Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

MOB(TMEM 23)-новый ген человека: особенности строения и функционирования

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "MOB(TMEM 23)-новый ген человека: особенности строения и функционирования"

На правахрукописи

ВЛАДЫЧЕНСКАЯ Ирина Петровна

МОВ (ТМЕМ23) - НОВЫЙ ГЕН ЧЕЛОВЕКА: ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Института Молекулярной Генетики РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Л. В. Дергунова Научный консультант:

доктор биологических наук, проф. С. А. Лимборская

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. М. Б. Евгеньев кандидат биологических наук Н. С. Куприянова

Ведущая организация:

Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН

Защита состоится // /Л "" на заседании Диссертационного совета

Д 002.235.01 в Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан /Я/О, 2004 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета Канидат химических наук

ZDDS--4 4S2{ 9

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

По предварительным оценкам, геном человека включает не менее 30 тысяч генов, из которых в настоящее время изучено менее половины. Поиск и идентификация неизвестных генов человека и исследование их структурно-функциональных особенностей, а также характеристика кодируемых ими белковых продуктов является одним из наиболее актуальных направлений современной молекулярной биологии. Выявление всех генов человека, установление карты тканеспецифичности их экспрессии, построение картины их взаимодействия будут являться факторами, которые предопределят переход молекулярной биологии на новый, более высокий уровень - уровень интегративного анализа (Свердлов, 1999), а также дадут более глубокое понимание природы физического и психического здоровья человека и откроют новые пути для развития медицины.

Широкомасштабные исследования, в результате которых стали известны полные последовательности геномов многих организмов, в том числе человека (Venter et al., 2001; Lander, 2001), предоставляют возможность быстро и эффективно решать проблему поиска новых, еще не описанных генов, и кодируемых ими белковых продуктов (Strausberg and Austin, 1999). В частности, анализ баз данных геномных и экспрессирующихся последовательностей человека, проводимый методами современной биоинформатики, позволяет вычленять последовательности, соответствующие отдельным генам, в их числе неизвестным ранее, а также получать информацию, касающуюся структуры и локализации этих генов.

Особый интерес представляет идентификация и анализ генов, специфически экспрессирующихся в различных тканях и определяющих особенности их функционирования. Уникальным объектом исследования является головной мозг человека. Отличительным свойством этого органа является то, что в нем, по сравнению с другими органами, имеется наибольшее количество морфологически и функционально различающихся клеточных популяций. Они осуществляют разнообразные функции, для реализации которых требуется множество белковых продуктов, и, следовательно, экспрессия очень большого числа генов. Таким образом, поиск новых генов и генных семейств, определяющих специфичность функционирования биохимических систем мозга и их регуляции, является актуальным

Цель и задачи исследования

Ранее для выявления генов, специфически экспрессирующихся в мозге, на основе полиаденилированной фракции РНК некоторых отделов головного мозга человека в Отделе молекулярных основ генетики человека ИМГ РАН были получены клонотеки кДНК. Дифференциальный скрининг клонотек позволил отобрать несколько клонов, в том числе НmobЗЗ (клон № 33 из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека, human medulla oblongata), последовательности которых экспрессировались преимущественно в головном мозге человека (Буякова и соавт., 1992).

В целях выявления и идентификации гена, активного преимущественно в тканях головного мозга человека и включающего в себя последовательность НmobЗЗ, а также для изучения его структурной организации и особенностей функционирования были поставлены следующие задачи:

• Определить первичную структуру экспрессирующейся последовательности НmobЗЗ и сравнить ее с последовательностями ранее изученных генов;

• Установить нуклеотидную последовательность транскрипта, включающего последовательность НmobЗЗ, и охарактеризовать структурную организацию соответствующего гена;

• Провести анализ экспрессии гена, включающего последовательность НmobЗЗ, в разных тканях человека;

• Определить in silico предполагаемую структурную организацию белковых продуктов, кодируемых исследуемым геном;

• Провести филогенетический анализ обнаруженного гена.

Научная новизна и практическая ценность работы

Обнаружен неизвестный ранее ген человека MOB (ТМЕМ 23), гипотетический белковый продукт которого совпадает с недавно идентифицированной последовательностью фермента фосфатидилхолин-церамид холинфосфотрансферазы 1 (сфингомиелинсинтетазы 1).

Впервые описана хромосомная локализация и геномная структура гена MOB (ТМЕМ 23), а также охарактеризованы особенности организации наиболее представленного транскрипта данного гена.

Впервые исследована транскрипционная активность гена MOB (ТМЕМ 23) и показано, что изучаемый ген экспрессируется в широком спектре тканей человека.

Обнаружено участие процессов альтернативного сплайсинга в регуляции функционирования изучаемого гена; идентифицированы и охарактеризованы два альтернативно сплайсируемых транскрипционных варианта мРНК MOB (ТМЕМ23).

Высказаны предположения о механизмах, регулирующих уровень активности гена MOB (ТМЕМ23) в организме.

Выявлено неизвестное ранее древнее семейство генов, включающее в свой состав MOB (ТМЕМ23), а также показана эволюционная консервативность белковых продуктов, кодируемых генами этого семейства.

Результаты исследования гена MOB (TMEM23), позволившие идентифицировать два альтернативных транскрипта гена с преимущественной экспрессией в мозговых тканях человека, представляют большой интерес с позиций определения вклада отдельных генов и их белковых продуктов в осуществление процессов, протекающих в головном мозге.

Идентификация MOB (TMEM23) как гена, кодирующего сфингомиелинсинтетазу 1 - фермент, регулирующий мощность воздействия на клетку про-апоптотического медиатора церамида, имеет большое значение для дальнейшего изучения механизмов регуляции процессов апоптоза клетки. Информация о структуре данного гена весьма значима для дальнейшего изучения особенностей его транскрипции. Сведения о характере организации мРНК MOB позволяют сформулировать гипотезу относительно механизмов регуляции активности данного гена и разработать подходы к изучению влияния 5'- и З'-НТО на эффективность его экспрессии. При возникновении необходимости изучения функциональных свойств гена MOB (TMEM23) in vivo методом его инактивации, информация о существовании белков-паралогов Mob, один из которых, возможно, выполняет функции, сходные с функциями Mob, позволит создать адекватную экспериментальную модель. Консервативность белкового продукта MOB в ряду ортологов предоставляет возможность достаточно широкого выбора модельных объектов для изучения роли сфингомиелинсинтетазы 1 в работе сфингомиелинового цикла.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на ежегодных научных конференциях Института молекулярной генетики (1996-2003), ежегодных конференциях Американского Общества Генетики Человека ASHG (1997; 1998; 2000; 2001 гт),

Европейского Общества Генетики Человека ESHG (2000; 2001; 2002; 2003 гг), HUGO (2001; 2002 гг), а также на III съезде биохимического общества (2002 г). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 24 печатных работы, в том числе 6

статей.

Структура и объем работы

Диссертация изложена нг//0страницах, содержит^рисунков и ^таблицы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы {/0J наименований).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первичную структуру НтоЬЗЗ определяли методом Сэнгера; изучаемая последовательность была локализована на хромосоме 10 человека при помощи картирующей панели ДНК гибридных клонов соматических клеток "человек-грызун".

Анализ при помощи программ ORFinder и DNASIS не выявил в составе последовательности НтоЬЗЗ открытых рамок считывания. Сравнение НтоЬЗЗ при помощи программы BLAST с последовательностями, депонированными в базе данных ГенБанк, не обнаружило сходства НтоЬЗЗ с известными генами. На основании этих результатов, а также учитывая то обстоятельство, что при создании клонотек кДНК использовались олиго^Т)-праймеры, мы предположили, что НтоЬЗЗ является фрагментом З'-нетранслируемой области мРНК неизвестного гена. Анализ баз данных EST позволил выявить большое количество анонимных экспрессирующихся последовательностей человека, полностью совпадающих с НтоЬЗЗ. Ряд последовательностей EST соответствовали 5'-концевой области НтоЬЗЗ, однако большая их часть совпадала с 3'- концевой областью НтоЬЗЗ. Ни одна из EST не удлиняла последовательность НтоЬЗЗ в 3'-направлении. Среди EST, совпадающих с 5'- концевой областью НтоЬЗЗ, была обнаружена анонимная последовательность АК026683, удлиняющая НтоЬЗЗ в 5'-направлении на 1632 п.н. (Рис1А). В свою очередь, анонимная последовательность BI752115 удлиняла АК086683 в 5'-направлении на 501 нуклеотид, а анонимная последовательность ВМ746008 удлиняла BI752115 в 5'- направлении на 34 нуклеотида. Во всех указанных случаях перекрывающиеся последовательности были сходны друг с другом не менее чем на 98%. Из перекрывающихся последовательностей клонов НтоЬЗЗ (Y14155), АК026683, BI752115, ВМ746008 сконструировали контиг протяженностью 3734 нукл. (ГенБанк,

1 35 М-

1 98 200 I I I

1633

2236

-1 AK026683

50.26S1 722 BI7S2115

535 634 ■ ■ BM746008

955

2193

НтоЬЗЗ (Y14155)

3734

BN000143

Б

// S S

_

H

14ИЙ

¡1 П Ш Ц-

IV V VI

vn Vin IX X

XI

320 Т.П.Н.

955

2193

В II II

(И HI

JLZ

3734 нукл.

Рисунок 1. In silico реконструкция гена MOB. (А). Построение контига BN000143 с использованием последовательностей, удлиняющих НтоЬЗЗ в ¿'-направлении. Цифрами обозначены области перекрытия последовательностей. (Б).Экзон-интронная структура гипотетического гена MOB. (В). Структурная организация гипотетического транскрипта MOB. Экзоны показаны в виде прямоугольников, интроны — в виде прерывистых линий. Черным цветом обозначена кодирующая область; треугольники обозначают функционально активные сайты полиаденилирования, овалы - ARE, заштрихованные области - дополнительные рамки считывания.

BN000143) В составе его последовательности обнаружили кодирующую область, фланкированную нетранслируемыми областями (Рис 1А) Было высказано предположение о том, что реконструированный т silico контиг представляет собой гипотетический транскрипт (или один из транскриптов) нового, не известного ранее гена человека, условно названного геном MOB (официальное номенклатурное название - ТМЕМ23)

Геномная организация гипотетического транскрипта MOB Для выявления геномного аналога гипотетического транскрипта MOB проводили сопоставление последовательности BN000143 с нуклеотидными последовательностями хромосом человека из баз данных Human Genome и HTGS при помощи программы BLAST Обнаружены два независимых геномных клона десятой хромосомы (АС012131 и АС069547), при сопоставлении с которыми последовательность BN000143 распадалась на одиннадцать отдельных, не перекрывающихся между собой фрагментов, предположительно представляющих собой экзоны гена MOB Таким образом, в состав гена MOB входит, по меньшей мере, одиннадцать экзонов (Рис 1Б) Размер гена MOB составляет около 320 т п н, его локализация на десятой хромосоме человека -область10q11 2

Структурная организация гипотетического транскрипта MOB. В состав реконструированного т silico транскрипта MOB (3734 нукл) входит предполагаемая кодирующая область (1239 нукл), фланкированная протяженными 3'- и 5'-нетранслируемыми областями (НТО)

Мультиэкзонная 5'-НТО (954 нукл, экзоны I-VI и частично VII) (Рис 1Б, В) содержит в своем составе три короткие открытые рамки считывания, локализующиеся в последовательностях экзонов I, V и VI Экзон I обогащен гуанином и цитозином (73%) В базе данных EST присутствуют последовательности, представляющие альтернативно сплайсируемые 5'-НТО гена MOB Кодирующая область транскрипта MOB начинается со "слабого" ATG-кодона (нуклеотидный контекст - AGTACAATGA) Указанные черты, характеризующие 5'-НТО и стартовый ATG-кодон транскрипта MOB, позволяют предположить, что активность данной мРНК специфически контролируется на пост-транскрипционном уровне, обеспечивая возможность ингибирования синтеза белкового продукта гена Такой тип регуляции описан для мРНК генов, кодирующих регуляторные белки - протоонкогены, ростовые факоры и их рецепторы, белки гомеодоменов и др, и является особо значимым в процессах эмбриогенеза (van der Velden and Thomas, 1999, Meyer et al, 2000)

З'-НТО (1538 нукл.) целиком принадлежит экзону XI гена MOB (Рис.1 Б, В), является АТ-богатым участком последовательности (содержание А и Т составляет 70%) и содержит большое количество поли(А)- и поли(Т)-трактов. Последовательность З'-НТО содержит шесть канонических сигналов полиаденилирования ААТААА. Анализ распределения EST человека относительно последовательности З'-НТО транскрипта MOB подтвердил функциональную активность трех сайтов из шести. В составе последовательности З'-НТО, между вторым и третьим функционально активными сайтами полиаденилирования, обнаружены шесть пентануклеотидных мотивов АТТТА, возможно, представляющих собой участки AU-богатых элементов (ARE), известных как детерминанты нестабильности транскриптов. (Рис.1 Б, В). Мы предполагаем, что в зависимости от конкретных условий ген MOB способен образовывать транскрипты, отличающиеся друг от друга по степени стабильности. Таким образом, анализ совокупности структурных черт, характеризующих последовательность транскрипта MOB, позволяет предполагать, что последний является короткоживущей молекулой, трансляционная активность которой жестко контролируется. Выявление транскриптов гена MOB в тканях человека. Реконструированный in silico транскрипт MOB идентифицировали в тканях человека при помощи ОТ-ПЦР на препаратах тотальной РНК мозжечка человека. Для всех реакций использовался один и тот же прямой праймер, отжигающийся на последовательности предполагаемого экзона I; обратные праймеры соответствовали участкам V, VI, VII, VIII, IX, X и XXI экзонов (Рис. 2А). Электрофоретическое разделение продуктов амплификации выявило фрагменты ДНК ожидаемых размеров для каждой из пар праймеров: F1/R1 - 402 п.н.; F1/R2 - 580 п.н.; F1/R3 - 718 п.н.; F1/R5 -1497 п.н.; F1/R6 -1647 п.н.; F1/R7 -1771 п.н.; F1/R9 - 2338 п.н. (Рис.2Б) Нуклеотидная последовательность одного из них, полученного при помощи праймеров к экзонам I/X, полностью совпадала с соответствующей областью гипотетической последовательности MOB. Таким образом, экспериментальные данные подтвердили существование предсказанного in silico транскрипта MOB и, следовательно, функциональную активность соответствующего гена. В этой же серии экспериментов для каждой из пар праймеров, соответствовавших экзонам I/VIII, ИХ, I/X, I/XI, наряду с ожидаемыми продуктами амплификации, был выявлен набор дополнительных, менее представленных фрагментов ДНК (Рис. 2Б, дорожки 4-7). Для каждой из упомянутых пар праймеров характер распределения дополнительных продуктов амплификации вдоль дорожки полиакриламидного геля, а также их локализация относительно основных продуктов оставались относительно

А

и in iv v vi

Fl*-

VIII IX

XI

1R8

нукл

2443-2140-^2 1986-" 1700-

M 1 2 3 4 5 6 7

1159__

1093— —

805 --

514 468

448 -

«M

339 ---

Рисунок 2. Обнаружение транскриптов гена MOB методом ОТ-ПЦР с использованием кДНК мозжечка человека. (А) Схематическое изображение локализации праймеров относительно последовательности транскрипта MOB и размеров ожидаемых продуктов ПЦР. (Б) Распределение продуктов ПЦР в 6% ПААГ. М - ДНК фага X, рестрицированная по сайтам Pstl; 1 - праймеры F1/R1; 2 - F1/R2; 3 - F1/R3; 4 - F1/R5; 5 - F1/R6; 6 - F1/R7; 7-F1/R8.

постоянными. Появление "минорных" полос на электрофореграмме расценивали как свидетельство существования альтернативно сплайсируемых транскриптов гена MOB.

Разница между длиной амплифицированного фрагмента самого короткого альтернативного транскрипта и длиной фрагмента основного транскрипта для всех упомянутых пар праймеров была приблизительно одинакова и соответствовала размеру экзона VII. Мы предположили, что самый короткий продукт амплификации соответствует фрагменту альтернативного транскрипта гена, лишенного экзона VII. Подтверждением нашего предположения явились результаты секвенирования соответствующего фрагмента ДНК, амплифицированного при помощи праймеров к экзонам I/X, а обнаруженный альтернативный транскрипт получил условное обозначение МОВ\.

На возможность существования в пуле мозжечковой РНК еще двух альтернативных транскриптов, отличных от описанных выше, указывали результаты гибридизации продуктов амплификации, полученных при помощи праймеров к экзонам I/XI, с меченым клоном НтоЬЗЗ. На радиоавтографе вместо двух ожидаемых определялось четыре радиоактивных сигнала (Рис. 3). Наиболее интенсивный из них был расположен между маркерными фрагментами размером 2,1 и 2,4 т.п.н. и соответствовал продукту амплификации основного транскрипта и ко-мигрирующим с ним в агарозном геле фрагментам альтернативных транскриптов сходной длины (на полиакриламидном геле эти продукты амплификации выглядели как набор "минорных" полос, сгруппированных вокруг "мажорного" фрагмента). Сигнал, расположенный несколько ниже маркерного фрагмента размером 1,7 т.п.н., соответствовал продукту амплификации альтернативного транскрипта МОВ\. Два дополнительных сигнала (между 1,09 и 1,16 т.п.н.; меньше 0,8 т.п.н.) выявляли продукты амплификации, не обнаруживаемые на акриламидном геле при окраске серебром. Мы предположили, что дополнительные гибридизационные сигналы могли соответствовать низко представленным в препарате мозжечковой РНК альтернативным транскриптам гена MOB. С другой стороны, нельзя исключать, что эти сигналы отражают присутствие продуктов деградации РНК.

Основываясь на совокупности представленных данных, можно предположить, что в препаратах мРНК мозжечка человека присутствует набор альтернативно сплайсируемых форм мРНК гена MOB. Альтернативные комбинации экзонов, выявленные в условиях эксперимента, затрагивали кодирующую область гена, по всей

А

Рисунок 3, Подтверждение специфичности фрагментов транскриптов гена MOB, амплифицированных при помощи праймеров F1/R8 на кДНК мозжечка человека. (А). Схематическое изображение локализации праймеров относительно транскрипта MOB. (Б). Электрофорез продуктов амплификации в 6%-ном ПААГ. (В). Саузерч-блот гибридизация продуктов амплификации с радиоактивно меченой плазмидой, содержащей вставку клона НшоЬЗЗ. Стрелками обозначены фрагменты ДНК, выявляемые как при окраске серебром, так и в результате гибридизации с радиоактивно меченым зондом. Указан размер маркерных фрагментов (ДНК фага X, рестрицированная по сайтам Pstl).

вероятности, обеспечивая разнообразие функциональных форм кодируемого белка в пределах ткани мозжечка.

Определение точек старта транскрипции и поиск промоторных областей гена MOB. Точки старта транскрипции гена MOB определяли методом удлинения праймера в ревертазной реакции (primer extension) на полиаденилированной фракции мРНК мозжечка. Исходно в эксперименте использовался набор праймеров, отжигающихся на последовательность экзона I; продукты ревертазной реакции не были получены ни для одного из них (Рис. 4А). Отсутствие продуктов в этом случае мы объясняем неэффективностью гибридизации между праймерами и GC-богатой последовательностью экзона I мРНК гена MOB. В следующей серии экспериментов отжиг специфического праймера R2 осуществляли на последовательности экзона VI, характеризующегося низким содержанием G и С (Рис. 4А). На радиоавтографе продуктов реакции, фракционированных в денатурирующем полиакриламидном геле, определялось два четких сигнала различной интенсивности (Рис.4Б). Сигнал низкой интенсивности соответствовал однонитевому продукту размером около 700 нуклеотидов и расценивался как ожидаемый фрагмент. Дополнительный сигнал имел высокую интенсивность и соответствовал фрагменту протяженностью около 350 нуклеотидов. Разделение продуктов реакции в денатурирующем геле с использованием в качестве маркера продуктов секвенирования ДНК плазмиды pUC19 позволило определить размер дополнительного фрагмента (339 нуклеотидов) (Рис. 4В). Появление дополнительного сигнала, вероятнее всего, явилось следствием существования в пуле мозжечковой РНК еще одного или нескольких новых типов транскриптов гена MOB, для синтеза которых используется альтернативный сайт инициации транскрипции. Предполагаются два варианта локализации этого сайта. Первый вариант предусматривает, что точка инициации транскрипции совпадает с началом экзона III, так как именно расстояние в 339 нуклеотидов отделяет З'-конец праймера R2 от 5'-конца экзона III. Этот вариант правомерен в том случае, если 5'-нетранслируемая область альтернативного транскрипта, как и транскрипта MOB, включает в себя непрерывную последовательность, состоящую из экзонов III, IV, V и VI. Второй вариант предусматривает возможность существования альтернативно сплайсируемых вариантов 5'-НТО гена, в формировании которых могут принимать новые неохарактеризованные экзоны, также входящие в структуру гена MOB. Последовательности EST, совпадающие с определенными областями интронов I и И, действительно указывают на возможное существование таких экзонов.

И

А

1 II I1IIVV VI

Б В

G А T С 1

Рисунок 4. Определение точек инициации транскрипции гена MOB методом удлинения праймера в 5'-направлении. (А). Схематическое изображение локализации использованных праймеров. Перечеркнутой стрелкой обозначено отсутствие продуктов в реакции. (Б). Электрофоретическое разделение продуктов реакции в 8%-ном денатурирующем ПААГ (низкое разрешение). М - ДНК фага фХ174, рестрицированная с помощью Hinfl; 1 - продукты реакции удлинения праймера. Черная стрелка указывает на фрагмент ожидаемого размера, белая - на дополнительный фрагмент. (В) Электрофоретическое разделение продуктов реакции в 8%-ном денатурирующем ПААГ (высокое разрешение). G, А, Т, С - маркерные дорожки, соответствующие продуктам секвенирования ДНК плазмидыриС 19; 1 -продукт реакции. Белая стрелка указывает на дополнительный фрагмент.

Полученные нами результаты показывают, что, по меньшей мере, два сайта инициации транскрипции гена MOB активны в мозжечке человека. Вероятнее всего, их активность определяется наличием двух промоторов, один из которых локализуется перед экзоном I; местом локализации второго может быть интрон II.

Анализируя геномные последовательности, фланкирующие 5'-концы экзона I и экзона III MOB, при помощи программы GENOMATIX, мы провели поиск соответствующих промоторов гена. Компьютерный анализ не выявил промоторных последовательностей в геномной области перед экзоном III; это обстоятельство, однако, не может свидетельствовать об их фактическом отсутствии. Гипотетические промоторная область, располагающаяся внутри протяженного CpG островка, была обнаружена перед последовательностью экзона I. В составе последовательности предполагаемой промоторной области не был идентифицирован ТАТА-бокс; отсутствие этого цис- элемента отмечено для промоторов повсеместно экспрессирующихся генов, или "генов домашнего хозяйства" (Azizkhan et al., 1993; Cross and Bird, 1995).

Анализ экспрессии транскриптов MOB и М0В1 в различных тканях человека.

Сопоставив данные, полученные на основании анализа гипотетических промоторов гена MOB, а также данные компьютерного анализа, показавшие, что последовательность транскрипта MOB совпадает с рядом экспрессирующихся последовательностей из клонотек кДНК широкого спектра тканей человека, мы пришли к выводу, что ген MOB транскрибируется во многих органах и тканях. Исходно для идентификации тканей, экспрессирующих MOB, мы воспользовались методом Нозерн-блот гибридизации; эксперимент проводили на полиаденилированной фракции РНК различных тканей человека. Однако этот подход оказался недостаточно информативным. Так, транскрипт, соответствовавший по размерам транскрипту MOB, был выявлен только в препаратах мозжечка и продолговатого мозга человека. В препаратах мРНК почки и мышечной ткани продукты гибридизации обнаружить не удалось, что, вероятнее всего, свидетельствовало низком уровне транскрипции гена MOB в указанных тканях, и о недостаточной чувствительности выбранного метода детекции. Впоследствии для анализа экспрессии MOB и МОВ\ мы применили значительно более чувствительный метод ОТ-ПЦР; для анализа MOB использовались праймеры, специфичные к последовательности экзона VII (Рис. 5), а для анализа МОВ\ - праймеры к экзонам VI и VIII. Присутствие транскрипта MOB (Рис.5), а также МОВ\

XI

—Tf-

1 2 3 4 5 6 7 8 M нукл.

'у,--* *' ' >':■ ■ * "ЛЙИЙ_448

410 п.н. ^

294 п.н. шш м» w w w— 339

ы —264 ~248

Рисунок 5. Анализ экспрессии транскрипта MOB в различных тканях человека методом ОТ-ПЦР; схематическое изображение локализации праймеров F6/R4 относительно транскрипта MOB и соответствующая электрофореграмма амплифицированных фрагментов в 6%-ном ПААГ. 1 - мозжечок, 2 - лобная кора. 3 -гиппокамп, 4 - почка, 5 - легкое, б - печень, 7 - лимфатический узел, 8 - селезенка. Закрашенная стрелка указывает на фрагменты транскрипта MOB, незакрашенная - на фрагменты ß2-MT. Приведены размеры фрагментов маркера (ДНК фага X, рестрицированная с помощью Pstl).

I II ШIV V VI VII VIII IX х

было показано в препаратах РНК мозжечка, лобной коры, гиппокампа, лимфатического узла, селезенки, печени, почки и легкого человека. Полученные данные подтверждали, что экспрессия гена MOB не является тканеспецифичной.

При помощи этой же серии экспериментов мы сопоставили между собой уровни экспрессии MOB и МОВ\, а также проанализировали изменения уровня экспрессии каждого из этих транскриптов в ряду исследуемых тканей. Уровень экспрессии транскриптов гена MOB в каждой ткани оценивали относительно "внутреннего контроля" - уровня экспрессии гена ß2-микроглобулина, характеризующегося относительно постоянной активностью в разных тканях (Lupberger et al., 2002). Для всех тканей были подобраны единые наиболее оптимальные условия ПЦР, при которых количество продуктов реакции исследуемого и контрольного транскрипта находилось в линейной зависимости от числа циклов и количества использованной матрицы; соблюдние этих условий сделало возможным проведение сравнительного анализа. Как показали результаты исследования, уровень экспрессии транскрипта MOB в тканях существенно различается. Наиболее активно MOB экспрессируется в мозговых тканях и почке, наименее активно - в тканях селезенки, лимфоидной ткани и печени человека, уровень экспрессии MOB в легком занимает промежуточное положение (Рис. 5). Активность экспрессии транскрипта МОВ1 во всех исследованных тканях ниже, чем активность MOB, однако профиль изменения уровня его экспрессии в ряду исследованных тканей в целом повторяет таковой для MOB.

In silico определение и анализ предполагаемых белковых продуктов, кодируемых транскриптами гена MOB. Поиск открытых рамок считывания нуклеотидных последовательностей транскриптов MOB и МОВ1 и последующая идентификация кодируемых ими аминокислотных последовательностей позволила нам определить первичную структуру предполагаемых белковых продуктов гена. Полипептид Mob, кодируемый экзонами VII - XI, состоял из 413-и аминокислотных остатков (Рис. 6А); Mobl, кодируемый экзонами VI, VIII - XI, как и ожидалось, имел укороченный N-конец и состоял из 216 аминокислотных остатков (Рис. 6Б). Шаг рамки считывания совпадал у обеих мРНК, поэтому оба полипептида имели совпадающие последовательности, кодируемые экзонами VIII - XI (Рис. 6). Согласно данным компьютерного анализа, обе полипептидные молекулы представляют собой интегральные мембранные белки, различающиеся количеством трансмембранных доменов. Кроме того, в составе N-концевой последовательности Mob, предположительно ориентированной внутрь мембранной структуры, присутствует

А

123456 7 89 10 И

1 234 5 6 8 9 10 И

! I *-*

кодирующая область

Рисунок 6. Схематическое изображение альтернативных транскриптов MOB (А) и МОВ1 (Б) и гипотетической структуры кодируемых ими белковых продуктов, показанной относительно клеточной мембраны. Пронумерованные цилиндры обозначают трансмембранные домены, овал обозначает SAM-домен. Одноименным цветовым оттеноком обозначены совпадающие участки кодирующеР области обоих транскриптов и совпадающие домены обеих белковых молекул (ТМ 3-5), разноименным - отличающиеся участки последовательностей транскриптов и домены белков.

Sterile Alpha Motif-домен (SAM-домен) - структура, задействованная в осуществлении белок-белковых и белок-липидных взаимодействий в процессах передачи клеточных сигналов, а также в процессах регуляции транскрипции, SAM-домен играет важную роль в процессах эмбриогенеза (Schultz et al, 1997, Bork and Koonm, 1998, Barrera et al, 2003) Выведенная нами последовательность Mob полностью совпадает с последовательностью недавно охарактеризованного фермента фосфатидилхолин-церамид холинфосфотрансферазы (сфингомиелинсинтетазы 1), этот факт означает, что идентифицированный нами новый ген MOB по существу является геном, одним из белковых продуктов которого является фермент сфингомиелинсинтетаза 1 (СМС1) Поиск и анализ белков, гомологичных Mob. Компьютерный анализ белковой базы данных NR на сервере BLASTP показал, что последовательность белка Mob полностью совпадает с большим количеством анонимных гипотетических белковых последовательностей, обнаруженным у организмов различных таксономических групп Систематизация выявленных белковых последовательностей показала, что в геноме животных могут существовать функциональные аналоги белка Mob (CMC1) Так, у человека выявлено две последовательности, представляющие собой гипотетические трансмембранные белки MGC26963 и sterile alpha motif domain containing 8, совпадающие с последовательностью Mob на 60% и на 34%, соответственно Значительное сходство этих последовательностей с Mob (CMC1) и друг с другом, общность их структурной организации, а также сходство экзон-интронной структуры кодирующих их генов дают возможность предположить, что Mob (CMC1), MGC26963 и sterile alpha motif domain containing 8 являются белками-паралогами, в совокупности представляющими собой новое семейство трансмембранных белков (В тексте MGC26963 и sterile alpha motif domain containing 8 условно обозначаются как parl Mob и par2 Mob) Следует отметить, что по всем указанным параметрам белок parl Mob все же более сходен с Mob (CMC1), чем par2 Mob Поскольку появление паралогичных белков объясняется дупликацей предкового гена, продуктами эволюционно более молодых дупликаций являются гены и, соответственно, их белковые продукты, дивергировавшие в меньшей степени, чем гены, дуплицировавшиеся на более ранних этапах эволюции (Henikoffet al, 1997, Petsko, 2001, Fitch, 2000, Koonin, 2001, Mirny and Gelfand, 2002) Исходя из этого, можно предположить, что появление белка par2 Mob явилось следствием более раннего события дупликации, чем появление Mob и parl Mob

H. sapiens M. muse uius R norvegicus G. gallus D. melanogaster С. elegans

* Номер кДНК/ Номер белка ! Размер белкового 1 продукта, а--к. ост. Размер экзонов кодирующей области • Номер кДНК/ Номер белка Размер белкового продукта, а.-к. ост. Размер экзонов кодирующей области ' Номер кДНК/ Номер белка Размер белкового продукта, а.-к. ост. Размер ЭКЗОНО& кодирующей области * Номер кДНК/ Номер белка Размер белкового продукта, а.-к, ост. Размер экзонов кодирующей области * Номер кДНК/ Номер белка Размер белкового продукта, а.-к ост. Размер экзонов кодирующей области * Номер кДНК/ Номер белка Размер белкового продукта, а.-к. ост. Размер экзонов кодирующей области

MOB NM 147156 NP_671512 413 854 118 154 167 1718 С ° * V» Z Z 413 843 117 155 169 >1000 _ SS гк iV 413 847 117 155 169 >1000 AY280962 ААР37282 413 846 117 155 169 >1000

pari MOB Я s Я £ •о ас tí 365 702 121 155 166 >100« 5 2 Й О© 2 & z z 365 695 177 155 166 >1000 ХМ 227679 ХР_227679 365 529 117 155 166 >1000

>250 >175 124

593 594 594 121

par2 MOB NM 144660 NP_65326I 326 100 121 7 >1000 2 о я s Й «> Ii' Z Z 478 100 122 152 >1000 ХМ 223784 XPJ23784 497 98 178 151 >1000 NM 139857 NP_648114 600 898 505 167 >1000 g » Ii z z 483 381 146 119 155 НО 139 173

Таблица 1. Экзон-интронная организация кодирующей области и размеры белковых продуктов генов, гомологичных Mob. Жирным шрифтом выделены экзоны, содержащие инициирующий и терминирующий кодоны. "Номера кДНК и белковых последовательностей приводятся в соответствии с номерами ГенБанка.

Присутствие возможных функциональных аналогов Mob (CMC1) предалагается также в организме других животных Ортологи Mob (CMC1) выявляются in silico у мыши, крысы и курицы, у всех указанных организмов белок очень консервативен Группой Huitema et al (Huitema et al, 2004) ортологи СМС1 (Mob) выявлены также у P falciparum и С elegans Ортологи pari Mob (CMC2) обнаружены у С elegans, малярийного плазмодия, мыши и крысы, ортологи раг2 Mob (SMS-related protein) - у С elegans, D melanogaster, мыши и крысы Экзон-интронная организация кодирующей области генов внутри группы ортологов MOB и внутри группы ортологов parl MOB также является очень консервативной, по крайней мере в геноме названных теплокровных животных (Табл 1)

Анализ совокупности аминокислотных последовательностей Mob (CMC1), pari Mob (CMC2) и par2 Mob (SMS-related protein) со всеми относящимися к ним ортологами показало, что все три группы паралогичных белков объединены единым консервативным мотивом, включающим область локализации всех трансмембранных доменов, белки группы Mob (CMC1) и par2 Mob (SMS-related protein) также содержат мотив SAM-домена на их N-концевых последовательностях

Из приведенных данных следует, что белок Mob (CMC1) и его паралоги имеют достаточно древнее происхождение Сходство трех паралогичных белков между собой ("горизонтальное" сходство) указывает на возможную общность выполняемых ими функций Консервативность всех трех указанных белков в ряду их ортологов ("вертикальное" сходство) показывает, что функция, выполняемая каждым из этих белков, также весьма консервативна и присуща широкому спектру живых организмов

ВЫВОДЫ

1 В результате in vitro и in silico исследования клона Hmob33, полученного ранее из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека, обнаружен новый ген В структуре идентифицированного гена, названного MOB (номенклатурное название -ТМЕМ23), Hmob33 представляет З'-некодирующую область Ген MOB {ТМЕМ23) протяженностью 320 т п н располагается на десятой хромосоме человека, в области 10ql 1 2, и состоит, по меньшей мере, из одиннадцати экзонов

2 MOB (TMEM 23) является представителем неизвестного ранее эволюционно древнего генного семейства, включающего три паралогичных гена Экзон-интронная организация кодирующих областей всех трех генов консервативна у представителей теплокровных

3. Транскрипционная активность MOB (TMEM23) характеризуется использованием механизмов альтернативного сплайсинга для синтеза мРНК, различающихся строением как кодирующей, так и 5'-нетранслируемой областей. Идентифицированы два альтернативных транскрипта MOB (TMEM 23); последовательность одного из этих транскриптов включает в себя экзоны I-XI, последовательность второго отличается отсутствием экзона VII.

4. Регуляция функционирования гена MOB (TMEM 23) предположительно осуществляется на нескольких уровнях. Транскрипционный уровень контроля представлен использованием альтернативных промоторов, пост-транскрипционный - синтезом альтернативно сплайсируемых форм транскриптов гена.

5. Ген MOB (TMEM23) экспрессируется в широком спектре тканей человека. Наиболее высокая представленность изученных транскриптов гена показана в тканях головного мозга.

6. MOB (TMEM 23) является геном, кодирующим эволюционно консервативные интегральные мембранные белки. Гипотетическая последовательность белка, кодируемого основным транскриптом, совпадает с недавно идентифицированной последовательностью фермента фосфатидилхолин-церамид холинфосфотрансферазы 1 (сфингомиелинсинтетазы 1). Эти данные позволяют заключить, что нами обнаружен и охарактеризован не изученный ранее ген сфингомиелинсинтетазы 1.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дергунова Л.В., Владыченская И.П., Раевская Н.М., Полукарова Л Г., Леликова ГЛ., Лимборская СА. // Особенности структуры, экспрессии и хромосомная локализация нуклеотидных последовательностей НшоЪЗ и НтоЬЗЗ, полученных из библиотеки кДНК продолговатого мозга человека // Молекулярная биология, 1998, т. 32, №2,с.249-254;

2. Дергунова Л.В., Раевская Н.М., Владыченская И.П., Полтараус А.Б., Климов ЕА., Удина И.Г., Сулимова Г.Е., Лимборская С.А. // Мозгоспецифическая последовательность Hfbl входит в состав протяженной З'-нетранслируемой

области гена комплексина 2 человека новые данные in vitro и in silico экспериментов//Молекулярная биология, 2001, т 35, №5, стр 778-786,

3 Vladychenskaya I Р , Dergunova L V, Limborska S A // In vitro and in silico analysis of the predicted human MOB gene encoding a phylogenetically conserved transmembrane protein//2002, Genet Anal Biomol Eng 18,263-268,

4 Л В Дергунова, Н М Раевская, И П Владыченская, С А Лимборская // Структурно-функциональный анализ кДНК последовательностей Hfbl, Hmob3 и Hmob33 как пример исследования мозгоспецифических генов человека// Молекулярная биочогия, 2003, т 37, №2, с 1-10,

5. Dergunova L V, Raevskaya N М, Vladychenskaya I P, Limborska S A // НтоЬЗ brain-specific sequence is a part of phylogenetically conserved human MAP1B gene 3'untranslated region //Genet Anal Biomol Eng , 2003,20(3), 91-96,

6. Vladychenskaya I P, Dergunova L V, Dmitrieva V G , Limborska S A // Human gene MOB structure specification and aspects of transcriptional activity // Gene, 2004, 338(2) 257-65

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Владыченская, Ирина Петровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы б

1.2. Цель и задачи исследования

1.3. Научная новизна

1.4. Практическая значимость работы ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Поиск новых генов

2.1. Биохимические методы

2.1.1. Традиционный подход к выявлению новых генов

2.1.2. Обратная генетика - еще один подход к поиску новых генов

2.1.2.1. Позиционное клонирование

2.1.2.2. Анализ клонотек кДНК и поиск генов тканеспецифических белков

2.1.2.3. Глобальные методы исследования экспрессии и их вклад в обнаружение новых генов

2.1.2.3.1. Поиск новых генов с помощью метода дифференциального дисплея мРНК

2.1.2.3.2. Поиск новых генов при помощи экспрессионных ДНК-микрочипов

2.2. Компьютерные методы

2.2.1. Секвенирование генома человека и совершенствование методов биоинформатики - возможность принципиально нового подхода к поискам генов

2.2.2. Использование базы данных экспрессирующихся последовательностей (EST) для поиска новых генов

2.2.2.1. Глобальные стратегии поиска новых генов in silico, или "количественный поиск"

2.2.2.1.1. Использование последовательностей клонотек кДНК для клонирования in silico

2.2.2.1.2. Клонирование in silico путем сопоставления протяженных геномных последовательностей с последовательностями EST

2.2.2.2. Направленный поиск генов, или "качественный поиск"

2.2.3. Уточнение структуры генов компьютерными методами

2.2.3.1. Определение экзон-интронной структуры генов

2.2.3.2. Поиск альтернативных продуктов транскрипции генов, клонированных in silico

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Клонирование последовательности кДНК НшоЬЗЗ

3.1.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и векторы для клонирования

3.1.2. Среды и растворы

3.1.3. Выделение однонитевой формы ДНК бактериофагов

М13 тр18 и М13 тр

3.1.4. Выделение двунитевой формы ДНК бактериофагов М13 шр18 и М13 тр

3.1.5. Выделение ДНК рекомбинантной плазмиды pUC со вставкой клона НшоЬЗЗ

3.1.6. Рестрикция плазмидной и фаговой ДНК

3.1.7. Клонирование фрагментов последовательности

НтоЬЗЗ в ДНК бактериофага М

3.1.7.1. Препаративное разделение фрагментов ДНК в агарозном геле

3.1.7.2. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля и их последующая очистка

3.1.7.3. Обработка препаратов векторной ДНК бактериальной щелочной фосфатазой

3.1.7.4. Получение рекомбинантных молекул фага М

3.1.7.5. Получение компететных клеток

3.1.7.6. Трансформация компетентных клеток

3.2. Определение первичной структуры клона НтоЬЗЗ методом секвенирования по Сэнгеру

3.3. Электрофоретическое фракционирование продуктов реакции секвенирования ДНК

3.4. Локализация последовательности клона НтоЬЗЗ на хромосомах человека

3.4.1. Олигонуклеотидные праймеры

3.4.2. Условия амплификации

3.4.3. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР

3.5. Выделение РНК из тканей человека

3.5.1. Выделение тотальной РНК

3.5.2. Получение полиаденилированной фракции мРНК хроматографией на микроколонках с олиго(dT)-целлюлозой

3.6. Нозерн-блот гибридизация

3.6.1. Фракционирование образцов в агарозном геле и перенос РНК на гибридизационный фильтр

3.6.2. Получение 32Р-меченого зонда

3.6.3. Гибридизация мРНК, иммобилизованной на фильтрах, с меченым зондом

3.7. ОТ-ПЦР

3.7.1. Обработка препаратов тотальной РНК ДНКазой I

3.7.2. Синтез одноцепочечной кДНК

3.7.3. Условия амплификации

3.7.4. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР в ПААГ

3.8. Саузерн-блот гибридизация

3.8.1. Фракционирование продуктов ОТ-ПЦР в агарозном геле

3.8.2. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр

3.9. Секвенирование продуктов ОТ-ПЦР

3.9.1. Элюция продуктов ОТ-ПЦР из ПААГ

3.9.2. Автоматическое секвенирование

3.10. Удлинение праймера (Primer extension)

3.10.1. Получение 32Р-меченого маркера и олигонуклеотидных праймеров

3.10.2. Гибридизация меченых праймеров с поли(А)+ фракцией мРНК

3.10.3. Реакция удлинения праймера

3.10.4. Электрофоретическое фракционирование продуктов реакции удлинения праймера

3 .11 .Компьютерные методы анализа

3.11.1. BLAST-анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей

3.11.1.1. Удлинение последовательности НтоЬЗЗ

3.11.1.2. Поиск белковых последовательностей, гомологичных гипотетическому белку Mob

3.11.2. Поиск и анализ предполагаемых промоторных областей

3.11.3. Поиск открытых рамок считывания и компьютерная трансляция нуклеотидных последовательностей

3.11.4. Анализ структуры предполагаемых белковых продуктов

3.11.4.1. Поиск трансмембранных доменов

3.11.4.2. Выявление известных функциональных мотивов, присутвующих в послеовательности белка Mob

3.11.5. Выравнивание последовательнотей белков-гомологов Mob

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Определение нуклеотидной последовательности клона НшоЬЗЗ

4.2. Локализация последовательности клона НшоЬЗЗ на хромосомах человека

4.3. In silico анализ последовательности клона НшоЬЗЗ и участка геномной последовательности, фланкирующего его с 3'-конца

4.4. In silico конструирование контига НМОВЗЗ гипотетического транскрипта гена MOB)

4.5. In silico определение экзон-интронной структуры предполагаемого гена MOB

4.6. Анализ гипотетического транскрипта гена MOB (последовательности BN000143)

4.7. Выявление транскриптов, соответствующих предсказанному in silico гену MOB, в тканях человека

4.8. Идентификация обнаруженных транскриптов гена MOB

4.9. Определение первичной структуры двух транскриптов гена MOB

4.10.Определение точек инициации транскрипции гена MOB

4.11.1л silico анализ участка геномной последовательности, фланкирующего 5'- конец гена MOB

4.12.Анализ экспрессии гена MOB в тканях человека

4.13.1л silico определение и анализ предполагаемых белковых продуктов, кодируемых транскриптами гена MOB

4.14.Идентификация белка Mob. Поиск и анализ последовательностей белков, паралогичных Mob

4.15.Выявление групп предполагаемых ортологов белков Mob, parlMob и par2Mob

4.16.Оценка степени эволюционного консерватизма белков

Mob,parlMob и par2Mob

4.17.Выявление функциональных мотивов, характеризующих семейство белков Mob

4.18.Таблицы и рисунки

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "MOB(TMEM 23)-новый ген человека: особенности строения и функционирования"

По предварительным оценкам, геном человека включает не менее 30 тысяч генов, из которых в настоящее время изучено менее половины. Поиск и идентификация неизвестных генов человека и исследование их структурно-функциональных особенностей, а также характеристика кодируемых ими белковых продуктов является одним из наиболее актуальных направлений современной молекулярной биологии. Выявление всех генов человека, установление карты тканеспецифичности их экспрессии, построение картины их взаимодействия будут являться факторами, которые предопределят переход молекулярной биологии на новый, более высокий уровень -уровень интегративного анализа (Свердлов, 1999), а также дадут более глубокое понимание природы физического и психического здоровья человека и откроют новые пути для развития медицины.

Широкомасштабные исследования, в результате которых стали известны полные последовательности геномов многих организмов, в том числе человека (Venter et al., 2001; Lander, 2001), предоставляют возможность быстро и эффективно решать проблему поиска новых, еще не описанных генов, и кодируемых ими белковых продуктов (Strausberg and Austin, 1999). В частности, анализ баз данных геномных и экспрессирующихся последовательностей человека, проводимый методами современной биоинформатики, позволяет вычленять последовательности, соответствующие отдельным генам, в их числе неизвестным ранее, а также получать информацию, касающуюся структуры и локализации этих генов.

Особый интерес представляет идентификация и анализ генов, специфически экспрессирующихся в различных тканях и определяющих особенности их функционирования. Уникальным объектом исследования является головной мозг человека. Отличительным свойством этого органа является то, что в нем, по сравнению с другими органами, имеется наибольшее количество морфологически и функционально различающихся клеточных популяций. Они осуществляют разнообразные функции, для реализации которых требуется множество белковых продуктов, и, следовательно, экспрессия очень большого числа генов. Таким образом, поиск новых генов и генных семейств, определяющих специфичность функционирования биохимических систем мозга и их регуляции, является актуальным направлением современной молекулярной биологии.

1.2. Цель и задачи исследования

Ранее в целях выявления генов, специфически экспрессируюгцихся в мозге человека, на основе полиаденилированной фракции РНК некоторых отделов головного мозга человека в нашей лаборатории были получены клонотеки кДНК. Дифференциальный скрининг клонотек позволил отобрать несколько клонов, в том числе НшоЬЗЗ (клон № 33 из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека, human medulla oblongata), последовательности которых экспрессировались преимущественно в головном мозге человека (Буякова и соавт., 1992).

В целях выявления и идентификации гена, активного преимущественно в тканях головного мозга человека и включающего в себя последовательность НтоЬЗЗ, а также для изучения его структурной организации и особенностей функционирования были поставлены следующие задачи:

• Определить первичную структуру экспрессирующейся последовательности НтоЬЗЗ и сравнить ее с последовательностями ранее изученных генов;

• Установить нуклеотидную последовательность транскрипта, включающего последовательность НтоЬЗЗ, и охарактеризовать структурную организацию соответствующего гена;

• Провести анализ экспрессии гена, включающего последовательность НтоЬЗЗ, в разных тканях человека;

• Определить in silico предполагаемую структурную организацию белковых продуктов, кодируемых исследуемым геном;

• Провести филогенетический анализ обнаруженного гена.

1.3. Научная новизна

Обнаружен неизвестный ранее ген человека MOB {ТМЕМ 23), гипотетический белковый продукт которого совпадает с недавно идентифицированной последовательностью фермента фосфатидилхолин-церамид холинфосфотрансферазы 1 (сфингомиелинсинтетазы 1). Впервые описана хромосомная локализация и геномная структура данного гена, а также охарактеризованы особенности организации транскрипта. Впервые исследована транскрипционная активность гена MOB {ТМЕМ 23) и показано, что изучаемый ген экспрессируется в широком спектре тканей человека. Обнаружено участие процессов альтернативного сплайсинга в регуляции функционирования изучаемого гена; идентифицированы и охарактеризованы два альтернативно сплайсируемых транскрипционных варианта мРНК. Высказаны предположения о механизмах, регулирующих уровень активности гена MOB {ТМЕМ 23) в организме. Выявлено неизвестное ранее древнее семейство генов, включающее в свой состав MOB (ТМЕМ 23), а также показана эволюционная консервативность белковых продуктов, кодируемых генами этого семейства.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Владыченская, Ирина Петровна

выводы

1. В результате in vitro и in silico исследования клона НшоЬЗЗ, полученного ранее из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека, обнаружен новый ген. В структуре идентифицированного гена, названного MOB (номенклатурное название - ТМЕМ 23), НшоЬЗЗ представляет З'-некодирующую область. Ген MOB {ТМЕМ23) протяженностью 320 т.п.н. располагается на десятой хромосоме человека, в области 10ql 1.2, и состоит, по меньшей мере, из одиннадцати экзонов.

2. MOB (ТМЕМ 23) является представителем неизвестного ранее эволюционно древнего генного семейства, включающего три паралогичных гена. Экзон-интронная организация кодирующих областей всех трех генов консервативна у представителей теплокровных.

3. Транскрипционная активность MOB (ТМЕМ 23) характеризуется использованием механизмов альтернативного сплайсинга для синтеза мРНК, различающихся строением как кодирующей, так и 5'-нетранслируемой областей. Идентифицированы два альтернативных транскрипта MOB (ТМЕМ 23); последовательность одного из этих транскриптов включает в себя экзоны I-XI, последовательность второго отличается отсутствием экзона VII.

4. Регуляция функционирования гена MOB (ТМЕМ 23) предположительно осуществляется на нескольких уровнях. Транскрипционный уровень контроля представлен использованием альтернативных промоторов, пост-транскрипционный -синтезом альтернативно сплайсируемых форм транскриптов гена.

5. Ген MOB (ТМЕМ23) экспрессируется в широком спектре тканей человека. Наиболее высокая представленность изученных транскриптов гена показана в тканях головного мозга.

6. MOB (ТМЕМ 23) является геном, кодирующим эволюционно консервативные интегральные мембранные белки. Гипотетическая последовательность белка, кодируемого основным транскриптом, совпадает с недавно идентифицированной последовательностью фермента фосфатидилхолин-церамид холинфосфотрансферазы

1 (сфингомиелинсинтетазы 1). Эти данные позволяют заключить, что нами обнаружен и охарактеризован не изученный ранее ген сфингомиелинсинтетазы 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Владыченская, Ирина Петровна, Москва

1. Буякова О.И., Баринова Е.И., Дергунова Л.В., Хаспеков ГЛ., Чивилев И.В., Лимборская С.А., Выделение и анализ мозгоспецифических последовательностей из библиотек кДНК разных отделов мозга человека, // Генетика, 1992, т. 28, с. 4046.

2. Киселев Л. Л., Молекулярная биология от 1970 до 2000 и дальше // Биоорганическая химия, 2000, т. 26, №10, с.767-771.

3. Свердлов Е. Д., Микрокосм генома // Молекулярная биология, 1999, т. 33, №6, с. 917-940.

4. Копанцев Е. П., Нестерова Т. Д., Бородин А. М., Закиян С. М. Создание картипующей панели гибридных клеток человек-грызун // Генетика, т.29, №9:14401451.

5. Фролов А.Е., Годвин Э.К., Фаворова О.О. Анализ дифференциальной экспрессии генов на ДНК-микрочипах и его применение в молекулярной онкологии. // Молекулярная биология, 2003, т. 37, №4, с. 573-584.

6. Adams MD, Celniker SE, Holt RA, Evans С A et. al. The genome sequence of Drosophila melanogaster // Science 2000 Mar 24;287(5461):2185-95.

7. Adams MD, Dubnick M, Kerlavage AR, Moreno R, Kelley JM et. al. Sequence identification of 2,375 human brain genes // Nature 1992 Feb 13;355(6361):632-4.

8. Adams MD, Kelley JM, Gocayne JD, Dubnick M et. al. Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project // Science 1991 Jun 21 ;252(5 013): 1651 -6.12