Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференциальная экспрессия онкозначимых генов при светлоклеточном раке почки

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Дифференциальная экспрессия онкозначимых генов при светлоклеточном раке почки"

064613890

На правах рукописи

) КУДРЯВЦЕВА Анна Викторовна ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ОНКОЗНАЧИМЫХ ГЕНОВ ПРИ

СВЕТЛОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ПОЧКИ

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Москва-2010

004613898

Работа выполнена в Лаборатории структурно-функциональной геномики (зав. лаб. Л.Ю. Фролова) Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Научные руководители: кандидат химических наук

Вера Николаевна Сенченко

доктор биологический наук Лев Львович Киселев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Петр Михайлович Рубцов

доктор биологических наук, профессор Валерий Вячеславович Носиков

Ведущая организация: Медико-генетический научный центр РАМН

Защита диссертации состоится " -У "¿йаирч 2СЮт. в часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан "_ А" АШ^У 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рак почки (РП) - широко распространенное в мире заболевание, основным гистологическим типом которого является светлоклеточная почечноклеточная карцинома (светлоклеточный рак почки, СРП). В мире ежегодно выявляется в среднем 190000 новых случаев рака почки, причем почти у трети больных опухоль служит причиной смерти. Это позволяет считать рак почки одной из основных проблем онкоурологии. До 4% случаев заболевания имеют наследственный характер и связаны с терминальными мутациями в соответствующих генах. В большинстве случаев заболевание на ранней стадии, когда условия для его лечения наиболее благоприятны, выявляют случайно при плановом обследовании. Это обусловливает необходимость разработки новых более надежных, быстрых и доступных для пациентов методов ранней диагностики СРП, послеоперационного мониторинга и раннего выявления метастазов.

Известно, что на ранних этапах развития рака эпителиального происхождения (карцином), в том числе СРП, часто происходят различные геномные и эпигеномные нарушения, особенно на коротком плече хромосомы 3 (Зр) (Zabarovsky et al., 2002; Angeloni D., 2007). В этой области располагаются кластеры генов-супрессоров опухолевого роста и генов-кандидатов (Klein et al., 2007), для которых синтез мРНК и/или белка в опухолях может быть нарушен. Для выяснения роли тех или иных генов в канцерогенезе проводят исследование их структурных и функциональных изменений в опухолях, в том числе оценивают экспрессию на уровне мРНК и белка по сравнению с нормальными тканями. При различных типах рака профили экспрессии одних и тех же генов, могут существенно отличаться. Это свидетельствует о множественности механизмов канцерогенеза и о важности этих генов в процессах малигнизации.

К настоящему времени для СРП не найдено специфичных диагностических маркеров. Все используемые в клинике маркеры, например, М2-РК (изомерная форма пируваткиназы, единственный, внедренный в российскую клиническую практику, маркер), пригодны только в качестве дополнительных и не могут применяться для однозначного установления диагноза. Одним из дополнительных маркеров СРП является повышение уровня сывороточного ферритина. Однако вклад в это изменение каждого их двух генов, FTL и FTH, кодирующих субъединицы белка, до сих пор недостаточно изучен.

Благодаря современному методу кДНК-микропанелей, стало возможным выявление изменений экспрессии сотен и тысяч генов одновременно, которое требует дополнительного уточнения. Для этих целей широко используют ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Количественная оценка изменений экспрессии генов помогает сделать вывод о степени их вовлеченности в процесс развития опухолей почки, вносит важный вклад в понимание молекулярных основ канцерогенеза, а также позволяет выбрать

4 i

\ э

\

гены, которые могут быть перспективными в качестве маркеров ранней диагностики и прогрессии СРП.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы - количественная оценка содержания мРНК генов, расположенных на коротком плече хромосомы 3, которые могут проявлять себя как гены-супрессоры в эпителиальных опухолях - VHL, RBSP3, SEMA3В, SEMA3F, HYAL1, HYAL2, NPRL2, генов кандидатов - ITGA9, CHL1, гена RB1, продукт которого является основной мишенью RBSP3, а также кодирующих субъединицы ферритина генов FTL и FTH при светлоклеточном раке почки.

В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:

1) Отработка методики количественных измерений содержания мРНК генов в образцах СРП и культур клеток почки, позволяющая оптимизировать условия, подобрать подходящие образцы сравнения и контрольные гены для получения воспроизводимых данных.

2) Оценка содержания мРНК выбранных генов.

3) Математическая обработка данных и сопоставление полученных результатов с клиническими характеристиками опухолей.

4) Поиск и обсуждение возможных причин, приводящих к изменению экспрессии исследуемых генов в опухолях почки.

5) Выбор генов, наиболее перспективных для дальнейшего применения в диагностике и генотерапии СРП.

Научная новизна и практическая ценность работы. Методом ПЦР-РВ впервые проведена количественная оценка экспрессии мРНК 13-ти генов, выполняющих в организме различные функции. Выявлено частое снижение содержания мРНК гена FTL, кодирующего легкую цепь ферритина, в то время как изменения гена тяжелой цепи - FTH - не значительные. Показано отсутствие заметных изменений экспрессии двух изоформ классического супрессора при раке почки - гена VHL, в то время как экспрессия белка существенно подавлена. Заметное и частое снижение содержания мРНК наблюдали у генов RBSP3, HYAL1, SEMA3B, СНЫ, дерегуляцияю экспрессии (как случаи повышения, так и понижения) - у генов NPRL2, HYAL2, ITGA9 и SEMA3F. Результаты для 4-х генов со значительным снижением могут быть использованы для разработки панели специфических маркеров ранней диагностики СРП и новых подходов в генотерапии этого заболевания.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлены на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007), «Петровские чтения - 2008» (Санкт-Петербург, 2008), на IX международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Киев, Украина, 2008), «IV конгресс молекулярных генетиков (Ростов-на-Дону, 2010). По материалам диссертации опубликованы две статьи, глава в книге и выдан один патент на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения,

выводов и списка цитированной литературы (136 наименований). Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 19 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы. Образцы опухолевых тканей (Т) СРП I-III клинических стадий и прилегающих к опухолям морфологически нормальных тканей (N) (т.н. «условные нормы») собраны и охарактеризованы в НИИ КО ГУ РОНЦ им H.H. Блохина РАМН. Средний возраст больных, среди которых 53% женщин и 47% мужчин, составил 53 года (32-80). В работе также использованы культуры опухолевых клеток почки ТК10, ТК164, YYK3, KRC/Y, КН39, HN4, Cakil, Caki2, KRC/Y, любезно предоставленные M.B. Кост (Каролинский институт, Стокгольм, Швеция).

Методы. Суммарную РНК выделяли из 50-ти опухолевых тканей почки человека, из 50-ти гистологически нормальных прилежащих к опухоли тканей, а также девяти клеточных линий с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen») с последующей обработкой ДНКазой I. ДНК из тех же тканей выделяли с использованием набора реагентов QIAamp DNA Mini Kit («Qiagen»), Концентрацию РНК и ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop ® ND-1000 ("NanoDrop Technologies Inc.). Параметр RIN (RNA Integrity Number), характеризующий целостность РНК, определяли на приборе Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием гексануклеотидных праймеров и обратной транскриптазы M-MuLV («Fermentas», Литва).

ПЦР-РВ проводили на приборе ABI PRISM ® 7000 Sequence Detection System в режиме относительных измерений (MCt - метод). Расчеты проводили с помощью разработанной в лаборатории программы «АТГ» (Анализ Транскрипции Генов, Свидетельство №2008612585, 2008, Роспатент, РФ). Использовали параметры LD и LI - LD (Level of mRNA Decrease, уровень снижения мРНК), равен 1/R и показывает, во сколько раз содержание мРНК гена снижено в опухоли по сравнению с нормальными тканями, LI (Level of mRNA Increase, уровень повышения мРНК), равен R и показывает, во сколько раз содержание мРНК гена повышено в опухоли по сравнению с нормальными тканями. Для статистического анализа использовали тесты Уилкоксона, Манна-Уитни, Крускала-Уоллиса, а также рассчитывали коэффициенты ранговой корреляции Спирмена.

Анализ метилирования проводили при помощи стандартной методики бисульфитного сиквенирования. ДНК обрабатывали бисульфитом при помощи набора EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research Corporation, Orange, CA, U.S.A.). Исследовали CpG-островки гена HYALI (-220 -560 п.н. NM_153281.1) и гена HYAL2 (-513 -742 п.н. NM_033158.2).

Оценку содержания белковых продуктов гена VHL проводили полуколичественно методом иммуногистохимии, при помощи конфокального микроскопа (SPE5, Leica).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Отработка методики проведения ПЦР-РВ

Выполнены необходимые предварительные опыты: выбор контрольных генов и образцов сравнения, оптимизация условий реакции для контрольных и исследуемых генов. Подобраны оптимальные концентрации праймеров и зондов, при которых амплитуда кинетических кривых и эффективность реакции (Е) максимальны. Для оценки уровня мРНК выбрали в качестве оптимальных два контрольных гена - вШВ и ЯРМ1, для которых значение порогового цикла (СО варьировало в пределах 2-х циклов (то есть +/- 2 раза). Для оценки изменений копий ДНК использовали три контрольных гена АСТВ, С и Б В и ЯРАЧ, для которых значение С1 варьировало в +/-1.5 раза).

Гены /*Т/, и ГТН, кодирующие субъединицы ферритина

Известно, что в сыворотке больных раком почки часто повышается содержание белка ферритина. Ферритин - основной переносчик негемового железа (РеЗ+ в форме гидроокиси) в организме. Этот белок образован 24-мя тяжелыми Н- и легкими Ь- субъединицами, кодируемыми двумя генами, расположенными на разных хромосомах - РТН (СепеГО: 2495, ИМ_002032, 1Ц13) и РТЬ (СепеГО: 2512, ЫМ_000146, 19д13.3). При ряде заболеваний отмечено резкое повышение содержания сывороточного ферритина ^аквка, 2005), которое при СРП в той или иной мере может служить опухолевым маркером (КаэЬуар е1 а1., 2005). Показано, что в регуляции экспрессии гена РТЬ принимает участие белок УНЬ, мутации этого гена выявлены в большинстве образцов СРП. Ранее оценку содержания мРНК генов РТЬ и FГ# в опухолях почки не проводили. Механизмы активации синтеза ферритина в сыворотке до конца не ясны.

В работе впервые показано снижение уровня мРНК от 2-х до 6-ти раз в 58% (23/40, Р<0.001) случаев СРП, значение 1ЛЭср составило 3 раза (рис.1). В остальных образцах уровень мРНК гена РТЬ не изменялся. Степень и частота изменений на 1-ой, П-ой и Ш-ей клинических стадиях близки.

Уровень мРНК гена РТН, в основном, сохраняется (73%, 11/15). В 27% (4/15) образцов обнаружено снижение, в отдельных случаях - до 4 раз (рис 2), среднее значение для всей выборки близко к единице.

Таким образом, обнаружено незначительное снижение содержания мРНК гена F7,Z, примерно в половине исследованных образцов, содержание мРНК гена РТН практически не изменялось. Биоинформатический анализ показал, что случаи снижения экспрессии гена РТЬ не обусловлены наличием мутаций в участках мРНК гена, соответствующих положению используемых в работе праймеров и зондов.

0,1 -1---------

ЪЪЪЪЬЪЪЪЬ '^¿г^ЪЪЪЪЪ ^о^^-Ь^МЪ^о Стадия 1 Стадия II Стадия III

Рис.1 Относительное содержание мРНК (Я) гена РТЬ в 40 образцах СРП.

> -V ъ Стадия III

Рис.2 Относительное содержание мРНК (R) гена FTH.

Известно, что соотношение легкой и тяжелой субъединиц ферритина может существенно варьировать даже в различных функциональных состояниях одной и той же клетки (Коойб, Уфоеп, 2007). Показано, что для экспрессии генов /<7Х и КГН важную роль играет посттранксрипционная регуляция, зависящая от содержания ионов железа, однако ее механизмы для этих генов различны. Полученные либо о предпочтительном вкладе

результаты могут свидетельствовать посттранскрипционной регуляции в повышение синтеза ферритина (Koorts, Viljoen, 2007, Sammarco et al., 2008), либо, что вероятнее, об отсутствии ассоциации между увеличением уровня ферритина в сыворотке крови и непосредственно в опухолевых клетках почки. Долгое время местом основного синтеза ферритина при СРП считали клетки самой опухоли почки (Essen et al., 1991). Однако, основываясь на полученные данные, а также на базы данных SAGE, можно предположить, что источником повышения уровня ферритина у онкологических больных являются макрофаги в очагах

хронического воспаления, сопутствующего опухоли. Сохранение содержания мРНК гена FTH при СРП не позволяет говорить об участии этого гена в канцерогенезе почки. Кроме того, полученные данные свидетельствуют об отсутствии значимых корреляций между изменением содержания мРНК генов FTL и FTH, что может указывать на независимые механизмы регуляции их экспрессии на уровне транскрипции. Такой вывод соответствует данным о различных путях регуляции экспрессии FTL и FTH и о распространенности «изоформ» ферритина, различающихся содержанием легких и тяжелых цепей (Koorts, Viljoen, 2007).

Гены, расположенные на хромосоме Зр

Большинство генов, рассмотренных ниже, расположены на коротком плече хромосомы 3 в районе Зр21, который уже более 20-ти лет находится под пристальным вниманием исследователей. Введение продуктов генов этого района может приводить к подавлению роста различных опухолевых клеток. В районе Зр21 выделяют 2 основные критичные области - АР20 и LUCA, в которых ранее идентифицированы десятки генов-супрессоров и генов-кандидатов.

Ген VHL

Ген VHL - известный супрессор опухолевого роста, который в течение многих лет исследуют в связи с его ролью в возникновении и развитии СРП и некоторых других заболеваний. Для этого гена характерны множественные мутации как при наследственных (синдром Хиппеля-Линдау), так и при спорадических формах рака почки. Показано, что количество белкового продукта при СРП значительно снижено (Kaelin, 2007). Ген VHL (GeneID: 7428, Зр25) имеет изоформу 1, размером 6.5 т.п.н. (NM_000551.2), которая содержит 3 экзона, и изоформу 2, размером б т.п.н. (NM_198156.1) содержащую первый и третий экзоны (Latif et al. 1993, Richards et al., 1996). Таким образом, в клетке формируются 2 белковых продукта гена VHL, которые содержат альфа- и бета- домены. Эти белки исходно располагаются в цитоплазме, но при участии бета-домена способны перемещаться между цитоплазмой и ядром (Lee et al., 1999), что является важным для участия в регуляции транскрипции и продукции ростовых факторов (Groulx, Lee, 2002). Посредством альфа-домена белок VHL формирует стабильные комплексы с В- и С-субъединицами элонгина (Takagi et al., 1997), куллина 2 (как и бета-домен) (Lonergan et al., 1998), и RING-box белка Rbxl (Kamura et al., 1999), что необходимо для образования убиквитин - ЕЗ - белок-лигазного комплекса. При гипоксии и потере функции VHL происходит стабилизация гипоксия-индуцибельного фактора (HIF1-альфа), что приводит к гиперэкспресии онкогена с-МЕТ и эффекту взаимного усиления в индукции заболевания (Pennacchietti et al., 2003).

Результаты количественной оценки содержания мРНК двух известных изоформ гена VHL в опухолях СРП представлены на рисунке 3. В подавляющем большинстве случаев (70%, 21/30, Р<0.05) обнаружено

сохранение содержания мРНК изоформы 1 гена УНЬ по сравнению с «условными» нормальными тканями (рис 3). В 23% (7/30) образцов выявлено снижение содержание мРНК этой изоформы, в 7% (2/30) обнаружено повышение. Уровень мРНК изоформы 1 гена УНЬ изменяется незначительно - повышается до 2 раз, снижается до 4 раз. Среднее значение содержания мРНК в образцах опухоли для всей выборки близко к единице.

Для изоформы 2 гена УНЬ также в подавляющем большинстве случаев (77%, 23/30, Р<0.05) обнаружено сохранение содержания мРНК по сравнению с «условными» нормальными тканями (рис. 3). В 20% (6/30) образцах выявлено снижение содержание мРНК изоформы 2, в 3% (1/30) обнаружено повышение. Уровень мРНК изоформы 2 изменяется незначительно - повышается до 3 раз, снижается до 3 раз, в среднем -практически не изменяется. Для двух изоформ степень и частота изменений, соответствующих различным клиническим стадиям и для всей выборки, имеют близкие значения. В клеточных линиях содержание мРНК двух изоформ гена УНЬ снижается значительнее, чем в образцах первичных опухолей - до 17 раз. Отличия в содержании мРНК в клеточных линиях по сравнению с первичными опухолями можно объяснить возможными изменениями из-за длительного культивирования.

Согласно данным анализа с использованием Иой-микропанелей (в сотрудничестве с группой Е. Забаровского, Каролинский институт, Швеция) обнаружены случаи метилирования и/или делеций, выборочно для 17 образцов ДНК из общей выборки опухолей почки.

Я

0,1

□ УН£, изоформа 1

□ УН/., изоформа 2

Л

|П

г

I м

/■?з-7Яв>еа/0 Ъ >, ъ % Ъ Ъ ЪЪ ^ Ф ^ ^ ^ ^ ¿о

Стадия I

Стадия II Образцы кДНК Рис.3. Относительное содержание мРНК изоформ гена УНЬ.

Стадия III

Показано что в 10 образцах, для которых определяли уровень мРНК, количество белка УНЬ заметно снижено по сравнению с «условно нормальной» тканью (рис 4).

Рис.4. Данные иммуногистохомического анализа белка УНЬ в опухолевых (а) и «условно нормальных» (б) тканях почки (парные образцы). На фотографиях белок УНЬ показан зеленым цветом.

у ♦

« / %

& » й У "

¿л *

9 ; *

ь р

« , О

1; /

Важная роль гена-супрессора УНЬ при развитии СРП показана уже более 20-ти лет. В литературе имеются многочисленные данные о мутациях этого гена, связанных с развитием рака и уменьшением количества белкового продукта. Однако данные об уровне мРНК в образцах СРП в литературе до сих пор отсутствовали. Механизмы подавления экспрессии белка УНЬ, описанного во многих работах, а также подтвержденного нами на образцах исследуемой выборки, окончательно не установлены. Проведенная в работе впервые количественная оценка содержания мРНК двух изоформ гена УНЬ позволяет сделать вывод, что, снижение белка не связано с подавлением транскрипции этого гена.

Ген УНЬ

Ген УЬЬЬ (вепеЮ: 50853, 3р21.3, ЫМ_015873) к настоящему времени мало изучен. Белковый продукт этого гена относится к семейству виллинов/гельзолинов, то есть является компонентом цитоскелета и участвует в контроле вязкости цитоплазмы, по-видимому, У1ЬЬ принимает участие в связывании актина. Ранее в нашей лаборатории показано, что при раке легкого уровень мРНК гена У1ЬЬ существенно снижен.

В подавляющем большинстве образцов (87%, 13/15), в которых провели количественную оценку содержания мРНК гена УЬЬЬ, изменений не выявлено. В одном образце выявлено незначительное повышение уровня мРНК - всего в 2,5 раза, а в одном образце - слабое снижение - в 3,5 раза. Таким образом, несмотря на расположение в районе, подверженном частым геномным и эпигеномным изменениям при СРП, содержание мРНК этого гена практически не изменяется.

Этот факт свидетельствует о дифференциальной экспрессии гена VILL в этих типах рака. Данные о содержании в тканях белка VILL при СРП и других эпителиальных злокачественных новообразованиях в литературе отсутствуют.

Ген ITGA9

Ген ITGA9 (GeneID: 3680, Зр21.3) имеет одну изоформу (NM_002207.2), расположен в области АР20 и кодирует субъединицу мембранного белка, принадлежащего семейству интегринов - поверхностных гликопротеинов клетки, обеспечивающих адгезию между клетками, а также клетками и внеклеточным матриксом. Белок представляет собой гетеродимер, состоящий из альфа- и бета-субъединиц, и является рецептором для VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) (Albelda, 1991). Данные литературы по изменению содержания мРНК ITGA9 в карциномах человека практически отсутствуют. Ранее методом ПЦР-РВ выявлено снижение уровня мРНК в 90% образцов немелкоклеточного рака легкого, которое в основном вызвано метилированием и делециями (Анедченко и др. 2008).

Результаты количественной оценки экспрессии гена ITGA9 в опухолях СРП представлены на рисунке 5 и в таблице 1 (см. стр. 23). В подавляющем большинстве случаев (72%, 36/50, Р<0.05) обнаружено сохранение содержания мРНК гена ITGA9 по сравнению с «условно нормальными» тканями. В 22% (11/50) образцов СРП обнаружено повышение содержание мРНК гена ÍTGA9, в 6% (3/50) образцов - снижение. Уровень мРНК гена ITGA9 варьировал - понижался до 5 раз и повышался до 13 раз, его среднее значение для всей выборки близко к единице. Однако на I-ой и П-ой клинических стадиях преобладает повышение уровня мРНК (Р<0,05), в то время как на Ш-ей стадии происходит как снижение, так и повышение, т.е. дерегуляция. Выявлено также статистически значимое различие частоты и степени снижения в образцах Ш-ей клинической стадии по сравнению с образцами 1-ой и Н-ой стадий (Р<0,05, критерий Манна-Уитни).

Во всех изученных клеточных линиях транскрипт гена ITGA9 отсутствовал, то есть его экспрессия полностью подавлена. Совместно с группой Е. Забаровского показано, что участки промотора ITGA9 в этих клеточных линиях подвержены тотальному метилированию, по-видимому, это основной механизм инактивации гена. Различие данных, полученных для первичных опухолей и клеточных линий возможно обусловлено многократным пассированием, а также рядом других факторов. Вероятно, в клеточных линиях функция молекул клеточной адгезии ITGA9 перестает быть необходимой, и промотор гена подвергается гиперметилированию.

Данные Notl-микропанелей выборочно для 17 образцов ДНК показали в 4-х случаях наличие делеций и/или метилирования, а в 5 случаях, по-видимому, происходят дупликации ДНК гена JTGA9. В нескольких опухолях со сниженным или повышенным уровнем мРНК не обнаружено геномных

или эпигеномных изменений. Эти результаты указывают на существование различных механизмов регуляции экспрессии гена 1ТСА9.

US 1J i si iflTl ¡ II ill) тЙ 1 ilLlnk L

У ' | 'II' f'y ' ■*■{• 'I...........U' pi 4 r I]

Стадия I Стадия П Стадия III

Образцы кДНК

Рис 5. Относительное содержание мРНК гена ITGA9

Гены RBSP3 и RB1

Гены RBSP3 и RB1 являются участниками сигнального пути pI6INK4A/Rbl, нарушения которого приводит к неконтролируемому делению клетки. Ген RBSP3 (GeneID: 10217, 3р21.3) из области АР20, имеет две изоформы A (NM_001008392, 4455 п.н.) и В (NM_005808, 4422 п.н.). Белковый продукт гена принадлежит семейству малых CTD (С-Terminal Domain) сериновых фосфатаз, катализирующих дефосфорилирование сериновых остатков С-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II и других белков (Yeo, et al., 2003; Kashuba et al. 2004; Zabarovsky et al., 2005). Белок RBSP3 обладает способностью подавлять рост опухолевых клеток in vitro и in vivo. В образцах рака шейки матки и немелкоклеточного рака легкого, показано снижение экспрессии этого гена методом ПЦР-РВ (Анедченко и др, 2007, Анедченко и др, 2008, Sinha et al., 2008, Mitra et al., 2010, Senchenko et al., 2010). Данные по оценке содержания мРНК гена RBSP3 в опухолевых тканях почки отсутствуют.

Ген RBI (GeneID: 5925, 3ql4, NM_000321.2) кодирует белок, который локализуется в ядре и экспрессируется в большинстве типов клеток. Белок pRBl является ключевым звеном сигнального пути р16шк4а-Сс1к/циклин-рЯВ1, осуществляющего негативную регуляцию процесса клеточного деления, и может быть активирован при участии белка RBSP3. RBSP3 дефосфорилирует RB1 по серину в положении 807-811, останавливая клеточный цикл на границе фаз митоза G1 и S и контролируя пролиферацию (Kashuba et al., 2004).

Результаты количественной оценки содержания мРНК гена ЛВЗРЗ и ЯВ1 в опухолях СРП представлены на рисунке 6. В 48% (24/50) исследуемых опухолей почки экспрессия гена снижается по сравнению с «условными» нормальными тканями (48%, 24/50, Р<0.05, таблица 1). В остальных образцах изменений не обнаружено. Уровень мРНК гена ЯВ8РЗ снижен от -2-х до -11-ти раз, значение ЦЭср составило 4 раза. Степень и частота снижений выше в образцах Ш-ей клинической стадии, по сравнению с образцами 1-ой и П-ой стадий (Р<0.05).

Стадия I Стадия II Стадия III

Образцы кДНК

Рис 6. Относительное содержание мРНК генов RBSP3 и RB1.

Таким образом, при СРП происходит заметное и частое снижение экспрессии гена RBSP3, особенно в образцах Ш-ей клинической стадии. Для большинства клеточных линий уровень мРНК также снижен от 2-х до 25 раз.

В тех же образцах СРП оценили количество копий гена RBSP3 относительно 3-х контрольных генов - АСТВ, GUSB и RPN1 методом ПЦР-РВ. Делеции обнаружены в 38% (19/50) образцов, случаев амплификаций не выявлено. По данным метода бисульфитного секвенирования, полученным в сотрудничестве с группой Е. Забаровского, в 28% образцов СРП выявлено метилирование промоторной области гена RBSP3. Таким образом, снижение уровня мРНК гена RBSP3 в опухолях почки может быть обусловлено в основном метилированием промоторной области и делециями.

Известно, что частое подавление экспрессии гена RBSP3 характерно для различных типов рака, например, рака легкого (аденокарциномы и плоскоклеточного рака) и рака шейки матки (Senchenko et al., 2010). В снижении уровня мРНК гена RBSP3 в этих типах рака, так же как и СРП, важную роль играют метилирование и делеции.

В половине исследуемых опухолей почки содержание мРНК гена RB1 повышается по сравнению с «условно нормальными» тканями (46%, 23/50, Р<0.05) до 25 раз. Только в одном образце уровень мРНК снижен в 4 раза. В остальных образцах изменений не обнаружено. Координированных изменений уровня мРНК генов RBSP3 и RB1 не выявлено. Известно, что ген RBI является супрессором опухолевого роста, при многих типах рака экспрессия его белка значительно подавлена. При раке молочной железы основным механизмом подавления являются частые онко-ассоциированные мутации (Derenzini et al., 2007). RBSP3 и RBI могут взаимодействать на уровне белковых продуктов. По-видимому, если функциональный белок RB1 не может синтезироваться вследствие мутаций, то клетка активирует синтез мРНК, однако на поздних стадиях активации уже не происходит и в основном наблюдается сохранение содержания мРНК.

Ген NPRL2

Ген NPRL2 (GeneID: 10641, NM_006545, 3р21.3) из области LUCA, имеет одну изоформу и кодирует растворимый белок, состоящий из белок-связывающего домена, имеющего сходство с коровым доменом белка MutS и домена, регулирующего пермеазу азота (Li J. et al., 2004; Zabarovsky et al., 2005). Белок обладает способностью подавлять рост опухолевых клеток in vitro и in vivo (Ji L. et al., 2002). Предполагают, что белковый продукт гена NPRL2 участвует в регуляции клеточного цикла и апоптоза, а также, возможно, в репарации повреждений ДНК. Ранее методом ПЦР-РВ показано значительное снижение содержания мРНК этого гена при раке легкого, причем при плоскоклеточном раке частота и степень снижения существенно больше, по сравнению с аденокарциномой (Senchenko et al., 2010). При гепатоцеллюлярной карциноме методом ПЦР-РВ показано повышение содержания мРНК NPRL2, которое связано с прогрессией заболевания и является независимым прогностическим признаком общей выживаемости (Otani et al., 2009).

Результаты количественной оценки содержания мРНК гена NPRL2 в опухолях СРП представлены на рисунке 7. В подавляющем большинстве случаев СРП (72%, 36/50, Р<0.05) обнаружено сохранение содержания мРНК гена NPRL2 по сравнению с «условно нормальными» тканями, в 16% (8/50) образцов выявлено снижение, в 12% (6/50) - повышение. Максимальное повышение и снижение уровня мРНК гена NPRL2 составило около 5-ти раз. Значение LIcp для всей выборки составило 3 раза, LDq, - 3 раза. Степень и частота изменений, соответствующих 1-ой и П-ой клиническим стадиям, близки. Обнаружена тенденция к увеличению частоты и степени снижения в образцах Ш-ей клинической стадии по сравнению с образцами 1-ой и 11-ой стадии (Р=0,072). Во всех изученных клеточных линиях выявлено снижение содержания мРНК гена NPRL2 от 2-х до 13 раз.

Стадия I Стадия II Стадяя III

Образцы к ДНК

Рис 7. Относительное содержание мРНК гена ЫРЯЬ2.

При СРП, по сравнению с карциномами других локализаций (Li et al,, 2004) снижение экспрессии мРНК гена NPRL2 менее значительное и более редкое, причем статистически значимо только на Ш-ей клинической стадии и в целом для всей выборки. Практически отсутствуют данные о механизмах, приводящих к изменению уровня мРНК гена NPRL2 в различных карциномах. Обнаружены гомозиготные делеции 3' области гена в клеточных линиях рака почки, легкого, а также в единичных опухолях яичников, шейки матки и простаты, в которых экспрессия мРНК гена NPRL2 отсутствовала (Li et al., 2004).

Полученные данные свидетельствуют о разных механизмах регуляции транскрипции гена NPRL2 и о его различной роли в развитии карцином: при гепатоцеллюлярной карциноме NPRL2 проявляет себя как онкоген, при раке легкого, молочной железы и шейки матки - как ген-супрессор, а при СРП происходит его дерегуляция.

Гены HYAL1 и HYAL2

Гены HYAL1 (GenelD: 3373, NM_007312, NM_033159, NMJ53283, NM_153285, NMJ53281, 3p21.3-p21.2) и HYAL2 (GenelD: 8692, NMJXB773, NM_033158, 3p21.3) кодируют ферменты гиалуронидазы, которые расщепляют гиалуроновую кислоту (ГК). ГК участвует в поддержании водного баланса в тканях, в регуляции пролиферации и миграции клеток посредством передачи сигналов между клетками через взаимодействие с их поверхностными рецепторами CD44 и RHAMM (Toole et al., 2004). Белок HYAL2 расщепляет высокомолекулярную ГК до небольших фрагментов размером до 20 кДа, в то время как белок HYAL1 расщепляет эти фрагменты до низкомолекулярных продуктов. Потеря активности этих белков приводит

к накоплению ГК, что, возможно, является одним из этапов на пути малигнизации и инвазии клеток (Csoka et al., 2001). HYALl принимает участие в регуляции неоангиогенеза в опухолях. Недавно для H Y ALI и HYAL2 показана опухоль-подавляющая активность in vivo, но не in vitro (Wang et al., 2008). В опухолях легкого методом ПЦР-РВ выявлено значительное снижение экспрессии генов HYALI и HYAL2 в большинстве изученных образцов (Анедченко и др, 2008).

Результаты количественной оценки содержания мРНК генов HYAL1 и HYAL2 в опухолях СРП представлены на рисунке 8 и в таблице 1.

Стадия I Стадия II Стадия III

Образцы кДНК

Рис 8. Относительное содержание мРНК генов НУЛЬ! и НУАЬ2.

В подавляющем большинстве образцов СРП обнаружено значительное снижение содержание мРНК гена НУАЫ по сравнению с нормальной тканью (74%, 37/50). В остальных образцах изменений не обнаружено. Уровень мРНК гена НУАЫ снижался довольно значительно - до -12 раз. Значения ЬОср составило 4 раза. Среднее значение уровня мРНК для всей выборки составило 3,5 раза. Степень и частота изменений, соответствующих 1-ой, П-ой и Ш-ей клиническим стадиям, близки.

Профиль экспрессии гена НУАЬ2 принципиально отличается от профиля НУАЫ. В подавляющем большинстве образцов СРП (72%, 36/50, Р<0.05) содержание мРНК гена НУАЬ2 не изменяется по сравнению с «условно нормальными» тканями. В 14% (7/50) образцов содержание мРНК гена НУАЬ2 повышено, в 14% (7/50) образцов - понижено. Уровень мРНК гена НУАЬ2 значительно варьировал - от повышения в 12 раз до снижения в 6 раз. Среднее значение уровня мРНК для всей выборки - около 1. Большой разброс значений свидетельствует о дерегуляции экспрессии этого гена при СРП. Степень и частота изменений, соответствующих 1-ой и П-ой

клиническим стадиям, близки. Выявлено статистически значимое различие частоты и степени снижения в образцах Ш-ей клинической стадии по сравнению с образцами 1-ой и И-ой стадий (Р=0.009), причем на 1-ой клинической стадии происходит повышение, а на Ш-ей стадии - снижение (Р<0.05).

Область промотора гена HYALI гипер метилирована в пяти исследованных образцах со сниженной экспрессией мРНК (до 8 раз). Промотор гена HYAL2 в образцах со сниженным содержанием мРНК (до 4,5 раз) также подвержен метилированию, однако, не столь значительному (около трети из 14 исследованных сайтов).

Во всех восьми изученных клеточных линиях содержание мРНК гена HYAL1 существенно снижено - от 6 до 400 раз. Содержание мРНК гена HYAL2 снижено не столь значительно - от 2-х до 20-ти раз. Координированных снижений экспрессии двух генов не выявлено.

Таким образом, при СРП происходит значительное и частое снижение уровня мРНК гена HYAL1 на 1-ой, а также последующих клинических стадиях, в то время как экспрессия HYAL2 подвергается дерегуляции. Основным механизмом подавления экспрессии генов HYAL1 и HYAL2, по-видимому, является метилирование CpG-островков промоторной области.

Полученные данные подтверждают, что гиалуронидазы вовлечены в процессы канцерогенеза, в том числе в развитие рака почки. Регуляция различных биологических свойств матрикса, в том числе плотности, -сложный многокомпонентный процесс, нарушения которого могут усиливать метастазирование и неоангиогенез при онкологических заболеваниях (Csoka et al., 2001). По-видимому, нарушение активности синтетаз и гиалуронидаз при СРП может отражаться на течении заболевания, в частности, нами доказана ассоциация изменения экспрессии гена HYAL2 с прогрессией СРП.

Гены SEMA3B и SEMA3F

Гены SEMA3B (GenelD: 7869, NMJXM636, NM_001005914, 3р21.3) и SEMA3F (GenelD: 6405, NM_004186.3, 3р21.3) принадлежат к третьему классу семейства генов семафоринов-коллапсинов, белковые продукты которых участвуют в передаче аксонных сигналов и являются секретируемыми. SEMA3B и SEMA3F, по-видимому, участвуют в подавлении процессов ангиогенеза в опухоли через конкуренцию за Np-рецепторы с сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF). Возможно также участие белка SEMA3B в процессе инициации апопгоза. Показано, что белки SEMA3B и SEMA3F могут проявлять опухоль-подавляющую активность in vivo при некоторых типах рака (Todd et al., 1996). Характерна высокая частота гомо- и гемизиготных делеций гена SEMA3B при различных карциномах человека (Lerman и Minna, 2000, Kuroki et al., 2003). В отличие от гена SEMA3B в нуклеотидной последовательности гена SEMA3F не было обнаружено ни одной мутации в 60 клеточных линиях различных типов рака легкого (Sekido et al., 1996, Xiang et al., 1996).

Результаты количественной оценки содержания мРНК генов SEMA3B и SEMA3F в опухолях СРП представлены на рисунке 9 и в таблице 1. В подавляющем большинстве образцов (82%, 41/50, Р<0.05) обнаружено значительное снижение содержания мРНК гена SEMA3B по сравнению с нормальной тканью - до 50 раз, значения LDcp составило 5 раз. В остальных образцах изменений не обнаружено. Среднее значение уровня мРНК составило 3 раза. Степень и частота изменений, соответствующих 1-ой, П-ой и Ш-ей клиническим стадиям, близки. Транскрипционные профили генов SEMA3B и SEMA3F существенно отличаются. В большинстве образцов СРП (60%, 30/50) обнаружено значительное повышение уровня мРНК гена SEMA3F по сравнению с нормальной тканью - до 12 раз (LIcp - 3,7 раза), в 10% (5/50) случаев - незначительное снижение. Среднее значение уровня мРНК для всей выборки составило 2,1 раза. Степень и частота изменений, соответствующих 1-ой и П-ой клиническим стадиям, близки. Выявлено статистически значимое уменьшение частоты и степени повышения уровня мРНК в образцах Ш-ей клинической стадии по сравнению с образцами 1-ой и П-ой стадии (Р<0,05). Во всех изученных клеточных линиях уровень мРНК гена SEMA3B снижался от 4 до 200 раз. Уровень мРНК гена SEMA3F снижен не столь значительно - от 2-х до 6-ти раз.

Таким образом, при СРП происходит значительное и частое снижение экспрессии гена SEMA3B на 1-ой, а также последующих клинических стадиях. Содержание мРНК гена SEMA3F, напротив, на 1-ой и Н-ой клинических стадиях заметно повышается. На Ш-ей стадии, по-видимому, происходит дерегуляция экспрессии SEMA3F, поскольку в равном количестве образцов уровень мРНК повышен и понижен.

Стадия I Стадия II Стадия III

Образцы кДНК

Рис 9. Относительное содержание мРНК генов БЕМАЗВ и БЕМЛЗЕ.

Показано, что SEMA3B и SEMA3F проявляют себя при некоторых видах рака как супрессоры опухолевого роста (Tomizawa et al., 2001, Xiang et al., 2002). Выявленное нами снижение содержания мРНК гена SEMA3B было ожидаемыми. Снижение количества белка SEMA3B в тканях опухолей, скорее всего, происходит посредством двух механизмов - множественных мутаций гена, а также подавления экспрессии на уровне транскрипции, по-видимому, обусловленного метилированием промоторной области (Kuroki et al., 2003). Экспрессия гена SEMA3F и кодируемого им белкового продукта в образцах СРП до настоящего времени детально не изучена. Можно предположить, что повышение содержания мРНК этого гена на первых двух клинических стадиях обеспечивает сдерживание усиливающегося процесса ангиогенеза посредством конкуренции SEMA3F с VEGF за нейропилиновые рецепторы. Однако к третьей стадии, когда заболевание прогрессирует, происходит дерегуляция экспрессии. Для уточнения механизмов функционирования белка SEMA3F необходимы дополнительные исследования о содержании белка в тканях, о наличии мутаций гена и метилирования промоторной области при СРП.

Ген CHL1

Ген CHL1 (GenelD: 10752 NM 006614.2, 3р26.3, часто используемый синоним - CALL) кодирует трансмембранные молекулы клеточной адгезии (САМ - cell adhesion molecule). Этот ген к настоящему времени изучен недостаточно. CHL1 экспрессируется в большинстве нормальных тканей, главным образом в виде транскрипта с размером 8 т.п.н. В некоторых тканях и клеточных линиях обнаружен транскрипт с размером 4.5 т.п.н. Этот ген вовлечен в процессы когнитивной деятельности, некоторые неврологические заболевания, например, шизофрению. Недавно было показано, что некоторые молекулы клеточной адгезии, включая L1, вовлечены в развитие рака и процессы метастазирования.

Результаты количественной оценки содержания мРНК гена CHL1 в опухолях СРП представлены на рисунке 10 и в таблице 1. В подавляющем большинстве случаев СРП (87%, 26/30, Р<0.05) обнаружено существенное снижение уровня мРНК гена CHL1 по сравнению с «условно нормальными» тканями - до 320 раз. Значение LDq, для всей выборки составило 18 раз. Выявлена тенденция к уменьшению частоты и степени снижения в образцах Ш-ей клинической стадии по сравнению с образцами 1-ой и И-ой стадии (Р=0,099).

Таким образом, при СРП происходит подавление экспрессии гена CHL1, причем уже на 1-ой клинической стадии.

! № t 1 I 1 5 I t ( ц \ Е [ Щ J 1

/ ^ г а- е «у в г0 ?? ъ % ъ ъ ъ ъ ъ-Ъ Ъ ❖ ^ ^ ❖ ^ •Ь

Стадия I Стадия II Стадия III

Образцы кДНК Рис 10. Относительное содержание мРНК гена CHL1.

Во всех клеточных линиях экспрессия гена СНЫ существенно подавлена - в 5-ти клеточных линиях транскрипта выявлено не было, еще в 3-х обнаружено снижение уровня мРНК от 70 до 770 раз. Возможно, более заметное снижение содержания мРНК в клеточных линиях по сравнению с образцами первичных опухолей связано с изменениями клеток в ходе пассирования клеточной культуры.

До сих пор в литературе отсутствовали данные по изменению экспрессии белка CHL1 при СРП. При таком существенном снижении содержания мРНК велика вероятность, что количество белка также снижено. Поскольку CHL1 относится к молекулам клеточной адгезии, то его участие в процессах развития заболевания, в частности, метастазирования ожидаемо. Однако мы не выявили заметного увеличения снижения содержания мРНК в образцах с метастазами (рис.10, образцы 25-30). Экспрессия не уровне мРНК существенно подавлена уже на 1-ой клинической стадии. Скорее всего, это связано с тем, что при метастазировании нарушается функционирование очень большого количества молекул, при этом CHL1, как и некоторые другие, перестает нормально функционировать на самых ранних этапах заболевания, а другие молекулы вносят свой вклад позже, что уже является критичным для сохранения целостности солидной опухоли и вызывает отсоединения отдельных клеток и их попадание в лимфатическую и кровеносную системы.

стадии Г Е н ы

П11.\РЗ ПУЛ и хЕмлт сни .ЧЕМЛЗГ ,\РК!.2 нули 1ТСА9

Т 0 (0/22) 0 (0/22) 0 (0/22) 0 (0/10) 73 (16/22) 14 (3/22) 18 (4/22) 23 (5/22)

0 45 (10/22) 27 (6/22) 23 (5/22) 10 (1/10) 23 (5/22) 82 (18/22) 82 (18/22) 77 (17/22)

I 1 55 (12/22) 73 (16/22) 77 (17/22) 90 (90/1 0) 4 (1/22) 4 (1/22) 0 (0/22) 0 (0/22)

Ср 12 (17Т 1.5) ¿3 (¿9-1) 44 (450-1) 424 (424302) Т2.5 (42-Т9) 1 (43-Т3) 1 (41.5-ТЗ) 1 (42-Т2)

Т 0 (0/12) 0 (0/12) 0 (0/22) 0 (0/10) 83 (10/12) 17 (2/12) 25 (3/12) 50 (6/12)

0 83 (10/12) 33 (4/12) 0 (0/22) 0 (0/10) 17 (2/12) 75 (9/12) 67 (8/12) 42 (5/12)

II I 17 (2/12) 67 (8/12) 100 (12/12) 100 (10/1 0) 0 (0/12) 8 (1/12) 8 (1/12) 8 (1/12)

Ср ¿1,5 (15-1) 42 (45-1) 47 (425-42) 417 (43493) Т4 (412) 1 (42-Т5) 1 (45-13) Т2 (45113)

! 0 (0/16) 0 (0/16) 0 (0/16) 10 (1/10) 25 (4/16) 6 (1/16) 0 (0/16) 0 (0/16)

0 31 (0.16) 19 (3/16) 25 (4/16) 20 (2/10) 50 (8/16) 56 (9/16) 63 (10/16) 88 (14/16)

III 1 69 (11/16) 81 (13/16) 75 (12/16) 70 (7/10) 25 (4/16) 38 (6/16) 37 (6/16) 12 (2/16)

Ср 43 (1П-1) ¿4 (41311.5) 43 (4142) 413 (420496) 1 (43-Т6) 41.5 (45-Т2) 42 (45-Т1-5) 1 (45-Т2)

т 0 (0/50) 0 (0/50) 0 (0/50) 3 (1/30) 60 (30/50) 12 (6/50) 14 (7/50) 22 (11/50)

0 50 (25/50) 26 (13/50) 18 (9/50) 10 (3/30) 30 (15/50) 72 (36/50) 72 (36/50) 72 (36/50)

Всего 1 50 (25/50) 74 (37/50) 82 (41/50) 87 (26/3 0) 10 (5/50) 16 (8/50) 14 (7/50) 6 (3/50)

Ср 42 (411-Т1.5) 43 (413-Т1.5) 44 (450-Т2) 418 (424302) Т2 (43-412) 42 (45-Т5) 1 (46-43) 1 (45413)

снижение дерегуляция

Примечание: Серым цветом выделены результаты, для которых Р>0.05 (тест Уилкоксона).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые проведена количественная оценка содержания мРНК 13-ти генов методом ПЦР-РВ при основном гистологическом типе рака почки -СРП, а также в клеточных линиях почки. Большинство генов расположены на коротком плече хромосомы 3, многие - в районе Зр21, в котором обнаружены группы генов с опухоль-подавляющей активностью. Известно, что при эпителиальных опухолях различной локализации часто происходят геномные и эпигеномные нарушения в этой области ^аЬагоуэку й а1„ 2002).

Обнаруженный характер изменений экспрессионных профилей исследованных в работе генов, расположенных на Зр, позволяет условно разделить их на три группы (таблица 1).

К первой группе отнесены гены КВБРЗ, НУАЫ БЕМАЗВ и СНЫ, содержание мРНК которых часто и значительно снижено на всех стадиях заболевания. Эти гены, по-видимому, вовлечены в процесс возникновения и развития СРП и могут быть потенциальными онкомаркерами для диагностики заболевания. Снижение уровня мРНК гена СНЫ (87%, до 302 раз) описано нами впервые и получен патент.

Ко второй группе отнесены гены 5ЕМАЗР, ИРЯЬ2, НУАЬ2 и 1ТСА9, у которых происходит дерегуляция экспрессии - случаи, как повышения, так и снижения.

Уровень мРНК остальных генов - У1Ы и УНЬ, не изменен (третья группа). Экспрессия белковых продуктов генов не всегда коррелирует с уровнем их мРНК, что обусловлено существованием различных механизмов регуляции, например, в случае УНЬ - посредством возникновения онко-ассоциированных мутаций, или посредством связывания с регуляторной микро-РНК.

Обнаружение активации и инактивации транскрипции генов при патологических процессах имеет фундаментальное и практическое значение для биологии и медицины.

выводы

1. Методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в 50 образцах светлоклеточного рака почки (СРП) 1-Ш стадий впервые обнаружены различные профили экспрессии 10-ти генов-супрессоров опухолевого роста и генов-кандидатов, расположенных на хромосоме 3 (Зр21-26). Сильное снижение выявлено у генов ЯВБРЗ (50%), НУАЫ (74%), БЕМАЗВ (82%), СНЫ (87%), дерегуляция (как случаи понижения, так и повышения) - 5ЕМАЗР, ЫРШ, НУАЫ, 1ТСА9, отсутствие изменений - УНЬ и У1Ы.

2. Выявлено увеличение частоты и степени снижения мРНК генов ЯВБРЗ 1ТСА9 НУАЫ и БЕМАЗЕ в образцах Ш-ей клинической стадии по сравнению с образцами 1-ой и Н-ой стадий (Р<0,05), что свидетельствует о связи этих изменений с прогрессией заболевания.

3. Метилирование промоторной области гена ЯВБРЗ обнаружено в 28% образцов (метод бисульфитного секвенирования), делеции - в 37% (ПЦР-РВ).

4. Показано, что снижение содержания мРНК генов НУАЫ и НУА12 вызвано метилированием Срв-островков промоторной области.

5. Для известного гена-супрессора УНЬ обнаружены редкие случаи делеций и/или метилирования (гибридизация на 1\'о(:1-микропанелях), преимущественное (>70%) сохранение содержания мРНК двух изоформ в опухоли по сравнению с нормой (ПЦР-РВ) при подавленной экспрессии белка (иммуногистохимия). Эти результаты свидетельствуют, что изменение содержания мРНК, не вносит значительный вклад в снижение количества белка УНЬ в опухоли.

6. Значительное и частое снижение экспрессии генов ЯВБРЗ, НУАЫ, БЕМАЗВ и СНЫ уже на начальных стадиях заболевания свидетельствует о функциональной важности кодируемых ими белков в предотвращении возникновения и/или развития опухолей почки, а также позволяет рассматривать их в качестве перспективных молекулярных маркеров для диагностики и генотерапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. A.B. Кудрявцева. Е.А. Анедченко, Н.Ю. Опарина, Г.С. Краснов, К.Н. Кашкин, A.A. Дмитриев, И.Б. Зборовская, Т.Т. Кондратьева, Т.В. Виноградова, М.В. Зиновьева, Е.П. Копанцев, В.Н. Сенченко. Экспрессия генов FTL и FTH, кодирующих субъединицы ферритина, при раке легкого и почки. Мол. биол., 2009, 43(6), стр. 1-11.

2. F. Wang, E.V. Grigorieva, J. Li, V.N. Senchenko, T.V. Pavlova, Е.А. Anedchenko, A.V. Kudryavtseva. A. Tsimanis, D. Angeloni, M.I. Lerman, V.l. Kashuba, G. Klein, E.R. Zabarovsky. HYALl and HYAL2 Inhibit Tumour Growth In Vivo but Not In Vitro. PLoS ONE, 2008, 3(8), p. еЗОЗ 1.

3. E.R. Zabarovsky, E.A. Braga, V. Loginov, V. Senchenko, A. Kudryavtseva, A. Dmitriev, D. Khodyrev, T. Pavlova, A.V. Rynditch, M.I. Lerman, V. Kashuba, Novel Methylation-Dependent Markers/Tumor Suppressor Genes Involved in the Development of Renal Cell Cancer, Horizons in Cancer Research, 2010, V.42.

Патент

«Способ диагностики светлоклеточной почечноклеточной карциномы и набор для его осуществления» (CALL), авторы А.В.Кудрявцева, Е.А. Анедченко, Т.Т. Кондратьева, М.И. Лерман, В.Н.Сенченко. Дата поступления 20.02.2009, № 2009105812/15(007776). Решение о выдаче патента 01.02.2010.

Тезисы

Материалы диссертации представлены на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007), «Петровские чтения - 2008» (Санкт-Петербург, 2008), «Петровские чтения - 2010» (Санкт-Петербург, 2010), на IX международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Киев, Украина, 2008), «IV конгресс молекулярных генетиков (Ростов-на-Дону, 2010).

Заказ № 222-а/10/10 Подписано в печать 28.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кудрявцева, Анна Викторовна

----------------------------------------------------------------------------------------Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБОЗНАЧЕНИЯ ГЕНОВ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация рака почки

1.2. Наследственный и спорадический светлоклеточный рак почки

1.3. Молекулярно-генетические нарушения при карциномах почки

1.4. Роль хромосомы 3 в развитии светлоклеточного рака почки

1.5. Методы оценки экспрессии генов

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы

2.1.1. Образцы тканей и клеточных линий

2.1.2. Образцы ДНК и кДНК из опухолевых и нормальных тканей почки и клеточных линий-----------------------------------------------.

2.2. Методы исследований

2.2.1. Выделение РНК

2.2.2. Выделение ДНК

2.2.3. Реакция обратной транскрипции

2.2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени

2.2.5. Анализ метилирования

2.2.6. Статистический анализ данных

2.2.7. Иммуногистохимический анализ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка методической базы для ПЦР

3.1.1. Выбор контрольных генов для ПЦР-РВ

3.1.2. Выбор образцов сравнения для ПЦР-РВ

3.2. Количественная оценка содержания мРНК генов при СРП

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дифференциальная экспрессия онкозначимых генов при светлоклеточном раке почки"

Рак почки (РП) - распространенное злокачественное новообразование, возникающее примерно с одинаковой частотой, как у мужчин, так и у женщин. РП часто встречается у детей (нефробластома), причем большинство случаев заканчивается летальным исходом [Fear et al., 2009]. Обычно РП взрослых людей имеет эпителиальное происхождение, то есть является карциномой. Основными причинами, увеличивающими риск возникновения карцином почки, считаются наследственность, гормональный дисбаланс, иммунодефицитные состояния, ионизирующие излучения и курение. Согласно данным статистики, при первом обращении за врачебной помощью примерно у 25% больных имеются симптомы отдаленных метастазов, поскольку в начальном периоде развития опухоли клинические симптомы скудны или отсутствуют. Поэтому большинство случаев выявления заболевания на ранней стадии, когда условия для ее лечения наиболее благоприятны, являются случайными находками при плановом обследовании. Между тем, при диагностике РП на 1-ой стадии развития заболевания выживаемость больных достигает 70%. Все это обуславливает необходимость разработки новых, более надежных, быстрых и доступных широкому кругу пациентов методов ранней диагностики РП, послеоперационного мониторинга и раннего выявления метастазов.

Развитие злокачественных опухолей почки - многофакторный и многостадийный процесс, в основе которого лежит накопление клетками различных изменений, затрагивающих многие гены. Для каждого гистологического типа РП характерны изменения в разных хромосомах. К ранним событиям при развитии наиболее распространенного гистологического типа РП — светлоклеточной почечноклеточной карциномы (далее — светлоклеточный рак почки - СРП) - относят аллельные потери, геми- и гомозиготные делеции короткого плеча хромосомы 3 (Зр). Изменения в районе Зр были впервые открыты при раке легкого и в дальнейшем выявлены при многих типах карцином [Ji et al., 2005]. Еще в 1997 г. показано, что введение субхромосомных фрагментов Зр в опухолевые клеточные линии приводит к подавлению их роста [Kok et al., 1997]. Это позволило предположить возможное присутствие генов-супрессоров опухолевого роста (TSG - Tumor Suppressor Genes) в этом районе генома. Долгое время на хромосоме 3 человека были известны лишь несколько TSG: FHIT, MLH1, VHL [Kok et al., 1997]. К настоящему времени, благодаря использованию микросателлитных маркеров, и картированию гомозиготных делеций в первичных опухолях и клеточных линиях, идентифицировано более 50 новых генов - потенциальных супрессоров опухолевого роста, значительную часть которых представляют гены, локализованные в районе Зр21 [Angeloni, 2007]. Белковые продукты генов из этой области выполняют в клетке разнообразные ключевые функции: регуляция клеточного цикла и адгезии, инициация апоптоза, репарация ДНК и др. Для некоторых из них доказана принадлежность к супрессорам опухолевого роста (например, RBSP3, NPRL2, SEMA3B, RASSF1 (изоформы А и С) и др.). Однако для большинства генов Зр роль в канцерогенезе до сих пор не ясна. Исследования TSG в основном посвящены структурным и функциональным изменениям кодируемых ими белков в различных опухолях. На сегодняшний день практически отсутствуют данные об изменениях экспрессии на уровне транскрипции в опухолях большинства TSG и кандидатов в супрессоры. Отсутствие и/или снижение количества мРНК гена в клетке с большой долей вероятности свидетельствует о снижении содержания или отсутствии соответствующего белка, однако при сохранении содержания мРНК, количество белкового продукта также может быть иногда существенно снижено. Более того, для многих TSG существует несколько изоформ мРНК, некоторые из которых кодируют белковые продукты, а некоторые, по-видимому, принимают участие в регуляции экспрессии, механизмы которой в большинстве случаев до конца не изучены. Выбранные гены изучены в различной степени, для некоторых известны функции белковых продуктов, для VHL, RBSP3, NPRL2, SEMA3B, HYAL1 и HYAL2 рядом авторов показана способность подавлять опухолевый рост. Также изучали изменение экспрессии некторых генов на уровне мРНК и/или белка, в основном, на клеточных линиях и, реже, в единичных опухолях различных карцином, с использованием качественных и полуколичественных методов. В случае генов NPRL2, HYAL1 и HYAL2 исследовали роль метилирования в подавлении их транскрипции.

Оценка содержания мРНК в опухолях - один из важных этапов в функциональных исследованиях TSG. При помощи к ДНК-микропанелей возможно исследовать изменение экспрессии сотен и тысяч генов, однако данный метод не позволяет количественно оценить содержание мРНК интересующих генов, для этих целей используют метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

Представленная работа посвящена количественной оценке содержания мРНК генов, расположенных на коротком плече хромосомы 3, которые могут проявлять себя как TSG в эпителиальных опухолях -VHL, RBSP3, SEMA3B, SEMA3F, HYALl, HYAL2, NPRL2, генов кандидатов в TSG - ITGA9, VILL, СНЫ, гена RB1, продукт которого является основной мишенью RBSP3, а также генов, кодирующих субъединицы ферритина - FTL и FTH в основном гистологическом типе рака почки - СРП, а также в культурах клеток почки, полученных от больных почечноклеточной карциномой. Помимо этого, в работе исследовали возможные механизмы выявленных изменений уровня мРНК: для некоторых генов изучали метилирование области промотора, для некоторых генов оценили изменение количества копий в опухолевых клетках по сравнению с нормальными. Полученные данные сопоставили с клиническими характеристиками исследуемых опухолей; провели сравнительный анализ изменения содержания мРНК генов в одних и тех же образцах СРП.

В работе впервые методом ПЦР-РВ выявлено частое снижение содержания мРНК гена РТЬ, кодирующего легкую цепь ферритина, в то время как изменения гена тяжелой цепи — РТН - не значительные. Показано отсутствие значимых изменений экспрессии двух изоформ классического супрессора при раке почки - гена УНЬ, в то время как экспрессия белка существенно подавлена. Заметное и частое снижение наблюдали у генов КВБРЗ, НУАЫ, БЕМАЗВ, СНЫ, дерегуляцию экспрессии (как случаи повышения, так и понижения) — у генов ИРКЬ2, НУАЬ2, 1ЮА9 и БЕМАЗР. Исследовали возможные причины, приводящие к изменению экспрессии некоторых генов в опухолях почки. Выявлено, что в подавлении экспрессии гена КВБРЗ могут принимать участие как делеции, так и метилирование, снижение содержания мРНК генов НУАЫ и НУАЫ вызвано метилированием Срв-островков промоторной области, а для известного гена-супрессора УНЬ обнаружены редкие случаи делеций и/или метилирования. Результаты для 4-х генов со значительным снижением могут быть использованы для разработки панели специфических маркеров ранней диагностики СРП и новых подходов в генотерапии этого заболевания.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кудрявцева, Анна Викторовна

выводы

1. Методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в 50-ти образцах светлоклеточного рака почки (СРП) 1-Ш стадий впервые обнаружены различные профили экспрессии 10-ти генов-супрессоров опухолевого роста и генов-кандидатов, расположенных на хромосоме 3 (Зр21-26). Сильное снижение выявлено у генов ЯВЗРЗ (50%), НУАЫ (74%), 8ЕМАЗ В (82%), СНЫ (87%), дерегуляция (как случаи понижения, так и повышения) - БЕМАЗР, ЫРЯ12, НУАЬ2, 1ТвА9, отсутствие изменений - УНЬ и VIЬЬ.

2. Выявлено увеличение частоты и степени снижения содержания мРНК генов ЯВБРЗ1ТОА9 НУА12 и БЕМАЗР в образцах III-ей клинической стадии по сравнению с образцами 1-ой и П-ой стадий (Р<0,05), что свидетельствует о связи этих изменений с прогрессией заболевания.

3. Метилирование промоторной области гена ЯВБРЗ обнаружено в 28% образцов (метод бисульфитного секвенирования), делеции - в 37% (ПЦР-РВ).

4. Показано, что снижение содержания мРНК генов НУАЫ и НУАЬ2 вызвано метилированием СрО-островков промоторной области.

5. Для известного гена-супрессора УНЬ обнаружены редкие случаи делеций и/или метилирования (гибридизация на N01:1-микропанелях), преимущественное (>70%) сохранение содержания мРНК двух изоформ в опухоли по сравнению с нормой (ПЦР-РВ) при подавленной экспрессии белка (иммуногистохимия). Эти результаты свидетельствуют, что изменение содержания мРНК не вносит значительный вклад в снижение количества белка УНЬ в опухоли.

6. Значительное и частое снижение экспрессии генов ЯВ8РЗ, НУАЫ, БЕМАЗВ и СНЫ уже на начальных стадиях заболевания свидетельствует о функциональной важности кодируемых ими белков в предотвращении возникновения и/или развития опухолей почки, а также позволяет рассматривать их в качестве перспективных молекулярных маркеров для диагностики и генотерапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые проведена количественная оценка содержания мРНК 13-ти генов методом ПЦР-РВ при основном гистологическом типе рака почки — СРП, а также в клеточных линиях почки. Большинство генов расположены на коротком плече хромосомы 3, многие - в районе Зр21, в котором обнаружены группы генов с опухоль-подавляющей активностью. Известно, что при эпителиальных опухолях различной локализации часто происходят геномные и эпигеномные нарушения в этой области ^аЬагоуяку е1 а1., 2002].

Обнаруженный характер изменений экспрессионных профилей исследованных в работе генов, расположенных на Зр, позволяет условно разделить их на три группы (таблица 12).

К первой группе отнесены гены ЯВЗРЗ, НУАЫ БЕМАЗВ и СНЫ, содержание мРНК которых часто и значительно снижено на всех стадиях заболевания. Эти гены, по-видимому, вовлечены в процесс возникновения и развития СРП и могут быть потенциальными онкомаркерами для диагностики заболевания. Снижение уровня мРНК гена СНЫ (87%, до 302 раз) описано нами впервые и получен патент (№2009105812/15(007776).

Ко второй группе отнесены гены ЗЕМАЗР, НРЯЬ2, НУАЬ2 и 1ЮА9, у которых происходит дерегуляция экспрессии - случаи как повышения, так и снижения.

Уровень мРНК остальных генов - У1ЬЬ и ¥НЬ, не изменен (третья группа). Экспрессия белковых продуктов генов не всегда коррелирует с уровнем их мРНК, что обусловлено существованием различных механизмов регуляции, например, в случае УНЬ - посредством возникновения онко-ассоциированных мутаций, или посредством связывания с регуляторной микро-РНК.

Обнаружение активации и инактивации транскрипции генов при патологических процессах имеет фундаментальное и практическое значение для биологии и медицины.

90

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кудрявцева, Анна Викторовна, Москва

1. Блинов H.H. TNM: Классификация злокачественных опухолей. 2003. 6-е изд. СПб.: Эскулап. С. 192-196.

2. Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. От идентификации геномного полиморфизма к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей. Молекулярная биология. 2004. 38. С. 145-154.

3. Киселев Л.Л., Сенченко В.Н., Опарина Н.Ю., Брага Э.А., Забаровский Е.Р. Гены-супрессоры-опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека. Молекулярная медицина 2005. 3. С. 17-28.

4. Коваленко H.A., Головченко К.В., Лесничук С.А. и др. Определение активности теломеразы в новообразованиях почки и простаты. Вопр. биол.,мед. и фармац. химии. 2003. 1. С. 21—25.

5. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия. 2000. 65(1). С. 5-33.

6. Лукьянов К.А., Гурская Н.Г., Богданова Е.А., Лукьянов С.А. Селективная супрессия полимеразной цепной реакции. Биоорганическая химия. 1999. (25)3. С. 163-170.

7. Татосян А.Г. Онкогены. Сборник обзорных статей «Канцерогенез». 2000. под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир, стр. 57-74.

8. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия. 2000. 65(1). С. 34-47.

9. RASSF1A, ITGA9, HYAL1 and HYAL2 genes in non-small cell lung cancer. Mol Biol (Mosk). 2008. 42(6). P. 965-976.

10. Angeloni D. Molecular analysis of deletions in human chromosome 3p21 and the role of resident cancer genes in disease. Brief Funct Genomic Proteomic. 2007. 6(1). P. 19-39.

11. Albelda S.M. Endothelial and epithelial cell adhesion molecules. Am J Respir Cell Mol Biol. 1991. 3. P. 195-203.

12. H.Bernard P.S., Wittwer C.T. Real-time PCR technology for cancer diagnostics. Clin Chem. 2002. 48(8). P.l 178-1185.

13. Bertrand P., Courel M.N., Maingonnat C., Jardin F., Tilly H., Bastard C. Expression of HYAL2 mRNA, hyaluronan and hyaluronidase in B-cell non-Hodgkin lymphoma: relationship with tumor aggressiveness. Int J Cancer. 2005. 113(2). P. 207-212.

14. Brambilla E., Constantin B., Drabkin H., Roche J. Semaphorin SEMA3F localization in malignant human lung and cell lines: Asuggested role in cell adhesion and cell migration. Am J Pathol. 2000. 156(3). 939-950.

15. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol. 2000. 25(2). P. 169-193.

16. Bustin S.A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problms. J Mol Endocrinol. 2002. 29(1). P. 23-39.

17. Cowey C.L., Hutson T.E. Molecularly targeted agents for renal cell carcinoma: the next generation. Clin Adv Hematol Oncol. 2010. 8(5). P. 357-64.

18. Csoka A.B., Frost G.I., Stern R. The six hyaluronidase-like genes in the human and mouse genomes. Matrix Biol. 2001. 20(8). P. 499-508.

19. Dacic S. Molecular profiling of lung carcinoma: identifying clinically useful tumor markers for diagnosis and prognosis. Expert Rev. Mol. Diagn. 2007. 7(1). P. 77-86.

20. Dheda K., Huggett J.F., Bustin S.A., Johnson M.A., Rook G., Zumla A. Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR. Biotechniques. 2004. 37(1). P. 112-114, 116, 118-119.

21. Duan D.R., Pause A., Burgess W.H., Aso T., Chen D.Y., Garrett K.P., Conaway R.C., Conaway J.W., Linehan W.M., Klausner R.D. Inhibition of transcription elongation by the VHL tumor suppressor protein. Science. 1995. 269(5229). P. 1402-1406.

22. Essen A., Ozen H., Ayhan A., Ergen A., Tasar C., Remzi F. Serum ferritin: a tumor marker for renal cell carcinoma. J. Urol. 1991. 145(6). P. 1134-1137.

23. Eymin B., Gazzeri S., Brambilla C., Brambilla E. Distinct pattern of E2F1 expression in human lung tumours: E2F1 is upregulated in small cell lung carcinoma./ Oncogene. 2001. 20(14). P. 1678-1687.

24. Eymin B., Gazzeri S., Brambilla C., Brambilla E. Mdm2 overexpression and pl4(ARF) inactivation are two mutually exclusive events in primary human lung tumors. Oncogene. 2002. 21(17). P. 2750-2761.

25. Fear N.T., Vincent T.J., King J.C., MacCarthy A., Bunch K.J., Murphy M.F. Wilms tumour and paternal occupation: an analysis of data from the National Registry of Childhood Tumours. Pediatr Blood Cancer. 2009. 53(1). P. 28-32.

26. Franzmann E.J , Schroeder G.L., Goodwin W.J., Weed D.T., Fisher P. Lokeshwar V.B. Expression of tumor markers hyaluronic acid and hyaluronidase (HYAL1) in head and neck tumors. Int J Cancer. 2003. 106(3). P. 438-445.

27. Fujisawa H, Kitsukawa T. Receptors for collapsin/semaphorins. Curr Opin Neurobiol. 1998. 8(5). 587-592.

28. Gao W., Keohavong P. Analysis of K-RAS and P53 mutations in sputum samples. Methods Mol Biol. 2005. 291. P. 217-233.

29. GeneCards database, http://bioinformatics.weizmann. ac.il/cards/

30. Gibson U.E., Heid C.A., Williams P.M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 1996. 6(10). P. 995-1001.

31. Grail A, Hancock B.W, Harrison P. 1992. Serum ferritin in normal individuals and in patients with malignant lymphoma and chronic renal failure measured with seven different commercial immunoassay techniques. J Clin Pathol. 35, 1204—1212.

32. Groulx I., Lee S. Oxygen-dependent ubiquitination and degradation of hypoxia-inducible factor requires nuclear-cytoplasmic trafficking of the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein. Mol Cell Biol. 2002. 22(15). P. 5319-5336.

33. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer. Cell. 2000. 100(1). P. 57-70.

34. Hahn W.C., Weinberg R.A. Rules for making human tumor cells. N Engl J Med. 2002. 347(20). P. 1593-1603.

35. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996. 6(10). P. 986-994.

36. Hesson L.B., Cooper W.N., Latif F. Evaluation of the 3p21.3 tumour-suppressor gene cluster. Oncogene. 2007. 26. P. 7283-7301.

37. Jacobson A., Rahmanian M., Rubin K., Heldin P. Expression of hyaluronan synthase 2 or hyaluronidase 1 differentially affect the growth rate of transplantable colon carcinoma cell tumors. Int J Cancer. 2002. 102(3). P. 212-219.

38. Ji L., Minna J.D., Roth J.A., 3p21.3 tumor suppressor cluster: prospects for translational applications. Future Oncol. 2005. 1(1). P. 79-92.

39. Kibel A., Iliopoulos O., DeCaprio J.A., Kaelin W.G. Jr. Binding of the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein to Elongin B and C. Science. 1995. 269(5229). P.1444-1446.

40. Klatte T., Pantuck A.J. Molecular biology of renal cortical tumors. Urol Clin North Am. 2008. 35(4). P. 573-580.

41. Knudson A.G. Hereditary cancer, oncogenes, and antioncogenes. Cancer Res. 1985. 45. P. 1437-1443.

42. Ko J.L., Cheng Y.W., Chang S.L., Su J.M., Chen C.Y., Lee H. MDM2 mRNA expression is a favorable prognostic factor in non-small-cell lung cancer. Int J Cancer. 2000. 89(3). P. 265-270.

43. Koorts A.M., Viljoen M. Ferritin and ferritin isoforms II: protection against uncontrolled cellular proliferation, oxidative damage and inflammatory processes. Arch Physiol Biochem. 2007 (1). 113(2). P. 55-64.

44. Koorts A.M., Viljoen M. Ferritin and ferritin isoforms I: Structure-function relationships, synthesis, degradation and secretion. Arch Physiol Biochem. 2007 (2). 113(1). P. 30-54.

45. Kovar J.L., Johnson M.A., Volcheck W.M., Chen J., Simpson M.A. Hyaluronidase expression induces prostate tumor metastasis in an orthotopic mouse model. Am J Pathol. 2006. 169(4). P. 1415-1426.

46. Kuroki ,T., Trapasso F., Yendamuri S., Matsuyama A., Alder H., Williams N.N., Kaiser L.R., Croce C.M. Allelic loss on chromosome 3p21.3 and promoter hypermethylation of semaphorin 3B in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2003. 63(12). P.3352-3355.

47. Lee S., Chen D.Y., Humphrey J.S., Gnarra J.R., Linehan W.M., Klausner R.D. Nuclear/cytoplasmic localization of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product is determined by cell density. Proc Natl Acad Sci USA. 1996. 93(5). P. 1770-1775.

48. Lepperdinger G., Strobl B., Kreil G. HYAL2, a human gene expressed in many cells, encodes a lysosomal hyaluronidase with a novel type of specificity. J Biol Chem. 1998. 273(35). P. 22466-22470

49. Li J., Wang F., Haraldson K., Protopopov A., Duh F.M., Geil L., Kuzmin I., Minna J.D., Stanbridge E., Braga E., Kashuba V.I., Klein

50. G., Lerman M.I., Zabarovsky E.R. Functional characterization of the candidate tumor suppressor gene NPRL2 located in 3p21.3C. Cancer Res. 2004. 64. P. 6438-6443.

51. Li R., Todd N.W., Qiu Q., Fan T., Zhao R.Y., Rodgers W.H., Fang

52. H.B., Katz R.L., Stass S.A., Jiang F. Genetic deletions in sputum asdiagnostic markers for early detection of stage I non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2007. 13(2). P. 482-487.

53. Liu D.W., Chen S.T., Liu H.P. Choice of endogenous control for gene expression in nonsmall cell lung cancer. Eur Respir J. 2005. 26(6). P. 1002-1008.

54. Lokeshwar V.B., Cerwinka W.H., Lokeshwar B.L. HYAL1 hyaluronidase: a molecular determinant of bladder tumor growth and invasion. Cancer Res. 2005 (a). 65(6). P. 2243-2250.

55. Lokeshwar V.B., Cerwinka W.H., Isoyama T., Lokeshwar B.L. HYAL1 hyaluronidase in prostate cancer: a tumor promoter and suppressor. Cancer Res. 2005 (b). 65(17). P. 7782-7789.

56. Madan A.K., Yu K., Dhurandhar N., Cullinane C., Pang Y., Beech D.J. Association of hyaluronidase and breast adenocarcinoma invasiveness. Oncol Rep. 1999. 6(3). P. 607-609.

57. Mertz J.R., Theil E.C. Subunit dimers in sheep spleen apoferritin. The effect on iron storage. J Biol Chem. 1983. 258(19). P. 11719-11726.

58. Milman N, Pedersen L. 2002. The serum ferritin concentration is a significant prognostic indicator of survival in primary lung cancer. Oncology reports. 9, 193—198.

59. Miyata Y., Koga S., Nishikido M., Hayashi T., Kanetake H. Relationship between serum ferritin levels and tumour status in patients with renal cell carcinoma. BJU Int. 2001. 88(9), P. 974-977.

60. Palmer E.L., Ruegg C., Ferrando R., Pytela R., Sheppard D. Sequence and tissue distribution of the integrin alpha-9 subunit, a novel partner of beta-1 that is widely distributed in epithelia and muscle. J. Cell Biol. 1993. 123. P. 1289-1297.

61. Pennacchietti S., Michieli P., Galluzzo M., Mazzone M., Giordano S., Comoglio P.M. Hypoxia promotes invasive growth by transcriptional activation of the met protooncogene. Cancer Cell. 2003. 3(4). P. 34761.

62. Radonic A., Thulke S., Mackay I.M., Landt O., Siegert W., Nitsche A. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. 313. P. 856-862.

63. Richards F,M„ Schofield P,N„ Fleming S„ Maher E,R. Expression of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene during human embryogenesis. Hum Mol Genet. 1996. 5(5). P.639-644.

64. Ronai Z., Yabubovskaya M.S., Zhang E., Belitsky G.A. K-ras mutation in sputum of patients with or without lung cancer. J Cell Biochem Suppl. 1996. 25. P. 172-176.

65. Sammarco M.C., Ditch S., Banerjee A., Grabczyk E. Ferritin L and H subunits are differentially regulated on a post-transcriptional level. J Biol Chem. 2008. 283(8). 4578-4587.

66. Schlessinger J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 2000. 103(2). P. 211-225.

67. Shu J., Jelinek J., Chang H., Shen L., Qin T., Chung W., Oki Y., Issa J.P. Silencing of bidirectional promoters by DNA methylation in tumorigenesis. Cancer Res. 2006. 66(10). P. 5077-5084.

68. Simpson M.A. Concurrent expression of hyaluronan biosynthetic and processing enzymes promotes growth and vascularization of prostate tumors in mice. Am J Pathol. 2006. 169(1). P. 247-257.

69. Takagi Y., Pause A., Conaway R.C., Conaway J.W. Identification of elongin C sequences required for interaction with the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein. J Biol Chem. 1997. 272(43). P. 27444-27449.

70. Toole BP. Hyaluronan: from extracellular glue to pericellular cue. Nat. Rev. Cancer. 2004. 4. P. 528-539.

71. Tse C., Xiang R.H., Bracht T., Naylor S.L. Human Semaphorin 3B (SEMA3B) located at chromosome 3p21.3 suppresses tumor formation in an adenocarcinoma cell line. Cancer Res. 2002. 62(2). P. 542-546.

72. Virmani AK., Gazdar A.F. Tumor suppressor genes in Lung cancer. Methods Mol. Biol. 2003. 222. P. 97-115.

73. Wang J., Xie L.Y., Allan S., Beach D., Hannon G.J. Myc activates telomerase. Genes Dev. 1998. 12(12). P. 1769-1774.

74. Weinberg R.A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 1995. 81. P. 323-330.

75. Wistuba I.I., Lam S., Behrens C., Virmani A.K., Fong K.M., LeRiche J., Samet J.M., Srivastava S., Minna J.D., Gazdar A.F. Molecular damage in the bronchial epithelium of current and former smokers. J Natl Cancer Inst. 1997. 89(18). P. 1366-1373.

76. Wong M.L., Medrano J.F. Real-time PCR for mRNA quantification. BioTechniques. 2005. 39. P. 1-11.

77. Xiang R., Davalos A.R., Hensel C.H., Zhou X.J., Tse C., Naylor S.L. Semaphorin 3F gene from human 3p21.3 suppresses tumor formation in nude mice. Cancer Res. 2002. 62(9). P. 2637-2643.

78. Yarden Y., Sliwkowski M.X. Untangling the ErbB signalling network. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2001. 2. P. 127- 137.

79. Ye Y., Vasavada S., Kuzmin I., Stackhouse T., Zbar B., Williams B.R. Subcellular localization of the von Hippel-Lindau disease gene product is cell cycle-dependent. Int J Cancer. 1998. 78(1). P. 62-69.

80. Yeo M., Lin P.S., Dahmus M.E., Gill G.N. A novel RNA polymerase II C-terminal domain phosphatase that preferentially dephosphorylates serine 5. J Biol Chem. 2003. 278(28) P. 26078-26085

81. Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers. Oncogene. 2002. 21(45). P.6915-6935.

82. Zabarovsky et al. Lung cancer principles and practice, third edition, 2005. P. 118-133.

83. Zhang L., Underhill C.B., Chen L. Hyaluronan on the surface of tumor cells is correlated with metastatic behavior. Cancer Res. 1995. 55(2). P. 428-433.1. БЛАГОДАРНОСТИ