Подавление экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста при немелкоклеточном раке легкого

Анедченко, Екатерина Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Подавление экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста при немелкоклеточном раке легкого
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Подавление экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста при немелкоклеточном раке легкого"

На правах рукописи

АНЕДЧЕНКО Екатерина Анатольевна

ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-СУПРЕССОРОВ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА ПРИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ

ЛЕГКОГО

03 00 03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 ОПТ

Москва-2008

003448805

Работа выполнена в Лаборатории структурно-функциональной геномики (и о зав лаб ЛЮ Фролова) Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им В А Энгельгардга РАН

Научные руководители. академик, доктор биологических наук, профессор

Лев Львович Киселев

кандидат химических наук Вера Николаевна Сенченко

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Наталья Николаевна Мазуренко

доктор биологических наук, профессор Александр Васильевич Карпухин

Ведущая организация Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится часов на заседании

Диссертационного совета Д 002 235 01 при Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардга РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардга РАН

«в <^Oбfdг$)J

Автореферат разослан"" 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Рак легкого (РЛ) - одно из самых распространенных злокачественных новообразований в мире С каждым годом заболеваемость и смертность от опухолей легкого растет, что связано главным образом с загрязнением окружающей среды и курением Это обусловливает необходимость разработки новых более надежных, быстрых и доступных широкому кругу пациентов методов ранней диагностики PJI, послеоперационного мониторинга и раннего выявления метастазов

Для выяснения роли тех или иных генов в канцерогенезе проводят исследование их структурных и функциональных изменений в первичных опухолях и клеточных линиях Для TSG, локализованных на Зр, характерны в различных эпителиальных опухолях миссенс- и нонсенс - мутации, метилирование промоторных районов, делеции Зч- и 5"- областей генов, которые приводят к нарушению синтеза их мРНК и/или белка Один из важных этапов в функциональных исследованиях TSG - оценка экспрессии на уровне транскрипции в опухолях по сравнению с нормой Отсутствие или снижение количества мРНК может быть критичным для функции TSG. Благодаря современным высокоэффективным технологиям с использованием метода кДНК-микропанелей стало возможным исследовать изменение экспрессии сотен и тысяч генов, однако данный метод не позволяет количественно оценивать содержание транскршггов интересующих генов. Для этих целей широко используют ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) Характер изменений экспрессии TSG, локализованных на Зр, в разных типах PJI позволит оценить степень вовлеченности исследуемых генов в процесс развития опухолей легкого, внесет важный вклад в понимание молекулярных основ канцерогенеза, а также позволит создать набор специфических маркеров для ранней диагностики и прогностики РЛ

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в

количественной оценке уровня мРНК генов - потенциальных супрессоров

опухолевого роста RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, RASSF1A, ITGA9, HYAL1 и HYAL2, локализованных на Зр в двух основных гистологических типах немелкоклеточного рака легкого (HMPJ1) - аденокарциноме (АК) и плоскоклеточном раке легкого (ПКРЛ)

В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи 1) отработка методики количественных измерений уровня мРНК генов, 2) оценка уровня мРНК генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, RASSF1A, 1TGA9, HYAL1, HYAL2 в образцах двух типов HMPJI - АК и ПКРЛ, 3) сопоставление полученных данных с клиническими характеристиками опухолей, 4) сравнительный анализ изменения уровня мРНК генов в одних и тех же образцах НМРЛ, 5) обсуждение возможных причин, приводящих к подавлению экспрессии исследуемых генов в опухолях легкого

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые количественно оценен уровень мРНК генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, RASSF1A, ITGA9, HYAL1 и HYAL2 в образцах НМРЛ двух типов - ПКРЛ и АК методом ПЦР-РВ Выявлено заметное и частое снижение уровня мРНК 6-ти генов в исследуемых опухолях легкого Обнаружены характерные различия в частоте и степени снижения содержания мРНК генов в двух гистологических типах НМРЛ частота и уровень снижений мРНК генов значительнее при ПКРЛ, чем при АК В большинстве опухолей легкого происходит одновременное снижение содержания мРНК генов, независимо от их расположения на Зр21 и функций белковых продуктов В случае генов HYAL1, HYAL2 и ITGA9 показано не только одновременное, но и координированное снижение уровня мРНК Впервые показано, что подавление транскрипции генов RBSP3/CTDSPL и ITGA9 при НМРЛ связано с геномными и эпигеномными механизмами

Полученные результаты могут быть использованы для разработки панели специфических маркеров ранней диагностики ПКРЛ и новых подходов в генотерапии НМРЛ

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлены на международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), международном симпозиуме «3rd International qPCR Symposium & Industrial Exhibition & Application Workshop» (Германия, 2007), на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения -2007» (Санкт-Петербург, 2007), на INTAS Workshop, «Mid-term review of the INTAS Thematic Calls 2005 on genomics/Proteomics & Energy» (Киев, Украина, 2007), на Российском медицинском форуме (Москва, 2007), на IX международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Киев, Украина, 2008), на 4-м съезде Российского

общества биохимиков (Новосибирск, 2008) По материалам диссертации опубликованы 4 работы и 1 патент

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы Qp¡ наименований) Работа изложена на//0 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц ирисунков

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы. Образцы тканей HMPJI I-III стадий (Т), образцы прилегающих к опухолям морфологически нормальных тканей (N) (т н «условные нормы») собраны и охарактеризованы в НИИ КО ГУ РОНЦ им Н Н Блсхина РАМН Образцы опухолевых тканей охарактеризованы в соответствии с TNM-классификацией Международного противоракового союза (UICC, версия 2002 г) Все образцы исследовали микроскопически для гистологического подтверждения присутствия опухолевых клеток По данным гистологического исследования в каждом образце опухолевые клетки составляли не менее 70 %

Образцы кДНК из опухолевых и нормальных тканей легкого предоставлены лабораторией «Структуры и функции генов человека» ИБХ РАН Коллекция состояла из 30 образцов кДНК из опухолей легкого I-III стадий, 30 образцов кДНК из прилегающих к опухолям морфологически нормальных тканей и 10 образцов кДНК из нормальных тканей легкого от скоропостижно скончавшихся доноров, не имеющих в анамнезе онкологических заболеваний

Методы. Суммарную РНК выделяли из образцов с использованием набора реагентов Tnzol RNA Prep («Лаборатория Изоген», Москва) или с использованием набора реагентов RNeasy Mim Kit («Qiagen») с последующей обработкой ДНКазой I ДНК из нормальных и опухолевых тканей легкого человека выделяли с использованием набора реагентов QIAamp DNA Mim Kit («Qiagen») Концентрацию РНК и ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop ® ND-1000 ("NanoDrop Technologies Inc) Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью гексануклеотидных праймеров и обратной транскриптазы M-MuLV («Fermentas», Литва) Синтез двухцепочечных кДНК проводили модифицированным SMART-методом (Zhu et al, 2001) В целом для оценки уровня мРНК использовали 59 образцов кДНК из опухолей легкого (18 -АК, 41 - ПКРЛ) и 59 образцов кДНК из «условных норм»

Праймеры и зонды для ПЦР-РВ подбирали с помощью разработанной в лаборатории программы «Primer Designer» (www imb ас ru/~mxie/PD) Анализ продуктов ПЦР-РВ подтверждали секвенированием на секвенаторе 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, США)

ПЦР-РВ проводили на приборе ABI PRISM ® 7000 Sequence Detection System в режиме относительных измерений (AACt - метод) с использованием программы RQ (Relative Quantitation software, Applied Biosystems, США) Изменение содержания мРНК исследуемых генов в опухоли по сравнению с «нормой» относительно контрольного(ых) гена(ов) рассчитывали по формуле.

0+ЕИсслед.)а1Т 0+EKOHTp)Ct2N "D — ———————

С1+Е У33 fl+E )ct4

V исолед./ N V контр / Т , где R - относительное содержание мРНК, Е - эффективность реакции, N - норма, Т - опухоль, Ct -пороговый цикл Все расчеты проводили с помощью разработанной в лаборатории программы «АТГ» (Анализ Транскрипции Генов, Свидетельство №2008612585,2008, Роспатент, РФ)

Воспроизводимость ПЦР-РВ данных проверяли в серии параллельных трехкратных измерений в одном и разных опытах Оценку достоверности обнаруженных изменений уровня мРНК каждого гена в опухолях по сравнению с нормами и контрольным(и) геном(и) провели с помощью непараметрического теста Уилкоксона Оценку достоверности изменений уровня мРНК между генами в разных группах АК и ПКРЛ, АК и ПКРЛ от больных с метастазами и без метастазов в регионарные лимфоузлы провели с помощью непараметрического теста Манна-Уитни Достоверными считали изменения при значениях Р < 0 05 Корреляции между изменениями уровня мРНК в парах генов выявляли в разных группах больных с помощью расчета коэффициентов ранговой корреляции Спирмена

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Отработка методики проведения ПЦР-РВ

Выполнены необходимые предварительные опыты сравнение и выбор оптимальных реакционных наборов для проведения ПЦР-РВ, оптимизация условий реакции для контрольных и исследуемых генов, выбор контрольных генов и образцов сравнения

Выбор оптимальных условий для ПЦР-РВ

В работе для проведения ПЦР-РВ использован набор РиалитиТМ («Биочип-ИМБ», Россия). Сравнение универсального набора TaqMan PCR Core Reagent Kit фирмы Applied Biosystems (США) с наборами GenePakTM PCR Core («Изоген», Россия), («Синтол», Россия) и РиалитиТМ («Биочип-ИМБ», Россия)

показало, что последний не уступает по основным параметрам набору TaqMan PCR Core Reagent Kit Оптимальные концентрации праймеров и зондов для контрольных и исследуемых генов выбраны при варьировании в диапазоне от 100 до 500 нМ, при которых амплитуда кинетических кривых и эффективность реакции (Е) максимальны

Выбор контрольных генов для ПЦР-РВ и образцов сравнения

В качестве контрольных выбраны гены GAPDH и RPN1 в опытах с кДНК и гены АСТВ, GUSB и RPN1 в опытах с ДНК Как видно из рисунка 1, значения основного параметра ПЦР-РВ порогового цикла (Ct), при котором интенсивность флуоресценции превышает ее фоновый уровень, для контрольных генов в опухоли по сравнению с нормой изменялись незначительно Согласно расчетам, в случае гена GAPDH изменение уровня мРНК в опухоли по сравнению с нормой не превышало 2-х раз, гена RPN1 (кДНК) - 3-х раз, а изменение копийности генов АСТВ, GUSB и RPN1 (ДНК) - 1,5 раза

Q 13

Дп Т И «ja

* f f * «§ m m * „ *

О Ер азцы к ДНК ОЗрицыДНК

N т N т N т N т N т

оарон крш асгв охт ярю

Рис 1 Изменение значений С! для контрольных генов в образцах кДНК и ДНК из нормальных и опухолевых тканей легкого Выборка состояла из 25 парных (норма - N. опухоль - Т) образцов кДНК и 20 парных образцов ДНК

