Идентификация и структурно-функциональная характеристика генов мобилизации плазмиды pAH 36-4CPA

Ситдикова, Лейсан Радисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация и структурно-функциональная характеристика генов мобилизации плазмиды pAH 36-4CPA
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и структурно-функциональная характеристика генов мобилизации плазмиды pAH 36-4CPA"

На правах рукописи

Ситдикова Лейсан Радисовна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ МОБИЛИЗАЦИИ

ПЛАЗМИДЫ рАН 36-4СРА 03.00.03. - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 2006

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Маркушева Татьяна Вячеславовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович

каццвдат биологических наук, доцент Плотникова Елена Генриховна

Ведущая организация:

Башкирский государственный университет

Защита диссертации состоится «27» декабря 2006 г. в 12 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01. при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан « ноября 2006 г.

Ученый секретарь Регионального

диссертационного совета, к.б.н.

Актуальность проблемы. В настоящее время проблема идентификации и исследования молекулярно-генетических особенностей строения экстрахромосомных элементов прокариот привлекает значительное внимание. В рамках решения этой проблемы проводится анализ разнообразия и распространения плазмид в природе, определяются особенности их взаимоотношений с клетками-хозяев, выявляются эволюционные связи и происхождение, а также изучаются механизмы горизонтального переноса генетической информации. Понимание последних напрямую связано с оценкой риска распространения в современном мире генетически модифицированных организмов (ГМО).

Согласно способности к трансферу плазмиды классифицируются на коньюгативные (самотрансмиссибельные) и мобшшзируемые (трансмиссибельные в присутствии дополнительных коньюгационных факторов). Коньюгативные плазмиды обладают детерминантами функций, требующихся для реализации механизмов передачи плазмид от клетки к клетке. Мобилизируемые плазмиды имеют небольшие размеры, они обычно несут область мобилизации (mob), кодирующую специфические компоненты белков мобилизации и область начала переноса (oriT) (Pansegrau, W., and Lanka E., 1996; Zechner, E. L., et al., 2000). Отмечено, что плазмиды, способные к мобилизации, могут переносить генетическую информацию не только среди грамположительных и грамотрицательных бактерий, но также в клетки растений и эукариот (дрожжей) (Kado, СЛ., 1994; Bravo-Angel, А. М., et al., 1999). Как оказалось, именно мобилизируемые плазмиды имеют огромное значение в процессах поддержания и распространения экофизиологических признаков, в частности, деградации ксенобиотиков и устойчивости к химическим факторам среды, включая антибиотики.

Clewell D.B., 2002). Изучение последовательностей нуклеотидов мобилизируемых плазмид позволяет раскрыть механизмы трансфера и установить филогенетические отношения среди членов различных таксонов. Привлечение ресурсов современных баз данных для изучения структурных особенностей генов мобилизации' позволяет предложить их классификацию в семействах и подсемействах, а описание генетической организации каждого семейства, их характерных черт и отношений среди кодируемых ими белков определяет подход к характеристике глобального генного пула мобилизируемых плазмид.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась идентификация и характеристика генов системы мобилизации плазмиды рАН 36-4СРА штамма Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4СРА. Задачи исследования:

1. провести рестрикционный анализ плазмиды рАН 36-4СРА штамма . Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4СРА;

2. определить последовательности нуклеотидов плазмиды рАН 36-4СРА;

3. идентифицировать гены мобилизации плазмиды рАН 36-4СРА;

4. выявить филогенетическое положение генов mob плазмиды рАН 36-4СРА;

5. изучить структуру кластера mob генов плазмиды рАН 36-4СРА;

6. провести Сравнительный анализ последовательностей нуклеотйдов генов mobA, mobC, тоЬВ и тоЬО плазмиды рАН 36-4СРА;

7. оценить трансфер плазмиды рАН 36-4СРА в клетки других бактерий. Научная новизна исследования. Идентифицирована

последовательность нуклеотидов кластера генов мобилизации плазмиды рАН36-4СРА Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4СРА. Длина последовательности составляет 1809 п.н. Показано, что система мобилизации плазмиды рАНЗб-4СРА объединяет 4 гена: mob А, В, С, и D. Длина mobA составляет 1497 п.н., тоЬй - 489 п.н., mobC - 324 п.н., тоЬО - 216 п.н.

Выявлена структурная организация кластера генов мобилизации плазмиды рАНЗб-4СРА. Установлено, что гены тоЬВ и mobD располагаются

внутри гена mob А, в то время как последовательность тоЬС частично перекрывается геном mob А. . ,

Обнаружена возможность трансфера плазмиды рАН 36-4СРА в клетки штаммов Gluconobacter oxydans IBRB-2T и Raouheïïaplanticola IBRB-33 4CPA.

Практическая значимость работы. Полученные в данном исследовании результаты раскрывают молекулярно-генетические особенности строения систем мобилизации малых плазмид и вносят существенный вклад в понимание процессов их функционирования. Результаты работы могут быть применены для создания новых штаммов векторных систем в области генной инженерии.'

Апробация работы. Результаты работы бьгли обсуждены в ходе работы Первого конгресса европейских микробиологов (Словения, 2003), 1-го Международного конгресса «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), конференции ELSO (Франция, 2004), 1-го Международного конгресса «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), 7-ой, 9-ой и 10-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2003, 2005, 2006), международной конференции «Проблемы' биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), Всероссийской Молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005).

Гранты. Работа была проведена при содействии Государственного контракта Э0029 «Экспедиционные исследования микроорганизмов промзоны нефтехимического производства», ФЦП «Интеграция науки высшего образования России на 2002-2006 годы», РФФИ-Агидель 02-04-97911, гранта Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие» и программы Президиума РАН «Поддержка молодых .ученых».

Публикации. Результаты диссертации изложены в 10 печатных работах, в том числе 3 статьях и публикации в базе данных NCBI (Microbial Genomes section of GenBank).

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения результатов исследований, выводов, списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 111 страницах, содержит 30 рисунков и 18 таблиц. Библиография включает 179 источников.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для исследования была выбрана плазмида рАН 36-4СРА штамма Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4СРА, выделенного из образцов почв промзоны г. Уфы. Штамм был идентифицирован согласно критериев молекулярной классификации по последовательности 16S рРНК.

Для выделения плазмидной ДНК применяли методику Бирнбойма-Доли (Bimboim and Doly, 1979). Рестрикционный анализ плазмидной ДНК проводился по стандартной методике (Маниатис и др., 1984). Размеры фрагментов ДНК устанавливали с использованием пакета программ Gel Analysis. Для определения устойчивости штамма к антибиотикам применяли метод диффузии в агар с применением дисков (Лабинская, 1978). Определение устойчивости штамма к тяжелым металлам проводили с использованием селективных сред. Конъюгацию клеток бактерий осуществляли согласно указаниям, изложенным в руководстве «Методы общей бактериологии» (1984). В качестве векторной системы для создания библиотеки генов плазмиды рАН 36-4СРА брали вектор pGEM-3Zfl[+) Promega (США). Компетентные клетки Е. coli готовили по стандартной методике (Sambrook et al., 1989).

Определение последовательностей выполнялось с использованием универсальных секвенирующих праймеров M13(F) и . M13(R). Реакции проводили по методу Сенгера (Sanger et al., 1977) с использованием набора Silver Sequencing (Promega, США) на приборе SQ3 Sequencer (Hoefer, США), допуская 1 незначительные модификации , согласно рекомендациям производителя. Автоматическое секвенирование клонированных фрагментов плазмиды рАН364СРА выполняли с помощью набора BigDye®Tcrminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), на приборе DNA Analyzes 3730, (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя. Первичный сравнительный анализ последовательностей с последовагелыюсЕями из базы данных GcnBank проводили с помощью пакета программ BLAST.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Рестрикционный анализ плазмиды рАН 36-4СРА штамма Citrobacter hydrophila IBRB 36 4СРА

В начале исследований из клеток Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА был получен препарат плазмиды рАН 36-4СРА. На основе RFLP-анализа (restriction fragment length polymorphism) с использованием BamHI, HincII и PvuII ферментов была построена рестрикционная карта изучаемой плазмиды, позволяющая разработать стратегию ее секвенирования (Рис.1).

Рис. 1. А, В. Результаты электрофоретического анализа BamHI-, HincII- и PvuII- рестрикционных фрагментов плазмиды рАН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА.

С. Рестрикционная карта плазмиды рАН 36-4СРА построенная по BamHI-, HincII- и PvuII- сайтам.

Условные обозначения: 1,7 — маркер молекулярной массы ДНК 1 т.п.н. (Сибэнзим); 2, 8 -маркер молекулярной массы ДНК 100 т.п.н. (Сибэнзим); 3, 9 - нативный препарат рАН 36-4СРА; 4, 14 - BamHI-фрагменты; 5 - HincII - ВатН1-фрагменты; 6, 10 - HincII - фрагменты; 11 - HincII - PvuII- фрагменты; 12 - PvuII- фрагменты; 13 - BamHI- PvuII- фрагменты.

2 3 4 5 «

7 8 9 10 Ч 12 13 14

1 ШЙЖЕ! aja^- ATG CTC ACC ATG TGG GTG ACG GAG GGC GAG CAC 45

46 CGG CGG CTG CTT GAG CGC TGC GAC GGC AGG CCG CTG GCG GCG TGG 90

91 ATG CGG CAG ACC TGC CTG GAC GAA AAG CCT GCG CGC ACC GGA AAG 135

136 СТС CCC TCA CTC TCG CCG GCG CTG CTG CGC CAG CTT GCC GGT ATG 1BO

181 GGC AAT AAC CTG AAC CAG ATA GCC CGC CGT GTT AAC GCC GGC GGC 225

226 GGC ACC GGC CAT GAC AGG GTA CAG ATT GTG GCG GCG CTG ATG GCC 270

271 АТС GAT GCC GGG CTT GAG CGG CTG CGG CAC GCC GTT CTT GAG AAA 315

316 GGA ACG GAC G— №1 щ g- -AT GAT CGT TAA —Щ. 360

361 — ■AT TTC АТС CAC GCG GTC GCG GCG GTG GCG CCG GGC CGG TGG 405

406 ACT АТС TGC TGG GTA AAG ACC GGC AGC GTG AAG GCG CCA GCG TCC 450

451 TGC AGG GGA AGC CGG AAG AAG TCC GGG AGC TGA TTG ACG CGT CGC 495

496 СТТ ACG TGA AGA AAT АСА CCT CCG GCG TTC TGT CGT TTG CGG AGG 540

541 CCG АТС TGC CTC CCG GCC AGC GGG AAA AAC TGA TGG CCA GCT TCG 585

586 AGC GGS TTC TGA TGC CCG GAC TCG ATA AAG АТС AGT Я ТЮВЯ TTC 630

631 TGT GGG TGG AGC ACG CGG АСА AGG GGC GTC TGG AGC TGA ACT TTC 675

676 TGA TCC CCA ATA CCG AAC TGC TGA CCG GCA GGC GGC TCC AGC CGT 720

721 ACT ACQ ACC GCG CCG ACC GGC CGC GCA TCG ATG CCT GGC AGA CCA 765

766 TCG TGA ACG GCA GAC TGG GGC TGC ATG ACC CGA ACG CGC CGG AAA 810

811 АСС GCC GGG CGC TGG TCA CGC CGT CCG GAC TGC CGA AAA CGA AGC 855

856 AGG AGG CCA CTG AAG CCA TCA CGC GCG GAC TGC TGA. CCC TTG CTT 900

901 CGI CCG GGG AGC TGA AAA ACC AGT CAG GAC AGT CAC TGA GGC GCT 945

946 CGG AAG GTA CAG GTT TTA TGA GGC TGG TGC GCA CCA CGA AAA GCA 990

991 GTA TCA CGC ATT GCC GAC CCG GAC GGG GGG CGA АСА TCC GAC TGA 1035

1036 AGG GAG CCA TCT — Hl--ATG AGC AGT CTT TTA ACG 1080

1031 CTG GCG AAG GAC TTA GAG CAG CAA TCG AAA GCG CAG AAG CAG AGT 1125

1126 ACC GGC GAG ATG CTG AAA GCC GCA TTC AGC GAG CAC GAG CAG TCT 1170

1171 GTC AGA GCG GAA CTG AGC GCA AGC GCG AGG AGA АТС AGC GAC GCC 1215

1216 АТС CTC GCC CAC GAG CAG AGT ATG AGC GAG GCG ATG GAG AAA AAC 1260

1261 CGG CGG AGC GTA CTG CGG ACT GCC GGG CGG АСА TGG CTC ACC АТС 1305

1306 CTG ATG GTG TCA GCG CTG CTG АТС GGC ACG AGC GGG AGC ATT CTG 1350

1351 TGG TGG CAG GGG CAG CAG ATA ACC GAC AAT TAC ACG CAT CTT CGT 1395

1396 CAG CAG GAA GAT ACC CTG GCG AAA ATG ACC GCC CGG ACG TGG GGA 1440

1441 GTG CGC TAT CAG GAG AGC AGC GAC GGC CGG AGG TTT CTT АТС CTG 1485

1486 CCG CCG GGG ATG CAA ACC GAA GCC АТС CCC TAC GAC GGG ACG АСА 1530

1531 TGG АТС CGC CTG AAA CAG GAG I- ATA GCG GAA ACT 1575

1576 Hü?» «У& ■Am §--AT GAC AGA GCT GGA AAA GCA GTT GCT GAG CGC 1620

1621 ATT AGA GCA GCT АСА GCA GGA СТА CTC GCA AAG GCT GGA CGA ATG 1665

1666 GGA GAG CGC CTT CGC GGA ATG GCG GAG CAT GTG TGG GCT TAT GCA 1710

1711 ACG GGA GAA CGC GGT GCT GAA CGA GCG CGT GTC GGA CTT GAG CAC 1755

1756 GCA GGT GCT GAG TT! AAG CGA GCA GCT GCG CCG CTT GTC CGG GAA 1800

1801 CTG А— Ш frlS im —А TGC CAT CGA GCT CCG GCA GAG GGA GAA 1845

1846 TGA GTA TCA GAA AAC ACT GGA GCT GGA GCG CCA GCC GCA GAA AAC 1890

1891 СТА CCG CGG GCC GAC ACT TTA А— ■fl ¡НИ 1923

Рис. 2. Последовательность фрагмента нуклеотидов[ плазмвды рАН36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА. '

Условные обозначения: Закрашенные прямоугольники показывают области начала и конца генов тоЬА, В, С и D, а также место начала сдвига рамки считывания (№ 645).

Секвенирование фрагментов рАН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА позволило идентифицировать фрагменты плазмиды, последовательность нуклеотидов одного го них представлена на рис. 2.

Результаты сравнительного анализа выявленной последовательности плазмиды рАН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4GPA с ресурсами базы данных GenBank обнаружили существенное сходство этого фрагмента рАН 36-4СРА с участками плазмид нескольких штаммов бактерий, а именно: pECOl Enterobacter cloacae ~ 99%, рАН3680 Aeromonas hydrophila - 99%, рЕС278 Escherichia coli 278В - 98%. При этом изучаемый фрагмент рАНЗб-4СРА, длина которого составила 1809 п.н., обладал наибольшим уровнем гомологии с последовательностью плазмиды pECOl, несущей кластер генов мобилизации (mob).

Сравнение последовательностей также указало на то, что кластер генов мобилизации плазмиды р АН 36-4СРА объединяет 4 гена mob А, mobB, тоЬС и mobD (рис. 2). Анализ расположения открытых рамок считывания позволил установить, что размер гена mob А рАН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА составляет 1497 п'.н., mobB - 489 п.н., mobD - 216 п.н., mobC - 324 п.н. (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительная характеристика генов мобилизации (mob) плазмид рАН 36-4СРА и pECOl

Ген Длина, п.н. Содержание GC-пар, % Кодируемый белок

рАН 36-4 CPA pECOl

mob А 1497 1502 60.59 МоЬА

mobB 489 492 59.92 MobB

mobD 216 213 58.8 MobD

mobC 324 324 66.05 MobC

Из приведенных данных следует, что размеры mob генов плазмид рАН 36-4СРА и pECOl имеют различия, в частности, длина генов тоЬА и mobB рАН 36-4СРА незначительно превышает длину генов mob К и тоЬВ pECOl, В случае mobD наблюдается обратная ситуация, в тоже время последовательности тоЬС оказываются одинаковыми.

Полученные данные позволяют также сделать вывод о том, что область мобилизации плазмид рАН 36-4СРА и pECOl имеют сходную структуру. Эта область рАН 36-4СРА устроена таким образом, что 2 гена (mobB и mobD) полностью перекрываются последовательностью гена тоЬА, в то время как ген тоЬС перекрывается геном mob К только частично (11 п.н.).

Расположение генов мобилизации (mob) на плазмиде рАН 36-4СРА может быть представлено следующим образом (рис. 3).

тоЬС mobB mobD

................................. -- >

mobA

Рис. 3. Схема расположения генов мобилизации (тоЬС, mobA, mobB, mobD) на плазмиде рАН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА.

Филогенетическое положение кластера генов мобилизации плазмиды рАН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА.

Филогенетическое положение кластера генов тоЪ штамма Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА было определено на основании сравнительного анализа последовательностей в формате ресурсов GenBank. Результаты анализа указали на общее происхождение тоЪ генов плазмид рАН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, pECOl Enterobacter cloacae и Aeromonas hydrophila pAH3680 (рис. 4).

.s«rmonicída stra!nÁ449 pi. «Aeromona* «almonídda sibsp. salmonada pAsal2 plnmid nterobacter cloaci«pirtati*e HebC gene, partial cds

Eslieric&ia cali plaemW pColK- Щ ««píete sequence E.coti ptflsmi^ PColD-157DNA

•EnM carotowt plawtM рЕСЗ DNA, compl. seq, Salmonella enteriticj seroyer Enterltidls piasmFd pK, compl. seq.

í, tompiate ptoémkE 'lasmid pSWIW RNA II gene, partial seq. «Plasmid pUCDSOM, complete seq. :PlaimidpSW200 from Erwinia stewartli lobC gene

r-* Plasmid ColA, coepUte genome *—-«Plasmid ColA-CA31 origin of replication region Halomonaa elongafa, plaamfd

■Г

Hafnla silver platmid pAfvB, compíete sequence

Hafnia alvei plasnid pAI*A, completeseq.

-CiirotocferftyrfropWIa plmidpAH 1ША, partial seq.

■Aeromonas bydropliila pAH36$0,conplete seq.

Рис. 4. Филогенетическое положение генов мобилизации {mob) плазмиды рАН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА.

Результаты сравнений последовательностей генов тоЬА, тоЪЪ, тоЬС и mobD плазмиды рАН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА с ресурсами базы данных GenBank приведены в таблице 2.

Из данных таблицы 2 можно сделать вывод о том, что наибольший уровень гомологии mob гены плазмиды рАН 36-4СРА обнаруживают с генами плазмиды рЕСО 1 Enterobacter cloacae.

Таблица 2

Результаты сравнительного анализа последовательности нуклеотидов генов mob А, mobB, тоЬС и mobD плазмиды рАН 36-4СРА с ресурсами GenBank

Плазмида Бактериальный источник Уровень гомологии в сравнении с рАН 36-4СРА, %

Название № в GenBank mobK mobB тоЬС mobD

pECOl ABl 17929.1 Enterobacter cloacae 99 99 96 100

pAH3680 DQ4Ö2049.1 Aeromonas hydrophila 98 98 96 99

pEC278 AY589571.1 Escherichia coli 91 н.д. 95 90

Условные обозначения: н.д. — нет данных.

Вместе с тем сравнение выявило вариабельность некоторых участков последовательностей генов mobK, mob'B, тоЬС и mobD плазмиды рАН 36-4СРА (табл. 3). При этом, как оказалось, замены некоторых нуклеотидов могут' привести к изменениям первичной структуры молекул белков MobA, MobB и МоЬС. Возможные замены аминокислотных остатков приведены в табл. 3.

Приведенные в табл! 3 данные указывают на присутствие единичных' замен нуклеотидов в mobK плазмиды рАН 36-4СРА, а именно, в позициях 92 (Ser —♦ Thr), 512, 514 (Thr —» Ala), 563 (Asn —► Ser).

Кроме этого, в последовательности гена тоЬА обнаружен сдвиг рамки считывания в 645 позиции, поэтому конец белка МоЬА, детерминируемый геном mob А плазмиды рАН 36-4СРА, существенно отличается от продукта МоЬА плазмиды pECOl Enterobacter cloacae (рис. 2).

Из анализа данных табл. 3 также следует, что в последовательности гена тоЬВ плазмиды рАН 36-4СРА обнаруживаются три нуклеотадные замены в позициях 55, 86, й 104, которые приводят к заменам трех аминокислотных остатков в молекуле белка MobB: Lys —» Gin, Ala —» Val, Gin —» Arg.

В последовательности гена mobC плазмиды рАН 36-4СРА обнаруживаются 9 нуклеотидных замен, 3 из которых, расположенные в положениях 65, 89 и 115, приводят к заменам трех аминокислотных остатков в молекуле белка MobC: Pro —♦ Gin, Thr —* Ile, Thr —» Ser.

Согласно результатам сравнительного анализа последовательностей нуклеотидов генов rnobí) и аминокислотных остатков белка MobD в формате базы данных GenBank установлено, что эти последовательности плазмид рАН 36-4СРА pECOl имеют 100% гомологию.

Из приведенного следует, что можно прогнозировать наличие отличий молекул белков МоЬА, MobB и MobC, детерминируемых плазмидой рАН 36-4СРА, от соответствующих белков плазмиды pECOl Enterobacter cloacae, в то время как белки MobD будут обладать одинаковой структурой.

Таблица 3

Вариабельность нуклеотидов последовательностей генов тоЪК, тоЬВ, тоЬС плазмид рАН 36-4СРА и рЕС01, приводящая к заменам аминокислотных ! остатков белков МоЬА, МоЬВ и МоЬС

Ген № позиции Нуклеотиды Аминокислотные остатки

pECOl рАН 36-4СРА pECOl рАН 36-4CPA

тоЬА 92 С G Ser Thr

512 G А Thr Ala

514 А Т

563 G А Asn Ser

тоЬВ 55 С А Lys Gin

86 Т С Ala Val

104 G А Gin Arg

тоЬС 65 А С Pro Gin

89 Т С Thr Ile

115 Т А ' Thr Ser

Условные обозначения:

аминокислоты:

Gin - глутамин, Arg - аргинин, Ala - аланин, Val - валин, Lys — лизин; Pro — пролин; Thr — треонин; Ile - изолейцин; нуклеотиды:

С - цитозин, Т - тимин, G - гуанин, А - аденин.

Обсуждая полученные данные, следует отметить, что белки, кодируемые генами mobA, mobB, тоЬС и mobD обладают различными функциями. Белок МоЬА является критическим компонентом релаксомы, которая обеспечивает инициирование трансфера ДНК как в конъюгативных, так и в мобилизируемых плазмидах. МоЬА способен формировать специфический комплекс ДНК, который является удивительно устойчивым, с периодом полураспада приблизительно 95 минут (Zhang S. and Meyer R. 1997). In vitro было показано, что белок МоЬА способен прочно связываться с перемещаемой цепью ДНК, и плохо - с комплементарной или линейной ДНК. Сайт oriT и окружающие его последовательности требуются для эффективного завершения раунда трансфера. Структура повторов IR, прилегающих к oriT, является наиболее важной для связывания МоЬА с одноцепочечной ДНК (Becker Е.С. and Meyer R.J., 2000), при этом ветвь IR, ближайшая к nick-сайту, требуется для разрезания oriT в релаксоме. В этой реакции требуется двухвалентный катион (Mg2\ Mn2+, Са2+ или Ва2+ (Scherzinger Е., et al., 1992).

Механизм реализации активности релаксазы плазмиды pMV158 был продемонстрирован ш vitro (Guzman L.M. and Espinosa M., 1997). Релаксаза pMV158 разрезала ДНК в ник-сайте и оставалась прочно связанной с ДНК-мишенью. Белок был способен расщеплять ДНК в суперскрученном или одноцепочечном состоянии, в присутствии Mg2*, предполагается, что реакцию расщепления катализирует Туг 49. (Seiinger L.B. et al., 1990; Grohmann E. et а!.,1999).

Хотя белок МоЬА является самодостаточным для разрыва одноцепочечного ДНК субстрата (Scherzinger Е. et al., 1993), для ник-активности на двуцепочечной ДНК качестве дополнительного белка необходим белок MobC (Scherzinger Е., et al., 1992). MobC помогает в раскрытии цепи, распространении области разделения цепей ДНК вокруг разрыва, и таким образом он содействует увеличению эффективности разрыва (Zhang S. and

Meyer R. 1997). Так, например, показано, что плазмида R1162 мобилизовалась с низкой частотой в отсутствии MobC (Zhang S. and Meyer R., 1997).

Третий mob - кодируемый белок, MobB, также требуется для эффективной мобилизации. В его присутствии наблюдалось увеличение пропорции молекул плазмиды с разрывом в oriT, он способен стабилизировать релаксому (Perwez Т. and Meyer R., 1996). Опубликована модель, в которой MobB участвует в" регулировании экспрессии генов R1162, изменяя ее стабильность (Perwez Т. and Meyer R J., 1999).

Функция «исключение входа» была предложена для белка MbeD, так как этот белок может связаться через N-концы молекул амфипатических а-спиралей внутренних мембран (Yamada Y. et al., 1995)

Отмечено, что релаксазы pMV158 семейства вовлечены в сайт-специфическую рекомбинацию между сайтами oriT, которая может привести к амплификации генов (Francia M.V. and Clewell D.B., 2002).

Интересно, что пять генов мобилизации, mobA, mobli, mobC, mobD и mobE, принадлежащих pRAS3, pTF-FC2, pTC-F14 и pRA2, оказались эквивалентными генам irai, irai, /гаК, trab Тгар-коньюгативных систем, соответственно (Ziegelin G. et al., 1991; Rohrer J. and Rawlings D.E., 1992). Сходство не ограничивалось гомологией генов, и касалось порядка и направления их транскрипции (Rohrer J. and Rawlings D.E., 1992). Три гена (mobк, motíB и mobC) существенны для мобилизации плазмиды, в то время как другие два (mobD и mobE) только увеличивали частоту мобилизации.

Достаточно много известно о mob области плазмиды RP4. Эта плазмида, возможно, является наиболее изученной из всех коньюгативных плазмид. Она является типичным представителем релаксаз семейства ЗН-Со1Е1 (Zechner E.L. et al., 2000; Lanka E. and Wilkins B.M., 1995). Белок Tral является релаксазой, в то время как TraJ и ТгаК - два ДНК- связывающих белка-помощника, которые, как полагают, помогают Tral получать доступ к сайту связывания через

различные процессы, такие, как изменение локальной структуры ДНК и изменения суперскрученности ДНК. До сих пор функции TraL и ТгаК неизвестны (Zechner E.L. et al., 2000).

Интенсивный сайт-направленный мутагенез использовался для обнаружения каталитических аминокислотных остатков.

Обнаружено, что каталитический центр релаксомы реализуется через три Мотива белка МоЬА (рис. 6) (Francia M.F., 2003). Сравнительный анализ последовательностей аминокислотных остатков, составляющих три Мотива каталитического центра релаксомы и белка МоЬА рАН 36-4 CPA показал, что ген mob А плазмиды р АН 36-4 CPA детерминирует все три каталитических домена релаксазы (рис.6). Анализ аминокислотной- последовательности Мотивов I, И, III позволяет отнести релаксазу рАН36-4СРА к семейству ColEl и подсемейству MOBIICN.

Релаксазы ColEl семейства обладают каталитическим тирозином (Туг - № 19) в Мотиве I, каталитическим серином (Ser - № 55, 59) и дополнительно остатком глицина (Gly - № 56, 68) в Мотиве II, а также каталитическим гистидином (His - № 97) в Мотиве III.

Сравнение последовательности МоЬА, детерминируемых геном тоЬА рАН 36-4СРА позволяют сделать вывод о том, что замены нуклеотидов, последовательности тоЬА плазмиды рАН 36-4СРА, приводящие к заменам аминокислотных остатков МоЬА, не затрагивают каталитические ■аминокислотные остатки релаксирующего комплекса.

Мотив I

5 10 15 20

рАНЗб-4 CPA IV I V К F II Г к G R G G G А G Р V D Y L L G

Семейство ColEl м I V К F н - - R G G G А G Г V D Y L L G

Консенсус I IV I V К F н R G G G А G Р V D Y L L G

Мотив II

50 55 60 65 70

PAII36-4CPA Y V к К Y т S G V L S F А Е А D L Р Р G Q R

Семейство ColEl F А к К Y т S G V L S F А Е К Е L Р Р G G R

Консенсус II к к Y т S G V L S F А Е L Р Р G R

Мотив III

90 9; ЮС 10 5 11С

pAI ГЗб-4 CPA О Y S I L \\ V Е н А D К G R L Е L N F L I Р N Т Е

Семейство ColEl О Y S I L W V Е н О D к G R L Е L N F V I Р N м Е

Консенсус III Q Y S I L VV V Е Н D к G R L, Е L N F I Р N Е

Рис. 6. Сравнительный анализ усредненных последовательностей релаксаз семейства ColEl (Мотив I, Мотив II и Мотив III) и последовательности MobA, детерминируемый плазмидой рАН 36-4СРА.

Условные обозначения: А - Алании, О - Аспарагиновая кислота,

0 - Глицин, Е - Глутаминовая кислота, Р — Фенилаланин, Н - Гистидин,

1 - Изолейцин, К - Лизин, Ь, - Лейцин, N — Аспарагин, М- Метионин, Р - Пролин, <3 - Глутамин, Я - Аргинин, Б - Серин, Т - Треонин,

У - Тирозин, XV - Триптофан, V - Вапин.

Исследование процесса трансфера плазмиды рАН 36-4СРА С. hydrophila IBRB-36 4СРА

Исследование функционирования генов mob рАН 36-4СРА С. hydrophila IBRB-36 4СРА проводили с использованием нескольких генетических маркеров, позволяющих тестировать трансфер плазмиды. В роли одного из маркеров были использованы детерминанты деградации хлорфеноксиуксусных кислот (ifd), которые, как было показано ранее, находятся под контролем плазмиды рАН 36-4СРА. В качестве дополнительных маркеров были специально подобраны маркеры устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов. Поиск дополнительных маркеров осуществляли следующим образом. Плазмида рАН 36-4СРА была элиминирована из клеток штамма С. hydrophila IBRB-36-4CPA, а затем

бесплазмидные варианты клеток были протестированы в сравнении с клетками, обладающими плазмидами, на селективных средах. В качестве тестируемых признаков были взяты реакции к действию нескольких антибиотиков (стрептомицина, эритромицина, олеандомицина) и ионов некоторых тяжелых металлов (Сиг+, Сс12+, РЬг+, Мп2+, 8п1+, Сг14) (табл. 4).

Как видно из данных табл. 4, присутствие в клетках С. Ьус1горЫ1а 1ВЯВ-36-4СРА плазмиды рАН 36-4СРА обеспечило их . устойчивость к стрептомицину. Вместе с тем, удаление плазмиды рАН 36-4СРА из клеток С. Ьу<1горЫ1а 1В1Ш-36 4СРА не влияло на их отношение к эритромицину и олеандомицину, что указало на хромосомную природу этих генов.

Результаты тестирования устойчивости клеток к ионам тяжелых металлов показало, что на плазмиде рАН 36-4СРА расположены детерминанты устойчивости к иону цинка ZIli+, в то время как гены устойчивости к ионам РЬ2+, Мп2<~, 8п2+и Сг2+ располагаются на хромосоме.

Таблица 4

Локализация детерминант устойчивости к антибиотикам и ионов тяжелых металлов С. Ъус1горЫ1а ШЯВ-Зб 4СРА

Селективный агент Оценки воздействия на клетки С. hydrophila IBRB-36 4СРА

Генотип

Р1+ РГ

Антибиотики Стрептомицин (str) +

Эритромицин (егу) + +

Олеандомицин (ole) + +

Ионы тяжелых металлов Zn2+ (цинк) +

Pb2+ (свинец) + +

Мп2+ (марганец) + + .

Sn2+ (олово) + + '

Сг2* (хром) + ■ +

Условные обозначения: + - устойчив, - - чувствителен.

В ходе дальнейшей работы была проверена возможность переноса плазмиды рАН 36-4СРА в клетки новых хозяев, а именно, бактерий Gluconobacter oxydans IBRB-2T и Raoultella planticola IBRB-33 4CPA. С этой целью клетки штамма-донора плазмиды рАН36-4СРА, содержащих гены str, zinc и tfd С. hydrophila IBRB-36 4СРА и штаммов-реципиентов Gluconobacter oxydans IBRB-2T, несущих гены кап, amp, cob и cad и Raoultella planticola IBRB-33 4CPA, обладающих генами cat, mob и fer культивировались в богатой среде. В результате были получены трансконъюганты, обладающие признаками устойчивости к антибиотикам и ионам тяжелых металлов, детерминируемыми плазмидой рАН 36-4СРА. Результаты исследования представлены в табл. 5.

Таблица 5

Анализ трансфера плазмиды рАН 36-4СРА С. hydrophila IBRB-36 4СРА в клетки G. oxydans IBRB-2T и R planticola IBRB-33 4СРА

Генотип штамма-донора Генотип штамма-реципиента Генотип трансконъюгантов

Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА str+, zinc+, tfd+ Gluconobacter oxydans IBRB-2T kan+, amp+ cob+, cad+ kan+, amp+ cob+, cad+, zinc+ tfd4"

Raoultella planticola IBRB-33 4CPA cat1", mob+, fer+ cat+, str+ mob+, fer+, zinc+ tfd+

Условные обозначения: kan+ - канамицин, amp* - ампициллин, cat+ -хлорамфеникол, str+ - стрептомицин; cob'1' - кобальт, cad+- кадмий, zinc4" -цинк; tfd - гены катаболизма 2,4-Д.

■ Результаты этой части исследования показали возможность трансфера плазмиды рАН36-4СРА в клетки других штаммов. Плазмида рАНЗб-4СРА была способна экспрессировать катаболические функции деградации хлорированных феноксиуксусных кислот, а также функции резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов в другом бактериальном хозяине. В результате мобилизации плазмида рАН 36-4СРА обеспечила новую клетку-хозяина важными функциями, которые могут позволить бактериям занять новую экологическую нишу в неблагоприятных условиях среды, а именно, при воздействии антибиотиков, ксенобиотиков и ионов тяжелых металлов.

выводы

1. Идентифицирована последовательность нуклеотидов кластера генов мобилизации плазмиды рАНЗб-4СРА Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4CPA. Длина последовательности составляет 1809 п.н.

2. Показано, что система мобилизации плазмиды рАНЗб-4СРА состоит из генов тоЪ А, В, С, и D. Длина тоЬА составляет 1497 пл., тоЬВ - 489 п.н, тоЬС-324 п.н, mobD - 216 п.н.

3. Установлена структурная организация кластера генов мобилизации плазмиды рАН36-4СРА. Показано, что гены тоЬВ и mobD располагаются внутри гена тоЬА, в то время как последовательность тоЬС частично перекрывается геном тоЬА.

4. Выявлено филогенетическое положение генов mob плазмццы pAI 136-4СРА. Установлено общее происхождение mob генов плазмид рАН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, pECOl Enterobacter cloacae и Aeromonas hydrophila pAH3680.

5. Выявлено, что плазмида pAH36-4CPA может быть мобилизована в клетки Gkiconobacter axydans IBRB-2T и Raoultclla planticola IBRB-33 4CPA.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Журенко Е.Ю., Маркушева ТВ, Галкин ЕР, Коробов В.В, Жарикова IIB, Гафиягова (Ситдикова) JI.P. Glueonobacter axydans IBRB-2T -деструктор 2,4,5^грихлорфеноксиуксусной кислоты//Биотехнология. - 2003.-№ 6. -С. 67-71:

2. Маркушева Т.В, Журенко ЕЮ, Галкин Е.Г, Коробов В.В, Жарикова HB, Гафиягова (Ситдикова) J1JP. Идентификация и характеристика плазмиды штамма Aeronotnas hydrophila IBRB-36-4CPA, несущей гены катаболизма хлорфешксиуксус11Ь1Х кислот//Генетика.-2004.-T.40.-Ns 11.-С. 1469-1474.

3. Жарикова HB, Маркушева Т.В, Галкин ЕР, Коробов В.В, Журенко Е.Ю, Ситдикова ЛР, Колганова ТВ, Кузнецов Б.Б, Турова Т.П. Raoutella planticola -новый штамм-деструктор 2,4,5^ихлорфеноксиуксусной кислоты // Прикладная биохимия и микробиология. -2006. - Т. 42. - № 3. - С. 292-297.

• 21

4. Zharikova N.V., Markusheva T.V., Galkin E.G., Korobov V.V., Zhurcnko E.U., Sitdikova L.R., Kolganova T.V., Kuznetsov ВВ., Tourova T.P. Raoultella plartticola strain 334ch 16S ribosomal RNA gene, partial sequence // GenBank. 2006. accession numbers DQ333356.

5. Zharikova N. V., Korobov V.V., Zhurenko E.Yu, Gafiyatova (Sitdikova) LK., Michalev AA., Madjar V.V, Galkin E.G., Markusheva T.V. Bacteria-degrading phenol and its chlorinated derivatives // First FEMS Congress of European Microbiologists. - Slovenia. -2003.-P. 430.

6. Gafiyatova (Sitdikova) L.R., Zharikova N.V, Korobov V.V., Lubyanov EA, Zhurenko E.Yu., Madjar V.V, Markusheva T.V. Aeromonas hydrophila IBRB-36 4CPA plasmid,

. carrying genes of chlorophenoxyacetic acid conversion antibiotic and heavy metals resistance // ELSO Meeting. - France. - 2004. - P. 260.

7. Гафшггова (Сигдикова) JI.P, Жарикова H.B., Лубянов EA., Логинова АЛ, Ягудин РА., Дремова А.Ю., Фаххиева ГР, Маджар В.В., Маркушева TJB. Микроорганизмы промышленных экосистем: деструкторы хлорзамещенных ароматических кислот // Тезисы докладов 9-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века». — Пущино. -2005.-С. 196.

8. Жарикова НВ, Коробов ВВ, Сйгднкова ЛР, Маркушева TJ3. Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА — новый ппамм-деструкгор хлорированных феноксиуксусных кислот // Тезисы докладов Всероссийской Молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты совремешюй микробиологии». — Москва, -

2005.-С.88.

9. Жарикова НВ, Коробов В.В., Сигдикова Л.Р., Журенко Е.Ю., Анисимова ЛА-, Ягудин РА„ Маджар ВВ., Галкин ЕР., Маркушева ТВ. Сравнительный анализ D-плазмиды РСН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА // Материалы 10-й Путинской шкалы-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века». -Пущино.-2006.-С. 18.

10. Сигдикова ЛР, Жарикова НВ, Коробов ВВ., Логинова А.Н., Салимова АР, Фатхугдинова А.Ф, Хузина Л.Ф, Легушс Э.Ф., Кусова И.В, Галкин ЕР, Маркушева Т.В. Поиск бактерий, способных к угалюации хлорированных ароматических соединений и тяжелых металлов // Материалы 10-й Путинской шкшы-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века». — Пущино. -

2006.-С.369.

Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт+», заказ N8 90, тираж 100 шт, 450054, пр. Октября, 71

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ситдикова, Лейсан Радисовна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Плазмиды и механизмы переноса генетической информации у 8 бактерий

1.1. Конъюгация

1.1.1. Конъюгативные плазмиды

1.1.2. Генетическая организация факторов переноса

1.2. Мобилизация 10 1.2.1. Характеристика белков мобилизации

1.3. Главные семейства малых мобилизируемых плазмид

1.3.1. MOBq семейство

1.3.2. ColEl-семейство 24 1.3.2.1. MOBhen подсемейство 30 1.3.2.1. МОВр подсемейство

1.3.3. рМУ158-семейство

1.3.4. CloDF13 семейство

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований

2.2. Выделение плазмидной ДНК

2.3. Очистка плазмидной ДНК в легкоплавкой агарозе

2.4. Клонирование плазмидной ДНК

2.4.1. Приготовление компетентных клеток

2.4.2. Приготовление векторов

2.4.3. Лигирование

2.4.4. Трансформация клеток плазмидной ДНК

2.5. Выделение плазмидной ДНК клонов

2.6. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК

2.7. Секвенирование плазмид со вставкой

2.7.1. Введение метки в праймер

2.7.2. Постановка реакции секвенирования

2.8. Определение устойчивости штамма к антибиотикам

2.9. Определение устойчивости штамма к тяжелым металлам

2.10. Конъюгация клеток бактерий

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Рестрикционный анализ плазмиды рАН 36 4СРА штамма Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА

3.2. Создание геномных библиотек перекрывающихся рестрикционных фрагментов плазмиды рАН 36-4СРА

3.2.1. Rsa I библиотека клонов

3.2.2. Kzo9l - библиотека клонов 62 3.2.2. Alul- библиотека клонов

3.3. Определение последовательности нуклеотидов фрагментов 68 плазмиды рАН 36 4СРА

3.3.1. Секвенирование библиотеки клонов Rsa I - Kzo9I - Alul - 68 фрагментов рАН364СРА

3.3.2. Секвенирование плазмиды рАНЗб 4СРА методом «праймерной прогулки»

3.4. Сравнительный анализ фрагмента плазмиды рАН 36-4СРА в формате базы данных GenBank

3.5. Филогенетическое положение генов mob плазмиды рАН 36-4СРА штамма Citrobacter hydrophila

3.6. Сравнительный анализ кластера mob генов плазмиды рАН 36-4СРА

3.6.1. Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов mob А 77 плазмиды рАН 36-4СРА

3.6.2. Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов тоЬВ 80 плазмиды рАН 36-4СРА

3.6.3. Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов тоЬС 82 плазмиды рАН 36-4СРА

3.6.4. Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов mobD 84 плазмиды рАН 36-4СРА

3.7. Исследование процесса трансфера плазмиды рАН 36-4СРА

С. hydrophila IBRB-36 4СРА

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и структурно-функциональная характеристика генов мобилизации плазмиды pAH 36-4CPA"

Согласно способности к трансферу плазмиды классифицируются на коньюгативные (самотрансмиссибельные) и мобилизируемые (трансмиссибельные в присутствии дополнительных коньюгационных факторов). Коньюгативные плазмиды обладают детерминантами функций, требующихся для реализации механизмов передачи плазмид от клетки к клетке. Мобилизируемые плазмиды имеют небольшие размеры, они обычно несут область мобилизации {mob), кодирующую специфические компоненты белков мобилизации и область начала переноса (oril) (Pansegrau W., Lanka E., 1996; Zechner E. L., et al., 2000). Отмечено, что плазмиды, способные к мобилизации, могут переносить генетическую информацию не только среди грамположительных и грамотрицательных бактерий, но также в клетки растений и эукариот (дрожжей) (Kado C.I., 1994; Bravo-Angel А. М., et al., 1999). Как оказалось, именно мобилизируемые плазмиды имеют огромное значение в процессах поддержания и распространения экофизиологических признаков, в частности, деградации ксенобиотиков и устойчивости к химическим факторам среды, включая антибиотики.

Вместе с тем следует отметить, что анализ разнородности и разнообразия мобилизируемых плазмид проведен в меньшей степени, чем это сделано для коньюгативных плазмид. Поэтому исследования особенностей строения мобилизируемых плазмид становятся особенно важными. Изучение последовательностей нуклеотидов мобилизируемых плазмид позволяет раскрыть механизмы трансфера и установить филогенетические отношения среди членов различных таксонов. Привлечение ресурсов современных баз данных для изучения структурных особенностей генов мобилизации позволяет предложить их классификацию в семействах и подсемействах, а описание генетической организации каждого семейства, их характерных черт и отношений среди кодируемых ими белков определяет подход к характеристике глобального генного пула мобилизируемых плазмид.

1. провести рестрикционный анализ плазмиды рАН36-4СРА штамма Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4СРА;

2. определить последовательность нуклеотидов фрагментов плазмиды рАН 36-4СРА;

3. идентифицировать гены мобилизации плазмиды рАН 36-4СРА;

4. выявить филогенетическое положение генов mob плазмиды рАН 36-4СРА;

5. изучить структуру кластера mob генов плазмиды рАН 36-4СРА;

6. провести сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов генов mobA, mobC, тоЬВ и mobD плазмиды рАН 36-4СРА;

7. оценить трансфер плазмиды рАН 36-4СРА в клетки других бактерий. Научная новизна исследования. Идентифицирована последовательность нуклеотидов кластера генов мобилизации плазмиды рАН36-4СРА Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4СРА. Длина последовательности составляет 1809 п.н. Показано, что система мобилизации плазмиды рАН36-4СРА объединяет 4 гена: mob А, В, С, и D. Длина mob к составляет 1497 п.н., тоЪВ - 489 п.н., тоЬС - 324 п.н., mobD - 216 п.н.

Выявлена структурная организация кластера генов мобилизации плазмиды рАН36-4СРА. Установлено, что гены тоЬВ и mobD располагаются внутри гена тоЬА, в то время как последовательность тоЬС частично перекрывается геном тоЬА.

Обнаружена возможность трансфера плазмиды рАН 36-4СРА в клетки штаммов Gluconobacter oxydans IBRB-2T и Raoultellaplcmticola IBRB-33 4CPA.

Практическая значимость работы. Полученные в данном исследовании результаты раскрывают молекулярно-генетические особенности строения систем мобилизации малых плазмид и вносят существенный вклад в понимание процессов их функционирования. Результаты работы могут быть применены для создания новых векторных систем в области генной инженерии.

Апробация работы. Результаты работы были обсуждены в ходе работы Первого конгресса европейских микробиологов (Словения, 2003), 1-го Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), конференции ELSO (Франция, 2004), 7-ой, 9-ой и 10-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003, 2005, 2006), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), Всероссийской молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва,

2005).

Гранты. Работа была проведена при содействии Государственного контракта Э0029 «Экспедиционные исследования микроорганизмов промзоны нефтехимического производства», ФЦП «Интеграция науки высшего образования России на 2002-2006 годы», РФФИ-Агидель 02-0497911, гранта Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие» и программы Президиума РАН «Поддержка молодых ученых».

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ситдикова, Лейсан Радисовна

1. Идентифицирована носледовательность нуклеотидов кластера генов

мобилизации плазмиды рАН36-4СРА Citrobacter hydrophyla IBRB-36

4СРА. Длина последовательности составляет 1809 п.н. 2. Показано, что система мобилизации плазмиды рАН36-4СРА состоит из

генов mob А, В, С, и D. Длина тоЬк составляет 1497 п.н., тоЬВ - 489

н.н, тоЬС - 324 п.н, mobD - 216 п.н. 3. Установлена структурная организация кластера генов мобилизации

плазмиды рАН36-4СРА. Показано, что гены тоЬВ и mobD

располагаются внутри гена mob А, в то время как последовательность

тоЬС частично перекрывается геном тоЬА.

4. Выявлено филогенетическое положение генов mob плазмиды рАН36-4СРА.

Установлено общее происхождение mob генов плазмид рАН 36-4СРА

Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, pECOl Enterobacter cloacae и

Aeromonas hydrophila рАП3680. 5. Выявлено, что нлазмида рАП36-4СРА может быть мобилизована в

клетки Gluconobacter oxydans IBRB-2T и Raoultellaplanticola ЮИВ-ЗЗ 4СРА.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ситдикова, Лейсан Радисовна, Уфа

1. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина. 1978. 394 с.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. Под ред. А.А. Баева. М.: Мир, 1984.-480 с.

3. Методы общей бактериологии: в 3-х т. Под. ред. Ф. Герхарда и др. М.: Мир, 1990. 4.

4. Пехов А.П. Плазмиды бактерий. М.: Медицина, 1986. 224 с. Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК. М.: Паука, 1999.-429 с.

5. Aelion СМ., Swindoll СМ. and Pfaender F.K. Adaptation to and biodegradation of xenobiotic compounds by microbioal communities from a pristine aquifer//Appl. Environ. Microbiol. 1987. Vol. 53. P. 2212-2217.

6. Amabile-Cuevas C.F. and Chicurel M.E. Bacterial plasmids and gene flux Cell. 1992. Vol. 70. P. 189-199.

7. Antoine R. and Locht C. Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-range plasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmids from gram-positive organisms Mol. Microbiol. 1992. Vol. 6. P. 1785-1799.

8. Aravind L. and Koonin E.V. Gleaning non-trivial structural, functional and evolutionary information about proteins by iterative database searches J. Mol. Biol. 1999. Vol. 287. P. 1023-1040.

9. Barkay T. and Pritchard П. Adaptation of aquatic microbial communities to pollutant stress. Microbiol. Sci. 1988. Vol. 5. P. 165-169.

10. Barth P.Т., Tobin L., Shaфe G.S. Development of broad host-range plasmid vectors//Molecular Biology, Pathogenicity and Ecology of Bacterial Plasmids. Plenum Press, New York. 1981. P. 439-448. 92

11. Becker E.C. and Meyer R.J. Recognition of oriT for DNA processing at termination of a round of conjugal transfer J. Mol. Biol. 2000. Vol. 300. P. 1067-1077.

12. Becker E.C. and Meyer R.J. Relaxed specificity of the rl 162 nickase: a model for evolution of a system for conjugative mobilization of plasmids J. Bacteriol. 2003. Vol. 185. P. 3538-3546.

13. Berg Т., Firth N., Apisiridej S., Hettiaratchi A., Leelapom A. and Skurray R.A. Complete nucleotide sequence of pSK41: evolution of staphylococcal conjugative multiresistance plasmids J. Bacteriol. 1998. Vol. 180. P. 43504359.

14. Bhattacharjee M.K. and Meyer R.J. A segment of a plasmid gene required for conjugal transfer encodes a sitespecific, single-strand DNA endonuclease and ligase//Nucleic Acids Res. 1991. Vol. 19. P. 1129-1137.

15. Bhattacharjee M.K. and Meyer R.J. Specific binding of MobA a plasmidencoded protein involved in the initiation and termination of conjugal DNA transfer to single-stranded oriT DNA Nucleic Acids Res. 1993. Vol. 21. P. 4563568.

16. Bimboim H.C. and Doly J. A Rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA //Nucl. Acids. Res. 1979. Vol. 7. P. 1513-1523.

17. Blair D.G. and Helinski D.R. Relaxation complexes of plasmid DNA and protein. I. Strand-specific association of protein and DNA in the relaxed complexes of plasmids ColEl and ColE2 J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P. 8785-8789.

18. Boer R., Russi S., Guasch A., Lucas M, Blanco A.G., Perez-Luque R., Coll M. and de la Cruz F. Unveiling the Molecular Mechanism of a Conjugative 93

19. Bogdanova E.S., Bass LA., Minakhin L.S., Petrova M.A., Mindlin S.Z., Volodin A.A., Kalyaeva E.S., Tiedje J.M., Hobman J.L., Brown N.L., Nikiforov V.G. Horizontal spread of mer operons among Gram-positive bacteria in natural environments Microbiology. 1998. Vol. 144. P. 609-620.

20. Boyd A.C., Archer J.A. and Sherratt D.J. Characterization of the ColEl mobilization region and its protein products Mol. Gen. Genet. 1989. Vol. 217. P. 488-498.

21. Brasch M.A. and Meyer R.J. A 38 base-pair segment of DNA is required in cis for conjugative mobilization of broad host-range plasmid Rl 162 J. Mol. Biol. 1987. Vol. 198. P. 361-369.

22. Burdett V. Identification of tetracycline-resistant R-plasmids in Streptococcus agalactiae (group B) Antimicrob. Agents Chemother. 1980. Vol. 18. P. 753760.

23. Burlage R.S., Bemis L.A., Layton A.C., Sayler G.S. and Larimer F. Comparative genetic organization of incompatibility plasmids//J. Bacteriol. 1990. Vol. 172. P. 6818-6825.

24. Burrus V., Pavlovic G., Decaris B. and Guedon G. Conjugative transposons: the tip of the iceberg Mol. Microbiol. 2002. Vol. 46. P. 601-610.

25. Burrus V., Pavlovic G., Decaris B. and Guedon G. The ICEStl element of Streptococcus thermophilus belongs to a large family of integrative and conjugative elements that exchange modules and change their specificity of integration// Plasmid. 2001. Vol. 48. P. 77-97.

26. Cabezon E and de la Cruz F. TrwB: An Fl-ATPase-like molecular motor involved in DNA transport during bacterial conjugation// Res Microbiol. 2006. Vol. 157. P. 299-305. group degradative 94

27. Caryl J.A. and Thomas CD. Investigating the basis of substrate recognition in the pC221 relaxosome// Mol Microbiol. 2006. Vol. 60. P. 1302-18.

28. Catchpole I., Thomas C, Davies A. and Dyke K.G. The nucleotide sequence of Staphylococcus aureus plasmid pT48 conferring inducible macrolide- lincosamide-streptogramin resistance and comparison with similar plasmids expressing constitutive resistance J. Gen. Microbiol. 1988. Vol. 134. P. 697709.

29. Cesar C.E., Machon C, de la Cruz F. and Llosa M. A new domain of conjugative relaxase TrwC responsible for efficient orzT-specific recombination on minimal target sequences// Mol Microbiol. 2006. Vol. 62. P. 984-996.

30. Chang A.C.Y. and Cohen S.N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid J. Bacteriol. 1978. Vol. 134. P. 1141-1156.

31. Charpentier E., Gerbaud G. and Courvalin P. Conjugative mobilization of the rolling-circle plasmid pIP823 from Listeria monocytogenes BM4293 among gram-positive and gramnegative bacteria J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. P. 3368-3374.

32. Clarke P.H. The evolution of degradative pathways Microbiol Degrradation of Organic Compounds (Gibson D.T., Eds.). Marsel Dekker, New York, NY. 1984. P.I 1-27.

33. Clement P., Pieper D.H. and Gonzalez B. Molecular characterization of a deletion/duplication rearrangement in tfd genes from Ralstonia eutropha Ш Р 134 (pJP4) that improves growth on 3-chlorobenzoic acid but abolishes growth on 2,4-dichlorophenoxyacetic acid Microbiology. 2001. Vol. 147. P. 21412148. 95

34. Climo M.W., Sharma V.K. and Archer G.L. Identification and characterization of the origin of conjugative transfer (oriT) and a gene (nes) encoding a singlestranded endonuclease on the staphylococcal plasmid pGOl J. Bacteriol. 1996. Vol. 178. P. 4975-4983.

35. Cohan F.M. The role of genetic exchange in bacterial evolution ASM News. 1996. Vol. 62. P. 631-636.

36. Cohen S. and Chang A. Revised interpretation of the origin of the pSClOl plasmid J. Bacteriol. 1977. Vol. 132. P. 734-737.

37. Collins S.M. and Hall R.M. Gene cassettes from the insert region of integrons are excised as covalently closed circles Mol. Microbiol. 1992. Vol. 6. P. 2875-2885.

38. Cook D.M. and Farrand S.K. The oriT region of the Agrohacterium tumefaciens Ti plasmid pTiC58 shares DNA sequence identity with the transfer origins of RSFIOIO and RK2/RP4 and with T-region borders J. Bacteriol. 1992. Vol. 174. P. 6238-6246.

39. Courvalin P. Transfer of antibiotic resistance genes between gram-positive and gram-negative bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1994. Vol. 38. P. 1447-1451.

40. Couturier M., Bex F., Bergquist P.L. and Maas W.K. Identification and classification of bacterial plasmids Microbiol. Rev. 1988. Vol. 52. p. 375395.

41. Crellin P.K. and Rood J.I. Tn4451 from Clostridium perfringens is a mobilizable transposon that encodes the functional Mob protein TnpZ Mol. Microbiol. 1998. Vol. 27. P. 631-642. 96

42. Doolittle W. F. and Sapienza C. Selfish genes, the phenotype paradigm and genome evolution//Nature. 1980. Vol. 284. P. 601-603.

43. Dougherty B.A., Hill C, Weidman J.F., Richardson D.R., Venter J.C. and Ross R.P. Sequence and analysis of the 60 kb conjugative, bacteriocin-producing 97

44. Droge M., Puhler A., Selbitschka W. Horizontal gene transfer among bacteria in terrestrial and aquatic habitats as assessed by microcosm and field studies Biol. Fertil. Soils. 1999. Vol. 29. P. 221-245.

45. Drolet M., Zanga P. and Lau P.C. The mobilization and origin of transfer regions of a Thiobacillus ferrooxidans plasmid: relatedness to plasmids RSFlOlOandpSClOl//Mol. Microbiol. 1990. Vol. 4. P. 1381-1391.

46. Espinosa M. et al. Plasmid replication and copy number control The Horizontal Gene Pool: Bacterial Plasmids and Gene Spread (Thomas СМ., Ed.). Harwood Academic Publishers, London. 2000. P. 17.

47. Farias M.E., Grohmann E. and Espinosa M. Expression of the mobM gene of the streptococcal plasmid pMV158 in Lactococcus lactis subsp. Lactis II FEMS Microbiol. Lett. 1999. Vol. 176. P. 403-410.

48. Finnegan J. and Sherratt D. Plasmid ColEl conjugal mobility: the nature of bom a region required in cis for transfer Mol. Gen. Genet. 1982. Vol. 185. P. 344-351.

49. Francia M.V. and Clewell D.B. Identification of new oriT sites on the pheromone responding E. faecalis plasmids pADl and pAM373 ASM Conference on Cell-Cell Communication, Snowbird, Utah. 2001. 254 p.

50. Francia M.V. and Clewell D.B. Amplification of the tetracycline resistance determinant of pAMalphal in Enterococcus faecalis requires a site-specific recombination event involving relaxase J. Bacteriol. 2002. Vol. 184. P. 51875193.

51. Francia M.V. and Clewell D.B. Transfer origins in the conjugative Enterococcus faecalis plasmids pADl and pAM373: identification of the pADl nic site a specific relaxase and a possible TraG-like protein Mol. Microbiol. 2002. Vol. 45. P. 375-395. 98

52. Frantz B. and Chakrabarty A.M. Organization and nucleotide sequence determination of a gene cluster involved in 3-chlorocatechol degradation Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. Vol. 84. P. 4460-4464.

53. Furuya N., Nisioka T. and Komano T. Nucleotide sequence and functions of the oriT operon in Incll plasmid R64 J. Bacteriol. 1991. Vol. 173. P. 22312237.

54. Goodner B. et al. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciem C58 Science. 2001. Vol. 294. P. 23232328.

55. Gormley E.P. and Davies J. Transfer of plasmid RSFIOIO by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobactehum smegmatis II J. Bacteriol. 1991. Vol. 173. P. 6705-6708.

56. Grohmann E., Guzman L.M. and Espinosa M. Mobilisation of the streptococcal plasmid pMV158: interactions of MobM protein with its cognate oriT DNA region //Mol. Gen. Genet. 1999. Vol. 261. P. 707-715.

57. Grohmann E., Muth G. and Espinosa M. Conjugative plasmid transfer in grampositive bacteria//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. Vol. 67. P. 277-301.

58. Guerry P., van Embden J. and Falkow S. Molecular nature of two nonconjugative plasmids carrying drug resistance genes J. Bacteriol. 1974. Vol. 117. P. 619-630.

59. Guzman L.M. and Espinosa M. The mobilization protein, MobM, of the streptococcal plasmid pMV158 specifically cleaves supercoiled DNA at the plasmid oriT. J. Mol. Biol. 1997. Vol. 266. P. 688-702.

60. Harayama S., Rekik M., Bairoch A., Neidle E.L. and Ornston L.N. Potential DNA slippage structures acquired during evolutionary divergence of 99

61. Harayama S. and Timmis K.N. Aerobic biodegradation of aromatic hydrocarbons by bacteria// Degradation of Environmental Pollutants by Microorganisms and their metalloenzymes (Sigel H., Sigel A., Eds.) Marcel Dekker, New York. NY. 1992. P. 99-157.

62. Hattori Y., Suzuki K., Uraji M., Ohta N., Katoh A. and Yoshida K. Genome structure of pTi-SAKURA (I): strategy for DNA sequencing of a Japanese cheny-Ti plasmid //Nucleic Acids Symp. Ser. 1997. P. 159-160.

63. Henderson D. and Meyer R. The MobA-linked primase is the only replication protein of R1162 required for conjugal mobilization J. Bacteriol. 1999. Vol. 181,2973-2978.

64. Henderson D. and Meyer R.J. The primase of broadhost-range plasmid Rl 162 is active in conjugal transfer J. Bacteriol. 1996. Vol. 178. P. 6888-6894.

65. Hendrix R.W., Lawrence J.G., Hatfull G.F. and Casjens S. The origins and ongoing evolution of viruses Trends Microbiol. 2000. Vol. 8. P. 504-508.

66. Hickey R.M., Twomey D.P., Ross R.P. and Hill С Exploitation of plasmid pMRCO 1 to direct transfer of mobilizable plasmids into commercial lactococcal starter strains //Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67 P. 2853-2858.

67. Hill K. E. and Top E.M. Gene transfer in soil systems using microcosms FEMS Microbiol. Ecol. 1998. Vol. 25. P. 319-329.

68. Ilyina T.V. and Koonin E.V. Conserved sequence motifs in the initiator proteins for rolling circle DNA replication encoded by diverse replicons from eubacteria, eucaryotes and archaebacteria Nucleic Acids Res. 1992. Vol. 20. P.3279-3285. 100

69. Kado C.I. Origin and evolution of plasmids Antonie van Leeuwenhoek. 1998. Vol. 73. P. 117-126.

70. Kasberg Т., Daubaras D.L., Chakrabarty A.M., Kinzelt D. and Reineke W. Evidence that operons tcb, tfd, and clc encode maleylacetate reductase, the fourth enzyme of the modified ortho pathway J. Bacteriol. 1995. Vol. 177. P. 3885-3889.

71. Koehler T.M. and Thome C.B. Bacillus subtilis (natto) plasmid pLS20 mediates interspecies plasmid transfer J. Bacteriol. 1987. Vol. 169. P. 52715278.

72. Kumar S., Tamura K., Jakobsen I.B. and Nei M. MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software Bioinformatics. 2001. Vol. 17. P. 1244-1245. 87. LAbee-Lund T.M. and Sorum H. A global nonconjugative Tet С plasmid, pRAS3, from Aeromonas salmonicida II Plasmid. 2002. Vol. 47. P. 172-181.

73. Laemmli СМ., Leveau J.H.J., Zehnder A.J.B., and van der Meer J.R. Characterization of a second tfd gene cluster for chlorophenol and chlorocatechol metabolism on plasmid pJP4 in Ralstonia eutropha JMP 134 (pJP4) in. Bacteriol. 2000. Vol. 182.P. 4165-4172.

74. Lampson B.C. and Parisi J.T. Nucleotide sequence of the constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin В resistance plasmid pNE131 from Staphylococcus epidermidis and homologies with Staphylococcus aureus plasmids pE 194 andpSN2 //J. Bacteriol. 1986. Vol. 167. P. 888-892.

75. Lanka E. and Wilkins B.M. DNA processing reactions in bacterial conjugation //Annu. Rev. Biochem. 1995. Vol. 64 P. 141-169. 101

76. Lawrence J.C. and Ochman, H. Molecular archaeology of the Escherichia coli genome//Proc. Narl. Acad. Sci. 1998. Vol. 95. P. 9413-9417.

77. Lessl M. and Lanka E. Common mechanisms in bacterial conjugation and Timediated T-DNA transfer to plant cells Cell. 1994. Vol. 77. P. 321-324.

78. Leveau J.H.J., Zehnder A.J.B. and van der Meer J.R. Genetic characterization of the insertion sequence IS JP4 on plasmid PJP4 from Ralstonia eutropha JMP 134//Gene. 1997. Vol. 202. P. 103-114.

79. Lovett M.A. and Helinski D.R. Relaxation complexes of plasmid DNA and protein, П. Characterization of the proteins associated with the unrelaxed and relaxed complexes of plasmid ColEl J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P. 87908795.

80. Mason J.R., Cammack R. The electron-transport proteins of hydroxylating bacterial dioxygenases Annu. Rev. Microbiol. 1992. Vol. 46. P. 277-305.

81. Mazodier P. and Davies J. Gene transfer between distantly related bacteria Annu. Rev. Genet. 1991. Vol. 25. P. 147-171.

82. Meijer W.J., Wisman G.B., Terpstra P., Thorsted P.B., Thomas СМ., Holsappel S., Venema G. and Bron S. Rolling-circle plasmids from Bacillus subtilis: complete nucleotide sequences and analyses of genes of pTA1015, pTA1040, pTA1050 and рТАЮбО, and comparisons with related plasmids from gram-positive bacteria FEMS Microbiol. Rev. 1998. Vol. 21. P. 337368.

83. Mergeay M., Lejeune P., Sadouk A., Gerits J. and Fabry L. Shuttle transfer (or retrotransfer) of chromosomal markers mediated by plasmid pULBl 13 Mol. Gen. Genet. 1987. Vol. 209. P. 61-70. 102

84. Mills D.A., Phister T.G., Dunny G.M. and McKay L.L. An origin of transfer (oriT) on the conjugative element 98 pRSOl from Lactococcus lactic subsp. lactis ML3 //Appl. Environ. Microbiol. 1998. Vol. 64. P. 1541-1544.

85. Mrkobrada S., Boucher L., Ceccarelli D.F., Tyers M. and Sicheri F. Structural and functional analysis of Saccharomyces cerevisiae Mobl//J.Mol.Biol. 2006. Vol. 362. P. 430.

86. Muфhy C.G. and Malamy M.H. Characterization of a "mobilization cassette" in transposon Tn4399 from Bacteroides fragilis II J. Bacteriol. 1993. Vol. 175. P.5814-5823.

87. Naglich J.G. and Andrews Jr. R.E. Tn916-dependent conjugal transfer of PC 194 and PUB 110 from Bacillus subtilis into Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis II Plasmid. 1988. Vol. 20. P. 113-126. 105. Nei M. and Kumar S. Molecular evolution and phylogenetics// Oxford University Press. 2000.

88. Neidle E.L., Hartnett C, Bonitz S. and Ornston L.N. DNA sequence of the Acinetobacter calcoaceticus catechol 1,2-dioxygenase I structural gene catA: evidence for evolutionary divergence of intradiol dioxygenases by acquisition of DNA sequence repetitions J. Bacteriol. 1988. Vol. 170. P. 4874-4880.

89. Neidle E.L., Hartnett C, Ornston L.N., Bairoch A., Rekik M., Harayama S. Nucleotide sequences of the Acinetobacter calcoaceticus benABC genes for benzoate 1,2-dioxygenase reveal evolutionary relationships among multicomponent oxygenases//J. Bacteriol. 1991. Vol. 173. P. 5385-5395.

90. Neilson J.W., Josephson K.L., Pepper I.L., Arnold R.G., DiGiovanni G.D. and Sinclair N.A. Frequency of horizontal gene transfer of a large catabolic plasmid (pJP4) in soil //Appl. Environ. Microbiol. 1994. Vol. 60. P. 4053-4058. 103

91. Novick R.P. Staphylococcal plasmids and their replication Armu. Rev. Microbiol. 1989. Vol. 43. P. 537-565.

92. Nunez B. and de la Cruz F. Two atypical mobilization proteins are involved in plasmid CloDF 13 relaxation//Mol. Microbiol. 2001. Vol. 39. P. 1088-1099.

93. Orgel L.E. and Crick F.H.C. Selfish DNA Nature. 1980. Vol. 288. P. 601603.

94. Ornston L.N., Houghton J., Neidle E.L. and Gregg L.A. Subtle selection and novel mutation during evolutionary divergence of the P-ketoadipate pathway.// Pseudomonas: Biotransformations, Pathogenesis and Evolving Biotechnology (Silver S., Chakrabarty A.M., Iglewaki B. and Kaplan S., Eds.) American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1990. P.207-225.

95. Osbom A.M., Bruce K.D., Strike P. and Ritchie D.A. Distribution, diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon FEMS Microbiol. 1997. Rev. 19. P. 239-262.

96. Pansegrau W., Balzer D., Kruf, V., Lurz R. and Lanka E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P. 6555-6559.

97. Pansegrau W. and Lanka E. Common sequence motifs in DNA relaxases and nick regions from a variety of DNA transfer systems Nucleic Acids Res. 1991. Vol. 19. P. 3455.

98. Pansegrau W., Schrode W. and Lanka E. Concerted action of three distinct domains in the DNA cleaving joining reaction catalyzed by relaxase (Tral) of conjugative plasmid RP4 J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 2782-2789.

99. Pansegrau W. and Lanka E. Enzymology of DNA transfer by conjugative mechanisms. Prog. Nucleic Acids Res. //Mol. Biol. 1996. Vol. 54. P. 197-251. 104

100. Perkins E.J., Gordon M.P., Caceres O., Lurquia P.F. Organization and sequence analysis of the 2,4-dichlorophenol hydroxylase and dichlorocatechol oxidative operons of plasmid pJP4 //J. Bacteriol. 1990. Vol. 172. P. 2351-2359.

101. Perwez T. and Meyer R. MobB protein stimulates nicking at the Rl 162 origin of transfer by increasing the proportion of complexed plasmid DNA J. Bacteriol. 1996. Vol. 178. P. 5762-5767.

102. Perwez T. and Meyer R.J. Mobilization of the non-conjugative plasmid RSFIOIO: a genetic and DNA sequence analysis of the mobilization region Mol. Gen. Genet. 1999. Vol. 206. P. 161-168.

103. Perwez T. and Meyer R.J. Stabilization of the relaxosome and stimulation of conjugal transfer are genetically distinct functions of theRl 162 proteinMobB J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. P. 2124-2131.

104. Plumeier I., Perez-Pantoja D., Heim S., Gonzalez В., Pieper D.H. Importance of different tfd genes for degradation of chloroaromatics by Ralstonia eutropha JMP134//J. Bacteriol. 2002. Vol. 184. P. 4054-4064.

105. Priebe S.D. and Lacks S.A. Region of the streptococcal plasmid pMV158 required for conjugative mobilization J. Bacteriol. 1989. Vol. 171. P. 47784784.

106. Projan S.J. and Archer G.L. Mobilization of the relaxable Staphylococcus aureus plasmid pC221 by the conjugative plasmid pGOl involves three pC221 loci//J. Bacteriol. 1989. Vol. 171. P. 1841-1845.

107. Ramos J.L., Stolz, A., Reneke W. and Timmis K.N. Altered effector specificities in regulators of gene expression: TOL plasmid xylS mutants and their use to engineer expansion of the range of aromatics degraded by bacteria //Proc. Natl.Acad.Sci. USA. 1986. Vol. 83. P.8467-8471. 105

108. Reineke W. and Knachmuss H.-J. Microbial degradation of haloaromatics Annu. Rev. Microbiol. 1988. Vol. 42. P. 263-287.

109. Reineke W. Development of hybrid strains for the mineralization of chloraromatics by patchwork assembly Annu Rev Microbiol. 1998. Vol. 52. P. 287-331.

110. Rensing C, Deborah Т., Newby D.T., Pepper I.L. The role of selective pressure and selfish DNA in horizontal gene transfer and soil microbial community adaptation Soil Biol. and Biochem. 2002. Vol. 34. P. 285-296.

111. Richard Meyer. Identification of the mob Genes of Plasmid pSClOl and Characterization of a Hybrid pSClOl-Rl 162 System for Conjugal Mobilization //J. Bacteriol. 2000 Vol.182. P.4875-4881.

112. Rohrer J. and Rawlings D.E. Sequence analysis and characterization of the mobilization region of a broad-hostrange plasmid, pTF-FC2, isolated from Thiobacillusferrooxidans in. Bacteriol. 1992. Vol. 174. P. 6230-6237.

113. Sachelam P., Schiltz E., and Brandsch.R. A Functional mobA Gene for Molybdopterin Cytosine Dinucleotide Cofactor Biosynthesis Is Required for Activity and Holoenzyme Assembly of the Heterotrimeric Nicotine Dehydrogenases of Arthrobacter nicotinovorans//App\ Environ Microbiol. 2OO6.V0I. 72. P. 5126-5131.

114. Saitoti N. and Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees Mol. Biol. Evol. 1987. Vol. 4. P. 406-425.

115. Sakaya N., Kaneko S., Matsunaga S. and Itaya M. Experimental Basis for a Stable Plasmid, pLS30, to Shuttle between Bacillus subtilis Species by Conjugation Transfer//J Biochemistry. 2006. Vol.139. P. 557-561. 106

116. Scherzinger E., Kruft V. and Otto S. Purification of the large mobilization protein of plasmid RSFIOIO and characterization of its site-specific DNAcleaving/DNA-joining activity//Eur J Biochem. 1993. Vol. 217. P. 929-938.

117. Scherzinger E., Lurz R., Otto S., Dobrinski B. In vitro cleavage of double- and single-stranded DNA by plasmid RSFlOlO-encoded mobilization proteins// Nucleic Acids Res. 1992. Vol. 20. P.418.

118. Scholz P., Haring V., Wittmann-Liebold В., Ashman K., Bagdasarian M. and Scherzinger E. Complete nucleotide sequence and gene organization of the broad-host-range plasmid RSFIOIO Gene. 1989. Vol. 75. P. 271-288.

119. Selinger L.B., McGregor N.F., Khachatourians G.G. and Hynes M.F. Mobilization of closely related plasmids pUBllO and pBC16 by bacillus plasmid pXO503 requires transacting open reading frame beta J. Bacteriol. 1990. Vol. 172. P. 3290-3297.

120. Showsh S.A. and Andrews Jr. R.E. Functional comparison of conjugative transposons Tn916 and Tn925 Plasmid. 1996. Vol. 35. P. 164-173.

121. Silver S. and Phung L.T. Bacterial heavy metal resistance: new surprises Ann. Rev. Microbiol. 1996. Vol. 50. P. 753-789.

122. Smalla K., Osbom M. and Wellington E.M.H. Isolationand characterisation of plasmids from bacteria. In: The Horizontal Gene Pool: Bacterial Plasmids and Gene Spread (Thomas, C.M., Ed.). Harwood Academic Publishers, London. 2000. P. 207-248.

123. Smith C.J. and Parker A.C. The transfer origin for Bacteroides mobilizable transposon Tn4555 is related to a plasmid family from gram-positive bacteria J. Bacteriol. 1998. Vol. 180. P. 43539. 107

124. Springael D., Diels L., Hooyberghs L., Kreps S. and Mergeay, M. Construction and characterization of heavy metal-resistant haloaromaticdegrading Alcaligenes eutrophus strains Appl. Environ. Microbiol. 1993. Vol. 59. P. 334-339.

125. Srinivas P., Kilic A.O. and Vijayakumar M.N. Sitespecific nicking in vitro at ori T by the DNA relaxase of Tn5252 Plasmid. 1997. Vol. 37. P. 42-50.

126. Stiens M., Schneiker S., Keller M., Kuhn S., Puhler A., andSchluter A. Sequence Analysis of the 144-Kilobase Accessory Plasmid pSmeSMlla, Isolated from a Dominant Sinorhizobium meliloti Strain Identified during a Long-Term Field Release Experiment// Appl Environ Microbiol. 2006. Vol. 72. P.3662-3672.

127. Sykora P. Macroevolution of plasmids a model for plasmid speciation J. Theor. Biol. 1992. Vol. 159. P. 53-65.

128. Szpirer C, Top E., Couturier M. and Mergeay M. Retrotransfer orgene capture: a feature of conjugative plasmids, with ecological and evolutionary significance //Microbiology 1999. Vol. 145. P. 3321-3329.

129. Szpirer C.Y., Faelen M. and Couturier M. Mobilization function of the pBHRl plasmid, a derivative of the broad-hostrange plasmid pBBRl J. Bacteriol. 2001. Vol. 183. P. 2101-2110.

130. Taghavi S., Mergeay M. and van der Lelie D. Genetic and physical maps of the Alcaligenes eutrophus CH34 megaplasmid pMOL28 and its derivative pMOLSO obtained after temperature-induced mutagenesis and mortality Plasmid. 1997. Vol. 37. P. 22-34. 108

131. Thorsted P.B. et al. Complete sequence of the IncPbeta plasmid R751: implications for evolution and organisation of the IncP backbone J. Mol. Biol. 1998. Vol. 282. P. 969-990.

132. Timmis K.N. and Pieper D.H. Bacteria designer for bioremediation Trends Biotechnol. 1999. Vol. 17. P. 200-204. 157. Top E.M., De Rore H., Collard J.M., Gellens V., Slobodkina G., Verstraete W. and Mergeay M. Retromobilization of heavy metal resistance genes in unpolluted and heavy metal polluted soil FEMS Microbiol. Ecol. 1995. Vol. 18. P. 191-203.

133. Toussaint A. and Merlin C. Mobile elements as a combination of functional modules Plasmid. 2002. Vol. 47. P. 26-35.

134. Varsaki A., Lucas M., Afendra A.S., Drainas C. and de la Cruz F. Genetic and biochemical characterization of MbeA, the relaxase involved in plasmid ColEl conjugative mobilization Mol. Microbiol. 2003. Vol. 48. P. 481-493.

135. Vedantam G., Novicki T.J. and Hecht D.W. Bacteroides fragilis transfer factor Tn5520: the smallest bacterial mobilizable transposon containing single integrase and mobilization genes that function in Escherichia coli J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. P. 2564-2571.

136. Wang A. and Macrina F.L. Streptococcal plasmid pIP501 has a functional oriT site J. Bacteriol. 1995. Vol. 177. P. 4199-4206.

137. Wang K., Herrera-Estrella A. and Van Montagu M. Overexpression of virDl and virD2 genes in Agrobacterium tumefaciens enhances T-complex formation and plant transformation//J. Bacteriol. 1990. Vol. 172. P. 4432-4440.

138. Whittle G., Hund B.D., Shoemaker N.B. and Salyers A.A. Characterization of the 13-kilobase ermF region of the bacteroides conjugative transposon CTnDOT//Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67. P. 3488-3495.

139. Willetts N. and Crowther C. Mobilization of the nonconjugative IncQ plasmid RSFIOIO Genet. Res. 1981. Vol. 37. P. 311-316.

140. Woese C.R. Bacterial evolution//Microbiol. Rev. 1987. Vol. 51. P 221-271. 10

141. Yamada Y., Yamada M. and Nakazawa A. A ColEl-encoded gene directs entry exclusion of the plasmid J. Bacteriol. 1995. Vol. 177. P. 6064-6068. 174. Yim G, de la Cruz F, Spiegelman G.B. and Davies J. Transcription modulation of S. typhimurium promoters by sub-MIC levels of rifampicin// J Bacteriol. 2006. Vol. 188. P.7988-7991.

142. Zatyka M. and Thoma CM. Control of genes for conjugative transfer of plasmids and other mobile elements FEMS Microbiol. Rev. 1998. Vol. 21. P. 91-319.

143. Zhang S. and Meyer R. J. Localized denaturation of oriT DNA within relaxosomes of the broad-host-range plasmid R1162// Mol Microbiol. 1995. Vol. 17. P. 727-735.

144. Zhang S. and Meyer R. The relaxosome protein MobC promotes conjugal plasmid mobilization by extending DNA strand separation to the nick site at the origin of transfer Mol. Microbiol. 1997. Vol. 25. P. 509-516.

145. Zhou L., Timmis K.N. and Ramos J.L. Mutations leading to constitutive expression from the TOL plasmid meta-cleavage pathway operon are located at the C-terminal end of the positive regulator protein XylS J.Bacteriol. 1990. Vol. 172. P. 3707-3710.

146. Ziegelin G., Pansegrau W., Strack В., Balzer D., Kroger M., Kruft V. and Lanka E. Nucleotide sequence and organization of genes flanking the transfer origin of promiscuous plasmid RP4 DNA Seq. 1991. Vol. 1. P. 303-327. Ill

Информация о работе

Ситдикова, Лейсан Радисовна
кандидата биологических наук
Уфа, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Идентификация и структурно-функциональная характеристика генов мобилизации плазмиды pAH 36-4CPA - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы