Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная и функциональная характеристика генов человека RFP2, RFP2OS, KCNRG и C13ORF1

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурная и функциональная характеристика генов человека RFP2, RFP2OS, KCNRG и C13ORF1"

На правах рукописи Иванов Дмитрий Валерьевич

Сторна, „ функциональная характеристика ,е„„в человека ЯРР2, «то*, КСЖв е СНОМ7

Специальность - 03.00.15 -

генетика.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ БЕСПЛАТНЫЙ ЭКЗЕМПЛЯР

Москва-2003

Работа выполнена в лаборатории анализа генома Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Баранова Анна Вячеславовна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

академик Шестаков Сергей Васильевич, кандидат биологических наук Ко робко Игорь Викторович.

Ведущая организация: Государственное Учреждение Гематологический Научный Центр РАМН.

Защита состоится "_"_ 2003 г. в_ч._мин. на заседании

диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991 ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (095)132-89-62

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан "_"_2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Г.Н. Полухина

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы. Опухолевые заболевания занимают второе место в мире как причина смертности после заболеваний сердечно-сосудистой системы. Для многих типов опухолей пока не выявлены гены, повреждения которых служат "спусковым крючком" активного канцерогенеза. Выявление генов связанных с развитием опухолей создает основу для понимания молекулярных механизмов возникновения и развития онкозаболеваний, а также приводит к появлению новых методов их диагностики и лечения. Поэтому исследования, направленные на поиск и изучение генов, вовлеченных в процесс образования опухолей, остаются высоко актуальными.

Причиной возникновения и прогрессии опухолей являются изменения генома соматических клеток. Этот факт заметно облегчает переход от стадии описания фенотипических проявлений заболевания, в том числе хромосомных перестроек, часто сопровождающих процесс возникновения опухолей, к стадии выяснения молекулярных механизмов его развития. Показано, что перестройки участков генома человека могут приводить к утрате или дефектам генов (так называемых супрессоров опухолевого роста), в норме подавляющих клеточное деление и развитие опухолей. Одним из таких участков генома является ^14.3 повреждаемый при некоторых онкологических заболеваниях, таких как В-клеточный хронический лимфолейкоз, рак простаты и других. В большинстве работ минимальный утрачиваемый район был ограничен БТБ- маркерами П138273 и 013825. Благодаря результатам, полученным в ходе международного проекта "Геном человека", в настоящий момент у исследователя имеются практически все необходимые данные для выявления точной структуры генов, находящихся в этой области. Нуклеотидная последовательность этого района, размером приблизительно 800 т.п.н., содержит семь генов, лишь три из которых были ранее охарактеризованы.

Данная работа посвящена характеристике структуры и функции четырех генов человека Ю7Р2, КРРЮБ, КСШв и С!ЗОШ, один из которых может являться искомым геном-супрессором опухолевого роста, повреждаемым при перестройках области ^14.3.

Дель и задачи исследования. Целью исследования является структурная и функциональная характеристика генов человека ЯРР2, КРР20Б, КСШС и С130ЯР1, являющихся возможными кандидатами на роль супрессора опухолевого роста.

Для реализации поставленной цели при исследовании этих генов решались следующие задачи:

1. Выявить соответствующие генам изоформы мРНК и установить их экзон-интронную структуру;

2. Провести анализ тканеспецифичности экспрессии исследуемых генов;

3. Провести т яШсо функциональную характеристику предсказанных аминокислотных последовательностей кодируемых исследуемыми генами;

4. Методом дрожжевой двугибридной системы выявить гены, продукты которых являются потенциальными партнерами по взаимодействию белков, кодируемых исследуемыми генами.

Научная новизна. Впервые выявлено наличие нескольких изоформ мРНК генов человека РРР2, ЯРРЮБ, КСЖО, С130№1 и экспериментально подтверждено существование этих изоформ методами ОТ-ПЦР и нозерн-гибридизации. Установлен профиль тканеспецифичности экспрессии этих генов. Методом анализа т яШсо выявлены вероятные функциональные домены в аминокислотных последовательностях генов ЁРР2, КСИ1№ и С]ЗОЯГ1. С помощью дрожжевой двугибридной системы для белка ЯРР2 выявлены десять, а для белка С130ИР1 - два потенциальных партнера по взаимодействию.

Научно-практическая значимость работы. В области ^14.3 уточнена локализация рекомбинантных космид, которые могут быть использованы в клинической цитогенетике на ДНК пациентов, больных онкологическими заболеваниями, для идентификации хромосомных перестроек. ДНК этих клонов также может быть использована для поиска областей, регулирующих транскрипционную активность генов данной области.

Полученные данные о структуре генов КРР2, ЯРР205, КСШС и С130ЯГ1 позволяют приступить к их детальному мутационному анализу на ДНК пациентов больных онкологическими заболеваниями, ассоциированными с исследуемой областью. Подробный структурный анализ этих генов создает базу для последующих функциональных исследований.

Функциональная характеристика исследуемых генов впервые позволила высказать предположения о возможной роли каждого из них в развитии онкологических заболеваний, ассоциированных с исследуемой областью. Полученные результаты по выявлению генов, белковые продукты которых являются потенциальными партнерами ИРР2 и С13СЖР1, могут быть использованы при построении генных сетей, элементами которых являются исследованные гены.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Впервые проведена структурная и функциональная характеристика четырех генов человека ЛРР2, ЯГР205, КСтв и С1 ЗОИЛ]

2. Впервые выявлены изформы РНК: четыре для гена одна для МР20Б-, две для КСШв; три для С130Ш1. Для всех изоформ РНК установлена экзон-интронная структура;

3. Гены КРР2, КСМЮ и СНСЖЛ экспрессируются во многих исследованных неопухолевых тканях и опухолевых клеточных линиях;

4. Изоформы мРНК генов №Р2, КСЖв и С130Ш содержат эволюционно-консервативные ОРС, содержащие функциональные домены. Изоформа РНК не содержит ОРС;

5. Выявлены десять белков потенциальных партнеров по взаимодействию с белком ЯРР2 и два потенциальных партнера по взаимодействию белка С130КР1.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на межлабораторном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" ИОГен РАН им.Н.И.Вавилова (Москва, 2002); представлены на 8-й конф. "Геном Человека", г.Черноголовка, 612 января 1998 г., на 9-й итоговой конф. "Геном Человека-99", г.Черноголовка, 2-5 февраля 1999 г., на 10-й итоговой конф. "Геном Человека-2000" и других.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, результатов с обсуждениями, заключения, выводов, списка литературы, состоящего из 257 источников, приложения и благодарностей. Диссертация изложена на 201 странице машинописного текста, содержит 15 рисунков, три таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы.

В работе использовалось оборудование, реактивы и расходные материалы российских и зарубежных фирм-производителей. В работе были использованы штаммы клеток Е. Coli NM522, JM109, также штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y153. Использовались клоны из специфичных по хромосоме 13 космидных библиотек ICRF С108 и LA13NC01. Была использована в работе экспрессионная кДНК клонотека фирмы "Clontech", созданную на основе мРНК из клеточной линии К562 (каталожный номер HL4032AH).

Обработку ДНК эндонуклеазами рестрикции, электрофоретическое фракционирование фрагментов ДНК, полимеразную цепную реакцию, ТТЦР в сочетании с реакцией обратной транскрипции, выделение плазмидной ДНК из E.coli и S.cerevisiae, приготовление гибридизационных зондов, блот-гибридизацию по Саузерну, нозерн-гибридизацию, гибридизацию на колониях, трансформацию клеток E.coli и S.cerevisiae проводили в соответствии с общепринятыми методиками. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводили методом Сэнгера на камере для вертикального электрофореза Sequi-Gen Sequencing Cell (фирма Bio-Rad, США) с использованием набора "fmol®DNA Cycle Sequencing Systems" (Promega, США). Для поиска партнеров по взаимодействию с исследуемыми белками была использована дрожжевая двугибридная система MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 (Clontech, USA). Поиск клонов ДНК, кодирующих белки партнеры по взаимодействию, а так же необходимые тесты были проведены в соответствии с рекомендациями в описании двугибридной системы.

Для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакеты BLAST, находящиеся по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Использовали программу HcpolyA, распознающую участки полиаденелирования, (http://www.itba.mi.cnr.it-webeene). Для предсказания сайтов сплайсинга использовали программу NNSSP (http://www.fhiitflv.org/seq tools/splice.htmll. Для поиска гидрофобных областей в предсказанных белках использовали программу SOSUI (http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiíiame0.html). Для поиска доменов использовали программу "Search the Conserved Domain Database with Reverse Position Specific BLAST" размещенную на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/).

Праймеры для ПЦР подбирали с помощью программы OLIGONEW. Для множественного выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали программу CLUSTAL X (1.5b).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Космидный контиг области, содержащей гены ЯГР2, ЯРР20Б,

свояп и КСЖв.

Ранее построенные контиги космидных клонов района, расположенного между 8Т8 маркерами 11)1381168 и Б138272 (КарапасЬе В.1. е1 а1., 1998; Ка1асЫкоу 8. е1 а1., 1997) не позволили точно определить структуру исследуемых генов. Поэтому был построен космидный контиг, который представлен на рисунке 1. Нам также удалось показать, что фрагменты гена С130ЯР1 расположены на космидах \22Y4 и 105Р10, фрагменты генов ЯРР2 и КСИЯв расположены на космиде 67В4, а ген ЯРР20Б расположен на космидах 116С1 и 156Н12.

■■■ Центромера

STS DI3S1168 SIS WH333

Теламера I

ШР7

67В4

31а

-«В11

а

ы

32*

140F11

Рис. 1. Уточненный космидный контиг исследуемой области генома человека.

Полученные космидные клоны геномной ДНК могут быть использованы для идентификации нормальных и аномальных хромосом человека ДНК пациентов больных онкологическими заболеваниями, ассоциированными с исследуемой областью. ДНК этих клонов также может быть использована для поиска областей, содержащих регуляторные элементы данных генов.

2. Экзон-интронная структура и возможная функция гена RFP2.

2.1. Изоформы мРНК гена RFP2.

Ген RFP2 был клонирован A.B. Барановой в виде клона кДНК BCLL2. Нуклеотидная последовательность клона BCLL2 была определена нами и имеет длину 1256 п.н. Нуклеотидная последовательность клона содержит кодон AUG в благоприятном контексте для инициации трансляции и открытую рамку считывания (ОРС), кодирующую предсказываемую последовательность, состоящую из 407 аминокислот.

С помощью нозерн-гибридизации зонда, содержащего ОРС, на нозерн-блоты показано наличие, по крайней мере, трех изоформ мРНК гена RFP2, размером 1,4 т.н., 2,4 т.н. и 7,5 т.н. (рис. 2).

12345678 маркер 12345678

Рис. 2. Результат нозерн-гибридизации на филыры НнШ фирмы Clontech кДНК-зонда содержащего ОРС; Н:1-сердце, 2-мозг, 3-плацента, 4-легкое, 5-печень, 6-скелетная мышца, 7-почка, 8-поджелудочная железа; Н2: 1-селезенка, 2-тимус, 3-простата, 4-яички, 5-яичники, 6-тонкий кишечник, 7-толстый кишечник, 8-лимфоциты периферической крови.

В базе данных экспрессирующнхся последовательностей значительное число EST совпадают с нуклеотидной последовательностью 3'- и 5'-конца клона BCLL2. Ряд экспрессирующнхся последовательностей содержат нуклеотидные последовательности, продолжающиеся далее в 3'-направлении и совпадающие между собой. Девять EST содержат нуклеотидные последовательности, продолжающиеся далее в 5'-направлении. Эти последовательности можно разбить на две группы по наличию или отсутствию внутренней нуклеотидной последовательности в 85 нуклеотидов.

По нашей просьбе в лаборатории, возглавляемой С.А. Лукьяновым (ИБХ РАН), были получены 5'- и 3'-RACE-продукты, нуклеотидная последовательность которых была определена нами. Эти последовательности, а также описанные выше EST были использованы для дизайна праймеров для постановки ОТ-ПЦР с целью детального анализа изоформ мРНК гена RFP2. Полученные продукты были клонированы и их последовательности установлены по методу Сэнгера.

Суммарный анализ всех нуклеотидных последовательностей позволил восстановить возможные последовательности двух изоформ мРНК RFP2, соответствующие полосе размером 1.4 т.н. Одна из них имеет в длину 1414 нуклеотидов и зарегистрирована нами под номером AF241850. Этой же полосе соответствует последовательность длиной 1499 нуклеотидов, зарегистрированная под номером AY191002 и отличающаяся на 85 нуклеотидов в 5'-области от последовательности AF241850.

Анализ той же совокупности данных позволяет выдвинуть гипотезу, что изоформы мРНК, соответствующие полосам длиной 2.4 т.н. и 7.5 т.н., совпадают с нуклеотидной последовательностью изоформ мРНК, соответствующих полосе 1.4 т.н. и имеют более длинную не кодирующую 3 '-последовательность.

2.2. Экзон-интронная структура гена ЯРР2.

Экзон-интронную структуру изоформ мРНК АР241850 и АУ191002 гена КРР2 мы установили, определив нуклеотидную последовательность космидной ДНК клонов 67В4,116С1 с олигонуклеотидов на эти изоформы. Эти последовательности были поданы в базу данных под номерами АБ241849 и АР241848. Данные по локализации экзонов гена КГР2, позволили установить ориентацию гена от центромеры к теломере.

Нуклеотидная последовательность клона 67В4 содержит единственный экзон, длиной 1256 нуклеотидов, с консервативным сигналом сплайсинга и ОРС исследуемого гена. Следует отметить, что в 3'-области восстановленных изоформ мРНК присутствуют длинные поли-А последовательности, которые отсутствуют в нуклеотидной последовательности 67В4. Рядом с поли-А трактом этих изоформ расположен сигнал полиаденелирования "ТАТААА". Этот результат позволяет нам сделать вывод о том, что нуклеотидная последовательность 3'-области этих изоформ мРНК ВРР2 восстановлена полностью.

Полученные нуклеотидные последовательности изоформ мРНК, соответствующие полосам 2.4 т.н. и 7.5 т.н. мы сравнили с последовательностью ДНК космидного клона 67В4. Эти последовательности совпали. Однако, для изоформ мРНК, соответствующих полосе 2.4 т.н., в геноме присутствует длинная поли-А последовательность, там, где завершается последовательность восстановленного транскрипта. Сигнал полиаденелирования для этого транскрипта не является строгим. Таким образом, последовательность, соответствующая полосе 2.4 т.н., нельзя считать восстановленной полностью. Последовательность изоформы мРНК гена №Р2 длиной 7.5 т.н. не была полностью восстановлена.

Нуклеотидная последовательность клона 116С1 включает в себя два альтернативных, различающихся по длине на 85 нуклеотидов экзона 1 и 1' и экзон 2. Таким образом, Ш?Р2 кодирует альтернативные изоформы мРНК, в 5'-области содержащие либо экзона 1, либо экзон Г. Перед экзонами 1 и Г, с помощью люциферазной репортерной системы, было показано наличие промоторной области (личное сообщение М.Ю. Скоблова). Этот результат позволяет нам сделать вывод о том, что нуклеотидные последовательности 5'-области изоформ мРНК гена ЯГР2 восстановлены полностью.

Данные о нуклеотидной последовательности геномной ДНК (нуклеотидные последовательности АР279660 и АЬ137060), содержащие экзоны ЯРР2, полностью подтвердили выводы, сделанные нами экспериментальным путем. Описанная нами структура ЯГР2 приведена на рисунке 3.

центромера

теломера

кета

18 на

«31 он 5172пн. 3112он. 377Ш.В. «на "»а* 12Ж.Ш. «Збнл 9Sh.ii 733 на

Изоформа мРНКЛ№2 АР241850 Изоформа мРНК ЛЕТ2 А У191002

ехГ

ех2 ехЗ

З^-^-ОНИ

ех2 ехЗ

2747 нл 1286 нл.

Изоформа мРНКЖОУКС? АУ129«53

ех5 «14

ехЗ ех2 ех1

|П1и >1 Д,

266 ИЛ. 548 ил

36 на 169 ап.

■Изоформа РНК гена ЯРР20$ АГ529010

«1 ей ехЗ

^ Изоформа мРНК КСННв АУ129654

->

Ряс 3. Экзон-интроиная структура генов ЯРР2, ПЕР20й я КСШв. В язоформах мРНК геиа КСШС ■цветом выделена область ОРС.

2.3. Анализ профиля экспрессия гена RFP2 в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека.

Для определения профиля экспрессии и разнообразия изоформ мРНК гена RFP2 была проведена нозерн-гибридизация (рис. 2). Нами показано, что ген человека RFP2 экспрессируется практически во всех представленных на нозерн-блотах тканях в виде хотя бы одного транскрипта. Изоформы мРНК размером 1.4 т.н. наиболее интенсивно представлены в ткани яичек. Формы 2.4 т.н. представлена преимущественно в скелетных мышцах и лимфоцитах периферической крови, а формы размером 7.5 т.н. - в тимусе.

Проведенные нами независимые эксперименты по ОТ-ПЦР на матрице мРНК из клеточных линий Lim 1215 (рак толстой кишки), T47D (рак молочной железы), SKOV-3 (рак яичников), SAOS-2 (остеосаркома), К562 (хронический миелоцитарный лейкоз), Т|.13 (остеосаркома) с праймеров на ОРС показали присутствие транскриптов гена RFP2 только в клеточных линиях К562 и Lim 1215.

2.4. Анализ аминокислотной последовательности, кодируемой геном RFP2.

Изоформы мРНК гена RFP2 содержат ОРС, которой соответствует предсказанная аминокислотная последовательность, состоящая из 407 аминокислот. Эта последовательность содержит цинк-связывающие домены RING и В-ВОХ, а также «спирально скрученный» домен. Такое сочетание доменов называется Rfp-подобным трехчастным доменом, по названию белка Rip (Ret finger protein). Белок Rfp (E.value 10'14) приобретает онкогенные свойства, когда его трехчастный домен в результате транслокации состыковывается с содержащим тирозин-киназный домен белком Ret (Cao T. et al., 1997). Не менее интересны и другие белки, в высокой степени гомологичные RFP2 (были отобраны белки с E.value равной или меньше чем 10"7). Среди них белок XPRF (E.value 10"13), продукт гена MIDI, вовлечен в такие фундаментальные процессы, как закладка органов эмбриона и контроль пролиферации клеток (Quaderi N.A. et al., 1997; Gaudenz К. et al., 1998). Другой белок, гомологичный RFP2, Rpt-1 (E.value 1013) - это внутриклеточный протеин, обнаруженный в покоящихся Т-хелперах. Имеет аминокислотное сходство с RPP2 и Ro/SSA белок (E.value 10'"), антитела к которому присутствуют в крови пациентов такими аутоиммунными заболеваниями, как синдром Шогрена, системная красная волчанка и волчанка новорожденных (Chan E.K. et al., 1991; Sibilia J., 1998). MURF-1 (E.value 10'17) и MURF-2 (E.value 10'16) имеют высокое сходство с RFP2 и вовлечены в процессы сокращения мышц.

Белок RFP2 эволюционно-консервативен. Белки, в высокой степени гомологичные RFP2, обнаружены у гребенчатого тритона Pleurodeles waltii

(E.value 10"19), шпорцевой лягушки Xenopus laevis (E.value 10"16), и у нематоды Cenorhabditis elegans (E.value 10" ).

В работе (Reymond A. et al., 2001) было показано, что RFP2 является либо цитоплазматическим белком с около ядерной локализацией, либо мембранным белком эндоплазматического ретикулама. Этот результат интересен еще и потому, что в аминокислотной последовательности С-концевой области предсказано наличие двух трансмембранных доменов. Также в ряде исследований было показано, что белки, содержащие RING-домен, являются Е2-зависимыми ЕЗ убиквитин-лигазами. Представляются интересными работы, описывающие белок Der3/Hrdlp, содержащий RING-домен и также являющийся Е2-зависимой ЕЗ убиквитин-лигазой (Taxis С. et al., 2002; Deak Р.М. and Wolf D.H., 2001). Этот белок вовлечен в процесс деградации неправильно свернувшихся или неспособных образовывать специфические комплексы белков эндоплазматического ретикулума. Наличие трансмембранных доменов и RIftG-домена в белке RFP2, а также данные по локализации позволяют высказать гипотезу о схожей функции белкового продукта гена RFP2.

2.5. Поиск партнеров белка RFP2 методом дрожжевой двугибридной

системы.

Для того чтобы обнаружить партнеров по взаимодействию белка RFP2 была использована дрожжевая двугибридная система MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 (Clontech, USA). Созданная нами конструкция pGBT+RFP2 на основе шаттл-вектора pGBT9 была использована для скрининга экспрессионной кДНК клонотеки. В результате проведенного скрининга были протестированы более миллиона независимых клонов, из них 25 оказались положительными. По результатам тестов, позволяющим установить ложноположительные клоны, для дальнейшей работы были отобраны 13. Нуклеотидные последовательности вставок ДНК клонов были проанализированы и соответствуют десяти генам. Функция двух генов не описана. Описание функции восьми генов представлено в таблице 1.

2.6. Возможная функция гена RFP2.

Собирая воедино экспериментальные данные, можно высказать предположение о возможной функции RFP2. Данные по локализации белка и анализу аминокислотной последовательности позволяют предположить, что белок RFP2 "заякорен" на мембране эндоплазматического ретикулума. В сочетании с возможной функцией RING домена, можно предположить, что белок действует как ЕЗ убиквитин-лигаза. Многие потенциальные партнеры RFP2 содержатся, ассоциированы, проходят через эндоплазматический ретикулум. Перечисленные данные позволяют предположить связь белка RFP2 с системой деградации белков

неправильно свернувшихся или образовавших неверные комплексы, ассоциированной с эндоплазматическим ретикулумом. Активность любой системы контроля существенна для нормального функционирования клетки. Возможное участие ЯРР2 в одной из таких систем с учетом его локализации в области генома, ассоциированной со многими онкологическими заболеваниями выделяет его среди других генов как возможного супрессора опухолевого роста.

таблица 1

Ген Функция

RPLP1 Рибосомальный фосфопротеин Р1, который является компонентом большой 60S субьедниицы. Играет важную роль на этапе элонгации при синтезе белков на рибосомах

LRPAPI (2 раза) Вероятно, LRPAPI - новый класс шаперонов, которые селективно предотвращают лигаид-нндуцируемую агрегацию и последующую деградацию в эндоплазматическом ретикулуме. Показана ассоциация ДНК-полиморфизмов гена LRPAPI с late-onset формой болезни АльцгеЙмера.

ССТ5 Белок входит в семейство шапероиов ТСР-1/српб0. Возможно участвует в правильном сворачивании тубулина, актина н иентрактииа.

PRKCSH (2 раза) Белок 80К-Н вовлечен в формирование мембранных белковых комплексов ответственных за передачу сотнала от рецептора фактора роста фибробластов 3. Показано участие 80К-Н в системе дополнительного гликозилнрования (advanced glycation endproduets, AGE), ответственной за неэнзиматическую ассоциацию сахара с белком или лип ид ом в эндоплазматическом ретикулуме.

PMF1 Белок PMF1, является коактиватором, вместе с транскршщнонным фактором NF-£2-rebtcd factor 2 (Nrf-2) регулирующим транскрипцию Spermidine/spermine N(l)-acety!traiisferase (SSAT).

MCF2L (2 раза) В базе данных GeneCard предсказана функция белкового продукта этого гена как ГДФ-обменивающего фактора, который связывает регуляторыые пути идущие через белковые продукты генов RAC1, RHOA, CDC42. Также, белок может участвовать в аксонном транспорте.

VPS1S Ген VPS18 кодирует гомолог дрожжевого белка VpslS, который входят в белковый комплекс класса С, ответственный за сортировку вакуолярных белков (vacuolar protein sorting, VPS). Вероятно, такая же функция, как и у дрожжевого гомолога, у белкового продукта гена VPS18.

CAPNS1 Ген CAPNS1 кодирует малую субъеднницу белковых комплексов Calpain I и Calpain П, кальций-зависимых цист ей новых протеаз (ЕС 3.4.22.17). Вероятно, они участвуют в интегрнн-опосредованвой _ передаче сигнала, перестройке цнтоскелета и контроле клеточного цикла. Вероятно, малая субъединнца выполняет ре гулят орную функцию. Кал панны I н П вовлечены в разрушение тканей, ассоциированное с ишемией мозга и сердца, а такав с болезнью АльцгеЙмера.

3. Экзон-интронная структура и возможная функция гена RFP20S.

3.1. Экзон-интронная структура гена RFP20S.

Ген RFP20S был обнаружен Тяжеловой Т.В. в виде экспрессирующейся последовательности EST N35296 (ткань-меланоциты). Нуклеотидная последовательность соответствующего EST клона была определена нами. Эта последовательность была зарегистрирована нами под номером AF529010. Следует отметить, что в нуклеотидной последовательности транскрипта RFP20S длиной 1768 н. не удалось обнаружить протяженные ОРС.

Экзон-интронную структуру изоформы РНК RFP20S удалось установить, анализируя геномные нуклеотидные последовательности из базы данных GenBank AF334404, AF440619 и AL391993. Структура гена приведена на рисунке 3. Исследуемая изоформа состоит, по крайней мере, из пяти экзонов. Первый экзон частично перекрывается с экзонами 1 (совпадают на 57 нуклеотидов) и Г (совпадают на 146 нуклеотидов) RFP2. Длины экзонов и интронных областей приведены на рисунке 3. Анализ сигналов сплайсинга, наличие в кДНК длинного поли-А тракта и отсутствие его в нуклеотидной последовательности геномной ДНК, а также присутствие строгого сигнала полиаденелирования "ААТААА" позволяет утверждать, что изоформа РНК гена RFP20S синтезируется с цепи, комплиментарной к цепи, с которой синтезируются изоформы мРНК гена RFP2.

Наличие транскрипта RFP20S в клеточных линиях К562 и Liml215 было подтверждено экспериментально ОТ-ПЦР. Следует отметить, что продукт ОТ-ПЦР не был получен с клеточных линий T47D, SKOV-3, SAOS-2, Тиз.

3.2. Возможная функция гена RFP20S

Экзоны 1 и Г RFP2 перекрываются с первым экзоном RFP20S, при этом транскрипция генов осуществляется с комплиментарных цепей. Таким образом, траснкрипт RFP20S является эндогенным антисмысловым траснкриптом для гена RFP2. В обзоре T.Sijen и J.M.Kooter (Sijen Т. and Kooter J.M., 2000), а так же у J.M.Bosher и М. Labouesse (Bosher J.M. and Labouesse M., 2000) рассмотрены механизмы пост транскрипционной репрессии генов, одним из которых является репрессия посредством эндогенной антисмысловой РНК. Возможно, этот механизм регуляции может иметь место и в случае генов RFP2 и RFP20S.

4. Экзон-интронная структура и возможная функция гена KCNRG.

4.1. Экзон-интронная структура и анализ профиля экспрессии гена

KCNRG.

Ген KCNRG был обнаружен Тяжеловой Т.В. в виде двух EST. Нуклеотидные последовательности клонов были определены нами и зарегистрированы под номерами AY129653 (изоформа А) и AY129654 (изоформа В). Анализ базы данных GenBank позволил выявить нуклеотидную последовательность AF440619 фрагмента хромосомы 13, соответствующую последовательностям изоформ. Выравнивание этой последовательности и изоформ мРНК гена KCNRG позволяет утверждать, что изоформа А состоит из трех экзонов, изоформа В состоит из 2 экзонов (рис. 3). Изоформа А мРНК отличается внутренним экзоном от изоформы В. Следует отметить, что в З'-области общего экзона изоформ мРНК присутствуют длинные поли-А тракты. При этом в геноме отсутствует

i I

f

поли-А последовательность или последовательность подобная ей. Рядом с поли-А трактом расположен сигнал полиаденелирования "ААТААА". Следовательно нуклеотидная последовательность З'-области изоформ мРНК восстановлена полностью.

Анализ нуклеотидной последовательности, прилегающей к первому экзону, позволил выявить два повторяющихся элемента: (A)26(TA)12(CA)1oTGTA(CA)2TACA(TA)4CA(TA)3G(TA)4 и (А),з(ТА)зз. Эти элементы разделены последовательностью длиной 660 нуклеотидов и способны образовывать стабильные вторичные структуры (температура плавления около 60°С). В этом случае данные, полученные при проведении эксперимента по достройке праймера (primer extension experiment), нельзя признать убедительными. Полученные в этом случае продукты реакции f обратной транскрипции могут соответствовать абортивным продуктам

* реакции.

Последовательность в 400 нуклеотидов, содержащая 100 нуклеотидов первого экзона и уходящая в 5'-область по геному, была ' проанализирована на наличие сигналов сплайсинга. В данной

последовательности сигналы сплайсинга обнаружены не были. Таким образом, вероятно общий первый экзон имеет в длину 636 нуклеотидов или больше.

Проведенные нами эксперименты по ОТ-ПЦР на матрице мРНК выделенной из тканей целой простаты, легких, мозга, желудка, почки, лимфоцитов показали присутствие обеих изоформ мРНК гена KCNRG в приведенных тканях. В клеточных линиях Lim 1215, T47D, А431, SAOS-2 ( удалось зарегистрировать обе изоформы. В клеточных линиях SKOV-3,

Du 145, LNCaP данные изоформы обнаружены не были.

I 4.2. Анализ аминокислотных последовательностей, кодируемых геном

I KCNRG.

Две изоформы мРНК гена KCNRG содержат ОРС, которым f соответствуют предсказанные последовательности, состоящие из 229 (изоформа А) и 272 (изоформа В) аминокислотных остатков. ^ Аминокислотные последовательности отличаются по С-концу. Отличия не затрагивают область домена тетромеризации потенциал-зависимых калиевых каналов Т1 (E.value 10"14). Кодон, кодирующий первую аминокислоту для обеих изоформ, расположен в первом экзоне в ^ относительно благоприятном контексте (aagaAUGag) для инициации

трансляции, стоп-кодон - в третьем экзоне. Кодон AUG, кодирующий I третий метионин, расположен в более благоприятном контексте, но при

этом нарушается структура домена Т1. Однако следует отметить, что и в этом случае последовательность, содержащая AUG (caagAUGgt) отличается от оптимальной последовательности (aacaAUGgc).

Белок KCNRG эволюционно-консервативен: у нематоды C.elegance нами обнаружен белок VM106R.1 (E.value 10"12)с неизвестной функцией, а в геноме мухи D.melanogaster-белок CG10830 (E.value 10"'2).

Белок KCNRG содержит единственный домен Т1, занимающий положение с аминокислотной позиции 7 по позицию 94. Домен Т1 - это N-концевой, цитоплазматический домен ответственный за тетрамеризацию а-субъединиц потенциал-зависимых калиевых каналов, открывающихся в зависимости от разности потенциалов на мембране клетки (Miller С., 1992; Larsson Н.Р. et al., 1996). Каждая а-субъединица содержит шесть трансмембранных доменов S1-S6, Р-сегмент между S5 и S6, который участвует в формировании поры для прохождения ионов калия, и глобулярный домен, расположенный в аминоконцевой области белка, который необходим для инактивации открытого канала (Miller С., 1992; Larsson Н.Р. et al., 1996). Домен Т1 расположен между глобулярным ,

доменом непосредственно перед первым трансмембранным доменом. Однако KCNRG не содержит трансмембранных доменов и является растворимым. KCNRG не содержит также и глобулярного домена. Эти данные позволяют нам выдвинуть гипотезу, что белковый продукт гена KCNRG регулирует активность потенциал-зависимых калиевых каналов через процесс их сборки.

Для того чтобы проверить эту гипотезу, нами была создана конструкция pGKCNRG на базе вектора pEGFP-Nl. На клеточной линии LNCaP (рак простаты) сотрудниками лаборатории нейрофизиологии (University of Bordeaux II, France) было показано, что экспрессия KCNRG приводит к снижению тока калия (личное сообщение). Этот результат свидетельствует о возможном участии KCNRG в регуляции калиевых каналов, по крайней мере, в клеточной линии LNCaP.

Эти данные, а также результаты, полученные при анализе аминокислотной последовательности белка, позволяют выдвинуть гипотезу, что KCNRG препятствует сборке каналов, выполняя регуляторную функцию. Конкретизировать калиевые каналы, с которыми ,

взаимодействует белок KCNRG, подавляя их активность, не представляется возможным: библиотека для дрожжевой двугибридной системы, использованная в этом исследовании, не подходит для этой задачи. »

4.3. Возможная функция белкового продукта гена KCNRG.

В последнее время появились работы, в которых показано, что активность калиевых каналов является одним из ключевых факторов определяющих переход клеток из фазы Gl клеточного цикла к митозу (Abdul М. and Hoosein N., 2002). Например, Скрима с соавторами (Skryma R.N. et al., 1997) показали, что клеточная линия LNCaP рака простаты активно пролиферирует при активации потенциал-зависимых калиевых каналов. Когда калиевые каналы блокированы, митогенная активное«

клеток оказывается подавленной. Активность потенциал-зависимых калиевых каналов также важна при пролиферации лимфоцитов (Chung I. et al., 1997). Таким образом, ген KCNRG, расположенный в области делетируемой при многих онкологических заболеваниях, в частности, при раке простаты и В-ХЛЛ, белок которого возможно подавляет активность калиевых каналов, становится первостепенным кандидатом на роль супрессора опухолевого роста при этих заболеваниях.

5. Экзон-интронная структура и возможная функция гена C130RF1.

5.1. Реконструкция изоформ мРНК гена C130RF1.

Ген C130RF1 был обнаружен Тяжеловой Т.В. в виде совокупности экспрессирующихся последовательностей EST, а также нуклеотидных последовательностей клонов IMAGE ID: 24667, IMAGE ID:24774, IMAGE ID:4792366. В качестве базовой нами была выбрана последовательность клона IMAGE ID: 24667. Нуклеотидная последовательность этого клона содержит ОРС, которой соответствует предсказываемая последовательность в 196 аминокислот.

Нозерн-гибридизация продукта ОТ-ПЦР, содержащего ОРС позволила выявить три изоформы мРНК гена C130RF1 длиной 1.1 т.п.н., 1.5 т.п.н. и 3 т.п.н. Среди нуклеотидных последовательностей в геномной базе данных GenBank, две последовательности IMAGE ID: 24667 и IMAGE ID:24774, длиной 1499 н., совпадают между собой, совокупностью EST приписанных C130RF1 и возможно, соответствуют полосе на нозерн-блоте длиной 1.5 т.н. Последовательность кДНК клона IMAGE Ш:4792366 содержат в своем составе 1104 нуклеотида и совпадает с 5'-областью последовательностей IMAGE ID: 24667 и IMAGE ГО:24774. Возможно, эта последовательность соответствует нозерн-сигналу в 1.1 т.н. Изоформа, соответствующая полосе 3 т.н. на нозерн-блоте, была восстановлена путем построения контига из EST. Участок, который не удалось перекрыть EST, был восстановлен путем секвенирования продуктов ОТ-ПЦР на РНК клеточных линий. В результате выравнивания этих последовательностей мы получили общую последовательность длиной 3053 нуклеотидных пар, по-видимому, соответствующую норзерн-сигналу размером 3 т.п.н. Изоформы мРНК длиной 1.1 т.н. и 1.5 т.н. полностью совпадают с 5'-областью изоформы мРНК длиной 3 т.н.

5.2. Экзон-интронная структура гена C130RF1.

Анализ базы данных GenBank позволил выявить нуклеотидную последовательность AL136123, соответствующую нуклеотидным последовательностям изоформ мРНК гена C130RF1. Изоформы мРНК различаются длиной последнего, пятого экзона. Следует отметить, что в 3'-области восстановленных изоформ мРНК присутствуют длинные поли-А тракты. При этом в геноме для каждого транскрипта отсутствует поли-А

(

последовательность или последовательность подобная ей. Рядом с поли-А фактом этих изоформ расположены сигналы полиаденелирования "ААТААА" (для изоформы мРНК длиной 1.5 т.н.) и "АТТААА" (для изоформ мРНК длиной 1.1 т.н. и 3 т.н.). Этот результат позволяет нам сделать вывод о том, что нуклеотидная последовательность 3'-области изоформ мРНК гена С130№1 восстановлена полностью. Ген С130№1 состоит из пяти экзонов. Структура изоформ мРНК приведена на рисунке 4.

центромера

STSD13S1168

теломера

6J т.п. к. Ыт.ан. Зт-и-н. 5Т.П.И.

101 и. п.

167 н.п. 116 Н.П.

/НЬ—

Эю5

W--

^ Эю4 ЭкзЗ Экй

•S^Imm KvvnJI-^V—

343 в.п. Изоформы мРНКгена Эю1 C130BF1 длиной

1-Я 1.1 т.н.

_2ULbj

----EWvCb^^jJ

w

I.ST.B.

Зт.н.

Рис. 4. Экзон-интронная структура гена C130RF1. Цветом [] выделена область занимаемая OFC.

Анализ нуклеотидной последовательности промоторной области и первого экзона не выявил образование вторичных структур. Таким образом, результат, который мы можем получить при постановке эксперимента по достройке праймера (primer extension experiment) с целью выявить точку инициации транскрипции, позволит сделать однозначный вывод. Удалось показать, что для C130RF1 существует, как минимум пять точек инициации транскрипции, причем их можно разбить на два кластера: расстояние между точками внутри кластера составляет менее 10 нуклеотидов, между кластерами - более 200 нуклеотидов. Нуклеотидные последовательности 5'-областей транскриптов вероятно отличаются из-за присутствия в промоторной области различных участков для посадки белкового комплекса ДНК-зависимой РНК-полимеразы.

5.3. Анализ профиля экспрессии гена C130RF1 в нормальных тканях и опухолевых клеточных линнях человека.

Нами показано, что ген человека C130RF1 экспрессируется во многих представленных на нозерн-блотах тканях человека в виде хотя бы одного транскрипта. В каждой из изученных тканей наиболее хорошо выражена экспрессия изоформы мРНК длиной 3 т.н. Единственная ткань, в

которой уровень экспрессии изоформ мРНК 1.1 т.н. и 1.5 т.н. превосходит уровень экспрессии изоформы мРНК 3 т.н. - это семенники.

Проведенные нами независимые эксперименты по ОТ-ПЦР на матрице мРНК из клеточных линий Lim 1215, 041-11175 (фибробласты человека), T47D, SKOV-3, А431, SAOS-2, Dul45, К562 с праймеров на ОРС показали присутствие транскриптов C130RF1 во всех приведенных клеточных линиях.

5.4. Анализ аминокислотной последовательности, кодируемой геном

C130RF1.

Три основные изоформы мРНК гена C130RF1 содержат одну ОРС с инициирующим кодоном AUG в благоприятном контексте для инициации трансляции, которой соответствует предсказанная последовательность, состоящая из 196 аминокислот. Ко дон, кодирующий первую аминокислоту расположен в первом экзоне, а стоп-кодон в последнем экзоне.

C130RF1 эволюционно-консервативен. Нами обнаружены ортологичные белки у нематоды C.elegance (E.value Ю"40), у рыбы Danio rerio (Е.value 10"95), у мухи D.melanogaster (E.value Ю~20).

Предсказанная аминокислотная последовательность гена C130RF1 содержит единственный домен SPRY, занимающий положение с аминокислотной позиции 84 по позицию 196. Функция этого домена не установлена. Многие гены, белковые продукты которых содержат SPRY-домен, являются мембранными рецепторами. Самый известный из них и наиболее изученный - это рецептор рианодина RYR1 (Phillips M.S. et. aL, 1996), который высвобождает ионы кальция из саркоплазматического ретикулума клеток скелетных мышц. Однако белок C130RF1 не содержит трансмембранных доменов и является растворимым. Эти данные, позволяют нам выдвинуть гипотезу, что белковый продукт гена C130RF1 локализуется на цитоплазматической мембране и регулирует активность мембранных каналов и рецепторов.

Для того чтобы проверить эту гипотезу, нами была создана конструкция pGC130RFl на базе вектора pEGFP-Nl. Эта конструкция была передана нашим коллегам из лаборатории нейрофизиологии (University of Bordeaux II, France), которые показали, что C130RF1 локализуется на наружной мембране клетки (личное сообщение). Также эта конструкция была использована, для того чтобы проверить возможное участие C130RF1 в регуляции тока кальция в клетке. На клеточной линии LNCaP сотрудниками той же лаборатории было показано, что C130RF1 не участвует в регуляции тока кальция (личное сообщение). Этот результат позволяет высказать гипотезу о неучастии C130RF1 в регуляции кальциевых каналов, по крайней мере, в клеточной линии LNCaP.

5.5. Поиск партнеров белка C130RF1 методом дрожжевой двугнбридной системы.

Для того чтобы обнаружить партнеров по взаимодействию белка C130RF1 была использована дрожжевая двугибридная система MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 (Clontech, USA). Созданная нами конструкция pGBT+C130RFl на основе шаттл-вектора pGBT9 была использована для скрининга экспрессионной кДНК клонотеки. В результате проведенного скрининга были протестированы более двух миллионов независимых клонов, из них 9 оказались положительными. По результатам тестов, позволяющим установить ложноположительные клоны, для дальнейшей работы были отобраны 2. Один из них соответствовал гипотетическому гену HRIHFB2206. Этот ген состоит из 1 экзона и локализуется на 16 хромосоме в области q22.1. Этот ген кодирует белок длиной 313 аминокислот, содержащий с N-конца цинк-связывающий домен DM3. Белок является растворимым. Функция этого белка не известна. Второй клон кодирует пептид

FHTLQCLQFQQLSKKTFPYLCYL.

5.6. Возможная функция гена C130RF1.

Возможная локализация белка C130RF1 на цитоплазматической мембране, а также компьютерный анализ его аминокислотной последовательности свидетельствуют о его, вероятно, регуляторной активности в отношении белков цитоплазматической мембраны. Однако, белковый продукт гена C130RF1, как указывалось выше, скорее всего не причастен к регуляции тока кальция через мембраны клетки. Результаты поиска возможных белков партнеров белка C130RF1 методом дрожжевой двугибридной системы, не позволили конкретизировать возможное участие C130RF1 в регуляции активности белков мембран.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результатом данной работы стало построение уточненного космидного контига района хромосомы 13 человека, часто утрачиваемого при многих онкологических заболеваниях и расположенного между вТ8 маркерами 01381168 и 0138272, удовлетворяющего требованию идентификации структуры исследуемых генов КРР2, ШГР20$, С130ЯП и КСИЯС расположенных в этом районе, а также был проведен анализ тонкой структуры и начальные этапы функциональной характеристики этих генов.

Полученные космидные клоны геномной ДНК при построении контига могут быть использованы для идентификации нормальных и аномальных хромосом человека на ДНК пациентов больных

I i f

онкологическими заболеваниями, ассоциированными с исследуемой областью. ДНК этих клонов также может быть использованы для поиска областей, содержащих регуляторные элементы генов RFP2, RFP20S, C130RF1 и KCNRG.

Ген RFP2 локализуется на космидах клонотеки LANL 67В4 и 116С1. Гену соответствуют по крайней мере четыре изоформы мРНК длиной 1.4 т.н, 1.5 т.н, 2.4 т.н. и 7.5 т.н., которые представлены практически во всех исследованных нормальных тканях и некоторых опухолевых клеточных линиях человека. Количественное соотношение этих изоформ заметно варьирует в зависимости от типа нормальной ткани. Показано, что сигналу

* на нозерн-блоте в 1.4 т.н. соответствуют две изоформы мРНК, поданные нами в базу данных GenBank под номерами AF241850 и AY191002. Эти изоформы состоят из трех экзонов. Второй и третий экзоны этих изоформ

* совпадают. Изоформа AY191002 длиннее изоформы AF241850 на 85 нуклеотидов за счет области интрона на 3'-конце первого экзона. Ген транскрибируется в направлении от центромеры к теломере. Изоформы, содержат одну и ту же эволюционно-консервативную ОРС, которой соответствует предсказанная последовательность, состоящая из 407 аминокислот. Этот белок содержит цинк-связывающие домены RING и В-ВОХ, а также так называемый «спирально скрученный» домен. Такое сочетание доменов называется Rfp-подобным трехчастным доменом, по названию белка Rip (Ret finger protein). Следует отметить, что многие белки, содержащие цинк-связывающий домен RING типа, являются Е2-зависимыми ЕЗ убиквитин-лигазами. Белковый продукт гена RFP2 является либо цитоплазматическим белком, либо трансмембранным белком эндоплазматического ретикулума. Проведенный поиск партнеров белка RFP2 с использованием дрожжевой двугибридной системы позволил выявить 10 потенциальных белков партнеров по взаимодействию. Анализ аминокислотной последовательности, данные по локализации белка внутри клетки, а также проведенная структурная и функциональная

г характеристика потенциальных партнеров позволяют высказать гипотезу о

возможной вовлеченности белкового продукта гена RFP2 в процессы регуляции клеточного цикла, процессы, связанные с клеточной дифференцировкой, перестройкой цитоскелета, регуляцию раннего развития эмбриона, в неопластическую трансформацию клеток, либо в регуляцию иммунного ответа. Возможно, белок RFP2 участвует в работе системы деградации неправильно свернувшихся белков, ассоциированной с эндоплазматическим ретикулумом. Активность любой системы контроля существенна для нормального функционирования клетки. Возможное участие RFP2 в одной из таких систем с учетом его локализации в области генома, ассоциированной со многими онкологическими заболеваниями выделяет его среди других генов как возможного супрессора опухолевого

? t

роста, что указывает на необходимость его дальнейшего детального исследования.

Ген ЯРР208 локализуется на космидах клонотеки ЬАИЬ 156Н12 и 116С1. Изоформа РНК гена включает в себя 1768 нуклеотидов и не содержит протяженной ОРС. Нуклеотидная последовательность изоформы РНК гена подана в базу данных СепВапк под номером АР529010. Ген состоит, по крайней мере, из пяти экзонов и транскрибируется в направлении от теломеры к центромере. Изоформа РНК гена ЯТР20Б, частично перекрывается с первым экзоном гена №Р2 (на 57 нуклеотидов с изоформой АР241850 и на 146 нуклеотидов с изоформой АУ191002), являясь, таким образом, антисмысловым транскриптом для этого гена. Выдвинута гипотеза о возможном участии Ш7Р208 в регуляции экспрессии и трансляции гена ЯРР2.

Ген КСЫ1Ю локализован на космиде 67В4. Ген, вероятно, состоит из трех экзонов и транскрибируется от центромеры к теломере. Гену соответствуют, по крайней мере, две изоформы мРНК (зарегистрированы в базе данных СепВапк под номерами АУ129653 и АУ129654), которые представлены практически во всех исследованных нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека. Изоформы мРНК отличаются внутренней нуклеотидной последовательностью в 95 нуклеотидов. Разница в длине изоформ мРНК появляется в результате использования альтернативных сигналов сплайсинга.

Две изоформы мРНК гена АХГЛЖт содержат эволюционно-консервативные ОРС, которым соответствует предсказанные последовательности, состоящие из 229 и 272 аминокислотных остатков. Сплайсформы кодируют возможные белковые продукты массой около 20кДа, отличающиеся по С-концу. При этом отличия не затрагивают область домена тетрамеризации потенциал-зависимых калиевых каналов Т1. Белковый продукт гена КСЫ1№ возможно подавляет активность калиевых каналов. КСЫ1Ш, вероятно, препятствует сборке каналов, выполняя, таким образом, регуляторную функцию. Во многих работах продемонстрирована способность ослаблять митотическую активность некоторых типов клеток любым фактором подавляющим активность калиевых каналов. Таким образом, ген КСЫ1№, расположенный в области утрачиваемой при многих онкологических заболеваниях, в частности, в образцах карциномы простаты и В-ХЛЛ, является первостепенным кандидатом на роль супрессора опухолевого роста при этих заболеваниях.

Ген человека С130ЕР1 локализован на космидах 122Б4 и 105П0. Ген экспрессируется в виде трех основных изоформ мРНК, размер которых составляет 1.1 т.н., 1.5 т.н. и 3 т.н., которые представлены во многих исследованных нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека. Ген С130Ш*У состоит из пяти экзонов и транскрибируется от

теломеры к центромере. При этом разнообразие изоформ мРНК ' определяется альтернативными сигналами полиаденелирования. 1 Все изоформы мРНК содержат одинаковую эволюционно-

консервативную ОРС, которой соответствует предсказанная аминокислотная последовательность, состоящая из 196 аминокислот. Белковый продукт гена содержит единственный домен SPRY и, возможно, локализуется на цитоплазматической мембране. Данные по локализации белка, а также компьютерный анализ его аминокислотной последовательности свидетельствуют о его возможной регуляторной активности в отношении белков цитоплазматической мембраны. Однако, * белковый продукт гена C130RF1 не причастен к регуляции тока кальция через мембраны клетки. Результаты поиска возможных белков-партнеров белка C130RF1 методом дрожжевой двугибридной системы, не позволили конкретизировать возможное участие продукта гена C130RF1 в регуляции активности белков мембран.

Итак, в ходе данной работы впервые была получена структурная и функциональная характеристика четырех генов человека, расположенных в области ql4.3 хромосомы 13, часто утрачиваемой в образцах различных опухолей человека. В результате проведенного структурного и функционального анализа генов человека RFP2, RFP20S, KCNRG и C130RF1, наиболее перспективными кандидатами на роль гена-супрессора опухолевого роста следует признать гены RFP2 и KCNRG.

г*

v

выводы

1. Впервые проведена структурная и функциональная характеристика четырех генов человека №Р2, ЯРРЮБ, КСЖО и С!ЗОШ. Все определенные нами нуклеотидные последовательности геномной ДНК и к ДНК зарегистрированы в ОепВапк.

2. Впервые выявлены изформы РНК: четыре для гена ИГР2; одна для ЯРР205; две для КСШв; три для С13СЖР1. Две изоформы мРНК ЛРР2 (АР241850 и АУ191002) состоят из трех экзонов, транскрибируются в направлении от центромеры к теломере и отличаются длиной 3'-конца первого экзона. Изоформа РНК (АР529010) гена ЯРР208 состоит, по крайней мере, из пяти экзонов, транскрибируется в направлении от теломеры к центромере. Две изоформы мРНК КСШЮ состоят из двух (АУ129654) и трех (АУ129653) экзонов, транскрибируются в направлении от центромеры к теломере и отличаются длиной второго сплайсируемого экзона. Три изоформы мРНК гена С130Ш?1 состоят из пяти экзонов, транскрибируются в направлении от теломеры к центромере и отличаются длиной 3'-конца пятого экзона.

3. Показано, что гены КРР2, КСЫЯС и С130КР1 экспрессируются во многих исследованных неопухолевых тканях и опухолевых клеточных линиях.

4. Изоформы мРНК содержат эволюционно-консервативные ОРС длиной: 407ак. для ЯРР2; 229ак. и 272ак. для ЛШК<7; 196 ак. для С130Ш. Предсказанные аминокислотные последовательности содержат: Щр-подобный трехчастный домен (КБР2); домен тетромеризации потенциал-зависимых калиевых каналов Т1 (КСШв); БРЯУ-домен (С130ЯР1). Изоформа РНК размером не менее 1768 н. ЯРР20Б не содержит протяженных ОРС. Показано, что первый экзон ЯРР208 перекрывается с первым экзоном гена ЛРР2, а транскрипция этих генов осуществляется с противоположных цепей ДНК. Выдвинута гипотеза о возможном участии гена ЯРР208 в регуляции экспрессии гена ЕРР2.

5. Выявлены десять белков потенциальных партнеров по взаимодействию с белком ЯРР2, кодируемых генами ЬКРАР1, РЛКСЗН, РМП, МСР2Ь, УР818, САРЖ1, ЛРЬР!, ССТ5, РЫ10719, МСС5309 и два потенциальных партнера по взаимодействию с белком С130КР1 (пептид длиной 23 аминокислоты и продукт гипотетического тешНЯ1ШВ2206).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи:

1. Баранова А.В., Иванов Д.В., Макеева Н.В., Никитин Е.А., Сангфельдт О., Бородина Т.А., Капанадзе Б.И., Тяжелова Т.В., Коркоран М., Федорова Л.И., Шагин Д.В., Немцова М.В., Полтараус А.Б., Зеленин А.В., Залетаев Д.В., Лукьянов С.А., Грандер Д., Эйнхорн С., Янковский Н.К. Клонирование кандидатного гена Leu5, утрачиваемого у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом, как иллюстрация современной стратегии поиска генов-супрессоров опухолевого роста.// "Гематология и трансфузиология", 2000, т.45, №3, с.15-19

2. Тяжелова Т.В., Баранова А.В., Иванов Д.В., Макеева Н.В., Капанадзе Б.И., Никитин Е.А., Сангфельдт У., Грандер Д., Воробьев А.И., Эйнхорн С., Янковский Н.К. Транскрипционная карта района 13ql4, часто утрачиваемого у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом. // Генетика, 2001, т.37, №11, с. 1530-7.

3. Ivanov D.V., Tyazhelova T.V., Lemonnier L., Kononenko N., Pestova A.A., Nikitin E.A., Prevarskaya N., Skryma R., Panchin Y.V., Yankovsky N.K., Baranova A.V. A new human gene KCNRG encoding potassium channel regulating protein is a cancer suppressor gene candidate located in 13ql4.3. // FEBS Lett., 2003, v. 539, № 1-3, p. 156-60.

4. W.J. van Everdink, A. Baranova, C. Lummen, T. Tyazhelova, M.W.G. Looman, D. Ivanov, E. Verlind, A. Pestova, H. Faber, A.Y. van der Veen, N. Yankovsky, E. Vellenga, C.H.C.M. Buys. RFP2, C130RF1, and FAM10A4 are the most likely tumor suppressor gene candidates for B-cell chronic lymphocytic leukemia. // Cancer Genetics and Cytogenetics, 2003, v. 145, p. 1-10.

Тезисы и сообщения:

1. Баранова А.В., Капанадзе Б.И., Семов А.Б., Казаков А.Е., Аванесова М.Г., Гопко А., Иванов Д.В., Кашуба В., Бауш Ч., Забаровский Е.Р., Эйнхорн С., Янковский Н.К. "Локализация и характеристика нового клона кДНК, являющегося кандидатом на роль гена-супрессора, часто утрачиваемого при В-клеточной хронической лимфолейкемии". Постерное сообщение на 8-й конф. "Геном Человека", г.Черноголовка, 12-15 января 1998 г., с. 14-15.

2. N.K.Yankovsky, B.I.Kapanadze, A.V.Semov, A.V.Baranova, A.E.Kazakov,

D.VJvanov, N.V.Makeeva., I.V.Krivenkova, A.V.Poltaraus, H.Lehrach.,

E.R.Zabarovsky, Ch.Bays, R.Chapman, S.Einhorn. Screening for human B-cell chronic lymphocytic leukaemia suppressor gene: mapping and sequencing of cDNA clones from minimal deleted region. Abstr. of Human Genome Meeting'1998. Turin, Italy, March 26-31, p. 72.

3. Баранова А.В., Иванов Д.В., Макеева Н.В., Капанадзе Б.И., Казаков А.Е., Аванесова М.Г., Шагин Д.В., Немцова М.В., Никитин Е.А., Залетаев Д.В., Лукьянов С.А., Воробьев А.И., Забаровский Е.Р., Эйнсхорн С., Янковский Н.К. Экзон-интронная структура нового гена человека Leu5, кодирующего белок, принадлежащий к семейству Rfp, и являющегося кандидатом на роль супрессора опухолевого роста, повреждаемого при В-клеточном хроническом лимфолейкозе. Постерное сообщение на 9-й итоговой конф. "Геном Человека-99", г.Черноголовка, 2-5 февраля 1999 г., с. 5-6.

4. A. Baranova, D. Ivanov, N. Makeeva, Е. Nikitin, A. Poltoraus, О. Sangfeldt Exon-intron structure of a LEU5 gene belonging to Rfp family and located in the 13ql4.3 region often deleted in В cell chronic lymphocytic leukaemia. International Workshop in Chronic Lymphocytic Leukaemia, October 27-30, 1999, Paris, France, p. 30

5. NK Yankovsky, AV Baranova, DV Ivanov, ТА Borodina, NV Makeeva, EA Nikitin, O. Sangfeldt, D. Shagin, AI Vorobiev, SA. Lukianov, ER Zabarovsky, D. Grander, S. Einhorn. RFP2 (Leu5) is a strong candidate for a tumour suppressor gene within the D13S1168-D13S319 interval frequently lost in human В cell chronic lymphocytic leukaemia. Human Genome Meeting 2000, March 7-13. Abstract N294, p 80.

6. Иванов Д.В., Бородина T.A., Скоблов М.Ю., Пестова А.А., Капанадзе Б.И., Сангфельдт У., Эйнхорн С., Баранова А.В., Янковский Н.К. Структурное и функциональное исследование нового гена человека RFP2. Постерное сообщение на 10-й итоговой конф. "Геном Человека-2000", г.Черноголовка, 18-22 декабря 2000 г., с. 52.

7. A.V. Baranova, T.V. Tyazelova, D.V. Ivanov, M.Yu. Skoblov, T.A. Borodina, A.A. Pestova, B.I. Kapanadze, O. Sangfelt, D. Grander, S. Einhorn, N.K. Yankovsky Human chromosome 13 region ql4.3 often deleted in human malignancies: unusual distribution of the repeats and new candidate genes. Human Genome Meeting, 2001,19-23 April, Edinbourgh, UK, p. 88.

8. D.V. Ivanov, M.Yu. Skoblov, T.A.Borodina, A.A. Pestova, K.S.Shachbasov, O.Sangfeldt, S.Einhorn, A.V.Baranova, N.K.Yankovsky Structural and functional characterization of a novel human RFP2 gene Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology International symposium, 2001, November 18-24, Moscow-Minsk, p. 50-51.

9. N.K. Yankovsky, D. Ivanov, T. Tyazhelova, A. Pestova, M. Skoblov, A. Baranova. Human genes RFP2, RFP20S, KCNRG and C130RF1 as a new candidates for TSG deleted in 13ql4 area. HGM2003, Сапсйп, Mexico, April 27-30 2003, Poster 293.

01 648 *

2ос>? -А

I *

I

I

I

I

Издательство ООО "МАКС Пресс".

Лицензия ИД №00510 от 01.12.99 г. |

Подписано к печати 31.07.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 90 экз. Заказ 385.

Тел. 939-3890,928-2227,928-1042. Факс 939-3891. )

119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванов, Дмитрий Валерьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Генные сети.

1.2. Структурная геномика.

1.2.1. Методы реконструкции изоформ мРНК любого гена человека.

1.2.2. Методы, позволяющие установить геномную структуру любой изоформы мРНК гена (прошлое и настоящее).

1.2.3. Стратегии построения полной транскрипционной карты генома человека.

1.3. Функциональная геномика.

1.3.1. Как реконструировать генетическую сеть?.

1.3.2. Методы исследования регуляции экспрессии различных изоформ мРНК одного гена.

1.3.3. Способы изучения белок - белковых взаимодействий.

1.3.4. Исследования экспрессии совокупности генов на уровнях транскрипции и трансляции.

1.4. Современное состояние исследований генов района Я 14.3 хромосомы 13 человека, утрачиваемого при многих онкологических заболеваниях.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Оборудование.

2.1.2. Реактивы и расходные материалы.

2.1.3. Фотоматериалы.

2.1.4. Ферментные препараты.

2.1.5. Штаммы клеток, использованные в работе.

2.1.6. Библиотека рекомбинантных космидных клонов 1СЯР С108.

2.1.7. Библиотека рекомбинантных космидных клонов ЬАЫЬ 13КС01.

2.1.8. Экспрессионная кДНК библиотека для дрожжевой двугибридной системы.

2.2. Методы.

2.2.1. Среды, условия хранения и культивирования бактерий.

2.2.2. Выделение плазмидной и космидной ДНК из клеток Е. соП.

2.2.3. Выделение дрожжевой ДНК.

2.2.4. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле.

2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.

2.2.6. Клонирование фрагментов ДНК.

2.2.7. Трансформация в штаммы клеток.

2.2.8. Выделение тотальной РНК из культуры клеток.

2.2.9. Приготовление радиоактивно меченых ДНК-зондов.

2.2.10. Рестрикционный анализ ДНК и Саузерн-блоттинг.

2.2.11. Гибридизация Саузерн- и нозерн-блотов. Гибридизация на колониях.

2.2.12. Процедуры полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.2.13. ОТ-ПЦР.

2.2.14. Эксперимент по достройке праймера.

2.2.15. Определение нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера.

2.2.16. Проверка взаимодействия двух белков в дву гибридной системе.

2.2.17. Тест на присутствие в дрожжах белка, кодируемого репортерным геном 1ас2.

2.2.18. Метод "потери плазмид".

2.3. Программное обеспечение, использованное в работе.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Космидный контиг области, содержащей гены ЯГР2, ЕР7Р2 ОБ, СВОЯПпКСМЯО.

3.2. Экзон-интронная структура и возможная функция гена КРР2.

3.2.1. Картирование гена КРР2.

3.2.2. Изоформы мРНК гена №Р2.

3.2.3. Экзон-интронная структура гена ЯГР2.

3.2.4. Анализ профиля экспрессии гена ЯГР2 в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека.

3.2.5. Анализ нуклеотидных последовательностей изоформ мРНК гена ЯРР2.

3.2.6. Ортологи гена№Р2.

3.2.7. Анализ аминокислотной последовательности, кодируемой геном ЯГР2.

3.2.8. Поиск партнеров белка ИРР2 методом дрожжевой двугибридной системы.

3.2.9. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК клонов, выявленных методом дрожжевой двугибридной системы.

3.2.10. Возможная функция гена. ЯРР2.

3.3. Экзон-интронная структура и возможная функция гена ЯГР208.

3.3.1. Картирование гена ЯРР203.

3.3.2. Структура изоформы РНК гена ЯРР203.

3.3.3. Возможная функция гена ЯРР203.

3.4. Экзон-интронная структура и возможная функция гена КСМ1Ю.

3.4.1. Картирование гена КСЫ1Ю.

3.4.2. Экзон-интронная структура генаКСМ1Ю.

3.4.3. Анализ профиля экспрессии гена КСЫ1Ю в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека.

3.4.4. Анализ нуклеотидных последовательностей изоформ мРНК гена KCNRG.

3.4.5. У гена KCNRG, вероятно, присутствует собственная промотерная область.

3.4.6. Ортологи гена KCNRG.

3.4.7. Анализ аминокислотных последовательностей, кодируемых геном KCNRG.

3.4.8. Возможная функция белкового продукта гена KCNRG. .134 3.5. Экзон-интронная структура и возможная функция гена C130RF1.

3.5.1. Картирование гена C130RF1.

3.5.2. Реконструкция изоформ мРНК гена C130RF1.

3.5.3. Экзон-интронная структура гена C130RF1.

3.5.4. Анализ профиля экспрессии гена C130RF1 в нормальных тканях и опухолевых клеточных лигиях человека.

3.5.5. Анализ нуклеотидных последовательностей изоформ мРНК гена C130RF1.

3.5.6. Ортологи гена C130RF1.

3.5.7. Анализ аминокислотной последовательности, кодируемой геном C130RF1.

3.5.8. Поиск партнеров белка C130RF1 методом дрожжевой двугибридной системы.

3.5.9. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК клонов, выявленных методом дрожжевой двугибридной системы.

3.5.10. Возможная функция гена C130RF1.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурная и функциональная характеристика генов человека RFP2, RFP2OS, KCNRG и C13ORF1"

Актуальность темы. Опухолевые заболевания занимают второе место в мире как причина смертности после заболеваний сердечно-сосудистой системы. Для многих типов опухолей пока не выявлены гены, повреждения которых служат "спусковым крючком" активного канцерогенеза. Выявление генов связанных с развитием опухолей создает основу для понимания молекулярных механизмов возникновения и развития онкозаболеваний, а также приводит к появлению новых методов их диагностики и лечения. Поэтому исследования, направленные на поиск и изучение генов, вовлеченных в процесс образования опухолей, остаются высоко актуальными.

Причиной возникновения и прогрессии опухолей являются изменения генома соматических клеток. Этот факт заметно облегчает переход от стадии описания фенотипических проявлений заболевания, в том числе хромосомных перестроек, часто сопровождающих процесс возникновения опухолей, к стадии выяснения молекулярных механизмов его развития. Показано, что перестройки участков генома человека могут приводить к утрате или дефектам генов (так называемых супрессоров опухолевого роста), в норме подавляющих клеточное деление и развитие опухолей. Одним из таких участков генома явлется 13ql4.3, повреждаемый при некоторых онкологических заболеваниях, таких как В-клеточный хронический лимфолейкоз, рак простаты и других. В большинстве работ минимальный утрачиваемый район был ограничен 8Т8- маркерами 0138273 и Э13825. Благодаря результатам, полученным в ходе международного проекта "Геном человека", в настоящий момент у исследователя имеются практически все необходимые данные для выявления точной структуры генов, находящихся в этой области. Нуклеотидная последовательность этого района, размером приблизительно 800 т.п.н., содержит семь генов, лишь три из которых были ранее охарактеризованы.

Данная работа посвящена характеристике структуры и функции четырех генов человека КРР2, КРР208, КСШС и С130ЯР1, один из которых может являться искомым геном-супрессором опухолевого роста, повреждаемым при перестройках области 13ql4.3.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является структурная и функциональная характеристика генов человека КРР2, ЯГР203, KCNRG и С130ЯП, являющихся возможными кандидатами на роль супрессора опухолевого роста.

Для реализации поставленной цели при исследовании этих генов решались следующие задачи:

1. Выявить соответствующие генам изоформы мРНК и установить их экзон-интронную структуру;

2. Провести анализ тканеспецифичности экспрессии исследуемых генов;

3. Провести т бШсо функциональную характеристику предсказанных аминокислотных последовательностей кодируемых исследуемыми генами;

4. Методом дрожжевой двугибридной системы выявить гены, продукты которых являются потенциальными партнерами по взаимодействию белков, кодируемых исследуемыми генами.

Научная новизна. Впервые выявлено наличие нескольких изоформ мРНК генов человека ЯРР2, ЯГР208, КСИЯСУ С13(ЖГ1 и экспериментально подтверждено существование этих изоформ методами ОТ-ПЦР и нозерн-гибридизации. Установлен профиль тканеспецифичности экспрессии этих генов. Методом анализа т бШсо выявлены вероятные функциональные домены в аминокислотных последовательностях генов ЯРР2, КСИ1Ю и С/ЗОЛР/. С помощью дрожжевой двугибридной системы для белка КРР2 выявлены десять, а для белка С13СЖР1 - два потенциальных партнера по взаимодействию.

Научно-практическая значимость работы. В области 13ц 14.3 уточнена локализация рекомбинантных космид, которые могут быть использованы в клинической цитогенетике на ДНК пациентов, больных онкологическими заболеваниями, для идентификации хромосомных перестроек. ДНК этих клонов также может быть использована для поиска областей, регулирующих транскрипционную активность генов данной области.

Полученные данные о структуре генов ЯГР2, ЯГР205, КСЫ1Ю и СНОМ?! позволяют приступить к их детальному мутационному анализу на ДНК пациентов больных онкологическими заболеваниями, ассоциированными с исследуемой областью. Подробный структурный анализ этих генов создает базу для последующих функциональных исследований.

Функциональная характеристика исследуемых генов впервые позволила высказать предположения о возможной роли каждого из них в развитии онкологических заболеваний, ассоциированных с исследуемой областью. Полученные результаты по выявлению генов, белковые продукты которых являются потенциальными партнерами ЯРР2 и С13СЖР1, могут быть использованы при построении генных сетей, элементами которых являются исследованные гены.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Иванов, Дмитрий Валерьевич

5. ВЫВОДЫ.

1. Впервые проведена структурная и функциональная характеристика четырех генов человека ЯРР2, ЯГР208, КСЫЯС и С130ЯР1. Все определенные нами нуклеотидные последовательности геномной ДНК и кДНК зарегистрированы в вепВапк.

2. Впервые выявлены изформы РНК: четыре для гена ЛРР2; одна для Я/Т^ОЯ; две для КСШв; три для С130ЯР1. Две изоформы мРНК КРР2 (АР241850 и АУ191002) состоят из трех экзонов, транскрибируются в направлении от центромеры к теломере и отличаются длиной 3'-конца первого экзона. Изоформа РНК (АР529010) гена RFP20S состоит, по крайней мере, из пяти экзонов, транскрибируется в направлении от теломеры к центромере. Две изоформы мРНК КСИЯС состоят из двух (АУ129654) и трех (АУ129653) экзонов, транскрибируются в направлении от центромеры к теломере и отличаются длиной второго сплайсируемого экзона. Три изоформы мРНК гена С13СЖП состоят из пяти экзонов, транскрибируются в направлении от теломеры к центромере и отличаются длиной 3'-конца пятого экзона.

3. Показано, что гены ЯГР2, КСЫ1Ю и С130ЯГ1 экспрессируются практически во всех исследованных неопухолевых тканях.

4. Изоформы мРНК содержат эволюционно-консервативные ОРС длиной: 407ак. для КРР2\ 229ак. и 272ак. для КСИЯС-, 196 ак. для аЗОЯП. Предсказанные аминокислотные последовательности содержат: ИГр-подобный трехчастный домен (ЯГР2); домен тетромеризации потенциал-зависимых калиевых каналов Т1 (KCNRG); 8РЯУ-домен (С/ЗО/^/). Изоформа РНК размером не менее 1768 н. не содержит протяженных ОРС. Показано, что первый экзон ЛFP20»S, перекрывается с первым экзоном гена а транскрипция этих генов осуществляется с противоположных цепей ДНК. Выдвинута гипотеза о возможном участии гена РРР20Б в регуляции экспрессии гена РРР2.

5. Выявлены десять белков потенциальных партнеров по взаимодействию с белком ЮТ2, кодируемых генами Ы1РАР1, РЯКСЗН, РМП, МСИИ, УРБ18, САР№1, ЯРЬР1, ССТ5, Ей 10719, МСС5309 и два потенциальных партнера по взаимодействию белка С130ЯР1 (пептид длиной 23 аминокислоты и продукт гипотетического гена НШНРВ2206).

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Результатом данной работы стало построение уточненного космидного контига района хромосомы 13 человека, часто утрачиваемого при многих онкологических заболеваниях и расположенного между STS маркерами D13S1168 и D13S272, удовлетворяющего требованию идентификации структуры исследуемых генов RFP2, RFP2ÖS, C130RF1 и KCNRG расположенных в этом районе, а также был проведен анализ тонкой структуры и начальные этапы функциональной характеристики этих генов.

Полученные космидные клоны геномной ДНК при построении контига могут быть использованы для идентификации нормальных и аномальных хромосом человека на ДНК пациентов больных онкологическими заболеваниями, ассоциированными с исследуемой областью. ДНК этих клонов также может быть использованы для поиска областей, содержащих регуляторные элементы генов RFP2, RFP20S, C13ÖRF1 и KCNRG.

Ген RFP2 локализуется на космидах клонотеки LANL 67В4 и 116С1. Гену соответствуют по крайней мере четыре изоформы мРНК длиной 1.4 т.н, 2.4 т.н. и 7.5 т.н., которые представлены практически во всех исследованных нормальных тканях и некоторых опухолевых клеточных линиях человека. Количественное соотношение этих изоформ заметно варьирует в зависимости от типа нормальной ткани. Показано, что сигналу на нозерн-блоте в 1.4 т.н. соответствуют две изоформы мРНК, поданные нами в базу данных GenBank под номерами AF241850 и AY191002. Эти изоформы состоят из трех экзонов. Второй и третий экзоны этих изоформ совпадают. Изоформа AY191002 длинее изоформы AF241850 на 85 нуклеотидов за счет области интрона на 3'-конце первого экзона. Ген транскрибируется в направлении от центромеры к теломере. Изоформы, содержат одну и ту же эволюционно-консервативную ОРС, которой соответствует предсказанная последовательность, состоящая из 407 аминокислот. Этот белок содержит цинк-связывающие домены RING и В-ВОХ, а также так называемый «спирально скрученный» домен. Такое сочетание доменов называется Rfpподобным трехчастным доменом, по названию белка Rfp (Ret finger protein). Следует отметить, что многие белки, содержащие цинк-связывающий домен RING типа, являются Е2-зависимыми ЕЗ убиквитин-лигазами. Белковый продукт гена RFP2 является либо цитоплазматическим белком, либо трансмембранным белком эндоплазматического ретикулума. Проведенный поиск партнеров белка RFP2 с использованием дрожжевой двугибридной системы позволил выявить 10 потенциальных белков партнеров по взаимодействию. Анализ аминокислотной последовательности, данные по локализации белка внутри клетки, а также проведенная структурная и функциональная характеристика потенциальных партнеров позволяют высказать гипотезу о возможной вовлеченности белкового продукта гена RFP2 в процессы регуляции клеточного цикла, процессы, связанные с клеточной дифференцировкой, перестройкой цитоскелета, регуляцию раннего развития эмбриона, в неопластическую трансформацию клеток, либо в регуляцию иммунного ответа. Возможно, белок RFP2 участвует в работе системы деградации неправильно свернувшихся белков, ассоциированной с эндоплазматическим ретикулумом. Активность любой системы контроля существенна для нормального функционирования клетки. Возможное участие RFP2 в одной из таких систем с учетом его локализации в области генома, ассоциированной со многими онкологическими заболеваниями выделяет его среди других генов как возможного супрессора опухолевого роста, что указывает на необходимость его дальнейшего детального исследования.

Ген RFP20S локализуется на космидах клонотеки LANL 156Н12 и 116С1. Изоформа РНК гена включает в себя 1768 нуклеотидов и не содержит протяженной открытой рамки считывания. Нуклеотидная последовательность изоформы РНК гена подана в базу данных GenBank под номером AF529010. Ген состоит, по крайней мере, из пяти экзонов и транскрибируется в направлении от теломеры к центромере. Изоформа РНК гена RFP2ÖS, частично перекрывается с первым экзоном гена RFP2 (на 57 нуклеотидов с изоформой AF241850 и на 146 нуклеотидов с изоформой AY191002), являясь, таким образом, антисмысловым транскриптом для этого гена. Выдвинута гипотеза о возможном участие RFP20S в регуляции экспрессии и трансляции гена RFP2.

Ген KCNRG локализован на космиде 67В4. Ген, вероятно, состоит из трех экзонов и транскрибируется от центромеры к теломере. Гену соответствуют, по крайней мере, две изоформы мРНК (зарегестрированы в базе данных GenBank под номерами AY129653 и AY129654), которые представлены практически во всех исследованных нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека. Изоформы мРНК отличаются внутренней нуклеотидной последовательностью в 95 нуклеотидов. Разница в длине изоформ мРНК появляется в результате использования альтернативных сигналов сплайсинга.

Две изоформы мРНК гена KCNRG содержат эволюционно-консервативные ОРС, которым соответствует предсказанные последовательности, состоящие из 229 и 272 аминокислотных остатков. Сплайсформы кодируют возможные белковые продукты массой около 20кДа, отличающиеся по С-концу. При этом отличия не затрагивают область домена тетрамеризации потенциал-зависимых калиевых каналов Т1. Этот домен имеет отдаленную гомологию с BTB/POZ доменом, который участвует в белок-белковых взаимодействиях и присутствует во многих транскрипционных факторах. Нашими коллегами из университета в г. Лиль (Франция) было показано, что белковый продукт гена KCNRG возможно подавляет активность калиевых каналов. Белковый продукт, вероятно, препятствует сборке каналов, выполняя, таким образом, регуляторную функцию. Конкретизировать калиевые каналы, с которыми взаимодействует белок KCNRG, подавляя их активность, не представляется возможным: библиотека для дрожжевой двугибридной системы, использованная в этом исследовании, не подходит для этой задачи.

Во многих работах продемонстрирована способность ослаблять митотическую активность некоторых типов клеток любым фактором подавляющим активность калиевых каналов. Ген KCNRG, расположенный в области утрачиваемой при многих онкологических заболеваниях, в частности, в образцах карциномы простаты и B-XJIJI, является первостепенным кандидатом на роль супрессора опухолевого роста при этих заболеваниях.

Ген человека C130RF1 локализован на космидах 122F4 и 105F10. Ген экспрессируется в виде трех основных изоформ мРНК, размер которых составляет 1.1 т.н., 1.5 т.н. и 3 т.н., которые представлены практически во всех исследованных нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека. Ген C130RF1 состоит из пяти экзонов и транскрибируется от теломеры к центромере. При этом разнообразие изоформ мРНК определяется альтернативными сигналами полиаденелирования. Эксперимент по достройке праймера позволил выявить как минимум пять точек инициации транскрипции в промоторной области гена C130RF1.

Все изоформы мРНК содержат одинаковую эволюционно-консервативную ОРС, которой соответствует предсказанная аминокислотная последовательность, состоящая из 196 аминокислот. Белковый продукт гена содержит единственный домен SPRY и, возможно, локализуется на цитоплазматической мембране. Данные по локализации белка, а также компьютерный анализ его аминокислотной последовательности свидетельствуют о его возможной регуляторной активности в отношении белков цитоплазматической мембраны. Однако, белковый продукт гена C130RF1 не причастен к регуляции тока кальция через мембраны клетки, как было показано нашими французскими коллегами. Результаты поиска возможных белков-партнеров белка C130RF1 методом дрожжевой двугибридной системы, не позволили конкретизировать возможное участие продукта гена C130RF1 в регуляции активности белков мембран.

Итак, в ходе данной работы впервые была получена структурная и функциональная характеристика четырех генов человека, расположенных в области ql4.3 хромосомы 13, часто утрачиваемой в образцах различных опухолей человека. В результате проведенного структурного и функционального анализа генов человека ЯГР2, ЯРР20Б, КСИ1Ю и С130КР1, наиболе перспективными кандидатами на роль гена-супрессора опухолевого роста следует признать гены ЯГР2 и КСЫЯС.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванов, Дмитрий Валерьевич, Москва

1. Громов П.С., Целис Х.Э. От геномики к протеомике. // Молекулярная биология, 2000 Т. 34 - С. 597-611.

2. Кель О.В., Кель А.Э. Межгенные взаимоотношения в регуляции клеточного цикла: ключевая роль транскрипционных факторов семейства E2F. // Молекулярная биология, 1997 Т. 31 - С. 656 - 670.

3. Колчанов H.A., Ананько Е.А., Колпаков Ф.А., Подколодная O.A., Игнатьева Е.В., Горячковская Т.Н., Степаненко И.Л. Генные сети. // Молекулярная биология, 2000 Т. 34 - С. 533-544.

4. Подколодная O.A., Степаненко И.Л. Механизмы транскрипционной регуляции эритроид-специфичных генов. // Молекулярная биология, 1997 -Т. 31-С. 671-683.

5. Ратнер В.А. Генетические управляющие системы. Новосибирск: Наука, 1966 С. 181.

6. Сулимова Г.Е., Компанийцев А. А., Кунижева С. С., Климов Е.А., Рахманалиев Э.Р., Удина И. Г. Картирование в геноме человека EST- и STS-маркеров с использованием панели радиационных гибридов // Генетика, 2000. Т. 36. - С. 900-907.

7. Abdul M., Hoosein N. Expression and activity of potassium ion channels in human prostate cancer. // Cancer Lett, 2002 Vol. 186 - P. 99.

8. Alam J. and Cook J.L. Reporter genes: application to the study of mam-malian gene transcription. // Anal. Biochem, 1990 Vol. 188 - P. 245.

9. Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. Molecular Biology of the Cell. // New York and London: Garland Publishing, 1994 3rd ed.

10. Ananko E.A., Podkolodny N.L., Stepanenko I.L., Ignatieva E.V., Podkolodnaya

11. A., Kolchanov N.A. GeneNet: a database on structure and functional organisation of gene networks. // Nucleic Acids Res, 2002 Vol. 30 -P. 398401.

12. Anderson L., Seilhamer J. A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. // Electrophoresis, 1997 Vol. 18 - P. 533-7.

13. Aparicio S., Chapman J., Stupka E., Putnam N., Chia J.M., Dehal P., Christoffels A., Rash S., Hoon S., Smit A., Gelpke M.D., Roach J., Oh T., Ho

14. Y., Wong M., Detter C., Verhoef F., Predki P., Tay A. et al. Whole-genome1.I