В качестве образцов сравнения выбраны прилегающие к опухолям морфологически нормальные ткани, т н «условные нормы» Содержание мРНК исследуемых генов в нормальных тканях легкого от здоровых доноров по сравнению с усредненной «условной нормой» от 30 больных изменялось не более чем в 2 раза, что сопоставимо с изменением уровня мРНК контрольного гена САРОН в нормальных и опухолевых тканях легкого

Положительный контроль ПЦР-РВ

Известно, что содержание мРНК и белкового продукта гена, кодирующего каталитическую субъединицу фермента теломеразы (КГЕКТ), часто повышено в

различных опухолях человека (Hahn, 2003) В исследуемых опухолях легкого выявили значительное повышение уровня мРНК гена hTERT, что согласуется с данными литературы (Wang et al, 2000, Geng et al, 2003, Fujita et al, 2003) Важно отметить, что во всех «условных нормах» транскрипт гена hTERT не обнаружен Эти данные указывают на отсутствие опухолевого процесса в прилегающих к опухолям тканях и служат дополнительным доказательством правомерности использования «условных норм» в качестве образцов сравнения

Количественная оценка уровня мРНК генов при HMPJI

В работе оценили уровень снижения мРНК генов (LD, Level Decrease of mRNA), равный 1/R и показывающий, во сколько раз содержание мРНК гена снижено в опухоли по сравнению с нормальными тканями, а также частоту снижения уровня мРНК генов (FD, Frequency of Decrease of mRNA level) для разных группах больных (с диагнозом АК и ПКРЛ, АК и ПРКЛ без метастазов и с метастазами в регионарных лимфоузлах)

Гены, белки которых участвуют в регуляции клеточного цикла

Ген RBSP3/CTDSPL

Ген RBSP3/CTDSPL из области АР20 имеет две изоформы А (NM_001008392, 4455 п н ) и В (NM_005808, 4422 п н ) Белковый продукт гена принадлежит семейству малых CTD (C-Terminal Domain) сериновых фосфатаз, катализирующих дефосфорилирование сериновых остатков С-концевого домена большой субъединицы РНК полимеразы II и других белков (Yeo„ et al, 2003, Kashuba et al 2004, Zabarovsky et al, 2005) Белок RBSP3/CTDSPL обладает способностью подавлять рост опухолевых клеток m vitro и m vivo Предполагают, что RBSP3/CTDSPL может участвовать в негативной регуляции клеточного цикла через дефосфорилирование белка pRBl (Kashuba et al 2004) Согласно данным SAGE, не выявлено изменения экспрессии гена RBSP3/CTDSPL в нормальных тканях, в то время как в различных эпителиальных опухолях отмечено ее снижение или даже отсутствие Экспериментальные данные по изменению уровня мРНК гена RBSP3/CTDSPL в опухолевых тканях легкого отсутствуют, только в клеточных линиях мелкоклеточного рака легкого (MPЛ) (N146, N417, U2020, ACC-LC5) методами Нозерн-гибридизации и ПЦР-РВ показано снижение содержания мРНК (Kashuba et al 2004)

Результаты количественной оценки уровня мРНК гена RBSP3/CTDSPL в опухолях легкого представлены на рисунке 2А

При сравнении профилей экспрессии генов 1?В8РЗ/СТ05РЬ, ИРШ2/С2Р Л/ШТМ. 1ТСА9, НУАЫ и ШАЬ2 в одних и тех же опухолях выявлены те же закономерности и тенденции, которые обнаружены для каждого гена отдельно на более представительных выборках. Как видно из рисунка 5, экспрессионные профили генов в двух гистологических типах НМРЛ похожи, но не идентичны.

При АК обнаружена положительная корреляция между увеличением частоты и степенью подавления транскрипции генов ^?A55FiA и 1ЮА9 и опухолевой прогрессией (Р< 0,06), та же тенденция отмечена для генов ¡ШРЗ/СТОЗРЬ, №М2/в21, НУАЫ и НУАЬ2. У больных с АК без метастазов (образцы 1, 3 и 7) наблюдали повышение уровня мРНК генов ЫРШ2Ю2] (3 раза), Й/ШИА (до 4-х раз) и НУАЫ (до 8-ми раз). Эти опухоли различаются высокой степенью дифференцировки клеток и меньшей злокачественностью по сравнению с образцами АК (13, 15 и 16), для которых характерна низкая степень дифференцировки и большая злокачественность. Для остальных опухолей (2, 4, 6,11, 17) характерна умеренная степень дифференцировки клеток.

0,1

0,01

+ +

а квхрз @ ырка/021 □ дляяил а /тел? т нули в тли

Образцы к ДНК

Рис. 5. Изменение уровня мРНК 6-ти генов при НМРЛ относительно двух контрольных генов САРБН и Я.РЫР

Примечание: - / + - отсутствие / наличие метастазов в регионарных лимфоузлах.

При ПКРЛ частое и заметное снижение уровня мРНК генов ЯВЗРЗ/СТОБРиСТОЗРЬ, ЫРШ/в21, 1ТСА9, НУАЫ, НУАЫ отмечено уже на

Как видно из рисунка, в большинстве исследуемых опухолей легкого уровень мРНК гена снижается (85 % (50/59), Р<0 01), причем значения ГО для двух типов карцином легкого отличаются незначительно для АК - 78 % (14/18), Р<0 02 и ПКРЛ 88 % (36/41), Р<0 001 Суммарные результаты количественной оценки уровня мРНК гена КВБРЗ/СТБЗРЬ для двух гистологических типов НМРЛ представлены в таблице 1 При ПКРЛ уже на 1-ой клинической стадии происходит снижение уровня мРНК во всех 11-ти исследуемых образцах, а при АК только в 5-ти (71 %) В целом при НМРЛ значения ЫЭ варьируют от 2 до 10 раз, но в отдельных образцах наблюдается снижение до 30 раз (АК и ПКРЛ) и 100 раз (ПКРЛ) При ПКРЛ снижение уровня мРНК гена значительнее, чем при АК (6 раз против 4-х) В образцах АК от больных с метастазами снижение уровня мРНК происходит несколько чаще, а уровень мРНК ниже в 2 раза по сравнению с образцами АК от больных без метастазов (88 % и 6-ти раз против 70 % и 3-х раз) Напротив, при ПКРЛ наличие или отсутствие метастазов не влияет на значения ГО и 1Л>ср значительное и частое снижение уровня мРНК обнаружено как на ранних, так и последующих стадиях

Таким образом, при НМРЛ происходит заметное и частое снижение уровня мРНК гена ИВЕРЗ/СТПЯРЬ, причем при ПКРЛ снижение происходит с высокой частотой уже на ранних стадиях развития опухоли

Для выяснения причин, вызывающих снижение уровня мРНК гена ЛВ57>3/С7ЮТ£ в опухолях легкого сравнили данные ПЦР-РВ и №«1-микропанелей, полученных в Каролинском Институте (Швеция) Е Р Забаровским и сотрудниками (табл 2) Метод Иой-микропанелей позволяет одновременно выявлять делеции и/или метилирование промоторных районов генов в образцах опухолей по сравнению с «условной нормой» Данные Кой-микропанелей получены выборочно для 18-ти парных образцов ДНК (8 - АК, 10 - ПКРЛ), для которых также оценили количество копий гена методом ПЦР-РВ относительно 3-х контрольных генов (АСТВ, ОШВ и ДРЛ7)

Как видно из таблицы 2, в целом при НМРЛ выявлены делеции (39 %, 7/18) и метилирование промоторной области гена КВБРЗ/СТОЗРЬ (44 %, 8/18) Снижение уровня мРНК гена ЯВЗРЗ/СТОБРЬ вызвано делециями в 25 % (2/8) образцов АК и 50 % (5/10) ПКРЛ и метилированием промоторной области гена в 37,5 % (3/8) образцов АК и 50 % (5/10) ПКРЛ

Таблица 1 Частота и уровень снижения мРНК (РР и ЬРср) для исследованных генов при АК и ПКРЛ

Группы ГЕНЫ

ИВБРЭ/СТОБРЬ №11Ь2/С21 КАБ8Р1А 1ТОА9 НУЛИ НУА12

АК ПКРЛ АК ПКРЛ АК ПКРЛ АК ПКРЛ АК ПКРЛ АК ПКРЛ

Без метастазов *ГО 70 (7/10) 88 (21/24) 20 (2/10) 88 (21/24) 29 (2/7) 33 (2/6) 67 (4/6) 100 (6/6) 50 (3/6) 83 (5/6) 83 (5/6) 100 (6/6)

**Ш,р 3 (2-6) 5 (2-23) 4 (2-7) 10 (2-100) 4 (3-5) 4 (2-8) 3 (2-4) 13 (5-36) 7 (5-9) 10 (2-25) 4 (3-8) 9 (2-53)

Р <002 <0 001 >0 048 <0001 >0 046 >0 062 <0 032 < 0 032 >0 062 <0 062 <0062 < 0.032

С метастазами *ГО 88 (7/8) 88 (15/17) 75 (6/8) 82 (14/17) 100 (7/7) 81 (13/16) 100 (5/5) 92 (11/12) 83 (5/6) 92 (11/12) 100 (6/6) 100 (12/12)

**1Х>ср 6 (2-26) 7 (2-94) 4 (2-7) 8 (2-100) 7 (3-21) 6 (2-57) 10 (3-36) 11 (3-70) 19 (6-93) 8 (3-77) 8 (4-20) 8 (2-52)

Р <0024 <002 <0 024 <0 02 <0016 <0 022 <0 062 <0 02 <0 062 <002 <0062 <002

Всего *НЭ 78 (14/18) 88 (36/41) 44 (8/18) 85 (35/41) 64 (9/14) 68 (15/22) 82 (9/11) 94 (17/18) 67 (8/12) 89 (16/18) 92 (11/12) 100 (18/18)

4 (2-26) 6 (2-94) 4 (2-7) 9 (2-100) 6 (3-21) 6 (2-57) 6 (2-36) 11 (3-70) 12 (5-93) 9 (2-77) 6 (3-20) 8 (2-53)

Р <002 <0 001 <0 01 <0 001 <0 05 <0 001 <0 018 <0 02 >0 054 <002 <0018 <002

Примечание: * - ЕО в %, цифры дроби в скобках - количество образцов со сниженным уровнем мРНК к общему количеству образцов, ** - ЬДр, в скобках указан интервал обнаруженных снижений 1ЛЭ (разы) Для расчета Р использовали непараметрический тест Уилкоксона

Таблица 2 Сравнение данных ПЦР-РВ и Notl-микропанелей для гена RBSP3/CTDSPL

№ № образца ПЦР-РВ Notl-микропанели** Возможные причины снижения уровня мРНК гена

Снижение уровня мРНК (разы) ДНК*

АК

1 1 2-3 дел + делеция

2 2 6-8 сохр + метилирование

3 4 3-4 сохр - другой механизм

4 5 2-3 дел + делеция

5 7 2-3 сохр - другой механизм

6 11 7-11 сохр - другой механизм

7 16 3-4 сохр + метилирование

8 17 6-11 сохр + метилирование

ПКРЛ

9 23 5-8 сохр + метилирование

10 25 6-11 дел + делеция

11 26 4-6 сохр + метилирование

12 27 2-3 дел + делеция

13 46 6-8 сохр + метилирование

14 43 2-2,5 дел + делеция

15 52 12-20 сохр + метилирование

16 53 2-3 сохр + делеция

17 54 12-14 сохр + метилирование

18 55 3-4 дел + делеция

Примечание * дел - делеция, сохр - сохранение копий гена, ** + делеция и/или метилирование, - отсутствие изменений

Кроме того, снижение уровня мРНК гена не связано делениями и/или метилированием в 37,5 % (3/8) случаев АК, что может быть вызвано другими причинами, например мутациями Так, согласно данным литературы, для гена RBSP3/CTDSPL характерна высокая частота делеций (1 на 1000 п н.) в различных эпителиальных карциномах и опухолевых клеточных линиях.

Таким образом, снижение уровня мРНК гена RBSP3/CTDSPL в опухолях легкого в основном обусловлено делениями и/или метилированием промоторной области при ПКРЛ - 100 % случаев и АК - 62,5 %, а вклад делеций и метилирования при ПКРЛ одинаков

Ген NPRL2/G21

Ген NPRL2/G21 (NM_006545) из области LUCA, также известный как ген TUSC4 (tumor suppressor candidate 4), имеет одну изоформу (NM_006545) и кодирует растворимый белок, состоящий из белок-связывающего домена, имеющего сходство с коровым доменом белка MutS и домена, регулирующего пермеазу азота (Li J et al, 2004, Zabarovsky et al, 2005) Белок обладает

способностью подавлять рост опухолевых клеток in vitro и in vivo (Ji L et al, 2002). Предполагают, что NPRL2/G21 участвует в регуляции клеточного цикла и апоптоза, а также, возможно, в репарации повреждений ДНК По данным SAGE снижение уровня экспрессии гена отмечено только при раке почки (РП) Только в клеточных линиях HMPJI методом Нозерн-гибридизации показано снижение содержания мРНК гена NPRL2/G21 (Li J et al, 2004)

На рисунке 2Б и в таблице 1 представлены результаты количественной оценки уровня мРНК гена NPRL2/G21. В большинстве опухолей легкого (76 % (45/59), Р<0 01) уровень мРНК гена снижен, в 3% (2/59) - повышен и в 8 % (5/59) - транскрипт гена не обнаружен Повышение уровня мРНК гена отмечено только в 2-х образцах АК на 1-ой клинической стадии Значения FD и LDcp для двух типов HMPJI достоверно различаются, так при ПКРЛ снижение уровня мРНК более сильное и частое, чем при АК (85 % и 9 раз против 56 % и 4-х раз, Р = 0 002, тест Манна-Уитни) При ПКРЛ уже на 1-ой клинической стадии уровень мРНК гена снижен во всех 11 образцах, в то время как при АК только в 2-х (29 %) В группе больных с диагнозом АК с метастазами значение FD выше, чем в группе больных с диагнозом АК без метастазов (75 % против 20 %) В случае ПКРЛ наличие или отсутствие метастазов существенно не влияет на значения FD Снижение уровня мРНК гена NPRL2/G21, согласно данным литературы, может быть вызвано делениями 3"- и 5Ч- областей (Li J et al, 2004)

Таким образом, в образцах НМРЛ происходит заметное и частое снижение уровня мРНК гена NPRL2/G21, вплоть до полного отсутствия. При ПКРЛ снижение уровня мРНК происходит с высокой частотой уже на ранних стадиях развития опухоли, причем это снижение более сильное и частое, чем при АК

Ген RASSF1A

Известный ген-супрессор RASSF1 расположен в области LUCA и имеет несколько изоформ Один из основных его транскриптов - изоформа А (NM_007182) кодирует цитоплазматический белок, в С-концевой области которого расположен домен, взаимодействующий с онкобелком Ras (Ras -association domen), а также домен SARAH, который регулирует гомотопическое и гетеротипическое взаимодействие между белками, содержащими этот домен Присутствие в RASSF1A этих функциональных доменов указывает на его важную роль в передаче сигнала от поверхности клетки в ядро (Lerman and Minna, 2000, Zabarovsky et al, 2002, Pfeifer and Dammann, 2005; Zabarovsky et al, 2005, Hesson et al, 2007) Помимо этого, RASSF1A участвует в регуляции клеточного цикла Согласно данным SAGE, снижение или полное отсутствие мРНК отмечено при АК В клеточных линиях и единичных образцах НМРЛ

качественными и полуколичественными методами показано снижение или отсутствие уровня мРНК гена RASSF1A (Dreijermk et al, 2001, Dammann et al, 2003,2000, Pfeifer and Dammann, 2005)

В работе в большинстве опухолей легкого обнаружено снижение уровня мРНК гена RASSF1A (72 % (26/36), Р<0 01), а также повышение уровня мРНК гена в 2-х образцах АК на 1-ой клинической стадии (рис 2В) Значения FD и LDcp в группах больных с диагнозом АК и ПКРЛ близкие (табл 1) Значение FD достоверно выше в образцах АК от больных с метастазами, по сравнению с образцами от больных без метастазов (100 % против 29 %, Р<0 06), та же тенденция отмечена при ПКРЛ (81 % против 33 %) В целом при НМРЛ, значение LD варьирует от 2 до 10 раз, но в отдельных образцах АК наблюдаются сильные снижения до 20 раз и образцах ПКРЛ до 50 и 57 раз При АК значение LDcp для гена RASSF1A достоверно выше в образцах от больных с метастазами, чем в образцах от больных без метастазов и составляет 7 и 4 раза соответственно (Р<0 06), для ПКРЛ отмечена та же тенденция (6 против 4 раз) По данным литературы, снижение уровня мРНК гена RASSF1A в опухолях легкого может быть вызвано метилированием его промоторной области (Dammann et al, 2000, Burbee et al, 2001, Логинов и др, 2004, Pfeifer and Dammann, 2005)

Таким образом, в опухолях легкого с высокой частотой происходит снижение уровня мРНК гена RASSF1A, причем для двух типов НМРЛ обнаружено увеличение значений ГО и LDcp при прогрессии опухоли

Гены, кодирующие белки, участвующие в регуляции ангиогенеза и клеточной адгезии

Ген ITGA9

Ген ITGA9 имеет одну изоформу (NM_002207), расположен в области АР20 и кодирует субъединицу мембранного белка, принадлежащего семейству интегринов - поверхностных гликопротеинов клетки, обеспечивающих адгезию между клетками, а также клетками и внеклеточным матриксом Белок представляет собой гетеродимер, состоящий из альфа- и бета-субъединиц, и является рецептором для VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) (Albelda, 1991) По данным SAGE, отмечено снижение экспрессии гена ITGA9 в опухолях легкого Данные литературы по изменению содержания мРНК ITGA9 в карциномах человека практически отсутствуют, только в клеточных линиях и единичных первичных опухолях МРЛ методом нозерн-гибридизации показано повышение уровня мРНК (Hibi et al, 1994)

В объединенной группе НМРЛ выявлено значительное и частое снижение уровня мРНК гена ITGA9 (90 % (27/30), Р<0,001) (рис 3) Для двух

гистологических типов НМРЛ выявлены различия в значениях ГО и иэср. Показано более сильное и частое падение уровня мРНК гена при ПКРЛ по сравнению с АК (95 % и 11 раз против 82 % и 6 раз, Р=0.033). При АК от больных с метастазами значение ГО достоверно выше, чем при АК от больных без метастазов (100 % против 67 %, Р<0,06).

од

0,01

1 2 3 4 6 7 11 13 15 16 17 22 2 3 24 25 26 27 43 44 45 46 47 52 53 54 5 5 5 6 57 5 8 59

I ¥ ш I и III

+ +

Образцы к ДНК

Рис. 3. Изменение уровня мРНК гена 1ТвА9 при НМРЛ (30 образцов: 11 - АК, 19 - ПКРЛ) относительно контрольного гена САРРН.

Примечание'. I, II, III - клинические стадии; - / + - отсутствие / наличие метастазов в регионарных лимфоузлах.

Значения ЬБ при АК изменялись от 2 до 36 раз, а при ПКРЛ от 3 до 70 раз. В образцах АК от больных с метастазами значение 1ЛЭср (10 раз) достоверно выше, чем образцах АК от больных без метастазов (3 раза) (Р<0.06). В случае ПКРЛ достоверных различий в значении иЗср в образцах от больных без или с метастазами не выявлено.

Таким образом, при НМРЛ с высокой частотой происходит снижение уровня мРНК гена 1ТСА9. Снижение уровня мРНК гена при ПКРЛ происходит с высокой частотой уже на ранних стадиях развития опухоли и не зависит от присутствия метастазов в регионарных лимфоузлах, а в случае АК - коррелирует с опухолевой прогрессией.

До сих пор данные о причинах изменения уровня мРНК гена 1ЮА9 в опухолях легкого в литературе отсутствовали. Сравнение данных ПЦР-РВ и

АК ПКРЛ

У Ш г • . ^ 'С 1 1 ГII |!| 9Г 1р1 < -

№)й-микропанелей для гена 1ТСА9 выборочно для 19 образцов (8 - АК, 11 -ПКРЛ) показало, что снижение уровня мРНК гена ассоциировано с делециями и/или метилированием в 50 % образцов АК и в 91 % образцов ПКРЛ (табл 3) В опухолях со сниженным уровнем мРНК (образцы АК № 2, 4, 11, 17 и ПКРЛ № 26) не обнаружено геномных и эпигеномных изменений, что указывает на возможное существование других причин подавления экспрессии исследуемого гена

№ № образца Снижение уровня мРНК (разы), ПЦР-РВ Делеции и/или метилирование, Not I - микропанели *

АК

1 1 2-3 +

2 2 2-3 -

3 3 3-5 +

4 4 2-3 -

5 И 6-8 -

6 15 32-42 +

7 16 9-11 +

8 17 2-4 -

ПКРЛ

9 23 10-12 +

10 25 24-26 +

11 26 7-11 -

12 27 32-42 +

13 43 6-9 +

14 45 4-6 +

15 46 9-11 +

16 52 9-11 +

17 53 7-8 +

18 54 24-32 +

19 55 3-4 +

Примечание: делеция и/или метилирование (+), отсутствие изменений (-)

Гены HYALI uHYAL2

Кодируемые генами HYAL1 и HYAL2 ферменты гиалуронидазы выполняют в клетке близкие функции - расщепляют гиалуроновую кислоту (ГК). ГК участвует в поддержании водного баланса в тканях, в регуляции пролиферации и миграции клеток посредством передачи сигналов между клетками через взаимодействие с их поверхностными рецепторами CD44 и RHAMM (Toole et al, 2004) Расщепление ГК происходит в два этапа вначале до фрагментов размером до 20 кДа (катализирует белок HYAL2), а затем полное

расщепление до низкомолекулярных продуктов (катализирует белок HYAL1). Потеря активности этих белков приводит к накоплению ГК, что, возможно, является одним из этапов на пути малигнизации и инвазии клеток (Csoka et al., 2001). Для HYALl и HYAL2 недавно показана опухоль-подавляющая активность только in vivo, но не in vitro (Wang et al., 2008). В опухолях легкого по данным SAGE отмечено снижение экспрессии этих генов. Отсутствие транскрипта гена HYAL1 методом Нозерн-гибридизации показано в клеточных линиях HMPJI и MPJ1 (Lerman and Minna, 2000). Экспериментальные данные по изменению уровня мРНК гена HYAL2 в клеточных линиях и первичных опухолях легкого отсутствуют.

В исследуемых опухолях легкого с высокой частотой происходит снижение уровня мРШ как гена HYAL1 (82 % (23/28), Р<0.001), так и гена HYAL2 (96 % (27/28), PcO.OOl) (рис. 4).

I II III I II П1

+ - + Образцы кДНК

Рис. 4, Изменение уровня мРНК генов НУАЫ и НУАЬ2 при НМРЛ (28 образцов: 12 - АК, 16 - ПКРЛ) относительно контрольного гена САРОН. Примечание4. I, II, III - клинические стадии; - / + - отсутствие / наличие метастазов в регионарных лимфоузлах.

Для гена НУА12 значения ГО при АК и ПКРЛ близкие (92 % и 100 %), в то время как для гена НУАЫ значение БО при АК несколько ниже, чем при ПКРЛ (67 % против 94 %) (табл. 2). Присутствие или отсутствие метастазов не влияет на значения БО для гена НУАЬ2 при АК и ПКРЛ, и для гена НУАЫ при ПКРЛ.

Однако прогрессия АК сопровождается более сильным и частым падением уровня мРНК гена НУАЫ (83 % против 50 %) Для двух генов в большинстве образцов Ы5 изменяется от 2 до 20 раз, но отмечены также сильные снижения в отдельных образцах до 100 раз для гена НУАЫ и 60 раз для гена НУАЫ Значения Ц}ср для генов НУАЫ и НУА12 близки (9 и 7 раз) Отмечены также случаи повышения уровня мРНК гена НУАЫ в образцах АК 1-ой стадии (до 3-х, 4-х и 8-ми раз)

Согласно данным литературы, основная причина снижения уровня мРНК генов НУАЫ и НУАЬ2 в опухолях - метилирование их промоторной области (Свока е1 а1, 2001) В данной работе исследовали метилирование промоторной области одного из 2-х генов - НУАЫ. Предварительную оценку метилирования провели выборочно в 4-х образцах НМРЛ (2 - ПКРЛ, 2 - АК) со сниженным уровнем мРНК методом бисульфитной конверсии с последующим секвенированием в Каролинском институте (Швеция) Е Р Забаровским и сотр Метилирование промоторной области гена выявлено во всех исследованных опухолевых образцах. Степень метилирования промоторной области гена НУАЫ варьировала от 21 до 71 % Самая высокая степень метилирования обнаружена в образце ПКРЛ III - ей клинической стадии При этом в ДНК из «условных норм» метилирование промоторной области гена НУАЫ не обнаружено

Таким образом, в опухолях легкого выявлено частое и заметное снижение уровня мРНК генов НУАЫ и НУАЫ, причем при ПКРЛ снижение происходит уже на ранних стадиях При АК для гена НУАЫ обнаружено увеличение значений И) и 1ЛЗср при прогрессии опухоли По нашим предварительным данным, подавление экспрессии гена НУАЫ при ПКРЛ и АК вызвано метилированием его промоторной области.

Сравнение экспрессионных профилей генов в одних и тех же опухолях

легкого

Сравнение экспрессионных профилей генов ЯВЗРЗ/СТБЗРЬ, ШШ2/Б21, ЛЮТМ, 1ТСА9, НУАЫ и НУАЫ провели на выборке из 27-ми опухолей (И образцов АК и 16 - ПКРЛ) В целом, в большинстве исследуемых опухолей легкого происходит одновременное снижение уровня мРНК 6-ти генов (рис 5) Для большей достоверности выявленных изменений нормирование данных провели относительно двух контрольных генов (БАРОН и 11РИ1). Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена, рассчитанные для уровней мРНК генов относительно одного контрольного гена БАРОН и относительно двух контрольных генов БАРОН и КРИ1, составили 0 87 - 0 95 (Р < 0 001).

При сравнении профилей экспрессии генов ЯВ8РЗ/СТ08РЬ, ИРШ2/С21, Л/ШТМ. 1ТСА9, НУАЫ и ШАЬ2 в одних и тех же опухолях выявлены те же закономерности и тенденции, которые обнаружены для каждого гена отдельно на более представительных выборках. Как видно из рисунка 5, экспрессионные профили генов в двух гистологических типах НМРЛ похожи, но не идентичны.

0,1

0,01

+ +

а квхрз @ ырка/021 □ дляяил а /тел? т нули в тли

Образцы к ДНК

Рис. 5. Изменение уровня мРНК 6-ти генов при НМРЛ относительно двух контрольных генов САРБН и &РМ.

Примечание: - / + - отсутствие / наличие метастазов в регионарных лимфоузлах.

При ПКРЛ частое и заметное снижение уровня мРНК генов ЯВЗРЗ/СТОБРиСТОЗРЬ, ЫРШ/в21, 1ТСА9, НУАЫ, НУАЬ2 отмечено уже на

ранних стадиях развития опухолевого заболевания (опухоли без метастазов) На последующих стадиях (опухоли от больных с метастазами) также отмечено частое и значительное снижение уровня мРНК генов, не зависящее от клинической стадии, степени дифференцировки клеток и присутствия метастазов в регионарных лимфоузлах Повышение уровня мРНК генов, а также зависимость изменения ЦЗ от степени дифференцировки клеток не обнаружены

Таким образом, в одних и тех же образцах НМРЛ с высокой частотой снижается уровень мРНК генов ЫРЫ2, ИА55Р1А, 1ТвА9,

НУАЫ и НУАЫ, что указывает на подавление их транскрипции в опухоли и возможное снижение содержания их белковых продуктов При ПКРЛ в отличие от АК подавление транскрипции исследуемых генов с высокой частотой происходит уже на ранних клинических стадиях, что, безусловно, представляет интерес для ранней диагностики этого заболевания

Корреляции мезду изменением уровня мРНК б-ти исследуемых генов

Для выявления корреляций между уровнями мРНК в парах генов в разных группах больных использовали два типа представления данных качественное, при котором учитывали наличие или отсутствие изменений (снижений/повышений), и количественное - сравнивали относительный уровень мРНК генов (7?) В первом случае при ПКРЛ обнаружены высокие коэффициенты корреляции Спирмена г5 (065 - 091) независимо от локализации генов в районе Зр213 и функций их белковых продуктов (табл 4) В объединенной группе НМРЛ (АК и ПКРЛ) значения г5 несколько ниже, но достаточно высокие (0 63-0 84) Наибольшие значения г5 (0,91) отмечены для пар генов НУШ и 1ТвА9, НУШ и НУАЫ, КВЕРЗ/СТОБРЬ и 1ТвА9, ЫРЯИЮИ и НУАЫ При количественном представлении данных как при ПКРЛ, так и при НМРЛ высокие значения г5 отмечены только в парах /ТОА9 и НУАЫ, НУАЫ и НУАЫ, ШЯЫЮИ и НУАЫ Однако уровни мРНК достоверно различаются у генов №№2/021 и НУШ (Р=0,04), а в случае пар генов 1ТвА9 и НУАЫ, НУАЫ и НУАЫ - близки, что указывает не только на одновременное, но и координированное подавление их экспрессии Кроме того, во всех образцах уровни мРНК генов ТЮА9, НУАЫ и НУАЫ, белки которых участвуют в регуляции ангиогенеза и клеточной адгезии, достоверно ниже, чем генов ЯВЗРЗ/СТВБРЬ, ИРВЫ, Л/ШРМ, белки которых участвуют в регуляции клеточного цикла (значения Р изменялись от 0 01 до 0 10, тест Манна-Уитни), что возможно отражает различную степень вовлеченности/инактивации их белковых продуктов в процессы развития и прогрессии опухолей легкого

Таблица 4 Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена (г5) для пар исследованных генов

ПАРЫ ГЕНОВ |

Группы Функции белков Локализация на Зр21 3

Регуляция клеточного цикла Клеточная адгезия АР20 LUCA

RBSP3У NPRL2 RBSP3/ RASSF1A NPRL2/ RASSF1A ITGA9/ HYAL1 JTGA9/ HYAL2 HYAL1/ HYAL2 RBSP3/ ITGA9 NPRL2/ HYAL1 NPRL2/ HYAL2 RASSF1A/ HYAL1 RASSF1A/ HYAL2

ПКРЛ I 0.91 0.77 0.65 0.81 0.91 : .91 0.91 0.81 0.91 , 0.84 0.77

II 0.32 -0 12 0.50 0 38 0.76 .67 0.55 0 48 0'.7§ 0.58 0 54

АК I 0.72 0.68 0.63 0.68 кш 0 .82 0.84 0.74 ! 0.66 • 0.71 0.76

+ ПКРЛ II 0 34 0 16 0 41 0 59 0.72 • 0 .78 0 53 0 46 0 60 0.57

Примечания 1 .Сравнивали уровни мРНК генов при качественном (I) и количественном (П) представлении данных Значения г5 близкие к 1 0 означают сильную положительную корреляцию, а близкие к нулю означают ее отсутствие 2 Черным выделены пары генов, для которых показаны высокие коэффициенты корреляции и близкие уровни мРНК, серым - пары генов, для которых показаны высокие коэффициенты корреляции, но достоверно отличные уровни мРНК Для каждой группы значения Р составляли от О 001<Р<0 42

В двух основных гистологических типах НМРЛ (ПКРЛ и А К) методом ПЦР-РВ показано частое и значительное снижение уровня мРНК генов -супрессоров опухолевого роста RBSP3/CTDSPL, NPRL2, RASSF1A и генов потенциальных супрессоров опухолевого роста ITGA9, HYAL1 и HYAL2, которое достоверно отличается от изменения уровня мРНК контрольных генов GAPDH и RPNI. Диапазон снижения уровня мРНК генов в опухоли значительно больше (до 100 раз), чем в норме (не более 2-х раз в «условных нормах» по сравнению с нормальными тканями от здоровых доноров), кроме того, биологическая вариабельность уровня мРНК контрольных генов в норме и опухоли в целом также незначительна (рис. 1)

Выявлены различные закономерности изменения уровня мРНК генов в первичных опухолях легкого - АК и ПКРЛ На начальных стадиях АК наряду со снижением обнаружены единичные случаи повышения уровня мРНК генов NPRL2/G21, RASSF1A и HYAL1 Это характерно для опухолей с высокой степенью дифференцировки и низкой степенью злокачественности Можно предположить, что одна из причин состоит во включении альтернативных механизмов, препятствующих инактивации TSG, в начале процесса онкотрансформации клеток Кроме того, степень и частота подавления экспрессии генов RASSF1A и ITGA9 достоверно ассоциирована с прогрессией АК При ПКРЛ независимо от клинической стадии и присутствия метастазов в регионарных лимфоузлах наблюдали одновременное снижение уровня мРНК генов, при этом для генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, ITGA9, HYAL1, HYAL2 значительное снижение уровня мРНК (в среднем, в 7-13 раз) отмечено во всех опухолях уже на первой стадии

В целом, в большинстве исследуемых опухолей (объединенная группа НМРЛ, ПКРЛ) происходит одновременное снижение уровня мРНК исследуемых генов, которое не зависит от их расположения на Зр21 3 и функций белковых продуктов (значения коэффициентов корреляции Спирмена rs составили от 0 63 до 0.91, Р< 0 001) (рис 5, табл. 4) Наибольшие значения rs отмечены для пар генов ITGA9 и HYAL2, HYAL1 и HYAL2, причем уровни мРНК этих генов близкие, что указывает не только на одновременное, но и на координированное подавление их экспрессии

Согласно нашим результатам, полученным с помощью Notl -микропанелей и ПЦР-РВ, в большинстве исследуемых опухолей снижение уровня мРНК генов RBSP3/CTDSPL и ITGA9 из области АР20 ассоциировано с делециями и/или метилированием их промоторных областей (83 % и 74 % соответственно) Вклад этих событий для гена RBSP3/CTDSPL (100 %) и ITGA9

(91%), более значителен при ПКРЛ, чем при АК - 62,5 % и 64 % соответственно, что указывает на возможное существование других механизмов подавления их экспрессии при АК, например, мутаций

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что экспрессия на уровне транскрипции группы генов протяженного локуса Зр21 3 в значительной степени подавлена в двух основных гистологических типах НМРЛ - АК и ПКРЛ Результаты работы свидетельствуют в пользу предложенной ранее гипотезы об одновременной инактивации групп генов с различными функциями из двух областей локуса Зр21 3 (АР20 и LUCA) при возникновении и прогрессии эпителиальных опухолей (Senchenko et al, 2003, 2004) Белки, кодируемые этими генами, могут участвовать в общих сигнальных путях в клетке или их пересечениях Например, согласно опубликованным данным, возможно кооперативное взаимодействие белков RBSP3/CTDSPL и RASSF1A при задержке клеточного цикла через снижение содержания фосфорилированной формы RBI (Zabarovsky et al, 2005)

Результаты имеют как теоретическое, так и практическое значение Частое одновременное снижение уровня мРНК генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, RASSF1A, ITGA9, HYAL1 и HYAL2 (табл 1, рис 5) при ПКРЛ перспективно для разработки панели специфических маркеров ранней диагностики ПКРЛ и новых подходов в генотерапии НМРЛ

ВЫВОДЫ

1 В образцах немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) I-III клинических стадий с высокой частотой снижается содержание мРНК генов -супрессоров опухолевого роста, расположенных в двух областях на хромосоме Зр человека, а именно RBSP3/CTDSPL, ITGA9 (АР20), NPRL2/G21, RASSF1A, HYAL1, HYAL2 (LUCA)

2 Профили экспрессии 6-ти генов при плоскоклеточном раке (ПКРЛ) и аденокарциноме (АК) легкого похожи, но не идентичны При ПКРЛ заметное снижение уровня мРНК генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, ITGA9, HYALI и HYAL2 происходит уже на 1-ой стадии При АК на ранней стадии обнаружены случаи повышения уровня мРНК генов NPRL2/G21, RASSF1A и HYAL1 Частота и степень подавления экспрессии генов RASSF1A и ITGA9 достоверно ассоциирована с прогрессией АК

3 Снижение уровня мРНК генов ШРЗ/СтЗРЪ №В12Ю21, ЯА58Р1А, 1ТСА9, НУАЫ и ША12 происходит независимо от расположения в одной или разных областях района Зр2)..3 и функций их белковых продуктов

4 Уровни мРНК генов ГГСА9 и НУА12, НУАЫ и НУАЬ2, белки которых участвуют в регуляции клеточной адгезии и агнгиогенезе, у каждого пациента близки, что указывает на одновременное и координованное подавление их экспрессии

5 Для генов ЯВБРЗ/СТОЗРЬ и ЯОД9 (область АР20), имеющих №>И -узнающие участки в 5Ч- области, снижение уровня их мРНК вызвано преимущественно делениями и/или метилированием промоторной области

6 Подавление экспрессии генов ШРЗ/СТЭБРЬ, ЫРШЮИ, ШЯРМ, 1ТСА9, НУАЫ и ШМ2 свидетельствует о функциональной важности кодируемых ими белков в предотвращении возникновения и/или развития опухолей легкого

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1 Е А Анедченко. НП Киселёва, А А Дмитриев, ФЛ Киселев, ЕР Забаровский, В Н Сенченко Ген-супрессор опухолевого роста RBSP3/CTDSPL при раке шейки матки копийность и уровень транскрипции Мол биол, 2007,41(1), стр 86-95

2 Е А Анедченко. А А Дмитриев, ГС Краснов, ТТ Кондратьева, ЕП Копанцев, ТВ Виноградова, М.В. Зиновьева, И Б Зборовская, БЕ Полоцкий, О В Сахарова, В В Кашуба, Е Р Забаровский, В Н Сенченко Подавление экспрессии генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, RASSFJA, ITGA9, HYAL1 и HYAL2 при немелкоклеточном раке легкого Мол биол , 2008,42(6), стр 960-970

3 F Wang, EV Gngoneva, J Li, VN Senchenko, TV, Pavlova, EA Anedchenko. A.V Kudryavtseva, A Tsimanis, D Angeloni, MI Lerman, V I. Kashuba, G Klein, E R Zabarovsky HYALl and HYAL2 Inhibit Tumour Growth In Vivo but Not In Vitro PLoS ONE, 2008, 3(8), p e3031

4 E A Anedchenko. N Yu Oparrna, G S Krasnov, L S Pavlova, N M Alexandrova, A A Dmitnev, F L Kisseljov, and V N Senchenko «Activation of the hTERT gene expression in squamous cell cervical carcinomas is not associated with gene amplification» Oncology reports, 2008, 20(2), p 469-474

Тезисы

1 Сенченко В H, Опарина Н Ю, Анедченко ЕА, Краснов Г С, Киселева Н П, Киселев Ф Л, Забаровский Е Р «Исследование изменения копийности и уровня экспрессии гена-супрессора опухолевого роста RBSP3 (HYA22) в нормальных и опухолевых тканях» II Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», октябрь 2005, сборник тезисов

2 Опарина Н Ю, Фридман МЛ, Машкова Т Д, Зиновьева О Л., Анедченко Е А . Краснов Г С , Кропотова Е С , Сенченко В Н, Киселёв Л Л «Выбор

онкозначимых генов для плоскоклеточного рака легких» Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, №3,2006, стр 14

)

3 Машкова Т Д, Опарина Н Ю, Зиновьева О Л, Краснов Г С, Анедченко Е А. Кропотова Е С , Сенченко В Н, Киселев Л Л. «Оценка экспрессии генов ОАРК1, Т1МРЗ, ШЗПА, НУШ, ЫРШ2Ю21 и ¥1Ъ при плоскоклеточном раке легких» Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, №3,2006, стр 15.

4 Сенченко В Н, Анедченко ЕА, Киселев Л Л «Подавление экспрессии онкозначимых генов в эпителиальных опухолях» IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008 г, Новосибирск, тезисы и доклады, стр 248.

Патент

1 Сенченко В Н, Анедченко Е А, Копанцев Е П, Виноградова Т.В , Зиновьева М В , Зборовская И Б, Кондратьева Т Т, Сахарова О В, Свердлов Е Д, Киселев Л Л. Патент «Способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления» № регистрации 207142408 от 19 ноября 2007

Работа получила поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (08-04-01577-а), (05-04-49408), Министерства образования и науки (гос контракт № 02.435 11.3016), Федерального агентства по науке и инновациям Российской Федерации (гос контракты №02 512.11.21.01 и 02 512 11 2241)

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 26 09 2008 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 1,25 Тираж 100 экз Заказ 524 Тел 939-3890 Тел./факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им МВ Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анедченко, Екатерина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБОЗНАЧЕНИЯ ГЕНОВ

ВВЕДНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация рака легкого

1.2. Молекулярные нарушения при раке легкого

1.3. Роль хромосомы 3 в возникновении и развитии рака легкого 28 1.3.1. Гены-супрессоры опухолевого роста (области АР20 и LUC А)

1.4. Методы оценки экспрессии генов

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материа

2.1.1. Образцы тканей

2.1.2. Образцы кДНК

2.1.3. Праймеры и зонды

2.2. Методы

2.2.1. Выделение РНК

2.2.2. Выделение ДНК

2.2.3. Реакция обратной транскрипции

2.2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ)

2.2.5. Анализ продуктов ПЦР-РВ

2.2.6. Статистический анализ данных

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Разработка методической базы для ПЦР-РВ

3.1.1. Выбор наборов реактивов для ПЦР-РВ

3.1.2. Выбор контрольных генов и образцов сравнения для ПЦР-РВ

3.1.3. Положительный контроль ПЦР-РВ

3.2. Количественная оценка уровня мРНК генов RBSP3/CTDSPL,

МРЯ12/в21, КАББРЫ, 1ТвА9, НУАЫ и НУАЬ2 при НМРЛ

3.2.1. Гены, кодирующие белки, участвующие в регуляции клеточного цикла {МЗРЗ/СТОБРЬ, №Я12Ю21, ДЛЯЯ/^Л)

3.2.2. Гены, кодирующие белки, участвующие в регуляции ангиогенеза и клеточной адгезии {1ТвА9, НУАЫ и НУАЬ2)

3.3. Сравнение уровней мРНК генов в одних и тех же опухолях легкого 70 3.3.1. Корреляции между изменением уровня мРНК исследуемых генов в разных группах больных

3.4. Ассоциация подавления экспрессии генов КВЗРЗ/СТВБРЬ, 1ТОА9 и НУАЬ2 при НМРЛ с делециями и метилированием их промоторных областей

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 78 ВЫВОДЫ 83 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85 БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AK - аденокарцинома легкого а.о. — аминокислотные остатки

ГК - гиалуроновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК - комплиментарная ДНК

MPJI — мелкоклеточный рак легкого мРНК - матричная (информационная) РНК

HMPJI - немелкоклеточный рак легкого

ОТ - реакция обратной транскрипции

ОТ-ПЦР — полимеразная цепная реакция, сопряженная с реакцией обратной транскрипции

ПААГ - полиакриламидный гель

ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого п. н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

PJI - рак легкого

РМЖ - рак молочной железы

РП - рак почки

PLUM - рак шейки матки

РЯ - рак яичников

СПКР - светлоклеточная почечноклеточная карцинома почки т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

АР-20 - район TSG на Зр, перекрываемый Alu-ПЦР-клоном

FD — частота снижения уровня мРНК гена (от англ. frequency of mRNA level decrease)

LUCA - район TSG на Зр (от англ. lung cancer TSG region)

LD — уровень снижения мРНК гена (от англ. level decrease of mRNA)

LOH - потеря гетерозиготности (от англ. loss of heterozygosity) микросателлитная нестабильность

MI - микросателлитная нестабильность (от англ. microsatellite instability) Зр — короткое плечо хромосомы 3 человека

SAGE - серийный анализ экспрессии генов (serial analysis of gene expression)

TSG — ген-супрессор опухолевого роста (tumor suppressor gene) ОБОЗНАЧЕНИЯ ГЕНОВ

RBSP3/CTDSPL - ген, кодирующий малую С-концевую сериновую фосфатазу, которая активирует RBI (RBI serine phosphatase from human chromosome 3).

RASSF1A — ген, кодирующий белок, содержащий домен гомологичный онкобелку семейства Ras 1 (Ras association domain family 1 ).

NPRL2/G21 - ген, кодирующий аналог 2 регулятора пермеазы азота (nitrogen permease regulator like-2).

HYALl, HYAL2 - гены, кодирующие белки семейства эндоглюкозаминидаз. ITGA9 - ген, кодирующий субъединицу мембранного белка, принадлежащего семейству интегринов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Подавление экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста при немелкоклеточном раке легкого"

Рак легкого (РЛ) - одно из самых распространенных злокачественных новообразований в мире. В России РЛ занимает первое место среди онкологических заболеваний у мужчин (23,3%) и последнее место у женщин (4,2%) [1]. Смертность от РЛ превышает смертность от рака молочной железы, толстой кишки и простаты, вместе взятых и составляет 18 % [2]. Основная причина возникновения РЛ в 80 - 85 % случаев - курение. К причинам возникновения остальных 15-20 % случаев РЛ относят воздействие канцерогенных веществ, радиации, предшествующие изменения в бронхах и легочной паренхиме, а также химиотерапия цитостатиками при лечении рака других органов [1].

Согласно данным статистики, при первом обращении за врачебной помощью у 30-35 % больных имеются симптомы отдаленных метастазов, поскольку в начальном периоде развития опухоли клинические симптомы скудны или отсутствуют. Обычно данные анамнеза и первичного обследования не дают информации, необходимой для установления диагноза. Инструментальные методы диагностики РЛ (рентгенологическое и томографическое исследование, бронхоскопия) практически не позволяют обнаружить опухоль на ранней стадии, когда условия для ее лечения наиболее благоприятны. Между тем, при диагностике РЛ на 1-ой стадии развития заболевания выживаемость больных достигает 70 % [3]. Все это обуславливает необходимость разработки новых более надежных, быстрых и доступных широкому кругу пациентов методов ранней диагностики РЛ, послеоперационного мониторинга и раннего выявления метастазов.

Развитие злокачественных опухолей легкого - многофакторный и многостадийный процесс, в основе которого лежит накопление клетками различных геномных изменений, затрагивающих многие гены. К ранним событиям при развитии РЛ относят аллельные потери, геми- и гомозиготные делеции короткого плеча хромосомы 3 (Зр). Делеции Зр наблюдали в 100% случаев мелкоклеточного PJI (MPJI), 80-85% случаев немелкоклеточного PJI (HMPJI), а также в клетках из зон пренеопластических поражений легких - гиперплазии и дисплазии [4, 5, 6, 7, 8, 9]. Еще в 1997 г. показано, что введение субхромосомных фрагментов Зр в опухолевые клеточные линии приводит к подавлению их роста [10]. Это позволило предположить возможное присутствие генов-супрессоров опухолевого роста (TSG - Tumor Suppressor Genes) в этом районе генома. Долгое время на хромосоме 3 человека были известны лишь несколько TSG: FHIT, MLH1, VHL [10]. За последние несколько лет, благодаря использованию подхода, основанного на применении микросателлитных маркеров, и картированию гомозиготных делеций в первичных опухолях и клеточных линиях, идентифицировано около 50 новых генов потенциальных супрессоров опухолевого роста, значительную часть которых представляют гены, локализованные в районе Зр21 [9]. Известно, что белковые продукты генов из этой области выполняют в клетке разнообразные ключевые функции: регуляция клеточного цикла и адгезии, инициация апоптоза, репарация ДНК и др. Для некоторых из них доказана принадлежность к супрессорам опухолевого роста (например, CACNA2D2, DLCJ, BLU, FUS1, RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, SEMA3B, RASSF1 (изоформы А и С)). Однако для большинства генов Зр до сих пор не ясна роль в канцерогенезе. На сегодняшний день внимание исследователей направлено, в основном, на изучение структурных изменений интересующих генов, а также функциональных изменений кодируемых ими белков в различных опухолях. Практически отсутствуют данные об экспрессии на уровне транскрипции большинства TSG и кандидатов в супрессоры в опухолях. Отсутствие и/или снижение количества мРНК гена в клетке с большой долей вероятности свидетельствует о снижении содержания или отсутствии соответствующего белка. Оценка содержания мРНК в опухолях - один из важных этапов в функциональных исследованиях TSG. Благодаря современным высокоэффективным технологиям с использованием кДНК-микропанелей стало возможным исследовать изменение экспрессии сотен и тысяч генов, однако данный метод не позволяет количественно оценивать содержание транскриптов интересующих генов, для этих целей широко используют метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

Представленная работа посвящена количественной оценке уровня мРНК генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, RASSF1A, ITGA9, HYAL1 и HYAL2 из двух областей района Зр21 LUCA (3р21.31-р21.2) и АР20 (Зр22-р21.33) в двух основных гистологических типах немелкоклеточного рака легкого (HMPJI) - АК и ПКРЛ. Задачи исследования состояли в отработке методики количественных измерений уровня мРНК генов; оценке уровня мРНК выбранных генов при АК и ПКРЛ; сопоставлении полученных данных с клиническими характеристиками исследуемых опухолей; сравнительном анализе изменения уровня мРНК генов в одних и тех же образцах НМРЛ; обсуждении возможных причин, приводящих к подавлению экспрессии исследуемых генов в опухолях легкого. Стоит отметить, что эти гены не относятся к малоизученным, поскольку известны функции их белков, для 5-ти, кроме ITGA9 показана опухольподавляющая активность. Также изучали изменение экспрессии на уровне мРНК и/или белка, в основном, на клеточных линиях легкого и реже в единичных опухолях легкого, с использованием качественных и полуколичественных методов. В случае генов RASSF1A, NPRL2/G21, HYAL1 и HYAL2 исследовали роль метилирования в подавлении их транскрипции.

В работе впервые методом ПЦР-РВ выявлено значительное снижение уровня мРНК генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, RASSF1A, ITGA9, HYAL1 и HYAL2 в большинстве опухолей легкого. Обнаружено, что частота и уровень снижений мРНК генов значительнее при ПКРЛ, чем при АК. В большинстве опухолей легкого происходит одновременное снижение содержания мРНК генов независимо от их расположения на 3р21.3 и функций белковых продуктов. Более того, впервые показано, что подавление транскрипции генов ЯВЗРЗ/СТВБРЬ и 1ТОА9 при НМРЛ связано с геномными и эпигеномными механизмами.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Анедченко, Екатерина Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. В образцах немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) 1-Ш клинических стадий с высокой частотой снижается содержание мРНК генов - супрессоров опухолевого роста, расположенных в двух областях на хромосоме Зр человека, а именно: ЯВЗРЗ/СТПБРЬ, 1ЮА9 (АР20), КРКЫЮИ, МББПА, НУАЫ, НУАЬ2 (ШСА).

2. Профили экспрессии 6-ти генов при плоскоклеточном раке (ПКРЛ) и аденокарциноме (АК) легкого похожи, но не идентичны. При ПКРЛ заметное снижение уровня мРНК генов ЯВЗРЗ/СТОЗРЬ, ЫРЯЬ2/021, 1ЮА9, НУАЫ и НУАЬ2 происходит уже на 1-ой стадии. При АК на ранней стадии обнаружены случаи повышения уровня мРНК генов ИРЯЬ2/021, КАББРЫ и НУАЫ. Частота и степень подавления экспрессии генов КАББРЫ и 1ЮА9 достоверно ассоциирована с прогрессией АК.

3. Снижение уровня мРНК генов ЯВЗРЗ/СтЗРЬ, ЫРКЬ2/в21, ИАББРЫ, 1Т0А9, НУАЫ и НУАЫ происходит независимо от расположения в одной или разных областях района 3р21.3 и функций их белковых продуктов.

4. Уровни мРНК генов ITGA9 и HYAL2, HYAL1 и HYAL2, белки которых участвуют в регуляции клеточной адгезии и ангиогенезе, у каждого пациента близки, что указывает на одновременное и координованное подавление их экспрессии.

5. Для генов RBSP3/CTDSPL и ITGA9 (область АР20), имеющих Notl -узнающие участки в 5"- области, снижение уровня их мРНК вызвано преимущественно делециями и/или метилированием промоторной области.

6. Подавление экспрессии генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, RASSF1A, ITGA9, HYAL1 и HYAL2 свидетельствует о функциональной важности кодируемых ими белков в предотвращении возникновения и/или развития опухолей легкого.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анедченко, Екатерина Анатольевна, Москва

1. Татосян А.Г. Онкогены. Сборник обзорных статей «Канцерогенез». 2000. под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир, стр. 57-74.

2. Jemal A., Siegel R., Ward Е., Murray Т., Xu J., Smigal С., Thun M.J. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin. 2006. 56(2). P. 106-130.

3. Зборовская И.Б., Татосян А.Г. Молекулярные маркеры различных стадий развития немелкоклеточного рака легкого. Молекулярная биология. 2004. 38(2). С. 191-202.

4. Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers. Oncogene. 2002. 21(45). P.6915-6935.

5. Massion P.P., Carbon D.P. The molecular basis of lung cancer: molecular abnormalities and therapeutic implications. Respir Res. 2003.4:12.

6. Zabarovsky et al. Lung cancer principles and practice, third edition, 2005. P. 118-133.

7. Angeloni D. Molecular analysis of deletions in human chromosome 3p21 and the role of resident cancer genes in disease. Brief Funct Genomic Proteomic. 2007. 6(1). P.19-39.

8. Ю.Кок К., Naylor S.L., Buys C.H. Deletions of the short arm of chromosome 3 in solid tumors and the search for suppressor genes. Adv Cancer Res. 1997. 71. P. 27-92.

9. Yokota J., Kohno T. Molecular footprints of human lung cancer progression. Cancer Sci. 2004. 95(3). P. 197-204.

10. TNM: Классификация злокачественных опухолей. 2003. 6-е изд. под ред. Н.Н. Блинова. СПб.: Эскулап. С. 192-196.

11. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer. Cell. 2000. 100(1). P. 57-70.

12. Hahn W.C., Weinberg R.A. Rules for making human tumor cells. N Engl J Med. 2002. 347(20). P. 1593-1603.

13. Knudson A.G. Hereditary cancer, oncogenes, and antioncogenes. Cancer Res. 1985. 45. P. 1437-1443.

14. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия. 2000. 65(1). С. 5-33.

15. Kohno T.,Yokota J. How many tumor suppressor genes are involved in human lung carcinogenesis? Carcinogenesis. 1999. (20)8. P. 1403-1410.

16. Kopper L., Timär J. Genomics of lung cancer may change diagnosis, prognosis and therapy. Pathol Oncol Res. 2005. 11(1). P. 5-10.

17. Dacic S. Molecular profiling of lung carcinoma: identifying clinically useful tumor markers for diagnosis and prognosis. Expert Rev. Mol. Diagn. 2007. 7(1). P. 77-86.

18. Hesson L.B., Cooper W.N., Latif F. Evaluation of the 3p21.3 tumour-suppressor gene cluster. Oncogene. 2007. 26. P. 7283-7301.

19. Zochbauer-Muller S., Gazdar A.F., Minna J.D. Molecular pathogenesis of lung cancer. Annu Rev Physiol. 2002. 64. P. 681-708.

20. Wieland I., Ammermüller T., Böhm M., Totzeck B., Rajewsky M.F. Microsatellite instability and loss of heterozygosity at the hMLHl locus on chromosome 3p21 occur in a subset of nonsmall cell lung carcinomas. Oncol Res. 1996. 8(1). P. 1-5.

21. Benachenhou N., Guiral S., Gorska-Flipot I., Labuda D., Sinnett D. High resolution deletion mapping reveals frequent allelic losses at the DNA mismatch repair loci hMLHl and hMSH3 in non-small cell lung cancer. Int J Cancer. 1998. 77(2). P. 173-180.

22. Miozzo M., Sozzi G., Musso K., Pilotti S., Incarbone M., Pastorino U., Pierotti M.A. Microsatellite alterations in bronchial and sputum specimens of lung cancer patients. Cancer Res. 1996. 56(10). P. 22852288.

23. Froudarakis M.E., Sourvinos G., Fournel P., Bouros D., Vergnon J.M., Spandidos D.A., Siafakas N.M. Microsatellite instability and loss of heterozygosity at chromosomes 9 and 17 in non-small cell lung cancer.Chest. 1998. 113(4). P. 1091-1094.

24. Wistuba I.I., Lam S., Behrens C., Virmani A.K., Fong K.M., LeRiche J., Samet J.M., Srivastava S., Minna J.D., Gazdar A.F. Molecular damage in the bronchial epithelium of current and former smokers. J Natl Cancer Inst. 1997. 89(18). P. 1366-1373.

25. Shiseki M., Kohno Т., Nishikawa R., Sameshima Y., Mizoguchi H., Yokota J. Frequent allelic losses on chromosomes 2q, 18q, and 22q in advanced non-small cell lung carcinoma. Cancer Res. 1994. 54(21). P. 5643-5648.

26. Shiseki M., Kohno Т., Adachi J., Okazaki Т., Otsuka Т., Mizoguchi H., Noguchi M., Hirohashi S., Yokota J. Comparative allelotype of early and advanced stage non-small cell lung carcinomas. Genes Chromosomes Cancer. 1996. 17(2). P. 71-77.

27. Чумаков П.М. Функция гена p53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия. 2000. 65(1). С. 34-47.

28. Denissenko M.F., Pao A., Tang М., Pfeifer G.P. Preferential formation of benzoa.pyrene adducts at lung cancer mutational hotspots in P53. Science. 1996. 274(5286). P. 430-432.

29. Gao W., Keohavong P. Analysis of K-RAS and P53 mutations in sputum samples. Methods Mol Biol. 2005. 291. P. 217-233.

30. Uchida C., Miwa S., Kitagawa K., Hattori T., Isobe T., Otani S., Oda T., Sugimura H., Kamijo T., Ookawa K., Yasuda H., Kitagawa M. Enhanced Mdm2 activity inhibits pRB function via ubiquitin-dependent degradation. EMBO J. 2005. 24(1). P. 160-169.

31. Ko J.L., Cheng Y.W., Chang S.L., Su J.M., Chen C.Y., Lee H. MDM2 mRNA expression is a favorable prognostic factor in non-small-cell lung cancer. Int J Cancer. 2000. 89(3). P. 265-270.

32. Eymin B., Gazzeri S., Brambilla C., Brambilla E. Mdm2 overexpression and pl4(ARF) inactivation are two mutually exclusive events in primary human lung tumors. Oncogene. 2002. 21(17). P. 2750-2761.

33. Weinberg R.A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 1995. 81. P. 323-330.

34. Virmani AK., Gazdar A.F. Tumor suppressor genes in Lung cancer. Methods Mol. Biol. 2003. 222. P. 97-115.

35. Eymin B., Gazzeri S., Brambilla C., Brambilla E. Distinct pattern of E2F1 expression in human lung tumours: E2F1 is upregulated in small cell lung carcinoma. Oncogene. 2001. 20(14). P. 1678-1687.

36. Zajac-Kaye M. Мус oncogene: a key component in cell cycle regulation and its implication for lung cancer. Lung Cancer. 2001. 34. P. S43-S46.

37. Bouchard C., Staller P., Eilers M. Control of cell proliferation by Мус. Trends Cell Biol. 1998. 8. P. 202-206.

38. Vita M., Henriksson M. The Мус oncoprotein as a therapeutic target for human cancer. Semin Cancer Biol. 2006. 16(4). P. 318-330.

39. Введение в молекулярную медицину, под ред. Пальцева М.А. М: «Медицина», 2004.

40. Kitamura Н., Kameda Y., Ito Т., Hayashi Н. Atypical adenomatous hyperplasia of the lung. Implications for the pathogenesis of peripheral lung adenocarcinoma. Am J Clin Pathol. 1999. 111(5). P. 610-622.

41. Ronai Z., Yabubovskaya M.S., Zhang E., Belitsky G.A. K-ras mutation in sputum of patients with or without lung cancer. J Cell Biochem Suppl. 1996. 25. P. 172-176.

42. Zhang L.F., Gao W.M., Gealy R., Weissfeld J., Elder E., Whiteside T.L., Keohavong P. Comparison of K-ras gene mutations in tumour and sputum DNA of patients with lung cancer. Biomarkers. 2003. 8(2). P. 156-161.

43. Mao L., Hruban R.H., Boyle J.O., Tockman M., Sidransky D. Detection of oncogene mutations in sputum precedes diagnosis of lung cancer. Cancer Res. 1994. 54(7). P. 1634-1637.

44. Schlessinger J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 2000. 103(2). P. 211-225.

45. Yarden Y., Sliwkowski M.X. Untangling the ErbB signalling network. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2001. 2. P. 127- 137.

46. Baillie R., Carlile J., Pendleton N., Schor A.M. Prognostic value of vascularity and vascular endothelial growth factor expression in non-small cell lung cancer. J Clin Pathol. 2001. 54(2). P. 116-120.

47. Meyerson M. Role of telomerase in normal and cancer cells. J Clin Oncol. 2000. 18(13). P. 2626-2634.

48. Autexier C., Lue N.F.: The Structure and Function of Telomerase Reverse Transcriptase. Annu Rev Biochem. 2006. 75. P. 493-517.

49. Wu K.J., Grandori C., Amacker M., Simon-Vermot N., Polack A., Lingner J., Dalla-Favera R. Direct activation of TERT transcription by c-MYC. Nat Genet. 1999. 21(2). P. 220-224.

50. Geng Z., Zhang D., Liu Y. Expression of telomerase hTERT in human non-small cell lung cancer and its correlation with c-myc gene. Chin Med J (Engl). 2003. 116(10). P. 1467-170.

51. Horikawa I., Barrett J.C: Transcriptional regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms. Carcinogenesis. 2003. 24. P. 1167-1176.

52. Wang J., Xie L.Y., Allan S., Beach D., Hannon G.J. Myc activates telomerase. Genes Dev. 1998. 12(12). P. 1769-1774.

53. Wang J., Liu X., Jiang W., Liang L. Telomerase activity and expression of the telomerase catalytic subunit gene in non-small cell lung cancer: correlation with decreased apoptosis and clinical prognosis. Chin Med J (Engl). 2000. 113(11). P. 985-990.

54. Wang L., Soria J.C., Kemp B.L., Liu D.D., Mao L., Khuri F.R. hTERT expression is a prognostic factor of survival in patients with stage I non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2002. 8(9). P. 2883-2889.

55. Fujita Y., Fujikane T., Fujiuchi S., Nishigaki Y., Yamazaki Y., Nagase

56. A., Shimizu T., Ohsaki Y., Kikuchi K. The diagnostic and prognostic relevance of human telomerase reverse transcriptase mRNA expression detected in situ in patients with nonsmall cell lung carcinoma. Cancer. 2003. 98(5). P. 1008-1013.

57. Hiyama K., Hiyama E., Ishioka S., Yamakido M., Inai K., Gazdar A.F., Piatyszek M.A., Shay J.W. Telomerase activity in small-cell and non-small-cell lung cancers. J. Natl. Cancer Inst. 1995. 87. P. 895-902.

58. Pasrija T., Srinivasan R., Behera D., Majumdar S. Telomerase activity in sputum and telomerase and its components in biopsies of advanced lung cancer. Eur J Cancer. 2007. 43(9). P. 1476-1482.

59. Lu C., Soria JC., Tang X., Xu X.C., Wang L., Mao L., Lotan R., Kemp

60. C., Sanchez-Pernaute A., Torres A., Diaz-Rubio E., Balibrea J.L., Benito

61. M. Relationship between 3p deletions and telomerase activity in non-small-cell lung cancer: prognostic implications. Br J Cancer. 2004. 90(10). P. 1983-1988.

62. Zhu C.Q., Cutz J.C., Liu N., Lau D., Shepherd F.A., Squire J.A., Tsao M.S. Amplification of telomerase (hTERT) gene is a poor prognostic marker in non-small-cell lung cancer. Br J Cancer. 2006. 94(10). P. 14521459.

63. Esteller M., Corn P.G., Baylin S.B., Herman J.G. A gene hypermethylation profile of human cancer. Cancer Res. 2001. 61(8). P. 3225-3229.

64. Belinsky S.A. Silencing of genes by promoter hypermethylation: key event in rodent and human lung cancer. Carcinogenesis. 2005. 26(9). P. 1481-1487.

65. Dammann R., Takahashi T., Pfeifer G.P. The CpG island of the novel tumor suppressor gene RASSF1A is intensely methylated in primary small cell lung carcinomas. Oncogene. 2001. 20(27).P. 3563-3567.

66. Pfeifer G.P., Dammann R. Methylation of the tumor suppressor gene RASSF1A in human tumors. Biochemistry (Mosc). 2005. 70(5). P. 576583.

67. Wistuba I.I., Mao L., Gazdar A.F. Smoking molecular damage in bronchial epithelium. Oncogene. 2002. 21(48). P. 7298-7306.

68. Esteller M., Sanchez-Cespedes M., Rosell R., Sidransky D., Baylin S.B., Herman J.G. Detection of aberrant promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in serum DNA from non-small cell lung cancer patients. Cancer Res. 1999. 59(1). P. 67-70.

69. Palmisano W.A., Divine K.K., Saccomanno G., Gilliland F.D., Baylin S.B., Herman J.G., Belinsky S.A. Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum. Cancer Res. 2000. 60(21). P. 5954-5958.

70. Wistuba I.I., Gazdar A.F. Molecular pathology of lung cancer. Verh Dtsch Ges Pathol. 2000. 84. P. 96-105.

71. Киселев Л.Л., Сенченко B.H., Опарина Н.Ю., Брага Э.А., Забаровский Е.Р. Гены-супрессоры-опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека. Молекулярная медицина 2005. 3. С. 17-28.

72. Riazimand S.H., Welkobrsky H.J., Bernawer H.S., Jacob R., Mamn W.J. Investigation for fine mapping of amplification in chromosome 3q26.3-28 frequently occurring in squamous cell carcinomas of the head and neck. Oncology. 2002. 63 (4). P. 385-392.

73. Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. От идентификации геномного полиморфизма к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей. Молекулярная биология. 2004. 38. С. 145-154.

74. Tse C., Xiang R.H., Bracht T., Naylor S.L. Human Semaphorin 3B (SEMA3B) located at chromosome 3p21.3 suppresses tumor formation in an adenocarcinoma cell line. Cancer Res. 2002. 62(2). P. 542-546.

75. Xiang R., Davalos A.R., Hensel C.H., Zhou X.J., Tse C., Naylor S.L. Semaphorin 3F gene from human 3p21.3 suppresses tumor formation in nude mice. Cancer Res. 2002. 62(9). P. 2637-2643.

76. Shu J., Jelinek J., Chang H., Shen L., Qin T., Chung W., Oki Y., Issa J.P. Silencing of bidirectional promoters by DNA methylation in tumorigenesis. Cancer Res. 2006. 66(10). P. 5077-5084.

77. Albelda S.M. Endothelial and epithelial cell adhesion molecules. Am J Respir Cell Mol Biol. 1991. 3. P. 195-203.

78. Hibi K., Yamakawa K., Ueda R., Horio Y, Murata Y, Tamari M, Uchida K, Takahashi T, Nakamura Y, Takahashi T. Abberant upregolation of a novel integrin alpha subunit gene at 3p21.3 in small cell lung cancer. Oncogene. 1994. 9. P. 611-619.

79. Palmer E.L., Ruegg C., Ferrando R., Pytela R., Sheppard D. Sequence and tissue distribution of the integrin alpha-9 subunit, a novel partner ofbeta-1 that is widely distributed in epithelia and muscle. J. Cell Biol. 1993. 123. P. 1289-1297.

80. Shivakumar L., Minna J.D., Sakamaki Т., Pestell R.G., White M.A. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation. Mol. Cell. Biol. 2002. 22. P. 4309-4318.

81. Vos M.D., Ellis C.A., Bell A., Birrer M.J., Clark G.J. Ras uses the novel tumor suppressor RASSF1 as an effector to mediate apoptosis. J. Biol. Chem. 2000. 275. P. 35669-35672.

82. Ortiz-Vega S., Khokhlatchev A., Nedwidek M., Zhang X.F., Dammann R., Pfeifer G.P., Avruch J. The putative tumor suppressor RASSF1A homodimerizes and heterodimerizes with the Ras-GTP binding protein Norel. Oncogene. 2002. 21(9). P. 1381-1390.

83. Oh H.J., Lee K.K., Song S.J., Jin M.S., Song M.S., Lee J.H., Im C.R., Lee J.O., Yonehara S., Lim D.S. Role of the tumor suppressor RASSF1A in Mstl-mediated apoptosis. Cancer Res. 2006. 66(5). P. 2562-2569.

84. RASSF1A isoform of RASSF1 promotes microtubule stability and suppresses tumorigenesis. Mol Cell Biol. 2005. 25(18). P. 8356-8367.

85. Dammann R., Li C., Yoon J.H., Chin P.L., Bates S., Pfeifer G.P. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3. Nat Genet. 2000. 25(3). P. 315319.

86. Pan Z.G., Kashuba V.I., Liu W.Q., Shao J.Y., Zhang R.H., Jiang J.H., Guo C., Zabarovsky E., Ernberg I., Zeng Y.X. High frequency somatic mutations in RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Biol Ther. 2005.4. P. 1116-1122.

87. Agathanggelou A., Cooper W.N., Latif F. Role of the Ras-association domain family 1 tumor suppressor gene in human cancers. Cancer Res. 2005. 65(9). P. 3497-3508.

88. Малюкова А.В., Логинов В.И., Ходырев Д.С., Кадырова Е.Л., Пронина И.В., Иванова Т.А., Киселев Ф.Л., Забаровский Е.Р.,

89. Киселева Н.П., Брага Э.А. Метилирование предполагаемого гена-супрессора RASSF1A в опухолях шейки матки. Молекулярная биология. 2004. 38(6). С. 1005-1013.

90. Rosell R., Lord R.V., Taron M., Reguart N. DNA repair and cisplatin resistance in non-small-cell lung cancer. Lung Cancer. 2002. 38(3). P. 217-227.

91. Rosell R., Taron M., Barnadas A., Scagliotti G., Sarries C., Roig B. Nucleotide excision repair pathways involved in Cisplatin resistance in non-small-cell lung cancer. Cancer Control. 2003. 10(4). P. 297-305.

92. Siddik Z.H. Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance. Oncogene. 2003. 22(47). P. 7265-7279.

93. Toole BP. Hyaluronan: from extracellular glue to pericellular cue. Nat. Rev. Cancer. 2004. 4. P. 528-539.

94. Csoka A.B., Frost G.I., Stern R. The six hyaluronidase-like genes in the human and mouse genomes. Matrix Biol. 2001. 20(8). P. 499-508.

95. Zhang L., Underhill C.B., Chen L. Hyaluronan on the surface of tumor cells is correlated with metastatic behavior. Cancer Res. 1995. 55(2). P. 428-433.

96. Bertrand P., Courel M.N., Maingonnat C., Jardin F., Tilly H., Bastard C. Expression of HYAL2 mRNA, hyaluronan and hyaluronidase in B-cellnon-Hodgkin lymphoma: relationship with tumor aggressiveness. Int J Cancer. 2005. 113(2). P. 207-212.

97. Lepperdinger G., Strobl B., Kreil G. HYAL2, a human gene expressed in many cells, encodes a lysosomal hyaluronidase with a novel type of specificity. J Biol Chem. 1998. 273(35). P. 22466-22470

98. Lokeshwar V.B., Cerwinka W.H., Isoyama T., Lokeshwar B.L. HYAL1 hyaluronidase in prostate cancer: a tumor promoter and suppressor. Cancer Res. 2005. 65(17). P. 7782-7789.

99. Kovar J.L., Johnson M.A., Volcheck W.M., Chen J., Simpson M.A. Hyaluronidase expression induces prostate tumor metastasis in an orthotopic mouse model. Am J Pathol. 2006. 169(4). P. 1415-1426.

100. Jacobson A., Rahmanian M., Rubin K., Heldin P. Expression of hyaluronan synthase 2 or hyaluronidase 1 differentially affect the growth rate of transplantable colon carcinoma cell tumors. Int J Cancer. 2002. 102(3). P. 212-219.

101. Simpson M.A. Concurrent expression of hyaluronan biosynthetic and processing enzymes promotes growth and vascularization of prostate tumors in mice. Am J Pathol. 2006. 169(1). P. 247-257.

102. Madan A.K., Yu K., Dhurandhar N., Cullinane C., Pang Y., Beech D.J. Association of hyaluronidase and breast adenocarcinoma invasiveness. Oncol Rep. 1999. 6(3). P. 607-609.

103. Lokeshwar V.B., Obek C., Soloway M.S., Block N.L. Tumor-associated hyaluronic acid: a new sensitive and specific urine marker for bladder cancer. Cancer Res. 1998. 58(14). P. 3191.

104. Franzmann E.J , Schroeder G.L., Goodwin W.J., Weed D.T., Fisher P. Lokeshwar V.B. Expression of tumor markers hyaluronic acid and hyaluronidase (HYAL1) in head and neck tumors. Int J Cancer. 2003. 106(3). P. 438-445.

105. Lokeshwar V.B., Cerwinka W.H., Lokeshwar B.L. . HYAL1 hyaluronidase: a molecular determinant of bladder tumor growth and invasion. Cancer Res. 2005. 65(6). P. 2243-2250.

106. Li R., Todd N.W., Qiu Q., Fan T., Zhao R.Y., Rodgers W.H., Fang H.B., Katz R.L., Stass S.A., Jiang F. Genetic deletions in sputum asdiagnostic markers for early detection of stage I non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2007. 13(2). P. 482-487.

107. Лукьянов K.A., Гурская Н.Г., Богданова E.A., Лукьянов С.А. Селективная супрессия полимеразной цепной реакции. Биоорганическая химия. 1999. (25)3. С. 163-170.

108. Фролов А.Е., Годвин Э.К., Фаворова О.О. Анализ дифференциальной экспрессии генов на кДНК-микрочипах и его применение в молекулярной онкологии. Молекулярная биология. 2003. 37(4). С. 573-584.

109. Gibson U.E., Heid С.A., Williams P.M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 1996. 6(10). P. 995-1001.

110. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996. 6(10). P. 986-994.170. http://qpcr2005.gene-quantification.info

111. Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J., Giusti W., Deets K. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl. 1995. 4. P. 357-362.

112. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol. 2000. 25(2). P. 169-193.

113. Bustin S.A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol. 2002. 29(1). P. 23-39.

114. Bernard P.S., Wittwer C.T. Real-time PCR technology for cancer diagnostics. Clin Chem. 2002. 48(8). P. 1178-1185.

115. Zhu Y.Y., Machleder E.M., Chenchik A., Li R., Siebert P.D. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 2001. 30. P. 892-897.

116. Dheda K., Huggett J.F., Bustin S.A., Johnson M.A., Rook G., Zumla A. Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR. Biotechniques. 2004. 37(1). P. 112-114, 116, 118-119.

117. Wong M.L., Medrano J.F. Real-time PCR for mRNA quantification. BioTechniques. 2005. 39. P. 1-11.

118. Radonic A., Thulke S., Mackay I.M., Landt O., Siegert W., Nitsche A. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. 313. P. 856-862.

119. Liu D.W., Chen S.T., Liu H.P. Choice of endogenous control for gene expression in nonsmall cell lung cancer. Eur Respir J. 2005. 26(6). P. 1002-1008.

120. Hahn W.C. Role of telomeres and telomerase in the pathogenesis of human cancer. J Clin Oncol. 2003. 21(10). P. 2034-2043.

121. Wang J., Liu X., Jiang W., Liang L. Telomerase activity and expression of the telomerase catalytic subunit gene in non-small cell lung cancer: correlation with decreased apoptosis and clinical prognosis. Chin Med J (Engl). 2000. 113(11). P. 985-990.

122. Hung J., Kishimoto Y., Sugio K., Virmani A., Mclntire D.D., Minna J.D., Gazdar A.F. Allele-specific chromosome 3p deletions occure at an early stage in the pathogenesis of lung carcinoma. JAMA. 1995. 6. P. 963-968.

123. Wistuba I.I., Gazdar A.F., Minna J.D. Molecular genetics of small cell lung carcinoma. Semin Oncol. 2001. 28. P. 3-13.

124. GeneCards database, http://bioinformatics.weizmann. ac.il/cards/

125. Couzin J. MicroRNAs make big impression in disease after disease. Science. 2008. 319(5871). P. 1782-1784.

126. Petersen S., Heckert C., Rudolf J., Schluns K., Tchernitsa O.I., Schäfer R., Dietel M., Petersen I. Gene expression profiling of advanced lung cancer. Int J Cancer. 2000. 86(4). P. 512-517.

127. McDoniels-Silvers A.L., Stoner G.D., Lubet R.A., You M. Differential expression of critical cellular genes in human lung adenocarcinomas and squamous cell carcinomas in comparison to normal lung tissues. Neoplasia. 2002. 4(2). P. 141-150.

Информация о работе

Анедченко, Екатерина Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Подавление экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста при немелкоклеточном раке легкого - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы