ЖТ человека, получено на клетках, выделенных из жировой ткани относительно здоровых молодых доноров. В то же время известно, что старение и само заболевание может оказывать негативное влияние на состояние МСК [Fehrer, 2005; Sethe, 2006; Stolzing, 2008; Katsara, 2011; Madonna, 2011; Sun, 2011]. В единичных работах показано, что при старении снижается пролиферативный потенциал МСК-ЖТ и их способность к дифференцировке [Zhu, 2009; Huang, 2010], а также ухудшаются их ангиогенные свойства: снижается продукция VEGF, пролиферативный потенциал клеток и способность формировать тубулярные структуры на Матригеле [El-Ftesi, 2009; Huang, 2010]. Поскольку МСК входят в состав сосудистой стенки и принимают участие в процессах ее репарации при повреждении, , изменения, происходящие с ними при старении, могут являться важным патогенетическим фактором заболеваний, ассоциированных с возрастом, включая атеросклероз, сахарный диабет и артериальную гипертонию. Изменения свойств МСК, в том числе их способности стимулировать рост сосудов, могут снижать эффективность аутологической клеточной терапии у пожилых пациентов с ИБС или хронической ишемией нижней конечностей - наиболее вероятных кандидатов для клеточной терапии. Так, на экспериментальных моделях инфаркта миокарда было показано, что эффективность клеточной терапии с использованием МСК костного мозга в группе старых мышей была снижена по сравнению с группой молодых животных [Sethe, 2006; Bujak, 2008], а МСК пациентов старше 50 лет были менее эффективны по сравнению с клетками детей в возрасте 1-5 лет [Fan, 2010]. Для повышения эффективности клеточной терапии собственными клетками пациента, а также для разработки методов стимуляции эндогенных регенеративных процессов необходимо понимание молекулярных механизмов, обусловливающих снижение терапевтических свойств клеток, в частности, их способности стимулировать васкуляризацию ишемизированных тканей.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

2. Оценить содержание ангиогенных факторов (VEGF, P1GF, HGF, ангиопоэтина-1, ангиогенина и тромбоспондина-1) в кондиционированной среде и ангиогенную активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ пациентов разного возраста с ИБС и без нее.

3.Проанализировать профиль экспрессии генов, кодирующих факторы, которые участвуют в регуляции ангиогенеза, в МСК-ЖТ пациентов разного возраста с ИБС и без нее.

4.Определить влияние возраста на пролиферацию, жизнеспособность, способность к дифференцировке и продукцию активных форм кислорода в МСК-ЖТ мышей.

5.Сравнить способность МСК-ЖТ мышей разного возраста стимулировать ангиогенез на моделях in vitro и in vivo.

6.Проанализировать профиль экспрессии генов, кодирующих факторы, которые участвуют в регуляции ангиогенеза, в МСК-ЖТ мышей разного возраста.

7.Определить влияние гипоксии на ангиогенные свойства МСК-ЖТ.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование морфофункциональных и молекулярных характеристик МСК, выделенных из жировой ткани пациентов разного возраста с ИБС и без нее. Установлено, что в МСК-ЖТ с возрастом происходит укорочение теломер и снижается доля активно пролиферирующих клеток. Это указывает на развитие процессов клеточного старения в МСК-ЖТ пожилых пациентов, что особенно выражено у больных ИБС. Впервые показано, что при старении снижается секреция этими клетками важнейших проангиогенных факторов, таких как VEGF, P1GF, IIGF, ангиопоэтин-1, ангиогенин, и ангиогенная активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ. Впервые установлено, что при старении МСК-ЖТ снижается вклад VEGF в ангиогенную активность суммарных продуктов секреции клеток. Впервые обнаружено, что в МСК-ЖТ, полученных от пациентов в возрасте старше 60 лет, происходит активация системы внеклеточного протеолиза: увеличение экспрессии и активности матрикспых металлопротеиназ 2 и 9 типов, увеличение экспрессии генов урокиназы и урокиназного рецептора, а также ингибитора активаторов плазминогена PAI-1, что особенно выражено в группе кардиологических больных.

Результаты данной работы помогают расширить представления о молекулярных механизмах снижения регенеративного потенциала стволовых/ прогениторных клеток с возрастом, в том числе ангиогенной активности МСК.

Практическая значимость. Результаты диссертационной работы раскрывают механизмы снижения регенеративных свойств МСК у пожилых людей и больных ИБС, что целесообразно учитывать при разработке методов клеточной терапии и, в частности, тактики терапевтического ангиогенеза на основе введения МСК-ЖТ для лечения больных ИБС. Полученные в исследовании данные о снижении ангиогенного потенциала МСК-ЖТ с возрастом и выявление конкретных ангиогенных факторов, секреция которых снижается с возрастом, могут быть положены в основу разработки методов предтрансплантационной подготовки МСК-ЖТ пожилых пациентов, способствующих усилению способности клеток стимулировать рост кровеносных сосудов. К таким методам может относиться генетическая модификация МСК-ЖТ конструкциями, несущими гены факторов роста, продукция которых снижена у пожилых больных. Мишени для этой модификации определены в данной работе. Другим методом, согласно полученным в работе данным, может быть предтрансплантационное культивирование МСК-ЖТ в условиях гипоксии.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ефименко, Анастасия Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. МСК-ЖТ, полученные от пациентов разного возраста, не различаются по морфологии и имму но фенотипу, способности к дифференцировке в адипогенном и остеогенном направлениях и пролиферативной активности, однако доля активно делящихся клеток и средняя длина теломер в МСК-ЖТ уменьшаются с возрастом пациентов, что особенно выражено у больных ИБС и может свидетельствовать об ускоренном клеточном старении при данном заболевании.

2. Секреция УЕОР, РЮТ, РЮР, ангиопоэтина-1 и ангиогенина, а также ангиогенная активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ снижаются с возрастом, как у пациентов без кардиологических заболеваний, так и у больных ИБС, что сопровождается снижением содержания мРНК РЮР и РЮР, но не других ангиогенных факторов. Блокирование УЕвР в кондиционированной среде приводит к подавлению ангиогенной активности суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ в среднем на 57%, и степень подавления тем меньше, чем короче теломеры в клетках.

5. Способность МСК-ЖТ стимулировать ангиогенез in vitro и in vivo снижается с возрастом.

6. В МСК-ЖТ старых мышей происходит снижение экспрессии генов VEGF и P1GF и повышение HGF, TGFpi и TBS1, а также генов некоторых компонентов внеклеточного протеолиза (uPAR, ММП-2 и 9, PAI-1).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование аутологичных МСК-ЖТ открывает широкие перспективы для разработки новых методов лечения заболеваний ишемического генеза, благодаря их способности стимулировать рост кровеносных сосудов, в основном путем продукции ангиогенных факторов роста и цитокинов. Однако в нашей работе показано, что возраст пациентов может оказывать значительное влияние на ангиогенные свойства МСК-ЖТ, в том числе у больных ИБС. Мы установили, что МСК, выделенные из жировой ткани пожилых пациентов, несмотря на сохранение имму но фенотипа, свойственного мезенхимальным стволовым клеткам, и мультипотентности, меньше секретируют проангиогенных факторов, чем клетки пациентов молодого и среднего возраста, что подтверждается на модели образования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле. Это> накладывает определенные ограничения на- применение аутологичных клеточных препаратов у пожилых пациентов, которые составляют самую большую когорту среди кандидатов на проведение клеточной терапии заболеваний ишемического генеза. Кроме того, полученные нами результаты-и значительный разброс данных между пациентами по ангиогенным свойствам МСК-ЖТ указывают на необходимость тестирования пригодности аутологичных клеток стимулировать рост кровеносных сосудов, а также актуальность разработки методов предтрансплантационной подготовки МСК-ЖТ пожилых пациентов.

На мышах мы показали, что наблюдаемые в МСК-ЖТ изменения связаны именно с возрастом. Мы установили, что в МСК-ЖТ старых животных, наряду со снижением количества жизнеспособных клеток, укорочением теломер, уменьшением пролиферационного потенциала и усилением оксидативного повреждения, наблюдаются изменения экспрессии ангиогенных факторов и компонентов внеклеточного протеолиза по сравнению с клетками от молодых животных. Ангиогенная активность суммарных продуктов секреции «старых» клеток в среду культивирования ниже, чем «молодых», и МСК-ЖТ старых животных хуже стимулируют васкуляризацию in vivo на модели подкожной имплантации Матригеля.

Остается не до конца ясным, изменяется ли секреторный профиль всех МСК-ЖТ в популяции или при старении происходят сдвиги в составе субпопуляций МСК-ЖТ. В пользу последнего предположения косвенно свидетельствует обнаруженная нами тенденция к снижению доли активно пролиферирующих МСК-ЖТ с возрастом. Проблема гетерогенности популяции МСК-ЖТ осложняется еще и отсутствием четких маркеров собственно мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани или их «проангиогенной» субпопуляции, изменение экспрессии которых с возрастом можно было бы проследить. Одним из маркеров, характеризующих субпопуляции МСК костного мозга, различающиеся по устойчивости к старению, может служить уровень активности теломеразы в клетках. Интересным представляется разделить популяцию МСК-ЖТ на несколько субпопуляций по активности теломеразы и сравнить их соотношение у молодых и пожилых пациентов, а также ангиогенный потенциал каждой из субпопуляций.

Для МСК-ЖТ как человека, так и мыши была отмечена активация системы компонентов внеклеточного протеолиза с возрастом. Сходные процессы происходят при старении в стенках артерий, в частности в гладкомышечных клетках сосудов. Предстоит выяснить, являются ли изменения в системе компонентов внеклеточного протеолиза компенсаторной реакцией на снижение ангиогенных свойств МСК-ЖТ.

Открытым остается вопрос о механизмах снижения ангиогенного потенциала МСК-ЖТ с возрастом. Происходит ли это за счет «внутреннего» старения самих клеток (снижения пролиферативного потенциала и укорочения теломер, усиления оксидативного стресса, накопления генетических и эпигенетических повреждений, сбоев в системе репарации ДНК и нарушения белкового метаболизма в клетках) или обусловлено, в первую- очередь, воздействием внешних стимулов стареющего организма, например, изменениями во взаимодействии МСК-ЖТ с белками внеклеточного матрикса и эндотелиальными клетками. Учитывая периваскулярную локализацию MGK во всех тканях организма, представляется также важным определить, какова может быть роль ухудшения ангиогенных свойств МСК-ЖТ при старении в развитии эндотелиальной дисфункции и патогенезе сосудистых заболеваний, ассоциированных с возрастом.

Мы показали, что кратковременное культивирование МСК-ЖТ в условиях гипоксии приводит к усилению их способности стимулировать ангиогенез на моделях in vitro и in vivo. Увеличение содержания мРНК проангиогенных факторов в гипоксических условиях выражено слабее в клетках, выделенных из жировой ткани старых животных, однако увеличение ангиогенной активности суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ в ответ на гипоксию статистически значимо не отличалось в группах молодых и старых животных. Это позволяет предполагать, что можно добиться стимуляции ангиогенных свойств клеток с помощью их культивирования перед трансплантацией при низком содержании кислорода.

При аутологичной терапии, по-видимому, эффект клеточной терапии для стимуляции ангиогенеза у пожилых пациентов может снижаться в том числе за счет микроокружения и состояния организма. На это указывают и наши данные: васкуляризация имплаптатов Матригеля, введенных старым мышам, была снижена по сравнению с молодыми животными, хотя клетки в составе имплантатов были одинаковые. Альтернативы клеточной терапии с использованием аутологичных клеток обсуждаются, но пока они сопряжены с определенными трудностями и необходимостью серьезных исследований иммунологических свойств МСК-ЖТ (в случае трансплантации аллогенных клеток от более молодых и здоровых доноров), потенциала и безопасности индуцибельных плюрипотентных стволовых клеток (1Р8С) или возможности использования других типов стволовых и прогениторных клеток (например, пуповинной крови) для терапевтического ангиогенеза. В настоящее время применение аутологичных клеток-предшественников наиболее этически и юридически оправданно. Таким образом, необходим поиск оптимальных способов предтрансплантационной подготовки аутологичного клеточного материала, полученного от пожилых пациентов, для повышения эффективности клеточной терапии заболеваний ишемического генеза. Учитывая полученные нами результаты, можно предложить использовать такие методы, как кратковременное гипоксическое прекондиционирование, а также введение в клетки генетических конструкций, содержащих гены УЕОР, РЮР, 1ЮР, ангиопоэтина-1 и/или ангиогенина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Ефименко, Анастасия Юрьевна, Москва

1. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р. и др. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток из липоаспирата человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода. Цитология. 2009; 51(1): 5-10.

2. Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е., Рубина К.А. и др. Влияние гипоксии и воспалительных факторов на жизнеспособность и ангиогенную активность мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани и костного мозга. Цитология. 2010; 52(2): 144-154.

3. Калинина Н.И., Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е. и др. Гипоксия как основной активатор ангиогенеза и роста жировой ткани. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2009; 95(3): 283-9.

4. Лопатина Т.В., Калинина Н.И., Ревищин A.B. и др. Индукция нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани. Клеточная трансплаталогия и тканевая инженерия. 2008; 3(4): 50-54.

5. Мертвецов Н.П., Стефанович Л.Е. Ангиогенин и механизм ангиогенеза. Новосибирск: Наука, 1997; 78.

6. Парфенова Е.В., Плеханова О.С., Меньшиков М.Ю. и др. Регуляция роста и ремоделирования кровеносных сосудов: уникальная роль урокиназы. Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 2009; 95(5):442-464.

7. Парфенова Е.В., Плеханова О.С., Ткачук В.А. Активаторы плазминогена в ремоделировании сосудов и ангиогенезе. Биохимия. 2002; 6: 119-34.

8. Парфенова Е.В., Цоколаева З.И., Трактуев Д.О. и др. Поиск новых «инструментов» для терапевтического ангиогенеза. Молекулярная медицина. 2006; 2: 10-23.

9. Рубина К.А., Калинина Н.И., Ефименко А.Ю. и др. Механизм стимуляции ангиогенеза в ишемизированном миокарде с помощью стромальных клеток жировой ткани. Кардиология. 2010; 50(2):51-61.

10. Смолянинов А.Б., Жаров Е.В., Новикова П.Ю. и др. Теломеры, стволовые клетки и клеточное старение организма. АГ инфо. 2009; 4: 3-7.

11. Akbari M., Krokan H. E. Cytotoxicity and mutagenicity of endogenous DNA base lesions as potential cause of human aging. Mech Ageing Dev. 2008; 129(7-8): 353-65.

12. Aksu A. E., Rubin J. P., Dudas J. R., et al. Role of gender and anatomical region on induction of osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 2008; 60(3): 306-22.

13. Amos P., Shang H., Bailey A., et al. IF ATS series: The role of human adipose-derived stromal cells in inflammatory microvascular remodeling and evidence of a perivascular phenotype. Stem Cells 2008; 20(10):2682-90.

14. Anand-Apte В., Pepper M. S., Voest E., et al. Inhibition of angiogenesis by tissue inhibitor of metalloproteinase-3. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997; 38(5): 817-23.

15. Andl T., Reddy S. T., Gaddapara T., et al. WNT signals are required for the initiation of hair follicle development. Dev Cell. 2002; 2(5): 643-53.

16. Annabi B., Lee Y.T., Turcotte S., et al. Hypoxia promotes murine bone marrow-derived stromal cells migration and tube formation. Stem cells. 2003; 21: 337-347:

17. Argraves W. S., Greene L. M., Cooley M. A., et al; Fibulins: physiological and disease perspectives. EMBO Rep. 2003; 4(12): 1127-31.

18. Assmus B., Urbich C., Aicher A., et al. HMG-CoA reductase inhibitors reduce senescence and increase proliferation of endothelial progenitor cells via regulation of cell cycle regulatory genes. Circ Res. 2003; 92(9): 1049-55.

19. Augello A., Kurth T. B., De Bari C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 2010; 20: 121-33.

20. Augustyniak A., Bylinska A., Skrzydlewska E. Age-dependent changes in the proteolytic-antiproteolytic balance after alcohol and black tea consumption. Toxicol Mech Methods. 2011; 21 (3):209-15.

21. AustL., Devlin B., Foster S. J., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 2004; 6(1):7-14.

22. Bacou F., el Andalousi R. B., Daussin P. A., et al. Transplantation of adipose tissue-derived stromal cells increases mass and functional capacity of damaged skeletal muscle. Cell Transplant. 2004; 13(2): 103-11.

23. Baglioni S., Francalanci M., Squecco R., et al. Characterization of human adult stem-cell populations isolated from visceral and subcutaneous adipose tissue. FASEB J. 2009; 23(10):3494-505.

24. Bagnato C., Thumar J., Mayya V., et al. Proteomics analysis of human coronary atherosclerotic plaque: a feasibility study of direct tissue proteomics by liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Mol Cell:Proteomics. 2007; 6: 1088— 1102.

25. Bailey A.M., Kapur S., Katz A. J. Characterization of adipose-derived stem cells: an update. Curr Stem Cell Res Ther. 2010; 5(2):95-102.

26. Balcerczyk A., Pirola L. Therapeutic potential of activators and inhibitors of sirtuins. Biofactors. 2010; 36(5):383-93.

27. Banas A., Teratani T., Yamamoto Y., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 2007; 46(l):219-28.

28. Baptista L. S., do Amaral R. J., Carias R. B., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 2009; 11(6):706-15.

29. Barleon B., Siemeister G., Martiny-Baron G., et al. Vascular endothelial growth factor up-regulates its receptor fms-like tyrosine kinase 1 (FLT-1) and a soluble variant ofFLT-1 in human vascular endothelial cells. Cancer Res. 1997; 57(23):5421-5.

30. Bartunek J., Vanderheyden M., Wijns W., et al. Bone-marrow-derived cells for cardiac stem cell therapy: safe or still under scrutiny? Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2007; 4(1): 100-5.

31. Baxter M. A., Wynn R. F., Jowitt S. N., et al. Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion. Stem Cells. 2004; 22(5):675-82.

32. Bell D. R., Van Zant G. Stem cells, aging, and cancer: inevitabilities and outcomes. Oncogene. 2004; 23(43):7290-6.

33. Bhang S. H., Cho S. W., Lim J. M., et al. Locally delivered growth factor enhances the angiogenic efficacy of adipose-derived stromal cells transplanted to ischemic limbs. Stem Cells. 2009; 27(8):1976-86.

34. Blande I.S., Bassaneze V., Lavini-Ramos C., et al. Adipose tissue mesenchymal stem» cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 2009; 49(12):2680-5.

35. Bujak M., Kweon H. J., Chatila K., et al. Aging-related defects are associated with adverse cardiac remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2008; 51(14):1384-92.

36. Burtner C. R., Kennedy B. K. Progeria syndromes and ageing: what is the connection? Nat Rev Mol Cell Biol. 2010; ll(8):567-78.

37. Byun G. H., Koh J. M., Kim D. K., et al. Alpha-lipoic acid inhibits TNF-alpha-induced apoptosis in human bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 2005; 20(7):1125-35.

38. Cai L., Johnstone B. H., Cook T. G., et al. Suppression of hepatocyte growth factor production impairs the ability of adipose-derived stem cells to promote ischemic tissue revascularization. Stem CelIs.2007;25(12):3234-43.

39. Calvani M., Rapisarda A., Uranchimeg B., et al. Hypoxic induction of an HIF-1 alpha-dependent bFGF autocrine loop drives angiogenesis in human endothelial cells. Blood. 2006; 107(7):2705-12.

40. Campisi J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 2005; 120(4):513-22.

41. Cao Y., Sun Z., Liao L., et al. Human adipose tissue-derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 332(2):370-9.

42. Carmeliet P., Jain R.K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 2011; 473 (7347): 298-307.

43. Carmeliet P., Moons L., Herbert J. M., et al. Urokinase but not tissue plasminogen activator mediates arterial neointima formation in mice. Circ Res. 1997; 81(5):829-39.

44. Carmeliet P., Moons L., Lijnen R., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 1997; 96(9):3180-91.

45. Carvalho P. P., Wu X., Yu G., et al. The Effect of Storage Time on Adipose-Derived Stem Cell Recovery from Human Lipoaspirates. Cells Tissues Organs. 2011; in press.

46. Castilho R. M., Squarize C. H., Chodosh L. A., et al. mTOR mediates Wnt-induced epidermal stem cell exhaustion and aging. Cell Stem Cell. 2009; 5(3):279-89.

47. Cawthon R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 2002; 30(10):e47.

48. Cesari M., Pahor M., Incalzi R. A. Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1): a key factor linking fibrinolysis and age-related subclinical and clinical conditions. Cardiovasc Ther. 2010; 28(5):e72-91.

49. Chambers S.M., Shaw C.A., Gatza C., et al. Aging hematopoietic stem cells decline in function and exhibit epigenetic dysregulation. PLoS Biol. 2007; 5(8):e201.

50. Chandra V.G.S., Phadnis S., Nair P.D., Bhonde R.R. Generation of pancreatic hormone-expressing islet-like cell aggregates from murine adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells. 2009; 27: 1941-1953.

51. Charruyer A., Barland C. O., Yue L., et al. Transit-amplifying cell frequency and cell cycle kinetics are altered in aged epidermis. J Invest Dermatol. 2009; 129(11):2574-83.

52. Charville G.W., Rando T.A. Stem cell ageing and non-random chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2011; 366(1561):85-93

53. Choi J.H., Kim K.L., Huh W., et al. Decreased number and impaired angiogenic function of endothelial progenitor cells in patients with chronic renal failure. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004; 24: 1246-1252.

54. Christiaens V., Lijnen H.R. Angiogenesis and development of adipose tissue. Mol. Cell. Endocrinol. 2010; 318: 2-9.i

55. Clapp C., Martial J. A., Guzman R. C., et al. The 16-kilodalton N-terminal < fragment of human prolactin is a potent inhibitor of angiogenesis. Endocrinology.1993; 133(3):1292-9.

56. Cleland J. G., Freemantle N., Coletta A. P., et al. Clinical trials update from the American Heart Association: REPAIR-AMI, ASTAMI, JELIS, MEGA, REVIVE-II, SURVIVE, and PROACTIVE. Eur J Heart Fail. 2006; 8(1):105-10.

57. Colombo E. S., Menicucci G., McGuire P. G., et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor promotes retinal angiogenesis through increased urokinase expression. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007; 48(4):1793-800.

58. Conboy I. M., Conboy M. J., Wagers A. J., et al. Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment. Nature. 2005; 433(7027):760-4.

59. Conde-Green A., de Amorim N. F.; Pitanguy I. Influence of decantation, washing and centrifugation on adipocyte and mesenchymal stem cell content of aspirated adipose tissue: a comparative study. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2010; 63(8):1375-81.

60. Connolly D. T. Vascular permeability factor: a unique regulator of blood vessel function. J Cell Biochem. 1991; 47(3):219-23.

61. Coppe J. P., Patil C. K., Rodier F., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biol. 2008; 6(12):2853-68.

62. Coultas L., Chawengsaksophak K., Rossant J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 2005; 438(7070):937-45.

63. Crisan M., Yap S., Casteilla L., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 2008; 3: 301-313.

64. Darbro B.W., Lee K.M., Nguyen N.K., et al. Methylation of the pl6(INK4a) promoter region in telomerase immortalized human keratinocytes co-cultured with feeder cells. Oncogene.2006;25(56):7421-33.

65. De Ugarte D. A., Alfonso Z., Zuk P. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunol Lett. 2003; 89(2-3):267-70.

66. Deindl E., Ziegelhoffer T., Kanse S. M., et al. Receptor-independent role of the urokinase-type plasminogen activator during arteriogenesis. FASEB J. 2003; 17(9):1174-6.

67. Devy L., Blacher S., Grignet-Debrus C., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 2002; 16(2): 147-54.

68. Di Rocco G., Iachininoto M. G., Tritarelli A., et al. Myogenic potential of adipose-tissue-derived cells. J Cell Sci. 2006; 119(14): 2945-52.

69. Dimmeler S., Aicher A., Vasa M., et al. HMG-CoA reductase inhibitors (statins) increase endothelial progenitor cells via the PI 3-kinase/Akt pathway. J Clin Invest. 2001; 108(3):391-7.

70. Distler J.W., Hirth A., Kurowska-Stolarska M. Angiogenic and angiostatic factors in the molecular control of angiogenesis. Q J Nucl Med. 2003; 47:149-61.

71. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8(4):315-7.

72. Donehower L. A. Does p53 affect organismal aging? J Cell Physiol. 2002; 192(l):23-33.

73. Dorshkind K., Montecino-Rodriguez E., Signer R. A. The ageing immune system: is it ever too old to become young again? Nat Rev Immunol. 2009; 9(l):57-62.

74. El-Ftesi S., Chang E. I., Longaker M. T., et al. Aging and diabetes impair the neovascular potential of adipose-derived stromal cells. Plast Reconstr Surg. 2009; 123(2):475-85.

75. Eto H., Miyata M., Shirasawa T., et al. The long-term effect of angiotensin II type la receptor deficiency on hypercholesterolemia-induced atherosclerosis. Hypertens Res. 2008; 31(8):1631-42.

76. Fan M., Chen W., Liu W., et al. The effect of age on the efficacy of human mesenchymal stem cell transplantation after a myocardial infarction. Rejuvenation Res. 2010; 13(4):429-38.

77. Fan L., Chen L., Chen X., Fu F. A meta-analysis of stem cell mobilization by granulocyte colony-stimulating factor in the treatment of acute myocardial infarction. Cardiovasc. Drugs Ther. 2008; 22: 45 -54.

78. Farre-Guasch E., Marti-Page C., Hernadez-Alfaro F., et al. Buccal fat pad, an oral access source of human adipose stem cells with potential for osteochondral tissue engineering: an in vitro study. Tissue Eng Part C Methods. 2010; 16(5):1083-94.

79. Faustini M., Bucco M., Chlapanidas T., et al. Nonexpanded mesenchymal stem cells for regenerative medicine: yield in stromal vascular fraction from adipose tissues. Tissue Eng PartC. 2010; 16(6): 1515-21.

80. Fehrer C., Lepperdinger G. Mesenchymal stem cell aging. Exp Gerontol. 2005; 40(12):926-30.

81. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocr Rev. 2004; 25(4):581-611.

82. Ferrara N., Kerbel R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 2005; 438(7070):967-74.

83. Feser J., Truong D., Das C., et al. Elevated histone expression promotes life span extension. Mol Cell. 2010; 39(5):724-35.

84. Flores I., Blasco M. A. The role of telomeres and telomerase in stem cell aging. FEBS Lett. 2010; 584(17):3826-30.

85. Flores I., Canela A., Vera E., et al. The longest telomeres: a general signature of adult stem cell compartments. Genes Dev. 2008; 22(5):654-67.

86. Flores I., Cayuela M. L., Blasco M. A. Effects of telomerase and telomere lengthi ion epidermal stem cell behavior. Science. 2005; 309(5738): 1253-6.

87. Fraser J. K., Wulur I., Alfonso Z., et al. Differences in stem and progenitor cell yield in different subcutaneous adipose tissue depots. Cytotherapy. 2007; 9(5):459-67.

88. Fraser J. K.5 Zhu M., Wulur I., et al. Adipose-derived stem cells. Methods Mol Biol. 2008; 449(59-67.

89. Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp. Hematol. 1976; 4: 267-274.

90. Frontini M.J., Nong Z., Gros R., et al. Fibroblast growth factor 9 delivery during angiogenesis produces durable, vasoresponsive microvessels wrapped by smooth muscle cells. Nature Biotechnology. 2011; 29(5): 421-427.

91. Fuchs E., Merrill B. J., Jamora C., et al. At the roots of a never-ending cycle. Dev Cell. 2001; l(l):13-25.

92. Gale N. W., Yancopoulos G. D. Growth factors acting via endothelial cell-specific receptor tyrosine kinases: VEGFs, angiopoietins, and ephrins in vascular development. Genes Dev. 1999; 13(9): 1055-66.

93. Gao X., Xu Z. Mechanisms of action of angiogenin. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2008; 40(7):619-24.

94. Gennaro G., Menard C., Miehaud S. E., et al. Age-dependent impairment of reendothelialization after arterial injury: role of vascular endothelial growth factor. Circulation. 2003; 107(2):230-3.

95. Ghosh A.K., Vaughan D.E. PAI-1 in Tissue Fibrosis. J Cell Physiol. 2011; in press.

96. Giangreco A., Qin M., Pintar J. E., et al. Epidermal stem cells are retained in vivo throughout skin aging. Aging Cell. 2008; 7(2):250-9.

97. Gimble J., Guilak F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 2003;5(5):362-9.

98. Gimble J.M., Katz A.J., Bunnell B.A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 2007; 100(9):1249-60.

99. Gimble J.M., Bunnell B.A., Chiu E.S., Guilak F. Concise Review: Adipose derived stromal vascular fraction cells and stem cells: let's not get lost in translation. Stem Cells. 2011; 29(5): 749-54.

100. Girolamo L.D., Lopa S., Arrigoni E., et al. Human adipose-derived stem cells isolated from young and elderly women: their differentiation potential and scaffold interaction during in vitro osteoblastic differentiation. Cytotherapy. 2009; 1-11.

101. Goldberg A.D., Allis C.D., Bernstein E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 2007; 128(4):635-8.

102. Gray M. D., Shen J. C., Kamath-Loeb A. S., et al. The Werner syndrome protein is a DNA helicase. Nat Genet. 1997; 17(l):100-3.

103. Gualandris A., Lopez Conejo T., Giunciuglio D., et al. Urokinase-type plasminogen activator overexpression enhances the invasive capacity of endothelial cells. Microvasc Res. 1997; 53(3):254-60.

104. Guo Y., Higazi A. A., Arakelian A., et al. A peptide derived from the nonreceptor binding region of urokinase plasminogen activator (uPA) inhibits tumor progression and angiogenesis and induces tumor cell death in vivo. FASEB J. 2000; 14(10):1400-10.

105. Haider H.K., Ashraf M.J. Preconditioning and stem cell survival. Cardiovasc Transl Res. 2010; 3(2): 89-102.

106. Handsley M.M., Edwards D.R. Metalloproteinases and their inhibitors in tumor angiogenesis. Int J Cancer. 2005; 115(6):849-60.

107. Hao L.Y., Armanios M., Strong M.A., et al. Short telomeres, even in the presence of telomerase, limit tissue renewal capacity. Cell. 2005; 123(6):1121-31.

108. Harris L.J., Zhang P., Abdollahi H. et al. Availability of adipose-derived stem cells in patients undergoing vascular surgical procedures. J Surg Res. 2010; 163(2): el05-12.

109. Hart R.W., Setlow R.B. Correlation between deoxyribonucleic acid excision-repair and life-span in a number of mammalian species. Proc Natl Acad Sci USA. 1974; 71(6): 2169-73.

110. Herrmann J.L., Abarbanell A.M., Weil B.R., et al. Optimizing stem cell function for the treatment of ischemic heart disease. Journal of Surgical Research. 2011; 166: 138-145.

111. Heymans S., Luttun A., Nuyens D., et al. Inhibition of plasminogen activators or matrix metalloproteinases prevents cardiac rupture but impairs therapeutic angiogenesis and causes cardiac failure. Nat Med. 1999; 5(10):1135-42.

112. Hill J.M., Zalos G., Halcox J.P., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 2003; 348:593-600.

113. Hockel M., Schlenger K., Doctrow S., Kissel T., Vaupel P. Therapeutic angiogenesis. Arch Surg. 1993; 128(4):423-9.

114. Hoenig M.R., Bianchi C., Rosenzweig A., et al. Decreased vascular repair and neovascularization with ageing: mechanisms and clinical relevance with an emphasis on hypoxia-inducible factor-1. Curr Mol Med. 2008; 8(8):754-67.

115. Housman T.S., Lawrence N., Mellen B.G., et al. The safety of liposuction: results of a national survey. Dermatol Surg. 2002; 28(ll):971-8.

116. Hu G.F., Riordan J.F. Angiogenin enhances actin acceleration of plasminogen activation. Biochem Biophys Res Commun.l993;197(2):682-7.

117. Hu X., Yu S.P., Fraser J.L., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted' heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. J Thorac Cardiovasc Surg. 2008; 135: 799-808.

118. Huang J.I., Beanes S.R., Zhu M., et al. Rat extramedullary adipose tissue as a source of osteochondrogenic progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 2002; 109(3): 103341; discussion 1042-3.

119. Huang S.C., Wu T.C., Yu H.C., et al. Mechanical strain modulates age-related changes in the proliferation and differentiation of mouse adipose-derived stromal cells. BMC Cell Biol. 2010; 11-18.

120. Huang S.D., Lu F.L., Xu X.Y., et al. Transplantation of angiogenin-overexpressing mesenchymal stem cells synergistically augments cardiac function in a porcine model of chronic ischemia. J Thorac Cardiovasc Surg. 2006; 132(6): 13291338.

121. Im W., Chung J.Y., Kim S.H., et al. Efficacy of autologous serum in human adipose-derived stem cells; cell markers, growth factors and differentiation. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2011; 57: 1470-5.

122. Janzen V., Forkert R., Fleming H. E., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor pl6INK4a. Nature. 2006; 443(7110):421-6.

123. Jaulmes A., Sansilvestri-Morel P., Rolland-Valognes G., et al. Nox4 mediates the expression of plasminogen activator inhibitor-1 via p38 MAPK pathway in cultured human endothelial cells. Thromb Res. 2009; 124(4):439-46.

124. Jiang S., Haider H.K., Ahmed R.P., et al. Transcriptional profiling of young and old mesenchymal stem cells in response to oxygen deprivation and reparability of the infarcted myocardium. J Mol Cell Cardiol. 2008; 44(3):582-96.

125. Jimenez B., Volpert O.V., Crawford S.E., et all Signals leading to apoptosis-dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1. Nat Med 2000;6:41-8.

126. Jimi S., Ito K., Kohno K., et al. Modulation by bovine angiogenin of tubular morphogenesis and expression of plasminogen activator in bovine endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 1995; 211(2):476-83.

127. Jones B.J., McTaggart S.J. Immunosuppression by mesenchymal stromal cells: from culture to clinic. Exp Hematol. 2008; 36(6): 733-741.

128. Jones D.L., Rando T.A. Emerging models and paradigms for stem cell aging. Nat. Cell Biol. 2011; in press.

129. Jurgens W.J., Oedayrajsingh-Varma M.J., Helder M.N., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell Tissue Res. 2008; 332(3):415-26.

130. Kachgal S., Putnam A.J. Mesenchymal stem cells from adipose and bone marrow promote angiogenesis via distinct cytokine and protease expression mechanisms. Angiogenesis. 2011; 14(1): 47-59.

131. Kaewkhaw R., Scutl A. M., Haycock J. W. Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for Schwann-cell phenotype and function. Glia. 2011; 59(5):734-49.

132. Kang S.K., Putnam L.A., Ylostalo J., et al. Neurogenesis of rhesus adipose stromal cells. J. Cell Sci. 2004; 117: 4289-4299.

133. Katz A.J., Tholpady A., Tholpady S.S., et al. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 2005; 23(3):412-23.

134. Kelly G.S. A review of the sirtuin system, its clinical implications, and the potential role of dietary activators like resveratrol: part 2. Altern Med Rev. 2010; 15(4):313-28.

135. Khan W.S., Adesida A.B., Tew S.R., et al. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury. 2009; 40(2):150-7.

136. Kilroy G.E., Foster S.J., Wu X., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 2007; 212(3):702-9.

137. Kim W.S., Park B.S., Sung J.H. The wound-healing and antioxidant effects of adipose-derived stem cells. Expert Opin Biol Ther. 2009; 9(7):879-87.

138. Kirkwood T.B. Understanding the odd science of aging. Cell.2005;120(4):437-47.

139. Koga H., Kaushik S., Cuervo A.M. Protein homeostasis and aging: The importance of exquisite quality control. Ageing Res Rev. 2011; 10(2):205-15.

140. Kondo K., Shintani S., Shibata R., et al. Implantation of adipose-derived regenerative cells enhances ischemia-induced angiogenesis. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2009; 29(l):61-6.

141. Kondo T., Hayashi M., Takeshita K., et al. Smoking cessation rapidly increases circulating progenitor cells in peripheral blood in chronic smokers. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004; 24: 1442-1447.

142. Kortlever R.M., Higgins P.J., Bernards R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 2006; 8(8):877-84.

143. Kostka G., Giltay R., Bloch W., et al. Perinatal lethality and endothelial ccll abnormalities in several vessel compartments of fibulin-1 -deficient mice. Mol Cell Biol. 2001; 21(20):7025-34.

144. Kovacic J.C., Boehm M. Resident vascular progenitor cells: An emerging role for non-terminally differentiated vessel-resident cells in vascular biology. Stem Cell Res. 2009; 2: 2-15.

145. Krecki R., Krzeminska-Pakula M., Drozdz J., et al. Relationship of serum angiogenin, adiponectin and resistin levels with biochemical risk factors and the angiographic severity of three-vessel coronary disease. Cardiol J. 2010; 17(6): 599-606.

146. Krishnamurthy J., Ramsey M.R., Ligon K.L., et al. pl6INK4a induces an age-dependent decline in islet regenerative potential.Nature.2006;443(7110):453-7.

147. Krishnamurthy J., Torrice C., Ramsey M. R., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. J Clin Invest. 2004; 114(9): 1299-307.

148. Kudlow B.A., Kennedy B.K., Monnat R.J., Jr. Werner and Hutchinson-Gilford progeria syndromes: mechanistic basis of human progeroid diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007; 8(5):394-404.

149. Lafleur M.A., Handsley M.M., Edwards D.R. Metalloproteinases and their inhibitors in angiogenesis. Expert Rev Mol Med. 2003; 5(23): 1-39.

150. Lamalice L., Le Boeuf F., Huot J. Endothelial cell migration during angiogenesis. CircRes. 2007; 100(6):782-94.

151. Lee H. W., Blasco M. A., Gottlieb G. J., et al. Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. Nature. 1998; 392(6676):569-74.

152. Lee J. E., Kim I., Kim M. Adipogenic differentiation of human adipose tissue-derived stem cells obtained from cryopreserved adipose aspirates. Dermatol Surg. 2010; 36(7):1078-83.

153. Lei L., Liao W., Sheng P., et al. Biological character of human adipose-derived adult stem cells and influence of donor age on cell replication in culture. Sci China C Life Sci. 2007; 50(3):320-8.

154. Leong D.T., Hutmacher D.W., Chew F.T., et al. Viability and adipogenic potential of human adipose tissue processed cell population obtained from pumpassisted and syringe-assisted liposuction. J Dermatol Sci. 2005; 37(3):169-76.

155. Liang L., Chinnathambi S., Stern M., et al. As epidermal stem cells age they do not substantially change their characteristics. J Investig Dermatol Symp Proc. 2004; 9(3):229-37.

156. Lim J.H., Lee Y.M., Chun Y.S., et al. Sirtuin 1 modulates cellular responses to hypoxia by deacetylating hypoxia-inducible factor 1 alpha. Mol Cell. 2010; 38(6): 864878.

157. Lin C. S., Xin Z. C., Deng C. H., et al. Defining adipose tissue-derived stem cells in tissue and in culture. Histol Histopathol. 2010; 25(6):807-15.

158. Lin K., Matsubara Y., Masuda Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived cells isolated with the Celution system. Cytotherapy. 2008; 10(4):417-26.

159. Lin T. M., Tsai J. L., Lin S. D., et al. Accelerated growth and prolonged lifespan of adipose tissue-derived human mesenchymal stem cells in a medium using reduced calcium and antioxidants. Stem Cells Dev. 2005; 14(1):92-102.

160. Lindroos B., Suuronen R., Miettinen S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Rev. 2011; 7(2):269-91.

161. Liu H., Fergusson M. M., Castilho R. M., et al. Augmented Wnt signaling in a mammalian model of accelerated aging. Science. 2007; 317(5839):803-6.

162. Liu Z., Sun L. Y. Complex roles of Sirtuin 1 in cancer and aging. Transl Res. 2011; 157(5):273-5.

163. Locke M., Feisst V., Dunbar P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 2011; 29(3):404-l 1.

164. Losordo D.W., Dimmeler S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 2004; 109: 2487-91.

165. Madonna R., De Caterina R. Adipose tissue: a new source for cardiovascular repair. J Cardiovasc Med (Hagerstown). 2010; ll(2):71-80.

166. Madonna R., De Caterina R. In vitro neovasculogenic potential of resident adipose tissue precursors. Am J Physiol Cell Physiol. 2008; 295(5):1271-80.

167. Madonna R., Geng Y.J., De Caterina R. Adipose tissue-derived stem cells: characterisation and potencial for cardiovascular repair. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2009; 29: 1723-1729.

168. Madonna R., Renna F. V., Cellini C., et al. Age-dependent impairment of number and angiogenic potential of adipose tissue-derived progenitor cells. Eur J Clin Invest. 2011; 41(2): 126-33.

169. Madonna R., Willerson J.T., Geng Y.J. Myocardin a enhances telomerase activities in adipose tissue mesenchymal cells and embryonic stem cells undergoing cardiovascular myogenic differentiation. Stem Cells. 2008; 26(1): 202-11.

170. Manalo D.J., Rowan A., Lavoie T., et al. Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by fflF-1. Blood. 2005; 105(2): 659-69*.

171. Mandriota S. J., Seghezzi G., Vassalli J. D., et al. Vascular endothelial growth factor increases urokinase receptor expression in vascular endothelial cells. J Biol Chem. 1995; 270(17):9709-16.

172. Mantel C., Broxmeyer H. E. Sirtuin 1, stem cells, aging, and stem cell aging. Curr Opin Hematol. 2008; 15(4):326-31.

173. Maumus M., Peyrafitte J. A., D'Angelo R., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology and phenotype. Int J Obes (Lond). 2011; in press.

174. Mauney J. R., Kaplan D. L., Volloch V. Matrix-mediated retention of osteogenic differentiation potential by human adult bone marrow stromal cells during ex vivo expansion. Biomaterials. 2004; 25(16):3233-43.

175. Mazar A. P., Henkin J., Goldfarb R. H. The urokinase plasminogen activator system in cancer: implications for tumor angiogenesis and metastasis. Angiogenesis. 1999; 3(1): 15-32.

176. Mazo M., Planat-Benard V., Abizanda G., et al. Transplantation of adipose derived stromal cells is associated with functional improvement in a rat model of chronic myocardial infarction. Eur J Heart Fail.2008;10(5):454-62.

177. Mcllhenny S. E., Hager E. S., Grabo D. J., et al. Linear shear conditioning improves vascular graft retention of adipose-derived stem cells by upregulation of the alpha5betal integrin. Tissue Eng Part A. 2010; 16(l):245-55.

178. Mcintosh K., Zvonic S., Garrett S., et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 2006; 24: 1246-53.

179. Melzer D., Frayling T. M., Murray A., et al. A common variant of the pl6(INK4a) genetic region is associated with physical function in older people. Mech Ageing Dev. 2007; 128(5-6):370-7.

180. Mendez-Ferrer S., Ellison G. M., Torella D., et al. Resident progenitors and bone marrow stem cells in myocardial renewal' and repair. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2006; 3(1): 83-9.

181. Miranville A., Heeschen C., Sengenes C., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 2004; 110(3):349-55.

182. Mischen B. T., Follmar K. E., Moyer K. E., et al. Metabolic and functional characterization of human adipose-derived stem cells in tissue engineering. Plast Reconstr Surg. 2008; 122(3):725-38.

183. Mitchell J. B., Mcintosh K., Zvonic S., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 2006; 24(2):376-85.

184. Miyahara Y., Nagaya N., Kataoka M., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 2006; 12(4):459-65.

185. Molofsky A.V., Slutsky S.G., Joseph N.M., et al. Increasing pl6INK4a expression decreases forebrain progenitors and neurogenesis during ageing. Nature. 2006; 443(7110):448-52.

186. Moon M.H., Kim S.Y., Kim Y.J., et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia. Cell Physiol Biochem. 2006; 17(5-6):279-90.

187. Morizono K., De Ugarte D.A., Zhu M., et al. Multilineage cells from adipose tissue as gene delivery vehicles. Hum Gene Ther. 2003; 14: 59-66.

188. Moses M. A. The regulation of neovascularization of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Stem Cells. 1997; 15(3):180-9.

189. Murohara T., Shintani S., Kondo K. Autologous adipose-derived regenerative cells for therapeutic angiogenesis. Curr Pharm Des. 2009; 15(24):2784-90.

190. Murphy J.M., Dixon K., Beck S., et al. Reduced chondrogenic and adipogenic activity of mesenchymal stem cells from patients with advanced osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2002; 46(3):704-13.

191. Nakagami H., Maeda K., Morishita R., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005; 25(12):2542-7.

192. Nakagami H., Morishita R., Maeda K., et al. Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy. J Atheroscler Thromb. 2006; 13(2):77-81.

193. Naldini L., Tamagnone L., Vigna E., et al. Extracellular proteolytic cleavage by urokinase is required for activation of hepatocyte growth factor/scatter factor. EMBO J. 1992; ll(13):4825-33.

194. Ng L. W., Yip S. K., Wong H. K., et al. Adipose-derived stem cells from pregnant women show higher proliferation rate unrelated to estrogen. Hum Reprod. 2009; 24(5): 1164-70.

195. Nie C., Yang D., Xu J., et al. Locally Administered Adipose-derived Stem Cells Accelerate Wound Healing through Differentiation and Vasculogenesis. Cell Transplant. 2010; in press.

196. Nombela-Arrieta C., Ritz J., Silberstein L.E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat Rev Mol Cell Biol*. 2011; 12(2):126-31.

197. Oedayrajsingh-Varma M. J., van Ham S. M., Knippenberg M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 2006; 8(2): 166-77.

198. Ohnishi S., Yasuda T., Kitamura S., Nagaya N. Effect of hypoxia on gene expression of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and mononuclear cells. Stem cells. 2007; 25: 1166-1177.

199. O'Reilly M.S., Boehm T., Shing Y., et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell. 1997, 88(2):277-285.

200. O'Reilly M. S., Holmgren L., Shing Y., et al. Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell. 1994; 79(2):315-28.

201. Otrock Z. K., Mahfouz R. A., Makarem J. A., et al. Understanding the biology of angiogenesis: review of the most important molecular mechanisms. Blood Cells Mol Dis. 2007; 39(2):212-20.

202. Padoin A. V., Braga-Silva J., Martins P., et al. Sources of processed lipoaspirate cells: influence of donor site on cell concentration. Plast Reconstr Surg. 2008; 122(2):614-8.

203. Parfyonova Y. V., Plekhanova O. S., Tkachuk V. A. Plasminogen activators in vascular remodeling and angiogenesis. Biochemistry (Mosc).2002;67(l):l 19-34.

204. Park E., Patel A.N. Changes in the expression pattern of mesenchymal and pluripotent markers in human adipose-derived stem cells. Cell Biol Int. 2010; in press.

205. Pepper M. S. Extracellular proteolysis and angiogenesis. Thromb Haemost. 2001; 86(l):346-55.

206. Peroni D., Scambi I., Pasini A., et al. Stem molecular signature of adipose-derived stromal cells. Exp Cell Res. 2008; 314(3):603-15.

207. Planat-Benard V., Menard C., Andre M., et al. Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells. Circ Res. 2004; 94(2):223-9.

208. Planat-Benard V., Silvestre J. S., Cousin B., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 2004; 109(5):656-63.

209. Plouet J., Moro F., Bertagnolli S., et al. Extracellular, cleavage of the vascular endothelial growth factor 189-amino acid form by urokinase is required, for its mitogenic effect. J Biol Chem. 1997; 272(20):13390-6.

210. Pompilio G., Ambrosio G., Briguori C., et al. Clinical studies of cardiac cell therapy in Italy. G Ital Cardiol (Rome). 2007; 8(9):586-91.

211. Potier E., Ferreira E., Andriamanalijaona R., et al. Hypoxia affects mesenchymal stromal cell osteogenic differentiation and angiogenic factor expression. Bone. 2007; 40:1078-1087.

212. Pu L.L. Discussion: Sources of processed lipoaspirate cells: influence of donor site on cell concentration. Plast Reconstr Surg. 2008; 122(2): 619-20.

213. Pu L.L., Cui X., Fink B.F., et al. Adipose aspirates as a source for human processed lipoaspirate cells after optimal cryopreservation. Plast Reconstr Surg. 2006; 117(6):1845-50.

214. Puissant B., Barreau C., Bourin P., et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 2005; 129(1):118-29.

215. Rada T., Reis R.L., Gomes M.E. Novel method for the isolation of adipose stem cells (ASCs). J Tissue Eng Regen Med. 2009; 3(2): 158-9.

216. Raffetto J.D., Khalil R.A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease. Biochem Pharmacol.2008;75(2):346-59.

217. Raghu H., Lakka S. S., Gondi C. S., et al. Suppression of uPA and uPAR attenuates angiogenin mediated angiogenesis in endothelial and glioblastoma cell lines. PLoS One. 2010; 5(8):el2458.

218. Rando T.A. Stem cells, ageing and the quest for immortality. Nature. 2006; 441(7097):1080-6.

219. Rangappa S., Fen C., Lee E. H., et al. Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes. Ann Thorac Surg. 2003; 75(3):775-9.

220. Rasmussen J. G., Frobert O., Pilgaard L., et al. Prolonged hypoxic culture and trypsinization increase the pro-angiogenic potential of human adipose tissue-derived stem cells. Cytotherapy. 2010; in press.

221. Rehman J., Traktuev D., Li J., et al. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation. 2004; 109(10):1292-8.

222. Reiss Y. Angiopoietins. Recent Results Cancer Res. 2010; 180: 3-13.

223. Rissanen T.T., Yla-Herttuala S. Current status of cardiovascular gene therapy. MolTher. 2007; 15(7):1233-47.

224. Rivard A., Berthou-Soulie L., Principe N., et al. Age-dependent defect in vascular endothelial growth factor expression is associated with reduced hypoxia-inducible factor 1 activity. J Biol Chem. 2000; 275: 29643-7.

225. Rodriguez K.A., Gaczynska M., Osmulski P.A. Molecular mechanisms of proteasome plasticity in aging. Mech Ageing Dev. 2010; 131(2):144-55.

226. Rubin J.P., DeFail A., Rajendran N., Marra K.G. Encapsulation of adipogenic factors to promote differentiation of adipose-derived stem cells. J Drug Target. 2009; 17: 207-215.

227. Rubina K., Kalinina N., Efimenko A., et al. Adipose stromal cells stimulate angiogenesis via promoting progenitor cell differentiation, secretion of angiogenic factors, and enhancing vessel maturation. Tissue Eng Part A. 2009; 15(8):2039-50.

228. Rundhaug J. E. Matrix metalloproteinases and angiogenesis. J Cell Mol Med. 2005; 9(2):267-85.

229. Sadat S., Gehmert S., Song Y. H., et al. The cardioprotective effect of mesenchymal stem cells is mediated by IGF-I and VEGF. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 363(3):674-9.

230. Sadoun E., Reed M. J. Impaired angiogenesis in aging is associated with alterations in vessel density, matrix composition, inflammatory response, and growth factor expression. J Histochem Cytochem. 2003; 51(9): 1119-30.

231. Safford K. M., Safford S. D., Gimble J. M., et al. Characterization of neuronal/glial differentiation of murine adipose-derived adult stromal cells. Exp Neurol. 2004; 187(2):319-28.

232. Sahin E., Depinho R. A. Linking functional decline of telomeres, mitochondria and stem cells during ageing. Nature. 2010; 464(7288):520-8.

233. Sarin K. Y., Cheung P., Gilison D., et al. Conditional telomerase induction causes proliferation of hair follicle stem cells. Nature. 2005; 436(7053): 1048-52.

234. Sasaki T., Fukai N., Mann K., et al. Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998; 17(15):4249-56.

235. Savitsky K., Bar-Shira A., Gilad S., et al. A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase. Science. 1995; 268(5218):1749-53.

236. Schenke-Layland K., Strem B. M., Jordan M. C., et al. Adipose tissue-derived cells improve cardiac function following myocardial infarction. J Surg Res. 2009; 153(2):217-23.

237. Scheubel R. J., Zorn H., Silber R. E., et al. Age-dependent depression in circulating endothelial progenitor cells in patients undergoing coronary artery bypass grafting. J Am Coll Cardiol. 2003; 42(12):2073-80.

238. Schipper B. M., Marra K. G., Zhang W., et al. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 2008; 60(5):538-44.

239. Schreml S., Babilas P., Fruth S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 2009; ll(7):947-57.

240. Semenza G.L. Oxygen homeostasis. WIREs Syst Biol Med. 2010; 2:336-61.

241. Semenza G.L. Vasculogenesis, Angiogenesis, and Arteriogenesis: Mechanisms of Blood Vessel Formation and Remodeling. J Cell Biochem. 2007; 102: 840-847.

242. Serrano R., Barrenetxe J., Orbe J., et al. Tissue-specific PAI-1 gene expression and glycosylation pattern in insulin-resistant old rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2009; 297(5):R1563-9.

243. Sethe S., Scutt A., Stolzing A. Aging of mesenchymal stem cells. Ageing Res Rev. 2006; 5(1):91-116.

244. Sharpless N. E., DePinho R. A. How stem cells age and why this makes us grow old. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007; 8(9):703-13.

245. Shi Y. Y., Nacamuli R. P., Salim A., et al. The osteogenic potential of adipose-derived mesenchymal cells is maintained with aging. Plast Reconstr Surg. 2005; 116(6):1686-96.

246. Shibuya M. Vascular endothelial growth factor-dependent and -independent regulation of angiogenesis. BMB Rep. 2008; 41(4):278-86.

247. Shui C., Scutt A. Mild heat shock induces proliferation, alkaline phosphatase activity, and mineralization in human bone marrow stromal cells and Mg-63 cells in vitro. J Bone Miner Res. 2001; 16(4):731-41.

248. Shyu K. G., Chang H., Isner J. M. Synergistic effect of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor on neoangiogenesis in hypercholesterolemic rabbit model with acute hindlimb ischemia. Life Sci. 2003; 73(5):563-79.

249. Siebert J., Reiwer-Gostomska M., Babinska Z., et al. Low serum angiogenin concentrations in patients with type 2 diabetes. Diabetes Care.2007;30(12):3086-7.

250. Simmons P.J., Torok-Storb B. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1. Blood. 1991; 78(l):55-62.

251. Six I., Kureishi Y., Luo Z., et al. Akt signaling mediates VEGF/VPF vascular permeability in vivo. FEBS Lett. 2002; 532(l-2):67-9.

252. Son E. D., Kim H., Choi H., et al. Cathepsin G increases MMP expression in normal human fibroblasts through fibronectin fragmentation, and induces the conversion of proMMP-1 to active MMP-1. J Dermatol Sci. 2009; 53(2): 150-2.

253. Song H., Kwon K., Lim S., et al. Transfection of mesenchymal stem cells with the FGF-2 gene improves their survival under hypoxic conditions. Mol Cells. 2005; 19(3):402-7.

254. Song Y. H., Gehmert S., Sadat S., et al. VEGF is critical for spontaneous differentiation of stem cells into cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 354(4):999-1003.

255. Sottile J. Regulation of angiogenesis by extracellular matrix. Biochim Biophys Acta. 2004; 1654:13-22.

256. Stefansson S., Petitclerc E., Wong M. K., et al. Inhibition of angiogenesis in vivo by plasminogen activator inhibitor-1. J Biol Chem. 2001; 276(11):8135-41.

257. Stein I., Itin A., Einat P., et al. Translation of vascular endothelial growth factor mRNA by internal ribosome entry: implications for translation under hypoxia. Mol Cell Biol. 1998; 18(6):3112-9.

258. Stern M. M., Bickenbach J. R. Epidermal stem cells are resistant to cellular aging. Aging Cell. 2007; 6(4):439-52.

259. Stolzing A., Jones E., McGonagle D., et al. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mech Ageing Dev. 2008; 129(3):163-73.

260. Strem B.M., Hicok K.C., Zhu M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J. Med. 2005; 54: 132-141.

261. Sudhoff T., Sohngen D. Circulating endothelial adhesion molecules (sE-selectin, sVCAM-1 and sICAM-1) during rHuG-CSF-stimulated stem cell mobilization. J Hematother Stem Cell Res. 2002; 11(1): 147-51.

262. Suga H., Matsumoto D., Eto H., et al. Functional implications of CD34 expression in human adipose-derived stem/progenitor cells., Stem Cells Dev. 2009; 18(8): 1201-10.

263. Sumi M., Sata M., Toya N., et al. Transplantation of adipose stromal cells, but not mature adipocytes, augments ischemia-induced angiogenesis. Life Sei. 2007; 80(6):559-65.

264. Sun L., Cui M., Wang Z., et al. Mesenchymal stem cells modified with angiopoietin-1 improve remodeling in a rat model of acute myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 357(3): 779-784.

265. Sun Y., Li W., Lu Z., et al. Rescuing replication and osteogenesis of aged mesenchymal stem cells by exposure to a young extracellular matrix. FASEB J. 2011; 25(5):1474-85.

266. Takahashi M., Izawa A., Ishigatsubo Y., et al. Therapeutic neovascularization by implantation of autologous mononuclear cells for patients with connective tissue diseases. Curr Pharm Des. 2009; 15(24): 2778-2783.

267. Tello-Montoliu A., Marin F., Patel J., et al. Plasma angiogenin levels in acute coronary syndromes: implications for prognosis. Eur Heart J. 2007; 28(24):3006-l 1.

268. Thangarajah H., Vial I. N., Chang E., et al. IF ATS collection: Adipose stromal cells adopt a proangiogenic phenotype under the influence of hypoxia. Stem Cells. 2009; 27(l):266-74.

269. Timper K., Seboek D., Eberhardt M., et al. Fluman adipose tissue-derived mesenchymal stem cells differentiate into insulin, somatostatin, and glucagon expressing cells. Biochem Biophys Res Commun. 2006; 341(4):1135-40.

270. Tirziu D., Simons M. Angiogenesis in the human heart: gene and cell therapy. Angiogenesis. 2005; 8(3):241-51.

271. Tkachuk V., Stepanova V., Little P. J., et al. Regulation and role of urokinase plasminogen activator in vascular remodelling. Clin Exp Pharmacol Physiol. 1996; 23(9):759-65.

272. Tomita S., Ueno M., Sakamoto M., et al. Defective brain development in mice lacking the Hif-lalpha gene in neural cells. Mol Cell Biol. 2003; 23(19):6739-49.

273. Toyoda M., Matsubara Y., Lin K., et al. Characterization and comparison of adipose tissue-derived cells from human subcutaneous and omental adipose tissues. Cell Biochem Funct. 2009; 27(7):440-7.

274. Traktuev D. O., Tsokolaeva Z. I., Shevelev A. A., et al. Urokinase gene transfer augments angiogenesis in ischemic skeletal and myocardial muscle. Mol Ther. 2007; 15(ll):1939-46.

275. Ugwu F., Van Hoef B., Bini A., et al. Proteolytic cleavage of urokinase-type plasminogen activator by stromelysin-1 (MMP-3). Biochemistry. 1998; 37(20):7231-6.

276. Vasa M., Fichtischerer S., Adler K., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 2001; 103(24):2885-90.

277. Vieira N. M., Brandalise V., Zucconi E., et al. Isolation, charactcrization, and differentiation potential of canine adipose-derived stem cells. Cell Transplant. 2010; 19(3):279-89.

278. Wang C., Jurk D., Maddick M., et al. DNA damage response and cellular senescence in tissues of aging mice. Aging Cell. 2009; 8(3):311-23.

279. Wang M., Monticone R. E., Lakatta E. G. Arterial aging: a journey into subclinical arterial disease. Curr Opin Nephrol Ilypertens. 2010; 19(2):201-7.

280. Wang M., Zhang J., Spinetti G., et al. Angiotensin II activates matrix metalloproteinase type II and mimics age-associated carotid arterial remodeling in young rats. Am J Pathol. 2005; 167(5): 1429-42.

281. Wang M., Zhao D., Spinetti G., et al. Matrix metalloproteinase 2 activation of transforming growth factor-betal (TGF-betal) and TGF-beta 1-type II receptor signaling within the aged arterial wall. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2006; 26(7):1503-9.

282. Wang X., Kua H. Y., Hu Y., et al. p53 functions as a negative regulator of osteoblastogenesis, osteoblast-dependent osteoclastogenesis, and bone remodeling. J Cell Biol. 2006; 172(1):115-25.

283. Waterstrat A., Van Zant G. Effects of aging on hematopoietic stem and progenitor cells. Curr Opin Immunol. 2009; 21(4):408-13.

284. Wilson A., Butler P. E., Seifalian A. M. Adipose-derived stem cells for clinical applications: a review. Cell Prolif. 2011; 44(l):86-98.

285. Wilson A., Shehadeh L. A., Yu H., et al. Age-related molecular genetic changes of murine bone marrow mesenchymal stem cells. BMC Genomics. 2010; 11: 223-229.

286. Wykrzykowska J.J., Bianchi C., Sellke F.W. Impact of aging on the angiogenic potential of the myocardium: implications for angiogenic therapies with emphasis on sirtuin agonists. Rec Pat Cardiovasc Drug Discov. 2009; 4(2): 119-32.

287. Xiang G., Schuster M. D., Seki T., et al. Down-regulation of plasminogen activator inhibitor 1 expression promotes myocardial neovascularization by bone marrow progenitors. J Exp Med. 2004; 200(12):1657-66.

288. Yamada T., Akamatsu H., Hasegawa S., et al. Age-related changes of p75 neurotrophin receptor-positive adipose-derived stem cells. J Dermatol Sci. 2010; 58(l):36-42.

289. Yu G., Floyd Z. E., Wu X., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from lipoaspirates. Methods Mol Biol. 2011; 702: 17-27.

290. Zachary I., Morgan R. D. Therapeutic angiogenesis for cardiovascular disease: biological context, challenges, prospects. Heart. 2011; 97(3):181-9.

291. Zannettino A. C., Paton S., Arthur A., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 2008;214:413-21.

292. Zhang D. Z., Gai L. Y., Liu H. W., et al. Transplantation of autologous adipose-derived stem cells ameliorates cardiac function in rabbits with myocardial infarction. Chin Med J (Engl). 2007; 120(4):300-7.

293. Zhang H., Gao X., Weng C., et al. Interaction between angiogenin and fibulin 1: evidence and implication. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2008; 40(5):375-80.

294. Zhang P., Moudgill N., Hager E., et al. Endothelial Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Elderly Patients with Cardiovascular Disease. Stem Cells Dev. 2010; in press.

295. Zhu M., Kohan E., Bradley J., et al. The effect of age on osteogenic, adipogenic and proliferative potential of female adipose-derived stem cells. J Tissue Eng Regen Med. 2009; 3(4):290-301.

296. Zhu X. Y., Zhang X. Z., Xu L., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells overexpressing hHGF into cardiac tissue. Biochem Biophys Res Commun. 2009; 379(4):1084-90.

297. Zuk P. A., Zhu M., Mizuno H., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001; 7(2):211-28.

Информация о работе

Ефименко, Анастасия Юрьевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2011
ВАК 03.00.04

Диссертация

Влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы