Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые подходы к синтезу искусственных генов (il-la и il-lra)

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Некоторые подходы к синтезу искусственных генов (il-la и il-lra)"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ химии ИИ. М.М.ШЕМЯХИНА И Ю-А.ОВЧИННИКОВА

ЛЕБЕДЕНКО Екатерина Николаевна

Некоторые подходы к синтезу искусственных генов (П-1а и И-1га)

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

од

У си

На правах рукописи

Москва - 1994

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте биаорганическои химия им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Ю. А. Берлин

Официальные оппоненты: локтор биологических наук, профессор

В. Д. Смирнов кандидат химических наук В. Г. Корооко

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Зашита состоится "-'2. " октября 1994 г. в 10.00 на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемяхина и Ю~А.Овчинникова РАН по адресу: 117571, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института бисорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮА. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан "42 " сентября 1994 г.

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В настоящее время интенсивно развивается область упологин, изучающая механизмы возникновения и регуляции палительных и иммунных реакций на клеточном и молекулярном внях. Важнейшими медиаторами этих процессов являются ки-цитокины, причем одну из ключевых ролей играет интерлейкин IL-1). IL-1I выделенный из тканей ряда животных и человека, во х случаях представлен в виде двух различных белков - IL-loi и 1ß. Эти белки обладают одинаковым спектром биологических ивностей и связываются с одними и теми же клеточными впторами. Сродство к тем же детерминантам поверхности клетки ет также недавно идентифицированный природный рецепторный агонист интерлейкина 1 (IL-1ra). Этот белок не обладает явностью IL-1| но играет существенную роль в регуляции его ержания в клетках и тканях. Свойства всех трех упомянутых выше ков позволяют рассматривать их как перспективные апевтические средства и как объекты исследования анд-рецепторных взаимодействий. Важной проблемой является учение этих белков в нативном и мутантном виде в значительных ичествах, что возможно лишь с помощью клонирования и прессии их генов. Большинство генов известных цитокинов. в том ne гены семейства IL-1. ранее были клонированы через кДНК редством трудоемкого метода конструирования и анализа потек. Появление метода полимеразной цепной рбакции (ПНР), эавшего огромное влияние на развитие молекулярной биологии и «ных дисциплин, не могло не затронуть также проблемы синтеза ов. Среди различных подходов к решению этой проблемы следует Оенно отметить элегантный метод сплайсинга генов путем нгации перекрывающихся фрагментов ДНК (SOE) (Horton. 1989). дставлялось целесообразным исследовать другие варианты ользования метода ПЦР для искусственного синтеза генов IL-Ici и 1га человека с целью создания на их основе экспрессирующих струкций.

Научная новизна и практическая ценность работы Настоящая работа является частью проводимых в Институте органической химии исследований по молекулярному клонированию экспрессии генов биологически важных белков человека и

животных. „„„,„,, Е химико-Ферментативному

в -а««* лреио,е"г!;:,. ;.,„, .»„.«».».гс «—■«■

синтезу эу>вр»от»ч«.«»' «НО. „„„ЯвМИ и<

ш о „о.о.ь.

.ь— м-л. В составе

„„.« ».»Мппи „„в,.,.«.» .шеи«»«

- — ,в мш,ар"ого

белка бактериальной клетки.

Презентация^атер^ статей. Результаты

Г" Т " «

.„».„.„то. г=".,11::::э„„. „„„.т.,..«

Международном круглом стопе Международном

-:—:си= — ■ — практического применения" (Москва, 1991).

CjsrssSUSSm страницах» включай 31 рисунков

диссертация изложена на «о ^ яитеоатуры, методической Работа состоит из введения, „ списка

»о™. обсуждения полученных Р83'льтаТ0В'_

эованной литературы (ГИПпяп»«*

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

лет для искусственного синтеза генов „а протяжении многих лет для и У „ „одхода-.

обратная транскрипция мРНКс^ последу ^ идвестной нукяеотидной

скринингом или же - для ТИВИ|Л синтез. Для

последовательность» - "е " геФ„0В мы обратились к методу

разработки других способов синтезаг „„формации

РПЦР, который при "Дао ки ДНК. включая «елые

позволяет легко получать протяже ные У ^^ ^

„„он- эукариотическйх генов При это»^^ спецйф„ческую для использовать не только ыи»* доступную в

различных клеток и тканей), но и стабильную геномную ДИК.

2. Синтез генов путем амплификации in vitro дуплекса мРНК-кДНК 2.1. Синтез гена XL-ioi

Структурной основой синтеза послужили данные о нуклеотидной последовательности гена IL-let и соответствующей кДНК, а также о структуре зрелого лимфокина, включающей в себя аминокислотные остатки 113-271 предшественника (Furutani et al, 1986). Эти данные позволили сконструировать прямой и обратный дезоксинуклеотидные праймеры - соответственно 30-членники (I) и (II) (рис.1) - для амплификации участка кДНК, соответствующего зрелому IL-1ct. Эти праймеры содержат на З'-конце 20-звеннук1 последовательность, гомологичную 5'-концевому участку (праймер (I)) и комплементарную 3'-концевому участку (праймер (II)) смысловой цепи гена, а на Б'-конце - BamHI-сайт, Фланкированный одним нуклеотидным эвеном. Кроме того, прямой праймер вкличает в себя инициирующий кодон ATG, а обратный - нативный и добавочный терминирующие кодоиы TAG и ТАА в виде соответствующих комплементарны* последовательностей ста и тта.

Для получения гена XL-Id мы исходили из суммарной полиаденилированной мРНК, выделенной из моноцитов человека в

старт

5' CGGAТССАТСТСАТСАCCTTTTAGCTTCCT (I) ВатШ

СТОП СТОП

5' CGGATCCTTACTACGCCTGGTTTTCCAGTA (II) ВатШ стоп

5' CTACTCGTCCTCCTGGAAGTA (III)

старт

5' CGGATCCATGCGACCCTC7GGGAGAAAATCC (IV) ВатHI

стоп

5' CGGATCCCTACTCGTCCTCCTGGAXGTA (V) flamHI

5' CGACCCTCTGGGAGAAAATCC (VI)

Рис.1. Структура праймеров для амплификации in vitro генов IL-1с( и IL-lra (здесь и далее в обозначении деэокси-нуклеотидных последовательностей префикс "d" опущен).

- б -

лаборатории С.А.Кетлинского (ВНИИОЧБ. С.-Петербург). Синтез

первой цепи кДНК проводили в инкубационной смеси, содержавшей 1

мкг мРИК в качестве матрицы, 5 пмоль праймера (II), 10 мкКи 32

[d- PJdCTP, а также реактивы из набора для синтеза кДНК (cDNA Synthesis System Plus, Amersham). Десятую часть этой смеси, содержащую дуплекс мРНК-кДНК, использовали без дополнительной очисТки в качестве матрицы в последующей ПЦР с праймерами (I) и (II) (по 20 пмоль каждого). В результате 30 циклов ПЦР (денатурация 1 мин при Э4°С, отжиг 2 мин при б? С, элонгация 3 мин при 72°С) был получен продукт амплификации гена IL-1d (около 500 п.о.) (рис.2), который был затец очищен электрофорезом в 8* ПААГ с последующей электроэлюцией и гель-фильтрацией на сефадексе G-50 (выход 1,2 мкг).

Полученный таким образом фрагмент ДНК был сначала обработан ДНК-полимеразой I (фрагмент Кленова) для удаления 3'-выступающих звеньев, появляющихся в результате ПЦР, а затем лигирован с плаэмидным вектором риС19, предварительно расщепленным эндонуклеазой рестрикции Smal и терминально дефосфорилированным фосфатазой из кишечника теленка (CIP) (рис.2). Далее полученной пикированной рекомбинантной ДНК, содержащей два одноцепочечных разрыва в местах дефосфорилирования, трансформировали компетентные клетки E.coli НВ101 или TG1 и из клонов, отобранных На сртзтге—-с—ампицилдшшм__и__Х^£а1, выделяли методом щелочного лизиса ДНК и секвенировали ее по методу "Сенгёра^ Таким—образом— был синтезирован и клонирован структурный ген зрелого lL-1d, который Фланкирован ЯалШ-сайтами, содержит кодоны' инициации и терминации трансляции и в принципе пригоден для прямой экспрессии в бактериальной системе.

2.2. Синтез гена IL-1ra

Первичная структура рецепторного антагониста IL-1 была установлена независимо в двух лабораториях (Eisenberg et al., 1990; Carter et al., 1990) путем секвенирования кДНК из библиотеки моноцитов человека: он синтезируется в виде 177-эвенного полипептида, превращающегося после отщепления 25-звеиной N-концевоЙ сигнальной последовательности в Функционально активный 152-звенный IL-Ira. Располагая этими данными,мы сконструировали праймер (III) (рис.1), комплементарный 3'-концевому участку транслируемой части мРНК IL-Ira - кодонам U7-152 (здесь и далее нумерация кодонов и аминокислотных

остатков начинается or триплета cga, кодирующего аргнннн -N-концевой остаток зрелого II,-1га) и терминирующему кодопу tag и способный избирательно инициировать обратную транскрипцию именно этой мРНК в составе многокомпонентной смеси полиаденилированных мРНК иэ моноцитов человека. Обратную транскрипцию проводили так же, как при синтезе гена IL-1d (см. раздел 2.1).

Полученный в результате специфический гибридный дуплекс мРНК-кДНК без выделения служил матрицей в последующей ПИР. Лля

э 1 3'

суыыарная поли(А)-мРНК

lUACUGGAAAACCAGGCGUAq^^gPP^

ATGACCTTTTGGTCCGCATC

ATTCCTAGGC праймер (ti)

обратная транскрипция

ÎAAAA

■ATGACCrriTGGTCCGCATC

ATTCCTAGGC

HHP

с прайиерами (I) и (II)

BamHI Н£рт >' С GGATCCATGTCATCACCTTTTAGCTTCC'

gcctaggtacagtagtggaaaatcgaaggaj

стой СТОО

ACTGGAAAACCAGGCGTAGTAAGGATCCt}

ÍATGACCTTTTGGTCCGCATCATTCCT.IGGC

1. клонирование

в pUC19/Smal,CIP

2. BamHI

BamHI

BaiBHlH£p,r стоп стоп

i ' MrCCATGTCATCACCTTTTAGCTTCCTeeBrrACTGGAAAACCAGGCGTAGTAAG 1 ' GTACAGTAGTGGAAAATCGAAGGAHHHjATGACCTTTTGGTCCGCATCATTCCr.iG

BamHI

ген IL-Id (492 п.о.)

Рис.2. Конструирование гена зрелого п,~1е( с помощь» ПЦР на дуплексе мРНК-кДНК в качестве исходной матрицы.

этой реакции в качестве прямого праймера предполагалось использовать 31-звенный нуклеотид (IV) (рис.1), содержащий наряду с 21-эвенным 3'-концевым участком, идентичным 5'-концу значащей цепи гена IL-1ra (кодоны 1-7), также дополнительную декануклеотиднуго последовательность, отвечающую ВалШ-сайту, Фланкированному с 5'-конца звеном с, и инициирующему кодону ATG. Для использования в качестве обратного праймера был синтезирован 28-мер (V) (рис.1), в котором последовательность (III), комплементарная кодонам 147-152 и терминатору трансляции TAG и использовавшаяся нами для обратной транскрипции (см. выше), дополнена, как и в прямом прайм^ре (IV), 5'-фланкированным BamHl-сайтом. ПЦР с праймерами (IV) и (V) должна была привести к полинуклеотиду, в котором ген IL-1ra окаймлен ВалШ-сайтами и, наряду с нативным терминирующим кодоном TAG, содержит инициирующий кодон ATG, непосредственно предшествующий началу структурного гена зрелого антагониста.

Однако такая комбинация праймеров в ПЦР с гибридом мРНК-кДНК в качестве матрицы не дала нужного продукта амплификации даже в результате двух последовательных раундов ПЦР по 30 циклов каждый. Поэтому на первом этапе ПЦР мы использовали в качестве праймеров олигонуклеотиды, не содержащие свисающих концов, т.е. образующие с матрицей совершенные дуплексы. При этом в качестве обратного "пр^ймвтга—был—иеподьадван олигонуклеотид (III), а в качестве прямого - олигонуклеотид (Vi), составляющий З^концевую—часхь_ праймера (IV) и, таким образом, идентичный 5'-концу значащей цепи гена IL-lra.

При электрофоретическом анализе реакционной смеси (после 40 циклов) с прокрашиванием бромистым этидием полоса нужного полинуклеотида не была обнаружена, однако при использовании аликвоты (1:10) этой реакционной смеси для повторной ПЦР (еще 30 циклов) - на этот раз с праймерами (IV) и (V) со свисающими концами - была идентифицирована полоса, отвечающая полинуклеотиду ожидаемого размера (476 п.о.).

После второго этапа ПЦР продукт амплификации гена IL-1ra был встроен по тупым концам в плаэмиду pUC19/Smal,С1Р; эту и последующие стадии '(трансформацию, выделение и анализ ДНК) проводили как при синтезе гена IL-lot (см. выше). Среди проанализированных клонов не было обнаружено ДНК с нативной последовательностью гена IL-1ra - все они содержали нуклеотиднне замены, ведущие как к молчащим, так и к миссенс-мутациям.

В и р и ii ни и о причиной возникших замен могли быть как обратная транскриптаза RAV2 (Amersham), так и термоотабильная ДНК-полимераза I'hermus thermophilus (ЛИНФ РАН, Гатчина), использовавшиеся нами в синтезе гена и не обладающие 3'-корректирующей активностью. Учитывая, что суммарное число циклов ПНР, приведшее к искомому гену, было весьма значительным (70), можно било бы отнести все полученные замены на счет :Ш1-полимераэы. Это особенно вероятно в случае мутации в кодоне 148, кбторая может быть связана с репликацией или же со структурным дефектом обратного праймера (хотя бы в какой-то доле его молекул), проявившимся в части клонов, но никак не с обратной транскрипцией, начинающейся за пределами этого праймера. Однако в опытах по клонированию фрагментов гена IL- Ы с помощью Г£Л-лолимераэы без участия обратной транскриптазы (см. раздел 3.2.2.) мы не обнаружили клонов, несущих замены. Следует также отметить, что именно на счет обратной транскриптазы было отнесено несовпадение данных о природе второго звена в составе первого кодона в гене зрелого iL-1ra по данным анализа кДНК и геномной ДНК (Eisenberg et al., 1990).

Чтобы из имевшихся мутантных ДНК получить последовательность, в точности отвечающую первичной структуре IL-Ira, мы использовали ДНК из трех различных клонов, несущие в совокупности четыре значащие мутации в различных частях гена (рис.3). Проведенные с участием этих ДНК две рекомбинации in vitro по сайтам КрпХ/EcoWlll и EcoMllI/Hindlll позволили устранить мутации, вызывающие аминокислотные замены, и привели к гену, хотя и сохранившему две молчащие мутации (транзиции Т-*С и С-»Т в третьем положении кодонов 105 и 148), но в точности кодирующему ранее описанную 152-эвенную последовательность зрелого рецепторного антагониста IL-1.

Таким образом, путем амплификации in vitco дуплекса мРНК-кДНК были получены два эукариотических гена: IL-ld и его рецепторного антагониста, пригодных для экспрессии в E.coli.

Этот подход к искусственному синтезу генов обладает рядом несомненных достоинств: не требует создания и анализа клонотеки; не нуждается в синтезе двухцепочечной кДНК, а с обнаружением ревертаэной активности ГеЛ-полимераэы (Myers et al., 199)) не нуждается и в самой обратной транскриптаэе для первой стадии синтеза; в принципе не требует полной структурной информации о гене1 (достаточно знать последовательность нескольких

начало синтетического гена

+

15 ДА

Крп I

200 _I_

EcoUllll ,300

131

GAA-.GGA GlmGly

400

-x-J—

л 373 ATG-»GTG Met-»Val

конец гена

начало синтетического гена

pi 4

100 _I_

КрлГ

ВапЛП

200

_j—х-

-t-230 AGA-»AAA Lys-»Arg

EcoMlll ,300 __I_

конец гена

400 —x—1—х-t г 373 424 ATG-»GTG Met-»Val

Hii

Bai

начало синтетического гена ,, , EcoUllll I 100 200 ,300 _I_I_

AAC-*GAC T-»C Asn-»Asp

Рис.3. Мутации (обозначены крестиками) в трех клонах (р23, р14, р1б), несущих вставку синтетического гена IL1ra (тонкая линия) в составе плаэмиды pUCl9 (жирная линия). Указаны нумерация нуклеотидов в последовательности гена (числа над линией), нуклеотилные замены (в том числе ил положение -числа под линией) и соответствующие им замены аминокислот. Посредством двух рекомбинаций in vitro по отмеченным на схеме Kpnl/Ecobllll- и £со47Ш/Я1лс1П1-сайтам была получена нуклеотидная последовательность, не содержащая миссенс-мутаций и кодирующая нативную аминокислотную последовательность зрелого lL-1ra. Заштрихованы участки плазмид, составившие в результате ген нативного зрелого IL-1 га.

аминокислотных остатков N-конца требуемого белка. чтобы сконструировать вырожденный прямой праймер и провести ПЦР на полиаденилированной мРНК с олиго-dT в качестве обратного праймера); не требует фракционирования суммарной клеточной РНК в случае использования специфического для данного гена праймера для обратной транскрипции. В то же время, из-за нестабильности или малой доступности мРНК не всегда удается оптимизировать условия ПЦР на этой матрице, а увеличение числа циклов ПЦР для повышения выхода - может приводить к накоплению мутаций в процессе ферментативного синтеза ДНК.

3. Искусственный сплайсинг ДНК с помощью направленного лигирования (СИЛ)

Наряду с амплификацией in vitro генов в составе дуплекса мРНК-кДНК представлялось целесообразным также использовать в качестве более доступной и стабильной матрицы геномную ДНК. Такой подход совершенно очевиден, когда речь идет о прокариотических генах, однако в случае эукариот нативные гены обычно слишком велики для их вычленения из геномной ДНК с помощью одноэтапной ПЦР. К тому же мозаичная структура генов эукариот препятствует получению таким методом генов, пригодных для экспрессии в бактериальных системах. Поскольку каждый из экэонов может быть синтезирован с помощью ПЦР по отдельности, основная возникающая при этом проблема состоит в точной стыковке получаемых фрагментов с образованием полноразмерного безынтронного гена.

Ранее для решения этой проблемы был разработан эффективный метод точного сочленения фрагментов ДНК с помощью элонгации перекрывающихся участков (gene splicing by overlap extention, SOE) (Horton et al., 1989). Метод SOE раэносторонен и может быть использован не только для стыковки экзонов, но и для точного сочленения любых фрагментов ДНК. Недостатком этого метода, как и других методов на основе ПЦР, является довольно высокая вероятность внесения мутаций в целевую последовательность из-за отсутствия 3*-» 5'-корректирующей активности у обычно используемых термостабильных Tag- и ГГЛ-ДНК-полимераз. Кроме того, эффективность метода SOE может снижаться и из-за нематричной достройки З'-концов фрагментов с появлением дополнительного нуклеотидного эвена. В то же время, использование Vent-ДНК-полимеразы (Mead et al., 1991), обладающей 3'-+ 5'-карректирующей активностью и почти не проявляющей активности

терминальной трансфераэы, позволяет в значительной мере обойти эти трудности.

Традиционным альтернативным способом стыковки фрагментов ДНК является лигирование липких (самокомплементарных) выступающих концов, образующихся в результате расщепления ДНК эндонуклеазами

рестрикции II класса. Однако возможности направленного вбедения

«

рестриктных сайтов в кодирующую последовательность структурного гена (см., например. Landau et al., 1988) весьма ограниченны, так как далеко не всегда для создания такого сайта удается подобрать нуклеотидные замены, не приводящие к заменам аминокислот.

Более широко применим способ создания уникальных выступающих концов с помощью эндонуклеаз рестрикции класса IIS (обзор по этим Ферментам см. Szybalski et al., 1991). Однако векторы, применявшиеся для регенерации фрагментов ДНК с уникальными IIS-выступающими концами и последующего их сочленения, обычно требуют дополнительной стадии лигирования по тупым концам, что может приводить к структурным осложнениям.

Чтобы решить проблему точного сочленения экэонных фрагментов при синтезе генов, мы разработали метод искусственного сплайсинга ДНК с помощью направленного лигирования (CHJI) с использованием ПЦР и эндонуклеаз рестрикции класса IIS Ясо311 и Espl. Почти дШШШ2Шенно_снашими статьями по этой части работы (Lebedenko et

al., 1990; 1991 ) был оТШЛпгкован—а н а л о цццщй___под ход с

использованием эндонуклеазы Fo£I (Jayaraman et al., 1991).

3.1. Характеристика метода CHJI

Метод CHJI основан на следующих принципах:

1. Получение фрагментов ДНК с помощью ПЦР с одновременным введением в эти фрагменты фланкирующих сайтов эндонуклеаз рестрикции класса Ils (IIS-сайтов).

2. Стыковка ПЦР-фрагментов по уникальным четырехэвенным выступающим 5'-концам, образующимся в результате обработки этих фрагментов соответствующими эндонуклеазами.

С помощью серии ПЦР на геномной ДНК в качестве матрицы получают набор подлежащих сочленению сегментов ДНК. Для того чтобы одновременно с получением этих сегментов ввести в них терминальные IIS-сайты, в ПЦР используют синтетические праймеры со свисающим (т.е. некомплементарным матрице) Б'-концом, который и содержит IIS-сайт.

В настоящей работе мы использовали эндонуклеазы рестрикции ЕсоЪМ (Ви1киа ег а1., 1985) И гвр31 (ВтпаПе et а1.\ 1991), которые узнают в составе двухцепочечной ДНК шестиэвенные непалиндронные участки и расщепляют ДНК по двум цепям на расстоянии одного и пяти звеньев от участков узнавания с образованием 5'-выступающих четырехэвенннх концов (рис.4). Именно эти концы предназначены для стыковки фрагментов ДНК, причем ПБ-сайт ориентирован в праймере таким образом, чтобы обработка продува амплификации соответствующей эндонуклеазой сопровождалась удалением этого сайта из целевого фрагмента (рис.4). Кроме того, каждое из мест будущего расщепления продуктов ПЦР конструируется в составе праймеров так, чтобы образующиеся 5'-выступающие концы стыкуемых фрагментов были взаимно комплементарны.

В отличие от обычных липких (самокомплементарных) концов, способных отжечься и затем сшиться с любым другим концом аналогичного происхождения, каждый из выступающих концов, образующихся при действии ЕсоЗМ и подобных ей эндонуклеаэ, обладает специфической первичной структурой, определяемой последовательностью ДНК, которая примыкает к участку узнавания. Общее число возможных четырехэвенннх концов такого рода

3' 5'

5'. 3'.

£со311-сайт . N-N-N-N-N-»1- С-А-С-А-С-С-И

А I

£5р31-сант

.К-Ч-П-Ы-^-П*С-Т-С-Т-в-в-Ч*

ЕсаЭП

5'.. .И

* * * * *

уникальный

выступающий

конец

1

н-с-с-т-с-т-с-н-л-н-я-н-н.. .

А т

I ЕзрЗ]

конец

N... И*.. 5'

Ч-в-С-А-в-А-С-Ц-И-Я-И-И-Ч*. .

уникальный . выступающий I ЕзрЗ!

Н-Н-Н-Н-й... 3'

и*

ДНК-яигаза

Б'.-.Н-Н-Н-И-Н-Н... ******

3'...н-и-н-и-и-н...

Рис.4. Принцип стыковки сегментов ДНК, Фланкированных ПБ-сайтами (И и Л*- комплементарные звенья ДНК).

- 14 -

« ГРЧВ1 чтобы каждый из ни* можно было

достаточно велико (256), чтобы л 0Т<5р0СИть 16

=—

_ — — .г~ Гт

Б^-вистдамего коицй! ,р„„еит» ИК » «е

например, от Гок1>.

3 2. Синтез гена ХЬ-Ш человека методом СНЛ т 7 1 Конструирование праймеров для ПЦР

зи ;:„ си» «« ш - »»„г г.

159-эвенного предшественника

остатки 113-271) в .. г. .„пгтичнрЬ * (полностью) и 7

закодированных в экзопах о ..

08_6, иБ-7 и СБ-7 (рис.6). частей: его

Каждый из этих пр^ров «оот«« « « ' цепей

3'-концевая часть комплементарна Д вав другая

соответствие экзонного *кахяого из

часть составляет свисающий Б -иней ^^ ^^ прай„еров,

внутренних праймеров ^-5. послеДух>щей стиковки

отпи^туоные предпосылки для последующе» создающих структурныеи я „„, воиеЦ содержит

экэон 5 171 п.о.

экзон б

125 п.о.

часть локуса lb-Id в геноме человека

гибридизация с синтетическими праймерами

DS-5

DS-6

DS-7

OS-5

ПЦР

ЕсоЪ1I BemHI

US-6

ПЦР

ЕсоЪ1I

US-7

ПДР

ЕсоЭ11 ВатHI

154 п.о. (АК 113-164)

125 П.О. (АК 164-205)

198 П.О. (АК 206-271)

ковалентная свивка фрагментов

сплаВсироваинив ген зрелого lb— tot человека

(АК 113-271)

Рис.5. Конструирование гена зрелого IL-1сС методом искусственного сплайсинга.

для каждой пары стыкуемых продуктов амплификации эти 5'-выступающие концы взаимно комплементарны, а экзон-экзонная граница проходит по их середине (рис.6).

В принципе положение экэон-экэонной границы, определяемое дизайном праймеров. может быть сдвинуто в ту или другую сторону (в глубь любого из двух стыкуемых продуктов ПЦР). Однако для такого смещения необходимо соответствующее удлинение свисающей части одного иэ праймеров. В данном случае мы выбрали вариант положения экэон-экэонной границы, который, с одной стороны, требует минимальной длины свисающей части праймеров, а с другой -позволяет извлекать иэ генома фрагменты ДНК, соответствующие экзоняым сегментам гена, которые могут представлять

старт

5' CGGATCCATGTCATCACCTTTTAGCTTCCT BanMl US-5*

2 звена

экзона б [ экзон 5 5' CggrcrCCC/lCXGCTTCATCCAGATTATGT ЕсоЗ11 DS-5

5' TCATCACCTTTTAGCTTCCT

US-5M

5' CTTCATCCAGATTATGTAAT

DS-5M

2 звена

экзояа 5 | экзон б 5' CCCCTCTCCACIGAAATTTGACATGG( £co31I US-<

2 эвена

экзона 7 [ экзон 6

5' CCGGTCTCCTCCXTCAGGAGCACTGG' EcoJ11 1

2 звена

экзона б | экзон 7

5' CCGGTCTCTAGGAGATGCCTGAGATAt Eco311 US

стоп стоп 5' CGGArccmCTACGCCTGGTTTTCC BamRl D

Рис.6. Праймерн для амплификации in vitro экэонов 5. 6 и 7 гена IL-lc(i отчеркнуты жирной чертой сверху унркальные четырехэвенные последовательности будущих 5'-выступающих концов, предназначенных для стыковки продуктов ПЦР; курсивом набрана последовательность свисающих 5'-концов; праймеры, отмеченные звездочкой (US-5 и DS-7), идентичны соответственно праймерам (X) и (II) на рис. 1.

самостоятельный интерес как полинуклеотиды, ктшгрующие-функциональные домены целевого белка.

Наружные праймеры (US-5 и DS-7) в своей свисающей части содержат фланкированный одним эвеном ВалШ-сайт (для встраивания гена в экспрессирующий вектор) и дополнены соответственно сигналами инициации и терминации трансляции (последний, наряду с нативным терминирующим кодоном, представлен соответствующей комплементарной последовательностью).

3.2.2. Амплификация in vitro экзонных сегментов гена IL-1оС и их клонирование Три пары праймеров (рис.6) были использованы нами в трех раздельных ПЦР с геномной ДНК человека в качестве матрицы. Оказалось, что в то время как вторая (US-6 и DS-6) и третья (US-7 и DS-7) пары праймеров функционировали нормально, приводя к образованию 6-го экзона и соответствующего фрагмента 7-го экзона, первая пара (US-5 и DS-5) вообще не давала продуктов амплификации - по-видимому, из-за неких особенностей взаимодействия праймера

)S-5 с матрице/» (в системе US-5 и DS-7 с кДНК в качестве матрицы шплификация проходила нормально, что снимает подозрения с |раймера US-5).

Нужный фрагмент 5-го экэона удалось получить лишь с помощью двухэтапной амплификации. При этом на первом этапе в качестве 1раймеров были использованы 20-эвенные олигонуклеотиды, не зодержащие свисающих концов (рис.6): US-5M, совпадающий с 3'-концевой частью праймера US-5, и DS-5M, сдвинутый по сравнении з комплементарной матрице частью праймера DS-5 на три нуклеотидных звена в сторону прямого праймера. После 30 циклов ЛЦР в стандартных условиях (см. раздел 2.1) и идентификации нужного по длине фрагмента электрофорезом в 15* ПААГ аликвоту реакционной смеси (1:50) использовали на втором этапе в качестве матрицы для ПЦР с праймерами US-5 и DS-5. В этом случае амплификация прошла успешно с образованием соответствующего фрагмента 5-го экэона.

Высокая специфичность проведенных ПЦР в принципе- делала возможной последующую сборку гена непосредственно после обработки полученных фрагментов эндонуклеаэами ЕсоЗМ и ВзтЯ1. Однако, чтобы получить представляющие самостоятельный интерес фрагменты геномной ЛНК, в точности соответствующие экэонам, а также учитывая отсутствие у rt/i-ДНК-полимеразы корректирующей активности и наблюдавшееся возникновение мутаций в амплифицированных фрагментах, особенно при увеличении числа циклов ПЦР, мы провели промежуточное клонирование синтезированных экэонных фрагментов в плаэмидном векторе pUC19/SmaI,ClP и их секвенирование по Сенгеру. В составе проанализированных клонов, содержащих плаэмиды со вставками экэонов 5-7, мутантных последовательностей не оказалось, т.е. амплификация in vitro этих участков геномной ДНК протекает без заметных погрешностей.

3.2,3. Сборка гена IL-1d иэ экэонных Фрагментов и его клонирование в векторе pDR5A0

По 25 мкг рекомбинантных плазмид pUC19, содержащих продукты амплификации 5, в и 7 экэонов гена IL-1d, по отдельности обработали рестриктаэами, выщепляищими эти фрагменты гена (£со311 и Baniil в случае экэонов б и 7, £"со311 в случае экэона 6). Реакционные смеси разделили электрофорезом в 10* ПААГ, нужные полосы после прокрашивания бромистым этидием вырезали иэ геля, объединили и провели электроэлюцию. После гель-Фильтрации на

сефадексе G-SO получили 2,6 мкг смеси экэонных фрагментов.

Половину препарата (1,3 мкг) обработали Т4-ДНК-лигаэой в 40

мкл стандартного буфера (12 ч при 4°С), затем фермент

инактивировали нагреванием и, доведя концентрацию NaCl до 100 мМ,

обработали рестриктазой ВатHI. Аликвоту реакционной смеси,

меченную с помощью ДНК-полимераэы I (фрагмент Кленова) и

32' '

[cí- PJdATP, анализировали электрофорезом в 10* ПААГ (рис.7).

Продукт сшивки выделили электрофорезом основной части реакционной

смеси в тех же условиях. После электроэлюции и гель-фильтрации на

сефадексе G-50 получили 0,7 мкг целевого полинуклеотида (ген

зрелого IL-lcí), который встроили в врктор pDR540/ BamHI, CIP при

15-кратном молярном избытке фрагмента.

Рис.7. Сборка гена путем направленного . |

лигирования экзонных фрагментов. 1 - ген 1Ь-1о(, ^96-полученный через кДНК (ЛалНГ-фрагмент плазмиды "рис 19-II. 1с( длиной 496 п.о. после полимераэной достройки 3'-концов; контроль), 2 - продукты -ЛИПЯЯИПЙ гщддки 5, 6 и 7-го экзонов гена И-1с1

после обработки Banfll и полимераэной достройки З'-концов (электрофорез в 10* ПААГ). j 2

Полученной рекомбинантной плаэмидой трансформировали клетки Е.coli TGI. Рекомбинанты отбирали методом гибридизации колоний, используя в качестве зондов олигонуклеотиды US-5 и DS-7, после чего клоны с нужной ориентацией вставки идентифицировали рестриктным анализом по величине EcdRl-фрагмента (450 п.о. в случае правильной ориентации и 804 п.о, в случае обратной ориентации вставки). Секвенирование отобранных клонов показало, что полученная структура, включая места стыков, в точности отвечает нативной нуклеотидной последовательности гена. Таким образом, на примере гёна зрелого интерлейкина-1с( человека был разработан метод искусственного сплайсинга, позволяющий сочленять любые полученные с помощью ПЦР сегменты геномной ДНК при наличии данных о первичной структуре коротких фланкирующих последовательностей.

4. Экспрессия генов IL-1ra и IL-1ot человека в E.coli .

4.1. Получение конструкций для экспрессии генов IL-1ra и IL-lot в E.coli

. Для экспрессии генов IL-1ra и IL-lot в E.coli мы использовали вначале вектор pDR540, содержащий гибридный индуцируемый tac-промотор и последовательность Шайна-Дальгарно (SD-последовательность). Оба гена были клонированы в этом векторе по уникальпому ЯатН1-сайту, при этом расстояние от инициирующего кодона клонированного гена до SD-послеяовательноотн составило ю п.о. Нужные клоны отбирали по результатам гибридизации в колониях, используя в качестве зондов 20-звешше олигонуклеотиды: 5' CATCTTCCCTCCATGGATTC, комплементарный нуклеотидам 176-195 значащей цепи гена зрелого IL-1ra, и US-5M (рис.5), комплементарный нуклеотидам 132-151 значащей цепи гена зрелого IL~1d, а также по результатам рестриктного анализа ДНК (для идентификации клонов с нужной ориентацией генов).

Целый ряд клонов, несущих вектор pDR540 с генами lL-1ra и IL-Id в нужной ориентации, мы исследовали на способность продуцировать белок с мол. массой около 17 кДа, выращивая биомассу с индукцией IPTG и анализируя клеточные лиэаты гель-электрофорезом в денатурирующих условиях. Однако ни в одном из штаммов E.coli, использовавшихся нами в качестве хозяина для рекомбинантных конструкций (НВ101, TG1 и SG50020), не наблюдалось сколько-нибудь заметного синтеза целевых белков.

Поскольку отсутствие экспрессии может вызываться факторами, действующими как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции, мы решили попытаться использовать векторы с более сильными, фаговыми промоторами, а также оптимизировать трансляцию.

4.2. Оптимизация трансляции гена IL-1ra

Одним из способов преодолеть трудности трансляции гетерологичных генов в Е. coli является экспрессия генов в составе сложного оперона, в котором первым транслируемым цистроном является эффективно экспрессирующийся в E.coli ген или его фрагмент. В лаборатории С.В.Машко (ВНИИ Генетика) был разработан и успешно использован для оптимизации экспрессии ряда генов (в том числе, гена IL-Iß) вектор pPR-TGATG, в котором под контролем р„ 'промотора фага X находится эффективно транслируемый

искусственный составной цистрон. Эффективная экспрессия чужеродного гена достигается при клонировании его в этот вектор таким образом, чтобы его инициирующий кодон ATG перекрывался одним эвеном с терминирующим кодоном TGA составного цистрона.

Для правильной стыковки гена IL-1ra с описанным вектором необходимо было ввести дополнительную последовательнорть в проксимальный конец гена. Для этого мы сконструировали 33-эвенный дуплекс (Vil) и клонировали его в плаэмиде риС19. Этот дуплекс содержит 3'-концевой Фрагмент описанного выше составного цистрона вектора pPR-TGATG (от fcoRI-полусайта до перекрывающихся стоп- и старт-кодонов), ВатHl-полусайт длв клонирования, а также ЕсоЗИ-сайт, предназначенный для стыковки. любого гена с этим дуплексом по образующемуся в результате расщепления этим ферментом уникальному 5'-выступающему концу CATC, приходящемуся на участок перекрывания стоп- и старт-кодонов.

5' 3'

-5-!-c^jx3¥cgatgcgaccctctgggagaaaatc (VIII)

£sp3I -

5' CGGATCCAAGCTTACTCGTCCTCCTGGAAG (IX)

ВапйП Hindll J

Далее, используя метод СИЛ, мы состыковали с этой последовательностью ген IL-1ra. Для этого с помощью ПЦР на гибридной плаэмиде pDR540, содержащей ген IL-1ra (плазмида pDR5A0-iL1ra на рис.8), с праймерами (VIII) (прямой) и (IX) (обратный) (курсивом выделены свисающие концы праймеров) мы получили модифицированный ген IL-1ra, фланкированный с 3'-конца Báuüíl- и Дл'лсИИ-сайтами, а с 5'-конца - Яяр31-сайтом. Последний был ориентирован таким образом, чтобы при £5р31-расщеллении образовался 5'-выступающий конец GATG гена, комплементарный 5'-выступающему концу сатс дуплекса (VII) после его расщепления ЕсоЗ1I. Использование £sp3i вместо ЕсоЗИ связано с присутствием в гене IL-Ira участка узнавания эндонуклеазы ЕсоЗМ, что делает невозможным выщепленне целого гена с помощью этой эндонуклеазы.

fcoRI

SD

trpD

cron ссоЗ 11 старт

aattcgaacaggagactttctgatgqgagaccg

gcttgtcctctgaaagactacgctctgg

clga g]c1

CCTAG ВатЯ I

(vii)

После встраивания полученного таким образом гена в плаэмиду iUC19(SD2). содержащую дуплекс (VII), мы получили рекомбинантную [лазмиду pUC19(SD2)-IL1ra (рис.8), в которой между EcoRI- и íindiil-сайтами заключен ген IL-Ira и предшествующий ему |истальный фрагмент составного цистрона вектора pPR-TGATG, жлючающий SD-последовательность: при этом стоп-кодон этого (истрона перекрывается с инициирующим кодовом гена lL-)ra. ScoRí/ ЯйяйШ-фрагмент полученной нами конструкции был !ереклойирован в pPR-TGATG-вектор И.Б.Ломакиным (ВНИИ Генетика) с )бразованием двуцистронного "оверлапона" с перекрывающимися ;топ- и старт-кодонами. Штамм, несущий рекомбинантную плаэмиду 3PR-TGATG-IL1га и продуцирующий IL-1ra (до 10% общего клеточного 5елка), был передан во ВНИИОЧБ для промышленного использования.

Рис.8. Схема клонирования гена IL-1ra.

I.:;. Клонирование и ткопрепоия гена il.-ir.i в векторе ptJEMI Наряду о конструированием двуцнсгронного оверлапонп мы клонировали синтезированный нами FcoRl. Ш/кЯП-.&рагмент илазннды pi'f !•> ( Sl)2 ) - II, I га : геном IL-1га (он. раздел i.2.) в вектор pGEM 1 под контроль одного из наиболее сильных црокариотнческпх промоторов - позднего промогорп <пага Г7 (рис.8). В качестве хозяина использовали штамм E.coli BL21(DE3)i содержащий в составе бактериальной хромосомы ген РНК-полпмераэы этого tpara под контролем индуцируемого ijc-промотора. Ряд клонов, несущих рекомбннантнун) плазмнлу рОЕМ1(SD2)-IL1га, исследовали на способность продуцировать белок с мол. массой 17 кДа. выращивая биомассу с индукннен IPTG н анализируя клеточные лнзаты гель-члектрофорезом в денатурирующих условиях. При использовании свежих Iранешормантов для засева культуральной жидкости (среда (.В) н ч индукипи мн получили лнзаты клеток, содержащие 13S

'"■елка чю питым сканирования геле» на спектрофотометре Gilford) мол. массой 17 кДа (рис.1)).

Нмнуноблогннг гелей, проведенный нами в лаборатории О.А.Кетлинского (ВНПМОЧБ, С.-Петербург), показал специфическое связывание этого белка с поликлоналышми антителами к XL— let (рис.it>). Учитывал некоторую (19«) гомологи» этих двух белков, а также сходные вторичные структуры (Stockmatt ас jl., 1992), можно n<iii:>) а гк. «го синтезирующийся в полученной конструкции, не челок

присущий E.coli антагонистом IL-1

действительно

являегол

I шпеи 1 irptitiM-

кЛа

46 ,0-4

30,0-

Рнс.9. Электрофорез белков лизатов E.coli BL2KDE3) с pGEM1(SD2)-IL 1 га в ПААГ-SDS;

1 - без индукции, 21,

2 - ) ч индукция

г р ТС,. ! 4 ,

Рис. 'О. Япмуноблотинг белков лизата E.coli BL21(DE3) с pGEMI(SD2)-ILlra;

1 - пммуноблотннг о поликлоналышми антителами к iL-la,

2 - белки лизата,

3 - молекулярные ILlra ^IL1 га маркеры (содержимое

карманов 2 и 3

окрашено

ампдочерним).

1 2

^®шективная зкс.нрессия синтезированного в гена rI.-ia была осуществлена К.Р.Бпрпх

настоящей работе в специально

окопе|рунрованном векторе

/силптолем трансляции.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый подход к искусственному синтезу укариотических генов - метод сплайсинга ДНК с помопьс аправленного лигирования (СНЛ).

2. Методом СНЛ с использованием геномной ДНК человека интеэирован безынтронный ген зрелого интерлейкина-1с( человека.

3. Путем амплификации in vitro дуплексов мРНК-кДНК получены езынтронные гены двух зрелых белков-цитокинов человека нтерлейкина-1ct и его рецепторного антагониста.

4. С использованием созданных геино-ннженерных конструкций юуществлена экспрессия гена рецепторного антагониста штерлейкина-1 в бактериальной системе.

Основные результаты диссертации изложены в следующих печатных работах:

1. Лебеденко Е.Н., Плуталов О.В., Берлин Ю.А. Синтез гена зрелого ннтерлейкина-id человека путем амплификации in vitro дуплекса мРНК-кДНК. Биоорган, химия 1990, 16, 1570-1573.

2. Lebedenko E.N., Plutalov O.V., Berlin Yu.A. Construction of eukaryotic genes by means of polymerase chain reaction: a gene encoding human interleukin Id. Collection Czech. Chem. Commun.

1990, 55, Spec. Issue I, 269-272.

3. Berlin Yu.A., Lebedenko E.N., Plutalov O.V., Boreskov Yu.G An approach to the synthesis of functionally active polydeoxy-nucleotides using DNA amplification in vitro. Proceedings of the 9tli International Round Table "Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Application", Uppsala, 1990, p.66.

4. Lebedenko E.N., Plutalov O.V., Berlin Yu.A. Approach to the synthesis of functionally active polydeoxynucleotides using DNA amplification in vitro. Nucleosides and Nucleotides, 1991, 10, 631-632.

5. Lebedenko E.N., Birikh K.R., Plutalov O.V., Berlin Yu.A. Synthesis and modification of genes through artificial splicing -by—Hirprt-fid ligation (ASDL) ■ Nucleic Acids Symposium Series,

1991, Ho. 24, 215-216~

6. Lebedenko E.N., Birikh K.R., Plutalov O.V., Berlin Yu.A. Method of artificial DNA splicing by directed ligation (SDL). Nucleic Acids Res. 1991, 19, 6757-6761.

7. Берлин Ю.А. Лебеденко E.H., Бирих К.P., Плуталов О.В. Искусственный сплайсинг ДНК с помощью направленного лигирования. Биоорган, химия 1992, 18, 217-225.

8. Лебеденко Е.Н., Берлин Ю.А. Синтез гена антагониста рецептора ннтерлейкина-1 с помощью полимеразной цепной реакции. Биоорган. ХИМИЯ 1993, 19, 586-588.

9. Лебеденко Е.Н., Бирих К.Р., Беккер М., Берлин Ю.А. Синтез и прокариотическая экспрессия гена рецепторного антагониста ннтерлейкина-1 человека. Биоорган, химия 1994, 20, 944-954.