Потоковая модель метаболизма, связанного с производством водорода бактериями рода Rhodobacter

Голомысова, Анастасия Никитична

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Потоковая модель метаболизма, связанного с производством водорода бактериями рода Rhodobacter
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Потоковая модель метаболизма, связанного с производством водорода бактериями рода Rhodobacter"

На правах рукописи

Голомысова Анастасия Никитична

Потоковая модель метаболизма, связанного с производством водорода бактериями рода ШюДоЬа^ег

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

2 7 Я Н В 2011

Москва-2010

4842939

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор Твердислов Всеволод Александрович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Ризниченко Галина Юрьевна

Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем биологии РАН

Защита состоится «24» февраля 2011 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д501.001.96 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Россия, Москва, Ленинские горы 1/12, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, «Новая» аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан <#0 » декабря 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Пантелеев Михаил Александрович

кандидат биологических наук

М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

В настоящее время, в связи с экономическими и экологическими проблемами, возникающими при использовании традиционных видов топлива, возрастает научная и инновационная актуальность разработок по альтернативным источникам энергии. Водород является перспективным экологически чистым топливом. Хотя в современной промышленности водород получают из ископаемых видов топлива, однако в лабораторных условиях разрабатываются пути его синтеза, безопасные для окружающей среды.

Одним из наиболее перспективных путей синтеза водорода является его получение за счет солнечной энергии с помощью фотосинтезирующих микроорганизмов. В частности, пурпурные несерные бактерии способны образовывать водород как побочный продукт роста культуры на органических отходах. Когда этот процесс будет доведен до индустриальных масштабов, это позволит не только производить экологически чистое топливо, но и очищать окружающую среду. Однако такие существенные преимущества будут достигнуты, только если будет сконструирована рентабельная система производства водорода. Такая система должна быть основана на бактериальных штаммах, производящих водород с наибольшим выходом в удобных для промышленности условиях. Наиболее перспективными кандидатами для крупномасштабного производства биоводорода считаются бактерии из группы пурпурных несерных бактерий, так как они показывают наибольшую эффективность преобразования энергии и могут использовать большое разнообразие субстратов. Из этой группы бактерии рода Ююс1оЬас1ег являются наиболее распространенными участниками экспериментов по производству водорода.

биологии дают возможность построить эффективно производящую биоводород систему теоретически, что заметно уменьшает объем экспериментальной работы. Один из таких методов, называемый метод баланса стационарных метаболических потоков (Flux Balance Analysis), предложенный в начале 90-х годов Б.О. Палсоном с соавторами (Varma&Palsson, 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60, 3724-3731), позволяет построить математическую модель метаболизма бактерии в стационарном приближении на основе данных о наборе генов бактерии. Такая модель называется потоковой или стехиометрической моделью метаболизма. Потоковая модель может быть использована для компьютерной симуляции экспериментов и подбора оптимальных условий для наработки биотоплива. Кроме того, она может быть использована для поиска генных модификаций, приводящих к увеличению наработки водорода или другого химического вещества.

В связи с необходимостью конструирования эффективной производящей биоводород системы, актуальным оказывается построение потоковой модели метаболизма бактерий рода Rhodobacter, связанного с производством водорода и изучение особенностей этого метаболизма.

Цель и задачи исследования

Главной целью проведённой работы было создание потоковой модели анаэробного метаболизма бактерий рода Rhodobacter, а именно R. sphaeroides и R. capsuîatus, с помощью которой можно будет разработать инновационную технологию производства водорода этими бактериями, а также исследовать возможности коррекции метаболизма этих бактерий.

В задачи работы входило:

• для каждой из бактерий R. sphaeroides и R. capsuîatus создание и сопоставление с литературными данными списка биохимических реакций, описывающих анаэробный метаболизм бактерий и достаточных для описания производства водорода этой бактерией;

• для каждой из бактерий Я. хрИаегогЛа и Я. саряиШш создание потоковой модели анаэробного фотогетеротрофного метаболизма с помощью метода баланса стационарных метаболических потоков;

• поиск экспериментальных данных, достаточно подробно описывающих рост и производство водорода культурами Я. $рИаего1с1ез и Я. сар8и1аШ, и проведение сравнения экспериментальных данных с предсказаниями построенной модели;

• на основе потоковых моделей Я. лр/гдегогд'ел' и Я. сарзиЫш провести сравнение их анаэробного метаболизма;

• определение изменений в экспериментальных условиях, необходимых для увеличения наработки водорода;

• предсказание мутантов бактерий Я. $ркаего1<1ев и Я. сараиШиа, производящих водород с повышенной скоростью.

Научная новизна

Впервые создана потоковая модель анаэробного метаболизма бактерии Ююс1оЬас1ег. Эта модель позволяет описывать распределение стационарных потоков вещества, как в центральном метаболизме, так и в метаболизме аминокислот, липидов, и в фотосинтетическом аппарате. Проведено сравнение предсказаний модели с экспериментальными данными и продемонстрирована ее работоспособность.

Впервые с помощью потоковой модели проведена интерпретация экспериментальных данных на всей продолжительности жизни бактериальной культуры.

Впервые предсказаны мутанты Я. $ркаего1(1ез и Я. сарэиШш способные производить водород с более высокой скоростью, чем природные штаммы.

Практическое значение работы

Построенная модель анаэробного метаболизма бактерий рода Я1юс1оЬас1ег позволяет провести компьютерный анализ экспериментальных данных о

производстве водорода бактериальной культурой и предложить пути изменения экспериментальных условий для оптимизации процесса и увеличения объема наработанного водорода. Кроме того, модель позволяет предсказать влияние различных факторов внешней среды, таких как освещение и тип субстрата, на результат эксперимента. Модель позволяет предсказать генные модификации Я. $ркаего1(1ез и Я. саряиЫш, приводящие к созданию штаммов с повышенным выделением водорода. Использовать такой материал можно будет в создании биореакторов, подборе субстратов и штаммов для запуска производства водорода бактериями Я, зрНаего1с1е$ и Я. саряи!аШ.ч в промышленных масштабах.

Апробация работы

Основные результаты диссертации были представлены на XVII международной конференции "Математика. Компьютер. Образование" (Дубна, 2010). Доклады о результатах работы были представлены на семинаре сектора информатики и биофизики сложных систем кафедры биофизики биологического факультета МГУ и семинаре лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН.

По материалам диссертации опубликовано 4 работы, из них 3 публикации в реферируемых журналах по списку ВАК и 1 тезисы в трудах международных конференций.

Структура работы

Диссертация представлена на 136 страницах и состоит из введения, 6 глав и трех приложений. Работа проиллюстрирована 21 рисунком и содержит 12 таблиц, список литературы включает 140 источников.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы задачи работы, кратко охарактеризованы методы и их решения, отражены научная новизна и практическая значимость результатов.

Глава 1. Современные представления о производстве биоводорода бактериальными клетками

В первой главе представлен обзор литературы, посвященный особенностям производства водорода биологическим путем. Особенное внимание уделено возможности выделения водорода микроорганизмами на свету за счет процесса фотосинтеза. Приведены причины, по которым пурпурные бактерии считаются наиболее перспективными производителями водорода в крупных масштабах. Обоснован выбор бактерий рода Rhodobacter в качестве предмета диссертации.

В этой главе приведен обзор известных в настоящее время экспериментальных условий, необходимых для производства водорода бактериями R. sphaeroides и R. capsulatus. Проведен анализ основных задач, которые ставят перед собой экспериментаторы. Выделены основные направления, по которым необходимо исследовать производство водорода биологическим путем с помощью математического моделирования.

Глава 2. Существующие модели бактериального метаболизма, основанные на методе баланса стационарных метаболических потоков

Во второй главе представлен обзор литературы, посвященный методу баланса стационарных метаболических потоков (БСМП) (Назипова и др., Мат. Биол. Биоинф., 2007, 2(1), 98-119), известному в англоязычной литературе как Flux Balance Analysis (Lee et al., Brief. Bioínform., 2006, 7(2), 140-150). Обоснована применимость метода к моделированию метаболизма бактериальной клетки, как в фазе экспоненциального роста, так и в

стационарной фазе. Показаны возможности метода, приведены примеры его успешного применения для моделирования бактериального метаболизма, в частности, метаболизма производства водорода, и фототрофного метаболизма. Объяснено, что имеющиеся в мировой литературе потоковые модели не могут быть применены для описания метаболизма производства водорода пурпурной несерной бактерией.

Глава 3. Потоковая модель метаболизма бактерий рода Rhodobacter

3.1. Метод баланса стационарных метаболических потоков (БСМП)

Первая часть третьей главы посвящена описанию метода БСМП и методам поиска генных модификаций. Построенная с его помощью модель метаболизма (потоковая модель), базируется на информации о наборе биохимических реакций, который определяется по набору генов бактерии, и на данных о составе клеточной биомассы. Распределение потоков вещества находится путем максимизации прироста биомассы (или другой целевой функции - линейной комбинации потоков) при различном составе среды, различном освещении и фиксированном наборе реакций. В методе БСМП используется стационарное приближение. Для поиска мутантов используется симуляция метаболизма клетки при поочередном блокировании потоков через отдельные реакции.

3.2. Построение списка биохимических реакций

Вторая часть третьей главы посвящена построению списка биохимических реакций, описывающих анаэробный метаболизм бактерий Я. sphaeroides и R. capsulatus. За основу взят набор биохимических реакций, представленный для бактерий R. sphaeroides 2.4.1 и R. capsulatus в базе данных KEGG («Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes», www.genome.jp/kegg/), который был дополнен и проверен по литературным данным. Приведены причины, по которым конкретные реакции были включены в модель и обоснован выбор ограничений на направления отдельных реакций. Также проведено сравнение списков биохимических реакций, описывающих метаболизм бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus, и сделан вывод об их различии.

3.3. Параметры потоковой модели

В третьей части третьей главы обоснован выбор входных и выходных потоков для стехиометрической модели (табл. 1). Описано построение потока вывода биомассы (В% табл. 1). Описан выбор целевых функций (табл. 1) и особенности их применения.

Таблица 1. Параметры потоковой модели.

Параметр Комментарии

ммоль/(гСБКч) скорость усвоения источника углерода, входной поток

Л/у, ммоль/(гСБКч) скорость усвоения источника азота, входной поток

Р/, ммоль/(гСБК-ч) интенсивность освещения, выражаемая в виде потока фотонов, поглощенных фотосинтетическим аппаратом, входной поток

5/мг/(гСБКч) скорость наработки биомассы, выходной поток

/саг. ммоль/(гСБКч) скорость выделения углекислого газа, выходной поток

/да, ммоль/(гСБК-ч) скорость выделения водорода, выходной поток

Ррип, мг/(гСБКч) скорость запасания полигидроксибутирата, выходной поток

мг/(гСБКч) скорость запасания полисахаридов, выходной поток

Рвш, ммоль/(гСБКч) скорость выделения бутирата, выходной поток

/•>„,., ммоль/(гСБК-ч) скорость выделения формиата, выходной поток

0/с = К*В/-Рсо2-Рцш целевая функция с акцентом на запасание веществ, А -численный коэффициент порядка 103

ОГ„ = А*ВГ+Рш целевая функция с акцентом на производство водорода

3.4. Методика обработки литературных данных о росте бактериальной культуры

В четвертой части третьей главы описаны методы обработки экспериментальных данных, а именно получение значений параметров модели на основе данных, публикуемых в экспериментальных работах. Показана применимость стационарной модели к фазе экспоненциального роста бактериальной культуры, если экспериментальные данные соответствуют определенным критериям.

Глава 4. Тестирование потоковых моделей К. зркаего'гйеь и Д. саряиШю

В настоящей главе проведена апробация потоковой модели. Она включает в себя сравнение предсказываемой моделью на основе вычислительных экспериментов качественной картины распределения потоков при фототрофном росте на различных субстратах с известными из эксперимента данными. Также

-7-

в настоящей главе приведен расчет численных значений некоторых выходных потоков и сравнение их с экспериментальными значениями. Кроме того, проведено сравнение расчетов, проводимых с помощью модели R. sphaeroides и модели R. capsulatus.

4.1. Распределение основных потоков вещества в метаболизме

В первой части главы приведены результаты качественного исследования распределения потоков в центральном метаболизме при фототрофном росте культуры на различных субстратах (фотоавтотрофный рост, ацетат, бутират, пропионат, лактат, малат и сукцинат). Представлены краткие схемы распределения потоков и показано, что основные потоки соответствуют общепринятым представлениям о распределении потоков вещества. В качестве примера на рис. 1 приведено распределение потоков в центральном метаболизме R. capsulatus при фотогетеротрофном росте на малате. В этом случае модель предсказывает высокую активность цикла Кальвина, что подтверждается экспериментальными данными (Tichi&Tabita, 2000, Arch. Microbiol. 174, 322-333) для роста R. capsulatus на малате. Блокирование потока через цикл Кальвина приводит к появлению выделения водорода при росте на малате, что также было ранее показано экспериментально в работе (Tichi&Tabita, 2000, Arch. Microbiol. 174,322-333).

Кроме того, в части 4.1 представлено сравнение численных результатов моделирования обоих видов, позволяющие оценить, насколько различия в наборе биохимических реакций оказывают влияние на метаболизм бактерий. Оказалось, что при фотоавтотрофном росте и при росте на летучих жирных кислотах численные значения выходных потоков вещества для R. sphaeroides и R. capsulatus совпадают. При фотогетеротрофном росте на классических лабораторных субстратах появляются незначительные различия в метаболизме двух видов, в частности R. sphaeroides требуется на 2-9% меньше освещения для поддержания производства биомассы с той же скоростью, что и R. capsulatus.

¡.Х5Р<£—

[Туг

>•Пент"рзо-(— •Л :

Яи5Р[ ! .Е4Р4-

Н5Р

\Г ф

Н|* V тгр

! Г1А1

.....<— Р6Р—>вбр—1 ;рэс;

КОвР

Я1Р

^фосфатньЛй: ^ ^

путь

СЗР-> СР х— с^1

ч,

[Ш

Э7Р |

в!Р,

|СаГ| [ВсЫ]

Цикл Кальвина^"

Г"

"М

кн,—©у

Эе1<—

б о>

* 5

5 о

с *

I- 2 д'у г 1

2Рй с!тгР

]РЬе|

/IV

н2 -

N43 «5ззэ

н* —>

н/'Ш!

со2 СПЗ»

Рогта1е _

, РЕР

,Руг '

;га]

'Саг! "1ув Уа! 11_еи Не |

АсСоА-

1 \1 .......•

■ АасСоА"

Вй

—ОА 1 СЙ МаСоА _

МаТ Цикл Кребса

Ч -

Бис

ЭисСоА-

РгСоА

Рис. 1. Распределение потоков в центральном метаболизме X. сарзи!а1их при фотогетеротрофном росте на малате. Ширина стрелок пропорциональна потоку вещества через соответствующую реакцию. Ромбами отмечены АТР-зависимые реакции, квадратами - ЫАВ(Р)Н-зависимые реакции, кругами - реакции, в которых участвует углекислый газ. Расшифровка обозначений метаболитов дана на стр. 25.

Так как количество выделяемого или поглощаемого культурой углекислого газа при росте на органическом субстрате характеризует корректность заложенного в модель состава биомассы, было проведено сравнение расчетного значения потока С02 с экспериментальным из работы (Огтегос!, 1956, ВюсЬет. 1 64, 373-380). В табл. 2 приведены основные результаты этого сравнения. Приведенные расчеты показывают, что модель корректно описывает известное распределение потоков в метаболизме бактерий

-9-

рода ЮюйоЪаМег при росте на классических лабораторных субстратах. Качественная картина распределения потоков сходна с экспериментальными данными для Я. sphaeroid.es и Я. сарзиШш. Количественные расчеты в пределах погрешности совпадают с экспериментальными данными для пурпурных бактерий.

Таблица 2. Расчетные и экспериментальные (ОгтегосЗ,1956, ВюсЬет. 1 64, 373-380) величины потока углекислого газа (ммоль/(гСБК ч)), выделяемого при усвоении субстрата со скоростью 1 ммоль/(гСБК ч).

Субстрат ацетат лактат малат сукцинат

Эксперимент 0.25±0.04 0.12±0.09 1.14±0.05 0.75±0.02

Расчет с помощью модели Я. sphaeroides 0.22 0.10 1.10 0.62

Расчет с помощью модели Я. саряиЬш 0.24 0.12 1.12 0.64

4.2. Рост культуры Д. сарвиШия на лактате и глутамате и производство водорода в этих условиях

Во второй части четвертой главы проведено моделирование эксперимента, описанного в классической работе (НШтег&Оеэ!, 1977, I. Вас1егю1. 129, 724731), в котором исследуется производство водорода культурой Я. сарьиЫиь на среде с лактатом и глутаматом в фазе роста и в стационарной фазе. Из экспериментальных данных были оценены скорости усвоения субстратов, скорость производства водорода и скорость роста культуры в фазе роста: 5/с = 1.062±0.010 ммоль/(гСБК-ч), = 1.66±0.14 ммоль/(гСБК-ч), РИ2 = 1.36±0.26 ммоль/(гСБК-ч), скорость роста р = 0.231 Ь"1. На рис. 2 представлены результаты моделирования роста бактерии с входными параметрами = 1.062 ммоль/(гСБК-ч) 1.66 ммоль/(гСБК-ч).

При значениях потока фотонов 5-20 ммоль/(гСБК-ч), модель предсказывает скорость роста культуры (скорость производства биомассы + скорость запасания биополимеров) равной 225-245 мг/(гСБК-ч), что хорошо описывает экспериментальные значения. Экспериментальное значение скорости наработки водорода достигается при значениях потока фотонов 17-21

ммоль/(гСБК-ч). Таким образом, экспериментальные данные правильно описываются моделью при значении потока фотонов 17-20 ммоль/(гСБК-ч).

3,0-

Результаты

вычислительного

эксперимента:

— - • С02, ммоль ....... ЫНз, ммоль

— - Н2, ммоль ---РНВ, 100 мг

— Биомасса, 100 мг - Скорость роста

культуры, 100 мг

Результаты эксперимента (Hillmer&Gest, 1977):

—— Скорость роста культуры, 100 мг

— - Н2, ммоль

2,5 2,0

з-*

ш t.5-

1.0

¿2 0.5

0,0 -0,5

, * /

у •

---- _ _ _ у* — — -

•< У У

/ *

У У

Поток фотонов, ммоль/(гСБК*ч)

Рис. 2. Расчетная зависимость потоков наработки биомассы и биополимеров и выделения газов и аммония от потока фотонов для потоковой модели Я capsulatus (серые кривые). На вход модели подавался лактат (Sfc - 1.062 ммоль/(гСБК-ч)) и глутамат (SfN =1.66 ммоль/(гСБК-ч)). Использовалась целевая функция Of и (табл. 1).

В приведенном эксперименте (Hillmer&Gest, 1977, J. Bacterid. 129, 724731) через И часов культура прекращает рост вследствие того, что в среде закончился источник азота. В стационарной фазе концентрация клеток в среде остается постоянной, и происходит выделение водорода {Fm - 2.08±0.13 ммоль/(гСБК ч)) и, возможно, запасание биополимеров за счет усвоения лактата (Sfc = 0.55±0.02 ммоль/(гСБК-ч)). Моделирование этой фазы роста дает максимальную скорость наработки водорода при такой скорости усвоения субстрата равной (F/K)max = 2.75±0.10 ммоль/(гСБК-ч), для этого необходимо 19 ммоль/(гСБК-ч) фотонов. Экспериментальное значение Fm ~ 2.08±0.13 ммоль/(гСБК-ч) достигается при потоке фотонов 13-15 ммоль/(гСБК-ч) - чуть ниже, чем поток фотонов в экспоненциальной фазе.

В целом, проведенное сравнение расчета и экспериментальных данных показывает способность модели предсказывать экспериментальные значения потоков.

4.3. Рост культуры R. sphaeroides па малате и аммонии и производство водорода в этих условиях

В третьей части четвертой главы проведено моделирование эксперимента, описанного в работе (Waligorska et al., 2009, J. Appl. Microbiol. 107, 1308-1318), в котором исследуется производство водорода культурой R. sphaeroides O.U.OOl, растущей на среде с малатом и аммонием. Фаза роста в представленных экспериментальных данных характеризуется линейным ростом со временем концентрации клеток в среде и линейным падением концентраций обоих субстратов, при этом водород не выделяется. Исходя из того, что концентрации субстратов падают линейно, можно получить, что соотношение Bf:Sfc'.Sfi{ остается постоянным в течении всей фазы роста, и модельный расчет достаточно провести только для одной временной точки. Был взят момент времени, в который скорость роста ^ = 0.107 h"1, Sfc (скорость усвоения малата) = 1.46 ммоль/(гСБК ч), SfN (скорость усвоения аммония) = 0.82 ммоль/(гСБК ч). На рис. 3 темно-серыми линиями представлены результаты моделирования роста бактерии с входными параметрами Sfc = 1.46 ммоль/(гСБК-ч) и SfN = 0.82 ммоль/(гСБК-ч). Экспериментальное значение биомассы достигается при потоке фотонов большем 5 ммоль/ч. В этом случае 20-25% биомассы составляются запасные вещества. Согласно данным (Waligorska et al., 2009, J. Appl. Microbiol. 107, 1308-1318), в анализируемом запуске после того, как культура употребила весь аммоний, концентрация запасенных веществ составляла 25%, так что предсказания модели хорошо согласуются с экспериментом.

Так как считается, что запасание биополимеров конкурирует с производством водорода, было проведено моделирование роста бактерии в этих же условиях с целевой функцией с акцентом на производство водорода. Модельные зависимости скоростей наработки биомассы, запасания веществ, выделения углекислого газа и водорода от света представлены на рис. 3 светлосерыми линиями. Из 1рафика видно, что при увеличении освещения вместо наработки полисахаридов начинает нарабатываться водород, в то время как при

потоке фотонов меньше 6 ммоль/ч, разницы между режимом с акцентом на запасание вещества и режимом с акцентом на выделение водорода не наблюдается. Это говорит о том, что производство водорода конкурирует не с производством полигидроксибутирата, а с производством полисахаридов.

Результаты 120" вычислительного эксперимента: 1

— - • С02, мл ....... РБС.мг £80

— - Н2, мл Ш ---РНВ, мг У 60

— • Биомасса, мг * ---Формиат, мг

— Скорость с роста культуры, мг 20

Результаты эксперимента о (УУаИдогвка efa/., 2009): —— Скорость роста культуры, мг

■1 ■ 1

1 •

t . //' • ■ * " -

• // ' ~ ~' • • . - "

— —>— г, — -r—i--- ....

6 8 10 12 14 Поток фотонов, ммоль/(гСБК*ч)

Рис. 3. Расчетная зависимость потоков наработки биомассы и биополимеров и выделения газов и аммония от потока фотонов для модели R. sphaeroides. На вход модели подавался малат (Sfc = 1.46 ммоль/(гСБК-ч)) и аммоний (S/j? = 0.82 ммоль/(гСБК-ч)), в качестве целевой функции использовалась Of с (темно-серые линии), либо О/н (светло-серые линии).

В стационарной фазе жизнедеятельности культуры в этом же эксперименте (Waligorska et al, 2009, J. Appl. Microbiol. 107, 1308-1318) концентрация малата в среде линейно падает со временем со скоростью 0.045 мМ/ч, а объем аккумулируемого газа линейно увеличивается со скоростью 0.0185 л/ч. Соответственно, скорости потребления субстрата и наработки водорода равны Sfc = 0.061 ммоль/(гСБК ч) и FH2 = 0.98 ммоль/(гСБК ч). Здесь сразу следует заметить, что теоретически из 0.061 ммоль малата можно получить не больше 0.061*6 = 0.366 ммоль водорода, а экспериментально получаемое количество в три раза больше. Это означает, что в реальности для производства водорода используется не только субстрат, но и внутренние ресурсы клетки. Как получено ранее, в фазе роста нарабатывалось 20% запасных веществ. Если в начале стационарной фазы 20% сухой биомассы клеток составлял РНВ, то за 24 часа стационарной фазы его можно было полностью использовать со скоростью 6 мг/(гСБК-ч). Поэтому при моделировании стационарной фазы на вход модели

-13-

подавался малат со скоростью 0.061 ммоль/(гСБК • ч) и гидроксибутират со скоростью 6 мг/(гСБКч). Расчет показал, что в этих условиях максимальная скорость производства водорода равна 1.05 ммоль/(гСБК-ч). Это значение скорости производства водорода практически совпадает с экспериментальным значением в анализируемой фазе. Таким образом, предположения об источнике субстрата для производства водорода и скорости его усвоения верны.

Таким образом, проведенный анализ экспериментальных данных (Waligorska et al., 2009, J. Appl. Microbiol. 107, 1308-1318) показывает, что в фазе роста культуры 20-23% субстрата идет на запасание биополимеров. При этом если избежать ингибирования нитрогеназы ионами аммония, в фазе роста теоретически возможно переключение метаболизма на выделение водорода. Однако анализ производства водорода в стационарной фазе показал, что все запасенные полимеры были преобразованы в водород. Значит, по крайней мере, в данных условиях, запасание биополимеров не является вредным фактором для производства водорода.

4.4. Заключение

В четвертой части четвертой главы проводится суммирование проведенной апробации модели и формулируются соответствующие выводы (см. выводы 1 и 2 на стр. 23).

Глава 5. Предсказание особенностей метаболизма и мутантов R. sphaeroides и R. capsulatus при помощи потоковой модели

В настоящей главе с помощью потоковой модели проводится исследование поведения бактерий рода Rhodobacter в различных условиях. Кроме того, проводится поиск генных модификаций, приводящих к появлению выделения водорода в условиях, оптимальных для роста бактерии.

5.1. Поведение бактерий при недостатке аммония в среде

В первой части пятой главы проводится исследование поведения бактерии при фотогетеротрофном росте при недостатке азота в среде, так как именно в подобных условиях, при достаточном освещении, бактерии синтезируют

полезные для промышленности вещества - водород и полиалканоаты. Моделирование с целевой функцией с акцентом на выделение водорода (Ofn, сплошные линии на рис. 4) характеризует максимальное количество водорода, которое может быть выделено клеткой при заданном потоке субстратов и заданном освещении. Построенная модель позволяет объяснить, почему выделение водорода происходит только при сильном освещении: выделение водорода, в отличие от выделения формиата и бутирата, требует АТР, поэтому в качестве стока для NADH появляется только когда есть возможность синтезировать дополнительное количество АТР, не требуемое для роста клетки, т.е. при сильном освещении.

60-

7 40-

ьс из о

. 20-

о с:

Si11 к Ш

igy 80-^

га ^г

ш 2 60 х

п Л

ё 840 о л a S ?п g о 20

оё „

С1

5 10 15 20 25 30

Поток фотонов, ммоль/(гСБК*ч)

Рис. 4. Расчетная зависимость потоков наработки биополимеров и выделения побочных продуктов от потока фотонов для потоковой модели R. capsulatus. На вход модели подавались ацетат (Sfc = 3 ммоль/(гСБК ч)) и аммоний (S/n = 1 ммоль/(гСБК ч)). Использовалось два вида условий: i) целевая функция О/и (сплошные линии), ii) целевая функция О/с (пунктирные линии).

Для исследования конкуренции процессов запасания биополимеров с производством водорода было проведено моделирование роста бактерии при недостатке азота в среде с целевой функцией с акцентом на запасание углерода {Ofc, пунктирные линии на рис. 4). В эту целевую функцию включено подавление выделения веществ, содержащих углерод, в среду. Моделирование показывает, что при сильном освещении бактерия запасает полисахариды, а при снижении освещения этот процесс заменяется на запасание полигидроксибутирата и выделение формиата и бутирата. Таким образом, с процессом производства водорода конкурирует (за NADH и за АТР) именно процесс запасания полисахаридов.

5.2. Производство водорода и запасание биополимеров в стационарной

фазе

В стационарной фазе, когда прекращается рост культуры, происходит только усвоение субстрата - источника углерода, за счет которого поддерживается жизнедеятельность культуры, запасание биополимеров и, как побочный процесс, выделение водорода. Взаимоотношения перечисленных процессов и их зависимость от освещения в стационарной фазе полностью аналогичны полученным в п. 5.1 для роста бактерии при недостатке азота в среде. Производство водорода конкурирует с запасанием полисахаридов за АТР и NADH и заменяется запасанием полигидроксибутирата при снижении освещения. Во второй части пятой главы с помощью построенной потоковой модели были исследованы пути преобразования субстрата в водород и биополимеры при неограниченном потоке фотонов. Проведенное сравнение стехиометрии образования этих веществ для R. capsulatus и R.sphaeroides показало, что распределение потоков в стационарной фазе у этих двух видов одинаково.

5.3. Путь усвоения ацетил-СоА у R. capsulatus

В третьей части пятой главы проведено дополнительное исследование роста R. capsulatus на ацетате, так как у этой бактерии отсутствует активная изоцитрат-лиаза - ключевой фермент глиоксилатного шунта, необходимого для

усвоения ацетата. Было проведено моделирование роста и производства водорода бактерией Л. саръиШш на ацетате при включении либо глиоксилатного шунта, либо цитрамалатного пути, либо этилмалонилового пути, после чего полученные результаты сравнивались друг с другом и с экспериментальными данными. В табл. 3 представлены результаты моделирования роста бактерии на ацетате и аммонии.

В экспериментах (Огтегос!, 1956, ВшсЬет. I. 64, 373-380) для пурпурных несерных бактерий получено значение скорости выделение углекислого газа при росте на ацетате равное 0.25 моль/моль субстрата. Как видно из табл. 3, это значение близко к результату, получаемому в модели с этилмалониловым путем, и заметно отличается от предсказаний моделей с цитрамалатным путем или глиоксилатным шунтом.

Таблица 3. Величины потоков (ммоль/ч), предсказываемые моделью при усвоении ацетата со скоростью 1 ммоль/ч._____

Путь усвоения ацетил-СоА глиоксилатный цитрам алатный этилмалониловый

шунт путь путь

Скорость производства биомассы 0.57 0.57 0.52

Необходимое количество фотонов 5.94 5.95 3.63

Скорость усвоения №Ь 0.49 0.49 0.45

Скорость выделения С02 0.06 0.07 0.24

Активность цикла Кальвина 0.36 0.35 0.00

Активность

дополнительного пути 0.40 0.40 0.35

усвоения ацетил-СоА

Также было проведено сравнение количества выделяемого в стационарной фазе водорода для модели бактерии с разными путями усвоения ацетил-СоА при максимальном освещении с экспериментальными данными. Оказалось, что для моделей, в которых усвоение ацетата происходит по этилмалониловому пути, производство водорода осуществляется по суммарной реакции: СНзСООН + 2Н20 — ЗН2 + 2Н+ + 2С02 Для моделей с цитрамалатным путем или глиоксилатным шунтом имеет место реакция:

СНзСООН + 2Н20 4Н2 + 2СОг -17-

В экспериментальных работах, относящихся к росту Л. саряиШия на ацетате, указывается максимальная скорость производства водорода от 2.5 до 3 моль водорода/моль субстрата, что ближе всего к работе модели по этилмалониловому пути.

По результатам сравнения предсказаний модели с двумя видами экспериментальных данных можно сказать, что модель с включенным этилмалониловым путем лучше описывает экспериментальные данные по выделению водорода и углекислого газа, чем модель с цитрамалатным путем или с глиоксилатным шунтом. Результаты каждого из экспериментов, относящихся к этому режиму роста, можно объяснить недостатком освещения или склонностью к запасанию биополимеров, тем не менее, представленные в настоящей работе данные численного моделирования дают возможность провести аккуратную экспериментальную проверку.

5.4. Предсказание генных модификаций, приводящих к увеличению наработки водорода в фазе роста

В четвертой части пятой главы описаны результаты использования модели для предсказания нокаутов (генных модификаций, приводящих к блокированию потока через реакцию, катализируемую продуктом соответствующего гена), приводящих к увеличению потока наработки водорода в фазе роста бактерии. Для расчета используется метод двухуровневого линейного программирования, описанный в главе 3. Первой целевой функцией при этом является поток наработки биомассы (В/), а второй - поток наработки водорода (Рц2). Были изучены группы, содержащие не более 4х нокаутов. Набор нокаутов, приводящий к увеличению наработки водорода, зависит от вида бактерии (К sphaeroid.es или Я.сарзиШия) и от субстрата, поэтому были проведены исследования для всех допустимых в модели комбинаций (12 вариантов). Приведено обсуждение влияния отдельных нокаутов на метаболизм бактерии. В качестве примера в табл. 4 приведен набор нокаутов, приводящий к увеличению наработки водорода при росте К саряиЫш на малате.

Таблица 4. Предсказанные моделью группы нокаутов, приводящие к увеличению скорости наработки водорода в фазе роста Л са/иы/а/нл на малате. Знаком "О" обозначено блокирование соответствующего ферменту потока. Скорость усвоения субстрата = I

Нокаут Скорость производства биомассы по сравнению с диким типом Скорость производства водорода, ммоль/(гСБКч)

ГММБСО РП, БСОТ РС то

О 93% 0.14

о 85% 0.53

0 о 93% 0.41

о О 90% 0.22

о о о 92% 0.47

0 0 о 90% 0.48

о о о 86% 0.79

При внесении полученных нокаутов в потоковую модель производство водорода появляется за счет перераспределения потоков таким образом, что в клетке возникает избыток КАО(Р)Н, при условии блокирования всех дополнительных стоков NAD(P)H, при этом скорость наработки биомассы снижается. Различия в списке биохимических реакций Я. sphaeroid.es и Я. саряиШия проявляются именно в наборах нокаутов. Группы нокаутов, предсказываемые для Я. capsu.la.tus основаны на блокировании КиВ1зСО (сток ЫАБН) и РРЬ (выделение формиата), а группы нокаутов, предсказанные для Я. sphaeroides, основаны на перенаправление синтеза глицеральдегид-3-фосфата с глюконеогенеза на синтез через О-глицерат. Однако надо иметь ввиду, что в модели не были введены ограничения на скорость реакции, поэтому в реальной клетке при перераспределении потоков может оказаться, что реакция, на которую пришелся основной поток вещества в мутанте, на это не рассчитана.

5.5. Заключение

В пятой части пятой главы проводится суммирование проведенного исследования метаболизма бактерии и формулируются соответствующие выводы (см. выводы 3-6 на стр. 23).

Глава 6. Обсуждение результатов

В данной главе суммированы выполненные в работе исследования, проводится обсуждение полученных результатов и их места в мировой науке. Приводятся дальнейшие направления развития модели. Дадим краткое резюме.

Бактерии рода Rhodobacter являются одними из наиболее перспективных производителей биоводорода. В настоящее время многие исследовательские группы ищут пути влияния на метаболизм этих бактерий, чтобы приспособить их для производства водорода в крупных масштабах. Однако условия, в которых бактерии рода Rhodobacter дают наибольший выход биогаза, различаются для разных штаммов и поиск оптимальных условий идет методом подбора для каждого следующего штамма. В этой исследовательской задаче не хватает теоретического осмысления получаемых экспериментальных данных, которое может дать модель метаболизма бактериальной клетки.

Потоковые модели метаболизма уже зарекомендовали себя как полезные инструменты для анализа распределения потоков вещества в метаболизме различных бактерий и для предсказания возможного влияния на жизнедеятельность клетки путем нокаутов. Хотя уже построено много моделей разных бактерий, они не могут быть использованы для анализа метаболизма бактерий рода Rhodobacter, так как отличаются от нее условиями жизнедеятельности.

В настоящей работе представлена потоковая модель анаэробного фотогетеротрофного метаболизма, объединяющая бактерии R. sphaeroides и Rcapsulatus. Эта модель, включая в себя кроме путей центрального метаболизма, пути биосинтеза аминокислот, липидов, нуклеиновых кислот и фотосинтетических пигментов, и процессы, происходящие при фотосинтезе, а так же реакции, связанные с выделением водорода и запасанием полимеров, является практически полной моделью анаэробного метаболизма Rhodobacter. При построении модели были учтены такие особенности, как наличие альтернативного пути усвоения ацетата и различный синтез фотосинтетических мембран при разном освещении. Хотя при построении моделей использовались

отдельные наборы биохимических реакций для R. sphaeroides и R. capsulatus, при тестировании модели оказалось, что эти различия не имеют существенного влияния на результаты моделирования, поэтому был сделан вывод о схожести метаболизмов этих двух видов.

Тестирование модели было проведено путем сравнения известных из эксперимента потоков с расчетными, как для фазы экспоненциального роста бактерии, так и для стационарной фазы. Тестирование показало, что модель правильно предсказывает реальные потоки вещества и может быть использована для анализа и интерпретации экспериментов.

Для демонстрации работоспособности модели был проведен анализ двух экспериментальных работ. На первом наборе экспериментов, опубликованном в работе (Hillmer&Gest, 1977, J. Bacterid. 129, 724-731), продемонстрирована способность модели корректно предсказывать распределение потоков в метаболизме R. capsulatus в фазе роста и в стационарной фазе при выделении водорода этой бактерией. Тоже было показано и на втором наборе экспериментов, относящихся к росту культуры R. sphaeroides на среде с малатом и аммонием (Waligorska et al., J. Appl. Microbiol., 2009, 107(4), DOSIS 18). Применение двух различных видов целевой функции при моделировании последних данных позволило предположить, что блокирование синтеза биополимеров может привести к возрастанию скорости наработки водорода в фазе роста. Более подробное исследование запасания биополимеров при недостатке азота в среде и в стационарной фазе подтвердило это предположение. Кроме того, численный анализ данных (Waligorska et al., J. Appl. Microbiol., 2009, 107(4), 1308-1318) показал, что бактерии используют весь запасенный полигидроксибутират для производства водорода в стационарной фазе. Этот результат, хотя и предполагался ранее в экспериментальных работах, впервые получил однозначное подтверждение.

С помощью построенной модели также сделаны предположения о генных модификациях, которые могут привести к увеличению наработки водорода. Увеличение скорости производства водорода во всех случаях происходит за

счет уменьшения скорости наработки биомассы, т.е. снижения скорости роста культуры. Это положительный момент, так как медленно растущая культура медленнее заполняет объем, и среда дольше пропускает свет. Кроме того, оказалось, что различия в наборах биохимических реакций, описывающих метаболизм бактерий Я. sphaeroid.es и Л. сар5иШш, приводят к различным наборам предсказанных нокаутов для этих двух видов бактерий. Все предсказанные нокауты, кроме блокирования потока через цикл Кальвина, в настоящей работе предлагаются впервые.

Однако надо помнить, что построенная модель метаболизма использует стационарное приближение, поэтому обладает определенными ограничениями. В то время как модель способна предсказать, как будет распределяться усвоенный клеткой субстрат при различном освещении, она не может дать представления о скорости усвоения субстрата при изменении его концентрации в среде. Поэтому построение кинетической модели метаболизма для предсказания поведения бактерии в различных условиях является одним из возможных направлений развития модели метаболизма бактерий рода Rhodobacter.

Другим возможным направлением развития является добавление известной генетической регуляции процессов, управляющей переключением потоков между различными метаболическими путями. Хотя в настоящее время недостаточно экспериментальных данных для построения полной картины, объединение потоковой модели метаболизма и модели генетической регуляции метаболизма позволит спланировать соответствующие эксперименты.

В целом, уже в настоящем виде построенная потоковая модель обладает большим исследовательским потенциалом и может быть использована для анализа данных различных экспериментов по производству не только водорода, но и других полезных веществ, и одновременно может применяться для эффективного планирования новых экспериментов.

Выводы

1. Впервые построена и апробирована потоковая модель анаэробного метаболизма бактерии рода Юю<1оЬас1ег. Показано, что предсказываемые моделью скорости роста культуры и наработки побочных продуктов хорошо согласуются с экспериментальными данными.

2. Выявлены различия между наборами биохимических реакций, характеризующими анаэробный метаболизм бактерий Я. sphaeroid.es и Я. саряиШш. Теоретически доказано, что эти различия не оказывают существенного влияния на физиологию фототрофного роста указанных бактерий.

3. С использованием построенной модели теоретически показано, что усвоение ацетата при фототрофном росте Я. сарзиШш не идет по цитрамалатному пути, как считалось ранее. На основании модельных расчетов высказана гипотеза о том, что у Я. саряиШш этой цели служит этилмалониловый путь.

4. С помощью разработанной модели показано, что блокировка синтеза полисахаридов у бактерий Я. хрИаего^Лех и Я. саръи1аШх приводит к заметному увеличению скорости производства водорода.

5. Предложены группы эффективных генных модификаций клетки Я. sphaeroides, приводящие к увеличению скорости наработки водорода в фазе роста культуры. Основной предложенной генной модификацией является выключение гена, кодирующего фосфоглицерат киназу (ЕС 2.7.2.3).

6. Предложены группы эффективных генных модификаций клетки Я. сар$и1а1т, приводящие к увеличению скорости наработки водорода в фазе роста культуры. Основной предложенной генной модификацией является выключение гена, кодирующего пируват: формиат лиазу (ЕС 2.3.1.54).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. А.Н. Голомысова, П.С. Иванов. «Моделирование анаэробного метаболизма Rhodobacter sphaeroides методом баланса стационарных метаболических потоков». Тезисы Всероссийской научной конференции «Математика. Компьютер. Образование», т. 17, (Москва-Ижевск) - 2010 - С. 229.

2. А.Н. Голомысова, М. Гомельский, П.С. Иванов. «Математическое моделирование бактериального метаболизма». Вестник Московского Университета. Серия 3.2010 №3, 73-76

3. Golomysova A, Gomelsky М and Ivanov PS, «Flux Balance Analysis of photoheterotrophic growth of purple nonsulfur bacteria relevant to biohydrogen production», International Journal of Hydrogen Energy, 2010, 35(23), 1275112760.

4. А.Н. Голомысова, П.С. Иванов, «Исследование анаэробного метаболизма бактерий Rhodobacter capsidatus с помощью потоковой модели», Биофизика, 2011,56(1), 85-98.

Благодарности

Автор выражает благодарность своему научному руководителю, Всеволоду Александровичу Твердислову, за внимание и всестороннюю поддержку проведенного исследования. Автор глубоко признателен научному руководителю своей дипломной работы, сотруднику кафедры биофизики физического факультета МГУ Павлу Сергеевичу Иванову за интересную постановку задачи для кандидатской работы, многочисленные и плодотворные обсуждения получаемых результатов и сотрудничество в их публикации.

Список использованных сокращений

2PG 2-фосфоглицерат

3PG 3-фосфоглицерат

АасСоА ацетоацетил-СоА

АсСоА ацетил-СоА

АТР аденозин-5'-трифосфат

Behl бактериохлорофилл а

But бутират, масляная кислота

Саг каротиноиды

Cit лимонная кислота

СоА кофермент А

Е4Р эритрозо-4-фосфат

F1P фруктозо-1-фосфат

F6P фруктозо-6-фосфат

FA жирные кислоты

Formate формиат, муравьиная кислота

FP2 фруктозо-1,6-бисфосфат

G глицеральдегид G1P глюкозо-1-

фосфат

G3P глицеральдегид-3 -фосфат

G6P глюкозо-6-фосфат

GIP2 1,3-бисфосфоглицерат

GP глицерон-фосфат

KDGP 2-ксто-З-дсчоксиглюконат-б-

фосфат

KEGG «Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes», база данных о биохимических реакциях

Mal малат, яблочная кислота

МаСоА малонил-СоА

NADH восстановленная форма

никотинамид-адении-динуклеотида

NAD(P)H восстановленная форма

никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфата,

либо никотинамид-аденин-динуклеотида

OA оксалоацетат

Ogl 2-оксоглутарат

PC пируват карбоксилаза (Pyruvate

carboxylase), ЕС 6.4.1.1

PEP фосфоенолпируват

PFL пируват: формиат лиаза (pyruvate

formate-lyase), ЕС 2.3 Л .54

РНВ поли- Р-гидроксибутират

PL фосфолипиды

РгСоА пропаноил-СоА

PRP2 фосфорибозил пирофосфат

PSC полисахариды

Руг пируват

R5P рибозо-5-фосфат

RPI рибозофосфат изомераза (Ribose-

5-phosphate isomerase), ЕС 5.3.1.6

Ru5P рибулозо-5-фосфат

RuBisCO рибулозобисфосфат

карбоксилаза

RuP2 рибулозо-1,5-бисфосфат S7P седогентулозо-7-фосфат SCOT сукцинил-СоА трансфераза (succinyl-CoA:3-oxoacid coenzyme А transferase), ЕС 2.8.3.5 SP2 седогентулозо-1,7-бисфосфат STK сукцинат: СоА лигаза (Succinate thiokinase), ЕС 6.2.1.5 Sue сукцинат, янтарная кислота SncCoA сукцинил-СоА TD треанин деаминазе (L-threonine ammonia-lyase), ЕС 4.3.1.19 UG UDP-глюкоза Х5Р ксилулозо-5-фосфат СБК сухая биомасса клеток

Подписано к печати J3.iZ.iQ_

Тираж 100 Заказ 2Ш.

Отпечатано в отделе оперггтвном печати! физического факультета МГУ

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Голомысова, Анастасия Никитична

Введение.

Глава 1. Современные представления о производстве биоводорода бактериальными клетками.

1.1 Производство водорода биологическим путем.

1.2 Производство водорода бактериями Я. зркаегспйеи и К. сарзиШш.

Глава 2. Существующие модели бактериального метаболизма, основанные на методе баланса стационарных метаболических потоков.

2.1 Математическое моделирование метаболизма.

2.2 Метод баланса стационарных метаболических потоков.

2.3 Примеры потоковых моделей.

2.4 Потоковые модели фотосинтезирующих микроорганизмов и бактерий -производителей водорода.

Глава 3. Потоковая модель метаболизма бактерий рода Шюс1оЬа&ег.

3.1 Метод баланса стационарных метаболических потоков (БСМП).

3.2 Построение списка биохимических реакций.

3.2.1 Гликолиз/глюконеогенез, пентозофосфатный путь и цикл Кальвина.

3.2.2 Метаболизм фосфоенолпирувата и пирувата.

3.2.3 Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса).

3.2.4 Метаболизм ацетата, пропионата и бутирата.

3.2.5 Биосинтез аминокислот.

3.2.6 Биосинтез нуклеиновых кислот.

3.2.7 Биосинтез липидов.

3.2.8 Биосинтез пигментов фотосинтетического аппарата.

3.2.9 Мембранные комплексы.

3.2.10 Уточнение списка биохимических реакций.

3.2.11 Отличительные особенности биохимии К. 5рИаего1с1ез и Я. сар$и1аШ$.Л

3.3 Параметры потоковой модели.

3.3.1 Вещества, усваиваемые, выделяемые или запасаемые бактерией.

3.3.2 Наработка биомассы клеток.

3.3.3 Целевая функция.

3.4 Методика обработки литературных данных о росте бактериальной культуры.

3.4.1 Скорость роста бактериальной культуры.

3.4.2 Усвоение субстрата и выделение побочных продуктов.

Глава 4. Тестирование потоковых моделей Я. 5рЬаего 'к1е$ и Я. сарзиШт.

4.1 Распределение основных потоков вещества в метаболизме.

4.1.1 Фотоавтотрофный рост.

4.1.2 Фотогетеротрофный рост на классических субстратах (малат, лактат, сукцинат).

4.1.3 Фотогетеротрофный рост на летучих жирных кислотах (ацетат, бутират, пропионат).

4.1.4 Качественные различия метаболизма Я. sphaeroid.es и Я. саряиШш.

4.2 Рост культуры Я. саряиШш на лактате и глутамате и производство водорода в этих условиях.

4.3 Рост культуры Я. $ркаего1(1е$ на малате и аммонии и производство водорода в этих условиях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Потоковая модель метаболизма, связанного с производством водорода бактериями рода Rhodobacter"

Актуальность

Одним из наиболее перспективных путей синтеза водорода является его получение за счет солнечной энергии с помощью фотосинтезирующих микроорганизмов. В частности, пурпурные несерные бактерии способны образовывать водород как побочный продукт роста культуры на органических отходах. Когда этот процесс будет доведен до индустриальных масштабов, это позволит не только производить экологически чистое топливо, но и очищать окружающую среду. Однако такие существенные преимущества будут достигнуты, только если будет сконструирована рентабельная система производства водорода. Такая система должна быть основана на бактериальных штаммах, производящих водород с наибольшим выходом в удобных для промышленности условиях. Наиболее перспективными кандидатами для крупномасштабного производства биоводорода считаются бактерии из группы пурпурных несерных бактерий, так как они показывают наибольшую эффективность преобразования энергии и могут использовать большое разнообразие субстратов. Из этой группы бактерии рода Rhodobacter являются наиболее распространенными участниками экспериментов по производству водорода.

До недавнего времени выбор подходящего штамма и условий для его оптимального роста и производства водорода требовал постановки большого количества экспериментов. В то же время современные методы системной биологии дают возможность построить эффективно производящую биоводород систему теоретически, что заметно уменьшает объем экспериментальной работы. Один из таких методов, называемый метод баланса стационарных метаболических потоков (Flux Balance Analysis), позволяет построить математическую модель метаболизма бактерии в стационарном приближении на основе данных о наборе генов бактерии. Такая модель называется потоковой или стехиометрической моделью метаболизма. Потоковая модель может быть использована для компьютерной симуляции экспериментов и подбора оптимальных условий для наработки биотоплива. Кроме того, она может быть использована для поиска генных модификаций, приводящих к увеличению наработки водорода или другого химического вещества.

В связи с необходимостью конструирования эффективной производящей биоводород системы, актуальным оказывается построение потоковой модели метаболизма бактерий рода КУюс1оЬас1ег, связанного с производством водорода и изучение особенностей этого метаболизма.

Цель и задачи исследования

Главной целью проведённой работы было создание потоковой модели анаэробного метаболизма бактерий рода Якос1оЬас(ег, а именно Я. sphaeroid.es и Я. capsu.la.tus, с помощью которой можно будет разработать инновационную технологию производства водорода этими бактериями, а также исследовать возможности коррекции метаболизма этих бактерий.

В задачи работы входило:

• для каждой из бактерий Я. sphaeroid.es и Я. сарзиШт создание и сопоставление с литературными данными списка биохимических реакций, описывающих анаэробный метаболизм бактерий и достаточных для описания производства водорода этой бактерией;

• для каждой из бактерий Я. sphaeroides и Я. сархиШт создание потоковой модели анаэробного фотогетеротрофного метаболизма с помощью метода баланса стационарных метаболических потоков;

• поиск экспериментальных данных, достаточно подробно описывающих рост и производство водорода культурами Я. sphaeroides и Я. сарзиШш, и проведение сравнения экспериментальных данных с предсказаниями построенной модели;

• на основе потоковых моделей Я. sphaeroides и Я. саряиШиз провести сравнение их анаэробного метаболизма;

• определение изменений в экспериментальных условиях, необходимых для увеличения наработки водорода;

• предсказание мутантов бактерий Я. sphaeroides и Я. сархиШиз, производящих водород с повышенной скоростью.

Научная новизна

Впервые создана потоковая модель анаэробного метаболизма бактерии Rhodobacter. Эта модель позволяет описывать распределение стационарных потоков вещества, как в центральном метаболизме, так и в метаболизме аминокислот, липидов, и в фотосинтетическом аппарате. Проведено сравнение предсказаний модели с экспериментальными данными и продемонстрирована ее работоспособность.

Впервые предсказаны мутанты Л. sphaeroid.es и Л. сархиШж способные производить водород с более высокой скоростью, чем природные штаммы.

Практическое значение работы

Построенная модель анаэробного метаболизма бактерий рода Мкн^оЬаМег позволяет провести компьютерный анализ экспериментальных данных о производстве водорода бактериальной культурой и предложить пути изменения экспериментальных условий для оптимизации процесса и увеличения объема наработанного водорода. Кроме того, модель позволяет предсказать влияние различных факторов внешней среды, таких как освещение и тип субстрата, на результат эксперимента. Модель позволяет предсказать генные модификации Л. $ркаего1йе$ и Л. сархиШш, приводящие к созданию штаммов с повышенным выделением водорода. Использовать такой материал можно будет в создании биореакторов, подборе субстратов и штаммов для запуска производства водорода бактериями К. хркаегохйеь и Я. сарзиШт в промышленных масштабах.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Голомысова, Анастасия Никитична

Выводы

1. Впервые построена и апробирована потоковая модель анаэробного метаболизма бактерии рода Rhodobacter. Показано, что предсказываемые моделью скорости роста культуры и наработки побочных продуктов хорошо согласуются с экспериментальными данными.

2. Выявлены различия между наборами биохимических реакций, характеризующими анаэробный метаболизм бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus. Теоретически доказано, что эти различия не оказывают существенного влияния на физиологию фототрофного роста указанных бактерий.

3. С использованием построенной модели теоретически показано, что усвоение ацетата при фототрофном росте R. capsulatus не идет по цитрамалатному пути, как считалось ранее. На основании модельных расчетов высказана гипотеза о том, что у R. capsulatus этой цели служит этилмалониловый путь.

4. С помощью разработанной модели показано, что блокировка синтеза полисахаридов у бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus приводит к заметному увеличению скорости производства водорода.

5. Предложены группы эффективных генных модификаций клетки R. sphaeroides, приводящие к увеличению скорости наработки водорода в фазе роста культуры. Основной предложенной генной модификацией является выключение гена, кодирующего фосфоглицерат киназу (ЕС 2.7.2.3).

6. Предложены группы эффективных генных модификаций клетки R. capsulatus, приводящие к увеличению скорости наработки водорода в фазе роста культуры. Основной предложенной генной модификацией является выключение гена, кодирующего пируват: формиат лиазу (ЕС 2.3.1.54).

5.5. Заключение

В настоящей главе с помощью построенной и протестированной потоковой модели исследованы особенности метаболизма бактерий рода Rhodobacter. Получены следующие результаты:

- При недостатке азота в среде и в стационарной фазе происходит запасание биополимеров или выделение водорода, формиата и бутирата (п. 5.1). При сильном освещении происходит выделение водорода или запасание полисахаридов, которые являются конкурирующими процессами. При слабом освещении происходит либо запасание РНВ, либо выделение формиата, либо углекислого газа.

- В п. 5.2 показано, что биохимические пути запасания биополимеров и выделения побочных продуктов не отличаются для Л. sphaeroid.es и К. сархиШш, поэтому поведение этих бактерий в стационарной фазе одинаково. При росте при недостатке азота в среде (п. 5.1) распределение потоков в метаболизме в силу линейности модели является суммой распределения потоков при росте клетки и распределения потоков при синтезе побочных продуктов в стационарной фазе. Это означает, что, так как распределение потоков в метаболизме Л. sphaeroides и Л. сарыйа1т одинаково и при оптимальном росте (п. 4.1), и в стационарной фазе, то распределение потоков будет одинаково и при недостатке азота в среде. Поэтому в п. 5.1. приведены результаты исследования производства побочных продуктов при недостатке азота в среде только для Л. саряиШш, так как для Л. sphaeroides оно такое же.

- С помощью построенной потоковой модели предсказаны наборы нокаутов, внесение которых в геном бактерий Л. sphaeroгdes и/или Л. сар$и1а1т приведет к появлению выделения водорода этими бактериями при росте на различных субстратах (п. 5.4). Производство водорода при этом происходит за счет перераспределения потоков таким образом, что в клетке появлялся избыток КАБ(Р)Н, при условии блокирования всех дополнительных стоков КАО(Р)Н, при этом скорость наработки биомассы снижается. Различия в списке биохимических реакций Л. sphaeroides и Л. сарзиШт проявляются именно в наборах нокаутов: группы нокаутов, предсказываемые для Л. сарзиШт основаны на блокировании Ил^бСО (сток КАОН) и РБЬ (выделение формиата), а группы нокаутов, предсказанные для Л. sphaeroides, основаны на перенаправление синтеза глицеральдегид-3-фосфата с глюконеогенеза на синтез через Б-глицерат. Однако надо иметь ввиду, что в модели не были введены ограничения на скорость реакции, поэтому в реальной клетке при перераспределении потоков может оказаться, что реакция, на которую пришелся основной поток вещества в мутанте, на это не рассчитана.

- С помощью потоковой модели Л. саряиШш проведено сравнение различных путей усвоения ацетил-СоА: глиоксилатного шунта, этилмалонилового пути и цитрамалатного пути. Оказалось, что по количеству выделяемого углекислого газа и водорода глиоксилатный и цитрамалатный пути одинаковы, а этилмалониловый путь заметно отличается (п. 5.3). Имеющиеся экспериментальные данные ближе к предсказаниям модели с этилмалониловым путем, на основании чего сделан вывод, что у Л. сар8и1аШ5, скорее всего, действует именно этот путь усвоения ацетил-СоА.

Глава 6. Обсуждение результатов

Бактерии рода Rhodobacter являются одними из наиболее перспективных производителей биоводорода (Koku et al, 2002; Basak&Das, 2007; Eroglu et al, 2008; Basak&Das, 2009; Obeid et al, 2009). В настоящее время многие исследовательские группы ищут пути влияния на метаболизм этих бактерии, чтобы приспособить их для производства водорода в крупных масштабах. Однако условия, в которых бактерии рода Rhodobacter дают наибольший выход биогаза различаются для разных штаммов и поиск оптимальных условий идет методом подбора для каждого следующего штамма. В этой исследовательской задаче не хватает теоретического осмысления получаемых экспериментальных данных, которое может дать модель метаболизма бактериальной клетки.

Потоковые модели метаболизма уже зарекомендовали себя как полезные инструменты для анализа распределения потоков вещества в метаболизме различных бактерий и для предсказания возможного влияния на жизнедеятельность клетки путем генных модификаций (Durot et al, 2009; Milne et al, 2009). Хотя уже построено много стехиометрических моделей разных бактерий, они не могут быть использованы для анализа метаболизма бактерий рода Rhodobacter, так как отличаются от нее условиями жизнедеятельности (Feist et al, 2009). Среди существующих потоковых моделей метаболизма бактерий, связанного с производством водорода, большинство занимают модели темнового производства водорода (Е. coli (Pharkya et al, 2004; Manish et al, 2007), Citrobacter amalonaticus (Oh et al, 2008), Clostridium butyricum (Cai et al, 2010)), и только одна модель цианобактерии Synechocystis sp. (Montagud et al, 2010) описывает производство водорода фотосинтезирующим микроорганизмом. Все эти модели не могут быть использованы для исследования производства водорода ПНС бактериями, так как у них отличаются как основные синтезирующие водород ферменты (у всех перечисленных организмов используются гидрогеназы), так и фотосинтетический аппарат (у цианобактерий две фотосистемы и оксигенный фотосинтез).

Для анализа метаболизма пурпурных бактерий в 2002 г. была построена потоковая модель центрального метаболизма (Klamt et al, 2002). Однако в этой модели отсутствовали реакции, связанные с производством водорода и биополимеров и не учитывались известные особенности жизнедеятельности Rhodobacter, поэтому они неприменима к анализу производства водорода бактериями рода Rhodobacter.

В настоящей работе представлена потоковая модель анаэробного фотогетеротрофного метаболизма, объединяющая бактерии R. sphaeroides и R. capsulatus. Эта модель, включая в себя кроме путей центрального метаболизма, пути биосинтеза аминокислот, липидов, нуклеиновых кислот и фотосинтетических пигментов, и процессы, происходящие при фотосинтезе, а так же реакции, связанные с выделением водорода и запасанием полимеров, является практически полной моделью анаэробного метаболизма Rhodobacter. При построении модели были учтены такие особенности, как наличие альтернативного пути усвоения ацетата и различный синтез фотосинтетических мембран при разном освещении. Особенностью настоящей модели является возможность использования различных целевых функций для исследования склонностей бактериальной культуры к синтезу различных побочных продуктов. Хотя при построении моделей использовались отдельные наборы биохимических реакций для R. sphaeroides и R. capsulatus, при тестировании модели оказалось, что эти различия не имеют существенного влияния на результаты моделирования, поэтому был сделан вывод о схожести метаболизмов этих двух видов.

Для демонстрации работоспособности модели был проведен анализ двух экспериментальных работ. На первом наборе экспериментов, опубликованном в работе (Hillmer&Gest, 1977а) продемонстрирована способность модели корректно предсказывать распределение потоков в метаболизме R. capsulatus в фазе роста и в стационарной фазе при выделении водорода этой бактерией. Тоже было показано и на втором наборе экспериментов, относящихся к росту культуры R. sphaeroides на среде с манатом и аммонием (Waligorska et al., 2009). Применение двух различных видов целевой функции при моделировании последних данных позволило предположить, что блокирование синтеза биополимеров может привести к возрастанию скорости наработки водорода в фазе роста. Более подробное исследование запасания биополимеров при недостатке азота в среде и в стационарной фазе подтвердило это предположение. Кроме того, численный анализ данных (Waligorska et al, 2009) показал, что бактерии используют весь запасенный полигидроксибутират для производства водорода в стационарной фазе. Этот результат, хотя и предполагался ранее в экспериментальных работах, впервые получил однозначное подтверждение.

С помощью построенной потоковой модели было проведено исследование распределения потоков в метаболизме бактерий при фотогетеротрофном росте на малате и ацетате. Последний субстрат был выбран, так как он в последние годы все чаще используется экспериментаторами как субстрат для роста бактерий рода Rhodobacter (Barbosa et al., 2001; Fang et al, 2005; Laurinavichene et al, 2008; Ózgür et al, 2010). Ацетат представляет особый интерес для промышленного использования пурпурных несерных бактерий, так как является одним из основных составляющих органических отходов (Тао et al., 2008). Результаты выполненных к настоящему времени лабораторных экспериментов по производству водорода бактериями на ацетате не обнадеживают, поскольку эффективность использования данного субстрата составляет около 60% (Fang et al, 2005; Laurinavichene et al., 2008). К тому же пурпурные несерные бактерии при росте на ацетате гораздо более склонны запасать полигидроксибутират, чем при росте на лактате или малате (Koku et al., 2002; Eroglu et al, 2008). Проведенное исследование метаболизма ацетата с помощью потоковой модели позволило количественно охарактеризовать соотношение запасаемых биополимеров и производимого водорода, а также определить метаболические пути (выделение бутирата и формиата, запасание полисахаридов), конкурирующие с выделением водорода.

Метаболизм некоторых пурпурных несерных бактерий характеризуется отсутствием глиоксилатного шунта, необходимого для усвоения ацетата. Считается, что R. capsulatus также относится к подобным бактериям (Meister et al., 2005). Для пурпурных несерных бактерий открыто два запасных пути усвоения ацетата: цитрамалатный путь у Rhodospirillum rubrum (Берг&Ивановский, 2009) и этилмалониловый путь у Rhodobacter sphaeroides (Erb et al., 2007). Хотя в работе (Meister et al, 2005) было продемонстрировано только присутствие у R. capsulatus фермента метилмалил-СоА лиазы, общего для цитрамалатного и этилмалонилового пути, в настоящее время в литературе (Kars et al., 2009; Kars&Gündüz, 2010) считается, что у R. capsulatus присутствует именно цитрамалатный путь. Для проверки этого факта в настоящей работе было проведено сравнение предсказаний потоковой модели R. capsulatus с различными путями усвоения ацетата с имеющимися экспериментальными данными (Ormerod, 1956; Fang et al., 2005; Laurinavichene et al., 2008; Özgür et al., 2010). Оказалось, что модель с включенным этилмалониловым путем лучше описывает экспериментальные данные по выделению водорода и углекислого газа, чем модель с цитрамалатным путем или с глиоксилатным шунтом. Результаты каждого из экспериментов, относящихся к этой моде роста, можно объяснить недостатком освещения или склонностью к запасанию биополимеров, тем не менее представленные в настоящей работе данные численного моделирования дают возможность провести аккуратную экспериментальную проверку.

Эффективность производства водорода дикими видами бактерий ограничена внутренними связями, некоторые из которых заложены в настоящую потоковую модель. Кроме ограничения на скорость работы нитрогеназы (не учитывается в модели), общее количество произведенного водорода лимитируется следующими факторами: обратное усвоение водорода гидрогеназой (не моделируется, так как может быть легко устранено блокированием гидрогеназы (Kars et al., 2009)), ингибирование нитрогеназы ионами аммония, недостаточное освещение культуры, альтернативные "стоки" электронов, и т.п. (Кагэ&ОйпсШг, 2010). Преодоление этих ограничений приведет к созданию "суперпроизводителя" водорода (Каге&СйпсШг, 2010). С помощью потоковой модели возможно вычислить пути преодоления последних двух из перечисленных препятствий. В то время как расчет необходимого освещения должен проводится для конкретных экспериментальных условий (как было продемонстрировано при тестировании модели), вычисление генных модификаций, приводящих к блокированию альтернативных "стоков" электронов может быть проведено независимо от эксперимента, что и было сделано в настоящей работе.

С помощью построенной модели были сделаны предположения о генных модификациях, которые могут привести к увеличению наработки водорода. Увеличение скорости производства водорода во всех случаях происходит за счет уменьшения скорости наработки биомассы, т.е. снижения скорости роста культуры, что предсказывалось экспериментаторами (МеЫскл е/ а/., 2008). Это положительный момент, так как медленно растущая культура медленнее заполняет объем, и среда дольше пропускает свет. Кроме того, оказалось, что различия в наборах биохимических реакций, описывающих метаболизма бактерий & $ркаегспс1ех и Я. саряиШия, приводят к различным наборам предсказанных нокаутов для этих двух видов бактерий. Группы нокаутов, предсказываемые для Я. сарзиШш основаны на блокировании цикла Кальвина (сток КАОН) и РРЬ (выделение формиата), а группы нокаутов, предсказанные для Я. 5ркаегогс1е8, основаны на перенаправление синтеза глицеральдегид-3-фосфата с пути глюконеогенеза на синтез через Б-глицерат. Но так как в модели не были введены ограничения на скорость реакции, результирующее распределение потоков в реальной клетке может отличаться от предсказываемого, так как при перераспределении потоков может оказаться, что реакция, на которую пришелся основной поток вещества в мутанте, на это не рассчитана. Все предсказанные нокауты, кроме блокирования потока через цикл Кальвина, в настоящей работе предлагаются впервые.

Однако надо помнить, что построенная модель метаболизма использует стационарное приближение, поэтому обладает определенными ограничениями. В то время как модель способна предсказать, как будет распределяться усвоенный клеткой субстрат при различном освещении, она не может дать представления о скорости усвоения субстрата при изменении его концентрации в среде. Тем не менее, стехиометрическая матрица, которая является основой потоковой модели, может стать основой и для построения динамической модели (.ГатзЫсН&Ра^зоп, 2008). Располагая картиной распределения потоков вещества в клетке, можно существенно сократить число переменных в построенной на основе потоковой модели редуцированной кинетической модели (Ризниченко&Рубин,

2004). Поэтому построение кинетической модели метаболизма для предсказания поведения бактерии в различных условиях является одним из возможных направлений развития модели метаболизма бактерий рода Шюс1оЪас1ег.

Другим возможным направлением развития является добавление известной генетической регуляции процессов, управляющей переключением потоков между различными метаболическими путями. Например, ингибирование нитрогеназы ионами аммония может быть добавлено в модель на регуляторном уровне, так как этот процесс хорошо изучен и уже ведутся работы по созданию мутантов, менее подверженных влиянию аммония (Кагз&ОипсШг, 2010). Хотя в настоящее время недостаточно экспериментальных данных для построения полной картины, объединение потоковой модели метаболизма и модели генетической регуляции метаболизма позволит спланировать соответствующие эксперименты.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Голомысова, Анастасия Никитична, Москва

1. Берг, И.А., Ивановский, Р.Н., 2009. Ферменты цитрамалатного цикла у Rhodospirillum rubrum. Микробиология 78, 22-31.

2. Любецкая, А.В., Рубанов, Л.И., Гельфанд, М.С., 2006. Применение потоковой модели для изучения метаболизма Escherichia coli. Биохимия 71, 1544 — 1549.

3. Минкевич, И.Г., Цыганков, А.А., 2002. Материально-энергетический баланс роста фототрофных пурпурных бактерий. Биофизика 47, 663-672.

4. Ризниченко, Г.Ю., Рубин, А.Б. Биофизическая динамика продукционных процессов. Москва-Ижевск: Институт компьютерных исследований, 2004.

5. Фукс, Г. Биосинтез клеточных строительных блоков. В: Ленгелер, Й., Древе, Г., Шлегель, Г. (ред.), Современная микробиология. Прокариоты. "Мир", Москва, 2005, стр. 145-203.

6. Фукс, Г., Крегер, А. Рост и питание. В: Ленгелер, И., Древе, Г., Шлегель, Г. (ред.), Современная микробиология. Прокариоты. "Мир", Москва, 2005, стр. 132-134.

7. Цыганков, А.А., 2006. Получение водорода биологическим путем. Российский химический э/сурнал L, 26-33.

8. Alber, В.Е., Kung, J.W., Fuchs, G., 2008. 3-Hydroxypropionyl-coenzyme A synthetase from Metallosphaera sedula, an enzyme involved in autotrophic CO2 fixation. Journal of Bacteriology 190,1383-1389.

9. Alber, B.E., Spanheimer, R., Ebenau-Jehle, C., Fuchs, G., 2006. Study of an alternate glyoxylate cycle for acetate assimilation by Rhodobacter sphaeroides. Molecular Microbiology 61,297-309.

10. Aoki, K.F., Kanehisa, M., 2005. Using the KEGG database resource. Current Protocols in Bioinformatics Unit 1:12.

11. Asada, Y., Miyake, J., 1999. Photobiological hydrogen production. Journal of Bioscience andBioengineering 88, 1-6.

12. Barbosa, M.J., Rocha, J.M.S., Tramper, J., Wijffels, R.H., 2001. Acetate as a carbon source for hydrogen production by photosynthetic bacteria. Journal of Biotechnology 85, 25-33.

13. Basak, N., Das, D., 2007. The prospect of purple non-sulfur (PNS) photosynthetic bacteria for hydrogen production: the present state of the art. World Journal of Microbiology&Biotechnology 23, 31-42.

14. Basak, N., Das, D., 2009. Photofermentative hydrogen production using purple non-sulfur bacteria Rhodobacter sphaeroides O.U.OOl in an annular photobioreactor: A case study.

15. Bio mass and Bioenergy 33, 911-919.

16. Beard, D.A., Liang, S.-d., Qian, H., 2002. Energy balance for analysis of complex metabolic networks. Biophysical Journal 83, 79-86.

17. Beard, D.A., Babson, E., Curtis, E., Qian, H., 2004. Thermodynamic constraints for biochemical networks. Journal of Theoretical Biology 228, 327-333

18. Burgard, A.P., Pharkya, P., Maranas, C.D., 2003. Optknock: A bilevel programming framework for identifying gene knockout strategies for microbial strain optimization. Biotechnology and Bioengineering 84, 647-657.

19. Cai, G., Jin, В., Saint, C., Monis, P., 2010. Metabolic flux analysis of hydrogen production network by Clostridium butyricum W5: Effect of pH and glucose concentrations. International Journal of Hydrogen Energy 35, 6681-6690.

20. Chory, J., Kaplan, S., 1983. Light-dependent regulation of the synthesis of soluble and intracytoplasmic membrane proteins of Rhodopseudomonas sphaeroides. Journal of Bacteriology 153, 465-474.

21. Covert, M.W., Schilling, C.H., Palsson, B., 2001. Regulation of gene expression in flux balance models of metabolism. Journal of Theoretical Biology 213, 73-88.

22. Domingues, A., Vinga, S., Lemos, J., 2010. Optimization strategies for metabolic networks. BMC Systems Biology 4:113.

23. Durot, M., Bourguignon, P.-Y., Schachter, V., 2009. Genome-scale models of bacterial metabolism: reconstruction and applications. FEMS Microbiology Reviews 33, 164-190.

24. Eroglu, I., Asian, K., Gunduz, U., Yucel, M., Turker, L. Continuous Hydrogen Production by Rhodobacter sphaeroides O.U.OOl. In: Zaborsky, O.R. (Ed.), BioHydrogen. Plenum Press, New York, 1998

25. Eroglu, I., Tabanoglu, A., Gunduz, U., Eroglu, E., Yucel, M., 2008. Hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides O.U.OOl in a flat plate solar bioreactor. International Journal of Hydrogen Energy 33, 531-541.

26. Fang, H.H.P., Liu, H., Zhang, T., 2005. Phototrophic hydrogen production from acetate and butyrate in wastewater. International Journal of Hydrogen Energy 30, 785-793.

27. Feist, A.M., Herrgard, M.J., Thiele, I., Reed, J.L., Palsson, B.O., 2009. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews. Microbiology 7, 129-143.

28. Feist, A.M., Palsson, B.O., 2008. The growing scope of applications of genome-scale metabolic reconstructions using Escherichia coli. Nature. Biotechnology 26, 659-667.

29. Feist, A.M., Scholten, J.C.M., Palsson, B.O., Brockman, F.J., Ideker, T., 2006. Modeling methanogenesis with a genome-scale metabolic reconstruction of Methanosarcina barkeri. Molecular Systems Biology 2:4.

30. Fuhrer, T., Sauer, U., 2009. Different biochemical mechanisms ensure network-wide balancing of reducing equivalents in microbial metabolism. Journal of Bacteriology 191, 2112-2121.

31. Gadhamshetty, V., Sukumaran, A., Nirmalakhandan, N., Thein Myint, M., 2008. Photofermentation of malate for biohydrogen production ~ A modeling approach. International Journal of Hydrogen Energy 33, 2138-2146.

32. Geyer, T., Helms, V., 2006. Reconstruction of a kinetic model of the chromatophore vesicles from Rhodobacter sphaeroides. Biophysical Journal 91, 927-937.

33. Ghirardi, M.L., Dubini, A., Yu, J., Maness, P.C., 2009. Photobiological hydrogen-producing systems. Chemical Society Reviews 38, 52-61.

34. Hallenbeck, P.C., 2009. Fermentative hydrogen production: Principles, progress, and prognosis. International Journal of Hydrogen Energy 34, 7379-7389.

35. He, D., Bultel, Y., Magnin, J.-P., Willison, J.C., 2006. Kinetic analysis of photosynthetic growth and photohydrogen production of two strains of Rhodobacter capsulatus. Enzyme Microbiology and Technology 38, 253-259.

36. Henry, C.S., Broadbelt, L.J., Hatzimanikatis, V., 2007. Thermodynamics-based metabolic flux analysis. Biophysical Journal 92, 1792-1805.

37. Hillmer, P., Gest, H., 1977a. H2 metabolism in the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas capsulata: H2 production by growing cultures. Journal of Bacteriology 129, 724-731.

38. Hillmer, P., Gest, H., 1977b. H2 metabolism in the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas capsulata: production and utilization of H2 by resting cells. Journal of Bacteriology 129, 732-739.

39. Holzhutter, H.-G., 2006. The generalized flux-minimization method and its application to metabolic networks affected by enzyme deficiencies. Biosystems 83, 98-107.

40. Jahn, A., Keuntje, B., Dorffler, M., Klipp, W., Oelze, J., 1994. Optimizing photoheterotrophic H2 production by Rhodobacter capsulatus upon interposon mutagenesis in the hupL gene. Applied Microbiology and Biotechnology 40, 687-690.

41. Jamshidi, N., Palsson, B.O., 2008. Formulating genome-scale kinetic models in the postgenome era. Moleculer Systems Biology 4:171.

42. Kaplan, S. Control and kinetics of photosynthetic membrane development. In: Clayton, R.K., Sistrom, W.R. (Eds.), The photosynthetic bacteria. Plenum Press, New York, 1978, p. 808-839.

43. Kars, G., Giindiiz, U., 2010. Towards a super H2 producer: Improvements in photofermentative biohydrogen production by genetic manipulations. International Journal of Hydrogen Energy 35, 6646-6656.

44. Kars, G., Giindiiz, U., Rakhely, G., Yiicel, M., Eroglu, I., Kovacs, K.L., 2008. Improved hydrogen production by uptake hydrogenase deficient mutant strain of Rhodobacter sphaeroides O.U.OOl. International Journal of Hydrogen Energy 33, 3056-3060.

45. Kauffman, K.J., Prakash, P., Edwards, J.S., 2003. Advances in flux balance analysis. Current Opinion in Biotechnology 14,491-496.

46. Khatipov, E., Miyake, M., Miyake, J., Asada, Y. Polyhydroxybutyrate accumulation and hydrogen evolution by Rhodobacter sphaeroides as a function of nitrogen availability. In: Zaborsky, O.R. (Ed.), BioHydrogen. Plenum Press, New York, 1998

47. Kiley, P.J., Kaplan, S., 1988. Molecular genetics of photosynthetic membrane biosynthesis in Rhodobacter sphaeroides. Microbiology Reviews 52, 50-69.

48. Kim, E.J., Kim, M.S., Lee, J.K., 2007. Phosphatidylcholine is required for the efficient formation of photosynthetic membrane and B800-850 light-harvesting complex in Rhodobacter sphaeroides. Journal of Microbiology&Biotechnology 17, 373-377.

49. Kim, E.-J., Kim, J.-S., Kim, M.-S., Lee, J.K., 2006a. Effect of changes in the level of light harvesting complexes of Rhodobacter sphaeroides on the photoheterotrophic production of hydrogen. International Journal of Hydrogen Energy 31, 531-538.

50. Kim, M.-S., Baek, J.-S., Lee, J.K., 2006b. Comparison of H2 accumulation by Rhodobacter sphaeroides KD131 and its uptake hydrogenase and PHB synthase deficient mutant. International Journal of Hydrogen Energy 31, 121-127.

51. Kim, S., Seol, E., Oh, Y.-K., Wang, G.Y., Park, S., 2009. Hydrogen production and metabolic flux analysis of metabolically engineered Escherichia coli strains. International Journal of Hydrogen Energy 34, 7417-7427.

52. Klamt, S., Grammel, H., Straube, R., Ghosh, R., Gilles, E.D., 2008. Modeling the electron transport chain of purple non-sulfur bacteria. Moleculer Systems Biology 4:156.

53. Klamt, S., Schuster, S., Gilles, E.D., 2002. Calculability analysis in underdetermined metabolic networks illustrated by a model of the central metabolism in purple nonsulfiir bacteria. Biotechnology and Bioengeneering 77, 734-751.

54. Klein, G., Klipp, W., Jahn, A., Steinborn, B., Oelze, J., 1991. The relationship of biomass, polysaccharide and H2 formation in the wild-type and nifA/nifB mutants of Rhodobacter capsulatus. Archives of Microbiology 155, 477 482.

55. Koku, H., Eroglu, I., Giinduz, U., Yiicel, M., Tiirker, L., 2002. Aspects of the metabolism of hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides. International Journal of Hydrogen Energy 21, 1315-1329.

56. Koku, H., Eroglu, I., Giinduz, U., Yiicel, M., Tiirker, L., 2003. Kinetics of biological hydrogen production by the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides O.U. 001. International Journal of Hydrogen Energy 28, 381-388.

57. Kondo, T., Arakawa, M., Hirai, T., Wakayama, T., Hara, M., Miyake, J., 2002. Enhancement of hydrogen production by a photosynthetic bacterium mutant with reduced pigment. Journal of Bioscience and Bioengineering 93, 145-150.

58. Kondo, T., Wakayama, T., Miyake, J., 2006. Efficient hydrogen production using a multi-layered photobioreactor and a photosynthetic bacterium mutant with reduced pigment. International Journal of Hydrogen Energy 31,1522-1526.

59. Kummel, A., Panke, S., Heinemann, M., 2006. Putative regulatory sites unraveled by network-embedded thermodynamic analysis of metabolome data. Moleculer Systems Biology 2.

60. Lee, J., Yun, H., Feist, A., Palsson, B., Lee, S., 2008a. Genome-scale reconstruction and in silico analysis of the Clostridium acetobutylicum ATCC 824 metabolic network. Applied Microbiology and Biotechnology 80, 849-862.

61. Lee, J.M., Gianchandani, E.P., Eddy, J.A., Papin, J.A., 2008b. Dynamic analysis of integrated signaling, metabolic, and regulatory networks. PLoS Computational Biology 4, el000086.

62. Lee, J.M., Gianchandani, E.P., Papin, J.A., 2006. Flux balance analysis in the era of metabolomics. Briefings in Bioinformatics 7, 140-150.

63. Lee, J.Z., Klaus, D.M., Maness, P.-C., Spear, J.R., 2007. The effect of butyrate concentration on hydrogen production via photofermentation for use in a Martian habitat resource recovery process. International Journal of Hydrogen Energy 32, 3301-3307.

64. Lee, S.K., Chou, H., Ham, T.S., Lee, T.S., Keasling, J.D., 2008c. Metabolic engineering of microorganisms for biofuels production: from bugs to synthetic biology to fuels. Current Opinion in Biotechnology 19, 556-563.

65. Liu, T., Li, X., Zhou, Z., 2010. Improvement of hydrogen yield by hupR gene knock-out and nifA gene overexpression in Rhodobacter sphaeroides 6016. International Journal of Hydrogen Energy 35, 9603-9610.

66. Mackenzie, C., Chounhary, M., Larimer, W.F., Predki, F.P., Stilwagen, S., Armitage, P.J., 2001. The home stretch, a first analysis of the nearly completed genome of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1. Photosynthesis Research 70, 19-41.

67. Macler, B.A., Bassham, J.A., 1988. Carbon allocation in wild-type and Glc+ Rhodobacter sphaeroides under photoheterotrophic conditions. Applied and Environmental Microbiology 54, 2737-2741.

68. Makhorin, A. GNU Linear Programming Kit. Free Software Foundation, Boston, 2001.

69. Manish, S., Venkatesh, K.V., Banerjee, R., 2007. Metabolic flux analysis of biological hydrogen production by Escherichia coli. International Journal of Hydrogen Energy 32, 38203830.

70. McEwan, A.G., 1994. Photosynthetic electron transport and anaerobic metabolism in purple non-sulfur phototrophic bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek 66, 151-164.

71. McKinlay, J.B., Harwood, C.S., 2010. Photobiological production of hydrogen gas as a biofuel. Current Opinion in Biotechnology 21, 244-251.

72. Meister, M., Saum, S., Alber, B.E., Fuchs, G., 2005. L-malyl-coenzyme A/p-methylmalyl-coenzyme A lyase is involved in acetate assimilation of the isocitrate lyase-negative bacterium Rhodobacter capsulatus. Journal of Bacteriology 187, 1415-1425.

73. Melnicki, M.R., Bianchi, L., De Philippis, R., Melis, A., 2008. Hydrogen production during stationary phase in purple photosynthetic bacteria. International Journal of Hydrogen Energy 33, 6525-6534.

74. Milne, C.B., Kim, P.-J., Eddy, J.A., Price, N.D., 2009. Accomplishments in genome-scale in silico modeling for industrial and medical biotechnology. Biotechnology Journal 4, 16531670.

75. Montagud, A., Navarro, E., Fernandez de Cordoba, P., Urchueguia, J., Patil, K., 2010. Reconstruction and analysis of genome-scale metabolic model of a photosynthetic bacterium. BMC Systems Biology 4, 156.

76. Muller, F.M., 1933. On the metabolism of the purple sulphur bacteria in organic media. Archiv fur Mikrobiologie 4, 131-166.

77. Nath, K., Kumar, A., Das, D., 2005. Hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides strain O.U.OOl using spent media of Enterobacter cloacae strain DM11. Applied Microbiology and Biotechnology 68, 533-541.

78. Navarro, E., Montagud, A., Fernández de Córdoba, P., Urchueguia, J.F., 2009. Metabolic flux analysis of the hydrogen production potential in Synechocystis sp. PCC6803. International Journal of Hydrogen Energy 34, 8828-8838.

79. Nogales, J., Palsson, B., Thiele, I., 2008. A genome-scale metabolic reconstruction of Pseudomonasputida KT2440: ÍJN746 as a cell factory. BMC Systems Biology 2:79.

80. Novak, L., Loubiere, P., 2000. The metabolic network of Lactococcus lactis: distribution of 14C-labeled substrates between catabolic and anabolic pathways. Journal of Bacteriology 182, 1136-1143.

81. Obeid, J., Magnin, J.-P., Flaus, J.-M., Adrot, O., Willison, J.C., Zlatev, R., 2009. Modelling of hydrogen production in batch cultures of the photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus. International Journal of Hydrogen Energy 34, 180-185.

82. Oh, Y.-K., Kim, H.-J., Park, S., Kim, M.-S., Ryu, D.D.Y., 2008. Metabolic-flux analysis of hydrogen production pathway in Citrobacter amalonaticus Y19. International Journal of Hydrogen Energy 33, 1471-1482.

83. Ooshima, H., Takakuwa, S., Katsuda, T., Okuda, M., Shirasawa, T., Azuma, M., Kato, J., 1998. Production of hydrogen by a hydrogenase-deficient mutant of Rhodobacter capsulatus. Journal of Fermentation and Bioengineering 85, 470-475.

84. Ormerod, J.G., 1956. The use of radioactive carbon dioxide in the measurement of carbon dioxide fixation in Rhodospirillum rubrum. Biochemical Journal 64, 373-380.

85. Ormerod, J.G., Gest, H., 1962. Symposium on metabolism of inorganic compounds. IV. Hydrogen photosynthesis and alternative metabolic pathways in photosynthetic bacteria. Bacteriology Reviews 26, 51-66.

86. Ozgur, E., Uyar, B., Oztiirk, Y., Yucel, M., Gunduz, U., Eroglu, I., 2010. Biohydrogen production by Rhodobacter capsulatus on acetate at fluctuating temperatures. Resources, Conservation and Recycling 54, 310-314.

87. Papoutsakis, E.T., 1984. Equations and calculations for fermentations of butyric acid bacteria. Biotechnology and Bioengineering 27, 174-187.

88. Pharkya, P., Burgard, A.P., Maranas, C.D., 2004. OptStrain: A computational framework for redesign of microbial production systems. Genome Research 14, 2367-2376.

89. Pirt, S.J., 1982. Maintenance energy: a general model for energy-limited and energy-sufficient growth. Archives of Microbiology 133, 300-302.

90. Reed, J.L., Palsson, B.O., 2003. Thirteen years of building constraint-based in silico models of Escherichia coli. Journal of Bacteriology 185, 2692-2699.

91. Risso, C., Van Dien, S.J., Orloff, A., Lovley, D.R., Coppi, M.V., 2008. Elucidation of an alternate isoleucine biosynthesis pathway in Geobacter sulfurreducens. Journal of Bacteriology 190, 2266-2274

92. Sasaki, K. Hydrogen and 5-Aminolevulinic Acid Production by Photosynthetic Bacteria. In: Zaborsky, O.R. (Ed.), Biohydrogen. Plenum Press, New York, 1998.

93. Savinell, J.M., Palsson, B.O., 1992. Network analysis of intermediary metabolism using linear optimization. I. Development of mathematical formalism. Journal of Theoretical Biology 154, 421-454.

94. Sauer, U., Hatzimanikatis, V., Hohmann, H.P., Manneberg, M., van Loon, A.P., Bailey, J.E., 1996. Physiology and metabolic fluxes of wild-type and riboflavin-producing Bacillus subtilis. Applied and Environmental Microbiology 62, 3687-3696.

95. Schilling, C.H., Edwards, J.S., Letscher, D., Palsson, B.0., 2000. Combining pathway analysis with flux balance analysis for the comprehensive study of metabolic systems. Biotechnology and Bioengineering 71, 286-306.

96. Segre, D., Vitkup, D., Church, G.M., 2002. Analysis of optimality in natural and perturbed metabolic networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 15112-15117.

97. Seifert, K., Waligorska, M., Laniecki, M., 2010. Hydrogen generation in photobiological process from dairy wastewater. International Journal of Hydrogen Energy 35, 9624-9629.

98. Shastri, A.A., Morgan, J.A., 2005. Flux balance analysis of photoautotrophic metabolism. Biotechnology Progress 21, 1617-1626.

99. Shi, X.-Y., Yu, H.-Q., 2004. Hydrogen production from propionate by Rhodopseudomonas capsulata. Applied Biochemistry and Biotechnology 117, 143-154.

100. Shi, X.Y., Yu, H.Q., 2005. Optimization of volatile fatty acid compositions for hydrogen production by Rhodopseudomonas capsulata. Journal of Chemical Technology & Biotechnology 80, 1198-1203.

101. Smallbone, K., Simeonidis, E., Broomhead, D.S., Kell, D.B., 2007. Something from nothing: bridging the gap between constraint-based and kinetic modelling. FEBS Journal 21 A, 5576-5585.

102. Stephanopoulos, G., 1994. Metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology 5,196-200.

103. Stephanopoulos, G., 1999. Metabolic fluxes and metabolic engineering. Metabolic Engineering 1, 1-11.

104. Strnad, H., Lapidus, A., Paces, J., Ulbrich, P., Vlcek, C., Paces, V., Haselkorn, R., 2010. Complete Genome Sequence of the Photosynthetic Purple Nonsulfur Bacterium Rhodobacter capsulatus SB 1003. Journal of Bacteriology 192, 3545-3546.

105. Takaichi, S. Distribution and Biosynthesis of Carotenoids. In: Hunter, C.N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., Beatty, J.T. (Eds.), The Purple Phototrophic Bacteria. Springer Science + Business Media B.V., 2009, p. 97-117.

106. Tao, Y., He, Y., Wu, Y., Liu, F., Li, X., Zong, W., Zhou, Z., 2008. Characteristics of a new photosynthetic bacterial strain for hydrogen production and its application in wastewater treatment. International Journal of Hydrogen Energy 33, 963-973.

107. Teusink, B., Wiersma, A., Jacobs, L., Notebaart, R.A., Smid, E.J., 2009. Understanding the adaptive growth strategy of Lactobacillus plantarum by in silico optimisation. PLoS Computational Biology 5, el000410.

108. Tichi, M.A., Tabita, F.R., 2000. Maintenance and control of redox poise in Rhodobacter capsulatus strains deficient in the Calvin-Benson-Bassham pathway. Archives of Microbiology 174, 322-333.

109. Tichi, M.A., Tabita, F.R., 2001. Interactive control of Rhodobacter capsulatus redox-balancing systems during phototrophic metabolism. Journal of Bacteriology 183, 63446354.

110. Tsygankov, A. A., Laurinavichene, T.V., 1996. Influence of the degree and mode of light limitation on growth characteristics of the Rhodobacter capsulatus continuous cultures. Biotechnology and Bioengineering 51, 605-612.

111. Van Dien, S.J., Iwatani, S., Usuda, Y., Matsui, K., 2006. Theoretical analysis of amino acid-producing Escherichia coli using a stoichiometric model and multivariate linear regression. Journal of Bioscience and Bioengeneering 102, 34-40.

112. Varma, A., Palsson, B.O., 1993a. Metabolic capabilities of Escherichia coli: II. Optimal growth patterns. Journal of Theoretical Biology 165, 503-522.

113. Varma, A., Palsson, B.O., 1993b. Metabolic capabilities of Escherichia coli: I. Synthesis of biosynthetic precursors and cofactors. Journal of Theoretical Biology 165, 477502.

114. Varma, A., Palsson, B.O., 1994. Stoichiometric flux balance models quantitatively predict growth and metabolic by-product secretion in wild-type Escherichia coli W3110. Applied and Environmental Microbiology 60, 3724-3731.

115. Vermeglio, A., Joliot, P., 1999. The photosynthetic apparatus of Rhodobacler sphaeroides. Trends in Microbiology 7, 435-440.

116. Waligorska, M., Seifert, K., Goreeki, K., Moritz, M., Laniecki, M., 2009. Kinetic model of hydrogen generation by Rhodobacter sphaeroides in the presence of NH4+ ions. Journal of Applied Microbiology 107, 1308-1318.

117. Weaver, P.F., Wall, J.D., Gest, H., 1975. Characterization of Rhodopseudomonas capsulata. Archives of Microbiology 105, 207-216.

118. Willows, R.D., Kriegel, A.M. Biosynthesis of bacteriochlorophylls in purple bacteria. In: Hunter, C.N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., Beatty, J.T. (Eds.), The Purple Phototrophic Bacteria. Springer Science + Business Media B.V., 2009, p. 57—79.

119. Zaborsky, O.R. (Ed), BioHydrogen. Plenum Press, New York, 1998.

120. Автор выражает благодарность своему научному руководителю, Всеволоду Александровичу Твердислову, за внимание и всестороннюю поддержку проведенного исследования.

Информация о работе

Голомысова, Анастасия Никитична
кандидата физико-математических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Потоковая модель метаболизма, связанного с производством водорода бактериями рода Rhodobacter - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы