Реорганизация актинового цитоскелета, лежащая в основе движения клеток.

Александрова, Антонина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Реорганизация актинового цитоскелета, лежащая в основе движения клеток.
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Реорганизация актинового цитоскелета, лежащая в основе движения клеток."

АЛЕКСАНДРОВА Антонина Юрьевна

РЕОРГАНИЗАЦИЯ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА, ЛЕЖАЩАЯ В ОСНОВЕ ДВИЖЕНИЯ КЛЕТОК

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2011

005010631

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н.Н. Блохина РАМН,

Отделе математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова

Научный консультант: член-корр. РАН, доктор медицинских

наук, профессор Ю.М. Васильев

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

Смирнова Елена Александровна, Кафедра клеточной биологии и гистологии Биологического ф-таМГУ им. М.В. Ломоносова

Доктор биологических наук, профессор Ширинский Владимир Павлович . НИИ экспериментальной кардиологии

Российского кардиологического научного комплекса Росздрава

Доктор биологических наук, профессор Надеждина Елена Сергеевна Институт белка РАН

Ведущая организация: Институт цитологии РАН

Зашита состоится «21» февраля 2012 г. В 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В .Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_____»___________________2011г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета ,

Кандидат биологических наук —ч Е.Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ.

Актуальность проблемы

При различных патологиях нарушается характер движения клеток. В частности в процессе развития злокачественных опухолей клетки приобретают способность проникать в соседние ткани и органы (инвазировать) или могут образовывать отдаленные очаги роста - метастазы. Способность клеток опухоли к инвазии и метастазированию является одной из основных причин смертности людей, страдающих от онкологических заболеваний. В процессе опухолевой прогрессии клетки претерпевают существенные морфологические изменения, что и приводит к приобретению ими несвойственных ранее способностей и изменению характера движения. В частности эпителиальные клетки при развитии опухоли претерпевают так называемый эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) при котором нарушаются межклеточные контакты, клетки приобретают фибробластоподобную форму, могут двигаться поодиночке. При этом существенно возрастает возможность их индивидуальной миграции и они могут инвазировать в близлежащие органы. В последнее время был так же описан так называемый мезенхимапьно - амебоидный переход (МАП), в результате которого клетки начинают двигаться на амебоидный манер, напоминающий движение лимфоцитов. При этом резко увеличивается скорость движения индивидуальных клеток в Зх-мерном матриксе и практически пропадает зависимость движения клеток от контактов с субстратом или активности ферментов, растворяющих матрикс - матриксных металлопротеаз (ММП). Картина усложняется тем, что при определенных условиях клетки могут возвращаться к прежнему способу миграции, что очень затрудняет попытки найти способы регуляции движения и ингибирования инвазии опухолевых клеток. Это свойство опухолевых клеток было описано несколько лет назад и называется пластичность опухолевых клеток (Wolf et al., 2003). Поэтому чрезвычайно важно знать, какие механизмы отвечают за тот или иной способ миграции и что регулирует движение клеток.

Давно показано, что в основе движения клеток лежат перестройк! цитоскелета, в частности актинового цитоскелета. Выделяют несколько основны этапов движения - образование протрузий на ведущем краю клетки, закрепленн этих протрузий с помощью адгезионных структур, подтягивание и перенос тел* клетки за счет акто-миозинового сокращения. Известно, что основной механизи формирования актиновых филаментов - это полимеризация сети на краю клетки Однако оставалось неясным, каким образом густая равномерная сеть актине перестраивается в пучки микрофиламентов, способные к сокращению. Так же бы неизвестен вклад каждой из составляющих клеточного движения - образовани протрузии и акто-миозинового сокращения в эффективность клеточной миграции.

В последнее время был сделан огромный методологический скачок появились новые методы микроскопии - фазово-контрастная микроскопия компьютерным усилением, конфокальная микроскопия, электронная томография открывающие новые возможности в исследовании клеточных структур. < помощью трансфекции белков, меченных флуорохромами, появилаа возможность наблюдать за динамикой и активацией индивидуальных белков пр> движении живых клеток. В связи с этим представляется актуальным применением этих новых методов исследовать динамику формирования 1 реорганизации цитоскелета при движении нормальных клеток, чтобы понимать какие механизмы лежат в основе клеточного движения.

Как уже отмечалось выше, при прогрессии опухолей резко меняете морфология и характер движения клеток. Различия в строении актиновог цитоскелета у нормальных и трансформированных клеток были описаны ранее Общепринят факт, что опухолевые клетки отличаются от нормальных отсутствие! крупных пучков микрофиламентов - стресс-фибрилл и крупных зрелы фокальных контактов. Для трансформированных клеток характерно или полно отсутствие пучков микрофиламентов, или остаточные актиновые пучки и наличи мелких точечных фокальных комплексов. Но вопрос о том, как и почем указанные изменения приводят к возникновению у опухолевых клето способностей к инвазии в соседние ткани, остается открытым.

Цели настоящей работы.

Исходя из сказанного выше, в настоящей работе были поставлены дв основные цели: -

1. Исследовать перестройки актинового цитоскелета, лежащие в основе движения нормальных клеток, проанализировать вклад разных составляющих -полимеризации актиновой сети и акто-миозиновой сократимости - для обеспечения эффективного клеточного движения, выяснить роль образования адгезионных структур в реорганизации актинового цитоскелета.

2. Исследовать изменения морфологии клеток и цитоскелета, возникающие при опухолевой трансформации и приводящие к изменению характера клеточного движения и приобретению клетками инвазивного фенотипа.

Задачи исследования:

1. Используя в качестве активаторов клеточного движения скэттер-фактор (НвР/8Р) (для эпителиальных клеток) и опухолевый промотор форболовый эфир РМА (для фибробластов) исследовать изменения морфологии клеток и цитоскелета при инициации движения, определить роль системы микротрубочек и транспорта внутриклеточных частиц в миграции клеток.

2. С помощью специфических ингибиторов, исследовать роль основных составляющих клеточного движения - формирования протрузий на ведущем крае и актин-миозинового сокращения для эффективного движения клеток.

3. С применении современных микроскопических техник (видеомикроскопии живых клеток, метода компьютерно-усиленного фазового контраста, видеонаблюдения за меченными белками, инъецированными в клетку и т.д.) исследовать структуру и динамику ведущего края клетки при движении.

4. С помощью коррелятивной видео и электронной микроскопии и с применением электронной томографии исследовать ультраструктуру и динамику актинового цитоскелета и адгезионных структур на ведущем крае при движении клеток. Исследовать на белковом уровне динамику формирования адгезионных структур с субстратом и предложить модель реорганизации актинового цитоскелета при движении клеток.

5. Исследовать роль второй составляющей - акто-миозинового сокращения для движения клеток с помощью высокоспецифичных ингибиторов акто-миозинового сокращения. Для этого исследовать динамику движения клеток, регуляцию направленности движения и формирование клеточного монослоя в условиях ингибирования сократительной активности.

6. Исследовать изменения характера движения клеток, вызванного неопластической трансформацией с помощью нескольких альтернативных методов и проанализировать, какие именно морфологические изменения существенны для приобретения клетками инвазивного поведения.

7. Исследовать ультраструктуру актинового цитоскелета фибробластов с разной степенью трансформации и выявить нарушения строения цитоскелета определяющие проявление инвазивного фенотипа.

8. Для выяснения механизмов изменения клеточной морфологии при трансформации проанализировать влияние экспрессии онкогенов (N-1^) на

морфологию фибробластов. Исследовать изменения морфологии и

цитоскелета фибробластов под влиянием активных кислородных радикало

(ЯОБ).

Научная новизна и практическая ценность.

Исследованию подвижности клеток и механизмам, определяющим эт> подвижность, уделяется огромный интерес в мире. Благодаря бурном) техническому развитию микроскопии в последнее время появилось много новы методов и подходов, позволяющих изучать движение индивидуальных клеток. ] настоящей работе было использовано уникальное сочетание современных методо - видеомикроскопию, метод компьютерно-усиленного фазового контраста, ТЖ (тотальную интерференционно-отражательную микроскопию), конфокапьну! микроскопию. Для осуществления коррелятивной электронной V видеомикроскопии был разработан метод, позволяющий, сочетать видеосъемю живых клеток с последующим изучением на электронномикроскопическом уровн клеточных структур с известной жизненной историей. Впервые в сочетании корреляционной электронной микроскопией был применен метод ЭЛеКТрОННО|‘ томографии, позволяющей с высоким разрешением исследовать Зх-мерно строение адгезионных структур построить модели реорганизации цитоскелета н> разных стадиях формирования ФА. Полученные модели прояснили механизмь формирования адгезионных структур и перестройки цитоскелета при движени! клеток. Проведенные исследования продемонстрировали важнейшую рол формирования новых адгезионных структур в процессе реорганизации актиновог цитоскелета во время клеточного движения.

Исследование динамики трансфицированных в клетку белков - компоненто фокальных адгезий позволило внести существенный вклад в современно представление о строении и динамике адгезионных структур. Впервые в мир была выделена стадия инициальных фокальных адгезий, как начальная стади формирования адгезионных структур. Ранее эта стадия не была описан исследователями из-за методических трудностей, и только использование таког широкого набора белков-маркеров и последующее исследование структуры помощью коррелятивной электронной микроскопии позволило выделить этот эта формирования ФА. Впервые была показана роль белка УЛБР, как организатор сборки фокальных адгезий. Трансфекция клеток белками, меченным флуорохромами, позволила наблюдать перестройки актинового цитоскелета пр движении клеток, дало возможность выяснить механизмы, регулирующие динамику цитоскелета. Были исследованы две зоны, образующиеся на активном ведущем краю - ламеллиподия и ламелла. Впервые в мире было показано, что основным процессом, определяющим быстрый ретроградный ток в ламеллиподии,

является полимеризация актина, тогда как медленный ретроградный ток в ламеллиподии обеспечивается акто-миозиновым сокращением. Впервые в мире было показано, что формирование адгезионных структур de novo происходит в зоне ламеллиподии и при дальнейших перестройках именно позиция этих структур определяет положение границы между ламеллиподией и ламеллой. Эти исследования вносят весомый вклад в понимание процессов перестройки цитоскелета, лежащие в основе клеточного движения.

Изменение характера клеточного движения приводит к проявлению таких свойств опухолевых клеток, как способность к инвазии. Важность исследования механизмов, приводящих к подобным изменениям, сомнению не подлежит. В работе была сделана комплексная оценка изменений, вызываемых неопластической трансформацией, с применением большого набора различных методов (иммуноморфологии, электронной микроскопии, видеомикроскопии живых клеток, разнообразных тестов на эффективность миграции, биохимических исследований регуляции подвижности) на нескольких клеточных системах, включающих в себя контрольные (нетрансформированные) фибробласты и те же клетки с разной степенью трансформации, полученные в результате трансформации разными агентами.

Впервые проведен сравнительный компьютерный анализ динамики активного края нормальных и трансформированных клеток и в результате показано, что характерным признаком трансформации фибробластов является значительное перераспределение псевдоподиальной активности. У трансформированных клеток существенно возрастает доля активного клеточного края и соответственно уменьшается стабильный край. При трансформации клеток изменяется не только распределение, но и характер псевдоподиальной активности: протрузии на переднем крае становятся более мелкими, а частота их образования и частота образования раффлов значительно возрастает. Эти изменения коррелируют с изменениями строения актиновой сети в ламеллиподии, а также с отсутствием полноценных контактов клетки с субстратом. С помощью метода платиновых реплик (электронная микроскопия) выявлена ультраструктурная основа такого перераспределения: нарушение регулярности актиновой сети, появление большого количества «дыр» в подмембранном слое актина на ведущем краю клетки и разрушение краевого актинового пучка, в норме стабилизирующего боковые края клеток. В результате исследования клеточных линий, находящихся на разных стадия опухолевой трансформации, показано, что по мере нарастания таких признаков трансформации, как изменение ультраструктуры цитоскелета и перераспределения активности ведущего края, изменяется характер миграции клеток. Движение одиночных трансформированных клеток носит менее направленный характер и скорость их миграции падает, в основном в результате отсутствия поляризации активности на ведущем крае. Одновременно появляется

и/и ли усиливается способность к трехмерной миграции через поры камеры Бойдена и способность к инвазии. Проведенная работа дает основание предположить, что именно перераспределение псевдоподиальной активности, вызванное изменениями структуры актинового цитоскелета, в результате которого, трансформированные клетки легко меняют направление движения, является определяющим в проявлении способности опухолевых клеток к инвазии.

Впервые показано, что, по крайней мере одним из механизмов, лежащих в основе изменения морфологии и подвижности клеток является накопление активных кислородных радикалов (ЯОБ) под действием гиперэкспрессии онкоген,: Ы-Лаз, и одним из путей возвращения нормального фенотипа может быть обработка клеток антиоксидантами (в нашем случае М-ацетил цистеином).

Полученные результаты имеют не только теоретическое, но и важное научнопрактическое значение, так как показывают новые подходы к нормализации морфологии и движения опухолевых клеток и открывают новые направления исследований в области клеточной биологии и антиопухолевой терапии.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Наиболее важным этапом, определяющим движение клеток, является формирование активного ведущего края. Акто-миозиновая сократимост существенна для упорядочивания движения и правильного формирования клеточных слоев.

2. Две зоны ведущего клеточного края - ламеллиподия и ламелла- отличаются по структуре, динамическим характеристикам и по механизмам, обеспечивающим динамику актиновой сети. Положение границы ламеллиподия-ламелла и дальнейшая реорганизация актинового цитоскелета при движении клеток определяется образованием ФА.

3. Образование ФА начинается в ламеллиподии с формирования инициальной фокальной адгезии. Белком-организатором сборки ФА является УЛБР, который первым появляется в точке ФА. Инициальные ФА являются необходимой стадией формирования ФА, хотя еще не сопряжены с выраженной структурной организацией актиновой сети.

4. Характерным признаком неопластической трансформации фибробластов является перераспределение краевой активности. При этом существенно увеличивается доля активного и, соответственно, сокращается доля стабильного края, а также изменяется характер псевдоподиальной активности на ведущем крае клетки. Эти признаки нарастают по мере нарастания степени трансформации клеток.

5. Изменение характера и распределения краевой активности у трансформированных клеток связано с нарушениями структуры

цитоскелета, видимыми при электронно-микроскопических исследованиях. Это приводит к изменению характера клеточной миграции и появлению у опухолевых клеток способностей к инвазии.

6. По крайней мере одним из молекулярных механизмов, лежащих в основе указанных изменений цитоскелета в результате трансформации является возрастание уровня реактивных кислородных радикалов (ROS) в результате оверэкспрессии онкогена N-Ras. Обработка таких клеток антиоксидантом NAC (N-ацетил цистеином) приводит к нормализации фенотипа и подвижности клеток.

Конкретное участие автора заключалось в планировании исследования, разработке методологии, выборе моделей, составлении программы. Проведение экспериментов, получение научных результатов, анализ этих результатов, формулировка научных положений и выводов проводились диссертантом самостоятельно.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на Международном симпозиуме „Биологическая подвижность,, Пущино, 1994; The Cytoskeletal and Cell Function Meeting, Cold Spring Harbor, NY, 1995; International Congress"Cyto-skeleton and Cancer", Les Embiez(Var), France, 1995; конференции «Цитокелет и клето чная регуляция». Пущино, 11-12 мая, 2000 года; 17'1’ European Cytoskeleton Forum, Nyon-Geneva, Switzerland ,2002; FEBS special Meeting on Cytoskeletal Dynamics; From Cell Biology to Development and Disease, 2004, Helsinki, Finland ; Adhesion meeting 2005. Podosomes-invalopodia-focal adhesions. Munich, Germany; Advanced workshop on Integrated approaches in Cytoskeleton Research, 2005, Luxembourg ; 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения 2008», С.-Петербург, 2008; XII Российском онкологическом конгрессе, Москва, 2008 г.; на школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток», С-Петербург, 2008 г.; The American Society for Cell Biology, 49th Annua! Meeting, San Diego, CA,2009 and 50th Annual Meeting, Philadelphia, PA, 2010; 13 международной пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", 2009; of International symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies", Pushchino, 2010.

Первичная экспертиза диссертации произведена на совместной научной конференции лабораторий механизмов канцерогенеза, иммунохимии опухолей, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ канцерогенеза РОНЦ им.

Н.Н. Блохина РАМН и лаборатории математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова в НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 12 мая 2011 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 47 печатных работ: 13 журнальных статей (из которых 8 в зарубежных журналах), одна статья в специализированном сборнике, а так же тезисы докладов в материалах Российских и международных конференций.

Объем п структура диссертации

Диссертация изложена на 297 страницах машинописного текста и состоит из Введения, Обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание Материалов и Методов исследования, Результатов исследования, состоящих из двух частей: «Исследование реорганизации цитоскелета, лежащей в основе движения нормальных клеток» и «Исследование изменений, возникающих в результате трансформации», Обсуждения полученных результатов, Выводов и Списка литературы. Работа иллюстрирована 87 рисунками и 29 таблицами. Библиография включает 393 публикаций.

Работа выполнена в отделе математических методов в биологии, Научноисследовательском институте им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова; в лаборатории механизмов канцерогенеза, Института канцерогенеза Российского Онкологического научного Центра им. Н.Н. Блохина; ряд экспериментов проводили в Политехнической школе г. Лозанны, Швейцария, совместно с А.В. Верховским, и в институте молекулярной биотехнологии г. Вена, Австрия, совместно с группой проф. Д.В. Смолла.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Клеточные культуры.

Подбору клеточных линий для наших исследований мы уделяли особое внимание. В работе было использовано 16 различных клеточных линий эпителиальных клеток и фибробластов мыши, крысы, собаки и человека. Культивирование клеток проводилось при обычных условиях - 37°С и 5% С02.

Методы световой микроскопии, использованные в работе:

Фазовый контраст с компьютерным усилением. Фазовоконтрастная микроскопия с компьютерным усилением была предложена и описана ранее А. Верховским (Verkhovsky et al., 2003). Метод основан на том, что после компьютерного вычитания фона из фазово-контрастного изображения, получаемого с видеокамеры, можно повысить контрастность видеокадров и в результате существенно улучшить качество итогового изображения.

Флуоресцентная микроскопия. Для флуоресцентного окрашивания актиновых филаментов, фокальных контактов, миозина II, ДНК и р34 субъединицы Агр2/3-комплекса применяли фиксацию параформальдегидом (PFA). Покровные стекла, предварительно промытые теплой средой без сыворотки, фиксировали теплым 3,7% раствором PFA на бессывороточной среде DMEM 15 минут. Затем отмывали фосфатным буфером (PBS) 3 раза по 5 минут и обрабатывали 0,1% раствором Triton Х100, разведенным на PBS, в течение 3 минут, после снова проводили отмывку PBS три раза по 5 минут. Для окрашивания микротрубочек применялась фиксация клеток холодным метанолом в (*20°С) в течение 20 минут. В работе были использованы следующие антитела и красители: hVIN-1 (Sigma, США); anti-zyxin 164D (Transduction Lab); anti-myosin (non-muscle) BT561 (Biomedical Technologies Inc); anti-p34-Arc/ARPC2 (Upstate, США) DM1A (Sigma, США); TRITC-anti-rabbit IgG (H+L) (Jackson Immuno Research); TRITC-goat-anti-mouse (Sigma, США); Alexa 488 goat anti-mouse, Alexa 488 goat anti-rabbit, Alexa Fluor 488 phalloidin (Molecular Probes); DAPI (Sigma, США). При окрашивании антитела использовали в разведении, рекомендованном производителем. Препараты заключали в раствор эльванола на PBS и затем исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan (Zeiss, Германия) с масляными объективами Plan-Neofluolar *100 и *40. Микрофотосъемку препаратов осуществляли с использованием цифровой камеры Olympus DP70 с программным обеспечением (DP Controller).

Конфокальная микроскопия. Для более подробного исследования строения актинового цитоскелета часть иммунофлуоресцентно окрашенных препаратов снимали на конфокальном микроскопе (Zeiss, Германия) с увеличением объектива Plan-Neofluar хЮО. Полученные Z-серии обрабатывались при помощи программы Image Examiner, в результате чего были получены Z-сечения клеток и измерена средняя толщина ламеллы и средняя толщина раффла.

Видеомикроскопия. Видеосъемку осуществляли в специальных камерах для прижизненной съемки, при температуре 37°С, на микроскопах Axioplan (Zeiss, Германия) с объективами Plan-Neofluar х25 и х40, и Nikon Eclipse-Ti с объективом Plan-Neofluar х40. Использовались техники DIC микроскопии, фазово-контрастной микроскопии с компьютерным усилением (Alexandrova et al, 2008), TIRF-микроскопии, для съемки применяли цифровые камеры с охлаждением Hamamatsu (Mode C8484-05G) и Orca-ER Hamamatsu с программным обеспечением Wasabi (Hamamatsu, Япония) и Metamorph. Продолжительность съемки и межкадровые интервалы выбирались в зависимости от задачи эксперимента.

Трансфекция живых клеток.

Для исследования динамики формирования фокальных адгезий и реорганизации цитоскелета мы использовали метод трансфекции в клетку ДНК белков, меченых флуорохромами (GFP, RFP, mCherry) и с помощью

флуоресцентной микроскопии непосредственно следили за перераспределением окрашенных структур в процессе клеточного движения. Трансфекцию проводили с помощью липофектамина (Helicon, USA) и Superfect (Qiagen), согласно инструкциям производителей.

Анализ динамики формирования и подвижности клеточных структур.

Для анализа динамических преобразований на активном крае клетки (скорости ретроградного движения актина, подвижности адгезионных структур, псевдоподиальной активности и т.д.) мы анализировали отснятые видеопоследовательности, используя режим "Кимограф" в програмных обеспечениях Metamorph и ImageJ. В этом режиме были построены кимограммы (диаграмма, показывающая смещение отдельной точки вдоль заданной линии в течение заданного времени) (Hinz et al, 1999; Bear et al, 2002). Для этого выбирается узкий участок изображения (линия) и на кимограмме выстраивается последовательность этих линий во временной развертке. Смещение каждой точки вдоль выбранного участка видно по образующимся наклонным линиям на кимограмме, а угол наклона показывает скорость смещений.

Анализ миграционных способностей клеток.

Исследование способностей клеток к миграции мы проводили а) методом длительного наблюдения за миграциями индивидуальных клеток (Ломакина, Александрова, 2009); б) исследованием миграции клеток в экспериментальную рану (Alexandrova et al., 2006) и в) исследованию миграции через миллипоровые фильтры, покрытые и нет матригелем, согласно протоколу производителя (BD Falcon).

Использованные ингибиторы и модуляторы движения

В экспериментах использовали следующие ингибиторы: Y27632 - ингибитор Rho-киназы, 45 мкМ (Calbiochem); блеббистатин - ингибитор АТФ-азной активности немышечного миозина II, 45, 75 и 100 мкМ (Toronto Research Chemicals Inc.) (10 мМ раствор в DMSO); ингибиторы полимеризации актина -латрункулин А, 0.5, 1, 2мкМ (Calbiochem) и цитохалазин D 0.2 мкг/мл (Sigma); колцемид (Sigma), - агент, деполимеризующий микротрубочки,0,2 - 0.5 мкг/мл в зависимости от постановки опыта и типа клеток; таксол (пакситаксель, Sigma, 0,2 мкм)- агент стабилизирующий микротрубочки; ингибитор Rho-киназы НА1077 в дозе ЗОмкМ; ингибитор протеинкиназ Н7 (ЗОмкМ). Форболовый эфир РМА (Phorbol 12-myristate 13-acetate) (Sigma Chemical Co., Louis. MO) - активатор протеин киназы С, добавляли к клеткам в концентрации 50 нг/мл за 5 - 6 часов перед началом съемки; D-сфингозин, ингибитор протеин киназы С, в концентрации 5мкМ.

Выявление экспрессии белка Ras и определение активности металлопротеаз

проводили после электрофоретического разделения белков в 15%

полиакриламидном геле с помощью иммуноблотинга и зимографии по стандартным методикам.

Электронная микроскопия.

Электронная микроскопия применялась для исследования ультраструктуры цитоскелета и ФА. Были использованы два подхода:

Метод платиновых реплик. Исследование цитоскелета на фиксированных препаратах, высушенных методом перехода критической точки и напыленных углеродом и платиной по методу, разработанному Т. Свиткиной (Svitkina and Borisy, 1998; Svitkina, 2007). Платиновые реплики исследовали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEOL 1200ЕХ (JEOL, Япония) и CCD камеры ORIUS 835.10W (Gatan) с програмным обеспечением Gatan Digital Micrograph. Изображения представляли в инвертированном виде.

Электронная томография. Были исследованы серии снимков, сделанных при повороте негативно окрашенных препаратов с помощью FEI Tecnai F30 Helium (Polara) микроскопа при 300kV и охлаждении примерно до 80°К. Автоматическое сканирование и поворот осуществлялся с помощью программного обеспечения SerialEM версия 2.7.x или 2.8.x. Угол поворота был от -60° до + 60°. Для построения каждой томограммы были использованы серии двух поворотов, полученных при вращении вдоль ортогональных осей. Изображения фиксировали с помощью CCD- камеры Gatan UltraScan 4000. Томограммы на основании полученных серий были получены с помощью программного обеспечения IMOD (the Boulder Laboratory) для трехмерной электронной микроскопии клеток (Kremer et al., 1996; Frangakis and Hegerl, 2005). Для построения моделей использовали полученные Z-стеки, состоящие, как правило, из 90 - 120 секций, каждая около

0.75 нм толщиной. Каждый филамент мы прослеживали и рисовали по всей длине вручную в программе IMOD.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕОРГАНИЗАЦИИ ЦИТОСКЕЛЕТА, ЛЕЖАЩЕЙ В

ОСНОВЕ ДВИЖЕНИЯ НОРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК

Исследование инициальных процессов движения клеток п выяснение роли полимеризации актина и акто-миозиновой сократимости в движении клеток.

Начальным этапом работы было исследование процессов инициации клеточного движения. В настоящей работе для исследований инициальных процессов клеточного движения было использовано две системы:

1) активация подвижности эпителиальных клеток с помощью HGF/SF (скэтгер-фактора) и

2) активация движения крысиных фибробластов линии Rat 2/5 с помощью форбологвого эфира РМА (phorbol 12-myristate 13-acetate).

На этих системах было показано, что активация клеточного движения сопряжена с поляризацией клеток и формированием выраженного ведущего края. Необходимым условием для такой поляризации было наличие интактной системы микротрубочек. Так действие HGF/SF на формирование ведущего края и сопутствующие перестройки актинового цитоскелета полностью ингибируются при разрушении микротрубочек с помощью колцемида (2 мкг/мл) или при нарушении динамики их кругооборота с помощью таксола (0.2 мкМ). В литературе существовало мнение, что "разбегание" эпителиальных клеток под действием HGF/SF в первую очередь обусловлено нарушением межклеточных контактов. Для проверки этой гипотезы исследовали действие HGF/SF на многоядерные клетки MDCK, полученные в результате обработки исходных эпителиальных клеток цитохалазином Д (0.2 мкг/мл). Многоядерные клетки содержали 2-8 ядер, были по размеру равны небольшому островку эпителиальных клеток и по периметру демонстрировали псевдоподиапьную активность. В работе было показано, что обработка таких клеток HGF/SF приводит к перераспределению псевдоподиальной активности и "разбеганию" многоядерных клеток на отдельные фрагменты, которые остаются связанными между собой узкими длинными участками цитоплазмы. Такое разбегание совершенно аналогично разбеганию отдельных клеток из эпителиального островка под действием HGF/SF. Таким образом, было продемонстрировано, что именно поляризация и формирование ведущего края является наиболее существенным процессом для инициации клеточного движения. Принято считать, что направленное клеточное движение обеспечивается двумя основными процессами: полимеризацией актиновой сети на ведущем краю клетки и подтягиванием тела клетки за счет акто-миозинового сокращения. Задачей этой работы было выявить вклад каждой из этих составляющих в эффективное клеточное движение. Для этого были проанализированы действие ингибиторов полимеризации актина (латрункулина и цитохалазина Д) и действие ингибиторов акто-миозиновой сократимости (блеббистатина и Y27632) на два основных процесса, демонстрирующих клеточную подвижность: а) распластывание клеток на субстрате и б) миграция клеток в экспериментальную рану. В процессе распластывания площадь клеток увеличивается, и, кроме того фибробласты поляризуются, т.е. эффективность распластывания клеток можно оценить по увеличению площади распластывания и степени поляризации. В опытах были использованы крысиные фибробласты REF52.

Показано, что обработка клеток ингибиторами сократимости не тормозит распластывания клеток, а наоборот площадь клеток несколько увеличивается, а степень поляризации возрастает очень сильно по сравнению с контролем (Рис.1).

Обработка клеток низкими дозами цитохалазина Д и латрункулина А сильно ингибирует распластывание фибробластов. Таким образом для распластывания клеток наиболее критичным является полимеризация актиновой сети на краю клетки. Данные, полученные при ислледовании действия ингибиторов на миграционные способности клеток представлены на Рис. 2.

Динамика изменения площади клеток 6000 _________ при распластывании

5000 4000 3000 2000 1000

контроль У27632 блебб ЛатрА Цит Д

Динамика изменения степени поляризации клеток при распластывании

контроль У27632 блебб ЛатрА

ЦитД

Рис. 1. Действие ингибиторов полимеризации актина (латрункулина А и цитохалазина Д) и ингибиторов акто-миозиновой сократимости (блеббистатина и У27632) на распластывание фибробластов 11ЕР52.

Из Рис. 2 видно, что ингибиторы полимеризации актиновой сети существенно замедляют миграцию клеток, и напротив, обработка клеток ингибиторами сократимости приводит к обратному эффекту и способность клеток к миграции увеличивается. При этом хвостовые участки двигающихся клеток сильно

удлиняются, т.к. не могут подтягиваться из-за нарушения сократимости. Это и

является причиной существенного увеличения поляризации клеток в результате обработки их блеббистатином или У27632.

Рис. 2. Действие ингибиторов полимеризации актина (латрункулин А и цитохалазин Д) и ингибиторов сократимости (блеббистатин и

У27632) на миграцию фибробластов.

■контроль

-У27632

-блеббистатин

=цитД

0.2мкг/мл -лат 1мкМ

Дальность миграции (мкм)

Рис. 3. Густая культура фибробластов REF52, окраска актина ФИТЦ-фаллоидином. А- контроль; Б - клетки в присутствии ингибитора Y27632. Стрелки указывают места, где клетки перекрываются друг с другом ламеллиподиями.

Была исследована способность фибробластов к формированию монослоя у контрольных клеток и в присутствии ингибиторов сократимости (Рис. 3). Нормальные фибробласты в густой культуре формируют монослой, плотно соприкасаясь с соседними клетками, но не залезая на них. Обработка клеток Y27632 приводит к тому, что фибробласты образуют многослойные культуры. Длинные хвостовые участки налегают на соседние клетки. Кроме этого видно, что клетки могут пересекаться и за счет широких ламелл (Рис. ЗБ, отмечено стрелками).

Полученные результаты означают, что акто-миозиновая сократимость не играет существенной роли в осуществлении клеточного движения, а скорее важна для «правильного» формирования клеточных слоев и соответственно для формирования органной структуры. Таким образом, наиболее существенным процессом для движения клеток является именно образование новых протрузий на ведущем краю клеток.

Исследование динамических преобразований на ведущем активном крае в процессе распластывания и движения клеток.

Поскольку, как было показано, формирование ведущего края является наиболее существенным этапом клеточного движения, дальнейшей задачей стало исследование структуры и динамики ведущего края. С помощью флуоресцентной видеомикроскопии и метода компьютерно-усиленной фазово-конрастной микроскопии, предложенного А. Верховским (Verkhovsky et al., 2003) исследовали динамические преобразования на ведущем крае клетки при движении. Было показано, что на ведущем краю можно выделить две четко выраженных зоны, отличающихся по динамике актина и между ними видна ясная граница (Рис. 4).

Рис. 4. Фибробласт REF52 через 5 часов после посадки на стекло. В клетку инъецировали актин, меченный родамином, и исследовали ее с помощью техники фазового контраста (А) и флуоресцентной микроскопии (Б). Головками стрелок (А) обозначено зона быстрого актинового тока (ламеллиподия), пунктирными линиями (А) указан район, использованный для построения кимограмм (В, Г), стрелки на кимограмме (В) указывают наклон линий интенсивности, отражающие скорость актинового тока. Масштаб 5мкм, на кимограммах вертикальный масштаб 2 мкм, горизонтальный - 2 мин.

Крайняя зона - ламеллиподия - обозначена стрелками на Рис. 4 А. Видно, что ламеллиподия отличается от ламеллы, расположенной ближе к центру клетки, более высокой концентрацией актина (Рис. 4 Б) и различиями структуры, видимыми как на фазовом контрасте, так и на флуоресценции.

Кимограммы, построенные на флуоресцентном изображении и на фазовом контрасте показывают одинаковую скорость актинового тока (0,8 мкм/мин в ламеллиподия и 0,6 мкм/мин в ламелле).

Было показано, что скорости обратного актинового тока могут различаться в разных клетках, в зависимости от их состояния и фазы движения. Так скорости тока в ламеллиподии могут быть от 0.5 до 7 мкм/мин, а скорости тока в ламелле -от 0.05 до 2.5 мкм/мин соответственно, но, в одной и той же клетке всегда скорость тока в ламеллиподии много выше, чем в ламелле и между ними существует четкая динамическая граница.

Таким образом, было показано, что на активном ведущем краю имеются две зоны, различающиеся по строению и динамике, и между этими зонами существует четко выраженная граница. Эти зоны соответствуют описанным ранее ламеллиподии и ламелле (Salmon et al., 2002; Ponti et al., 2004). Ширина зоны ламеллиподии зависит от активности клетки, и так же как и фактическая скорость ретроградного тока может изменяться в зависимости от типа и от состояния клеток, но разница между быстрым током в ламеллиподии и более медленным в ламелле всегда остается существенной.

Следующей задачей данной работы было исследование молекулярных механизмов, регулирующих ретроградный ток актина в ламеллиподии и ламелле. Для этого прямо под микроскопом были добавлены ингибиторы:

а) полимеризации актиновых филаментов (цитохалазин Д в дозе 0,2 мкМ), или

б) ингибитор сократимости НА1077 в дозе ЗОмкМ (Рис.5).

Добавление цитохалазина Д приводит к немедленному аресту распластывания и уменьшению скорости обратного актинового тока в ламеллиподии с 2,6 мкм/мин до 0,4 мкм/мин. Скорость актинового тока в ламеллиподии становится равной скорости тока в ламелле, исчезает граница между этими двумя зонами, т.е. фактически ламеллиподия исчезает и остается только ламелла. Пунктирная линия на кимограмме Е показывает время добавления ЗОмкМ НА1077, которое приводит к уменьшению скорости ламеллярного тока (от 1 до 0,4 мкм/мин), не вызывая изменений в динамике актинового тока в ламеллиподии (4,5 мкм/мин). Таким образом, было показано, что за существование ламеллиподии отвечает полимеризация актиновых филаментов на краю клетки, тогда как динамика актина в ламелле определяется акто-миозиновой сократимостью.

Рис. 5. Влияние ингибиторов полимеризации актина и акто-миозиновой сократимости на динамику обратного тока актина в ламеллиподии и ламелле. Распластывание клетки меланомы В16, экспрессирующей GFP-актин. Фазово-контрастная (А) и флуоресцентная микроскопия (Б), анализ кимограмм аналогичен Рис. 4. Пунктирная линия, отмеченная "CD" на кимограмме В показывает время добавления цитохалазина Д 0,2 (мкМ). (Д) Усиленный фазовый контраст и кимограммы (Е) распластывающегося фибробласта линии Swiss ЗТЗ. Пунктирная линия на кимограмме Е показывает время добавления ЗОмкМ НА 1077. Масштаб 5мкм, на кимограммах вертикальный масштаб 2 мкм, горизонтальный - 2 мин.

Наличие четкой границы между ламеллиподией и ламеллой предполагает, что именно в районе этой границы и происходит переключение механизмов, отвечающих за ретроградный ток актина. Эта граница была определена на основе как анализа скорости, резко меняющейся при переходе от одной зоне к другой, так и на анализе текстуры актиновой сети, видной и на флуоресцентных изображениях и на фазовом контрасте (Рис. 4, 5). Интересно, что эта граница не гладкая, а состоит из нескольких сегментов. Выступы этих сегментов соотносятся на концах с радиально расположенными пучками актиновых филаментов, т.е. вероятно совпадают с фокальными контактами. Поэтому следующим шагом наших исследований стал детальный анализ соотношения между динамикой актинового тока и адгезионными контактами. Такой анализ приведен на Рис. 6. Видно, что положение фокальных адгезий, меченных УРР-паксиллином, совпадает с границей ламеллиподия - ламелла.

Рис. 6. Изменение динамики актинового тока в ламеллиподии при формировании ФА. Распластывающийся фибробласт линии ЛЕР-52, экспрессирующий УРР-паксиллин. (А) Наложение изображений, полученных с помощью усиленного фазового контраста (серое изображение) и флуоресцентной микроскопии (красный) (слева) и кимограмма (справа). (Б) Выборочные кадры из видеопоследовательности в районе, обозначенном белым квадратом на (А), демонстрируют формирование новых ФА и соответствующего смещения границы между ламеллой и ламеллиподией, время указано в мин:сек. Белыми головками стрелок указано образование ФА. Масштаб 5 мкм, на кимограммах вертикальная черта - 2 мкм, горизонтальная - 2 мин.

Анализ кимограмм (фазовый контраст наверху, флуоресценция посередине и наложение двух изображения - внизу) показывает, что быстрый ток актина не заходит за места адгезий. В то же время зона медленного активного тока выдвигается вперед одновременно с образованием новых фокальных адгезий. Стрелки на кимограммах нарисованы параллельно линиям с одинаковой интенсивностью и показывают скорость быстрого тока (4,5 мкм/мин), скорость медленного тока (0,5 мкм/мин) и скорость скольжения вновь образованной фокальной адгезии (0,15 мкм/мин)

Новые ФА (паксиллин-позитивные точка, обозначенная головкой стрелки) -формируются в зоне ламеллиподии в течение 30 сек (Б). При этом наблюдается нарушение (завихрение) тока, видимое на фазовом контрасте как усиление оптической плотности в передней части ФА. Вслед за формированием ФА следует выдвижение ламеллы (темная граница между ламеллиподией и ламеллой видна на фазовом контрасте).

Изложенные выше исследования предполагают, что формирование ФА определяет положение границы между двумя зонами активного клеточного края. Чтобы проанализировать динамическую организацию активного края в отсутствии ФА мы посадили клетки на субстрат, покрытый поли-Ь-лизином в бессывороточной среде, т.е. в отсутствии сывороточных белков и белков внеклеточного матрикса.

Рис. 7. Граница ламеллиподия-ламелла не образуется в отсутствии ФА. Фибробласт ЯЕР-52 распластывался в бессывороточной среде на подложке, покрытой полилизином (роІу-Ь-Іувіпе). Кимограмма построена вдоль пунктирной линии, ^ нарисованной на левом изображении. Масштаб 5 мкм, на кимограммах вертикальная черта - 2 мкм, горизонтальная - 2 мин. і_

В этих условиях клетки прикрепляются к субстрату и распластываются, но ФА и стресс-фибрилл не образуется. После посадки клетки начинают быстро распластываться на поли-Ь-лизине, но через некоторое время процесс I останавливается на стадии, когда образуется довольно широкие равномерно распластанные края и выступающая центральная часть клетки (Рис. 7). Анализ і динамических и структурных характеристик распластывания показал, что в этих | условиях ретроградный ток на активном краю равномерный от края и до _ околонуклеарной части клетки, структура так же равномерная и нет деления на ламеллиподию и ламеллу. Кимограмма на рисунке показывает равномерный 1

ретроградный актиновый ток со скоростью 1,6 мкм/мин. Скорость тока в таких клетках или одинаковая по всей ширине распластанного края, или постепенно уменьшается к центру клетки и по своим значениям промежуточная между быстрым и медленным током у клеток, распластывающихся в обычных условиях. Таким образом, две зоны не образуются в отсутствии ФА, доказывая тот факт, что граница между ламеллиподией и ламеллой не только пространственно совпадает с ФА, но и зависит от их наличия. Так же было показано, что начало формирования всех ФА происходит в зоне ламеллиподии (подсчитано 194 события -формирования ФА в 8 распластывающихся клетках). Если ингибировать образование ламеллиподии с помощью ингибитора полимеризации актина цитохалазина Д, образования новых ФА не происходит.

Медленный ток актина, наблюдаемый позади от краевой линии ФА существует не только в зоне ламеллы, свободной от крупных пучков микрофиламентов, но так же и внутри фазово-плотных пучков, соответствующих стресс-фибриллам и оканчивающихся в местах фокальных контактов.

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ОБРАЗОВАНИЯ ИНИЦИАЛЬНЫХ ФОКАЛЬНЫХ АДГЕЗИЙ ПРИ ДВИЖЕНИИ КЛЕТОК.

В качестве маркера инициальных ФА использовали белок УАБР, так как ранее было показано, что УА8Р появляется на самых ранних стадиях формирования адгезионных контактов (КоКпег й а1., 1999). Кроме того УАБР участвует в полимеризации актина на активном клеточном крае и поэтому у клеток, трансфицированных флуоресцентно-меченым УАБР в момент образования протрузий внешний край ламеллиподии окрашивается. Таким образом, этот белок может одновременно четко обозначать границы клетки, выступать маркером краевой активности и маркером инициальных ФА. Для проведения исследования динамики формирования ФА исследуемые клетки, помимо УАБР, были трансфицированы плазмидами, несущими ДНК других белков фокальных адгезий, слитыми с флуоресцирующими белками СЕР или Ш-Р. Во всех случаях совместной экспрессии УАБР и любого другого белка ФА сначала в зоне ламеллиподии формировалась точка, положительно окрашиваемая на УАБР, и позже, с задержкой в 20 -50 секунд в эту точку приходил и другой исследуемый белок ФА.

Исследована совместная динамика УАБР с винкулином, паксиллином, зиксином и трансмембранным белком ФА бета-3-интегрином, который может служить маркером взаимодействия клетки с субстратом. В качестве примера обработки полученных результатов анализ динамической ко-локализации УАБР с бета-3-интегрином представлен на Рис. 8. На рисунке показаны первый и последний кадр видеопоследовательности движения клетки В16, трансфицированной тСЬеггу-УА8Р (красный) и ЕОЕР-бета-З-интегрином (зеленый) (Рис. 8 А), а также монтаж из последовательности кадров одного из

участков ламеллиподии с вновь образующимися ФА (обозначено белой стрелкой). На графике интенсивности флуоресценции в точке возникновения ФА видно два пика интенсивности УАБР (красная линия). Первый соответствует времени прохождения через исследуемую точку краевой линии УА8Р, а второй -формированию ФА. Зеленая линия показывает интенсивность бета-3-интегрина в этой же точке. Видно, что бетаЗ-интегрин пришел в образующуюся ФА с задержкой 10 кадров (50 секунд) по сравнению с УАБР и максимальная интенсивность бета-3-интегрина была достигнута на 15 кадров (75 секунд) позже, чем максимальная интенсивность УАБР.

----Ье1аЗ

----УАЗР

21 41 61 81 101 121

№№ кадров

к250

£200

ш 150

НЮ0

Рис. 8 Динамическая ко-локализация тСЬеггуУАБР и ЕвРР-бета-3-интегрина в клетке В16. А - два кадра видеопоследовательности совместной динамики тСЬегту-УА8Р и ЕОРР-бета-З-интегрина, снятые с интервалом 40 секунд. Б - монтаж последовательности кадров участка, обозначенного рамкой, интервал между кадрами секунд. Белой стрелкой показано место возникновения ФА. В - график изменения интенсивности свечения в месте возникновения ФА во время клеточного движения. Красный - изменение интенсивности УАЭР, зеленая линия - изменение интенсивности бета-3-интегрина. Общее количество кадров —121..

Для того, чтобы исследовать степень встраивания белков ФА во вновь образующиеся структуры, проводили следующие эксперименты. Непосредственно после того, как были отсняты видеофильмы с формированием новой ФА, проводили экстракцию клеток раствором Тритона Х-100 прямо под микроскопом.

С помощью такого подхода было показано, что основные белки ФА - VASP, винкулин, паксиллин, бета-3-интегрин после экстракции остаются в точках новых ФА, т.е. они на самых ранних стадиях образования ФА структурно закреплены в этих точках.

Белок зиксин, ранее описанный, как компонент более зрелых ФА (Zaidel-Bar et al., 2003), демонстрирует сходную динамику включения при образовании ФА, т.е. также как и остальные белки ФА концентрируется в точке формирующейся ФА на 20-40 секунд позднее VASP. При этом оказалось, что при экстракции Тритоном Х-100, зиксин не остается в точках формирующихся ФА. Это означает, что несмотря на то, что хотя зиксин, также как и другие белки, концентрируется в VASP-положительных точках при формировании ФА, он еще не вовлечен в структуру и не закреплен . Вероятно для закрепления зиксина требуется дополнительное условие (например, дополнительное механическая сила, обусловленная наличием локальных ретракций на ведущем краю клетки). Именно поэтому в предыдущих работах, основанных в основном на исследовании фиксированных и экстрагированных клеток, зиксин не регистрировался в ранних ФА, а встречался только в истинных фокальных контактах, образованных при созревании фокальных комплексов под действием дополнительного акто-миозинового натяжения (Zaidel-Bar et al., 2003). Одним из методов исследования ФА является интерференционно-рефлекторная микроскопия (IRM), с помощью которой можно выявить участки клетки, близко прилегающие к поверхности субстрата (Izzard and Lochner, 1980). С помощью ШМ Иззард и Лохнер выделили «черные контакты» - места близкого прилегания клетки к субстрату (расстояние между мембраной и поверхностью субстрата 10-15 нм), , названные ими фокальные контакты, и «серые контакты» (расстояние между клеткой и субстратом около 30 нм), названные «близкими контактами». Среднее расстояние между клеткой и субстратом вне ФА > 100 нм. Как показали дальнейшие исследования, фокальные контакты, идентифицированные с помощью флуоресценции, выглядят, как черные штрихи, а фокальные комплексы, как черные точки. С помощью IRM исследовали инициальные ФА, и показали, что инициальные точки, обогащенные VASP, относились к «серым» контактам, согласно определению Иззарда и Лохнера. Эти серые точки часто входили в состав довольно широкой серой полосы, лежащей в основании ламеллиподии, и представляли собой локальные затемнения в тех местах, где VASP совпадал с интегрином. Несмотря на то, что эти точки были темно-серые, они были заметно светлее истинно «черных» контактов, удлиненных структур, расположенных в

центральной части клетки и содержащих УАБР и интегрин. Это означает, что клеточная мембрана в этих точках подходит довольно близко к поверхности, но не так близко, как в местах фокальных контактов. Вероятно, это происходит потому, что в точке инициальной ФА клетка присоединяется к субстрату через интегриновые рецепторы, но эта точка очень мала и не создает области "черного" контакта.

Таким образом, была показана роль белка УАБР, как организатора формирования новых ФА - инициальных ФА. Было показано, что инициальные ФА - это нестабильные структуры, в быстро двигающейся клетке (например, меланоме В16) большинство из них существует только в течение нескольких минут, пока зона ламеллиподии не пройдет через это место, а далее они растворяются. Для их дальнейшего созревания требуется дополнительные факторы, например локальные ретракции края клетки. Но при этом эта стадия является необходимой, так как все более зрелые ФА (фокальные комплексы и фокальные контакты) развиваются на месте инициальных ФА. Чтобы полно охарактеризовать эту начальную стадию формирования ФА, надо было исследовать строение актиновой сети в области инициальных ФА. Из-за их нестабильности это было возможно сделать, только применив коррелятивную видео и электронную микроскопию. Этот метод позволяет последить формирование новой ФА под ТШТ микроскопом, а потом, с помощью электронного микроскопа, исследовать структуру ФА с известной историей.

Было исследовано более 50 клеток и проанализировано строение УАБР-положительных инициальных ФА. Показано, что если новые ФА формируются в основании филоподий или на месте локальной ретракции, то на электронномикроскопическом уровне на месте УАБР-положительной точки актиновые филаменты собираются в небольшие, короткие пучки, состоящие из нескольких филаментов. Если в клетку трансфицировать винкулин и зиксин, эти белки, как правило, обнаруживается в составе таких ФА. Если новые ФА формируются в ламеллиподии и не связаны с локальными ретракциями, в этих точках не удается выявить специфической структуры актиновой сети, которая отличалась бы от структуры окружающей ламеллиподии. В составе таких ФА также обнаруживается трансфицированный ОРР-винкулин, но не зиксин.

Для более точного исследования трехмерной структуры ФА, находящихся на разных стадиях созревания, использовали корреляцию видеомикроскопии и электронномикроскопической томографии. На Рис. 9 дано пример анализа материала и корреляции световой и электронной микроскопии при исследовании структуры ФА.

Для дальнейшего анализа были выбраны две адгезии (показаны стрелками на Рис. 9 Б). Одна - на ведущем краю клетки, представленная точкой УАБР, время жизни которой около 60 секунд; другая - более зрелая штриховая адгезия,

размером 1,5 мкм, которая существовала на протяжении всего видеофильма и заметно за это время увеличилась в размере. Исследование структуры этих адгезий проводилось с помощью электронной томографии.

Рис. 9. Процедура корреляции видео и электронных изображений ФА. А - монтаж видеопоследовательности клетки ЗТЗ, трансфицированной СРР-УА8Р и стимулированной инъекцией доминантно-активного Яас. Время указано в секундах; Б - последний кадр перед фиксацией, окраска на УАЗР, стрелками показаны места ФА, выбранные для дальнейших исследований. В - наложение актиновых структур, выявленных с помощью ТРИТС-фаллоидина (красный) на негативное окрашивание для точной корреляции видео и электронной микроскопии; Г - наложение окрашивания УАБР на предыдущую картинку, для определения места исследуемых ФА.

Было показано, что в области инициальной ФА структура актиновой сети ничем не отличается от структуры актиновой сети окружающей ламеллиподии (Рис. 10). Отдельные филаменты были прослежены и прорисованы вручную.

Оказалось, что в районе инициальной ФА, также как и в окружающей ламеллиподии, есть довольно большое количество окончаний актиновых филаментов. Вопреки ожиданиям, эти свободные концы микрофиламенгов не связаны с нижней или верхней поверхностью клетки, а равномерно распределены в толще ламеллиподии. В отдельных случаях толщина ламеллиподии в месте инициальной ФА была несколько больше, чем в окружающих районах, но это было показано не для всех исследованных инициальных ФА.

Рис. 10. Электронно-микроскопическая томограмма инициальной ФА. А - структура актинового цитоскелета ламеллиподии, место инициальной ФА обведено красным овалом. На врезке указано место исследуемой ФА. Б, В - трехмерная модель строения инициальной ФА; Б - вид сверху; В - вид сбоку. Актиновые филаменты - 1 зеленые, концы филаментов отмечены красными точками, область инициальной ФА обведена голубой линией.

Структура более зрелой ФА представлена на Рис. 11. Эта ФА имеет размеры [ 1,5 мкм. На Рис. 11 Б видно, что эта ФА представлена небольшим пучком, 1 который расположен ближе к нижней поверхности клетки и начинается сразу за густой сетью микрофиламентов, типичной для ламеллиподии, т.е. адгезия находится в основании ламеллиподии. Анализ показал, что в основном филаменты, составляющие этот пучок, начинаются у нижней поверхности клетки, г но часть филаментов этого пучка являются прямым продолжением филаментов из ламеллиподии. При этом выше фокального комплекса под верхней мембраной г клетки актиновые филаменты организованы в сеть (Рис. 11 А). Подмембранная р сеть (А) и пучок микрофиламентов (Б) хотя и разделены пространственно, но не являются абсолютно автономными структурами, так как значительное количество 1 микрофиламентов из верхней сети переходят в состав пучка.

На других препаратах было показано, что во всех адгезиях, которые можно I отнести к фокальным комплексам, согласно их размеру и времени жизни, ) актиновые филаменты собраны в мелкие пучки, расположенные ближе к нижней Ц поверхности клетки. Эти пучки в основном короткие, состоят всего из нескольких филаментов и не связаны с актиновыми пучками, идущими к центральной части I

клетки. В таблице 1 представлены основные характеристики инициальных ФА, фокальных комплексов и фокальных контактов для более наглядного сопоставления этих структур.

Таблица 1. Классификация адгезионных структур.

Характеристики ФА Инициальные ФА Фокальные комплексы Фокальные контакты

Необходимость миозин П-зависимой сократимости " +

Наличие спец. структуры на ЭМ уровне " + +

Необходимость Агр 2/3-зависимой полимеризации актина + +

Структура Густая сеть Мелкие пучки Акто-миозиновые

актинового актиновых из нескольких сократимые пучки

цитоскелета на филаментов актиновых

месте ФА (ламеллиподия) филаментов,

Положение в клетке Ламеллиподия Г раница лп-лам,основание филоподий На конце стресс-фибрилл, в центре клетки и в хвостовых отростках

Белки ФА, входящие в состав Все белки ФА, но зиксин физически не включен в состав структуры Все белки ФА Все белки ФА

Связь с интегрином (ВКМ) + + +

ПШ Серые контакты Черные контакты Черные контакты

Рис. 11. Электронно-микроскопическая томограмма более зрелой ФА. На врезке показано расположение исследуемой ФА. А - подмембранный слой актиновых филаментов, Б - организация цитоскелета у нижней поверхности клетки.

Таким образом, было показано, что при формировании новой адгезии, существует короткоживущая стадия, которая предваряет фокальные комплексы и является совершенно обязательным этапом образования новой ФА. Эта стадия -инициальные ФА - по нескольким признакам отличается от фокальных комплексов, образование которых ранее считалось первым шагом формирования ФА.

ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ. ВОЗНИКАЮЩИХ В РЕЗУЛЬТАТЕ ТРАНСФОРМАЦИИ

Подбор клеточных систем для исследования.

Неопластическая трансформация приводит к существенному изменению формы клеток, их цитоскелета и характера движения. Изменения цитоскелета при трансформации было отмечено давно (Bershadsky and Vasiliev, 1988; Vasiliev and Gelfand, 1981; Mani et al, 2008; Polyak and Weinberg, 2009), в частности хорошо известны редукция актиновых стресс-фибрилл и нарушение созревания фокальных контактов у опухолевых клеток. Было показано также, что такая организация цитоскелета часто коррелирует с повышением локомоторной активности и/или метастатического потенциала опухолевых клеток (Рокота et al., 1994, Sachai and Marshall, 2003), но остается неясным, каким образом эти изменения цитоскелета связаны с изменением характера клеточного движения и возникновением у клеток способности к инвазии. Нашей задачей было выявление особенностей морфологии и цитоскелета трансформированных клеток, существенных для приобретения инвазивного фенотипа.

Для этих исследований мы выбрали три разные клеточные системы, включающие в себя контрольные фибробласты и их трансформированные

производные, для того, чтобы иметь возможность сравнивать клетки, находящиеся на разных стадиях опухолевой трансформации:

1). Модель моноонкогенной Ras-трансформациии: клетки 10(3), являющиеся иммортализованными мышиными фибробластами (Harvey and Levine, 1991), использовались нами как контроль, a 10(3)RAS - линия, полученные путем трансфекции исходной линии 10(3) плазмидой с геном конститутивно активного белка N-RASaspl3, использовалась в качестве модели Ras-трансформации;

2). Линия клеток эмбриональных легочных фибробластов человека MRC5 и ее трансформированные аналоги, полученные в результате инфицирования исходной линии вирусом SV-40 - MRC5-V1 и MRC5-V2 (Huschtscha and Holliday, 1983). Обе производные линии обладают повышенной митотической активностью, у них появляются способность образовывать колонии в полужидком агаре, они положительны по Т-антигену и являются иммортализованными. Однако MRC-5V2 способны расти в более бедной среде (с меньшим количеством глюкозы, без метионина), быстрее делятся, продуцируют большее количество свободного вируса на ранних пассажах, и среди них чаще встречаются полиплоидные клетки. Эти свойства позволили авторам определить MRC-5V2 как клон, обладающий более трансформированным фенотипом;

3). Нормальные подкожные фибробласты человека линии 1036 в качестве контрольных клеток и клетки опухолевого происхождения - линия фибросаркомы человека НТ1080. Фибробласты 1036 демонстрировали признаки нормальных клеток и при длительном культивировании старели. Клетки фибросаркомы хорошо образуют колонии в полужидкой среде и согласно литературным данным вызывают образование опухолей у животных, т.е. являются типичными опухолевыми клетками.

Во всех этих системах контрольные клетки имели морфологию типичных фибробластов: это были хорошо распластанные, поляризованные клетки с выраженными актиновыми стресс-фибриллами, ассоциированными с крупными фокальными контактами. В результате трансформации площадь клеток уменьшалась, существенно редуцировались актиновые стресс фибриллы, а количество и размер фокальных контактов снижались. Таким образом, во всех трех системах была ярко выражена классическая морфологическая трансформация. Необходимо отметить, что степень выраженности признаков трансформации несколько отличалась среди использованных клеточных систем. Так в мышиных фибробластах 10(3), трансформированных онкогеном Ras, описанные изменения были выражены в меньшей степени, чем у других трансформированных культур, например, наблюдалось довольно большое количество клеток с остаточными пучками микрофиламентов. SV40-трансформированные легочные фибробласты MRC-5V1 (в меньшей степени) и MRC-5V2 (в большей степени) по многим исследованным признакам

приближаются к высоко-инвазивным клеткам фибросаркомы НТ1080 и могут рассматриваться, как клетки с более выраженной морфологической трансформацией.

Таким образом, в работе рассматриваются и сравниваются клетки, находящиеся на разных стадиях трансформации, что дает возможность выделить изменения, наиболее существенные для появления у клеток способностей к инвазии.

С помощью конфокального микроскопа на примере системы легочных фибробластов, показаны типичные изменения актинового цитоскелета, сопровождающие трансформацию клеток и видимые на световом уровне (Рис. 12).

Сами клетки становятся мельче, уменьшается количество пучков актиновых филаментов, однако сильно увеличивается толщина клеток. Нормальные клетки довольно плоские, толщина ламеллы составляет около 1 мкм и лишь в области раффлов может достигать 2 мкм. На г-срезах клеток МЯС-5У1 видно большое количество краевых раффлов, эти области утолщены, по сравнению с остальными частями ламеллы (2 мкм) и их толщина достигает Змкм. На 2-срезах клеток МИС-5У2 видно значительное утолщение ламеллы, по сравнению с контролем. Толщина ламеллы составляет в среднем около 2,3 мкм, а в области раффлов достигает 4,5 мкм.

Поскольку, как было показано ранее, в движении клеток определяющую роль играет формирование ведущего края, задачей данной работы было сравнительное исследование распределения и характера краевой активности у нормальных и трансформированных клеток. Краевую активность оценивали на основе видеофильмов, полученных в результате прижизненного наблюдения за одиночными интерфазными клетками исследуемых линий в течение 10 минут. Исследование морфологических параметров клеточного края включало измерение количества и длины участков, относящихся к различным типам нестабильности (сильноактивные, слабоактивные и ретрактирующие участки). Сильноактивные -это участки, расположенные, как правило, на ведущем краю клетки, где активно образуются новые протрузии, иногда сопровождаемые локальными ретракциями; слабоактивные участки - нет постоянного образования протрузий, но есть мелкие ламеллиподии и/или филоподии; ретрактирующие участки - там, где в течение съемки наблюдается устойчивая ретракция. Анализ показал, что у всех исследованных контрольных фибробластов стабильный край занимает примерно половину всего периметра клетки (Рис. 13). Это совпадает с результатами, полученными другими авторами (Добринских, 2007).

В результате трансформации существенно увеличивается доля активного края и существенно снижается доля стабильного. Причем, степень увеличения доли активного края (и соответственно снижения доли стабильного края) напрямую зависит от степени трансформации клеток. Так, в системе моноонкогенной

трансформации онкогеном М-Клв доля активного края увеличивается с 44% до 65%, а в системах 8У40-трансформированных клеток и фибробласты кожи -фибросаркома, доля активного края увеличивается до 86-87% и до 92% соответственно. При таком существенном возрастании доли активного края клетки утрачивают полярность, и наиболее трансформированные клетки, МИС-5У2 и фибросаркома НТ1080, не имеют выраженного ведущего края и практически не поляризованы.

Рис. 12. Конфокальная микроскопия препаратов с флуоресцентным окрашиванием фаллоидином,

конъюгированным с ФИТЦ, и построение 2-срезов. А. Клетка МЯС-

5. Б. Клетка М11С-5У1. В. Клетка МЯС-5У2. Красным выделен участок клетки, на котором был построен Ъ~ срез. Красная линия обозначает плоскость построения 2-среза. Масштаб 5 мкм.

Следует отметить, что при более длительном наблюдении (до 40 минут) у трансформированных клеток на стабильных участках наблюдалось появление активности в виде образования мелких филоподий или ламеллиподий, а иногда и развивалась сильная протрузионная активность. У контрольных клеток стабильные участки оставались «истинно стабильными» на протяжении длительного времени.

Для дополнительного исследования распределения активного края применялись методы иммунофлуоресцентного окрашивания антителами к р34

субъединице Arp 2/3-комплекса. Зонам активной Агр2/3-зависимой полимеризации актина, т.е. протрузиям соответствуют ярко окрашенные полоски по периметру клеток. В контроле наблюдалось диффузное окрашивание цитоплазмы и яркий ободок свечения Агр2/3 на самой кромке ведущей ламеллы, можно было четко выделить и стабильные (неокрашенные) участки края. У трансформированных клеток сильно возрастало количество и протяженность светящихся участков. Следует отметить, что свечение отмечалось не только на крупных участках активности, но и на концах мелких ламеллиподии и филоподий, которые классифицировались нами ранее как слабоактивные участки.

10(3)

10(3)Ras

■ сту

□ сау

□ слау

□ ру

Рис. 13. Распределение краевой

активности по периметру клеток.

Сту - стабильный край клетки; сау -сильно активные участки; слау -

слабо-активные участки; ру -

ретрактирующие участки

ШС5 МЯС5-У1 МКС5.У2

Таким образом, увеличение доли активного края и соответственно уменьшение доли стабильного можно считать таким же признаком трансформации, как и исчезновение в клетках стресс-фибрилл.

В настоящей работе исследовали не только изменение распределения активности по периметру клетки, но также изменение динамики образования протрузий на ведущем крае клеток при трансформации. С помощью Б1С видеомикроскопии и последующего построения кимограмм было выяснено, что для контрольных фибробластов типичными являются крупные, плоские и широкие протрузии и довольно низкая активность раффлинга. Раффлы образуются из не прикрепившихся протрузий, они контрастные в Б1С-микроскопе и поэтому выглядят на кимограммах, как белые линии.

На Рис. 14 видно, что раффлы двигаются от края клетки к центру со скоростью, практически равной скорости локальной ретракции протрузий и скорости обратного тока актина в ламеллиподии. В норме наблюдаются отдельные раффлы, появляющиеся вслед за крупной протрузией (Рис.14 А).

У всех трансформированных клеток частота раффлов существенно повышается (в 1,5-3,2 раза) и превышает частоту протрузий, т.е. раффлы образуются и в отсутствии видимых протрузий. У наиболее трансформированных клеток раффлы могут сливаться в единый "вал" видимый позади небольшой ламеллиподии, или располагаться в несколько рядов. Такое расположение свидетельствует о частом возникновении дорзальных раффлов, не ассоциированных с образованием протрузий, что совпадает с картиной, наблюдаемой в конфокальный микроскоп (Рис. 12 В).

Рис. 14. Кимограммы, иллюстрирующие псевдоподиальную активность на ведущем крае MRC-5 (A), MRC-5V1 (Б) и MRC-5V2 (В) клеток. А. Видны крупные плоские протрузии. Б. Наблюдается активный раффлинг, протрузии более мелкие и частые, чем в контроле. В. Наблюдаются раффлы, сросшиеся в единый «вал». Ламеллоподии довольно мелкие и частые.

Повышенное образование дорзальных раффлов трансформированными клетками отмечалось также другими авторами (Buccione et al., 2004). Анализ динамической активности на ведущем краю клеток показал, что в результате трансформации возрастает частота протрузий и ретракций, но размеры протрузий уменьшаются по сравнению с нормальными клетками.

Поскольку характер движения ведущего края должен быть связан со структурой цитоскелета, были проведены ультраструктурные исследования актинового цитоскелета нормальных и 8У40-трансформированных фибробластов на электронно-микроскопическом уровне методом платиновых реплик (Svitkina and Borisy, 1998; Svitkina, 2007). Особое внимание было обращено на строение периферических районов для анализа причин различий краевой активности у нормальных и трансформированных клеток.

Электронно-микроскопическое исследование показало, что ламеллиподия на ведущем краю нормальных клеток представлена густой регулярной сетью

зз

Рис. 15. Ультраструктура актинового цитоскелета контрольного фибробласта МЯС5. А - общий вид протрузии, Б - участок ведущего края с ламсллиподией и филоподиями, В - большое увеличение, упорядоченная сеть актина в ламеллиподии; Г - участок стабильного края, Д - большое увеличение краевого пучка.

микрофиламентов (Рис. 15, А, Б, В), на краю которой видны окончания отдельных филаментов и с очень небольшими "дырками" в сети. Вдоль стабильного края клетки идет мощный пучок актиновых филаментов и с внешней стороны от этого пучка нет ни филоподий, ни ламеллиподий.

Рис. 16. Ультраструктура актинового цитоскелета клетки МЯС-5У2. А. Общий вид клетки Б. Тонкий «краевой пучок» актина (АП) в хвостовой части клетки с мелкими ламеллиподиями (Л), выходящими за его границы. В. Сильно-активный участок ведущего края, отмеченный белой рамкой на А. Видна небольшая ламеллиподия с нерегулярной актиновой сетью. Г. Слабоактивный участок края в боковой части клетки. Виден тонкий актиновый пучок (АП) и ламеллиподия (Л) с нерегулярной сетью актиновых микрофиламентов.

На Рис. 16 приведены платиновые реплики клетки М11С-5У2, как пример Ультраструктуры цитоскелета трансформированной клетки. На активном краю видны раффлы, ламеллиподия представлена гораздо менее упорядоченной сетью филаментов с большими "дырами" (Рис. 16 В). Вдоль боковой границы клетки идет тонкий и не плотный краевой пучок актина, который не ограничивает образования мелких ламеллиподий (Рис. 16 В, Г) или филоподий (Рис. 16 Г) с внешней стороны.

Таким образом, полученные данные подтверждают отсутствие «истинно стабильного края» у трансформированных клеток

ЛОКОМОТОРНОЕ ПОВЕДЕНИЕ НОРМАЛЬНЫХ И

ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ

Задачей настоящей работы было выяснение вопроса как описанные нами изменения, возникающие при трансформации, влияют на локомоторную активность клеток. Для более объективной оценки локомоторных способностей клеток мы применили несколько методов оценки эффективности миграции: индивидуальная миграция одиночных клеток в отсутствии специфических стимулов, миграция клеток в экспериментальную рану и миграция клеток через миллипоровые фильтры, без дополнительного покрытия (ЗТ) субстрат) или покрытые матригелем (модель инвазии). Во всех опытах были получены существенные различия в локомоторном поведении контрольных и трансформированных клеток, как на двумерном, так и на трехмерном субстрате.

Существенные различия наблюдались в количестве клеток, вышедших в экспериментальную рану за 24 часа: в зависимости от культуры число вышедших в рану трансформированных клеток превышало количество контрольных в 2-10 раз (Рис. 17).

Рис. 17. Увеличение в результате трансформации кол-ва клеток, мигрировавших в экспериментальную рану

Различия между нормальными и трансформированными клетками при анализе расстояния, на которое мигрировали клетки разных линий, были выражены гораздо меньше. Трансформированные клетки двигались в рану фронтом, в отличие от нормальных клеток, которые двигались поодиночке. Необходимо отметить, что клетки фибросаркомы могли открепляться от монослоя и «высеваться» в свободную область экспериментальной раны, и таким образом оккупировали свободный субстрат гораздо скорее, чем остальные исследованные линии.

При анализе движения одиночных клеток без дополнительного стимула оказалось, что, вопреки ожиданиям, общий путь, пройденный трансформированными клетками не увеличивался по сравнению с контрольными. Так, различия между контрольными и трансформированными клетками в Пае-системе оказались недостоверными, а общий путь, пройденный БУ40-трансформированными клетками и клетками фибросаркомы, оказался в 1,8-3,1 раза меньше, чем путь, пройденный контрольными клетками.

Таким образом, скорость движения одиночных Ыаз-трансформированных клеток немного возросла, а скорость движения 5У40-трансформированных клеток и клеток фибросаркомы даже снизилась. Стоит отметить, что скорость движения одиночных клеток наиболее морфологически трансформированных линий была более низкой, а именно 6 и 8 мкм/ч у МИС-5У2 и НТ-1080 соответственно. Наиболее важным в изменении характера миграции было то, что движение клеток всех исследованных трансформированных линий стало более ненаправленным (Рис. 18).

Уменьшение направленности движения, которое можно выразить с помощью отношения эффективного пути к общему пройденному пути (О/Т), четко коррелировало со степенью выраженности морфологической трансформации. Так, коэффициент Б/Т для контрольных клеток равнялся 0,71-0,77 и снижался до 0,51-

0,66 у трансформированных клеток.

Нужно отметить, что среди М11С-5У2 и клеток фибросаркомы наблюдалось значительное количество «стоячих» клеток. Ядра этих клеток хаотически смещались на небольшие расстояния и постоянно меняли направление движения. Часть этих клеток готовилось к делению, чем можно объяснить остановку движения. Другие явно относилась к интерфазным клеткам, но, тем не менее, не совершали направленного движения, в отличие от большинства одиночных контрольных клеток. Это свидетельствует о том, что часть трансформированных клеток попросту не способна выбрать единое направление движения в отсутствии дополнительного стимула, вероятно из-за перераспределения краевой активности вдоль всего периметра клетки и отсутствия поляризации. Примечательно, что наименьшее расстояние проходят клетки культуры НТ-1080. Для этих клеток

показана способность переходить от мезенхимального движения к амебоидному и инвазировать матригель (Wolf and Friedl, 2009; наши данные), возможно такой переход способствует продвижению клеток в трехмерном матриксе, но мешает движению клеток на двумерном субстрате.

КОНТРОЛЬ

• • *• , 1 i • ш it

10(3)

^igi; • MRC-? Д • • ,t

* . 4* л„ 103< • {' Л

ТРАНСФОРМАЦИЯ

• Л • > _

10(3)RAS s s

ф- • 0ч 2ч 4ч 6ч 8ч

• •

Рис. 18. Общий путь миграции (треки) клеток контрольных (10(3), MRC-5, 1036) и трансформированных (10(3)RAS, MRC-5V1, MRC-5V2, НТ-1080) культур за 8 часов.

При оценке движения клеток в трехмерном субстрате через фильтры и матригель наблюдалась иная картина. В результате Ras-трансформации клетки приобрели способность к трехмерной миграции, которая отсутствовала у контрольных 10(3) фибробластов. Контрольные человеческие фибробласты (MRC-5) исходно обладали способностью к трехмерной миграции, но в результате SV40-трансформации эта способность значительно увеличилась и была сравнима со способностью к трехмерной миграции у клеток саркомы. Кроме того, все исследуемые трансформированные линии, кроме 10(3)RAS, приобретали способность к инвазии, выраженную в проценте инвазии от 13-14% для SV40-трансформированных линий до 47% для линии фибросаркомы (Рис. 19). Данные результаты согласуются со способностями данных линий расти в матригеле, описанными другими авторами (Huschtscha and Holliday, 1983; Wolf et al, 2003).

Рис. 19. Способность клеток исследуемых культур к трехмерной миграции и инвазии.

Таким образом, наиболее активными в опытах по трехмерной миграции оказались клетки «наименее приспособленные» к индивидуальному движению на двухмерном субстрате (стекле), а также, обладающие способностью отделяться и «высеваться» из клеточного монослоя. В большей степени это касается клеток НТ-1080 и клеток MRC-5V2, характеризующиеся наибольшими морфологическими изменениями: крайней степенью редукции актиновых пучков и фокальных контактов, практически полным отсутствием поляризации и стабильного клеточного края, наличием активного дорзального раффлинга и «блеббообразных» утолщений в зоне ведущего края. Это может свидетельствовать о том, что перераспределение псевдоподиальной активности скорее необходимо не для увеличения скорости миграции (особенно на искусственном двумерном субстрате не характерном для биологических систем), а для облегчения поиска клеткой путей инвазии. Так, поведение исследуемых нами трансформированных клеток сходно с поведением лейкоцитов при их проникновении в кровяное русло. (Nourshargh et al, 2010). Как показали недавние исследования, лейкоциты мыши при попытке преодолеть стенку сосуда проявляют «поисковое» поведение в ответ на множественную стимуляцию воспалительными факторами, выбирая для миграции места, свободные от перицитов (Wang et al., 2006; Voisin et al, 2010). Скорее всего, наблюдаемое нами ненаправленное «поисковое» движение, сопровождающееся увеличением раффлинга и наличием «блеббообразных» натеков у трансформированных клеток является аналогом подобного движения на двумерном субстрате. Тем более, что одна из используемых нами линий (НТ-1080), для которой характерны все вышеперечисленные изменения способна легко переключаться с одного типа движения на другой, за счет изменения баланса малых ГТФаз семейства Rho (Yamazaki, 2005).

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ, ЛЕЖАЩИХ В ОСНОВЕ ПРИОБРЕТЕНИЯ КЛЕТКАМИ ИНВАЗИВНОГО ФЕНОТИПА.

Анализ экспрессии Ras в клетках исследуемых культур.

Рис. 20. Анализ экспрессии Ras в клетках исследуемых культур. Окрашивание антителами panRas (р21) и GTU88 (к у-тубулину, р48).

С помощью иммуноблотинга было показано, что вне зависимости от способа трансформации (онкогеном Ras, вирусом SV40 или при исследовании клеток из опухоли), повышенная экспрессия Ras наблюдалась в клетках всех трансформированных линий. Многими исследованиями показано, что активация Ras приводит к увеличению активности малой ГТФ-азы Rac (Bag-Zagi and Hall, 2000; Lambert et al., 2002; Reparsky et al., 2004; Strumane et al., 2006). Повышение активности Rac в свою очередь активирует белки WAVE, обеспечивающие Агр2/3-опосредованную полимеризацию актина и образование протрузий (Ridley et al., 1992; Ridley, 2001; Burridge and Wennerberg, 2004), и таким образом приводит к усилению полимеризации актина и образования псевдоподий. Поэтому активизацию псевдоподиальной активности на ведущем краю клеток при трансформации можно, хотя бы частично объяснить повышением активности Ras. Кроме того, показано, что усиленная экспрессия N-RAS приводит к увеличению количества дефосфорилированного кофилина (Chan et al., 2000; DesMarais et al., 2005), который в свою очередь может разрезать актиновые филаменты в составе краевых пучков, высвобождая свободные плюс-концы, стимулируя, таким образом, полимеризацию новых филаментов, приводящая к образованию новых протрузий. Этот факт хорошо объясняет ослабление и разрушение краевых пучков актиновых филаментов в результате трансформации. Разрушение краевых пучков ведет к потере истинно стабильных краев фибробластов, и, тем самым, к нарушению поляризации и перераспределению псевдоподиальной активности вдоль периметра клетки, описанной нами в настоящей работе.

Для того, чтобы выяснить, не вызвана ли выявленная разница в способности инвазировать матригель между нормальными и трансформированными клетками появлением активности металлопротеаз у исследованных трансформированных клеток, был проведен анализ активности металлопротеаз в исследуемых линиях методом зимографии.

у-туб

Ras

Рис. 21. Определение активности матриксных ммрэ металлопротеаз у клеток исследуемых линий. ММР2 Зимография. Окраска геля кумасси.

Наиболее высокая активность ММР2 наблюдается у фибробластов 1036. Активность металлопротеаз у всех линий - производных эмбриональных легочных фибробластов находится на одинаковом уровне, а у клеток фибросаркомы НТ1080 активность ММР2 даже понижена, но фиксируется активность ММР-9, что согласуется с результатами, полученными другими авторами для этих клеток ранее.

Таким образом, появление способности к инвазии в наших клеточных системах нельзя объяснить повышением активности металлопротеаз, т.е. действительно, инвазивное поведение этих клеток связано с изменением характера и распределения краевой активности, в основе которых лежат описанные выше изменения цитоскелета.

Анализ вклада малой ГТФ-азы Юю в формирование "трансформированного" фенотипа.

На разных клеточных системах нами было показано, что нарушение акто-миозиновой сократимости у фибробластов ведет не только к утрате актиновых стресс-фибрилл и нарушению созревания фокальных контактов , но и к существенному изменению формы клеток. Сравнение клеток, обработанных ингибиторами акто-миозиновой сократимости с клетками, трансформированными N-1^, показало, что изменения цитоскелета и морфологии клеток в обоих случаях напоминают друг друга. Как трансфекция онкогена Каэ, так и обработка клеток ингибиторами сократимости приводит к уменьшению площади, которую клетка занимает на субстрате. Причем совместное действие онкогена и ингибиторов этот эффект не усиливает. Так же при обоих типах обработок существенно усиливается как дисперсия, так и элонгация клеток. Ранее было показано, что обработка клеток ингибиторами сократимости не только не нарушает направленного клеточного движения, но даже ведет к увеличению скорости движения клеток (Рис 2). При сравнении подвижности клеток, трансформированных N-1^ и клеток, обработанных ингибиторами сократимости, оказалось, что в обоих случаях повышается их миграционная способность (Рис. 22).

Рис. 22 Изменение

миграционных

способностей

фибробластов ЯЕР52

в результате

трансформации

онкогеном М-Яаз или

обработки

ингибиторами

сократимости.

І-, жм

Рис. 23. Влияние экспрессии онкогена Лае, перекиси водорода и антиоксиданта ЫАС на актиновый цитоскелет (зеленый) и строение фокальных контактов (красный) крысиных фибробластов линии 11ЕР52. А - контрольные ЯЕР52, Б - ЯЕР52, обработанные перекисью водорода (50 мкМ), В - ЯЕЕ52, трансформированные М-Яав, Г - ЯЕР52, трансформированные М-Лав и обработанные ИАС (5мМ).

- контроль -+У27632 -+Ь1еЬЬі5Іаїіп -РАБ

Таким образом, понижение активности Rho ведет к появлению у клеток некоторых морфологических признаков трансформации, а так же ведет к ускорению их движения на субстрате. Как было показано ранее (Рис. 3), клетки в присутствии ингибиторов Rho не могут формировать нормальный монослой, а формируют псевдо-многослойную культуру, довольно сильно наползая друг на друга, и этим они так же похожи на трансформированные клетки.

Исходя их полученных результатов, можно предположить, что на ранних стадиях трансформации (в нашем случае трансформация одним онкогеном Ras) первичные морфологические изменения могут быть вызваны снижением контрактильности у клеток, вероятно за счет нарушения активности Rho-киназы.

Выяснение роли уровня активных кислородных радикалов в формировании "трансформированного" фенотипа

Для выяснения возможных молекулярных механизмов, лежащих в основе этих изменений, исследовали роль повышения реактивных кислородных радикалов (ROS) на морфологию, цитоскелет и подвижность клеток. Ранее в некоторых работах было показано, что повышенная экспрессия Ras может приводить к увеличению внутриклеточного содержания активных кислородных радикалов (Reactive Oxigen Species (ROS)) Мы решили проверить, как повышение активности ROS в клетке влияет на ее морфологию и способность к миграции. В этой серии экспериментов мы использовали эмбриональные фибробласты крысы REF52, а так же эти клетки, трансфицированные нерегулируемым конститутивно активным онкогеном N-Ras D13 и конститутивно активным онкогеном N-Ras под тетрациклиновым супрессором (линии REF52/tetRas и REF52/Ras соответственно). Клетки (REF52/tetRas культивировали в присутствии 1 мг/мл тетрациклина (Sigma). Отмывка тетрациклина приводила к индукции экспрессии онкогена Ras. Тетрациклин отмывали за 4-9 дней до эксперимента. Увеличение ROS в среде вызывали добавлением перекиси водорода, а редукцию количества ROS вызывали обработкой культуры антиоксидантом N-ацетил цистеином (NAC) в концентрации 5мМ. Было показано, что обработка клеток перекисью водорода (50мкМ в течение 4-24 часов) вызывала увеличение внутриклеточного содержания ROS на том же уровне, что и повышенная экспрессия онкогена Ras.

Контрольные клетки обеих линий имели очень сходную морфологию, и являлись хорошо распластанными фибробластами с ярко выраженными актиновыми пучками и хорошо развитыми фокальными контактами (Рис. 23 А). Экспрессия онкогена Ras в обеих линиях приводила к статистически достоверному уменьшению площади клеток, увеличению их поляризации. При этом наблюдалась существенная редукция актиновых пучков, так же как и уменьшение числа и размера фокальных контактов (Рис. 23 В).

Указанные изменения сопровождались увеличением клеточной подвижности, выражавшейся в усилении миграции клеток, измеренной при помощи теста -"экспериментальной раны" (Рис. 24).

Рис. 24. Влияние экспрессии онкогена Ras и обработки клеток перекисью водорода и антиоксидантом NAC на миграцию крысиных

фибробластов REF52 в экспериментальную рану. Показано количество клеток, мигрировавших в

экспериментальную рану за 24 часа (количество клеток в контроле принято за 100%) Представлены результаты четырех независимых

экспериментов.

Мы показали, что обработка клеток перекисью водорода вызывается такие же изменения морфологии, актинового цитоскелета и фокальных контактов, как и повышенная экспрессия онкогена Ras, а именно значительное уменьшение площади клеток, увеличение индексов дисперсии и элонгации, появление большого числа мелких отростков, и к редукции актинового цитоскелета и фокальных контактов(Рис. 23Б). Кроме того перекись водорода, так же как и экспрессия Ras, приводит к значительному увеличению количества клеток, мигрировавших в экспериментальную рану (Рис. 24).

Также мы показали, что сходные изменения морфологии и миграционных способностей клеток были вызваны добавлением антралина. Антралин - агент, который вызывает увеличение внутриклеточных ROS по механизму, совершенно отличному от перекиси водорода (К. Muller, 1996), таким образом существенным моментов в действии обоих этих веществ на морфологию и подвижность клеток является повышение уровня внутриклеточных ROS.

Обработка клеток антиоксидантом NAC снижает уровень ROS в Ras-трансформированных клетках, что вызывает частичную реверсию Ras-индуцированных изменений и в REF52/Ras и в REF52/tet-Ras культурах. Степень поляризации трансформированных клеток снижается и становиться сравнимой с поляризацией контрольных клеток, площадь также увеличивается, хотя и не достигает контрольного уровня. Обработка контрольных REF52 клеток антиоксидантом NAC приводила к росту появлению новых актиновых пучков, а так же к увеличению количества и размеров фокальных контактов. Эти

300 250 200 150 -100 50 -

0 контроль Н202

1_ NAC

REF52

REF52-Nras

морфологические изменения, вызванные обработкой трансформированных клеток N/40, сопровождались существенным подавлением миграции клеток (Рис.24). Было показано, что изменение уровня ЛОБ, как в результате Идз-трансформации, так и при действии перекиси водорода, ведет к повышению активности малой ГТФазы Яас1 и изменению уровня фосфорилированного кофилина. Участие Яас 1 и кофилина в регуляции миграции и морфологических реакций клеток описано ранее и воздействие ЛОБ на эти регуляторные пути хорошо объясняют описанные нами изменения.

Таким образом, мы показали, что, по крайней мере, частично влияние онкогена Я аз на морфологию, цитоскелет, адгезионные структуры и подвижность фибробластов может объясняться повышением уровня КОБ в клетках.

ВЫВОДЫ

1. Наиболее важным этапом, определяющим движение клеток, является формирование активного ведущего края. Акто-миозиновая сократимость существенна для упорядочивания движения и правильного формирования клеточных слоев.

2. На ведущем краю клетки существуют две зоны - ламеллиподия и ламелла, отличающиеся по строению и динамическим характеристикам. Динамика актинового тока в ламеллиподии обеспечивается за счет полимеризации актиновой сети на краю клетки, медленный ток актина в ламелле обеспечивается за счет акто-миозинового сокращения.

3. В зоне ламеллиподии формируются инициальные фокальные адгезии (ФА), которые определяют положение границы ламеллиподия-ламелла. Формирование новой адгезии вызывает сдвиг этой границы вперед и последующее выдвижение ламеллиподии, т.е. является инициирующим шагом в выдвижении активного края. В точках первичных ФА происходит реорганизация актинового цитоскелета из однонаправленной сети, характерной для ламеллиподии в сократимые пучки микрофиламентов, включающие в себя филаменты разной направленности и миозин II.

4. Первым шагом образования ФА является формирования инициальных ФА, в которых концентрируется белок УАБР. Остальные белки контактов встраиваются в структуру инициального контакта с задержкой от 0.5 до нескольких минут. Стадия инициальных ФА является обязательной при формировании адгезионных структур, но только некоторые из инициальных ФА созревают в более крупные адгезионные структуры - фокальные комплексы и фокальные контакты. Структура актинового цитоскелета в местах инициальных ФА не отличается от структуры окружающей ламеллиподии; пучки микрофиламентов, типичные для фокальных

комплексов и фокальных контактов появляются при их дальнейшем созревании.

5. При неопластической трансформации фибробластов происходит перераспределение краевой активности, существенно увеличивается доля активного края и соответственно сокращается доля стабильного края. Эти признаки нарастают по мере нарастания степени трансформации клеток и могут служит еще одним морфологическим критерием клеточной трансформации.

6. В результате трансформации меняется ультраструктура актинового цитоскелета. Актиновая сеть в ламеллиподии становится менее регулярной, появляется большое количество «дырок» в подмембранном слое микрофиламентов. Краевой актиновый пучок в боковых и хвостовой частях клетки существенно редуцирован и не обеспечивает стабильность клеточного края.

7. При трансформации клеток существенно изменяется не только распределение, но и характер псевдоподиальной активности: протрузии на переднем крае становятся более мелкими, а частота их образования и частота образования раффлов значительно возрастает. Эти - изменения коррелируют с изменениями строения актиновой сети ламеллиподии, а также с отсутствием полноценных контактов клетки с субстратом.

8. По мере нарастания таких признаков трансформации, как изменения

цитоскелета и перераспределение активности ведущего края, изменяется характер миграции клеток. Движение одиночных трансформированных клеток носит менее направленный характер и скорость их миграции падает, в основном в результате отсутствия поляризации активности на ведущем крае. Одновременно появляется и/или усиливается способность к ЗЭ миграции и способность к инвазии. .

9. Одним из молекулярных механизмов, лежащих в основе указанных изменений цитоскелета в результате трансформации является возрастание уровня реактивных кислородных радикалов (1105) в результате оверзкспрессии онкогена Н-Яаз, приводящих к повышению активности малой ГТФазы 11ас и заметному увеличению активного (дефосфорилированного) кофилина. Обработка таких клеток антиоксидантом ИАС (И-ацетил цистеином) приводит к нормализации фенотипа и подвижности клеток.

10.Перераспределение псевдоподиальной активности, вызванное изменениями структуры актинового цитоскелета, в результате которого трансформированные клетки легко меняют направление движения, является определяющим в проявлении способности опухолевых клеток к инвазии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК

1. Alexandrova A., Dugina V.B., Paterson Н., Bershadsky A.D. Motility of intracellular particles in rat fibroblasts is greatly enhanced by phorbol ester and by over-expression of normal N-ras product //Cell Motility and Cytoskel., 1993, Vol.25, P. 254-266

2. Dugina V.B., A.Alexandrova, K.Lane, E.Bulanova, Vasiliev J. The role of the microtubular system in response to HGF/SF //J.Cell Sci., 1995, Vol.108, P. 1659- 1667

3. Alexandrova A.Y.,.Dugina V.B., Ivanova O.J., Kaverina I.N., Vasiliev J.M Scatter factor induces segregation of multinuclear cells into several discrete motile domains // Cell Motil.Cytoskel, 1998, Vol.39, P.147-158

4. Александрова А.Ю., Иванов A.A., Чумаков П.М., Копнин Б.П., Васильев Ю.М., Changes in р53 Expression Can Modify Motility of Mouse Fibroblasts and Extracellular Matrix Organization //Oncogene, 2000, Vol. 19, P. 5826-5830

5. Дугина В.Б., Александрова А.Ю., Габбиани Д., Васильев Ю.М. Влияние акто-миозиновой сократимости на фокальные контакты миофибробластов и структуру стресс-фибрилл // Цитология, 2002, Т. 44, С. 48-55

6. Минина С. А., Александрова А.Ю., Васильев Ю. М. Изменение формы клеток и актинового цитоскелета при трансформации, вызванной онкогеном RAS; возможная роль RHO-киназы // Доклады Академии Наук, 2003, Т.388, С. 1-3

7. Alexandrova A.Y.,_Kopnin Р.В., Vasiliev J.M., Kopnin B.P. ROS Up-Regulation Mediates Ras-Induced Changes of Cell Morphology and Motility // Experimental Cell Research, 2006, Vol. 312, P. 2066-2073

8. Bershadsky A.D,_Ballestrem C, Carramusa L, Zilberman Y, Gilquin B, Khochbin S, Alexandrova A.Y., Verkhovsky A.B., Shemesh T, Kozlov M.M. Assembly and mechanosensory function of focal adhesions: experiments and models // European Journal of Cell Biology, 2006, Vol. 85, P. 165-173

9. Александрова А.Ю._Эволюция взаимодействий клеток с внеклеточным матриксом в канцерогенезе // Биохимия, 2008, Т.73, С. 915-924

10. JShutova М. S.,.Alexandrova A. Y., and Vasiliev J. M. Regulation of Polarity in Cells Devoid of Actin Bundle System After Treatment With Inhibitors of Myosin II Activity // Cell Motility and Cytoskeleton, 2008; Vol.65, P. 734-46.

11. Alexandrova AY, Arnold K, Schaub S, Vasiliev JM, Meister J-J. Comparative Dynamics of Retrograde Actin Flow and Focal Adhesions: Formation of Nascent Adhesions Triggers Transition from Fast to Slow Flow // PLoS ONE, 2008, Vol 3, e3234

12. Александрова А.Ю. Механизмы миграции культивируемых клеток//Сборник “Методы культивирования клеток” Изд-во Политехнического университета, г. Санкт-Петербург, 2008, С. 40 - 55.

13. Ломакина М.Е., Александрова А.Ю. Анализ изменений, вызываемых экспрессией онкогена N-RAS в характере и распределении псевдоподиальной активности фибробластов // Онтогенез, 2009, Т. 40, С.282-293

13a. Lomakina М. Е. and Alexandrova A. Y. Analysis of Changes Induced by Oncogene N-RAS Expression in Pattern and Distribution of Pseudopodial Activity of Fibroblasts // Russian Journal of Developmental Biology (ISSN 1062-3604), 2009, Vol. 40, P. 222231.

14. Шутова M.C. Александрова А.Ю. Сравнительное исследование распластывания нормальных и трансформированных фибробластов: роль полимеризации микрофиламентов и актин-миозинового сокращения // Цитология, 2010, Т.52, С. 41-51

14а. Shutova М. S. and Alexandrova A. Y. Normal and Transformed Fibroblast Spreading: Role of Microfilament Polymerization and Actin-Myosin Contractility //Cell and Tissue Biology (ISSN 1990_519X), 2010, Vol. 4, P. 25-35.

Тезисы докладов на конференциях:

15. Александрова А.,.Дугина В.Б., Бершадский А.Д., Васильев Ю. Регуляция скорости движения внутриклеточных частиц // Цитология, 1992, Т.34, N9, С. 46-47

16. Александрова А.,.Дугина В.Б. Роль движения внутрикле-точных частиц в процессе формирования ламеллярной цитоплазмы // Сборник тезисов Межд.симп. „Биол.подвижн., Пущино, 1994, С. 207-208

17. Дугина В.Б., Александрова А. Участие микротрубочек в процессе морфологических изменений эпителиальных клеток под действием рассеивающего фактора (HGF/SF) // Сборник тезисов Межд.симп. Биол.подвижн.,, Пущино, 1994, С. 213-214

18. Alexandrova A.. Role of the motility of intracellular particles during lamella formation // Asia Pac.J.Molec. Biol. Biothec., 1994, V.2, N3, P. 273

19. Alexandrova A., Dugina V.B. The significance of the microtubular system in response of the epithelial cells to HGF/SF // The Cytoskel. and Cell Function Meet. Cold Spring Harbor NY, 1995, P. 20

20. Dugina V., Alexandrova A., Vasiliev J.M. The effect of microtubular drugs on the cytoskeletal reorganization of polynuclear MDCK cells induced by HGF/SF // Int.Congr."Cytoskeleton and Cancer", Les Embiez(Var), France, 1995, P. 78

21. Дугина В.Б., Александрова А.Ю., Каверина И.Н. Сегрегация цитоплазмы многоядерных клеток на независимо движущиеся фрагменты под действием скеттер-фактора//Цитология, 1996, Т.38, С. 198

22. Alexandrova A.Y., Dugina V.B., Kaverina I.N. Segregation of polynyclear epithelial cells induced by scatter factor (HGF/SF) // Molecular Biol.Cell., 1996, V.7,142a

23. Александрова А., Дугина В., Иванова О., Каверина И., Васильев Ю. Сегрегация многоядерных эпителиальных клеток на несколько подвижных доменов //Тез. Докл. на 2-ом Съезде биофизиков России, С.37

24. Alexandrova A., Chumakov P., Kopnin В., Vasiliev J. Cell morphology and extracellular matrix organization are controlled by p53 expression // Molecular Biology of the Cell, 1999, Vol.10, P. 143a

25. Александрова А.Ю, Иванов А.А.,Чумаков П.М., Копнин Б.П., Васильев Ю.М. Влияние экспрессии р53 на морфологию клетки, структуру цитоскелета и образование внеклеточного матрикса // Сборник тезисов конференции «Цитокелет и клеточная регуляция». Пущино, 11-12 мая, 2000, С.5

26. Alexandrova A.Y., Verkhovsky А.В., Arnold Е., StutmanM., Schaub S., Meister J-J., Geiger B., BershadskyA. Dynamic coupling between actin flow and focal adhesion sites //Journal of molecular cell biology, 2001, P. 215a

27. Копнин Б.П., Саблина A.A., Александрова А.Ю., Чумаков П. Новая функция опухолевого супрессора р53: контроль архитектуры, адгезии и миграции клеток // Тезисы конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза», Москва, 2001, С. 19-20

28. Alexandrova A.Y., Verkhovsky А.В., Arnold Е., Stutman М., Schaub S., Meister J-J., Geiger B., BershadskyA. Dynamic coupling between actin cytoskeleton and focal contacts //Program and abstracts of 17th European Cytoskeleton Forum, Nyon-Geneva, Switzerland, 2002, P.72

29. Александрова А., Верховский А.. Динамика активного края распластывающихся фибробластов // Цитология, 2003, Т. 45, №9, С.841-842

30.Resch G.P.; Alexandrova A., Small J.V. Correlating ultrastructure and dynamics in the actin cytoskeleton // Abstract book of FEBS special Meeting on Cytoskeletal Dynamics: From Cell Biology to Development and Disease, June 12-14,2004, Helsinki, Finland, P.70

31. Bershadsky A.D., Ballestrem C., CarramusaL., Zilberman Y., Arnold K., Geiger B., Alexandrova A.Y., Verkhovsky A.V., Shemesh Т., Kozlov M.M. Mechanosensory function of focal adhesions: experiments and models //Adhesion meeting Podosomes-invalopodia-focal adhesions. Munich, April 28-30, Germany, 2005, P.33.

32. Alexandrova A.,_Resch G.P., Small J.V. Actin filament reorganisation during early adhesion formation in migrating cells // FEBS/ESF Advanced workshop on Integrated approaches in Cytoskeleton Research. Abstract Book August 27-31,2005, Luxembourg, P.27

33. Шутова М., Александрова А. Как ползет клетка. Перестройки цитоскелета, обеспечивающие движение клеток в культуре, роль актина и миозина 2. Молекулярные механизмы процессов онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция //Сборник тезисов конференции, Москва 15-16 мая, 2006, С. 26

34. Александрова А.Ю, Шутова М.С. Ведущая роль Агр 2/3-зависимой полимеризации актина и формирования первичных адгезионных структур в перестройках актинового цитоскелета, обеспечивающих движение клеток в культуре // Цитология, 2006, Т.48, №9, С.741

35. Ваулина М.Е., Александрова А. Влияние экспрессии онкогена N-RAS на псевдоподиальную активность фибробластов при их движении // Цитология, 2006, Т.48, №9, С. 749-750

36. Шутова М.С., Александрова А. Исследование подвижности нормальных фибробластов. Роль актин-миозинового сокращения // Цитология, 2006, Т.48, №9, С.813-814

37. Александрова А.Ю. Механизмы миграции культивируемых клеток // Тез. лекции на школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клетокС-Петербург, 6-10 октября », 2008, С. 40-55

38. Александрова А.Ю., Ломакина М.Е., Шутова М.С., Васильев Ю.М.

Реорганизация актинового цитоскелета фибробластов в процессе движения. Нарушения, приводящие к инвазии при опухолевой трансформации // Доклад на XI1 Российском онкологическом конгрессе, Москва, 18-20 ноября, 2008, С. 7

39. Александрова А.Ю. Нарушения регуляции подвижности фибробластов, лежащие в основе инвазии и метастазирования // Вопросы онкологии, 2008, Т.54, №54, С. 3-

40. Ваулина М.Е., Александрова А.Ю. Изменение распределения и характера псевдоподиальной активности в процессе трансформации фибробластов // Вопросы онкологии, 2008, Т.54, №54, С. 7-8

41. Shutova M.S., Alexandrova A.Y., Vasiliev J.M., SvitkinaT.M. Roles of myosin II in initiation of focal adhesion assembly during their restoration after blebbistatin treatment // The American Society for Cell Biology, 49th Annual Meeting, San Diego, 2009, P.84

42. Ломакина M.E., Александрова А.Ю. Анализ псевдоподиальной активности и локомоторного поведения трансформированных фибробластов // Сборник тезисов 13 международной пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века", 2009, С. 107-108

43. Ломакина М.Е. Александрова А.Ю. Изменение морфологии и характера миграции фибробластов в результате трансформации вирусом SV-40 // Цитология, 2010, Т.52, №3,С.261-262

44. Lomakina М.Е., Vasiliev J.M., Alexandrova A.Y. Associated Analysis of Protrusive Activity and Motile Behavior of Transformed Fibroblasts // Thesis of International symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies", Pushchino, 2010, P. 152-153

45. Alexandrova A.Y. Actin cytoskeleton reorganization during cell motility //Thesis of International symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies", Pushchino, 2010, P. 12-14.

46. Shutova M.S., Alexandrova A.Y., Vasiliev J.M., Svitkina T.M. Dynamics of actin-myosin and adhesion structures during cell recovery after blebbistatin treatment // Thesis of International symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies", Pushchino, 2010, P. 255-256.

47. Shutova M.S., Alexandrova A.Y., Vasiliev J.M., SvitkinaT.M. Roles of Nonmuscle Myosin II in Lamellipodial Protrusion and Focal Adhesion Initiation // The American Society for Cell Biology, 50th Annual Meeting, Philadelphia, PA, 2010, P.1217

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВКМ Внеклеточный матрикс

МАП Мезенхимально-амебоидный переход

ММП Матриксные металлопротеазы

ТРИТЦ Тетраметилродамин-5- (б)-изотиоцианат

ФА Фокальная адгезия

ФИТЦ Флуоресцеин-изотиоцианат

ЭМП Эпителио-мезенхимальный переход

HGF/SF Фактор роста гепатоцитов/скэттер фактор

IRM Интерференционно-рефлекторная микроскопия

NAC N-ацетил цистеин

PBS Фосфатный буфер

PFA Фиксирующий раствор параформальдегид

РМА форболовый эфир (phorbol I2-myristate 13-

acetate)

ROS Активные кислородные радикалы

VASP Vasodilator-stimulated phosphoprotein

Заказ № 6509 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Александрова, Антонина Юрьевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цели и задачи.

Научная новизна и практическая ценность

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. 17 L ОРГАНИЗАЦИЯ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА КЛЕТОК ПОЗВОНОЧНЫХ.

ГЛАВА 1. БЕЛКОВАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА

1.1. Актин - основной белок микрофиламснтов

1.2. Белки, индуцирующие полимеризацию актина

1.2.1. Arp2/3 (Actin-related Protein) комплекс

1.2.2. Формипы

1.2.3. УУН2-домен-содержащие актиновые нуклеаторы

1.3. Белки, регулирующие динамику актиновых филаментов в клетке

1.3.1. Кэпирующие белки

1.3.2. VASP (Vasodilator-stimulatedphosphoprotein)

1.3.3. ADF/кофилин (Actin Depolimerasing Factor)

1.4. Белки, регулирующие трехмерную организацию актина

ГЛАВА 2. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИНА В ПОДВИЖНОЙ КЛЕТКЕ

ФИБРОБЛАСТЕ)

2.1. Строение актинового цитоскелета фибробласта

2.2. Дискуссия о строении актииовой сети в ламеллиподии - ветвятся 29 ли актиновые филаменты в живых клетках?

ГЛАВА 3. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ ФОКАЛЬНЫХ АДГЕЗИЙ, РАЗНЫЕ 33 ТИПЫ АДГЕЗИЙ, СВЯЗЬ С ЦИТОСКЕЛЕТОМ.

ГЛАВА 4. РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ДВИЖЕНИЯ МАЛЫМИ

ГТФ-азами СЕМЕЙСТВА RHO.

ОСТАЮЩИЕСЯ ВОПРОСЫ ш ДВИЖЕНИЕ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК

ГЛАВА 5. СПОСОБЫ МИГРАЦИИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК

5.1. Коллективная миграция

5.2. Мезенхимальиый способ миграции

5.3. Амебоидный способ миграции

5.4. Пластичность, как свойство опухолевых клеток

ГЛАВА 6. ОСОБЕННОСТИ ЦИТОСКЕЛЕТА ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ

КЛЕТОК.

ГЛАВА 7. ИЗМЕНЕНИЕ СТРУКТУРЫ И СТРОЕНИЯ АДГЕЗИОННЫХ

КОНТАКТОВ КЛЕТКА-МАТРИКС В ПРОЦЕССЕ

КАНЦЕРОГЕНЕЗА.

7.1. Изменение белкового состава фокальных адгезий в процессе канцерогенеза.

7.2. Приобретение нового типа адгезионных структур в процессе канцерогенеза. Подосомы

7.3. Дальнейшая дедифференцировка ведет к ослаблению взаимодействия клеток с ВКМ.

7.4. Изменение состава внеклеточного матрикса в процессе канцерогенеза

ГЛАВА 8. УЧАСТИЕ МАЛЫХ ГТФаз В ПРОЦЕССАХ ИНВАЗИИ И

КАНЦЕРОГЕНЕЗА

ОСТАЮЩИЕСЯ ВОПРОСЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры.

Методы световой микроскопии

Фазовый контраст с компьютерным усилением

Флуоресцентная микроскопия

Конфокальная микроскопия

Интерференционно-отражательная микроскопия (ШРмикроскопия).

TIRF- м икроскоп ия

Видеосъемка

Трансфекция живых клеток, использованные конструкты 55 Анализ динамики формирования и подвижности клеточных структур. Кимограммы.

Использованные ингибиторы и модуляторы движения

Анализ морфологии клеток.

Электронная микроскопия

Метод платиновых реплик 58 Коррелятивная электронная микроскопия, негативный контраст

Электронная томография

Исследование клеточной подвижности 60 Подвижность индивидуальных клеток. Анализ характера псевдоподиальной активности.

Анализ характера и направления миграции

Миграция одиночных клеток в редкой культуре

Анализ миграции клеток в экспериментальную рану

Анализ миграции и инвазии клеток в камерах Бойдена

Инвазия в матригель

Определение активности Ras.

Зимография

Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

I. ИССЛЕДОВАНИЕ РЕОРГАНИЗАЦИИ ЦИТОСКЕЛЕТА, ЛЕЖАЩЕЙ В

ОСНОВЕ ДВИЖЕНИЯ НОРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК.

ГЛАВА 1. ИНИЦИАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ ДВИЖЕНИЯ КЛЕТОК.

1.1. ПЕРЕСТРОЙКИ ЦИТОСКЕЛЕТА ЭПИТЕЛИОЦИТОВ ПРИ ИНИЦИАЦИИ ДВИЖЕНИЯ ПОД ДЕЙСТВИЕМ СКЭТТЕР- 66 ФАКТОРА (HGF/SF).

1.2. РАЗДЕЛЕНИЕ НА ФРАГМЕНТЫ МНОГОЯДЕРНЫХ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК MDCK ПОД ДЕЙСТВИЕМ 68 HGF/SF.

1.3. Исследование активации движения клеток под действием форболового эфира РМА.

ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВКЛАДА ДВУХ СОСТАВЛЯЮЩИХ -ПОЛИМЕРИЗАЦИИ АКТИНА И АКТО-МИОЗИНОВОЙ СОКРАТИМОСТИ В ПОДВИЖНОСТЬ КЛЕТОК.

2.1. Исследование влияния ингибиторов сократимости и полимеризации актина на распластывание фибробластов

2.1.1.Динамика распластывания контрольных фибробластов

2.1.2.Влияние ингибиторов сократительной активности миозина 81 II (У27632 и блеббистатина на динамику распластывания нормальных фибробластов).

2.1.3. Влияние ингибиторов полимеризации актина латрункулина А и цитохалазина Д на динамику распластывания нормальных фибробластов.

2.2. Исследование влияния ингибиторов сократимости и полимеризации актина на способность клеток к миграции.

2.2.1.Движение нормальных фибробластов в рану

2.2.2. Движение клеток в присутствии ингибиторов полимеризации актина.

2.2.3. Движение клеток в присутствии ингибиторов сократимости

2.2.4. Формирование монослоя нарушается в присутствии ингибиторов миозиновой сократимости.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИЧЕСКИХ ПРЕОБРАЗОВАНИЙ НА ВЕДУЩЕМ АКТИВНОМ КРАЮ В ПРОЦЕССЕ

РАСПЛАСТЫВАНИЯ И ДВИЖЕНИЯ КЛЕТОК.

3.1. Две зоны ведущего края клетки - ламеллиподия и ламелла

3.2. Разные молекулярные механизмы, регулирующие движение актина в ламелле и ламеллиподии.

3.3. Роль формирования первичных фокальных контактов в динамической организации ведущего края клетки.

3.3.1. Формирование первичных фокальных контактов локально блокирует ламеллиподиальный ток актина.

3.3.2. Ингибирование ламеллиподиального быстрого ретроградного тока блокирует формирование инициальных контактов.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ОБРАЗОВАНИЯ

ИНИЦИАЛЬНЫХ ФОКАЛЬНЫХ АДГЕЗИЙ ПРИ ДВИЖЕНИИ

КЛЕТОК.

4.1. Модели для исследования динамики ФА.

4.2. Формирование VASP-положительных ФА.

4.3. Динамическая колоколизация VASP и винкулина и ультраструктура винкулин-положительных инициальных контактов.

4.4. Динамическая колокализация VASP и зиксина и ультраструктура зиксин-положительных инициальных контактов.

4.5. Динамическая колокализация VASP и бета-З-интегрина.

4.6. Исследование образования инициальных ФА у фибробластов ЗТЗ с помощью электронной томографии.

ОБСУЖДЕНИЕ

II. ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ, ВОЗНИКАЮЩИХ В РЕЗУЛЬТАТЕ

ТРАНСФОРМАЦИИ

ГЛАВА 5. ПОДБОР КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 6.

ГЛАВА 7.

МОРФОЛОГИЯ, СТРОЕНИЕ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА И АССОЦИИРОВАННЫХ С НИМ СТРУКТУР И АНАЛИЗ КРАЕВОЙ АКТИВНОСТИ У КОНТРОЛЬНЫХ И RAS-ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ

Морфология контрольных и Ras-трансформированных фибробластов

Исследование динамики ведущего активного края контрольных и Ras-трансформированных фибробластов

МОРФОЛОГИЯ, СТРОЕНИЕ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА И АССОЦИИРОВАННЫХ С НИМ СТРУКТУР И АНАЛИЗ КРАЕВОЙ АКТИВНОСТИ У КОНТРОЛЬНЫХ И SV40-ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ

Морфология и цнтоскелет контрольных и SV40трансформированыых фибробластов

Распределение и характер псевдоподиальной активности контрольных и 8У40-трансформированыых фибробластов

7.2.1. Морфометрические измерения периметра клеток

7.2.2. Распределение различных форм активности вдоль клеточного края

7.2.3. Распределение маркера образования протрузий Агр2/3-комплекса по периметру клетки

7.3. Ультраструктура актинового цитоскелета у контрольных и SV40-трансформироваиых фибробластов

7.4. Исследование динамики ведущего активного края контрольных и 177 8У40-трансформированных фибробластов

7.4.1. Частота протрузий и раффлов

ГЛАВА 8. МОРФОЛОГИЯ, СТРОЕНИЕ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА И АССОЦИИРОВАННЫХ С НИМ СТРУКТУР; АНАЛИЗ КРАЕВОЙ АКТИВНОСТИ У ПОДКОЖНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА ПО СРАВНЕНИЮ С КЛЕТКАМИ

ФИБРОСАРКОМЫ

8.1. Морфологическое описание исследуемых клеточных культур

8.2. Строение актинового цитоскелета и ассоциированных с ним 181 структур у контрольных подкожных фибробластов и клеток фибросаркомы НТ

8.3. Распределение и характер пссвдоподиальной активности

8.4. Исследование динамики ведущего активного края контрольных фибробластов и клеток фибросаркомы НТ

ГЛАВА 9. ЛОКОМОТОРНОЕ ПОВЕДЕНИЕ НОРМАЛЬНЫХ И

ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ В КУЛЬТУРЕ.

9.1. Изменение локомоторного поведения в системе Ras-трансформации.

9.2. Изменение локомоторного поведения в системе SV-40 трансформации.

9.3. Анализ локомоторного поведения контрольных подкожных фибробластов и клеток фибросаркомы НТ

9.4. Оценка инвазивных способностей трансформированных фибробластов

ГЛАВА 10. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ

МЕХАНИЗМОВ, ЛЕЖАЩИХ В ОСНОВЕ ПРИОБРЕТЕНИЯ КЛЕТКАМИ ИНВАЗИВНОГО ФЕНОТИПА.

10.1. Анализ активности матриксных металлопротеаз в исследуемых линиях.

10.2. Анализ вклада малой ГТФ-азы КЬо в формирование "трансформированного" фенотипа.

10.3. Выяснение роли уровня активных кислородных радикалов в формировании "трансформированного" фенотипа

ОБСУЖДЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Реорганизация актинового цитоскелета, лежащая в основе движения клеток."

Актуальность проблемы

Способность к движению является одним из основных свойств животных клеток. Движение клеток и клеточных слоев лежит в основе таких процессов, как формирование различных органов в эмбриогенезе, заживление ран и развитие воспалительных процессов. Движение клеток бывает очень разнообразно, зависит от типа клеток и от условий, в которых осуществляется миграция. Например, клетки эпителиального происхождения обычно перемещаются группами или целыми слоями, сохраняя при движении межклеточные контакты. Такой тип миграции называется групповым движением клеток. Наоборот фибробласты двигаются в индивидуальном порядке и демонстрируют так называемый мезенхимальный тип клеточного движения. При различных патологиях нарушается характер движения клеток. В частности в процессе развития злокачественных опухолей клетки приобретают способность проникать в соседние ткани и органы (инвазировать) или могут образовывать отдаленные очаги роста -метастазы. Способность клеток опухоли к инвазии и метастазированию является одной из основных причин смертности людей, страдающих от онкологических заболеваний. В процессе опухолевой прогрессии клетки претерпевают существенные морфологические изменения, что и приводит к приобретению ими несвойственных ранее способностей и изменению характера движения. В частности эпителиальные клетки при развитии опухоли претерпевают так называемый эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) при котором нарушаются межклеточные контакты, клетки приобретают фибробластоподобную форму, могут двигаться поодиночке. При этом существенно возрастает возможность их индивидуальной миграции и они могут инвазировать в близлежащие органы. В последнее время был так же описан так называемый мезенхимально - амебоидный переход (МАП), в результате которого клетки начинают двигаться на амебоидный манер, напоминающий движение лимфоцитов. При этом резко увеличивается скорость движения индивидуальных клеток в Зх-мерном матриксе и практически пропадает зависимость движения клеток от контактов с субстратом или активности ферментов, растворяющих матрикс - матриксных металлопротеаз (ММП). Картина усложняется тем, что при определенных условиях клетки могут возвращаться к прежнему способу миграции, что очень затрудняет попытки найти способы регуляции движения и ингибирования инвазии опухолевых клеток. Это свойство опухолевых клеток было описано несколько лет назад и называется пластичность опухолевых клеток (Wolf et а1., 2003). Поэтому чрезвычайно важно знать, какие механизмы отвечают за тот или иной способ миграции и что регулирует движение клеток.

Давно показано, что в основе движения клеток лежат перестройки цитоскелета, в частности актинового цитоскелета. Выделяют несколько основных этапов движения -образование протрузий на ведущем краю клетки, закрепление этих протрузий с помощью адгезионных структур, подтягивание и перенос тела клетки за счет акто-миозинового сокращения. Известно, что основной механизм формирования актиновых филаментов -это полимеризация сети на краю клетки. Однако оставалось неясным, каким образом густая равномерная сеть актина перестраивается в пучки микрофиламентов, способные к сокращению. Так же был неизвестен вклад каждой из составляющих клеточного движения - образования протрузии и акто-миозинового сокращения в эффективность клеточной миграции.

В последнее время был сделан огромный методологический скачок, появились новые методы микроскопии - фазово-контрастная микроскопия с компьютерным усилением, конфокальная микроскопия, электронная томография, открывающие новые возможности в исследовании клеточных структур. С помощью трансфекции белков, меченных флуорохромами, появилась возможность наблюдать за динамикой и активацией индивидуальных белков при движении живых клеток. В связи с этим представляется актуальным с применением этих новых методов исследовать динамику формирования и реорганизации цитоскелета при движении нормальных клеток, чтобы понимать, какие механизмы лежат в основе клеточного движения.

Как уже отмечалось выше, при прогрессии опухолей резко меняется морфология и характер движения клеток. Ранее была описана разница в строении актинового цитоскелета у нормальных и трансформированных клеток. Общепринят факт, что опухолевые клетки отличаются от нормальных отсутствием крупных пучков микрофиламентов - стресс-фибрилл, и крупных зрелых фокальных контактов. Для трансформированных клеток характерно или полное отсутствие пучков микрофиламентов, или остаточные актиновые пучки и наличие мелких точечных фокальных комплексов. Но вопрос о том, как и почему указанные изменения приводят к возникновению у опухолевых клеток способностей к инвазии в соседние ткани, остается открытым.

Цели и задачи.

Исходя из сказанного выше, в нашей работе мы поставили две основные цели:

1. Исследовать перестройки актинового цитоскелета, лежащие в основе движения нормальных клеток, проанализировать вклад разных составляющих - полимеризации актиновой сети и акто-миозиновой сократимости - для обеспечения эффективного клеточного движения, выяснить роль образования адгезионных структур в реорганизации актинового цитоскелета.

Для решения этих целей мы поставили следующие экспериментальные задачи:

1. Используя в качестве активаторов клеточного движения скэттер-фактор (HGF/SF) (для эпителиальных клеток) и опухолевый промотор форболовый эфир РМА (для фибробластов) исследовать изменения морфологии клеток и цитоскелета при инициации движения, определить роль системы микротрубочек и транспорта внутриклеточных частиц в миграции клеток.

3. С применением современных микроскопических техник (видеомикроскопии живых клеток, метода компьютерно-усиленного фазового контраста, видеонаблюдения за меченными белками, инъецированными в клетку и т.д.) исследовать структуру и динамику ведущего края клетки при движении.

8. Для выяснения механизмов изменения клеточной морфологии при трансформации проанализировать влияние экспрессии онкогенов (N-Ras) на морфологию фибробластов. Исследовать изменения морфологии и цитоскелета фибробластов под влиянием активных кислородных радикалов (ROS).

Научная новизна и практическая ценность.

Исследованию подвижности клеток и механизмам, определяющим эту подвижность, уделяется огромный интерес в мире. Благодаря бурному техническому развитию микроскопии в последнее время появилось много новых методов и подходов, позволяющих изучать движение индивидуальных клеток. В нашей работе мы использовали уникальное сочетание современных методов - видеомикроскопию, метод компьютерно-усиленного фазового контраста, TIRF (тотальную интерференционно-отражательную микроскопию), конфокальную микроскопию. Мы разработали метод, позволяющий, сочетать видеосъемки живых клеток с последующем изучением на электронно-микроскопическом уровне клеточных структур с известной жизненной историей и таким образом наладили возможность коррелятивной электронной и видеомикроскопии. Мы применяли метод электронной томографии, позволяющую с высоким разрешением исследовать Зх-мерное строение адгезионных структур построить модели реорганизации цитоскелета на разных стадиях формирования ФА. Такие модели построены впервые в мире и они внесли новое понимание организации построения адгезионных структур и механизмов перестройки цитоскелета при движении клеток. Проведенные исследования позволили ясно продемонстрировать важнейшую роль формирования новых адгезионных структур в процессе реорганизации актинового цитоскелета во время клеточного движения.

Исследование динамики трансфицированных в клетку белков - компонентов фокальных адгезий позволило внести существенный вклад в современное представление о строении и динамике адгезионных структур. Нами впервые в мире была выделена стадия инициальных фокальных адгезий, как начальная стадия формирования адгезионных структур. Ранее эта стадия не была описана исследователями из-за методических трудностей, и только использование такого широкого набора белков-маркеров и последующее исследование структуры с помощью коррелятивной электронной микроскопии позволило выделить этот этап формирования ФА. Мы впервые продемонстрировали роль белка VASP, как организатора сборки фокальных адгезий. Трансфекция клеток белками, меченными флуорохромами, позволила наблюдать перестройки актинового цитоскелета при движении клеток, дало возможность выяснить механизмы, регулирующие динамику цитоскелета. Были исследованы две зоны, образующиеся на активном ведущем краю - ламеллиподия и ламелла. Впервые в мире было показано, что основным процессом, определяющим быстрый ретроградный ток в ламеллиподии, является полимеризация актина, тогда как медленный ретроградный ток в ламеллиподии обеспечивается акто-миозиновым сокращением. Мы впервые в мире показали, что формирование адгезионных структур de novo происходит в зоне ламеллиподии и при дальнейших перестройках именно позиция этих структур определяет положение границы между ламеллиподией и ламеллой. Эти исследования вносят весомый вклад в понимание процессов перестройки цитоскелета, лежащие в основе клеточного движения.

Изменение характера клеточного движения приводит к проявлению таких свойств опухолевых клеток, как способность к инвазии. Важность исследования механизмов, приводящих к подобным изменениям сомнению не подлежит. Мы впервые в мире поставили перед собой задачу подробно оценить изменения динамики и распределения псевдоподиальной активности при трансформации и сопоставить их с изменениями, происходящими в ультраструктуре актинового цитоскелета ведущего края опухолевых клеток (которые также не были описаны ранее). Комплексная оценка изменений, вызываемых неопластической трансформацией с применением такого большого набора различных методов (иммуноморфологии, видеомикроскопии живых клеток, разнообразных тестов на эффективность миграции и биохимический анализ активности регуляторных молекул) на нескольких клеточных линиях проведен впервые. Мы провели сравнительный компьютерный анализ динамики активного края нормальных и трансформированных клеток. В результате этого анализа мы показали, что характерным признаем трансформации фибробластов является значительное перераспределение псевдоподиальной активности. При этом у трансформированных клеток существенно возрастает доля активного клеточного края и соответственно уменьшается стабильный край. При трансформации клеток существенно изменяется не только распределение, но и характер псевдоподиалыюй активности: протрузии на переднем крае становятся более мелкими, а частота их образования и частота образования раффлов значительно возрастает. Эти изменения коррелируют с изменениями строения актиновой сети в ламеллиподии, а также с отсутствием полноценных контактов клетки с субстратом. С помощью метода платиновых реплик (электронная микроскопия) мы выявили ультраструктурную основу такого перераспределения: нарушение регулярности актиновой сети, появление большого количества «дыр» в подмембранном слое актина на ведущем краю клетки и нарушение краевого актинового пучка, в норме стабилизирующего боковые края клеток. В результате исследования клеточных линий, находящихся на разных стадия опухолевой трансформации, мы показали, что по мере нарастания таких признаков трансформации, как изменения цитоскелета и перераспределение активности ведущего края, изменяется и характер миграции клеток. Движение одиночных трансформированных клеток носит менее направленный характер и скорость их миграции падает, в основном в результате отсутствия поляризации активности на ведущем крае. Одновременно появляется и/или усиливается способность к трехмерной миграции через поры камеры Бойдена и способность к инвазии. При выяснение молекулярных механизмов указанных изменений цитоскелета мы выявили возрастание активности малой ГТФазы Rae и заметное увеличение активного (дефосфорилированного) кофилина. Проведенная работа дает основание предположить, что именно перераспределение псевдоподиальной активности, вызванное изменениями структуры актинового цитоскелета, в результате которого трансформированные клетки легко меняют направление движения, является определяющим в проявлении способности опухолевых клеток к инвазии. Нами впервые показано, что по крайней мере одним из механизмов, лежащих в основе изменения морфологии и подвижности клеток является накопление активных кислородных радикалов (ROS) под действием гиперэкспрессии онкогена N-Ras, и одним из путей возвращения нормального фенотипа может быть обработка клеток антиоксидантами (в нашем случае N-ацетил цистеином). Эти выводы имеют не только теоретическое, но и важное научно-практическое значение, так как показывают новые подходы к нормализации морфологии и движения опухолевых клеток и открывают новые направления исследований в области клеточной биологии и антиопухолевой терапии.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Миграция клеток является сложным, хорошо скоординированным процессом, состоящим из нескольких стадий - выбрасывание новых протрузий на ведущем краю клетки, закрепление этих протрузий на субстрате за счет образования адгезионных структур, перемещения тела клетки, отрыва заднего конца клетки от субстрата и его подтягивания. Все эти события в основном базируются на перестройках актинового цитоскелета. Так показано, что протрузии формируются за счет полимеризации актиновых филаментов на краю клетки, а перемещение тела клетки и подтягивание хвостового участка зависит от сокращения актиновых стресс-фибрилл при участии моторного белка миозина II (Ridley et al., 2003; Mogilner and Oster, 2003). Адгезия клетки к субстрату осуществляется с помощью специализированных структур - фокальных адгезий (Geiger et al., 2001; Kaverina et al., 2002; Webb et al., 2003), которые кроме функций механического соединения с субстратом выполняют многочисленные регуляторные функции (Geiger et al., 2001, Sastry and Burridge, 2000; Zaidel-Bar et al., 2007). Способности клеток к миграции и сам характер миграции сильно варьирует от одного типа клеток к другому. Например фибробласты двигаются довольно медленно и их движение связано с постоянным выбрасыванием и сокращением ведущего края, для них характерно наличие больших сократимых пучков актиновых микрофиламентов и крупных фокальных контактов. Кератоциты рыб - мелкие, быстро ползущие клетки, их движение связано с равномерным выдвижением ведущего края. Для них характерно отсутствие пучков микрофиламентов и мелкие фокальные адгезии. Тем не менее, принципы организации актинового цитоскелета и его перестроек при движении клеток, его связь с адгезионными структурами являются общими для всех типов клеток.

I. ОРГАНИЗАЦИЯ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА КЛЕТОК ПОЗВОНОЧНЫХ.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Александрова, Антонина Юрьевна

ВЫВОДЫ

2. На ведущем крае клетки существуют две зоны - ламеллиподия и ламелла, отличающиеся по строению и динамическим характеристикам. Динамика актинового тока в ламеллиподии обеспечивается за счет полимеризации актиновой сети на краю клетки, медленный ток актина в ламелле обеспечивается за счет акто-миозинового сокращения.

6. В результате трансформации меняется улыраструктура актинового цитоскелета. Актиновая сеть в ламеллиподии становится менее регулярной, появляется большое количество «дырок» в подмембранном слое микрофиламентов. Краевой актиновый пучок в боковых и хвостовой частях клетки существенно редуцирован и не обеспечивает стабильность клеточного края.

7. При трансформации клеток существенно изменяется не только распределение, но и характер псевдоподиальной активности: протрузии на переднем крае становятся более мелкими, а частота их образования и частота образования раффлов значительно возрастает. Эти изменения коррелируют с изменениями строения актиновой сети ламеллиподии, а также с отсутствием полноценных контактов клетки с субстратом.

8. По мере нарастания таких признаков трансформации, как изменения цитоскелета и перераспределение активности ведущего края, изменяется характер миграции клеток. Движение одиночных трансформированных клеток носит менее направленный характер и скорость их миграции падает, в основном в результате отсутствия поляризации активности на ведущем крае. Одновременно появляется и/или усиливается способность к 3D миграции и способность к инвазии.

9. Одним из молекулярных механизмов, лежащих в основе указанных изменений цитоскелета в результате трансформации, является возрастание уровня реактивных кислородных радикалов (ROS) в результате оверэкспрессии онкогена N-Ras, приводящих к повышению активности малой ГТФазы Rae и заметному увеличению активного (дефосфорилированного) кофилина. Обработка таких клеток антиоксидантом NAC (N-ацетил цистеином) приводит к нормализации фенотипа и подвижности клеток.

10. Перераспределение псевдоподиальной активности, вызванное изменениями структуры актинового цитоскелета, в результате которого трансформированные клетки легко меняют направление движения, является определяющим в проявлении способности опухолевых клеток к инвазии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как уже говорилось в начале, настоящая работа состоит из двух основных частей. Первая часть - это исследование движения нормальных фибробластов и изучение клеточных механизмов, обеспечивающих это движение: реорганизации актинового цитоскелета, формирования адгезионных структур и взаимодействий этих процессов. Вторая часть посвящена исследованию нарушений, возникающих при неопластической трансформации и приводящих к формированию так называемого «инвазивного» фенотипа клеток, а именно анализу изменений морфологии и цитоскелета, вызванных трансформацией, и выявлению характеристик, которые являются определяющими при появлении у клеток способности инвазировать в окружающие ткани. Такая структура работы объясняется тем, что для исследования механизмов, определяющих патологические процессы инвазии опухолевых клеток, необходимо хорошо понимать, как обеспечивается движение клеток в норме, а, несмотря на огромный интерес к этим вопросам, многое до сих пор оставалось неизвестным.

Наши исследования реорганизации актиновой сети при движении фибробластов подтвердили существование двух зон на ведущем крае клетки, отличающихся по строению и динамическим характеристикам - ламеллиподии и ламеллы. Мы впервые выделили и разделили молекулярные механизмы, регулирующие динамику актина в этих зонах, и показали, что быстрый ретроградный ток актина в ламеллиподии определяется Агр 2/3 - зависимой полимеризацией актина на краю клетки, а медленный ретроградный ток в ламелле определяется акто-миозиновым сокращением. Мы также впервые показали роль вновь формирующихся фокальных адгезий в установлении границы между ламеллиподией и ламеллой, а также их роль в реорганизации актинового цитоскелета из равномерной униполярной сети в зоне ламеллиподии в цитоскелет ламеллы, содержащий акто-миозиновые сократимые пучки. Мы впервые доказали наличие и охарактеризовали самую начальную стадию формирования ФА - инициальные ФА. Показана динамика включения различных белков в состав ФА. С помощью исследования включения бета-3-интегрина в состав инициальных адгезий доказана их связь с внеклеточным матриксом. Выявлена и доказана новая роль белка УАБР, как организатора образования ФА. Кроме того, с помощью новейшей техники 3-х мерной компьютерной томографии, основанной на электронной микроскопии, показано строение актинового цитоскелета в местах образования ФА и показано строение ФА на разных стадиях формирования: от инициальной адгезии и до фокального контакта. С помощью этой же техники показано единство цитоскелета ламеллиподии и ламеллы и тем самым разрешен один из вопросов, до сих пор существовавших в современной клеточной биологии. Эти данные вносят существенный вклад в понимание механизмов клеточного движения. В процессе работы мы показали, что определяющим шагом в обеспечении движения клеток является формирование и распределение активного «ведущего» края. Именно эти результаты явились основанием для дальнейшего исследования изменения распределения активного края при трансформации клеток. В результате этих исследований мы впервые показали, что общим признаком нормальных фибробластов различного происхождения является то, что около 50% их периметра являются стабильными. Наличие стабильного бокового края определяет постоянство и направленность движения клеток. Характерной чертой трансформированных клеток, не описанной ранее, является существенное уменьшение доли стабильного края и, соответственно, увеличение и перераспределение активных участков. Мы показали, что нарастание этих признаков коррелирует с нарастанием других характерных признаков трансформации у клеток и усиления у них способностей к трехмерной миграции и инвазии. При этом в результате трансформации изменяется не только распределение псевдоподиальной активности вдоль периметра клетки, но меняется и динамический характер этой активности, а именно усиление краевой активности и общее увеличение раффлинга по всей поверхности клетки. Мы исследовали структуру цитоскелета у нормальных и трансформированных клеток с помощью электронномикроскопического метода платиновых реплик и показали, что в основе подобных изменений в динамике краевой активности лежат изменения ультраструктуры актинового цитоскелета. В частности нарушение регулярности подмембранной актиновой сети может вести к появлению поверхностных и боковых раффлов, а нарушение структуры стресс-фибрилл, идущих вдоль боковых стабильных участков клетки приводит к потере стабильности и возникновению мелких локальных филоподий и ламеллиподий. К активации раффлинга также может приводить изменения фокальных адгезий. Опытами с проверкой активности металлопротеаз в исследованных нами культурах мы показали, что, по крайней мере в рассмотренных нами случаях, именно изменения актинового цитоскелета приводят к увеличению способностей клеток при трансформации инвазировать матригель. Та важнейшая роль, которую мы показали для ФА в общей организации цитоскелета клетки при ее движении, предполагает, что изменения в динамике или строении ФА при трансформации может приводить к существенным изменениям организации актинового цитоскелета клетки. Таким образом, необходимы дальнейшие сравнительные исследования изменений строения и динамики ФА и цитоскелета в процессе трансформации и особенно при мезенхимально-амебоидном переходе (МАП). Для исследования этих вопросов представляются перспективными использованные нами методы и подходы.

Исследование механизмов клеточной миграции различными способами дали интересные результаты, так как показали, что не всегда увеличение скорости клеточной подвижности на двумерном субстрате коррелирует со способностью клеток инвазировать матригель (что, конечно, является моделью, более близкой к естественным условиям миграции клеток). Наши исследования показали, что более важным критерием для оценки изменения клеточной подвижности при трансформации является показатель направленности миграции, и именно нарушение способностей к направленной миграции является характерной особенностью опухолевых клеток.

Важным представляется исследование молекулярных механизмов, приводящих к к проявлению у клеток опухолевого фенотипа, возникновению описанных изменений цитоскелета и соответствующего миграционного поведения, демонстрация роли активных кислородных радикалов в проявлении изменений цитоскелета, приводящих к проявлению опухолевого фенотипа и поведения у клеток, а так же демонстрация роли малых ГТФаз в этих изменениях.

В целом подобный подход комплексного исследования механизмов движения нормальных клеток и изменения этих механизмов при трансформации представляется перспективным при дальнейших исследованиях.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Александрова, Антонина Юрьевна, Москва

1. Добринских Е. А. Изучение участия систем микротрубочек и актиновых филаментов в процессе движения фибробластов Автореферат на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва, 2007.

2. Домнина Л. В., Иванова О. Ю., Васильев 10. М. Изменение поляризации фибробластов при изменении контрактильности актинового цитоскелета. // Цитология, 2001, Т.43 (2), С. 133-141.

3. Копнин П.Б., Иванов A.B., Ильинская Г.В., Саблина A.A., Копнин Б.П., Чумаков П.М. Защитная функция р53 при Ras-индуцированной трансформации клеток REF52.// Мол. Биол., 2003, Т. 37, С. 458.

4. Любимов, A.B., Блэк, К.Л., Любимова, Ю.Ю. Изоформы ламинина в диагностике и прогнозировании течения опухолей мозга и молочной железы. // Вестник РОНЦ, 2003, Т. 3,С. 83-91

5. Минина С.А., Александрова А.Ю. и Васильев Ю.М. Изменение формы клеток и актинового цитоскелета при трансформации, вызванной онкогеном Ras; возможная роль Rho-киназы // Доклады Академии Наук. 2003. Т. 388(3). С. 1-3.

6. Ровенский Ю.А., Васильев Ю.М. Морфогенетические реакции клеток и их нарушения при опухолевой трансформации // Канцерогенез. М.: Медицина. 2004. С. 376-414.

7. Свиткина Т.М. Динамическая организация цитоскелета культивируемых клеток: ультраструктурное исследование. // Автореферат на соискание ученой степени доктора биологических наук. 1990, Москва.

8. Abercrombie, M. Contact inhibition in tissue culture // In Vitro 1970. V. 6, P. 128-142.

9. Abercrombie, M., and Dunn, G.A., Adhesions of fibroblasts to substratum during contact inhibition observed by interference reflection microscopy.// Exp. Cell. Res., 1975, V. 92, P.57-62.

10. Agapova L.S., Volodina J.L., Chumakov P.M., Kopnin B.P., Activation of Ras-Ral pathway attenuates p53-independent DNA damage G2 checkpoint.// J. Biol. Chem. 2004, V. 279, P. 36382-36389.

11. Agapova LS, Ivanov AV, Sablina AA, Kopnin PB, Sokova 01, Chumakov PM, Kopnin BP. P53-dependent effects of RAS oncogene on chromosome stability and cell cycle checkpoints. // Oncogene, 1999, V. 18(20), P. 3135-42.

12. Akisawa, N., Nishimori, I., Iwamura, T., Onishi, S. and Hollingsworth, M. A. High levels of ezrin expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines with high metastatic potential.//Biochem. Biophys. Res. Commua, 1999, V. 258, P. 395-400.

13. Albelda, S.M., Mette, S.A., Elder, D.E., Stewart, R., Damjanovich, L., Herlyn, M., and Buck, C.A. Integrin distribution in malignant melanoma: association of the beta 3 subunit with tumor progression. // Cancer Res., 1990, V. 50, P. 6757-6764.

14. Amann, K.J. and Pollard, T.D. The Arp2/3 complex nucleates actin filament branches from the sides of pre-existing filaments. //Nat. Cell Biol., 2001, V. 3, P. 306-310

15. Andreasen P.A., Kjoller L., Christensen L. and Duffy MJ. The urokinase-type plasminogen activator system in cancer metastasis: a review // Int J Cancer. 1997. V. 72. P. 1-22.

16. Applewhite , D.A., M. Barzik , S. Kojima, T.M. Svitkina, F.B. Gertler, and G.G. Borisy . Ena/VASP proteins have an anti-capping independent function in fi lopodia formation. // Mol. Biol. Cell, 2007, V. 18, P. 2579 2591 .

17. Archer H., Bar-Sagi D. Ras and Rac as activators of reactive oxygen species (ROS),// Methods Mol. Biol., 2002, V. 189, P. 67-73.

18. Azuma, K., Tanaka, M., Uekita, T., Inoue, S., Yokota, J., Ouchi, Y., and Sakai, R. Tyrosine phosphorylation of paxillin affects the metastatic potential of human osteosarcoma.// Oncogene, 2005, V. 24, P. 4754-4764.

19. Bachmann, C., L. Fischer, U. Walter, and M. Reinhard . The EVH2 domain of the vasodilator-stimulated phosphoprotein mediates tetramerization, F-actin binding and actin bundle formation. // J. Biol. Chem., 1999, V. 274, P. 23549 23557 .

20. Ballestrem C, Erez N, Kirchner J, Kam Z, Bershadsky A, Geiger B. Molecular mapping of tyrosine-phosphorylated proteins in focal adhesions using fluorescence resonance energy transfer. // J Cell Sci., 2006, V.l 19, P. 866-875.

21. Ballestrem C, Hinz B, Imhof BA, Wehrle-Haller B. Marching at the front and dragging behind: differential alphaVbeta3-integrin turnover regulates focal adhesion behavior. // J Cell Biol. 2001, V. 155(7), P. 1319-32.

22. Ballestrem C, Wehrle-Haller B, Imhof BA. Actin dynamics in living mammalian cells. // J Cell Sci. 1998, V. 111, P. 1649-58.

23. Barzik M, Kotova TI, Higgs HN, Hazelwood L, Hanein D, Gertler FB, Schafer DA Ena/VASP proteins enhance actin polymerization in the presence of barbed end capping proteins. // J Biol Chem., 2005, V. 280, P. 28653-28662

24. Baum, B., and Perrimon N. Spatial control of the actin cytoskeleton in Drosophila epithelial cells. //Nat. Cell Biol., 2001, V. 3, P. 883 890 .

25. Baum B. and Kunda P. Actin nucleation: spire-actin nucleator in a class of its own// Curr Biol. 2005. V 15 R305-R308.

26. Bear, J.E., Loureiro J.J., Libova I., Fassler R., Wehland J., and Gertler F.B. Negative regulation of fi broblast motility by Ena/VASP proteins. // Cell. 2000, V. 101, P. 717 728 .

27. Bear JE., Gertler FB. Ena/VASP: towards resolving a pointed controversy at the barbed ends. // Journal of Cell Science, 2009, V. 122, P. 1947-1953

28. Beningo KA, Dembo M, Kaverina I, Small JV, Wang YL. Nascent focal adhesions are responsible for the generation of strong propulsive forces in migrating fibroblasts. // J Cell Biol., 2001, V. 153, P. 881-888.

29. Beningo KA, Dembo M, Kaverina 1, Small JV, Wang YL. Nascent focal adhesions are responsible for the generation of strong propulsive forces in migrating fibroblasts. // J Cell Biol., 2001, V. 153, P. 881-888.

30. Bershadsky A.D. and Vasiliev J.M. // Cytoskeleton. New York: Plenum Press, 1988.

31. Bershadsky AD, Balaban NQ, Geiger B. Adhesion-dependent cell mechanosensitivity. // Annu. Rev. Cell Dev Biol., 2003, V. 19, P. 677-695.

32. Bissell, M.J., and Radisky, D. Putting tumours in context. //Nature Rev. Cancer, 2001, V. 1, P. 46-54.

33. Blanchoin L., Pollard T.D. and Hitchcock-DeGregori S.E. Inhibition of the Arp2/3 complex-nucleated actin polymerization and branch formation by tropomyosin // Curr. Biol. 2001. V. 11. P. 1300-1304.

34. Blanchoin, L., Amann KJ, Higgs HN, Marchand JB, Kaiser DA, Pollard TD. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. // Nature, 2000, V. 404, P. 1007-1011.

35. Bottaro, D.P., Rubin, J.S., Faletto, D.L., Chan, A.M.-L., Kmiecick, T.E., Van de Woude, G.F., and Aaronson, S.A. Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product. // Science, 1991, V. 251, P. 802-804.

36. Breckenridge M.T., Dulyaninova N.G. and Egelhoff T.T. Multiple regulatory steps control mammalian nonmuscle myosin II assembly in live cells. // Mol Biol Cell., 2009, V. 20, P. 338-347

37. Breitsprecher, D., Kiesewetter A.K., Linkner J., Urbanke C., Resch G.P., Small J.V., and Faix J. Clustering of VASP actively drives processive, WH2 domain-mediated actin filament elongation. // EMBO J., 2008, V. 27, P. 2943- 2954.

38. Brenner S.L. and Korn E.D. Substoichiometric concentrations of cytochalasin D inhibit actin polymerization. Additional evidence for an F-actin treadmill. // J Biol Chem., 1979, V. 254, P. 9982-5.

39. Brodu V, Casanova J. The RhoGAP crossveinless-c links trachealess and EGFR signaling to cell shape remodeling in Drosophila tracheal invagination. // Genes Dev., 2006, V. 20, P. 1817-1828.

40. Bruinsma R. Theory of force regulation by nascent adhesion sites. // Biophys J., 2005, V. 89, P. 87-94

41. Burgstaller, G., and Gimona, M. Actin cytoskeleton remodelling via local inhibition of contractility at discrete microdomains. // J. Cell Sci., 2004, V. 117, P. 223-231.

42. Burridge K, Feramisco JR. Microinjection and localization of a 130K protein in living fibroblasts: A relationship to actin and fibronectin. // Cell, 1980, V. 19, P. 587-595.

43. Burridge, K., Fath, K., Kelly, T., Nucolls, G., and Turner, C. Focal adhesions: transmembrane junctions between the extracellular matrix and the cytoskeleton. // Ann. Rev. Cell Biol., 1988, V. 4, P. 487-525.

44. Burridge, K., Wennerberg, K. Rho and Rac take center stage. // Cell, 2004, V. 2, P. 167-79.

45. Campellone KG, Welch MD: A nucleator arms race: cellular control of actin assembly. //Nat Rev Mol Cell Biol., 2010, V. 11, P. 237-251.

46. Carl UD, Pollmann M, Orr E, Gertlere FB, Chakraborty T, Wehland J. Aromatic and basic residues within the EVH1 domain of VASP specify its interaction with proline-rich ligands. // Curr Biol. 1999, V. 9(13), P. 715-8.

47. Carragher, N.O., and Frame, M.C. Focal adhesion and actin dynamics: a place where kinases and proteases meet to promote invasion. // Trends Cell Biol., 2004, V. 14, P. 241-249.

48. Castellano F, Le Clainche C, Patin D, Carlier MF, Chavrier P. A WASp-VASP complex regulates actin polymerization at the plasma membrane. // EMBO J., 2001, V. 20, P. 56035614.

49. Chan C., Beltzner C.C. and Pollard T.D. Cofilin Dissociates Arp2/3-Complex and Branches from Actin Filaments // Curr. Biol. 2009. V. 19, P. 537-545.

50. Chesarone MA, Goode BL: Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. // Curr Opin Cell Biol., 2009, V. 21, P. 28-37.

51. Chrzanowska-Wodnicka M, Burridge K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. // J Cell Biol., 1996, V. 133, P. 1403-1415.

52. Clark, E.A., Golub, T.R., Lander, E.S., and Hynes, R.O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. // Nature, 2000, V. 406, P. 532-535.

53. Clark, E.A., King, W.G., Brugge, J.S., Simons, M., and Hynes, R.O. Integrin-mediated signals regulated by members of the rho family of GTPases. // J. Cell Biol., 1998, V. 142, P. 573-586.

54. Cooper J.A. and Schafer D.A. Control of actin assembly and disassembly at filament ends // Curr Opin Cell Biol. 2000. V. 12(1), P. 97-103.

55. Coussens, L.M., Fingleton, B., and Matrisian, L.M. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. // Science, 2002, V. 295, P. 2387-2392.

56. Craig R., Smith R. and Kendrick-Jones J. Light-chain phosphorylation controls the conformation of vertebtate non-muscle and smooth muscle myosin molecules. // Nature, 1983, V .302, P. 436-439.

57. Cramer L.P. Organization and polarity of actin filament networks in cells: implications for the mechanism of myosin-based cell motility. // Biochem Soc Symp., 1999, V. 65, P. 173205.

58. Cukierman, E., R. Pankov, D.R. Stevens, and K.M. Yamada. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. // Science, 2001, V. 294, P. 1708-1712.

59. Curtis AS. THE MECHANISM OF ADHESION OF CELLS TO GLASS. A STUDY BY INTERFERENCE REFLECTION MICROSCOPY. // J Cell Biol. 1964, V. 20, P. 199-215.

60. Dalhaimer P, Pollard TD. Molecular dynamics simulations of Arp2/3 complex activation. // Biophys J., 2010, V. 99(8), P. 2568-76.

61. De, S., Razorenova, O., McCabe, N.P., O'Toole, T., Qin, J., and Byzova, T.V. VEGF-integrin interplay controls tumor growth and vascularization. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, V. 102, P. 7589-7594.

62. DeMali KA, Barlow CA, Burridge K. Recruitment of the Arp2/3 complex to vinculin: coupling membrane protrusion to matrix adhesion. // J Cell Biol., 2002, V. 159, P. 881-891.

63. Dent EW, Kwiatkowski AV, Mebane LM, Philippar U, Barzik M, Rubinson DA, Gupton S, Van Veen JE, Furman C, Zhang J, Alberts AS, Mori S, Gertler FB. Filopodia are required for cortical neurite initiation. // Nat Cell Biol., 2007,V. 9, P. 1347-1359

64. Deryugina E.I. et al., Matrix metalloproteinase activation modulates glioma cell migration // J. Cell Sci. 1997. V. 110. P. 2473-2482.

65. DesMarais V., Ichetovkin I., Condeelis J., and Hitchcock-DeGregori S.E. Spatial regulation of actin dynamics: a tropomyosin-free, actin-rich compartment at the leading edge // J. Cell Sci. 2002. V. 115. P. 4649-4660.

66. Domnina L.V., Ivanova O.Y., Margolis L.B., Olshevskaya L.V., Rovensky Y.A., Vasiliev J.M. and Gelfand I.M. Defective formation of the lamellar cytoplasm by neoplastic fibroblasts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V 69: 248-252.

67. Dowrick, P.G., and Warn, R. The effects of scatter factor on the cytoskeletal organization of epithelial cells. // Cancer Invest. 1990,V. 8, P. 675-683.

68. Dowrick, P.G., Prescott, A.R., and Warn, R. Scatter factor affects major changes in the cytoskeletal organization of epithelial cells. // Cytokine, 1991, V. 3, P. 299-310.

69. Dugina V., Zwaenepoel I., Gabbiani G., Clément S. and Chaponnier S. P- and y-cytoplasmic actins display distinct distribution and functional diversity // Journal of Cell Science. 2009. V 122, P. 2980-2988.

70. Dugina V.B., Svitkina T.M., Vasiliev J.M. and Gelfand I.M. Specific type of morphological reorganization induced by phorbol ester: Reversible partition of cell into motile and stable domains. // Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1987, V. 84, P. 4122-4125.

71. Dugina, V.B., Alexandrova, A.Y., Lane, K., Bulanova, E., and Vasiliev, J.M. The role of the microtubular system in the cell response to HGF/SF. // J. Cell Sci., 1995,, V. 108, P. 16591667.

72. Dunn G.A. and Brown A.F. Alignment of fibroblasts on grooved surfaces described by a simple geometric transformation. // J Cell Sci., 1986, V. 83, P. 313-340.

73. Etienne-Manneville S, Hall A. Rho GTPases in cell biology. // Nature, 2002, V. 420, P. 629635.

74. Even-Ram S., Doyle A.D., Conti M.A., Matsumoto K., Adelstein R.S. and Yamada K.M. Myosin IIA regulates cell motility and actomyosin-microtubule crosstalk. // Nat Cell Biol., 2007, V. 9, P. 299-309.

75. Faix J. and Grosse R. Staying in shape with formins // Dev. Cell. 2006 V. 10(6). P. 693-706.

76. Farina, K.L., Wyckoff, J.B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J.E., Condeelis, J.S., and Jones, J.G. Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein. // Cancer Res., 1998, V. 58, P. 2528-2532.

77. Feltkamp, C. A., Pijnenburg, M. A. & Roos, E. Organization of talin and vinculin in adhesion plaques of wet-cleaved chicken embryo fibroblasts. // J. Cell Sci., 1991, V. 100, P. 579-587

78. Fidler IJ. Critical determinants of cancer methastasis: rationale for therapy. // Cancer. Chemother. Pharmacol., 1999, V. 43, S 3-10.

79. Fox C.H., Caspersson T., Kudynowski J. Sanford K.K. and Tarone R.E. Morphometric analysis of neoplastic transformation in rodent fibroblast cell lines // Cancer Res. 1977. V 37. P. 892-897.

80. Fradelizi J, Noireaux V, Plastino J, Menichi B, Louvard D, Sykes C, Golsteyn RM, Friederich E. ActA and human zyxin harbour Arp2/3-independent actin-polymerization activity. //Nat Cell Biol. 2001, V.8, P. 699-707.

81. Frangakis, A. S. & Hegerl, R. Noise reduction in electron tomographic reconstructionsusing nonlinear anisotropic diffusion. // J. Struct. Biol., 2001, V. 135, P. 239250

82. Friedl P. and Wolf K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model // J Cell Biol. 2010. V. 188. P. 11-19.

83. Friedl P. and Wolf K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion // Cancer Res. 2008. V. 68. P. 7247-7249.

84. Friedl P. and Wolf K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms //Nat Rev Cancer. 2003. V. 3. P. 362-374.

85. Friedl P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration // Curr Opin Cell Biol. 2004. V. 16. P. 14-23.

86. Friedl P., Hegerfeldt Y. and Tusch M. Collective cell migration in morphogenesis and cancer// Int. J. Dev. Biol. 2004. V. 48. P. 441-449.

87. Friedl, P., Zanker, K. S. and Brocker, E.-B. Cell migration strategies in 3-D extracellular matrix: differences in morphology, cell matrix interactions, and integrin function. //Microsc. Res. Tech., 1998, V. 43, P. 369-378.

88. Frisch, S.M., and Ruoslahti, E. Integrins and anoikis. // Curr. Opin. Cell Biol., 1997, V. 9, P. 701-706.

89. Fukata Y, Amano M, Kaibuchi K: Rho-Rho-kinase pathway in smooth muscle contraction and cytoskeletal reorganization of non-muscle cells. // Trends Pharmacol Sci 2001, V.22, P. 32-39.

90. Furman, C., Sieminski A.L., Kwiatkowski A.V., Rubinson D.A., Vasile E., Bronson R.T., Fassler R., and Gertler F.B. Ena/VASP is required for endothelial barrier function in vivo. // J. Cell Biol., 2007, V. 179, P. 761 765.

91. Gabarra-Niecko, V., Schaller, M.D., Dunty, J.M. FAK regulates biological processes important for the pathogenesis of cancer. // Cancer Metastasis Rev., 2003, V. 4, P. 359-74.

92. Gadea G., Anguille C. and Roux P. Loss of p53 promotes RhoA-ROCK-dependent cell migration and invasion in 3D matrices // J Cell Biol. 2007. V. 178. P. 23-30.

93. Gates, J., Mahaffey J.P., Rogers S.L., Emerson M., Rogers E.M., Sottile S.L., Van Vactor D., Gertler F.B., and Peifer M. Enabled plays key roles in embryonic epithelial morphogenesis in Drosophila . II Development. 2007 . V.134 , P. 2027 2039 .

94. Geiger B and Bershadsky A Assembly and mechanosensory function of focal contacts. // Current Opinion in Cell Biology, 2001, V.13, P. 584-592

95. Geiger B and Yamada KM. Molecular Architecture and Function of Matrix Adhesions . // Cold Spring Harb Perspect Biol., 2011, V.3, P. a005033

96. Geiger B, Bershadsky A, Pankov R., Yamada KM. Transmembrane extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk. // Nat Rev Mol Cell Biol., 2001, V. 2, P. 793-805.

97. Geiger B. A 130K protein from chicken gizzard: Its localization at the termini of microfilament bundles in cultured chicken cells. // Cell, 1979, V. 18(1), P.193-205.

98. Gerald D., Berra E., Frapart Y.M., Chan D.A., Giaccia A.J., Mansuy D., Pouyssegur J., Yaniv M., Mechta-Grigoriou F. JunD reduces tumor angiogenesis by protecting cells from oxidative stress. // Cell, 2004, V. 118, P. 781-794.

99. Gertler, F. B., Niebuhr, K., Reinhard, M., Wehland, J. and Soriano, P. Mena, a relative of VASP and Drosophila Enabled, is implicated in the control of microfilament dynamics. // Cell, 1996, V. 87, P. 227-239.

100. Gherardi, E., Gray, J., Stoker, M., Perryman, M., and Furlong, R. Purification of scatter factor, a fibroblast-derived basic protein that modulates epithelial interactions and movement. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, V. 86, P. 5844-5848.

101. Ghosh M., Song X., Mouneimne G., Lawrence D.S. and Condeelis J.S. Cofilin promotes actin polymerization and defines the direction of the motility // Science. 2004. V. 304. P. 743746.

102. Giancotti, F. G. & Tarone, GPositional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2003, V. 19, P. 173-206

103. Giancotti, F.G., and Ruoslahti, E. Integrin signaling. // Science, 1999, V. 285, P. 1028-1032.

104. Giancotti, F.G., and Tarone, G. Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2003, V. 19, P. 173-206.

105. Giannone G, Dubin-Thaler BJ, Rossier O, Cai Y, Chaga O, Jiang G., Beaver W., Dobereiner H.G., Freund Y., Borisy G. and Sheetz M.P. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. // Cell, 2007, V. 128, P. 561-575.

106. Gimona, M, The microfilament system in the formation of invasive adhesions. // Seminars in Cancer Biology, 2008, V. 18(1), P. 23-34.

107. Gimona, M., and Buccione, R. Adhesions that mediate invasion. // Intern. J. Biochem. Cell Biol., 2006, V. 38, P. 1875-1892.

108. Gladson, C.L., and Cheresh, D.A. (1991) Glioblastoma expression of vitronectin and the alpha v beta 3 integrin. Adhesion mechanism for transformed glial cells.J. Clin. Invest., 88,1924-1932.

109. Goley ED, Welch MD. The ARP2/3 complex: an actin nucleator comes of age. // Nat Rev Mol Cell Biol., 2006, V. 7, P. 713-726.

110. Goode B.L., Eck M.J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly // Annu Rev Biochem. 2007. V 76, P. 593-627

111. Guo, W., and Giancotti, F.G. Integrin signalling during tumour progression. //Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2004, V. 5, P. 816-826.

112. Gupton S.L. and Gertler F.B. Filopodia: the fingers that do the walking // Sci STKE. 2007, V. 400. Review 5.

113. Gupton SL, Anderson KL, Kole TP, Fischer RS, Ponti A, et al. Cell migration without a lamellipodium: translation of actin dynamics into cell movement mediated by tropomyosin. // J Cell Biol., 2005, V. 168, P. 619-631.

114. Hannon G.J., Demetrick D. and Beach D. Isolation of the Rb-related pl30 through its interaction with CDK2 and cyclins // Genes. Dev. 1993. V. 7. P. 2378-2391.

115. Harris, A. K. Cell surface movements related to cell locomotion. // In Locomotion of Tissue Cells: Ciba Foundation Symposium, 1973, Amsterdam: Elsevier., V. 14, P 3-26.

116. Harris, A.K., Wild, P., and Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. // Science, 1980, V. 208, P. 177-179.

117. Harvey D.M., Levine A.J. p53 alteration is a common event in the spontaneous immortalization of primary BALB/c murine embryo fibroblasts // Genes Devel. 1991. V. 5. № 12B. P. 2375-235.

118. Heath JP, Dunn GA. Cell to substratum contacts of chick fibroblasts and their relation to the microfilament system. A correlated interference-reflexion and high-voltage electron-microscope study. // J Cell Sci., 1978, V. 29, P. 197-212.

119. Heath, J. P. and Holifield, B. F. Cell locomotion: new research tests old ideas on membrane and cytoskeletal flow. // Cell Motil. Cytoskeleton., 1991, V. 18, P. 245-257

120. Helin K. Regulation of cell proliferation by the E2F transcription factors // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. V 8,28-35

121. Hinz B., Alt W., Johnen C., Herzog V. and Kaiser H.W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis // Exp.Cell Res. 1999. V 251,234-243.

122. Hommem CC and Peifer M. Exploring the roles of diaphanous and enabled activity in shaping the balance between filopodia and lamellipodia // Mol Biol Cell. 2009 V. 20(24). P. 5138-55.

123. Hotulainen P, Lappalainen P. Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells. // J Cell Biol., 2006, V. 173, P. 383-394.

124. Howe, A., Aplin, A.E., Alahari, S.K., and Juliano, R.L. Integrin signaling and cell growth control. // Curr.Opin. Cell Biol., 1998. V. 10, P. 220-231.

125. Hu K, Ji L, Applegate KT, Danuser G, Waterman-Storer CM. Differential transmission of actin motion within focal adhesions. // Science, 2007, V. 315, P. 111-115.

126. Huschtscha L.I. and Holliday R. Limited and unlimited growth of SV40-transformed cells from human diploid MRC-5 fibroblasts //J. Cell. Sci. 1983. V. 63. P. 77-99.

127. Huttelmaier, S., B. Harbeck, O. Steffens , T. Messerschmidt, S. Illenberger, and B.M. Jockusch . Characterization of the actin binding properties of the vasodilator-stimulated phosphoprotein VASP. // FEBS Lett., 1999, V.451, P. 68 74 .

128. Hynes, R.O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. //Cell, 2002, V. 110, P. 673-687.

129. Hynes, R.O. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. // Cell, 1992, V. 69, P. 11-25.

130. Insall R. H. and Machesky L. M. Actin dinamics at the leading edge: from simple machinery to complecs networks // Developmental Cell., 2009, V P. 310-319

131. Irani K., Xia Y., Zweier J.L., Sollott S.J., Der C.J.,. Fearon E.R, Sundaresan M., Finkel T., Goldschmidt-Clermont P.J., Mitogenic signaling mediated by oxidants in Ras-transformed fibroblasts, // Science, 1997, V. 275, P. 1649-1652.

132. Ishizaki T., Uehata M., Tamechika I., Keel J., Nonomura K., Maekawa M. and Narumiya S. Pharmacological properties of Y-27632, a specific inhibitor of rho-associated kinases. // Mol Pharmacol., 2000, V.57, P. 976-983.

133. Itoh, K., Yoshioka, K., Akedo, H., Uehata, M., Ishizaki, T., and Narumiya, S. An essential part for Rho-associated kinase in the transcellular invasion of tumor cells. // Nature Med., 1999, V. 5, P. 221-225.

134. Ivanova OY, Svitkina TM, Vasiliev JM, Gelfand IM. Effect of colcemid on the distribution of pseudopodial activity in fibroblasts. Microtubule-independent stabilization of cell surface. // Exp Cell Res., 1980, V.128(2), P. 457-61.

135. Izzard, C.S., and Lochner, L.R. Formation of cell-to-substrate contacts during fibroblast motility: an interference-reflexion study. // J. Cell. Sci., 1980, V. 42, P. 81-116.

136. Jacobs J.P., Jones C. M. and Baillie J.P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5 //Nature. 1970. V. 227. P. 168-170.

137. Jurado C, Haserick JR, Lee J. Slipping or gripping? Fluorescent speckle microscopy in fish keratocytes reveals two different mechanisms for generating a retrograde flow of actin. // Mol Biol Cell., 2005, V.16, P. 507-518.

138. Kahana, O., Micksche, M., Witz, I.P., and Yron, LThe focal adhesion kinase (P125FAK) is constitutively active in human malignant melanoma. // Oncogene, 2002, V. 21, P. 39693977.

139. Kalluri R. and Zeisberg M. Fibroblasts in cancer // Nat Rev Cancer. 2006. V. 6. P. 392401.

140. Kalluri R. EMT: when epithelial cells decide to become mesenchymal-like cells // J Clin Invest. 2009. V. 9. P. 1417-1419.

141. Kaneko, K., Satoh, K., Masamune, A., Satoh, A., and Shimosegawa, T. Myosin light chain kinase inhibitors can block invasion and adhesion of human pancreatic cancer cell lines. //Pancreas, 2002, V. 24, P. 34^1.

142. Katz, N., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K.M., and Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cellmatrix adhesions. // Moll. Biol. Cell, 2000, V. 11, P. 1047-1060.

143. Kaverina I, Krylyshkina O, Small JV. Regulation of substrate adhesion dynamics during cell motility. // Int J Biochem Cell Biol., 2002, V. 34, P. 746-761.

144. Kaverina, I., Stradal, T.E., and Gimona, M. Podosome formation in cultured A7r5 vascular smooth muscle cells requires Arp2/3-dependent de-novo actin polymerization at discrete microdomains. // J. Cell Sci., 2003, V. 116, P.4915-4924.

145. Kaverina, I.N., Minin, A.A., Gyoeva, F.K., and Vasiliev, J.M. Kinesin-associated transport is involved in the regulation of cell adhesion. // Cell Biol. Int., 1997, V. 21, P. 299236.

146. Kerkhoff E. Cellular functions of Spir actin-nucleation factors // ScienceDirect. 2006. V 477-482.

147. Khaitlina SY.Functional specificity of actin isoforms. // Int Rev Cytol. 2001, V. 202, P. 35-98.

148. Koestler, S. A., Auinger, S., Vinzenz, M., Rottner, K. and Small, J. V. Differentially oriented populations of actin filaments generated in lamellipodia collaborate in pushing and pausing at the cell front. // Nat. Cell Biol., 2008, V. 10, P. 306-313.

149. Kornberg, L.J. Focal adhesion kinase and its potential involvement in tumor invasion and metastasis. // Head Neck, 1998, V. 20, P. 745-752.

150. Kovar D. R., Pollard T. D., Insertional assembly of actin filament barbed ends in association with formins produces piconewton forces. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2004, V. 101, P. 14725-14730

151. Kovar D.R. Molecular details of formin-mediated actin assembly // Curr Opin Cell Biol. 2006. V 18, P. 11-17.

152. Kozlov M.M. and Bershadsky A.D. Processive capping by formin suggests a force-driven mechanism of actin polymerization //JCB. 2004. V. 167(6). P. 1011-1017.

153. Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J. and Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2003, V. 19, P.541-564.

154. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N. & Mcintosh, J. R. Computer visualization of threedimensional image data using IMOD. // J. Struct. Biol., 1996, V. 116, P. 71-76

155. Krendel M., Mooseker M. S. Myosins: Tails (and Heads) of Functional Diversity. // Physiology, 2005, V. 20, P. 239-251.

156. Kunda P, Craig G, Dominguez V, Baum B. Abi, Sral, and Kette control the stability and localization of SCAR/WAVE to regulate the formation of actin-based protrusions. // Curr Biol. 2003, V. 13(21), P. 1867-75.

157. Kwiatkowski D.J. Functions of gelsolin: motility, signaling, apoptosis, cancer // Curr. Opin. Cell Biol. 1999. V. 11. P. 103-108.

158. Lai, F. P., Szczodrak, M., Block, J., Faix, J., Breitsprecher, D., Mannherz, H. G., Stradal, T. E., Dunn, G. A., Small, J. V. and Rottner, K. Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia. // EMBO J., 2008, V. 27, P. 982-992.

159. Lai, F. P., Szczodrak, M., Block, J., Faix, J., Breitsprecher, D., Mannherz, H. G., Stradal, T. E., Dunn, G. A., Small, J. V. and Rottner, K. Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia. // EMBO J., 2008, V. 27, P. 982-992.

160. Lammermann T., Bader B.L., Monkley S.J., Worbs T., Wedlich-Soldner R., Hirsch K., Keller M., Forster R., Critchley D.R., Fassler R. and Sixt M. Rapid leukocyte migration by integrinindependent flowing and squeezing //Nature. 2008. V. 435. P. 51-55.

161. Lanier, L. M., Gates, M. A., Witke, W., Menzies, A. S., Wehman, A. M., Macklis, J. D., Kwiatkowski, D., Soriano, P. and Gertler, F. B. Mena is required for neurulation and commissure formation. //Neuron, 1999, V. 22, P. 313-325.

162. Lauffenburger, D.A., and Horwitz, A.FCell migration: a physically integrated molecular process. // Cell, 1996, V. 84, P. 359-369 .

163. Lawrence, D. W., Comerford, K. M. and Colgan, S. P. Role of VASP in reestablishment of epithelial tight junction assembly after Ca2+ switch. // Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2002, V. 282, C1235-C1245.

164. Le Clainche C. and Carlier M.-F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adgesionin cell migration // Phisiological review. 2007. V 88,489-513

165. Lee J, Ishihara A, Jacobson K The fish epidermal keratocyte as a model system for the study of cell locomotion. // Symp Soc Exp Bio., 1993, V. 47, P. 73-89.

166. Lee S., Helfman D.M., Cytoplasmic p21Cipl is involved in Ras-induced inhibition of the ROCK/LIMK/cofilin pathway, // J. Biol. Chem., 2004, V. 279, P. 1885-1891.

167. Lewis A.K. and Bridgman P.C. Nerve growth cone lamellipodia contain two populations of actin fi laments that differ in organization and polarity // J. Cell Biol. 1992. V. 119, P. 1219-1243.

168. Li Z.H. and Bresnick A.R. The S100A4 metastasis factor regulates cellular motility via a direct interaction with myosin-IIA. // Cancer Res., 2006, V. 66, P. 5173-5180.

169. Lo C.M., Buxton D.B., Chua G.C., Dembo M., Adelstein R.S. and Wang Y.L. Nonmuscle myosin IIB is involved in the guidance of fibroflast migration. // Mol Biol Cell., 2004, V. 5, P. 982-989.

170. Lozano E., Betson M. and Braga V.M. Tumor progression: Small GTPases and loss of cell-cell adhesion// Bioessays. 2003. V. 5. P. 452-463.

171. Machesky L.M. and Insall R.H. Scarl and the related Wiskott-Aldrich syndrome protein, WASP, regulate the actin cytoskeleton through the Arp2/3-complex // Curr. Biol. 1998. V. 8, P.1347-1356.

172. Machesky, L.M. et al. Scar, a WASp-related protein, activates nucleation of actin filaments by the Arp2/3 complex. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1999, V. 96, P. 37393744

173. Machesky, L.M., and Hall, A. Role of actin polymerization and adhesion to extracellular matrix in Rac- and Rho-induced cytoskeletal reorganization. // J. Cell Biol., 1997, V. 138, P. 913-926.

174. Maekawa M., Ishizaki T., Boku S., Watanabe N., Fujita A., Iwamatsu A., Obinata T., Ohashi K., Mizuno K., Narumiya S., Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. // Science, 1999, V. 285, P. 895-898.

175. Maschler, S., Wirl, G., Spring, H., Bredow, D.V., Sordat, I., Beug, H., Reichmann, E. Tumor cell invasiveness correlates with changes in integrin expression and localization. // Oncogene. 2005, V. 17, P. 2032-41.

176. Matsudaira P. Actin crosslinking proteins at the leading edge // Semin. Cell. Biol. 1994. V. 5. P. 165-174.

177. Matsui, T., Maeda, M., Doi, Y., Yonemura, S., Amano, M., Kaibuchi, K., Tsukita, S., and Tsukita, S. // J. Cell Biol.,1998, V. 140, P. 647-657.

178. McGough A., Pope B., Chiu W. and Weeds A. Cofilin changes the twist of F-actin: implications for actin filament dynamics and cellular function // J. Cell Biol. 1997. V. 138, P. 771-781.

179. Medalia O. M. and Geiger B. Frontiers of microscopy-based research into cell-matrix adhesions. // Curr. Cell.Biol, 2010, V. 22(5), P. 659-68.

180. Mejillano Marisan R., Kojima S., Applewhite D.A., Gertler F.B., Svitkina T.M., and Borisy G.G. Lamellipodial versus filopodial mode of the actin nanomachinery: pivotal role of the filament barbed end // Cell Press. 2004. V 118, P. 363-373.

181. Mercurio, A.M., and Rabinovitz, I. Towards a mechanistic understanding of tumor invasion-lessons from the alpha6beta 4 integrin. // Semin. Cancer Biol., 2001, V. 11, P. 129-141.

182. Miki H., Sasaki T., Takai Y., Takenawa T. Induction of filopodial formation by a WASP-related actin-depolimerasing protein N-WASP //Nature. 1998. V. 391. P. 99-99.

183. Miranti, C. K. and Brugge, J. S. Sensing the environment: a historical perspective on integrin signal transduction. // Nature Cell Biol., 2002, V. 4, E83-E90.

184. Mitchison T.J. and Cramer L.P. Actin-based cell motility and cell locomotion // Cell. 1996. V. 84. P. 371-379.

185. Mittnacht S. Control of pRB phosphorylation // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. V 8,2127.

186. Moeller, M.J., A. Soofi, G.S. Braun, X. Li, C. Watzl, W. Kriz , and L.B. Holzman . Protocadherin FAT1 binds Ena/VASP proteins and is necessary for actin dynamics and cell polarization. // EMBO J., 2004, V. 23, P. 3769 3779 .

187. Mogilner A, Oster G. Polymer motors: pushing out the front and pulling up the back. // Curr Biol., 2003, V. 13, R721-733.

188. Montesano, R., Matsumoto, K., Nakamura, T., and Orci, L. Identification of a fibroblast-derived epithelial morphogene as hepatocyte growth factor. // Cell, 1991b, V. 67, P. 901— 908.

189. Montesano, R., Schaller, G., and Orci, L. Induction of epithelial tubular morphogenesis in vitro by fibroblast-derived soluble factors. // Cell, 1991a, V. 66, P. 697-711.

190. Moreau, V., Tatin, F., Varon, C., Anies, G., Savona-Barron, C., and Genot, E. Cdc42-driven podosome formation in endothelial cells. // Eur. J. Cell Biol., 2006, V. 85, P. 319-325.

191. Muller K., Antipsoriatic anthrones: aspects of oxygen radical formation, challenges and prospects, // Gen. Pharmacol., 1996, V. 27, P. 1325-1335.

192. Mullins, R.D., Heuser J.A. and Pollard T.D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1998, V. 95, P. 6181-6186

193. Myat MM. Making tubes in the Drosophila embryo. // Dev. Dyn., 2005, V. 232, P. 617632.

194. Nabeshima K., Inoue T., Shimao Y. and Sameshima T. Matrix metalloproteinases in tumor invasion: role for cell migration // Pathol Int. 2002. V. 52. P. 255-264.

195. Nakamura, T., Teramoto, H., and Ichihara, A. Purification and characterization of a growth factor from rat platelets for mature parenchimal hepatocytes in primary culture. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, V. 86, P. 6489-6493.

196. Neff, N.T., Lowrey, C., Decker, C., Tovar, A., Damsky, C., Buck, C., and Horwitz, A.F. A monoclonal antibody detaches embryonic skeletal muscle from extracellular matrices. // J. Cell Biol., 1982, V. 95, P. 654-666.

197. Nicol, A. Nermut MV, Doeinck A, Robenek H, Wiegand C, Jockusch BM. Labeling of structural elements at the ventral plasma membrane of fibroblasts with the immunogold technique. // J. Histochem. Cytochem., 1987, V. 35, P. 499-506.

198. Nicolas A, Geiger B, Safran SA. Cell mechanosensitivity controls the anisotropy of focal adhesions. // Proc Natl Acad Sci USA, 2004, V. 101, P. 12520-12525.

199. Nobes CD, Hall A: Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia. // Cell 1995, V. 81, P. 53-62.

200. Nourshargh S., Hordijk P. L. and Sixt M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. //Nat Rev Mol Cell Biol, 2010, V.l 1, P. 366-378

201. Oikawa T, Yamaguchi H, Itoh T, Kato M, Ijuin T, Yamazaki D, Suetsugu S, Takenawa T. PtdIns(3,4,5)P3 binding is necessary for WAVE2-induced formation of lamellipodia. // Nat Cell Biol., 2004, V. 6(5), P. 420-6.

202. Ostap E. M. 2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor. // J. Muscle Res. Cell Motil. 2002, V. 23 (4), P. 305-8.

203. Owens, L.V., Xu, L., Craven, R.J., Dent, G.A., Weiner, T.M., Kornberg, L., Liu, E.T., and Cance, W.G. Overexpression of the focal adhesion kinase (pl25FAK) in invasive human tumors. // Cancer Res., 1995, V. 55, P. 2752-2755.

204. Pankov R., Endo Y., Even-Ram S., Araki M, Clark K, Cukierman E, Matsumoto K, Yamada KM. A Rac switch regulates random versus directionally persistent cell migration //

205. J. Cell Biol. 2005. V. 170. < 5. P. 793-802.

206. Pantaloni, D. Boujemaa R, Didry D, Gounon P, Carlier MF. The Arp2/3 complex branches filament barbed ends: functional antagonism with capping proteins. // Nat. Cell Biol., 2000, V. 2, P. 385-391.

207. Parri M, Chiarugi P. Rac and Rho GTPases in cancer cell motility control. // Cell Commun Signal., 2010, V. 8, P. 23.

208. Pasic L, Kotova T, Schafer DA. Ena/VASP proteins capture actin filament barbed ends. // J Biol Chem. 2008, V. 283(15), P. 9814-9.

209. Patla I, Volberg T., Elad N., Hirschfeld-Warneken V., Grashoff C., Fassler R., Spatz J.P., Geiger B. and Medalia O. Dissecting the molecular architecture of integrin adhesion sites by cryo-electron tomography. // Nat Cell Biol, 2010

210. Pawlak G., Helfman D.M., Post-transcriptional down-regulation of ROCKI/Rho-kinase through an MEK-dependent pathway leads to cytoskeleton disruption in Ras-transformed fibroblasts. // Mol. Biol. Cell, 2002, V. 13, P. 336-347.

211. Pfaff, M., Du, X., and Ginsberg, M.H. Calpain cleavage of integrin beta cytoplasmic domains. // FEBS Lett., 1999, V. 460, P. 17-22.

212. Pilot F, Lecuit T. Compartmentalized morphogenesis in epithelia: from cell to tissue shape. // Dev. Dyn., 2005, V. 232, P. 685-694.

213. Plastino J, Olivier S, Sykes C. Actin filaments align into hollow comets for rapid VASP-mediated propulsion. // Curr Biol., 2004, V. 14(19), P. 1766-7.

214. Pletjushkina, O.J., Ivanova, O.J., Kaverina, I.N., and Vasiliev, J.M. Taxol-treated fibroblasts acquire an epithelioid shape and a circular pattern of actin bundles. // Exp. Cell Res., 1994, V. 212, P. 201-208.

215. Pokorna E., Jordan P. W. O'Neill C. H., Zicha D., Gilbert C. S., Vesely P. Actin cytoskeleton and motility in rat sarcoma cell populations with different metastatic potential // Cell Motil. Cytoskeleton. 1994. V 28 (1), P. 25-33.

216. Pollard T. D., Borisy G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. // Cell, 2003, V. 112, P. 453-465.

217. Pollard T.D. and Weihing R.R. Actin and myosin and cell movement. // CRC Crit Rev Biochem., 1974. V. 2, P. 1-65.

218. Pollard T.D. Introduction of actin and actin-binding proteins // Guidebook to the Cytoskeletal and Motor Proteins, Second Edition. 1999. P. 3-11.

219. Pollard TD Regulation of actin filament assembly by Arp2/3 complex and formins. // Annu Rev Biophys Biomol Struct., 2007, V. 36, P. 451-477

220. Pollard TD, Cooper JA. Actin, a central player in cell shape and movement. // Science. 2009, V. 326(5957), P. 1208-12.

221. Polyak K, Weinberg RA. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits // Nat Rev Cancer. 2009 V. 9(4) P. 265-73.

222. Ponti A, Machace M, Gupton SL, Waterman-Storer CM, Danuser G Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. // Science, 2004, V. 305, P. 17821786.

223. Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. and Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. // Science, 2004, V. 305, P. 1782-1786.

224. Potter, D.A., Tirnauer, J.S., Janssen, R., Croall, D.E., Hughes, C.N., Fiacco, K.A., Mier, J.W., Maki, M., and Herman, I.M. Calpain regulates actin remodeling during cell spreading. // J. Cell Biol., 1998, V. 141, P. 647-662.

225. Qualmann B. and Kessels M. M. New players in actin polymerization WH2-domain-containing actin nucleators // Cell 2009. V 276 - 285.

226. Ramos, D.M., But, M., Regezi, J., Schmidt, B.L., Atakilit, A., Dang, D., Ellis, D., Jordan, R., Li, X. Expression of integrin beta 6enchances invasive behavior in oral squamous cell carcinoma. // Matrix Biol, 2002, V. 21, P. 297-307

227. Rasheed S. Et al., Characterization of a newly derived human sarcoma cell line (HT-1080) // Cancer. 1974. V. 33. P. 1027-1033.

228. Renault L., Bugyi B., Carlier M.-F. Spire and Cordon-bleu: multifunctional regulators of actin dynamics // Cell 2008. V 18, P. 494-502.

229. Renfranz, P.J., Beckerle, M.C. Doing (F/L)PPPPs: EVH1 domains and their prolinerich partners in cell polarity and migration. // Curr. Opin. Cell Biol., 2002, V. 14, P. 88-103.

230. Resch G.P., Small J.V., Goldie K.N. Electron microscopy of extracted cytoskeletons: negative staining, cryoelectron microscopy and correlation with light microscopy. // In Cell Biology (J.E. Celis ed) 3rd ed„ Elsvier Science., 2005.

231. Ridley AJ, Schwartz MA, Burridge K, Firtel, RA, Ginsberg MH, et al. Cell migration: integrating signals from front to back. // Science, 2003, V. 302, P. 1704-1709.

232. Ridley AJ. Rho GTPases and cell migration. // Journal of Cell Science, 2001, V. 114, P. 2713-2722

233. Ridley, A., Comoglio, P.M., Hall, A. Regulation of scatter factor/hepatocyte growth factor responses by Ras, Rac and Rho in MDCK cells. // Мої. Cell Biol., 1995, V. 15, P. 1110-1122.

234. Ridley, A.J., and Hall, A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. // Cell, 1992, V. 70, P. 389-399.

235. Ridley, A.J., Paterson, H.F., Johnston, C.L., Diekmann, D., and Hall, A. The small GTP-binding protein rac regulates growth factor-induced membrane ruffling. // Cell, 1992, V. 70, P. 401^10.

236. Rinnerthaler G., Geiger B., and Small J.V. Contact formation during fibroblast locomotion: involvement of membrane ruffles and microtubules. // J.Cell.Biol., 1988, V. 106 (3), P. 747 760

237. Rolo A, Skoglund P, Keller R. Morphogenetic movements driving neural tube closure in Xenopus require myosin IIB. // Dev. Biol., 2009, V.327, P. 327-338.

238. Ronen D. and Ravid S. Myosin II Tailpiece Determines Its Paracrystal Structure, Filament Assembly Properties, and Cellular Localization. // J Biol Chem., 2009, V. 284(37), P. 24948-57.

239. Rottner K, Behrendt B, Small JV, Wehland J. VASP dynamics during lamellipodia protrusion. // Nat Cell Biol., 1999, V. 1, P. 321-322.

240. Rottner K, Hall A, Small JV: Interplay between rac and rho in the control of substrate contact dynamics. // Curr Biol 1999, V. 9, P. 640-648.

241. Sahai E., Garcia-Medina R., Pouyssegur J. and Vial E. Smurfl regulates tumor cell plasticity and motility through degradation of Rho A leading to localized inhibition of contractility // J Cell Biol. 2007. V. 176. P. 35-42.

242. Sahai E., Olson M.F., Marshall C.J., Cross-talk between Ras and Rho signalling pathways in transformation favours proliferation and increased motility. // EMBO J., 2001, V. 20, P. 755-766.

243. Sahai, E., and Marshall, C.J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. //Nat. Cell Biol., 2003, V. 5, P. 711-719.

244. Sahai, E., and Marshall, C.J. RHO-GTPases and cancer. // Nat. Rev. Cancer, 2002, V. 2, P. 133-42.

245. Salmon WC, Adams MC, Waterman-Storer CM. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. // J Cell Biol., 2002, V. 158, P. 31-37.

246. Samarin, S., Romero S., Kocks C., Didry D., Pantaloni D., and Carlier M.-F. How VASP enhances actin-based motility. // J. Cell Biol., 2003, V.163, P. 131 142.

247. Sanz-Moreno V, Gadea G, Ahn J, Paterson H, Marra P, Pinner S, Sahai E, Marshall CJ. Rac activation and inactivation control plasticity of tumor cell movement. // Cell. 2008, V. 135(3), P. 510-23.

248. Sastry SK, Burridge K Focal adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. // Exp Cell Res., 2000, V. 261, P. 25-36.

249. Schlaepfer, D.D., Mitra, S.K., Ilic, D. Control of motile and invasive phenotypes by focal adhesion kinase . // Biochim Biophys Acta, 2004, V. 1692, P. 77-102.

250. Schliwa, M., and Honer, B. Microtubules, centrosomes and intermediate filaments in directed cell movement. // Trends Cell Biol., 1993, V. 3, P. 377-380.

251. Schoenwaelder, S.M., and Burridge, K. Bidirectional signaling between the cytoskeleton and integrins. // Curr. Opin. Cell Biol., 1999, V. 11, P. 274-286.

252. Schwartz, M.A. Integrins, oncogenes, and anchorage independence. // J. Cell Biol., 1997, V. 139, P. 575-578.

253. Schwartz, M.A., Schaller, M.D., and Ginsberg, M.H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 1995, V. 11, P. 549-599.

254. Shemesh T. and Kozlov M. Actin polymerization upon processive capping by formin: a model for slowing and acceleration // Biophys J. 2007, V 92(5), P. 1512-21

255. Shutova M. S., Alexandrova A. Y., Vasiliev J. M. Regulation of polarity in cells devoid of actin bundle system after treatment with inhibitors of myosin II activity. // Cell Motil. Cytoskeleton. 2008, V. 65 (9), P. 734-46.

256. Skoble , J., Auerbuch V., Goley E.D., Welch M.D., and Portnoy D.A. Pivotal role of VASP in Arp2/3 complex-mediated actin nucleation, actin branch-formation, and L isteria monocytogenes motility. // J . Cell Biol., 2001, V. 155, P. 89 100 .

257. Skoglund P, Rolo A, Chen X, Gumbiner BM, Keller R. Convergence and extension at gastrulation require a myosin IIB-dependent cortical actin network. // Development 2008, V. 135, P.2435-2444.

258. Small J.V, Rottner K., Kaverina I., Anderson K.I., Assembling an actin cytoskeleton for cell attachment and movement. // Biochim. Biophys. Acta, 1998, V. 1404, P. 271-481.

259. Small J.V. and Sechi A Whole-mount electron microscopy of the cytoskeleton: negative staining methods. // in: Cell Biology: A laboratory handbook (J/Е/ Celis. td.,), 1998, V.3, 2ed, Academic Press, P. 285 292.

260. SMALL J.V., AUINGER S., NEMETHOVA M., KOESTLER S., GOLDIE K.N., HOENGER A. & RESCH G.P. Unravelling the structure of the lamellipodium. // Journal of Microscopy, 2008, V. 231, P. 479-485

261. Small J.V., Winkler C, Vinzenz, M., Schmeiser C. Reply: Visualizing branched actin filaments in lamellipodia by electron tomography. // Nature Cell Biology, 2011, V. 13, P. 1013-1014.

262. Small JV, Isenberg G, Celis JE. Polarity of actin at the leading edge of cultured cells. // Nature. 1978, V. 272(5654), P. 638-9.

263. Small JV, Stradal T, Vignal E, Rottner K. The lamellipodium: where motility begins. // Trends Cell Biol., 2002, V. 12, P. 112-120.

264. Small JV. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. // J Cell Biol., 1981, V. 91, P. 695-705.

265. Small JV. The actin cytoskeleton. // Electron Microsc Rev. 1988, V. 1(1), P. 155-74

266. Small, J. V. and Resch, G. P. The comings and goings of actin: coupling protrusion and retraction in cell motility. // Curr. Opin. Cell Biol., 2005, V. 17, P. 517-523

267. Somlyo A. V., Bradshaw D., Ramos S., Murphy C., Myers C. E., Somlyo A. P. Rho-kinase inhibitor retards migration and in vivo dissemination of human prostate cancer cells. // FEBS Lett., 2000, V.269, P. 652-659.

268. Spector I., Shochet N.R., Blasberger D. and Kashman Y. Latrunculins-Novel Marine Macrolides That Disrupt Microfilament Organization and Affect Cell Growth: I. Comparison with Cytochalasin D. // Cell Motil Cytoskeleton, 1989, V. 13, P. 127-144

269. Steffen A, Faix J, Resch GP, Linkner J, Wehland J, Small JV, Rottner K, Stradal TE. Filopodia formation in the absence of functional WAVE- and Arp2/3-complexes. // Mol Biol Cell. 2006, V. 17(6), P. 2581-91.

270. Steffen A., Rottner K., Ehinger J., Innocenti M., Scita G., Wehland J., Stradal T.E. Sra-1 and Napl link Rac to actin assembly driving lamellipodia formation. // EMBO J., 2004, V. 23(4), P. 749-759

271. Sternlicht, M.D. and Werb, Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol, 2001, V. 17, P. 463-516.

272. Stoker, M., Gherardi, E., Perryman, M., and Gray, J. Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell mobility. //Nature, 1987, V. 327, P. 239-242.

273. Stradal TE, Scita G. Protein complexes regulating Arp2/3-mediated actin assembly. // Curr Opin Cell Biol., 2006, V. 18, P. 4-10.

274. Straight A.F., Cheung A., Limouze J., Chen I., Westwood N.J., Sellers J.R. and Mitchison T.J. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. // Science, 2003, V. 299, P. 1743-1747.

275. Strongin A.Y., Marmer B.L., Grant G.A. and Goldberg G.I. Plasma membrane-dependent activation of the 72-kDa type IV collagenase is prevented by complex formation with TIMP-2 //J Biol Chem. 1993. V. 268(19). P. 14033-9.

276. Sukezane T., Oneyama C., Kakumoto K., Shibutani K., Hanafusa H., Akagi T. Human diploid fibroblasts are resistant to MEK/ERK-mediated disruption of the actin cytoskeleton and invasiveness stimulated by Ras. // Oncogene, 2005, V. 24, P. 5648-5655.

277. Svitkina T. Electron microscopic analysis of the leading edge in migrating cells. // Methods Cell Biol., 2007, V. 79, P. 295-319.

278. Svitkina T.M .and Borisy G.G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells // Methods Enzymol. 1998. V. 298. P. 570-92.

279. Svitkina T.M., Bulanova T.A., Chaga O.Y., Vignjevic D.M., Kojima Sh., Vasiliev J.M. and Borisy G.G. Mechanisms of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network // J. Cell Biol. 2003. V 160: 409.

280. Svitkina TM, Borisy GG. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. // Methods Enzymol. 1998, V. 298, P. 570-92.

281. Svitkina, T. M. & Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. // J. Cell Biol., 1999, V. 145, P. 1009-1026

282. Svitkina, T., Verkhovsky, A. B., McQuade, K. M. & Borisy, G. G. Analysis of the actinmyosin II system in fish epidermal keratocytes: mechanism of cell body translocation. // J. Cell Biol., 1997, V. 139, P. 397-415

283. Takaishi, K., Sasaki, T., Kato, M., Yamochi,W., Kuroda,S., Nakamura, T., Takeichi, M., Takai, Y. Involvment of Rho p21 small GTP-binding protein and its regulator in the HGF-induced cell motility. // Oncogene, 1994, V. 9, P. 273-279.

284. Takenawa T, Suetsugu S. The WASP-WAVE protein network: connecting the membrane to the cytoskeleton. // Nat Rev Mol Cell Biol., 2007, V. 8, P. 37-48.

285. Tamada M, Sheetz MP, Sawada Y. Activation of a signaling cascade by cytoskeleton stretch. //Dev Cell, 2004, V. 7, P. 709-718.

286. Tan, C., Cruet-Hennequart, S., Troussard, A., Fazli, L., Costello, P., Sutton, K., Wheeler, J., Gleave, M., Sanghera, J., and Dedhar, S. Regulation of tumor angiogenesis by integrin-linked kinase (ILK). // Cancer Cell, 2004, V. 5, P. 79-90.

287. Tanenbaum S.W. Cytochalasins. // Biochemical and Cell Biological Aspects. Amsterdam: Elsevier, North Holland. 1978, P. 1-564.

288. Tapon, N., and Hall, A. Rho, Rac and Cdc42 GTPases regulate the organization of the actin cytoskeleton. // Curr. Opin. Cell Biol, 1997, V. 9, P. 86-92.

289. Theriot JA. Accelerating on a treadmill: ADF/cofilin promotes rapid actin filament turnover in the dynamic cytoskeleton. // J Cell Biol., 1997, V. 136(6), P. 1165-8.

290. Thiery, J.P. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. // Nat. Rev. Cancer, 2002, V. 2, P. 442^154.

291. Tilghman, R.W., and Parsons, J.T. Focal adhesion kinase as a regulator of cell tension in the progression of cancer. // Semin. Cancer Biol., 2008, V. 18, P. 45-52.

292. Trinkaus, J.P. Cells into Organs: The Forces that Shape the Embryo. // Prentice-Hall, Englewood Cliffs, NJ., 1969, P. 237.

293. Tsubouchi, A., Sakakura, J., Yagi, R., Mazaki, Y., Schaefer, E., Yano, H. and Sabe, H. Localized suppression of RhoA activity by Tyr31/118-phosphorylated paxillin in cell adhesion and migration. // J. Cell. Biol., 2002, V. 159, P. 673-683.

294. Urban E, Jacob S, Nemethova M, Resch GP, Small JV. Electron tomography reveals unbranched networks of actin filaments in lamellipodia. // Nat Cell Biol., 2010, V. 12(5), P. 429-35.

295. Vallotton P. and Small J.V. Shifting views on the leading role of the lamellipodium in cell migration: speckle tracking revisited. // Journal of Cell Science, 2009, V. 122, P. 19551958

296. Vandekerckhove J, Weber K. At least six different actins are expressed in a higher mammal: an analysis based on the amino acid sequence of the amino-terminal tryptic peptide. // J Mol Biol., 1978, V. 126(4), P. 783-802.

297. Vasiliev, J.M. Cytoskeletal mechanisms responsible for invasive migration of neoplastic cells. // Int. J. Dev. Biol., 2004, V. 48, P. 425-439.

298. Vasiliev, J.M. Polarization of pseudopodial activities: cytoskeletal mechanisms. // J. Cell Sci., 1991, V. 98, P. \-4.

299. Vasiliev, J.M., and Gelfand, I.M. Chapter in Neoplastic and Normal Cells in Culture, Cambridge University Press, Cambridge, 1980.

300. Vasioukhin, V., C. Bauer, M. Yin, and E. Fuchs. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. // Cell, 2000, V. 100, P. 209 219.

301. Verkhovsky AB, Chaga OY, Schaub S, Svitkina, TM, Meister JJ, et al. Orientational order of the lamellipodial actin network as demonstrated in living motile cells. // Mol Biol Cell., 2003, V. 14, P. 4667-4675.

302. Verkhovsky AB, Svitkina TM, Borisy GG. Myosin II filament assemblies in the active lamella of fibroblasts: their morphogenesis and role in the formation of actin filament bundles. //J Cell Biol., 1995, V. 131, P. 989-1002.

303. Verkhovsky, A.B., Svitkina,T.M., and Borisy, G.G. Polarity sorting of actin filaments in cytochalasin-treated fibroblasts. // J. Cell Sci., 1997, V. 110, P. 1693-1704.

304. Vicente-Manzanares M., Ma X., Adelstein R. S., and Horwitz A.R., Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. // Nat Rev Mol Cell Biol., 2009a, V. 10(11), P. 778-790.

305. Vicente-Manzanares M., Zareno J., Whitmore L., Choi C.K. and Horwitz A.F. Regulation of protrusion, adhesion dynamics, and polarity by myosins IIA and IIB in migrating cells. // J Cell Biol., 2007, V. 176, P. 573-580.

306. Vicente-Manzanares, M., Choi, C. K. & Horwitz, A. R. Integrins in cell migration — the actin connection. // J. Cell Sci., 2009, V. 122, P. 199-206

307. Vignjevic D, Kojima S, Aratyn Y, Danciu O, Svitkina T and Borisy GG. Role of fascin in filopodial protrusion. // J Cell Biol 2006. V. 174. P. 863-75.

308. Vojtek A.B., Hollenberg S.M., Cooper J.A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf// Cell. 1993. V 214

309. Volberg, T., Geiger, B., Citi, S., and Bershadsky, A.D. Effect of protein kinase inhibitor H-7 on the contractility, integrity, and membrane anchorage of the microfilament system. // Cell Motil. Cytoskeleton, 1994, V. 29, P.321-38.

310. Wakatsuki T., Wysolmerski R. B., Elson E. L. Mechanics of cell spreading: role of myosin II. // J. Cell Sci., 2003, V. 116 , P. 1617-25.

311. Wang Z., Castresana M.R., Newman W.H., Reactive oxygen and NF-kappaB in VEGF-induced migration of human vascular smooth muscle cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, V. 285, P. 669-674.

312. Wang, Y. L. Exchange of actin subunits at the leading edge of living fibroblasts: possible role of treadmilling. // J. Cell Biol., 1985, V. 101, P. 597-602.

313. Watanabe N and Higashida C. Formins: processive cappers of growing actin filaments // Exp Cell Res. 2004. V 301(1), P.16-22

314. Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C. & Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. // Curr. Biol., 1998, V. 8, P. 1227-1230

315. Webb DJ, Brown CM, Horwitz AF Illuminating adhesion complexes in migrating cells: moving toward a bright future. // Curr Opin Cell Biol., 2003, V. 15, P. 614-620.

316. Webb, D.J., Donais, K., Whitmore, L.A., Thomas, S.M., Turner, C.E., Parsons, J.T., and Horwitz, A.F. FAK-Src signalling through paxillin, ERK and MLCK regulates adhesion disassembly. //Nat. Cell. Biol., 2004, V 2, P. 154-161.

317. Weinberg RA. Mechanisms of malignant progression. // Carcinogenesis. 2008 V. 6, P. 1092-5.

318. Wiseman, B.S., and Werb, Z. Stromal effects on mammary gland development and breast cancer. // Science, 2002, V. 296, P. 1046-1049.

319. Wittmann T, and Waterman-Storer CM. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? // J Cell Sci., 2001, V. 114, P. 3795-803.

320. Wolf, K., Wu, YI., Liu, Y., Geiger, J., Tam, E., Overall, C., Stack, M.S., and Friedl, P. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. //Nat. Cell Biol., 2007, V. 9, P. 893-904.

321. Wolfenson H, Henis, YI. Geiger B. and Bershadsky AD. The Heel and Toe of the Cell's Foot: A Multifaceted Approach for Understanding the Structure and Dynamics of Focal Adhesions. // Cell Motility and the Cytoskeleton, 2009, V. 66, P. 1017-1029

322. Wolfenson H, Lubelski A, Regev T, Klafter J, Henis YI, Geiger B. A role for the juxtamembrane cytoplasm in the molecular dynamics of focal adhesions. // PLoS One, 2009, V. 4, e4304.

323. Worthylake R. A., Lemoine S., Watson J. M., Burridge K. RhoA is required for monocyte tail retraction during transendothelial migration. // J. Cell Biol., 2001, V. 154, P. 147-160.

324. Wyckoff J.B., Jones J.G., Condeelis J.S. and Segall J.E. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor // Cancer Res. 2000. V. 60. P. 2504-2511.

325. Wyckoff JB, Pinner SE, Gschmeissner S, Condeelis JS, Sahai E. ROCK- and myosin-dependent matrix deformation enables protease-independent tumor-cell invasion in vivo. // Curr Biol. 2006 V. 16(15), P. 1515-23.

326. Yamasaki M., Furuike S., and Ito T. Mechanical response of single Filamin A (ABP-280) mjlecules and its role in the actin cytoskeleton // Journal of Muscle Research and Cell Motility. 2002. V. 23. P. 525-534.

327. Yamazaki D., Suetsugu S., Miki H., Kataoka Y., Nishikawa S., Fujiwara T., Yoshida N and Takenawa T. WAVE2 is required for directed cell migration and cardiovascular development // Nature. 2003. V. 424. P. 452-458.

328. Yamazaki, D., Kurisu, S., and Takenawa, T. Regulation of cancer cell motility through actin reorganization. // Cancer Sci., 2005, V. 96, P. 379-386.

329. Yang C & Svitkina T. Visualizing branched actin filaments in lamellipodia by electron tomography. //Nature Cell Biology, 2011, V. 13, P. 1012-1013,

330. Yang C., Czech L., Gerboth S., Kojima S., Scita G. and Svitkina T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells // PloS Biol. 2007. V 5(11): e317.

331. Yang N., Higuchi O., Ohashi K., Nagata K., Wada A., Kangawa K., Nishida E., Mizuno K., Cofilin phosphorylation by LIM-kinase 1 and its role in Rac-mediated actin reorganization. //Nature, 1998, V. 393, P. 809-812.

332. Zaidel-Bar R, Ballestrem C, Kam Z, Geiger B. Early molecular events in the assembly of matrix adhesions at the leading edge of migrating cells. // J Cell Sci., 2003, V.l 16, P. 46054613.

333. Zaidel-Bar R. and Geiger B. The switchable integrin adhesome. // J Cell Sci., 2010, V. 123, P.1385-1388,

334. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R. and Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. //Nat. Cell Biol., 2007, V. 9, P. 858-867.

335. Zamir E, Geiger B, Kam Z. Quantitative multicolor compositional imaging resolves molecular domains in cell-matrix adhesions. // PLoS ONE, 2008, V.3, el901.

336. Zamir E., Katz B.Z., Aota S., Yamada. K.M., Geiger B., Kam. Z. Molecular diversity of cellmatrix adhesions//JCS. 1999. V. 112. P. 1655-1669.

337. Zamir, E., and Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. // J. Cell Sci., 2001, V. 114, P. 3583-3590.

338. Zamir, E., Katz, M., Posen, Y., Erez, N., Yamada, K.M., Katz, B.Z., Lin, S., Lin, D.C., Bershadsky, A., Kam, Z. and Geiger, B. Dynamics and segregation of cell-matrix adhesions in cultured fibroblasts. // Nat. Cell Biol., 2000, V. 2, P. 191-196.

339. Zarnegar, R., and Michalopoulos, M. Purification and biological characterization of human hepatopoietin A, a polypeptide growth factor for hepatocytes. // Cancer Res., 1989, V. 49, P. 3314-3320.

340. Zhuge, Y., and Xu, J. Racl mediates type I collagen-dependent MMP-2 activation, role in cell invasion across collagen barrier. // J. Biol. Chem., 2001, V. 276, P. 16248-16256.

341. Zigmond SH, Evangelista M, Boone C, Yang C, Dar AC, Sicheri F, Forkey J. and Pring M. Formin leaky cap allows elongation in the presence of tight capping proteins // Curr Biol. 2003. V.l3(20). P. 1820-3.

Информация о работе

Александрова, Антонина Юрьевна
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.03.04

Диссертация

Реорганизация актинового цитоскелета, лежащая в основе движения клеток. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы