Молекулярно-генетический анализ регуляции азотного метаболизма фотосинтезирующей бактерии Rhodobacter sphaeroides

Зинченко, Владислав Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ регуляции азотного метаболизма фотосинтезирующей бактерии Rhodobacter sphaeroides
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ регуляции азотного метаболизма фотосинтезирующей бактерии Rhodobacter sphaeroides"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВЛ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Р Г Б ОД

1 3 МАГ] 1936 На правах рукописи

УДК 575.113:577.152.6:579.8:579.52.08

Зинченко Владислав Владимирович

Молекулярно-генетический анализ регуляции азотного метаболизма г фотосинтезирующей бактерии ШюйоЬааег 5р1шего1(1е5

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Специальность 03.00.07 - Микробиология 03.00.15 - Генетика

Москва 1996

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции биологического факультета Московского государственного университета им. М.ВЛомоносова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Р-Н. Ивановский

доктор биологических ваук, профессор В.В. Суходолец

доктор биологических наук, профессор Н.К. Янковский

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Центр "Биоинженерия" РАН

. , .. .. 'Защита состоится: "О "С/МУЬС 1996 г. в_часов

на заседании, диссертационного Ученого совета Д 053.05.66

при Московском государственном университете им М.ВЛомоносова по адресу:

119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет

С материалами диссертации можно ознакомится в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

Н.Ф.Пискунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фототрофные пурпурные неверные бактерии, относящиеся к семейству RhodospiuUaceae - это гракоприпательныс водные микроорганизмы, осушествляющие аноксигенный тип фотосинтеза и способные к азотфиксации. Благодаря этим особенностям представители семейства Rhodospirillaceae.широко распространены в природных экосистемах и являются их важными компонентами.

Особый интерес к пурпурным несерным бактериям обусловлен, прежде всего, их широкими метаболическими возможностями. Представители Rhodospirillaceae способны к . пяти различным типам роста: фотолитоазтотрсфному росту за счет энергии солнечного света с использованием Н2 в качестве донора электронов и СО2 в качестве акцептора электронов и источника углерода; фотогетеротрофному росту в анаэробных условиях с использованием различных органических соединений в качестве донора электронов; анаэробному (ферментативному) росту в темноте с использованием различных Сахаров в качестве доноров электронов и единственного источника энергии; аэробному хемогетеротрофному росту в темноте; аэробному хемолнтоавтотрофному росту в темноте с использованием Н2 в качестве источника энергии, О2 в качестве акцептора электронов и СО2 в качестве источника углерода (Madigan-- and ■ Gest,* • 1979). Поэтому неудивительно, что представители пурпурных несерных бактерий используются в качестве модельных объектов для изучения ряда фундаментальных биологических процессов: фотосинтеза, биогенеза мембран, фиксации углекислого газа и молекулярного азота. Широкие метаболические возможности пурпурных несеркых бактерий позволяют исследовать взаимодействие этих процессов на уровне их- генетического контроля, тогда как в других биологических системах эти процессы разобщены.

Исследование механизмов генетической регуляции азотфиксации у пурпурных несерпых бактерий, способных осуществлять этот процесс за счет анергии солнечного света, представляет не только теорепгаескии, но и фактический интерес. Фотосинтезирующие пурпурные несерные бактерии являются перспективными объектами биотехнологии и могут быть использованы для решения практических задач очистки сточных вод от токсичных соединений, в качестве продуцентов биотоплива (Н2) и биологически активных соединений, а также источника белково-витаминной биомассы для животноводства. Например, показано, что по содержанию убихинова Qhj, используемого в

медицине, пурпурные несерные бактерии в 200 раз превосходят дрожжи, являющиеся промышленным продуцентом этого соединения (Гоготов, 1988).

К началу ваших исследований (1980 г.) наиболее быстрыми темпами развивалась генетика азотфиксации у Klebsiella pneumoniae, представителя семейства Enterobacteriaceae. Выбор K.pneumoniae в качестве модельного объекта был обусловлен ее генетической близостью к E.coli, что дало возможность исследовать K.pneumoniae с помощью всего арсенала методов генетихи бактерий и молекулярной генетики. Среди пурпурных бактерий основными объектами для изучения генетического контроля процесса азотфиксации и его регуляции стали Rhodobacter capsulatus и Rhodobacter sphaeroides, у которых были получены мутанты, дефектные по метаболизму азота (Зиновьева и др., 1980; Shestakov et al., 1979; Wall й al., 1975, 1976; Willison and Vignais, 1982). Однако в генетическом плаве эти бактерии были плохо изучены. Процесс генетической рекомбинации у фототрофных бактерией впервые был описан у R.capsulatus. У этой бактерии обнаружили уникальную систему переноса генетической информации, так называемую капсдукцию, осуществляемую фагоподобными частицами GTA (gene transfer agent; Mans, 1974). Однако небольшой размер фрагментов траждуцирующей ДНК ограничивал использование GTA для анализа несцепленных генов. Кроме того, GTA-капсдукция осуществляется только в пределах определенных штаммов одного вида - R.capsulatus. Разработка систем конъюгацяонного переноса хромосомных генов R.sphaeroides и R.capsulatus, основанная на использовании плазмид IncP-группы (Maris, 1981; Sistrom, 1977; Pembeitoa and В oven, 1981), послужила толчком для дальнейшего развития генетики фотосинтезирующих пурпурных бактерий. Эти работы явились для нас предпосылкой создания систем клонирования генов в клетках пурпурных бактерий и изучения генетического контроля азотного метаболизма. В качестве объела исследования использовали штамм R.sphaeroides 2R, выделенный сотрудниками кафедры микробиологии МГУ под руководством .Е.Н.Кондратьевой и оказавшийся удобной моделью для молекулярно-генетического изучения азотфиксации на кафедре генетики и селекции МГУ под руководством С.ВЛИесгахова.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении механизмов генетической регуляции азотного метаболизма у R.sphaeroides.

В задачи исследования входило:

1. Исследование плазмид различных штаммов R.sphaeroides с целью возможного использования их для создания векторов клонирования.

2. Разработка систем переноса векторных плазмид в клетки пурпурных бактерий.

3. Создание различных типов векторных плазмид для клонирования генов в клетках R.sphaeroides.

4. Исследование в клетках R.sphaeroides экспрессии генов K.pneumoniae, контролирующих процесс азотфиксации.

5. Клонирование и молекулярный анализ гена glnA. R.sphaeroides, кодирующего глутаминсинтетазу (ГС); выяснение роли гена glnA в регуляции синтеза и активности яитрогеназы (НГ) и метаболизма ионов аммония.

6. Молехулярно-генетический и физиолого-биохимичесжий анализ мутантов пурпурных бактерий с плейотрошшми нарушениями азотного метаболизма.

7. Клонирование, идентификация и изучение генов, участвующих в регуляции метаболизма азота у R.sphaeroides.

8. Исследование экспрессии генов, контролирующих процесс азотфиксации у пурпурных несерных бактерий, в клетках различных штаммов R.sphaeroides.

9. Построение схемы генетической регуляции азотфиксации у R.sphaeroides.

Научная новизна. Разработано новое направление генетики фотосинтезарующих пурпурных бактерий, основанног на использовании методологии генной инженерии. Созданные новые системы переноса, клонирования и анализа генов позволяют решать широкий крут задач молекулярной генетики этой группы бактерий.

Выделена и охарактеризована новая плазмида IncQ-гругтпы - R89S, репликация которой зависит от ДНК-полимеразы I и осуществляется в отсутствии синтеза белка de novo. Показано, что плазмида R89S является удобной основой для создания интегративных векторов клонирования, позволяющих вводить генетическую информацию в хромосому или эндогенные плазмиды фотосинтезирующих пурпурных бактерий.

Клонирован и секвенирован ген glnA R.sphaercides; показано, что он входит ,в состав оперояа glnBA, транскрипция которого glnBA осуществляется с NtrC-зазнсимого прсмотора, расположенного в лидерной области гена ntrB. Определена молекулярная природа мутации gInA83, инактивирующей продукт гена glnA и нарушающей регуляцию синтеза и активности НГ ионами аммония.

Обнаружены \ новые гены ntrE, fitrD и ntrX R.sphaeroides, которые принимают участие в регуляции азотного метаболизма и не имеют гомологии с известными генами, контролирующими этот процесс у бактерий. Установлено, что эти гены расположены в одном кластере с опероном glnBA. Ген ntrX принадлежит к неизвестной ранее двухкомпонентной системе регуляции

адаптивного ответа бактерий, которая наряду с системой NtrB/NtrC принимает участие в контроле азотного метаболизма у Я.5рЬаего!<1ез.

Клонировали неизвестные ранее гены adgA (пас1Е) К.5рЬаег01с1е5 и Й.сарзЫаШз,- мутации в которых оказывают плейотропный эффект на азотный метаболизм. Показано, что ген adgA непосредственно не вовлечен в регуляцию азотного метаболизма, но мутации в этом гене могут оказывать непрямой метаболический эффект на способность к азотфиксации. ■

Клонированы регуляторные гены шгВ и ШгС к.5рЬаего:<Зез и установлена молекулярная природа плейотропной мутации пйгС12, нарушающей регуляцию азотного метаболизма. Показано, что в клетках &.5рЬаепй<1ез гены шхВ и псС участвуют в регуляции не только азотфиксации, но и других систем азотного метаболизма. Впервые установлено, что основным фактором, обуславливающим сходный комплекс изменений в азотном метаболизме у мутантов по генам е1пА, шгВ и пй-С с дерепрессированной НГ в присутствии высоких концентраций аммония, является низкий уровень активности ГС в их клетках. На основании молекулярно-генетического изучения генов пггВ и тгС, а также анализа * экспрессии регуляторных шГ-генов К^рЬаегтаёез и Е.сарзЫаоа предложена схема генетической регуляции азотфиксации у И.зрЬаего1ёез в зависимости от азотного статуса клеток.

" Впервые выявлена роль гена ШтС у фсгготрофных бактерий в контроле углеродного метаболизма я установлено, что регуляция азотного и" углеродного/энергетического метаболизма сопряжены на генетичесхом уровне.

Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе новые данные о генетическом - контроле метаболизма азота у К..5рЬаего1<1е5 способствуют более глубокому пониманию механизмов регуляции процессов азотфиксации и азотного метаболизма. Полученные результаты свидетельствуют о взаимосвязи на генетическом уровне азотного метаболизма и углеродного метаболизма, что по-новому освещает проблему координации этих фундаментальных биологических процессов у фототрофных бактерий.

Клонированные гены пурпурных бактерий могут быть использованы в качестве зондов для выявления гомологичных генов у других микроорганизмов. Описанные в работе системы клонирования и переноса генов могут найти широкое применение в генно-инженерных исследованиях на других видах микроорганизмов, особенно тех, для которых методы генетической трансформации ве разработаны или неэффективны.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на III, VI и IX Всесоюзных совещаниях по программе "Плазмнда" (Пущино, 1980, 1981, 1984), IV, V съездах ВОГИС им. Н.И.Вавилова (Кишинев, 1981; Москва,

1987), IV, VII и VIII Международных симпозиумах по фототрофным прокариотам (Бомбан, Франция, 1982; Амерсг, США, 199 l*v Урбино, Италия, 1994), III и V Международных симпозиумах по азотфиксации у небобовых (Хельсинки, Финляндия, 1984; Флоренция, Италия, 1990), Всесоюзной конференция "Новые направления биотехнологии" (Пушино, 1984), VI и VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987, 1990), VII, IX и X Международных конгрессах по азотфиксации (Кельн, ФРГ, 1988; Канкун, Мексика, 1992; Санкт-Петербург, 1995), IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент,

1988), Международной конференции "Проблемы и перспективы современной биотехнологии" (Братислава, ЧССР, 1989), VIII Восточно-европейском симпозиуме по биологической азотфиксации (Саратов, 1992), 9 Баховском коллоквиуме по азотфиксации Москва, 1995).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, описания материалов и методов исследования, пяти глав экспериментальной части с изложением результатов работы и их обсуждения, (заключения) основных выводов и списка датированной литературы. Материалы диссертации изложены на 335 стр. машинописного текста, включают 51 рисунок и 36 таблиц. Список литературы включает 274 наименования.

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Экспериментальные результаты, изложенные в диссертации, получены автором лично," а также совместно с сотрудниками и аспирантами кафедры генетики, работавшими под руководством диссертанта. Часть работы по исследованию гена adgA пурпурных бактерий была проведена в соавторстве с сотрудниками лаборатории биохимии микроорганизмов Центра ядерных исследований, Гренобль, Франция. Соискателю принадлежат разработка программы исследования, схемы основных экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов, выводы из работы. Автор приносит глубокую благодарность С.В.Шестакову, который инициировал и поддерживал эти исследования, а также всем. коллегам, способствовавшим осуществлению данной работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Создание систем переноса и клонирования генов в клетках R.sphaeroides .

1.1. Плазмиды различных штаммов R.sphaeroides и их рестрикоионный анализ

При разработке методов генетического анализа и клонирования генов в каком-либо микроорганизме необходимо предварительно изучить его эндогенные плазмиды. Во-первых, эндогенные плазмиды могут нести гены, определяющие какие-либо свойства организма и, во-вторых, они могут послужить основой для конструирования векторов клонирования. Нами был исследован хиазмидный состав семи штаммов R.sphaeroides различного происхождения. Как видно из табл. 1, все исследованные штаммы содержат от двух до пяти плазмйд размером от 42 до 142 т.п.н. Установлено, что в различных штаммах R.sphaeroides эндогенные плазмиды представлены одной копией на хлетку. По данным рестрикдионного анализа изученные плазмиды имеют по 15 и более сайтов узнавания доя большинства широко используемых крупнощешпцих рестршстаз. Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что эндогенные плазмиды R.sphaeroides из-за больших размеров и наличия, множества рестрикционных сайтов не годятся для конструирования на их основе векторов клонирования.

1.2. Перенос векторных плазмйд из клеток B.coli в клетки R.sphaeroides

Генетическое изучение каждого нового объекта обычно начинается с разработки систем переноса и клонирования генов, разработки методов рекомбинационного и комплементационного анализа. Для R.sphaeroides описана система трансформации клетох плазмидными ДНК (Fonnary and Kaplan, 1982). Тем не менее, введение плазмйд в клетки фототрофных пурпурных бактерий с помощью трансформации не получило распространения из-за низкой эффективности метода. По нашим данным, частота трансформации штамма R-sphaeroides 2R ДНК плазмиды RSF1010 составляла не более 1(Г7 - 10"8 трансформантов • на жизнеспособную реципиентную клетку, что ■ явно недостаточно для проведения генно-инженерных работ. Однако нами показана возможность передачи нехонъюгативных векторных плазмйд из клеток E.coli в клетки R.sphaeroides с помощью их мобилизации конъюгативными плазмидами Р-группы несовместимости. Как следует из данных, приведенных в табл. 2, с

Таблица 1

Плазмидный состав различных штаммов R.sphaeroides

Штамм Обозначение Размер

плазмиды плазмиды в т.п.я.

2R, 2К, 8259 pRS69 104 * 1

pRS94 142 i"3

28/5 pRS56 84 -4

pRS84 126

RS630 pRS54 82" 14

pRS88 133^3

HR pRS65 98 i"l

pRS74 112-3

pRS28 42**

' 2.411. pRS34 51 H

pRS66 99**

pRS70 105 * 3

pRS75 113**

* Приведены средние арифметические значения размеров плазмид и их

ошибки, определенные в 4 независимых экспериментах. ** Плазмиды штамма 2.4.1., использованные как маркерные (Saunders et al., 1976).

наибольшей эффективностью (независимо от гесА-геногипа донорных клеток) осуществляется мобилизация плазмид ЙЗРЮЮ и рА59, способных к автономной репликации в клетках R.sphaeroides. С меньшей эффективностью передаются плазмиды рВЙ325 и рМ121, имеющие репликон Со1Е1-типа и неспособные к автономной репликации в К.5рЬаегоМе$. Мобилизация этих шизмид носит гесА-зависимый характер (табл. 2). Показано, что перенос, репликация и

. - —- —^ Таблица 2

Мобилизация неконыогативных плазмид из Е.соЦ в к.5рЬаего1ёез 21£ в трехродительских скрещиваниях

Доноры Селективный маркер Частота образования трансконъюгантов

Штамм Плазмида*

RecA+ RSF1010 Smr 3,0 х 10"3

RecA" RSF1010 Snf 2,0x10-3

RecA+ pAS9 Tcr 3,0 х 10"5

RecA" pAS9 Tcr 2,5 х Ю-5

RecA+ pBR325 Tcr 1,0 х Ю-7

RecA" pBR325 Tcr <10-9

RecA+ pML21 Kmr 2,5 х 10"6

RecA" pML21 КшГ <10"'

* Донорами конъюгативных и мобилизуемых плазмид служили Кес+-штамм Е.соН С600 или Яес'-штамм Е.соИ НВ101.

наследование плазмид с Со1Е1-подобным репликоном осуществляется только в составе хоинтегратов с мобилизующими плазмидами. Таким образом, с помощью мобилизации представляется также возможность вводить в 11.5р11аего1с1е5 плазмиды, которые не способны к автономной репликации в клетках этой бактерии.

1.3. Векторы клонирования в клетках пурпурных бактерий

Сконструированы две группы векторных плазмид для клонирования генов в клетках Л.5рЬаепн(1с5:

Первая группа векторов, способных автономно реплицироваться в клетках 11.зрЬаего1с1ез, создана на основе репликона плазмиды 1пс<5-группы ЯБРЮЮ. Векторы общего назначения рУ2209 и рУ2219 имеют маркеры Зиг5тгКшг и могут быть использованы для клонирования по сайтам ЕсоШ и Бег! с

инактивацией гена арЬ, детерминирующего устойчивость к стрептомицину или по сайтам Нш<Ш1, Зта1 (Хта1) и ХИо! с инактивацией гена кап, детерминирующего устойчивость к канамицину (рис. 1). Для конструирования векторов прямой селекции теоретической основой послужили исследования (Чистосердоз и Цыганков, 1984; НеГГгоп е! а!., 1979), в которых показана возможность использования регуляторных элементов транспозонов Тп1 и ТпЗ для регуляции экспрессии гена ар(1. В нашей работе были использованы регуляторные элементы транспозона Тп801. В составе векторов рУ2356 и рУ2361 ген арЬ помещен под контроль промотора гена транспозазы !прА, который в норме репрессирован продуктом гена ШрЯ (рис. 1). Последовательность гена Шрй. содержит уникальный сайт ВашН1, вставка в который клонируемого ВашНГ- или ЗаиЗА-фрагмента инактивирует ген ШрИ, что приводит к дереп'рессии промотора гена №рА и гена арЬ. Векторы рУ£356 и рУгз61 позволяют по устойчивости к стрептомицину осуществлять прямой отбор клонов, содержащих рекомбинантные плазмиды со вставкой в ВатШ-сайт.

, При конструировании второй группы векторов был использован репликон . плазмиды 8393, нетипичного представителя плазмид 1пс(2-группы (рис. 2). Эта плазмида впервые выделена и описана нами. По генетической и структурной организации плазмида К89Б отличается от других известных 1пс0>-плазмид. В частности, .она имеет -узкий круг хозяев, - - ограниченный семейством ЕгЦегоЬайепасезе, и не способна автономно реплицироваться в клетках 11.5р11аего1<1е5. На основе репликона плазмиды К895 был сконструирован ряд векторов общего назначения, а также вектор для прямого отбора рекомбивантных клонов. Физические карты двух векторов с репликоном 1?89Б показаны на рис. 2. Вектор общего назначения рУ2414 имеет маркеры Зшг и Кя!г и может быть использован для клонирования с инсерционной инактивацией гена кап по сайтам Нтс!Ш, Эта! (Хта1) и ХЬо1. Вектор рУг452, как и описанные выше векторы прямой селекции на основе ВДРЮЮ, позволяет по устойчивости к стрептомицину осуществлять прямой отбор клонов, содержащих рекомбинантные ДНК со вставкой в ВатШ-сайт. Показана возможность использования производных плазмиды 12893 в качестве векторов интеграции. С этой целью ХЬо1-фрап,:енты хромосомной ДНК и БгпаЬфрзгменты эндогенных плазмид &5рЬаего1£1е5 клонировали в соответствующие сайты вектора общего назначения и полученные 'производные вводили в клетки И^рЬгегоМез с помощью мобилизации.'Такие векторные молекулы с высокой эффективностью передаются в клетка Е.$рЬаеяж)е5 и наследуются в них в составе коинтегратов с хромосомой или эндогенными плазмидами этой бактерии. Описанный подход

Рис. 1. Схема конструирования вехторов на основе плазмиды ЕБИОЮ арЬ - ген амижяяихозйдфосфотрансферазы, детерминирующий устойчивость клеток к стрептомицину; Ыа - ген В-лактамазы, детерминирующий устойчивость клеток к В-лактаииым антибиотикам; кап - ген канамицинфосфотрансферазы, детерминирующий устойчивость клеток к канамицину, трИ - ген,' кодирующий репрессор траяспозазы; 1лрА - ген, кодирующий транспозазу; р - промотор.

Ркс. 2. Схема конструирования векторов на основе плазмиды 1?895 Условные обозначения как на рис. 1.

был в дальнейшем использован для конструирования ШгС-инсерциояных мутантов й.зрЬаего!(5е5.

2. Исследование экспрессии структурных и регуляторных шГ-генов К.рпеитошае в клетках Й^Ьаепмёез

Регуляторные н структурные пЦ-гены К.рпешпогЛае, клонированные на длазмидных векторах, широко используются для изучения механизмов геиетичесхого контроля азотфиксации у бактерий различных таксономических груш. ,.

С целью исследования экспрессии шГ-генов К. рпеидаошае в клетки ЛлрЬаегаёез были введены многокопийные плазмиды, содержащие

транскрипционные слияния с геном lacZ. структурных генов nifH, nifF и регуляторного гена nifL (Kennedy and Drummond, 1985). Бактерии рода Rhodobacter не способны использовать лактозу в качестве единственного источника углерода, поэтому в случае экспрессии указанных слияний клетки R.sphaeroides должны приобретать способность расти на среде с лактозой и проявлять ^-галахтозидазную активность. Однако даже в условиях полной дерепрессии синтеза НГ оба теста показали отсутствие экспрессии nif-генов. Более того, многоходийные плазмиды, содержащие гены nifHDK, nifL или промотор гена niffl, не оказывали ингабирующего влияния на активность НГ в клетках R.sphaeroides. Известно, что в клетках энтеробактерий такие плазмиды приводят к поЬавлйацо синтеза НГ за счел связывания промоторными участками nif-генов белка NifA, необходимого для их активации (Buck and Cannon, 1987; Riedel et al., 1983). Для исследования функциональной активности регуляторного белка NifA в клетки R.sphaeroides была введена плазмида рСКЗ (Kennedy and Robson, 1983). В этой плазмиде ген nifA помещен под контроль промотора гена Кшт, который, в свою очередь, находится под контролем промотора гена niffi K.pneumoniae. Клоны, содержащие плазмиду рСКЗ не проявляли устойчивость к канамигошу, что указывает на отсутствие экспрессии промотора гена niffi в клетках R.sphaeroides. Известно, что для активации промотора гена nifB необходимо совместное действие продуктов генов nifA и ipoN (Kennedy and Robson, 1983). Однако клетки R.sphaeroides с плазмидой рСКЗ не приобретали устойчивость к канамицину и при введении в них дополнительной плазмиды с экспрессирующимся геном rpoN K.pneumoniae. Наличие в клетках R.sphaeroides плазмиды рСКЗ не оказывало влияния на активность НГ и ее чувствительность к репрессирующему действию ионов аммония, тогда как в клетках K.pneumoniae или Azotobacter vinelandii эта плазмида вызывала дерепрессмю синтеза НГ в присутствии аммония или 02 (Keimeny and Robson, 1983). Отсутствие экспрессии ntr-регулируемых промоторов K.pneumoniae и функциональной активности белков NifA и RpoN K.pneumoniae в клетках R.spbaeroides свидетельствуют о различной структурной организации nif-промоторов у этих диазотрофов и о существенном различии их транскрипционных систем. Полученные результаты позволяют заключить, что широко используемый прием исследования механизмов регуляции азотфиксации у различных диазотрофов с помощью введения в их' клетки плазмид с nif-регуляторными элементами K.pneumoniae не пригоден для фототрофной пурпурной бактерии R.sphaeroides.

3. Молехулярно-генетический анализ мутантов R.sphaeroides и R.capsulatus с аммоний-зависимым, ростом (Adg~)

Мутанты R.sphaeroides серии NF (NF-8, NF-15 и NF-78; Фролова и др., 1986) и мутанты R.capsulatus серии RC (RC27, RC28, RC29 и RC34; Wiliison et al., 1985) характеризуются плейотропными нарушепиямн азотного метаболизма. Свойства типичных мутантов R.sphaeroides NF-8 и R-capsulatns RC34 приведены в табл. 3. Эти мутанты не способны фиксировать молекулярный азот и использовать некоторые аминокислоты в качестве единственного источника азота, а также дефектны по транспорту метнламмония, то есть обладают NiFNtr" -фенотипом. Кроме того, NF-мутанты не способны к росту на среде с нитратом; ГС в их клетках не способна к дерепрессии в условиях недостатка азота.

Поскольку указанные мутанты проявляют аммоний-зависимый рост, их фенотип был обозначены как Adg" (ammonia-dependent growth), а соответствующий ген - adgA.

3.1. Клонирование и локализация генов adgA

Из банка генов R,sphaeroides, сконструированного на основе вектора прямой селекции. pYZ361, была выделена рекомбинашная плазмида pNF114, восстанавливающая фенотип дикого типа у Adg";.fyrairroB NF-8, NF-15 и NF-78. Рестрикционная карта клонированного ВагаШ-фрашеита ДНК R.sphaeroides размером 13,9 т.п.н. приведена на рис. 3. С помощью деяеционного анализа и инсерционного анализа с использованием фага mini-Mu ¿111734 ген adgA локализован на участке 1,4 т.п.н. в пределах ВагаШ-субфрашента размером 3,23 т.п.н. (плазмида pNF149, рис. 3).

Для; клонирования гена adgA R.capsulatus был использован космидный банк генов этой бактерии, сконструированный ранее (Colbeau et aL, 1986). Из этого банка отобрали космидный клон, восстанавливающий дикий фенотип у мутанта RC34. Полученная космида содержала фрагмент ДНК R-capsulatus размером около 20 т.п.к. EcoRI-еубфрагменты космиды клонировали в векторе pRK290 и с помощью комплементационного теста отобрали плазмиду рАР127, содержащую EtoRi-фрагмент ДНК R-capsulatus размером 5,8 т.п.н. С помощью делеционнэго и инсерционного анализа ген adgA R.capsulatus локализован в пределах Smal-субфрагмента размером 1,7 тл.н. (рис. 3).

Таблица 3

Свойства АЙ£~-мутантов Е^рНаепийсБ и Е.сар5и1аив и результаты их комплементационного анализа с помощью плазмид, содержащих клонированные гены adgA

Штамм Рост на средах Активность Поглоще-

ние

с источниками азот * а гс* метил-

аммония

n2 nh4+ no3- Glu Glu, His, nh4+ Glu

Pro, Ala

R.sphaeroides:

2R (дикий тип) + + "Г + + 575 1780 +

nf-8 - + - +/- - 680 590 -

NF-8 (pNFl 49) + + + + + 590 1930 +

NF-8 (pAPI27) + + + + + 630 2110 +

R.capsulatus: .

BIO (дахлй тап) + + - + + 450 500 +

RC34 - + - +/- - 400 450 -

RC34 (pNF149) + + - + + но но +

RC34 (рАР127) + - + + но но +

* В качестве источника азота использовали: сульфат аммония (NH4+), нитрат калия (NO3"), глутамин (Gin), глутамат (Glu), гистидин (His), пролин (Pro), алания (Ala) в концентрации 10 шМ или молекулярный азот (N2). Характер роста учитывали через 3 суток инкубации. + - наличие свойства

- отсутствие свойства +/- - слабый рост но - не определяли Активность ГС выражена в нмоль образовавшегося продукта в мин на мг белка.

га и и и » о а

JJU^LLJ pNF114

Itsphaeroides

1 Т.П.н.

adgA

я ° а

LLLUJ pNF149

Rcapsulatus

pAP127

adgA

Рис. 3. Рестрикционныг карты фрагментов ДНК R..sphaeroides и

R.capsu!atus, содержащих ген adgA BI - BamHI; Bg - Bglll; EV - EcoRV; H - Hpal; SI - Sali; Sm - Sraal.

Рис. 4. Локализация кесерций Кшг-кассет в 5,8 т.п.н. ЕсоЫ-фргшент плазмиды рАР127 и результаты комплементационного анализа мутанта Е,сар$и1айЕ • 11С34. .

+ - наличие комплементации (способность восстанавливать способность штамма 3?С34 фиксировать азот и использовать в качестве единственного источника азота глутамат). - - отсутствие комплементации. В - ВашН!; Е - ЕсоЫ; Н - Нра1; 8 - Бта!.

3.2. Исследование межвидовой .комплементируюздей активности генов adgA R.sphaeroides и R.capsulatus и их гибридизационный анализ

Как похазано в табл. 3, плазмиды pNF149 и рАР127 проявляют межвидовую комплементирующую активность и восстанавливают фенотип дикого типа у Adg" -мутантов как R.capsulatus, так ¿и R.sphaeroides.

С помощью гибридизационного анализа установлена гомология генор, adgA R.sphaeroides и R.capsulatus. Полученные результаты свидетельствуют о том, что гены adgA R.sphaeroides и R.capsu¡atus гомологичны друг другу как в функциональном, так и в структурном отношении. В то же время не обнаружено гомологии между геном adgA R.sphaeroides и генами rpoN, ni£R3, ntrB и ntrC, вовлеченными в регуляцию азотфиксации у R.capsulatus.

3.3. Введение инсерций в хромосомные гены adgA R.sphaeroides и R.capsulatus

С помощью стандартного метода, основанного на замещении хромосомного гена дикого типа на его мутантную копию, клонированную в составе плазмиды, ввести инсерции фага mini-Mu в хромосомный ген adgA штамма дикого типа R.sphaeroides не удалось. В последующих экспериментах метод отбора инсерций в ген adgA был нами модифицирован. Для этого в уникальный сайт BamHI (локализованный в одном из концов гева adgA R.capsulatus) плазмиды рАР127 была встроена Кшг-кассета из плазмиды pUC4-KIXX в двух противоположных ориентациях. В одной из ориентаций (ориентация I, рис. 4) Ктг-кассета приводила к утрате комплемеятирующей активности плазмяды рАР127, тогда как в другой ориентации (ориентация II, рис. 4) .она не влияла на комплементирующую активность плазмиды. Затем фрагменты плазмиды р АР 127, содержащие Кшг-кассету в ориентации 1 или II, ввели с помощью GTA-трансдукции в хромосому штамма дикого типа R.capsu!atus. Рекомбинанты, содержащие инсерцгао Ктг-кассеты в ориентации И, сохраняли дикий фенотип, тогда как рекомбинанты, содержащие инсерцию Ктг-кассеты в ориентации I; были способны формировать только микроколонии. Полученные результаты доказывают то, что ген adgA является существенным для роста клеток, a Adg~-фенотип NF-мутантов R^phaeroides и RC-мутантов R;capsulatus обусловлен миссенс-мутациями.

-3.4. Исследование экспрессии слияния nifH-lacZ в клетках adgA-мутантов

Для исследования экспрессии структурных генов НГ в клетки Adg'-мутантов R-sphaeroides и R.capsulatus была введена плазмида pRGKO, содержащая слияние гена niffl из R.capsulatus с геном lacZ, из E.coli (Kranz and Haselkorn, 1985). Как видно из табл. 4, в клетках дикого типа как R.sphaeroides, так и R.capsulatus, экспрессия гена nifH R.capsulatus активируется при росте клеток в среде с бедными источниками азота и подавляется в присутствии ионов аммония. В 5слетках adgA-мутантов обоих микроорганизмов наблюдается полная репрессия транскрипции гена niffl независимо от источника связанного азота в среде роста. Однако после инкубации клеток в течении 16 часов в безазотистой среде Экспрессия nifH-lacZ слияния в клетках дикого типа и Adg'-мутаитов в зависимости от источника азота в среде роста происходит восстановление

Таблица 4

Экспрессия шПЫасХ слияния в клетках дикого типа и Adg--мyтaнтoв в зависимости от источника азота в среде роста

• Активность р-гаяактозидазы

Штамм Источник азота в среде роста*

nh4+ Glu Gin -n

R.sphaeroides

2R 8 2100 1950 2300

nf-8 28 30 32 1300

Rxapsulatus -

bio 3 1200 950 1350

RC34 5 8 5 720

Клетки выращивали на среде с сульфатом аммония (10 мМ), отмывали в безазотистой среде (-Ы), ресуспендировали з среде с указанным источником азота и инкубировали в течение 16 час. Остальные обозначения как в табл. 3.

активности jB-галактозидазы примерно до 60% от ее уровня в клетках дикого типа. Эти данные указывают, что азотный статус клеток adgA-мутантов в условиях недостатка азота соответствует статусу клеток дикого типа в условиях избытка азота. Такое изменение азотного статуса может быть обусловлено накоплением в клетках ионов аммония. Высокая внутриклеточная концентрация ионов аммония должна приводить к репрессии синтеза НГ, ГС и х нарушению .поглощения клетками ионов аммония. В свою, очередь, низкая активность ГС у adgA-мутэнтов в условиях недостатка азота обуславливает ях неспособность расти на средах с бедными источниками азота.

Очевидно, продукт гена adgA играет важную роль в жизнедеятельности клеток и осуществляет метаболическую реакцию с участием ионов аммония. Для образования продукта зтой реакции в мутантных клетках необходим более высокий уровень концентрации ионов аммония, чем в клетках дикого типа.

Совокупность полученных данных позволяет заключить, что ген adgA непосредственно не вовлечен в регуляцию азотного метаболизма у фотосинтезирующих пурпурных бактерий R.sphaeroides и R.capsulatus. Это. заключение подтверждается недавно опубликованными данными, что ген adgA кодирует аммоний-зависимую NAD-синтетазу (Willison and Tissoi, 1994). В соответствии с номенклатурой авторы предложили переименовать ген adgA и дали ему название nadE.

4. Молекулярно-генетический анализ Gln'-мутантов ILsphaeroides 'и исследование района хромосомы, содержащего ген glnA

Были исследованы глутамин-зависимые ауксотрофы R.sphaeroides, выделенные ранее на кафедре генетики и селекции МГУ (Белавина, 1987). По биохимическим свойствам эти мутанты представляют однородную группу и характеризуются комплексным Gin" М^-фенопгаом: у них отсутствует или сильно снижена активность ГС и, в отличие от дикого типа, синтез и активность НГ в их клетках дерепрессированы в присутствии высоких концентраций аммония. Кроме того, у этих мутантов нарушена способность поглощать ионы аммония и [ ^ С) -мегкламмония, что свидетельствует о сопряжении процессов транспорта и утилизации ионов аммония. Свойства типичного мутанта Gln83 приведены в табл. 5. Известно, что мутанты R.capsulatus по гену glnA, кодирующему ГС, имеют аналогичный Gin" М^-фенотип (Scolnik et al., 1983: Wall and Gest, 1979). Комплементационный анализ с использованием плазмиды, содержащей ген glnA R-capsulatus, показал, что у всех исследованных нами Gb"-мутантов мутации локализуются в гене glnA.

Свойства штамма дикого типа R.sphaeroides 2R и мутанта G!n83

Штамм

Рост штаммов на средах с

источниками азота

NH4+

Gin

Активности ферментов

ГС

Gin

НГ

-NH4+ • +NH4+

Поглощение

клетками

метиламмония

2R С1п83

1900 0

51 57

0 56

* В качестве источника азота использовали глутамии (Gin) или аммоний

(NH^) в концентрации 10 гаМ. ** Клетки выращивали на среде с глутамином (10 мМ) в качестве источника азота с добавлением (+NH4+) или без добавления (-NH4+) сульфата аммония (10 шМ).

+ наличие свойсгра . . . , . .....

- отсутствие свойства

Активность ферментов выражена в нмоль образовавшегося продукта в мин на мг белка.

4.1. Клонирование и секвенирование glnA-района

На основе фагового вектора L47.1 были сконструированы два банка генов, содержащие EcoRI и Sau3 А-фрагменты ДНК R.sphaeroides ппамма дикого типа. Из этих банков были выделены фрагменты ДНК, которые гибридизовались с [°Р]-меченой плазмядой pJV27, содержащей ген glnA R.capsulatus (Scolnik et al-, 1983). С помощью гибридизационного и рестрикционного анализа было установлено взаимное, расположение клонированных фрагментов в хромосоме R.sphaeroides и с помощью делеционного анализа локализован ген glnA (рис. 5).

Анализ куклеотидной последовательности ВатН1-фрагмента ДНК размером 3605 п.н., содержащего ген glnA R.sphaeroides, выявил четыре открытые рамки считывания (ORF; рис. 5). Одна из ORF была идентифицирована как

ntrE ntrDginB glnA DtrX

CHICUDtZZ^CZr Z

Sя . SB S JPPIg E 8 P В SE 1 Т.П.Н

- Рис. 5. Физическая'карта фрагмента ДНК КлрЬаегоИез, содержащего glпA-район и схема секвенированного ВатНГ-фрагмента. Внизу на схеме показана организация лидерного района оперона ginBA. Подробное описание см. в тексте.

В - ВашН1; Вя - В$И; Е - ЕсоИ; Н - НтсНИ; Р - РуиН; Б - Бта1; Ба-БаиЗА. Показаны только некоторые сайты БаиЗА.

последовательность гена glnB, другая, расположенная дистально по отношению к glnB - как последовательность гена glnA. С помощью «делеционного анализа установлено, что гены glnA и glnB, кодирующие ГС и белок GlnB (один, из регуляторных белков азотного метаболизма) входят в состав одного оперона ginBA. Третья рамка, ORF1, расположена проксимально по отношению к гену glnB. Эта ORF транскрибируется в противоположном направлении и оканчивается за пределами секвенированной нами области. Какой-либо существенной гомологии этой рамхи с известными последовательностями из' банков генов EMBL и GenBank не обнаружено. Четвертая идентифицированная нами ORF, обозначенная ORF2, расположена дистально по отношению к гену glnA и транскрибируется в противоположном ему направлении. Рамка ORF2 начинается за пределами секвенированного фрагмента. Анализ аминокислотной

последовательности, кодируемой ORF2, выявил ее существенную гомологию с белками-регуляторами двухкомпонентных систем регуляции адаптивного ответа.

В лидернок области гена glnB R.sphaeroides идентифицировано несколько характерных последовательностей, которые могуг являться регуляторными элементами оперона glnBA. Последовательность TTGCAC-N23-TTCCCC, расположенная между 442 и 476 иуклеотидами, имеет высокую степень гомологии с последовательностью промотора. glnApl 'Exoli. Предполагаемая последовательность -35 у R.sphaeroides, так же как и в случае glnApl E.coli,

перекрывается сайтом связывания белка NtrC - GCAC-N5-TAGGGC (рис. 5).

Между нуклеотидами 226 и 241 выявлена последовательность TGTTG-Ng-CCGCA, гомологичная последовательности UAS (upstream activation sequence) -сайту связывания белка NiFA у K.pneumonia. В соответствии с моделью "петлеобразования ДНК", белок NifA связывается с ДНК в районе UAS м входит в контакт с комплексом сигма"^-фактор-РНК-полимераза в районе -24 и -12, свертывая ДНК в петлю (Buck et al., 1987). В лидерной области гена glnB не обнаружено последовательности, сходной с RpoN-регулируемыми промоторами с консенсусом -24 и -12. Этот консенсус отсутствует также и перед геном glnB у R.capsulatus. Таким образом, белок NtrC у пурпурных бактерий, очевидно, обладает уникальной особенностью: либо он способен активировать транскрипцию без участия какого-либо специфического сигма-фактора, либо в активацию транскрипции ..вовлечен какой-то .неизвестный -до сих пор специфический сигма-фактор.

Для определения природы мутации glnA83 и ее локализации была клонирована и секвенирована мутактная копия гена glnA из штамма Gln83. Проведенный анализ выявил транзидюо G->А, которая приводит к возникновению стоп-ходона TGA в положении 160 вместо - триптофаиового кодона TGG (рис.5).

4.3. Анализ аминокислотной последовательности белка GlnB и ГС R.sphaeroides

Сопоставление аминокислотных последовательностей белков GlnB и ГС R.sphaeroides с аналогичными белками других микроорганизмов выявило высокую степень их гомологии. Все белки GlnB имеют консервативный тирсзик-51, предполагаемый сайт уридилирования. Эти данные указывают на наличие консервативного механизма передачи информации об азотном статусе клетки к регуляторным белкам. Пурпурные бактерии, тем не менее, могут иметь заметные отличия в структурно-функциональной организации систем регуляции

метаболизма азота по сравнению с семейством Enterobacteriaceae, поскольку у них гены glnB и glnA организованы в один оперон и, следовательно, эхспрессируются координированно. . ГС R.sphaeroides является -типичным представителем глутамннсинтетаз первого типа, из чего следует, что комплексный фенотип glnA-мутантоз R.sphaeroides обусловлен не структурно-функциональными свойствами глутаминсинтетазы, а связан с особенностями регуляции азотного метаболизма. Очевидно, дерелрессированный синтез НГ в присутствии аммония у glnA-мутантов обусловлен двумя факторами. Во-первых, в результате низкой концентрации глутамина регуляторный белок NtrC, активирующий трансхрипцию nif-генов, всегда должен присутствовать в клетках этих мутантов в активной фосфорилированной форме NtrC-P. Во-вторых, клетки glaA-мутантов не способны транспортировать ионы аммония.

4.4. Исследование района хромосомы R.sphaeroides, содержащего оперон glnBA

Известно, что у пурпурных бактерий гены, контролирующие азотный метаболизм, собраны в кластеры (Kranz and Foster-Harnett, 1990). С целью исследования возможного участия генов, соответствующих ORF1 и ORF2, в генетическрм контроле азотного метаболизма у пурпурных бактерий с помощью ивсерционного мутагенеза были исследованы районы, прилегающие к оперону glnB-glnA. Анализ полученных мутантов показал, что оперон glnBA входит в состав кластера генов ntrE-ntrD-glnB-glnA-ntrX (рис. 5). С помощью комплемеятадиопяого теста и анализа полилептидов в системе мини-клеток установлено, что гены ntrD и ntrE организованы в оперон ntrDE. Инсерционная инактивация генов ntrE, ntrD и ntrX приводит к неспособности мутантных штаммов использовать нитрат и некоторые аминокислоты в качестве единственных источников азота, что указывает на возможное участие этих генов в регуляции азотного метаболизма. Ген ntrX, соответствующий ORF2, кодирует белок, гомологичный белкам-регуляторам двухкомпонентных регуляторных систем адаптивного ответа бактерий. Наибольшая степень гомологии выявлена между белком NtrX и белками OmpR S.typhiinurium (32,2%), OrapR E.coli (31,7%), NarL E.coli (26,1%) и VirG Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens (25,3%). Таким образом, локус ntrX, по-видимому; относится к новой, не известной ранее двухкомпонеятной генетической системе регуляции у бактерий.

5. Молекулярно-генетический анализ Огп-мутантов.

Клонирование и изучение генов тгВ и п!гС

Прототрофные мутанты К.хрЬаег01^е$ с дерепрессированной в присутствии высоких концентраций аммония НГ (Вгп-мутангы) и низкой активностью ГС выделены ранее на кафедре генетики и селекции МГУ (Шесгаков и др., 1983). Нами проведен сравнительный анализ четырех Вгп-мупштов. Свойства мутантов Бгп12 и Пгп21 были описаны ранее (Шестаков и др., 1988); мутанты БгаШ и Вш187 ранее детально не исследовались.

5.1.Физиолого-биохимический и комилементационный анализ Пгп-мутантов

Бт-мутанты не способны использовать аммоний, нитрат, N2, а также ряд аминокислот, за исключением глутамина, в качестве единственного источника азота (табл. б). Уровень активности ГС в клетках мутантов сильно снижен и составляет 5-10% от уровня активности ГС в клетках дикого типа в условиях недостатка азота. В отличие от клеток дикого типа все От-мутанты проявляют высокую активность НГ в присутствии высоких концентраций аммония. У всех Бт-мутантов нарушена способность поглощать аммоний и метиламмоний. Кроме того, у мутантов Огп12 и Вгп21 скорость' поглЪщения -глутамина резко снижена, тогда как мутанты Ош183 и Вт 187 не отличаются от штамма дикого типа по скорости поглощения С]-глутамина. Все исследованные нами штаммы, в том числе и штамм дикого типа, обладают сходными активностями гистидазы и нитратредуктазы.

Поскольку по ряду своих свойств Огп-мутанты проявляют большое сходство с С1п"-мутантами, для их комплементационного анализа были использованы плазмиды, содержащие гея Й.БрЬаегоШез. Полученные результаты

показали, что у мутантов Бгп183 и Огп187 мутации локализуются в гене ё1пА, тогда как у Огп12 и 0гп21 мутации локализуются за пределами оперона г1пВА и, видимо, затрагивают гея, контролирующий экспрессию этого оперона.

5.2. Выделение из банка генов плазмиды, восстанавливающей дикий фенотип у мутантов Ьт12 и Огп21, и локализация на ней участка, ответственного за комплементацию-

Из геномного банка К.5р11аего1£1ез, сконструированного на основе вектора рУгЗб!, была изолирована плазмида р1А1, восстанавливающая способность штаммов Вт12 и Игл21 использовать нитрат в качестве единственного

Свойства Огп-мутантов Я.БрЬаегоЫез

Штамм Рост на средах с источниками азота Активность ферментов Поглощение клетками

N2 N«4+ ЫОз" 01п С1и ны ГС НГ аммония метил- глутамина

01и МН4+ С1и МН4+ аммония

21* + + + + + + 2400 750 77 0 + + +

От 12 +/- +/- - + +/- - 125 122 54 56 - +/-

Эгп21 +/- +/- - + +/- - 129 120 50 42 - +/-

Огп183 +/- +/- - + +/- - 241 119 83 37 - +

РгпШ +/- +/- - + +/- - 255 134 80 27 - - +

Условия роста культур и условные обозначения как в табл. 3. + - наличие свойства

- отсутствие свойства ,

+/- - промежуточный фенотип

Активность ферментов выражена в нмоль образовавшегося продукта в мин на мг белка.

В В в н

L_xvL_LL

Е Е ЕВ

J_Li!

^ > ntrB' ntrC

ntrC12

pLA1

1 т.п.н.

I_I

Gly26—>Asp

Рис. б. Рестрикционные карта плазмиды р!А1, содержащей ген шгС 11.5рЬаего1с1е5. Схематически представлена локализация мутации пггС12. В - ВагаН1; Е - ЕсоИ; Н - НМШ.

источника азота. Дальнейший анализ показал, что плазмида pLAl восстанавливает все свойства штамма дикого типа у Drn-мутантов. Физическая карта BamHI-фрагмента ДНК R.sphaeroides размером 12,8 т.п.н., клонированного в составе плазмиды pLAl показана на рис. 6. С помощью делеционного анализа установлено, что минимальным комплементирующим фрагментом является HindIII-EcoRI-фрагмент размером 2,2 т.п.н. Следует отметить, что этот фрагмент проявляет пониженную комплементирукяцую активность и обеспечивает более слабый рост клеток Drn-мутантов на средах с нитратом или гистадином по сравнению с плазмидой pLAl. Очевидно, регуляторные элементы гена, ответственного за комплементацию, находятся за пределами HmdIII-EcoRI-фрагмента.

5.3. Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК,

• восстанавливающего дикий фенотип у мутантов Dml2 и Drn21

Минимальный комплементирующий HindIII-EcoRI-фрагмент (2186 п.н.) был секвенирован и анализ его нуклеотидной последовательности выявил наличие двух ORF (рис. 6). Одна из ORF была идентифицирована как ген ntrC по

признаку нуклеотидной и аминокислотной гомологии с последовательностями генов ntrC других бактерий. Ген ntrC кодирует полипептид с мол. массой 49,966 kDa, состоящий из 456 аминокислот. Вторая ORF расположена проксимально пс отношению к гену ntrC и является неполкой. По аминокислотной гомологии с белком NtrB R.capsulatus она была идентифицирована как З'-концевая часть гена ntrB. Степень гомологии аминокислотной последовательности белка NtrC R.sphaeroides варьирует от 33,7% до 80,3% в сравнении с NtrC-белками E.coli и R-capsuIatus,' соответственно. Степень гомологии С-концевых районов NtrB-белков составляет 38,5% для R.sphaeroides и E.coli и 77,4% для R.sphaeroides и R.capsulatus.

Данные секненирования в совокупности с данными комплемептационного анализа, позволяют заключить, что гены ntrB и ntrC у R.sphaeroides организованы в единый оперон ntrBC.-

Для определения природы мутации у штамма Drnl2 был клонирован и секвенирован фрагмент ДНК этого штамма, содержащий ген ntrC. Мутация, обозначенная ntrC12, произошла в результате транзишш G->A, что привело к -замене Gly на Asp в положении 26 (рис. 6).

5.4. Ивсерционный анализ генов ntrB и ntrC

Для выяснения роли генов ntrB "и ntrC в регуляции азотного метаболизма у R.sphaeroides исследованы мутанты с полной инактивацией этих генов. С этой целью были сконструированы штаммы, содержащие инсерции векторных плазмид в центральные районы генов ntrB и тгС. Физические карты районов хромосом с генами ntrB и ntrC штамма дикого типа и сконструированных мутантов показаны на рис. 7.

Штамм WZ45 (ntrB-инсерционкый мутант пггамма дикого типа) является прототрофом, но в отличие от дикого типа проявляет очень медленный рост на средах с аммонием, глутамином, глутаматом, проливом или гасгадином и не способен использовать нитрат или N2 в хачестве единственных источников азота (табл. 7). ГС в его клетках утратила способность к дерепрессии и снижена примерно до 8% от активности ГС в клетках дикого типа. Штамм DZ45 (ntrB-ивсерционный мутант штамма Drnl2) также проявляет очень низкую активность ГС, очень медленно растет, на средах с глутамином или глутаматом и не способен расти на средах с аммонием, гистидином или нитратом, а также в условиях азотфиксашш (табл. 7). Таким .образом, наличие мутации ntrC12 у шгВ-инсерционного мутанта DZ45 обуславливает более значительные вменения в использовании различных источников азота, чем у ntrB-инсерционного

» * Г В X

-и_^J_!_I

гЧтВ ^ гНгС "^У- 20 (Л«101" ТИП)

я н

—|Б'-п!гВ I—у/-кап [-3'-п1гВ^>| ЩгС \VZ45 (п!г8)

интегратизный вектор

8 К

—|б'-п1гв|—-кап 1- 3'-л1гВ^| тгС12 0245

(п№)

имтегративиыя вектор

ш ? х

-| 1 п!гВ ^ б'-п1гС [—| —| 3-^)— РОБ97 (п(гС)

интвгративныг» вектор

д к_. _^^ н в и к _.

п!гВ |—| З'-лмЪГ пПС \wZ5Z -

■-* интегратиёныЯ вектор

я «я

ШЮ12

интегративньй вектор

Рис. 7. Структурная организация пй-ВС-районов хромосомы у штамма дикого типа и пйгВ- и гНгС-иксерционных мутантов Я.5рЬаег01(1е5. В - ВашН1; Н - НМШ; Р - Ря1; X - Х1юГ.

мутанта ЧПА5 с геном яйС дикого типа. Полученные результаты позволяют заключить, что, хотя гены тгВ и ШгС организованы в один оперон ШгВС, инсерционная инактивация гена пггВ не приводит к полной инактивации гена ШгС. Очевидно, экспрессия гена пггС у тгВ-инсерционных мутантов осуществляется либо с собственного минорного промотора, либо с промотора, расположенного в векторной плазмиде.

Свойства ЖгВ- и П1гС мутантов К.БрЬаегоМеб

Штамм Рост на средах с источниками азота Активность ферментов

Ы2 ын4+ N03' 01п 01и ГС Д-галактозидаза <шШ-1асг)

01и МН4+ -Ш4+ +N114*

2Й +++ +++ +++ +++ +++ +++ 2400 750 2490 -8

0гп12 + ++ - ++ ++ 125 122 1750 1590

\VZ45 - + - + + - 185 150 .1510 568 .

- - + + - 109 86 850 325

Р0597 - - - + - - 18 13 230 80

Условия роста культур и условные обозначения как в табл. 3. +++ -нормальный рост ++ - слабый рост + - микроколонии - отсутствие роста

Активность ферментов выражена в нмоль образовавшегося продукта в мин на мг белка.

Исследование ntrC-инсерционного мутанта Р0597 показало, что он является глутамшюЕЫМ ауксотрофом. Этот мутант способен использовать в качестве единственного источника азота только глутамин и не растет на средах с другими аминокислотами, аммонием, нитратом, а также в атмосфере азота (табл. 7). Активность ГС и экспрессия слияния glnB-lacZ в клетках ntrC-мутантг Р0597 сильно подавлены и составляют менее 1% от их уровней в клетках дикого типа (табл. 7,8). Скорость роста ntrC-мутанта Р0597, также как и ntrB-мутантов WZ45 и DZ45, существенно снижена по сравнению со скоростью роста клеток штамма дикого типа. В отличие от Ii.sphaeroides, у R.capsulatus ntrB- и ntrC-инсерционные мутанты проявляют только Nir-фенотип, но нормально растут на средах с аммонием и другими источниками фиксированного азота (Kranz and Haselkoni, 1985).

Полученные нами результаты позволяют заключить, что в клетках R.sphaeroides транскрипция генов glnB и glnA, входящих в состав единого оперена glnBA, осуществляется координировано и полностью зависит от белка NtrC. Очевидно, такая зависимость экспрессии гена glnB, кодирующего белок GlnB (негативный регулятор транскрипции nif-генов), от белка NtrC является отличительной особенностью азот-чувствительного каскада регуляции nif-генов у R.sphaeroides и имеет важное физиологическое значение для этой бактерии.

- В отличие от NtrC,- белок NtrB не является абсолютно' необходимым для экспрессии оперона glnBA, поскольку ntrB-инсерционный мутант WZ45 сохраняет прототрофность. Белок NtrC, по-видимому, способен активировать транскрипцию этого оперона и в отсутствии белка NtrB. Как известно, только фосфорилированная форма белка NtrC обладает способностью активировать транскрипцию ntr-регудируемых генов (Reitzer and Magasanik, 1987). Вероятно, фосфорилирование белка NtrC в клетках ntrB-мутанта может осуществляться при участии других клеточных протеинкиназ, как это имеет место, например, у энтеробактерий (Ninfa et al., 1988; Schneider et al., 1991).

Совокупность полученных данных позволяет заключить, что активация транскрипции оперона glnBA обеспечивается низкой концентрацией белка NtrC, если он находится в активной фосфорилированной форме. Высокий уровень экспрессии оперона glnBA в клетках дикого типа R.sphaeroides в присутствии аммония указывает, что белок NtrC в активной форме присутствует в клетках -этой бактерии даже в условиях избытка азота. . ..

5.5. Экспрессия регуляторных nif-тенов R.capsulatus в клетках R.sphaeroides

Основные представления о регуляции синтеза нитрогеназы у пурпурных бактерий до последнего времени базировались, главным образом, на исследовании этого процесса у R.capsulaius. Для этой бактерии предложена модель регуляции процесса азотфиксации в зависимости от уровней содержания кислорода и фиксированного азота в окружающей среде. Это -" сигнал-передающий каскад, в который вовлечены продукты, по-крайней мере, шести генов: glnB, ntrB, ntrC, rpoN, nifAl и nifA2 (Kranz and Foster-Hartnetf, 1990; Hubner et al., 1991). Продукты генов ntrB, ntrC, rpoN, nifA! и nifA2 необходимы для активации транскрипции структурных nif-генов, тогда как продукт гена glnB является негативным регулятором экспрессии nif-генов.

Исследование экспрессии собственных регуляторных nif-генов на уровне их транскрипции у R.sphaeroides в настоящее время не представляется возможным, поскольку большинство этих генов до сих пор не клонированы. С целью исследования возможной межвидовой гомологии на функциональном уровне-нами была изучена экспрессия определенных структурных и регуляторных генов R-capsulatus в клетках R.sphaeroides с помощью lacZ-слияний. Для этой цели были использованы плазмвды, содержащие трансляционные слияния с геном lacZ E-coli генов niffi (pRGKO; Kranz et Haselkorn, 1985), nifAl (pPHU284; Hubner- et al., 1991), nifA2 (pDFH200; Foster-Hartneit and Kranz, 1992), rpoN (pPHU289; Hubner et al., 1991) из R.capsulatus и гена glnB (pGBL2) из R.sphaeroides. Как следует из полученных данных, наблюдается положительная корреляция между активностью НГ, определяемой методом ацетиленредукции, и активностью р-гаяактозидазы, экспрессируемой слиянием niffi-lacZ (табл. 6 и 7). Таким образом, экспрессия структурного гена nifH R.capsulatus в клетках R.sphaeroides адекватно отражает экспрессию собственного гена niffi R.sphaeroides. В клетках дикого типа обоих микроорганизмов ген niffi активируется в условиях недостатка азата и репрессируется в присутствии 10 мМ аммония (Kranz and Haselkorn, 1985; табл. 7). На этом основании можно сделать заключение, что в клетках R.sphaeroides, как и в клетках R.capsulatus, экспрессия структурных nif-генов регулируется продуктами генов nifA и rpoN, которые кодируют nif-специфический транскрипционный активатор NifA и nif-специфический альтернативный сигма-фактор RpoN, соответственно. ■ •

В клетках R^phaeroides дикого типа экспрессия всех исследованных нами регулятЬрных nif-генов, за исключением гена nifA2, активируется в условиях недостатка азота и репрессируется в условиях его избытка (табл. 8). Как следует из полученных данных, продукт гена ntrB вовлечен в регуляцию экспрессии гена

Экспрессия регуляторных nif-генов в клетхах штамма дикого типа и ntrC-мутантсв R.sphaeroides

Активность р-галахтозндазы

lacZ-слияние с геном

Штамм glnB nifÁl mfA2 rpoN

-nh4+ +nh4+ -nh4+ +nh4+ -nh4+ +N'H4+ -nh4+ +nh4+

2r 5230 1820 825 287 196 453 734 15

Dml2 240 272 73 93 42 53 455 207

Р0597 37 34 23 25 16 30 8 10

Условия роста культур и условные обозначения как в табл. 3. Активность ^З-галактозидазы выражена в нмоль образовавшегося продукта в мин на мг белка.

niffl, но не является абсолютно необходимым для его активации (табл. 7). Очевидно, в клетхах ntrB-инсерционного мутанта WZ45, также как и в клетках миссенс-ntrC-мутантов Drnl2 и Drn21, концентрация активной формы белка NtrC достаточна для активации экспрессии структурных nif-генов, по не оперона glnBA. Следовательно, в клетках R.sphaeroides для активации транскрипции оперона glnBA необходим более высокий уровень белка NtrC, чем для активации структурных nif-геяов. В клетках ntrC-инсерционного мутанта Р0597 экспрессия всех исследованных генов сильно подавлена, из чего можно заключить, что основная роль в регуляции экспрессии структурных и регуляторных nif-генов в ответ на избыток или недостаток азота принадлежит белкам двухкомпонентной системы NtrB/NtrC. В отличие от остальных регуляторных генов, ген nifA2 активируется ионами аммония (табл. 8). Этот факт дает основание предположить, что белок NifA R.sphaeroides является репрессором своего

Экспрессия слияния ШгВС-ЬЛ в клетках ппС-инсерционных мутантов К..5рЬаего1(1е$

Штамм Активность р-галактозидазы

+ЫН4+

УЖ52 207 186

Г>г52 41 39

Условия роста штаммов и условные обозначения как в табл. 3 Активность р-галактозидазы выражена в нмоль образовавшегося продукта в мин на мг белка.

собственного .синтеза. Следует .отметить, что экспрессия гена пиН как в клетках шгБ-мутанта \VZ45, так и шгС-мутанта Р0597 сохраняет частичную способность к регуляции со стороны азотного статуса клеток. Этот факт указывает на наличие дополнительного, независимого от системы ЫпВ/ШгС, азот-чувствительного механизма регуляции экспрессии ш(-генов.

5.6. Экспрессия гена пй"С в клетках К.5рЬгего1ёе5

Для исследования экспрессии гена шгС с оперонкого промотора были сконструированы штаммы \VZ52 и 0252, содержащие в хромосоме слияние гЛгВС-1ас2 (рис. 7). Оба штамма содержат копию гена ШгС, отделенную от оперокного промотора последовательностью векторной плазмиды, причем у штамма 0252 эта копия гена ШгС содержит мутацию п1гС12. Установлено, что уровень экспрессии слияния пкВС в клетках штамма \VZ52 примерно в пять раз выше, чем в клетках штамма 1)252 (табл. 9). Следовательно, продукт гена псгС активирует свой собственный синтез.

5.7. Схема регуляции nif-генов у R.sphaeroides

Совокупность полученных нами данных по экспрессии структурных и регуляторных nif-генов в клетках дикого типа, а также ттВ- и мтС-мутантов R.sphaeroides дает основание полагать, что модель регуляции nif-геиов, предложенная для R-capsulatus (Hubner et al., 1991; Kranz and Fosier-Hartnett, 1990; Kranz et al., 1990), в общих чертах верна и для R.sphaeroides.

Как показано на рис. 8, транскрипция nif-генов у R.sphaeroides регулируется двух-уровневым азот-чувствительным каскадом, в котором участвует несколько белков. Первый уровень включает белки UTase (уридилилтрансферазу), GlnB, NtrB и NtrC, вовлеченные в регуляцию не только nif-генов, но и других генов азотного метаболизма. Поскольку все известные транскрипционные активаторы, за исключением белков NtrC R.sphaeroides и R.capsulatus (Foster-Hartnett et al., 1994), участвующие в регуляции азотного метаболизма, действуют совместно с альтернативным сигма^-фактором, продуктом гена rpoN, то вполне вероятно, что в регуляции как оперона glnBA, так и гена nifA, участвует неизвестный сигма-фактор, действующий совместно с белком NtrC-P. Второй уровень является nif-специфическим и включает белки NifA и RpoN.

Первичным сенсорным белком, реагирующим на изменение азотного статуса, ■ является продукт гена glnD, уридилилтрансфераза, активность которой у E.coli модулируется глутамияом и 2-кетоглутаратом, выступающими в качестве аллостерических эффекторов (Son and Rhee, 1987). Наличие уридилилтрансферазы в клетках R.sphaeroides, также как и в клетках R.capsuiatus, не является экспериментально подтвержденным фактом, однако высокая гомология белков GlnB у E.coli, R.capsulatus и R.sphaeroides позволяет предсказать его существование в клетках пурпурных бактерий. В условиях недостатка азота (низком внутриклеточном отношении глутамнн/2-кетоглутарат) происходит уридилирование белка GlnB, который в своей модифицированной форме GlnB-UMP является неактивным. В этом случае белок NtrB функционирует в качестве протеинкиназы и фосфоршгарует белок NtrC. Фосфорилированный белок NtrC, NtrC-P, является функционально ахтивным и активирует транскрипцию гена nifA. Белок NifA активирует транскрипцию всех других nif-генов, а также транскрипцию генов ipoNl и rpoN2. Вместе с тем белок NifA является негативным регулятором собственного синтеза. Белок RpoN является альтернативным сигма-фактором РНК-полимеразы и необходим для транскрипционной активации nif-генов белком NifA. Присутствие в хромосоме R.sphaeroides двух копий гена rpoN показано в работе (Meijer and Tabita, 1992).

недостаток азота

низкое отношение

глутамин

2-кетоглутарат

е!пВ е!пА -С- -)-ч- I-1

р х_

С1пВ | -

итазе

присоединяет иМРкС1пВ

пи-В п1гС -©—\-1-1

С1пВ-иМР

■ | №гВ |

неизвестным сигизфакгор?

№гС-Р

(транскрипционный

активатор

гроМ! -0-1-*

№ГА

шГ-спецкфический транскрипционный активатор

[другие пН-гепы (шШРК)

тГ-специфический сигма5 - фактор

Рис. 8. Схема регуляции ш^геков у Л-зрИзегоШеБ.

Экспрессия оперона МгВС авторегулируется белком МнС с помощью механизма позитивного контроля.

Отличительной особенностью регуляции процесса азотфиксацш: у ЕлрЬаепдйез является абсолютная зависимость экспрессии оперона ¿<!лВА от продукта гена ШгС. При высокой внутриклеточной концентрации азота белок БЬВ находится в активной ^модифицированной форме и содействует

дефосфорилированию (ипактивации) NtrC-P, что в свою очередь приводит к репрессии оперона glnBA и снижению концентрации белка GInB. Существование такой регуляторной петли обуславливает наличие в клетках R.sphaeroides белка NtrC-P в определенной концентрации даже в условиях избытка азота.

Исследование экспрессии структурных и регуляторных nif-генов R.capsulatus в клетках R.sphaeroides выяввдо у R.sphaeroides наличие дополнительного NtrB/NtrC-независимого азот-чувсгвительного механизма регуляции экспрессии структурных nif-генов, который, очевидно, осуществляется на уровне посттрансляционной регуляции активности белка NifA. Недавно показано, что в регуляцию активности белка NifA у. R.capsulatus вовлечен продукт гена hvrA, который участвует также в регуляции процесса фотосинтеза (Klipp et ab, 1995). Вполне вероятно-, что дополнительная регуляция структурных nif-генов у R.sphaeroides осуществляется на уровне активности белка NifA с - помощью продукта гена hvrA.

Дерепрессированный синтез НГ в клетках R.sphaeroides в присутствии высоких концентраций аммония может быть обусловлен мутациями как в структурном гене ГС (glnA), так и в регуляторных генах ntrB и ntrC. Общим свойством всех исследованных нами мутантов с дерепрессированным синтезом НГ является низкий уровень активности ГС, что приводит к снижению внутриклеточной концентрации глутамина и запускает цепь событий, в результате которых белок NtrC фосфорилируется и активирует экспрессию nif-генов. Кроме того, низкий уровень ГС обуславливает снижение поглощения клетками ионов аммония, поскольку процессы транспорта и ассимиляции ионов 1' аммония у R.sphaeroides тесно сопряжены.

Дополнительными факторами, обеспечивающими- у мутантов высокий уровень экспрессии структурных nif-генов в присутствии высоких концентраций аммония, являются низкий уровень (в клетках ntrB и ntrC-мутаятов) белка GInB, выполняющего функцию негативного регулятора экспрессии структурных nif-генов, и отсутствие (в клетках ntrB-мутантов) белка NtrB, способного дефосфорилировать белок NtrC-P.

В заключение необходимо отметить, что у R.capsulatus транскрипция оперона glnBA в малой степени зависит от гена ntrC, и поэтому ntrC-мутанш с дерепрессированной НГ у R.capsulatus получить нельзя.

5.8. Роль гена ntrC в регуляции метаболизма углерода

Неожиданным свойством mrC-инсершюниого мутанта Р0597 оказалось нарушение - у него углеродного метаболизма. Этот мутант не способен . использовать пируват и соединения, метаболизируемые через пируват (фруктозу, глюкозу, DL-лакгаг), а также ацетат в качестве единственных источников углерода. Ок растет медленнее, чем клетки дикого типа, на средах с сукцинатом, DL-малатом, L-малатом, оксалоацетатом или 2-кетоглутаратом (табл. 10). Более высокая скорость роста у мутанта Р0597 наблюдалась при совместном использовании DL-малата и глюкозы, DL-малата и пирувата -или DL-малата и лактата в качестве источников углерода.

Пути метаболизма углерода у R.sphaeroides и R.capsulatus весьма сходны (Willison, 1993). Основным ферментом, обеспечивающим образование интермедиатов цикла трикарбоновых кислот из пирувата, является пируваткарбоксилаза, поскольку мутанты обоих микроорганизмов в отсутствие этого фермента (Рус'-мутангы) теряют способность использовать в качестве единственного источника углерода пируват или субстраты, ассимилируемые через пируват (Payne and Morris, 1969; Willison, 1988). Как следует из полученных нами данных, штамм Р0597 обладает сходным фенотипом с Рус"-мутактами R.sphaeroides и R.capsularus; что дает, основание предположить нарушение регуляции активности или синтеза пируваткарбоксилазы в его клетках. Очевидно, ген ntrC у R.sphaeroides прямо или опосредованно вовлечен в регуляцию углеродного метаболизма в клетках этой бактерии.

В отличие от Рус--мутантов, описанных в цитированных выше работах, ntrC-мутант Р0597 характеризуется более медленным ростом на средах с источниками углерода, ассимилируемыми в цикле трикарбоновых кислот. Возможно, данное свойство мутанта может быть связано либо с нарушением утилизации глутамина в качестве источника азота, либо изменениями в активности каких-либо ферментов цикла трикарбоновых кислот.

С биохимической точки зрения является очевидным, что первичная ассимиляция азота тесно сопряжена с метаболизмом углерода, поскольку углеродные соединения* необходимые для начальной ассимиляции азота, образуются из таких интермедиатов цикла трикарбоновых кислот, как 2-кетоглутарат и оксалоацетат. Однако на генетическом уровне регуляция азотного и углеродного метаболизма и их взаимосвязь у фототрофных бактерий остается малоизученной. Результаты, полученные в данной работе, являются первым примером, свидетельствующим о сопряжении метаболизма азота и углерода на уровне их генетической регуляции у фототрофных бактерий.

Таблица 10

Рост штамма дикого типа Я.5р!\аего;йе5 и тгС-инсерционного мутанта с различными легочниками углерода

Источник * углерода Штамм

211 Р0597

Глюкоза +++ -

Фруктоза +++ - ■

'. ОЬ-лактат -Н+ -

Пируват +++ -

Ацетат +-Н-

ОЬ-малат -к+ +

Ь-малат -Н+ +/-

2-оксоглутарат +++ +

Сукцинат + +/-

Оксалоацетат -ж- +

ОЬ-малат +

глюкоза +-Н- ++

БЬ-малат +

лактат +++ -н-

БЬ-малат +

пируват +++ ++

ОЬ-малат+ •

глутамат +++ ++

Ь-малат +

глюкоза +++ +

4++

-Н-. +

+/-

- Все источники углерода использовали в концентрации 10 шМ; все среды

качестве источника азота содержали глутамин (10 тМ)

- нормальный рост

. - слабый рост .

- плохой рост

- микроколонии

- отсутствие роста

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено сравнительное изучение плазмидного состава семи штаммов Я.зрЬаегО!ёез различного происхождения. Различные штаммы содержат от двух до пясти критических плазмид размером от 42 до 142 т.п.н. Из-за наличия множества сайтов узнавания для большинства ресгриктаз и больших размеров плазмиды й-БрЬгепийм малопригодны в качестве потенциальных векторов для-клонирования в клетках фотосинтезирующих пурпурных бактерий.

2. Разработаны системы переноса в клетки Я^рЬаегохйез неконъюгативных векторных плазмид различных групп несовместимости, основанные на их мобилизации конъюгативными плазмидами 1псР-группы. С помощью мобилизации можно передавать также плазмиды, не способные-к автономной репликации в клетках И.5р17аего1<Зе5, что существенно расширяет возможности генетического анализа и клонирования генов у пурпурных бактерий. Репликация и наследование таких плазмид осуществляется в составе коинтегратов с мобилизующими плазмидами, эндогенными плазмидами или с хромосомой Я.5р11аего1с1ез.

3. На основе плазмид 1пс(^-грулпы 1?ЗР10Ю и 1189$ сконструирован ряд автономйых и иктегративных векторов клонирования, позволяющих решать широкий круг задач молекулярной генетики фотосинтезирующих бактерий.

4. В клетках Н.зрЬаепиёез отсутствует экспрессия глг-регулируемых промоторов К.рпеитошае, а белки ЬроЫ и ША К.рпеитошае функционально неактивны. Таким образом, обычно - используемый подход к исследованию механизмов регуляции азотфиксации у различных диазотрофов с помощью плазмид, содержащих рггуляторные элементы К.рпеитошае, не пригоден для фотосикгезируюшей пурпурной бактерии Я.врЬаепййез.

5. Клонированы неизвестные ранее гены ас;еА К.5р1мегсМе5 и К.сарги'айк, мутации в которых приводят к плейотропным изменениям в азотном метаболизме и к утрате способности к азотфиксации. Установлена структурная и функциональная гомология генов адёА К^рЬаего!бе5 и Я.сарзЫашз в показано участие этих генов в обеспечении нормального роста клеток. На основе физиолого-биохимического и молекулярно-генетического гсследования ай£А-мугантов сделано заключение, что ген adgA не вовлечен непосредственно в

регуляцию азотного метаболизма, но может оказывать влияние на способность к азотфиксации опосредованно через иные метаболические функции клеток.

6. Клонированы и секвенированы гены glnA и £1пВ йлрЬаепнйез, кодирующие глутаминсинтетазу и регуляторный белок ОпВ, соответственно. Установлено, что оба гена входят в один оперон £1пВА, экспрессия которого осуществляется с Р^С-закисимого промотора. Для активации оперона glnBA требуется более высокий уровень активности белка №гС, чем для активации транскрипции структурных гпС-генов. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белка С1пВ и глутаминсинтетазы Я.прЬаего'^ез и других микроорганизмов показал, что эти белки обладают структурной организацией, типичной для прокариотяческих С1пВ-белков и глутаминсинтетаз первого типа, и, следовательно, плейотропный фенотип gInA-мyтaнтoв К^рЬаег^'ёез обусловлен не структурно-функциональными свойствами глутаминсинтетазы, а связан с особенностями регуляции азотного метаболизма.

7. Показано, что оперон £1пВА у И.зрЬаеп^ез расположен в одном кластере с генами пГгЕ, п^Б и геном пХгХ, который кодирует полипептид, гомологичный белкам-регуляторам, относящимся к двухкомпонентным регулягорным системам адаптивного ответа • бактерий. Мутации. в генах шгЕ-, гИтБ и п(гХ- ведут к повышению активности глутаминсинтетазы и утрате способности использовать некоторые соединения в качестве единственных источников азота, что указывает на возможное участие продуктов этих генов в регуляции азотного метаболизма.

8. Клонированы гены пггВ и шгС К.зрЬаепМеБ, кодирующие регуляторные белки №гВ и №гС двухкомпонентной регуляторной системы адаптивного ответа; определена нуклеотидная последовательность гена пггС и З'-концевой части гена п^В и показано, что эти гены входят в один оперон п1гВС. Установлена молекулярная природа мутации пП"С12, вызывающей плейотропные изменения в азотном метаболизме. Гены пй\В и пй"С у И-БрЬгеяМез, в отличие от близкородственного вида К.сар5и1а1ш, контролируют не только азотфиксашпо, но и участвуют в регуляции общего азотного метаболизма.

9. Показано, что сходство фенотипов у прототрофных glпA, шгВ и ШгС мутантов К.зрЬаенМез с конститутивным синтезом нитрогеназы и плейотропными нарушениями в азотном метаболизме обусловлено низкой активностью глутаминсинтетазы и систем транспорта ионов аммония.

10. Впервые установлено, что ген тгС принимает участие в регуляции углеродного метаболизма у Н.БрЬаегоШез, что свидетельствует о сопряжении азотного и углеродного/энергетического метаболизма на генетическом уровне.

11. Отличительной особенностью регуляторного каскадного механизма, контролирующего экспрессию т7-генов у К.зрЬаего^ёез, является взаимосвязь между регуляцией активности белка №гС и регуляцией экспрессии гена §1лВ. Предложена схема регуляции структурных ш'-генов у Л^рЬаепмс^з с участием белков ИпБ, №гВ, Ый-С, №[А и КроЫ в зависимости от азотного статуса клеток.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Бабыкин М.М., Дубейковский А.Н., Зинченко В.В. Экспресс-методы

выделения плазмидных ДНК. Тезисы III Всесоюзного рабочего совещания по программе "Плазмида", 1980, 45.

2. Зинченко В.В., Бабыкин М.М. Экспрессия плазмидных детерминантов

антибиотикорезисгентности в клетках Rhodopseudomonas sphaeroides. Тезисы VI Всесоюзного рабочего совещания по программе "Плазмида", 1981, 65-66.

3. Бабыкин М.М., Зинченко В.В. Трансформация клеток Rhodopseudomonas

sphaeroides плазмидной ДНК. Тезисы докладов IV съезда Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова; 1982, часть 4, 1011. ' "

4. Бабыкин М.М., Зинченко В.В. (1983)-. Способ разделения нуклеиновых

кислот. Авторское свидетельство N 1046249.

5. Shestakov S., Zinchenko V., Babykin М., Kameneva S. and Dubeikobsky A.

Development of gene transfer systems in purple bacterium Rhodopseudomonas sphaeroides. Abstracts of the XI International Genetic Congress, New Dehli,

1983, V.l, p.207. ... ...

6. Babykin M.M. and Zinchenko V.V. Rapid separation of DNAs by buoyant density

in three layer CsCl gradients. Anal. Biochem., 1984, 137, 175-181.

7. Zinchenko V., Saano A., Kameneva S.V. and Shestakov S.V. - Development of

systems for gene analyses in Rhodopseudomonas sphaeroides. Abstracts of the III International symposium on nitrogen fixation with non-legummes. Helsinki,

1984, p.38. •

8. Zinchenko V.V., Babykin M.M. and Shestakov S.V. Mobilization of non-

conjugative plasmids into Rhodopseudomonas sphaeroides. J. Gen. Microbiol., 1984, 130, 1587-1590.

9. Зинченко B.B., Бабыкин M.M., Шестаков C.B. Перенос векторных плазмид в

клетки Rhodopseudomonas sphaeroides. Генетика, 1984, 20, 12, 1934-1941.

10. Зинченко В.В, Саано А.К., Бабыкин М.М., Шестаков С.В. Векторы для

широкого круга хозяев на основе плазмиды RSF1010. Тезисы Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", Пушино, 1984, 10.

11. Бабыкин М.М., Зинченко В.В., Бибикова М.В., Шестаков С.В. Плазмиды

различных штаммов Rhodopseudomonas sphaeroides. Мол. генетика, микробиология и вирусология, 1984, 7, 23-28.

12. Зинченко В.В, Шесгопалов В.И., Бабыкин М.М. Тп1757 - новый транспозон,

содержащий последовательность pBR325. Тезисы IX Всесоюзного рабочего совещания по программе "Плазмида", Пущино, 1984, 34.

13. Zinehenko V., Saano A., Babykin М., Kopteva A. and Shesuikov S. Gene cloning

vectors for Rhodopseudomonas sphaeroides. . Abstracts of V International Symposium on Photosynthetic Prokaryotes, Grindelwald, Switzerland, 1985, p.371.

14. Шесгопалов В.И., Зинченко В.В. Векторы прямой селекции рекомбинантных

генов на основе IncQ плазмиды R89S. Проблемы современной биологии. Труды 17-й конференции молодых ученых биологического факультета МГУ. Рукопись депонирована в ВИНИТИ 15 сентября 1986 г., N 6662-13, 55-59.

15. Зинченко В.В., Саано А.К. Молекулярно-генетическая организация

плазмиды R89S группы несовместимости Q. Мол. генетика, микробиология и вирусолотих, 1986, 12, 10-15.

16. Зинченко В.В., Саано А.К., Бабыкин М.М., Шестаков С.В. Использование '

репликона плазмиды R89S для конструирования векторов интеграции. Мол. генетика, микробиология и вирусология, 1987, 7, 11-13.

17. Saano А.К. and Zinehenko V.V. A new IncQ plasmid R89S: properties and

genetic organization. Plasmid,. 1987, 17, 191-201. "18.Зинченхо B.B., Коптева' A.B., Митровова Т.Н., Фролова В.Д. Комплементациояный анализ глутамин-зависимых мутантов фотосивтезирующей бактерии Rhodobacter sphaeroides 2R. Тезисы докладов VI Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва, 1987, 163-164.

19. Каменева С.В., Зинченко В.В. Системы переноса и клонирования генов у

фототрофных азотфиксирующих бактерий. Тезисы докладов V съезда Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова, 1987, т.5, 36.

20. Shestakov S., Zinehenko V., Babykin М., Kopteva A., Kameneva S., Frolova V.,

Shestopalov V. and Bondarenko 0. Genetic studies on the regulation of nitrogen fixation in Rhodobacter sphaeroides. Nitrogen fixation: 100 years after. Proceedings of the 7th International congress on nitrogen fixation. . Koln (Cologne) F.R.G. Ed. by Bothe, FJ. de Bniijn and W.E.Newton. Stuttgart; New York: Fisher, 1988, 163-169.

21. Зинченко В.В. Генная инженерия пурпурных бактерий. В кк.: Фототрофные

микроорганизмы, Пущино, 1988, 36-43.

22. Зинченко В.В., Коптева А.В., Фролова В.Д., Шестаков С.В. Исследование

экспрессии nif и ntr генов Klebsiella pneumoniae в клетках Rhodobacter sphaeroides. Генетика, 1988, 24, 998-1007.

23. Zinchenko V., Churin Yu., Bibikova M. and Muronets E. Cloning of the genes

controlling nitrogen metabolism in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. In: "Problems and Perspectives of biotechnology", Bratislava, Chechoslovakia, 1989, p.1-2.

24. Шестаков C.B., Бабыкин M.M., Бибикова M.B., Бондаренко О.Р., Зинченко

В.В. Клонирование гена, контролирующего регуляцию азотфиксации у фотстрофной бактерии Rhodobacter sphaeroides. Доклады АН СССР, 1989, 305, 984-986.

25. Zinchenko V.V., Babykin М.М., Shestakov S., Allibert P., Vignais P.M. and

Willison J.C.. Ammonia-dependent growth mutants of Rhodobacter capsulatus and Rhodobacter sphaeroides: comparison of mutant phenotypes and cloning of wild-type (adgA) genes. J. Gen. Microbiol., 1990, 136, 2385-2393.

26. Чурин Ю.Н., Зинченко В.В. Исследование гена glnA Rhodobacter sphaeroides.

Тезисы VII Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов, 1990, 184-185.

27. Shesfakov S., Zinchenko V., Churin Y., Goguseva M. Analysis of regulatory genes

for nitrogen-fixation in Rhodobacter sphaeroides. Abstracts of the V International symposium on nitrogen fixation with non-legumes. Florence, Italy,

1990, p.174.

28. Shestakov S., Churin Yu., Zinchenko V. and Bibikova M. Genetic organization of

Rhodobacter sphaeroides chromosome region containing gene glnA. In: "Nitrogen fixation", M.Polsinelli, R.Materassi, Eds. Kluwer Acad. Publ., Dortrecht, Boston, London, 1991, 573-575.

29. Zinchenko V., Churin Yu. and Shestakov S. The glnA gene is a member of cluster

controlling nitrogen methsbolism in Rhodobacter sphaeroides. Abstracts of the VII International symposium on photosynothetic prokariotes, Amherst, USA,

1991, 196A. ^

30. Зинченхо B.B., Бабыкин M.M., Бибикова M.B., Чурин Ю.Н., Шестаков С.В.

Регуляция процесса азотфиксации у пурпурной фототрофной бактерии Rhhodobacter sphaeroides: клонирование гена ntr5. В сбор. "Экология и биотехнология азотфиксируютцих почвенных микроорганизмов" Санкт-Петербург, ИСХМ', 1991, 92-99.

31. Зинченко В.В., Коптева А.В., Белавина Н.В., Шестаков С.В.' Исследование , различного типа мутантов Rhodobacter sphaeroides с дерепрессированной

нитрогеназой. Генетика, 1991, 27, 991-999.

32. Shestakov S„ Zinchenko V., Babykin M., Churin Yu., Glaser V. and Malyshev I.

Cloning of new regulatory genes of Rhodobacter sphaeroides involved in nitrogen fixation. VIHth Eastern Europe Symposium on Biological Nitrogen Fixation NITROGENFIX-92, Saratov, 1992, p.13.

33. Shestakov S., Babykin M., Churin Y., Glazer V. and Zinchenko V., Cloning and

analysis of genes controlling nitrogen fixation in Rhodobacter sphaeroides, Abstracts of the 9th International Cogress on Nitrogen Fixation. Canctm/Mexico, 1992, N36.

34. Shestakov S., Zinchenko V., Glazer V., Babykin M., Churin Y. and Malishev I.

Regulation of nitrogen fixation in the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides. Abstracts of the VI International Symposium "Nitrogen Fixation with Non-Legumes", Ismailia, Egypt, 1993, 5.

35. Zinchenko V., Babykin M., Glaser V., Smirnova V. and Shestakov S. Rhodobacter

sphaeroides ntrC gene is involved in general control of nitrogen metabolism. Abstracts of the VIII International Symposium on Phototrophic Prokaryotes. Urbino, Italy, 1994, 155.

36. Zinchenko V., Churin Y., Shestopalov V. and Shestakov S.. Nucleotide sequence

and characterization of the Rhodobacter sphaeroides glnB and glnA genes. Microbiology, 1994, 140, 2143-2151.

37. Глазер B.M., Тевзадзе Г.Г., Бабыкин M.M., Зинченко В.В., Шестаков С.В.

Клонирование и идентификация, гена, контролирующего азотистый, метаболизм у фотосинтезирующей бактерии Rhodobacter sphaeroides. Мол. генетика, микробиология, вирусология, 1994, 5, 21-25.

38. Зинченко В.В., Бабыкин М.М., Глазер В.М., Малышев И.А., Халум Ф.,

Шестаков С.В. Идентификация генов, контролирующих азотистый метаболизм и азотфиксащно у фототрофной пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides. Генетика, 1994, т.30 (приложение), 56. - 39. Зинченко В.В., Бабыкин М.М., Бибикова М.В., Глазер В.М. Смирнова В.А., Чурин Ю.Н., Малышев И.А., Шестаков С.В. Молекулярная генетика регуляции азотфиксации у фотосинтезирующих бактерий семейства Rhodospirillaceae. Тезисы 9-го Ваковского коллоквиума по азотфиксации, Москва. 1995, 84.

40. Зинченко В.В., Шесгопалов В.И., Чурин Ю.Н. Анализ куклеотидаой последовательности глутаминсинтетазы Rhodobacter sphaeroides. Биохимия, 1995,60,9,1429-1433. /

41. Zinchenko V., Babykin M., Glaser V., Smirnova V., Abdullaev Z., Popov A. and Shestakov S. Role of the ntrB and ntrC genes of Rhodobactersphaeroides in the regulation of nitrogen and carbon metamolism. Nitrogen fixation: fundamentals and applications. Proceedings of the 10th International congress on nitrogen fixation. Kluwer Acad. Publ., Dortrecht, Boston, London, I-A. Tikhonovich, N.A. Provorov, V.I.Romanov, W.E.Newton (Eds), 1995, 243.

Информация о работе

Зинченко, Владислав Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 1996
ВАК 03.00.07

Автореферат

Похожие работы