Изменение экспрессии генов, активных в мозге крыс, в условиях фокальной церебральной ишемии под действием семакса и Pro-Gly-Pro

Дмитриева, Вероника Германовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменение экспрессии генов, активных в мозге крыс, в условиях фокальной церебральной ишемии под действием семакса и Pro-Gly-Pro
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменение экспрессии генов, активных в мозге крыс, в условиях фокальной церебральной ишемии под действием семакса и Pro-Gly-Pro"

На правах рукописи

00348444В

Дмитриева Вероника Германовна

ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В МОЗГЕ КРЫС В УСЛОВИЯХ ФОКАЛЬНОЙ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ СЕМАКСА И РЯО-СЬУ-РЯО

03.00.03 - Молекулярная биология

2 6 НОЯ 2009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2009

003484446

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН (зав. отделом доктор биологических наук, профессор С. А. Лимборская).

Научпый руководитель:

кандидат биологических наук

Людмила Васильевна Дергунова

Официальные оппоненты:

доктор биол. наук, профессор Валерий Вячеславович Носиков, ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

доктор биол. наук, профессор Сергей Сергеевич Шишкин, Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Ведущая оцгакизадия:

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН Защита диссертации состоится «/ ») 200$. в ^часов

па заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Россия, Москва, 1-ый Дорожный проезд д.1. Тел: (495)315-3747.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика»

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ггуальиосгь проблемы

Исследование работы генов под действием различных физиологических факторов является ной из самых актуальных проблем современной молекулярной биологии. Появившиеся недавно дходы и технологии позволяют анализировать особенности функционирования множества генов посредственно на транскрипционном уровне. Уже первые исследования в этой области казали, что траискриптом - совокупность всех мРНК (транскрштгов), синтезируемых одной еткой или группой клеток в данный момент времени, - активно и согласованно реагирует на югие воздействия, в том числе возникающие при различных патологических процессах. В стоящее время анализ транскриптома является одним из инструментов для изучения ханнзмов заболеваний и поиска способов их лечения. Особый интерес представляет следование транскриптома клеток нервной тхани в норме и при таких патологических здейсгвиях как нарушение мозгового кровообращения - церебральная ишемия. Среди иемических заболеваний мозга наибольшую значимость представляет инсульт - следствие ютоянного или временного снижения мозгового кровотока, в большинстве случаев вызванного юпозией мозговых артерий тромбом или эмболом. Профилактика и терапия этого заболевания -та из самых актуальных проблем современной медицины. В число препаратов, обладающих ;йропротекгивными свойствами, входит первый отечественный ноотропный препарат семакс, пешно используемый для лечения различных нейродегенеративных заболеваний, в том числе культа. Семакс представляет собой синтетический пептид Met-Glu-His-Phe-Pro-GIy-Pro, »-конец iToporo содержит фрагмент АКТЦ4-7), С-консц - пептид Pro-Gly-Pro (PGP). Исследование :йствия семакса в системе ш vitro на клеточных культурах свидетельствует о его ;йропротекгивных свойствах. В физиологических экспериментах также показано, что семакс 1ижает выраженность неврологического дефицита и увеличивает выживаемость животных с лсмическим инсультом (Мясоедов и соавг., 1999). Гипотеза о том, что семакс оказывает влияние i экспрессию нейротрофинов и их рецепторов, являющихся важнейшими регуляторами ункционирования и выживания нейронов, подтверждена на интакгных животных: применение ¡макса способствует повышению экспрессии нейротрофина Bdnf и его рецептора TrkB - на эовне белка и мРИК (Dolotov et al., 2006), нейротрофина Ngf- на уровне мРНК (Agapova et а!., 307). Действительно, система нейротрофинов и их рецепторов определяет альтернативный выбор между генетическими программами апоптоза и выживания, а также играет роль в репаративных процессах, и, следовательно, представляет собой потенциальный механизим нейропротекции при ишемии (Kokaia et al., 1995; Lee et al., 1998; Iadecola, 1999; Li et al., 1999; Lipton, 1999; Pitts, Miller, 2000; Lu et al., 2003). В связи с этим представляется необходимым исследовать влияние семакса на экспрессию нейротрофинов и их рецепторов в условиях церебральной ишемии.

Исследования деградации семакса в плазме крови и мозге у крыс показали, что в живом организме семакс подвергается быстрой ферментативной деградации с образованием смеси пептидных дериватов, в которой уже через 1 час после введения семакса преобладает PGP (Шевченко и соавт., 2006). Кроме того, недавно были выявлены самостоятельные эффекты PGP. Рассмотрение этих сведений ставит актуальный вопрос о вкладе PGP в терапевтические эффекты семакса.

Принимая во внимание ноотропные свойства семакса, представляется интересным исследовагъ его действие на экспрессию гена Egrl, кодирующего транскрипционный фактор, запускающий различные генные программы в нервной ткани, лежащие в основе обучения, формирования и распознавания долговременной памяти, синаптической пластичности (Wisden et al„ 1990; Nikolaev et al., 1992; Okuno, Miyashita, 1996; Tischmeyer, Grimm, 1999; Jones et al., 2001; Bozon et al., 2003). Кроме того, экспрессию гена Egrl также связывают с процессами воспаления, апоптоза и пролиферации, имеющими место при ишемическом повреждении нервной ткани (Lee et al., 2004).

Еще один ген, обнаруженный и охарактеризованный в нашем Отделе, - SMS1 - кодирует фермент сфингомиелинсинтетазу 1. Будучи ключевым компонентом сфингомиелинового цикла, сфингомиелинсинтетаза принимает участие в регулировании баланса между процессами клеточной гибели и выживания посредством регуляции образования про-апошотического медиатора церамида и синтеза анти-апопготического медиатора диацилглицерина (ДАТ) (Hannun, 1994; Geilen et al., 1997; Alessenko, 2000). Несмотря на то, что воздействие ишемии и оксидангного стресса на экспрессию компонентов сфингомиелинового цикла достаточно хорошо изучено, исследовать экспрессию сфингомиелинсинтетазы в условиях ишемии до сих пор не представлялось возможным.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение влияния нейропротективного препарата семакс и его С-концевого фрагмента PGP на экспрессию мРНК генов нейротрофинов и других факторов роста, их рецепторов, а также генов Egrl и SMS1 в различных участках мозга крыс в условиях экспериментальной модели фокальной ишемии мозга крыс. Для этого были поставлены следующие задачи:

• Выполнить гистологическое исследование мозга крыс, подвергнутых необратимой окклюзией левой среднемозговой артерии; локализовать очаг ишемического повреждения.

• Определить относительное содержание мРНК генов, кодирующих нейротрофины и другие факторы роста, их рецепторы, а также генов Egrl и SMS1 в различных участках мозга животных с церебральной ишемией.

• Определить относительное содержание мРНК генов, кодирующих нейротрофины и другие факторы роста, их рецепторы, а также генов Egrl и SMS1 в структурах мозга экспериментальных животных, получавших семакс или PGP.

• Провести сравнительный анализ-действия семахсаи PGPjia экспрессию, исследуемых генов в мозге крыс.

Научная новизна практическая значимость работы

Результаты исследования воздействия семакса и PGP на экспрессию нейротрофинов, факторов роста и их рецегггоров представляют научно-практический интерес. Впервые исследовано воздействие семакса и PGP на экспрессию генов нейротрофинов, факторов роста и их рецепторов, а также генов Egrl и SMS1 в условиях экспериментальнй фокальной ишемии мозга. Впервые показано активирующее действие семакса и PGP на представленность мРНК генов, кодирующих нейротрофины и их рецепторы, в ишемической коре мозга крыс, свидетельствующее о нейропротективных свойствах обоих пептидов. Действие семакса на транскрипцию генов

нейротрофинов и их рецепторов проявляется преимущественно в участке лобной коры, включающем очаг повреждения, тогда как действие PGP не является селективным и наблюдается в мозге здоровых, ложнооперированных и ишемизированных животных. Выявленное активирующее воздействие семакса па транскрипцию генов нейротрофинов и их рецепторов в течение суток после ишемической атаки, обеспечивающих нсйропротекцию и выживание нервной ткани, имеет существенное значение при фармакотерапии инсультов.

На фоне применения семакса и PGP в лобно-теменной доле коры мозга крыс, включающей очаг ишемии, впервые обнаружено изменение экспрессии мРНК большого числа генов факторов роста и их рецепторов. Функции генов, изменивших свою экспрессию при введении семакса, свидетельствует о его нейропротективном и ноотрошюм действии, а также указывают на анксиолитические свойства препарата и его роль в формировании сосудов. Выявленная в работе активация экспрессии многих генов факторов роста и их рецепторов при введении PGP, иллюстрирует нейропротективное действие этого пептида. Обнаруженное впервые активирующее воздействие PGP на транскрипцию гена Egrl свидетельствует о ноотропных свойствах этого пептида. Эти свойства PGP открывают новые перспективы в использовании пептида для терапии заболеваний нервной системы.

Новыми являются данные об изменении транскрипции генов нейротрофинов и их рецепторов не только в ищемизировашой коре, но также в коре контралатерального полушария и подкорковых структурах обоих полушарий мозга животных, подвергнутых фокальной ишемии. Эги результаты представляют большой интерес с позиций определения вклада данных генов в осуществление процессов, протекающих в головном мозге, в условиях повреждения. Впервые выявлены изменения транскрипции гена SMS1 в мозге животных в условиях экспериментальной ишемии, что имеет большое значение для дальнейшего изучения механизмов регуляции процессов апоптоза клетки в условиях эксперимиггальной ишемии.

Установлено, что эффекты семакса и PGP на транскрипцию генов нейротрофинов и их рецепторов совпадают лишь частично, а на экспрессию генов SMSI и Egrl существенно различаются. Сделано предположение, что одним из механизмов нейропротективного действия семакса и PGP в мозге в условиях ишемии является их воздействие на экспрессию генов системы факторов роста и их рецепторов, обеспечивающих функционирование клеток нервной ткани и сосудов. Следует подчеркнуть, что результаты изучения воздействия семакса и PGP на экспрессию исследованных генов имеют особую значимость для разработки новых терапевтических подходов. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 4 статьи и 16 материалов симпозиумов и конференций. Апробация диссертации

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на конференциях Американского Общества Генетики Человека (ASHG) 2003-2007 г.г., Европейского Общества Генетики человека (ESHG) 2005-2008 г.г., па Российском симпозиуме «Белки и пептиды» в 2007 и 2009 г., съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов в 2008 г., изложены на конкурсе работ на стипендию фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, ИМГ РАН, 2007 г). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании

Ученого совета ИМГ РАН 21 сентября 2009 г. и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» 7 октября 2009 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает введение; обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение; выводы; библиографический указатель. Список литературы состоит из 264-х источников, среди которых 29 источников отечественной и 235 источников зарубежной литературы. Материалы диссертации изложены на 129-ти страницах машинописного текста, содержат 7 таблиц и 19 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследования

Исследования выполнены на самцах крыс линии Вистар 2-х месячного возраста, массой 250 -350 г, содержавшихся в виварии при естественном освещении и имевших свободный доступ к пище и воде. Все крысы (п=142) были разделены на 10 групп: 1-я - здоровые животные, которым вводили физ. р-р (п=15); 2-я - здоровые животные, получавшие семакс (п=15); 3-я - здоровые животные, которым вводили PGP (п=14); 4-я- ложнооперированные крысы, которым вводили физ. р-р (п=15); 5-я - ложнооперированные крысы, получавшие семакс (п=15); 6-я -ложнооперированные крысы, которым вводили PGP (п=15); 7-я - животные с окклюзией левой средней мозговой артерии, которым вводили физ. р-р (п=17); 8-я - животные с окклюзией левой средней мозговой артерии, получавшие семакс (п=15); 9-я - животные с окклюзией левой средней мозговой артерии, получавшие PGP (п=15); 10-я - животные с окклюзией левой средней мозговой артерии для гистологического исследования (п=6). Экспериментальные группы 1 - 9 были разделены на 3 подгруппы в зависимости от временной точки (3,24 и 72 часа) и состояли не менее чем из 4 животных. Экспериментальная группа 10 была разделена на 2 подгруппы (3 и 24 часа после окклюзии). Семакс, PGP или физ. р-р вводили внутрибрюшинно через 15 мин, 1 час, 4, 8,24, 28, 32, 48, 52 и 56 часов. Семакс использовали из расчета 10 мкг/100 г веса крысы; PGP - 3.75 мкг/100 г. Через 3, 24 и 72 часа крыс декапитировали под действием эфирного наркоза. Из мозга крыс выделяли лобно-теменную долю коры и соответствующие ей подкорковые структуры (у крыс с окклюзией брали структуры обоих полушарий мозга) (Рис. 1).

Рисунок 1. Схема участков головного мозгы крыс, в которых исследовали изменение транскрипции после необратимой окклюзии левой средней мозговой артерии. 1С - лобно-теменная доля коры ипсилатерального полушария мозга; СС - лобно-теменная доля коры контралатерального полушария мозга; В -подкорковые структуры ипсилатерального полушария мозга; Св - подкорковые структуры контралатерального полушария мозга.

Относительный уровень мРНК исследованных генов в тканях мозга экспериментальных животных

определяли с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Этот метод позволяет проводить анализ

,ржания исследуемых молекул мРНК в препаратах суммарной РНК, полученных из шогических образцов. В качестве матрицы использовали кДНК, полученные на препаратах шарной РНК, выделенной из коры и подкорковых структур экспериментальных животных, кдый исследуемый препарат кДНК амплифицировали три раза. Внутренним стандартом, юсительно которого можно нормировать продукт исследуемого пула мРНК, являлся ген Gapdh, дарующий глицероальдегид-3-фосфатдегидрогеназу. Как показали исследования экспрессии юв домашнего хозяйства в мозге крыс при окклюзии средней мозговой артерии, ген Gapdh ¡актеризуется наиболее постоянной экспрессией в зоне повреждения и может быть использован качестве внутреннего стандарта при исследовании церебральной ишемии (Medhurst et al., 2000; rrison et al., 2000). Специфичность праймеров, подобранных для анализа экспрессии ¡ледуемых и контрольного генов, оценивали с помощью электрофореграммы продуктов илификации одного из образцов кДНК подкорковых структур мозга крысы в присутствии ггветствующих праймеров. Длина продуктов амплификации во всех случаях соответствовала идаемой. Продукты другой длины не были обнаружены. Статистическую обработку 1ученных данных экспрессии мРНК контрольного и исследуемых генов проводили с помощью ггерия рандомизации (статистически значимые различия при р <0,05) в программе Relative pression Software Tool (REST©) (Pfaffl et al., 2001, 2002). Эта программа позволяет определять неверность различий между группами по уровню экспрессии исследуемого гена, эмализованного к гену внутреннего контроля. Статистическую обработку данных по экспрессии юв факторов роста, полученных на коммерческой панели к генам факторов роста и их кпторов, выполняли с помощью прилагающегося к панели программного обеспечения iperarray, США). Изменение уровня экспрессии мРНК исследуемых генов оценивали юсительно экспрессии мРНК генов домашнего хозяйства (Rplpl, Rpll3a, Ldha, Actb), тользованных в качестве внутреннего контроля.

отологическое исследование срезов мозга крыс с фокальной церебральной ишемией

Модели церебральной ишемии мелких лабораторных животных являются ;периментальной основой для изучения механизмов, приводящих к гибели нейронов, процессов, кащих в основе восстановления неврологических функций, а также для тестирования гропротекторных препаратов. Наилучшим образом события, происходящие при ишемическом сульте у человека, отражает модель фокальной ишемии мозга экспериментальных животных ■сев, Скворцова, 2001). Фокальную ишемию мозга у экспериментальных животных вызывали с чощыо необратимой элекгрокоагуляционной окклюзии дистального участка (выше места ¡етвления a. lenticulostriatis) левой средней мозговой артерии (Povarova et al., 2004). Операцию эводили под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг, в/б). Животных декапитировали под зкозом через 3 часа (п=3) и 24 часа (п=3) после окклюзии. Извлеченный из черепной коробки зг крыс фиксировали в 4% р-ре формалина, затем отмывали и хранили в 70% спирте при +4°С. шотненный мозг разрезали на блоки, которые обезвоживали и заливали парафином, жротомные срезы мозга толщиной 6-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, стотопографическое картирование зон повреждений и точное определение уровней коронарных :зов производилось по стереотаксическому атласу головного мозга крыс (Paxinos, Watson, 1997). и картировании нами выявлен воспроизводимый инфаркт постоянного размера,

локализованный в лобно-теменной доле коры левого полушария мозга крыс с окклюзией. 3: формирующегося инфаркта неправильной трапецевидной формы, в среднем, определялась 1 1 уровне -2,5 - +2,0 мм от брегмы. Максимальная площадь инфаркта детектировалась на уровне 1,3 - +0,7 мм от брегмы и в этой области затрагивала все слои коры до внешней капсулы (Рис. 2 Б). По сравнению с нормальной картиной организации ткани мозга крыс (Рис. 2 В) в зо ишемического повреждения выявлялись участки различной степени поражения уже через 3 ча после окклюзии левой средней мозговой артерии (Рис. 2 Г). В зоне повреждения нервные клет по патоморфологическим критериям находились в состоянии ишемического шока с характерны! уплотнениями ядер и сморщиванием перикариона (Рис. 2 Г, Д). В зоне глубокой ишемии п,

большем увеличении определялись выраженные изменения нейронов, отек нейропш.....,

коллапсирование клеток, кариопикноз (Рис. 2 Д). В этом участке коры мозга нормальные нейрог: отсутствовали. На рис. 2 Е четко видна граница зоны ишемии. Через 24 часа после окклюзии зо инфаркта (некротическое ядро) окружена так называемой пенумброй, зоной ограниченно: функционирования нейронов, поврежденных ишемией (Рис. 2 Ж).

.¿'Я Ь ра \ Г 1—!—111111111 р ... 80мкм /' , • ' Г 1 » .. ' • норма ' пврумШ некроз '•-".' •,•*"' ' . зННЯВяЕ

\ 1 1 > 1 1 1 1 \ 1 \ 1 Б \ ,.4 , т -« у _ < • ' ♦ 1 ' ' * * Г 8 ' * " \ » ^ I . 15мкм Л д- . , . — • : >' ' » < • 1 » 3 ' ' -♦

•« * * *» 2 *4 ч ' . % а V- 1 . (Л - •V Э • * в" ЛЙ"', к» л. / * 1 - 4 * V* \ Ц V - - • •,« • V . V • А АЧ '/ С V • • 1 V V» . # А * -

Рисунок 2. Микрофотографии срезов мозга крыс спустя 3 часа (А-Д) и сутки (Е-И) после необратимой окклюэ средней мозговой артерии. Окрашивание гематоксилин-эозином. А- Коронарный срез мозга 0,5 мм от брега Пунктирная линия отграничивает зону повреждения, затрагивающую все слои коры. Б - Область, выделенг: сплошной линией (А), при большем увеличении. В - Нормальные нейроны. Г, Д - В зоне повреждения определяю^ сморщенные нейроны с эозинофильной цитоплазмой и пикнотическими ядрами. Отек нейропиля в зоне глубокс повреждения. Большинство некротических нейронов, нормальных нейронов нет. Е - Граница нормальной ткани зоны повреждения: интактные нейроны обозначены наконечниками, ишемические нейроны - стрелками. Ж Переходная зона: от нормальной ткани через ишемически измененную пенумбру к некротической ткани. 3, И -Коалулятивный некроз (указан стрелками) и вакуолизация в зоне некроза.

В зоне инфаркта выявлялись коагуляционый некроз клеток, вакуолизация и отек нейропиля, а также выраженная деградация клеток (Рис. 2 3, И). Данные гистологического исследования срезов через 3 и 24 часа после окклюзии соответствуют картине ишемического повреждения мозга, описанной в литературе (Garcia et а!., 1993). Таким образом, данная модель фокальной ишемии мозга крыс может быть использована для исследования церебральной ишемии и оценки эффективности лекарственных препаратов.

Анализ экспрессии генов иейротрофппов и их рецепторов в мозге крыс с ишемией

На сегодияшиий день накоплены многочисленные свидетельства, поддерживающие гипотезу о том, что пейротрофины составляют основу нейропротскторпого механизма при церебральной ишемии (Wu, 2005; Zhang et al., 2008). Нейропротекторное действие нейрогрофинов было подтверждено на моделях фокальной церебральной ишемии у крыс (Schabitz et al., 1997; Ferrer et al., 2001). В условиях использованной нами модели фокальной ишемии мозга у животных с окклюзией также обнаружено изменение транскрипции генов нейротрофинов и их рецепторов. В табл. I представлены изменения экспрессии генов нейротрофинов и их рецепторов, наблюдаемые в коре и подкорковых структурах обоих полушарий мозга крыс с окклюзией по сравнению с ложнооперированными животными.

Таблица 1. Анализ изменения экспрессии мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов в мозге крыс при ишемии. Цифры отражают, во сколько раз отличается относительный уровень транскриптор указанного гена в структурах мозга животных с окклюзией средней мозговой артерии от уровня этого гена в андлогичных структурах мозга ложнооперированных крыс. Стрелками указан характер изменения экспрессии генов. Представлены только статистически достоверные значения (р < 0,05).

Пнсилатеральное полушарие мозга

кара, включающая очаг повреждения

время/ ген Bdnf Nt-3 Ngf TrkB TrkC TrkA p75

3h f 1,21 ±0,1 J 2,1 ±0,13

24h 13,5 ±0.89 11,64 ±0,09 11,6 ±0,1 f 2,15 ±0,47

72h t 2,75 ± 0,56

подкорковые структуры

24h

72h J 1,55 ±0,12 П,51 ±0,17 i 1.77 ± 0,11 11,22 ±0,08 J 1,22 ± 0,07 i 1,87 ±0,06

Контралатеральное полушарие мозга

кора

время/ ген Bdnf Nt-3 Ngf TrkB TrkC TrkA p75

3h 12,41 ±0,05 11,63 ±0,27 11,28 ±0,12 11,23 ±0,06

24h t 2,6 ± 0,79

72h T 1,83 ± 0,34 11,3240,13 i 1,95 ±0,1

подкорковые структуры

3h i 2,49 ±0,05

24h

72h i 2,01 ± 0,09 Г 1,37±0,13 1 1,S2±0,11 11,38 ±0,18 11,86 ±0,06

В ипсилатералыюй лобно-теменной доле коры, включающей согласно проведенному гистологическому исследованию очаг повреждения, мы наблюдали повышение транскрипции

генов нейротрофинов: Ngf - через 3 часа, Bdñf - через 24 часа, Nt-3 - через 72 часа. Зафиксированное нами повышение транскрипции Bdnf в ишемизированной коре мозга животных с ишемией, включающей некротическое «ядро» и периинфактрную зону, соответствует данным, полученным в других работах (Ferrer et al, 2001; Pera et al, 2005; Kokaia et al, 1995; Kim et al, 2005). При этом иммуногистохимический анализ, выполненный Ferrer и соавт, показал, что повышение экспрессии Bdnf наблюдается преимущественно в периинфаркгной зоне, тогда как в «ядре» ишемии уровень экспрессии Bdnf чрезвычайно низок (Ferrer et al, 2001). Как и в работах Cui и Lindvall в нашем исследовании также обнаружено раннее (уже через 3 часа) повышение уровня транскрипции Ngf в ишемической коре мозга крыс с ишемией (Cui et al, 1999; Lindvall et al, 1992). Далее транскрипция гена Ngf возвращается на прежний уровень.

Согласно литературным данным, в моделях экспериментальной фокальной ишемии мозга, схожих с нашей, обычно не формируются дополнительные очаги инфаркта (Linnik et al, 1995). Гистологическое исследование использованной нами модели фокальной церебральной ишемии также не выявило дополнительных очагов ишемии в контралатеральном полушарии мозга крыс с окклюзией. Значительное падение транскрипции Bdnf, наблюдаемое в контралатеральном полушарии мозга крыс через 3 часа после окклюзии, может быть связано со стрессом, обусловленным хирургическим вмешательством, или с явлением распространяющейся деполяризации, затрагивающей нейроны и глию, и возникающей в зоне пенумбры или других пограничных зонах при ишемии (Ивашкин, Драпкина, 2001; Гусев, Скворцова, 2002). Такая деполяризация является аналогом экспериментальной "cortical spreading depression" (CSD), представляющей собой деполяризацию нейронов и астроцитов, сопровождающуюся нарушением ионного гомеостаза. При инсульте явление распространяющейся деполяризации способствует расширению зоны повреждения (Dohmen et al, 2008; Petzold et al, 2008). Как и в исследовании Lee et al. в условиях нашего эксперимента также наблюдается повышение транскрипции Ngf в коре контралатерачьного полушария мозга крыс через 3 часа после окклюзии (Lee et al, 1998). Кроме того, у этих крыс транскрипция Nt-3 также была повышена.

Поскольку действие нейротрофинов реализуется через взаимодействие с рецепторами, мы исследовали изменение транскрипции генов рецепторов нейротрофинов в условиях нашего эксперимента В некоторых экспериментах при церебральной ишемии наблюдали немедленное повышение экспрессии ТгкВ в тканях ипсилатерального и контралатерального полушарий мозга (Majda et al, 2001; Kokaia et al, 1995), однако в условиях использованной нами модели ишемии изменения транскрипции ТгкВ в мозге крыс через 3 часа после окклюзии не были выявлены. Более того, через сутки транскрипция ТгкВ и ТгкС была снижена в ишемической коре мозга животных с окклюзией, а через 72 часа - в подкорковых структурах ипсилатерального полушария таких крыс. В условиях аналогичного эксперимента Lee и соавт. показали, что в ишемической коре на фоне падения экспрессии NGF была зарегистрирована индукция экспрессии TrkA (Lee et al, 1998). В нашем исследовании профили транскрипции Ngf и ТгкА имеют обраггную направленность: повышение уровня мРНК Ngf сопровождается снижением уровня мРНК ТгкА. Таким образом, в условиях использованной нами модели повышение транскрипции нейротрофинов в ишемической коре мозга сопровождалось снижением транскрипции соответствующих рецепторов, наблюдаемое в эту же (Bdnf и ТгкВ, Ngf и ТгкА) или более раннюю (Nt-3 и ТгкС) временную точку. Взаимодействуя с высокоафинными Trk рецепторами, нейротрофины регулируют выживание

клеток, поэтому коэкспрессия иейротрофинов и их рецепторов считается потенциальным механизмом нейропротекции при ишемии (Lee et al., 1998; Li et al., 1999; Pitts, Miller, 2000). Действительно, индукция экспрессии рецепторов нейротрофшкж может обусловливать выживание нейронов при ишемическом повреждении, играя основную роль в регуляции чувствительности клеток к нейротрофинам. Согласно этому представлению в условиях использованной нами модели, несмотря на повышение содержания мРНК нсйротрофинов в ишемической коре мозга, клсгки пенумбры ввиду сниженной транскрипции рецепторов нсйротрофинов в этой зоне, по-Еидимому, не имеют защиты, достаточной для выживания.

Действие семакса и PGP на экспрессию генов иейротрофинов и их рецепторов в коре и подкорковых структурах мозга здоровых крыс

В условиях нашего эксперимента мы не наблюдали воздействия семакса на экспрессию генов иейротрофинов Bdnf и Ngf и всех исследованных рецепторов нсйротрофинов в коре мозга здоровых крыс. Однако у таких животных через сутки было выявлено снижение транскрипции гена Nt-З (1,45 ± 0,08). В работе Долотова и соавт. воздействие семакса на транскрипцию гена Bdnf в коре мозга интакгных крыс также не было выявлено (Dolotov et al., 2006). В то же время, Агаповой и соавт. описано снижение транскрипции гена Ngf в коре мозга здоровых животных (Agapova et al. 2007). В подкорковых структурах мозга здоровых крыс мы обнаружили индукцию транскрипции гена ТгкВ (1,49 ± 0,22) под воздействием семакса, что согласуется с исследованием Долотова и соавт., выявивших повышение транскрипции гена ТгкВ в гнппокампе интакшых животных (Dolotov et al., 2006). В коре здоровых животных, получавших PGP, через 3 часа наблюдалось снижение содержания мРНК гена Bdnf (2,07 ± 0,12). В то же время, PGP стимулировал транскрипцию генов рецепторов иейротрофинов в коре (ТгкВ -1,92 ± 0,41; ТгкЛ -2,11 ± 0,47) и в подкорковых структурах (ТгкВ - 1,84 ± 0,27) мозга этих крыс. Следует отметить, что при введении семакса и PGP здоровым крысам в подкорковых структурах мозга выявлен один и тот же эффект - повышение транскрипции гена ТгкВ. В коре мозга воздействие обоих пептидов па транскрипцию генов иейротрофинов тоже имеет схожие черты: снижение транскрипции генов иейротрофинов Nt-З под действием семакса, a Bdnf под действием PGP. Тем не менее, по сравнению с семаксом, который изменяет содержание мРНК генов Nt-З и ТгкВ, PGP воздействует на транскрипцию большего числа генов (Bdnf, Nt-З, ТгкВ, ТгкЛ).

Действие семакса и PGP на экспрессию генов иейротрофинов и их рецепторов в коре и подкорковых структурах мозга ложнооперированных крыс

Оперативное вмешательство и воздействие наркоза сами по ссбс являются серьезным стрессом для организма и, в частности, для головного мозга, и сопровождается изменением экспрессии исследованных нами генов (по сравнению со здоровыми животными): снижение относительного уровня мРНК Bdnf (2,01 ± 0,09) в лобно-теменной доле коры обоих полушарий через 3 часа после операции; повышение содержания транскриптов Bdnf( 1,65 ± 0,28) и Ngf (1,94 ± 0,39) в подкорковых структурах мозга на третьи сутки после операции.

Введите семакса ложнооперированным крысам повысило уровень транскрипции гена Bdnf через сутки после операции (Табл. 2). Следует отметить, что в мозге ложнооперированных животных семакс воздействовал на большее число исследованных генов по сравнению с его эффектами в мозге здоровых крыс. Так, у ложнооперированных крыс через 3 часа применения

семакса транскрипция генов рецепторов нейротрофинов ТгкВ и ТгкА была снижена в коре мозга, а в подкорковых структурах мозга, наоборот, повышена для генов ТгкВ и ТгкС (Табл. 2). Действие семакса наблюдалось также и в более поздние временные точки. На третьи сутки после ложной операции семакс снижал транскрипцию генов Ngf, ТгкВ и р75 в подкорковых структурах мозга, при этом содержание мРНК гена Nt-З было повышено.

Таблица 2. Анализ действия семакса и PGP на экспрессию мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов в мозге ложнооперированных крыс. Цифры отражают, во сколько раз отличается относительный уровень 1ранскриптов указанного гена в структурах мозга ложнооперированных животных, получавших семакс или PGP от уровня этого гена в аналогичных структурах мозга ложнооперированных крыс, получавших физ. р-р. Стрелками указан характер изменения экспрессии генов. Представлены только статистически достоверные значения (р < 0,05).

Семакс Кора

время / ген Bdnf Nt-3 Ngf TrkB TrkC TrkA p75

3h 11,48 ±0,11 i 1,6 ±0,15

24h t 2,32 ±0,51

72h

подкорковые структуры

3h t 2,36 ±0,39 113 ±0,22

24h 72h T 1,49 ±0,14 J 2,03 ±0.1 11,23 ±0,06 i 1.55 ± 0.06

PGP Кора

время /ген Bdnf Nt-3 Ngf TrkB TrkC TrkA p75

3h 24h t 2,32 ±0,51 i 1,31 ±0,09 i 1,54± 0.12 t 2,6 ±0,73

72h J 1,9 ±0,11 T 1,91 ± 0,32 | 2,37 ± 0,13 t 1,4 ±0,14 J 1,55 ±0,13

подкорковые структуры

3h 24h 72h J 1,99 ±0,26 J 1,55 ±0,14 J 1,29 ±0,09

PGP, в отличие от семакса, воздействовал на транскрипцию генов нейротрофинов и их рецепторов преимущественно в коре ложнооперированных крыс (Табл. 2). При введении PGP в коре мозга ложнооперированных животных наблюдали пониженное содержание мРНК Ngf уже через 3 часа после операции. Через сутки после операции PGP, также как и семакс, стимулировал транскрипцию гена Bdnf в коре мозга таких крыс. В этой структуре мозга PGP также ■воздействовал на транскрипцию генов, кодирующих рецепторы нейротрофинов: повышал содержание мРНК ТгкВ, ТгкА и, наоборот, снижал содержание мРНК ТгкС и р75. На третьи сутки после ложной операции PGP регулировал транскрипцию генов нейротрофинов в коре мозга следующим образом: содержание мРНК Bdnf и Ngf было снижено, а для гена Nt-З - повышено. Действие PGP в подкорковых структурах мозга ложнооперированных крыс практически совпадает с некоторыми эффектами, выявленными в коре мозга: транскрипция генов Ngf и р75 была снижена, а для гена Nt-З - повышена.

Принимая во внимание эффекты семакса и PGP в мозге здоровых животных, можно отметить, что в условиях стресса, вызванного оперативным вмешательством, оба пептида

воздействуют на транскрипцию большего числа исследованных генов в течение более продолжительного времени (Табл. 2). Кроме того, действие семакса и PGP на транскрипцию исследованных генов в мозге ложнооперированных животных можно охарактеризовать как модулирующее.

Действие семакса и PGP на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов в мозге крыс с ишемией

В лобно-теменной доле коры мозга животных с ишемией, включающей очаг повреждения, семакс стимулировал транскрипцию исследованных генов: Bdnf, ТгкА и ТгкС - через 3 часа, Nt-З и Ngf- через сутки после окклюзии (Табл. 3).

Таблица 3. Анализ действия семакса па экспрессию mI'IIK генов нейротрофинов и их рецепторов а мозге крыс при ишемии. Цифры отражают, во сколько раз отличается относительный уровень транскриптов указанного гена в структурах мозга животных с окклюзией средней мозговой артерии, получавших семакс, от уровня этого гена в аналогичных структурах мозга таких крыс, получавших физ. р-р. Стрелками указан характер изменения экспрессии генов. Представлены только статистически достоверные значения (р < 0,05).

Ипсилатеральиое полушарие мозга

кора, включающая очаг повреждения

ВГеи ««Г Ngf TrkB TrkC TrkA p75

3h Т 2,8±rt,5S 24h Т 1.44 ±0,25 72h 1 1,89 ±0,1 11,53 ±0,35 f 2,45 ±0,81 t 1,75 ±0,26 t 2,46 ±0,67

подкорковые структуры

3h 24h 72h 11,46 ±0,21 1 1,4 ± 0,1

Контралатеральное полушарие мозга

кора

ВРемя Bdnf Nt-3 1 ген Ngf TrkB TrkC TrkA p75

3h 24h 72h 11,73 ±0,07 11,76 ±0,25 11,59 ±0,07

подкорковые структуры

3(1 24h 72h 11,13 ±0,08 t 1,34 ±0,13 11,52 ±0,16

На третьи сутки после окклюзии транскрипция гена в ишемической коре оставалась повышенной, а содержание мРНК гена N1-3 снизилось. Таким образом, в ишемической коре мозга семакс способствовал более ранней активации транскрипции генов Вс]п/, N1-3 и ТгкА, а также предотвратил падение транскрипции гена ТгкС. Следовательно, нейропротекторное действие семакса включает в себя раннюю активацию транскрипции не только нейротрофинов, но и их рецепторов. Можно предположить, что именно ранняя активация коэкспрессии нейротрофинов и их рецепторов вносит свой вклад в успех неотложной терапии инсульта с помощью семакса , описанный Гусевым и соавт. (Гусев 2000,2002).

В остальных исследованных структурах мозга животных с ишемией действие семакса не всегда является активирующим: его можно охарактеризовать как модулирующее (Табл. 3). Так, через сутки после окклюзии семакс способствовал повышению транскрипции генов, кодирующих рецепторы нейротрофинов, в контралатеральном полушарии мозга крыс: ТгкС- в коре, ТгкВ и р75 - в подкорковых структурах. На третьи сутки применения семакса в подкорковых структурах обоих полушарий мозга животных с окклюзией содержание мРНК гена Добыло повышено.

Таблица 4. Анализ действия PGP на экспрессию мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов в мозге крыс при ишемии. Цифры отражают, во сколько раз отличается относительный уровень транскриктов указанного гена в структурах мозга животных с окклюзией средней мозговой артерии, получавших семакс, от уровня этого гена в аналогичных структурах мозга таких крыс, получавших физ. р-р. Стрелками указан характер изменения экспрессии генов. Представлены только статистически достоверные значения (р < 0,05).

Ипсилатеральное полушарие мозга

кора, включающая очаг повреждения

время, название Bdnf Nt-3 Ngf TrkB TrkC TrkA p75

ген:

3h t 2,56 ±0,48 t 1,99 ±0,18 11,64 ±0,2

24h 12,88 ±0,65 11,6 ±0,26 11,59 ±0,21 t 2,43 ±0,88 t 2,6 ±0,43

72h J 2,12 ±0,1

подкорковые структуры

3h Т 1.80*0,35 11,56 ±0,17 11,64 ±0,23

24h 4 1,42 ±0,08 11,79 ± 0,23

72h

Контралатералькое полушарие мозга

кора

время название Bdnf Nt-3 Ngf TrkB TrkC TrkA p75

ген:

3h 11Д9 ± 0,07 11,16 ±0,09 t 2,31 ±0,53 т 1,56 ±0Д8

24h t 1,64 ±0.26 t 2,32 ± 0,34 11,58 ±0,14 t 2,49 ±0,44

72h | 1,35 ±0,07 | 1,53 ± 0,06

подкорковые структуры

3h J 1,31 ±0,06 T 2,11 ±0,24

24h

72h 11,22 ±0,08

Снижение содержания мРНК под действием семакса наблюдали через 3 часа в подкорковых структурах ипсилатерального полушария для гена ТгкВ и через трое суток в коре контралатерального полушария для генов Bdnf и ТгкС. В ишемической коре PGP, также как и семакс, оказывал активирующее действие на транскрипцию исследованных генов нейротрофинов и их рецепторов (Табл. 4). Так, транскрипция генов Bdnf, ТгкС была повышена через 3 часа, a Ngf-24 часа после окклюзии. Через сутки после окклюзии PGP стимулировал транскрипцию генов, кодирующих рецепторы нейротрофинов (ТгкВ, ТгкС, TrkA) в ишемической коре мозга таких крыс. Кроме того, в течение первых суток PGP, в отличие от семакса, стимулировал транскрипцию гена р75, кодирующего низкоаффинный рецептор нейротрофинов. На третьи сутки применения PGP в ишемической коре отмечалось снижение транскрипции гена ТгкС. Эффекты PGP в

контралатеральной коре имели схожий характер с действием этого пептида в ишемической коре и проявлялись даже в более ранние сроки: содержание мРНК генов Ngf, ТгкВ, ТгкА, р75 было повышено уже через 3 часа, a Bdnf, Ngf, р75 - через сутки. Также как при введении семакса на фоне применения PGP транскрипция генов Bdnf и ТгкС была снижена в конграпатеральной коре мозга крыс на третьи сутки после окклюзии. В подкорковых структурах обоих полушарий мозга животных с окклюзией эффекты PGP менее выражены и не всегда имеют активирующий характер. При этом все стимулирующие эффекты PGP в подкорковых структурах совпадают с действием этого пептида в ишемической коре: для генов Bdnf, ТгкВ,р75 - в ипсилатеральном полушарии, для гена ТгкС - в контралатеральном полушарии.

Таким образом, действие PGP в мозге крыс с окклюзией имело схожие черты во всех исследованных структурах, однако наибольшее число эффектов, как и в мозге ложнооперированных животных, было отмечено именно в коре. Действие семакса проявляется преимущественно в ишемической коре мозга и, вероятно, носит избирательный характер в зависимости от типа стрессового воздействия (хирургический стресс/ церебральная ишемия). В отличие от семакса, воздействие PGP не является избирательным по отношению к ишемическому очагу и проявляется преимущественно в коре мозга крыс. Тем не менее, также как в случае семакса, число и характер эффектов PGP зависят от исходного состояния экспериментальных животных (интактные / ложнооперированные / с окклюзией).

Действие семакса и PGP на экспрессию генов факторов роста и их рецепторов в условиях фокальной ишемии

С целью исследования воздействия семакса и PGP на экспрессию других генов, активных б мозге, мы проанализировали действие этих пептидов на транскрипцию генов факторов роста и их рецепторов в коре мозга крыс через 3 часа после окклюзии. Изменение относительного уровня экспрессии мРНК генов системы факторов роста и их рецепторов под действием семакса или PGP при ишемии мозга у крыс представлены в табл. 5. На фоне применения семакса через 3 часа после окклюзии средней мозговой артерии в лобно-теменной доле коры мозга крыс, включающей очаг ишемии, обнаружено статистически значимое изменение экспрессии мРНК 16 из 77 исследованных генов. Наиболее выраженная активация экспрессии при применении семакса выявлена для гена Lif кодирующего гликопротеин семейства IL-6. Lif обеспечивает выживание клеток сетчатки глаза и кардиомиоцитов при ишемии, активируя транскрипционный фактор Stat3 и протеинкиназу Akt (Chollandi et al., 2009; Miyamoto et al., 2008). Введение гликопротеина Lif в ишемический мозг способствовало уменьшению размера очага повреждения (Suzaki et al, 2008). Кроме того, роль Lif при церебральной ишемии связывают с регулированием ангиогенеза и неоваскуляризации (Slevin et al., 2008), а также с пролиферацией прогениторных клеток субвентрикулярной зоны (Covey et al., 2007). Введение семакса повысило уровень мРНК гена немедленного реагирования Fos и провоспалительного цитокина ILlb и, напротив, снизило представленность мРНК рецептора ILlOr и гена транскрипционного фактора Stall, активацию которого связывают с гибелью клеток, а его ингибирование при ишемии способствует формированию очага повреждения меньшего объема (Cai et al., 2006). Наши результаты о влиянии семакса на экспрессию гена Fos подтверждают данные, полученные ранее (Умрюхин и соавт., 2001). Кроме того, применение семакса вызвало повышение экспрессии гена транскрипционного

фактора с-тус и генов Nf-1, Npy2r, участвующих в формировании сосудов, (Lee et al, 2003; Napoli et al., 2002; Norton et ah, 1995), а также гена Galrl, кодирующего рецептор пептида галанина, функционирование которого затрагивает различные процессы в ЦНС, в том числе восстановление после ишемии, формирование памяти и обучение (Lang et al., 2007). Также при введении семакса обнаружено снижение уровня мРНК гена Crhrl, кодирующего рецептор кортикотропин-релизинг гормона и связанного с формированием поведенческого ответа типа депрессии, беспокойства, страха (Hauger et al., 2006). Содержание мРНК гена Fits, особенности функционирования которого не достаточно изучены, также было снижено.

Через 3 часа после окклюзии средней мозговой артерии в мозге животных на фоне применения PGP обнаружено статистически значимое изменение экспрессии мРНК 20 из 77 исследованных генов. Введение PGP повысило содержание мРНК генов Nlfl, Tgfa, Tacrl, Nfl, Tgfblil, а для гена Nelil - снизило. В мозге животных, получавших PGP, как и у крыс, получавших семакс, обнаружено повышение экспрессии мРНК генов l.if Vgf, Gfral, c-myc, Nf-1, Galrl, а также снижение транскрипции гена Crhrl. Наряду с этим POP повышает экспрессию мРНК других генов, кодирующих факторы роста: Fgf2, Cntf Ntf5, Tgfa, Tgfblil.

Таблица 5. Изменение экспрессии мРНК системы генов факторов роста и их рецепторов в коре мозга крыс, включающей очаг ишемии, через 3 часа после окклюзии средней мозговой артерии при применении семакса или PGP. Числа отражают, во сколько раз уровень мРНК данного гена в мозговых тканях крыс с ишемией, получавших семакс или PGP, отличается от содержания мРНК этого гена у животных с ишемией, не получавших препараты. Стрелками указан характер изменения экспрессии. Для всех представленных значений р < 0,05. Отсутствие статистически значимого изменешш экспрессии генов у крыс, получавших препараты по сравнению с животными, не получавшими терапию, обозначено прочерком

Название гена семакс PGP

Ш, фактор, илгибирующий лейкоз t 3.06 t 1.69

Galrl, рецептор 1 галанина Î 2.40 t 2.72

Vgf, индуцибельный ф-р роста нервов t 1.45 t 1.60

Gfral, р-р альфа 1 семейства нейротроф. ф-ра, выделенного из культуры глиальных клеток t 1.40 t 1.45

Pifl, нейрофиброматоз 1 t 1-23 t 134

С-тус, гомолог вирусного онкогена мпелолейкоза птиц t 1.21 î 1.28

Crhrl, р-р 1 кортикотропин-релизинг-гормона 1 1.66 1 1.45

Fos, гомолог вирусного онкогена саркомы мыши T 1.70 -

Hi Ь, интерлейкин 1 бета r 1.43 -

Npy2r, рецептор Y2 нейролептида Y î 1.39 -

ШОга, р-р альфа интерлейкина 10 ' 1 1.68

Tgfbl, трансформирующий ф-р роста бета 1 11.42 -

Fus, ф-р, выделенный из лштосаркомы чел-ка 1 1.36 -

Stall, фактор активации транскрипции и передачи сигналов 1 1 1.33 ■ -

Frs3, субстрат р-ра ф-ра роста фибробластов Ц.15

Gmfg, фактор созревания глии гамма 11.61 11.13

Fgf2, фактор роста фибробластов 2 - î 1.76

Hctrl, р-р 1 гипокретина(орексина) | 1.66

Tacrl, рецептор 1 тачихинина - T 1.58

NtfS, нейротрофил 5 - T 1.56

Ptger2, р-р 2 простагландина Е, подтип ЕР2 - î 1.52

Cntfr, р-р цилиарного нейротроф. ф-ра -- T 1.21

Tgfa, трансформирующий фактор роста альфа - T 1.20

Crh, кортикотропин-релизинг-гормон (кортиколиберин) - T 1.18

Tgfblil, трансформирующий ф-р роста бета 1, индуцированный транскрипт 1 - î 1.13

Zfp91, белок цинковых пальцев 91 ■■ - ÎU1

Stat4, ф-р активации транскрипции и передачи сигналов 4 - 11.75

Ne'.ll, NEL-подобный фактор 1 птиц - 1 1.30

Стоит отметить, что для гена Gmfg, кодирующего фактор созревания глии, выявлено разнонаправленное действие семакса и PGP. Таким образом, PGP, как и семакс, повысил экспрессию факторов роста и их рецепторов в мозге, подвергнутом ишемии. При этом спектр генов, на транскрипцию которых воздействует PGP, шире по сравнению с семаксом.

При ишемии в лобно-теменной доле коры мозга, включающей очаг повреждения, семакс и PGP воздействуют на представленность мРНК факторов роста и их рецепторов, повышая экспрессию одних и снижая уровень других. При этом спектр генов, изменивших свою экспрессию под действием обоих препаратов, перекрывается лишь частично. Направление изменения экспрессии таких генов совпадает, за исключением гена Gmfg. Наиболее выраженное (в 2 и более раза) изменение экспрессии под действием семакса и PGP выявлено для генов Lif и Galrl, выполняющих нейропротеетивную функцию при ишемии. Разница в спектрах генов исследованной системы, изменивших свою экспрессию под воздействием семакса или PGP, свидетельствует о том, что механизмы их действия на нервную ткань, вероятно, имеют свои особенности. Рассматривая список генов, изменивших свою транскрипцию под влиянием исследованных пептидов, можно предположить два типа мишеней ростовых факторов, на экспрессию которых воздействуют семакс и PGP, - это нервная ткань (нейроны и глиальные клетки) и клетки сосудистой стенки. Один из механизмов нейропротекторного действия семакса и PGP при ишемии, возможно, связан с их воздействием на экспрессию генов системы факторов роста и их рецепторов, обеспечивающих функционирование клеток нервной ткани и сосудов.

Анализ экспрессии гена Egrl в мозге крыс под действием семакса и PGP

Еще один исследованный ген - Egrl (NGFI-A). Этот ген кодирует транскрипционный фактор, который обеспечивает экспрессию генов-мишеней, вовлеченных в процессы обучения и формирования памяти, а также участвующих в нейропротекции (Van et al., 1999, 2006; Knapska, Kaczmarek, 2004). Ген Egrl относят к генам немедленного реагирования, однако пик экспрессии мРНК Egrl на модели фокальной ишемии мозга крыс наблюдается через сутки после окклюзии средней мозговой артерии (Honkaniemi, Sharp, 1997; Yi et al., 2007). Такой характер экспрессии Egrl возможно связан с так называемым явлением распространяющейся депрессии в коре мозга и является маркером отсроченной гибели нейронов, происходящей по механизму апоптоза (Honkaniemi, Sharp, 1997).

Как и в исследованиях других авторов (Lu et al., 2003; Rybnikova et al., 2005), в условиях нашей модели фокальной ишемии мозга содержание мРНК Egrl в коре обоих полушарий было повышено через сутки после окклюзии (Табл. 6А). При этом через 3 часа после окклюзии изменения транскрипции гена Egrl в очаге ишемии не зафиксировано. Интересно, что через 3 часа после окклюзии транскрипция гена Egrl в контрапатеральном полушарии мозга была существенно снижена. PGP действовал на транскрипцию гена Egrl в коре мозга всех исследованных групп животных: здоровых, ложнооперированных и крыс с окклюзией (Табл. 6В). Кроме того, у животных с окклюзией PGP также изменял транскрипцию гена Egrl в подкорковых структурах мозга. Необходимо отметить, что влияние пептида во всех случаях было активирующим, за одним исключением: на третьи сутки транскрипция гена Egrl в ишемической коре была снижена. Можно предположить, что наблюдаемая нами активация экспрессии гена Egrl в мозге исследованных групп животных под действием PGP, связана с ролью транскрипционного фактора Egrl в процессах обучения, формирования памяти и нейропротекции.

Таблица 6. Анализ экспрессии мРНК гена Egrl в мозге крыс при ишемии под действием семакса или PGP. Числа отражают, во сколько раз отличается относительный уровень транскриптов указанного гена А) в структурах мозга животных с окклюзией средней мозговой артерии от уровня этого гена в аналогичных структурах мозга ложнооперированных крыс; Б) в структурах мозга животных с окклюзией средней мозговой артерии, получавших семакс, от уровня этого гена в аналогичных структурах мозга таких крыс, получавших физ. р-р; В) в структурах мозга животных с окклюзией средней мозговой артерии, получавших PGP, от уровня этого гена в аналогичных структурах мозга таких крыс, получавших физ. р-р. Стрелками указан характер изменения экспрессии генов. Представлены только статистически достоверные значения (р <0,05).

А время группа ипснлатсральное полушарие контралатеральное полушарие

кора, вкл. очаг повреждения подкорковые стр-ры кора подкорковые стр-ры

3h 13,06 ±0,05 12,66 ±0,06

24h 7 2,79 ±0,63 J 2,8 ±0,68

72h 11.52 ±0,12 11,56 ±0,12

Б семакс здоровые л/о ишемия

ипыпатеральное полушарие контралатеральное полушарие

время группа кора, вкл. очаг повреждения подкорковые стр-ры кора подкорковые стр-ры

24h Г 1,77 ±0,31 J. 1,66 ± 0,11 Т 1,57 ±0,18

72h 11,69 ±0,41 11,56 ± 0.09

В PGP здоровые л/о Ишемия

время группа кора, вкл. очаг повреждения подкорковые стр-ры кора подкорковые стр-ры

3h t 2,07 ±0,48

24h Т 1,63 ± 0,29 t 2,6 ±0,58 Т 1,69 ± 0,28 t 2,6 ± 0,48 t 1,99 ±0,23

72h | 2,01 ±0,12 Г 1,26 ± 0,13 ♦ 1,27 ±0,16

Действие семакса на транскрипцию гена Egrl отмечаюсь в коре ложнооперированных животных, где совпадало с таковым PGP, и в ишемической коре крыс с окклюзией, где эффекты семакса и PGP были разнонаправленными (Табл. 6Б, В). Возможно, такое действие семакса на транскрипцию гена Egrl в ишемизированной коре мозга крыс связано с ролью этого гена в апоптозе, пролиферации клеток, а также в формировании воспаления.

Анализ экспрессии гена SMS1 в мозге крыс с ишемией и под действием семакса н PGP

Обнаруженный нами ранее ген SMS! {MOB, ТМЕМ23), кодирующий ключевой компонент сфингомиелинового цикла, фермент сфингомиелинсинтетазу, принимает участие в регулировании баланса между процессами клеточной гибели и выживания посредством регуляции образования про-апоптотического медиатора церамида и синтеза анти-апоптотического медиатора ДАТ. Однако экспрессия гека SMS! при церебральной ишемии до сих пор не была исследована. Kubota и соавт. показали, что фокальная церебральная ишемия стимулирует немедленный (уже через 2 часа) и необратимый (до 96 часов) гидролиз сфингомиелина и образование церамида в ишемической коре мозга (Kubota et al., 1996). И действительно, наблюдаемый нами низкий уровень мРНК гена SMS1 предполагает снижение содержания сфингомиелина в этих структурах (Рис. 3). Фокальная церебральная ишемия способствовала раннему (уже через 3 часа) снижению транскрипции гена SMS1, продолжавшемуся, по крайней мере, сутки; на третьи сутки содержание мРНК этого гена вернулось к уровню здоровых крыс, но было выше, чем у ложнооперированных

крыс. Одновременное повышение содержание церамида и активности кислых SMase при церебральной ишемии наблюдали Ohlani и соавт. (Ohtani et al., 2004). Другие исследователи также связывают накопление церамида с активностью нейтральных и кислых SMase (Soeda et al., 2004; el Alwani et al., 2005,2006). По-видимому, накопление церамида в условиях ишемии обусловлено не только повышенной активностью SMase, но и снижением экспрессии гена SMS1. Возвращение количества транскриптов гена SMS1 на нормальный уровень, наблюдаемое на третьи сутки при ишемии, возможно, отражает восстановительные процессы в поврежденном отделе мозга. Характерная для этого периода активная пролиферации клеток микроциркуляторного русла -эндотелиальных и гладкомышечных - вероятно сопровождается увеличением количества транскрипта, необходимого для синтеза компонента клеточных мембран сфингомиелина, основного продукта прямой реакции, катализируемой SMS1. Поскольку в течение первых суток после операции относительный уровень мРНК гена SMS1 был снижен в подкорковых структурах мозга как ложнооперированных животных, так и крыс с ишемией, это падение транскрипции гена SMS1 может быть обусловлено стрессом, вызванным хирургическим вмешательством.

Таким образом, согласно временному профилю транскрипции гена SMSI в мозге крыс этот ген можно отнести к генам раннего реагирования (Iadecola, 1999). Наблюдаемое нами снижение транскрипции гена SMS1 в подкорковых структурах мозга на третьи сутки уже не может быть связано с оперативным вмешательством. Ввиду того, что в коре обоих полушарий мозга крыс с окклюзией через трое суток транскрипция гена SMSI вернулась к уровню здоровых животных, низкое содержание мРНК этого гена в подкорковых структурах мозга может быть проявлением распространяющейся деполяризации или же результатом компенсаторного эффекта. Действительно, одним из проявлений ингибирования синтеза сфингомиелина является пролиферация клеток. В то же время, как известно, в подкорковых структурах локализуется пул пролиферирующих клеток нервной ткани (Abrous et al., 2005; Faiz et al., 2005; Watts et al, 2005).

На фоне введения семакса в первые 3 часа в коре мозга здоровых и ложнооперированных животных выявлено снижение относительного уровня мРНК SMSI (Рис. 3). В подкорковых структурах здоровых крыс содержание мРНК SMSI оставалось на сниженном уровне в течение всего периода введения семакса. Согласно литературным данным, ядерный матрикс, являющийся местом синтеза ДНК и РНК, богат фосфолипидами, большую часть которых составляет сфингомиелин (Алесенко и соавт., 1983; Соссо et al., 1987; Alessenko, Burlakova, 2002).

Функции комплекса фосфолипидов в ядре не ограничиваются структурными: предположительно, его компоненты играют роль в стабилизации двойной спирали ДНК, а также обеспечивают сохранность и транспортировку вновь синтезированной РНК (Albi et al., 1996; Micheli et al., 1998). Следует отметить, что активность SMS также представлена в ядре: в частности, в составе ядерной мембраны и хроматина. Снижение содержания сфингомиелина наблюдается в начале S-фазы клеточного цикла и, вероятно, способствует расплетению ДНК и открытию двойной спирали (Albi, Magni, 1999). Можно предположить, что наблюдаемый нами эффект семакса в мозге здоровых животных (снижение экспрессии гена SMSI) связан с деконденсацией хроматина, необходимой для репликации ДНК при пролиферации клеток.

кора

подкорковые структуры

«0%

ата «%

моя «он-100% 80% 60% ■ 40% 20% 0%

110% 120% 100% 80'А 60% 40% 20% Ж

Цр -щ

140% 12«'. 100%

40%

а>%

I ив Г

24h

S^ ??

72h

tb__ l

Щ ТЧ

К L I С

} I - физ. р-р Ol - семакс Ш - PGP

140% 120% 100% 80% 60% <0% 20% О%

140% 120% 100% 80% ео%

40% 20%

I ш г

I SESqp

■Q ö"

Рисунок 3. Действие семакса и PGP на экспрессию гена SMS/ в мозге крыс. Анализ относительного уровня мРНК SMSI в коре и подкорковых структурах мозга крыс через 3, 24 и 72 часа представлен для групп: К -здоровые крысы, L -ложнооперированные крысы, i - ипсилатеральное полушарие мозга крыс с окклюзией, С - контралатеральное полушарие мозга крыс с окклюзией. Данные представлены в процентах от относительного уровня экспрессии гена у здоровых крыс (100%) как Середнее ± Ошибка среднего. Значимые различия (р<0,05) обозначены: *) при сравнении со здоровыми животными, получавших физ. р-р; *) при сравнении с ложноолерировакными животными, получавшими фнз. р-р; ') при сравнении полушарий крыс с ишемией, получавших физ. р-р; ") при сравнении с крысами, получавшими физ. р-р внутри групп (К, L, 1 или С).

У животных с окклюзией в течение первых суток семакс не воздействовал на содержание мРНК гена SMS.1 в очаге повреждения (Рис. 3). В коре контралатерального полушария мозга животных, получавших семакс, уровень исследуемого транскрипта снижен через сутки после окклюзии. Интересно, что на третьи сутки семакс оказывал противоположные эффекты на транскрипцию SMS/ в исследованных структурах мозга крыс с окклюзией: в коре - снижал, а в подкорковых структурах - повышал. По-видимому, наблюдаемая разница эффектов семакса в коре и подкорковых структурах ишемического мозга обусловлена ответом разного тина клеток. Биологический смысл, лежащий в основе выявленных изменений экспрессии мРНК SMS1 в ишемическом мозге на фоне применения семакса трудно интерпретировать. Ингибирование семаксом транскрипции гена SMS1 в коре мозга животных с окклюзией, вероятно, отражает компенсаторный эффект, который может проявляться в виде пролиферации клеток глии или блокирования апогггоза В первом случае уровень сфингомиелина должен снижаться в ядре, во

втором - в «липидных плотиках». В этом случае в подкорковых структурах семакс, вероятно, стимулирует метаболизм клеток, активируя систему антероградного везикулярного транспорта и синтез мРНК.

Действие PGP на транскрипцию гена SMS1 в мозге здоровых и ложнооперированных животных выявлено только на третьи сутки. У этих крыс относительный уровень гена SMS1 снижался в подкорковых структурах мозга. Можно предположить, что, как и при воздействии семакса, ингибирование транскрипции гена SMS1 может быть связано с пролиферацией клеток в подкорковых структурах мозга здоровых и ложнооперированных крыс. В коре ложнооперированных животных на третьи сутки PGP предотвращал падение транскрипции гена SMS1. У крыс с ишемией PGP препятствовал падению относительного уровня мРНК SMS! в очаге повреждения и в подкорковых структурах со стороны повреждения в течение первых суток. Стоит отметить, что действие семакса при этом не обнаружено. По-видимому, поддерживая уровень сфингомиелина в клетках, PGP препятствует ингибированию синтеза белков, антероградного везикулярного транспорта и работы сигнальных путей в ипсилатеральном полушарии мозга крыс с окклюзией и в коре ложнооперированных крыс. Однако через трое суток, как и при введении семакса, на фоне применения PGP содержание транскрипта SMS1 в очаге повреждения резко снижено, а в подкорковых структурах контралатерального полушария повышено по сравнению с крысами, не получавшими пептид.

Сложный характер функционирования SMS, ее участие в реакциях, продукты которых либо стимулируют рост и размножение клеток (медиатор ДАГ), либо приводят к их гибели (про-апоптотический фактор церамид), свидетельства о проявлениях ее активности в составе различных компартментов клетки, а также отсутствие данных об особенностях регуляции кодирующего ее гена, затрудняют интерпретацию полученных результатов. Для понимания биологического смысла выявленных нами изменений экспрессии мРНК SMS1 в условиях экспериментальной ишемии мозга, а также на фоне применения ноотропного препарата семакс и его С-концевого фрагмента PGP необходимо дальнейшее изучение особенностей функционирования компонентов сфингомиелинового цикла, как обеспечивающих выживаемость клеток, так и приводящих их к апоптозу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе впервые показано влияние семакса на экспрессию нейротрофинов, а также других факторов роста и их рецепторов при ишемии. Обнаружено действие PGP на экспрессию генов, кодирующих факторы роста и их рецепторы в мозге крыс. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в ишемической коре мозга оба исследованных пептида, и семакс, и PGP, оказывают активирующее воздействие на транскрипцию нейротрофинов и их рецепторов, обеспечивающих нейропротекцию и выживание клеток нервной ткани при ишемии. Эта индукция экспрессии генов нейротрофинов и их рецепторов наблюдается, преимущественно, через 3 и 24 часа после ишемической атаки, когда клетки пенумбры еще сохраняют свою функциональную активность и имеют потенциал к выживанию (Lipton, 1999; Lu et al., 2003).

Анализ воздействия семакса и PGP в мозге исследованных групп животных (здоровые, ложнооперированные животные и крысы с ишемией) свидетельствует о том, что действие семакса на транскрипцию генов нейротрофинов и их рецепторов проявляется преимущественно в ишемической коре. В этих структурах наиболее выраженная активация экспрессии под действием

семакса зафиксирована для генов Bdnf, Ngf, TrkC, ТгкА. Действие PGP на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов наблюдается в мозге всех исследованных групп животных. При этом большая часть изменений транскрипции исследованных генов выявляется в коре мозга. У здоровых животных в этих структурах под действием PGP зафиксирована наиболее выраженная активация экспрессии генов, кодирующих рецепторы нейротрофинов ТгкВ и ТгкА. В мозге крыс с окклюзией наиболее выраженная активация экспрессии под действием PGP в ишемизированной коре наблюдается для генов Bdnf, Ngf, ТгкВ, ТгкС, ТгкА и р75, в коре контралатеральтерального полушария - для генов Ngf, ТгкА ир75.

Количество наблюдаемых эффектов обоих пептидов в мозге исследованных групп крыс возрастало от здоровых животных до крыс с ишемией. Эффекты семакса и PGP во всех исследованных структурах мозга здоровых, ложнооперированных и животных с ишемией совпадали лишь частично. В случае транскрипции гена Egrl, действие PGP, в отличие от семакса, мы наблюдали в мозге всех исследованных групп животных. Причем PGP способствовал значительной активации экспрессии гена Egrl в коре мозга здоровых и ложнооперированных крыс, а также в коре обоих полушарий мозга животных с окклюзией. Поскольку экспрессию этого гена связывают с запуском различных генных программ в нервной ткани, лежащих в основе обучения, формирования и распознавания долговременной памяти, а также синаптической пластичности, можно предположить, что PGP способствует активации этих процессов в мозге крыс.

При исследовании действия пептидов на экспрессию факторов роста и их рецепторов в ишемической коре мозга выявлено, что семакс и PGP воздействуют на представленность мРНК более 20% исследованных генов факторов роста и их рецепторов, повышая экспрессию одних и снижая уровень других. Среди генов, увеличивших уровень транскрипции под действием семакса, можно выделить гены, функция которых связана с выживанием клеток при ишемии - Lif, Vgf, Gfral, гены раннего реагирования Fos и с-тус, гены Nf-1, Npy2r, участвующие в формировании сосудов, а также ген Galrl, играющий роль в обучении и формированием памяти. Ген транскрипционного фактора StatI, препятствующего апоптотической гибели клеток, и ген Crhrl, связанный с формированием поведенческого ответа типа депрессии, беспокойства, страха снизили свою экспрессию при введении семакса. Спектр генов, изменивших свою экспрессию под действием обоих препаратов, также, как и в случае генов нейротрофинов и их рецепторов, перекрывался лишь частично. Аналогично семаксу, PGP оказывал действие на экспрессию части перечисленных генов Lif, Vgf, Gfral, с-тус, Nf-1, Crhrl. Кроме того, также увеличивал транскрипцию и других факторов роста, имеющих нейропротективную функцию (Fgf2, Ntf5).

Таким образом, один из механизмов действия семакса и PGP в мозге связан с их воздействием на экспрессию генов системы факторов роста и их рецепторов, обеспечивающих функционирование клеток нервной ткани и сосудов. Семакс активирует транскрипцию нейротрофинов и их рецепторов при ишемии, наглядно демонстрируя нейропротекторное действие, благодаря которому его успешно применяют в клинике для лечения инсульта. Функции других исследованных генов факторов роста и их рецепторов, экспрессию которых активировал семакс, указывают на его ноотропное действие, роль в формировании сосудов, анксиолитические свойства. Активация экспрессии генов нейротрофинов, других исследованных генов факторов роста и их рецепторов, а также гена Egrl в мозге крыс при введении PGP обнаруживает

нейропротективное и, по-видимому, ноотропное, действие этого пептида. На основании наших результатов о частичном совпадении действия семакса и PGP в мозге крыс можно заключить, что некоторые эффекты семакса опосредованы PGP. В то же время разница в спектрах генов исследованной системы, изменивших свою экспрессию под воздействием семакса или PGP, свидетельствует, что механизмы их действия на нервную ткань, вероятно, имеют свои особенности. По-видимому, для семакса и PGP характерны специфические механизмы воздействия на транскрипцию исследованных генов.

Обнаружено ингибируюшее влияние семакса на транскрипцию гена SMS1 в подкорковых структурах мозга здоровых животных. По результатам исследования особенностей транскрипции гена SMS1 в мозге крыс этот ген можно отнести к генам раннего реагирования. На содержание транскриптов гена SMS! в мозге крыс воздействуют как фокальная церебральная ишемия, так и хирургический стресс, при котором транскрипции гена SMS1 падает в подкорковых структурах мозга. Мы предполагаем, что снижение экспрессии гена SMS1, вызванное ишемическим повреждением, вносит свой вклад в накопление церамида, наблюдаемое при ишемии.

ВЫВОДЫ

1. Фокальная церебральная ишемия вызывает изменения транскрипции генов нейротрофинов и их рецепторов не только в ишемизированной коре, но и в структурах мозга, отдаленных от очага повреждения, - коре контралатерального полушария, и в подкорковых структурах обоих полушарий мозга крыс.

2. В условиях фокальной ишемии мозга семакс и PGP воздействуют на экспрессию большого числа генов, кодирующих факторы роста и их рецепторы, - семакс изменил экспрессию 16-х, а PGP - 20-и из 77-и исследованных генов. Активация экспрессии генов, наблюдаемая при введении семакса, свидетельствует о его нейропрстективном (Lif, Vgf, Gfral) и ноотропном (Galrl) действии, а также указывает на его роль в формировании сосудов (Nf-1, Npy2r). Снижение экспрессии гена Crhrl под действием семакса подразумевает анксиолитичесхие свойства препарата. Выявленная активация экспрессии генов факторов роста и их рецепторов (Lif, Vgf, Gfral, Fgß, Ntß и др.) при введении PGP, обнаруживает нейропротективное действие этого пептида.

3. Действие семакса на транскрипцию генов нейротрофинов и их рецепторов проявляется преимущественно в участке лобной коры, включающем очаг повреждения. Действие PGP не является селективным и наблюдается в мозге крыс как при ишемии, так и у здоровых и ложнооперированных животных, при этом большая часть изменений исследованных генов выявляется в коре. В очаге повреждения семакс и PGP активируют транскрипцию генов нейротрофинов и их рецепторов через 3 и 24 часа после ишемической атаки, обеспечивая нейропротективное действие этих пептидов при ишемии.

4. Профиль изменения транскрипции гена SMS!, кодирующего фермент сфингомиелинсинтазу 1, в разных отделах мозга крыс позволяет отнести его к генам раннего реагирования. При ишемии транскрипция гена SMS1 снижается в очаге повреждения, внося свой вклад в накопление церамида. Операционный стресс вызывает падение экспрессии SMS1 в подкорковых структурах мозга.

5. В мозге интактных животных семакс снижает экспрессию гена SMS!. У крыс с ишемией семакс действует на экспрессию этого гена спустя трое суток после оперативного воздействия, оказывая разнонаправленное действие: в коре - снижение, ив подкорковых структурах -увеличение. В течение первых суток PGP способствует повышению транскрипции гена SMS1 в ишемизированной коре и подкорковых структурах контралатерального полушария мозга.

6.: В коре мозга животных с ишемией семакс снижает экспрессию гена транскрипционного фактора Egrl через сутки и увеличивает через трое суток после операции, при этом его действие противоположно эффектам PGP. Активирующее воздействие PGP на транскрипцию гена Egrl проявляется в мозге всех исследованных групп живошых, что может свидетельствовать о ноотропных свойствах этого пептида

7. Один iß механизмов нейропротекгивного действия семакса и PGP в мозге в условиях ишемии может быть связан с их воздействием на экспрессию генов системы факторов роста и их рецепторов, обеспечивающих функционирование клеток нервной ткани и сосудов. Эффекты семакса и PGP на транскрипцию генов нейротрофинов, факторов роста и их рецепторов в мозге крыс совпадают лишь частично, а на экспрессию генов SMS1 и Egrl существенно различаются. По-видимому, действие семакса и PGP на экспрессию генов осуществляется как через общие сигнальные пути, так и с использованием специфических для каждого пептида механизмов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Vladychenskaya LP., Dergunova L.V., Dmitrieva V.G.. Limborska S.A. Human gene MOB: structure specification and aspects of transcriptional activity // Gene. 2004. V. 338 (2). P. 257-265.

2. Dmitrieva V.G.. Torshina E.V., Yuzhakov V.V., Povarova O.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A., Dergunova L.V. Expression of sphingomyelin synthase 1 gene in rat brain focal ischemia.// Brain Research. 2008. V. 1188. P. 222-227.

3. Дмитриева В.Г.. Дергунова Л.В., Поварова O.B., Скворцова В.И., Л им боре кал С. А., Мясоедов Н.Ф. Действие семакса и его С-концевсго трипептида PGP на экспрессию генов факторов роста и их рецепторов в условиях экспериментальной ишемии мозга крыс. // Докл. Ак. Наук. 2008. Т. 422. №2. С. 258-261.

4. Dmitrieva V..G. Povarova O.V., Skvortsova V..1, Limborska S.A., Myasoedov N.F., Dergunova L.V. Semax and Pro-Gly-Pro Activate the Transcription of Neurotrophins and Their Receptor Genes after Cerebral Ischemia. // Cell Mol Neurobiol. 2009. Jul 25. (Epub ahead of print).

5. Vladychenskaya I.P., Dergunova L.V., V.G. Dmitrieva. Limborska S.A // Novel structure and functional peculiarities of human gene MOB// The American Journal of Human Genetics, 2003, v.73 (5), 341.

6. Vladychenskaya LP., Dergunova L.V., Dmitrieva V.G.. Limborska S.A. // MOB is a gene encoding human sphingomyelin synthase 1. // The American Journal of Human Genetics // 2004, v. 75, poster NO: 1279.

7. Dmitrieva V.G.. Dergunova L.V., Botsina А.У., Platonova I.A., Tvorogova T.V., Shaykhutdinova E.F., Torshina E.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A. // Analysis of iNOS expression in rats under brain experimental ischemia. // European Journal of Human Genetics // 2005, v. 13, poster NO: 1307.

8. Vladychenskaya I.P., Dergunova L.V., Dmitrieva V.G.. Limborska S.A. // Human gene MOB a member of yet unknown evolutionarilly conserved gene family, codes for sphingomyelin synthase.// European Journal of Human Genetics//2005, v. 13, poster NO: 1292.

9. Dmitrieva V.G.. Torshina E.V., Dergunova L.V., Tvorogova T.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A.// Analysis of MOB (TMEM 23) expression in rats under brain experimental ischemia.// European Journal of Human Genetics//2006, V.14,P. 364.

10. Dmitrieva V. G.. Torshina E. V., Povarova О. V., Dergunova L. V., Limborska S. A., Skvortsova V. I.// Analysis of SMS 1 mRNA expression in focal cerebral ischemia in rats after treatment with neuropeptide Semax and its C-terminal Pro-Gly-Pro tripeptide.// (abstract 1172/A). Annual meeting of The American Society of Human Genetics, October 9-13, 2006, New Orleans, Louisiana. Available from http://www.ashg.org/genetjcs/ashg06s/index.5html

11. Сафина ДР., Дмитриева В.Г.. Дергунова Л.В., Демвдюк И.В., Шрам С.И., Лимборская С.А., Костров С.В.// Изучение функциональной организации пронейротрофина NT-3.// Сборник тезисов 10-ой Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века".200б, стр. 46.

12. Сафина ДР., Рафиева Л.М., Коваль А.В., Дмитриева В.Г.. Раевская НМ., ГасановЕ.В., Демвдюк И.В., Костров С.В.// Процессинг предшественников нейротрофинов человека, как механизм, определяющий их функиональную активность.// VI Симпозиум "Химия протеолитических ферментов", 2007, стр. 131.

13. Dmitrieva У. G.. Dergunova L. V.,.Vlasova I. V., Povarova О. V., Skvortsova V. I., Limborska S. AM Brain-derived neurotrophic factor (BDNF): mRNA expression in rat brain focal ischemia under the treatment with neuropeptides Semax and PGP7/ European Journal of Human Genetics, 2007, V.15, suppl.l, P. 226-227.

14. Dmitrieva V. G- Dergunova L. V., Vlasova I. V., Povarova О. V., Skvortsova V. I., Limborska S. A..// Semax and PGP affect the mRNA expression of neurotrophins and their receptors under the focal cerebral ischemia in rats // Presented at the annual meeting of The American Society of Human Genetics, 2007, San Diego, • California. Abstiactbook, P. 517, Available

■ fromhttp://www.ashg.org/Eenetics/ashg06s/index.shtml. abstract 2765/F.

15. Баязутдинова Г.М., Тихомиров E E., Персиянцева H.A., Лимборская C.A., Дергунова Л.В., Дмитриева В.Г.. Пинелис В.Г., Мясоедов Н.Ф. // Влияние Семакса и его аналога Pro-Gly-Pro на экспрессию генов BDNF и TRKB в культивируемых корковых нейронах при гиперстимуляции глутаматных рецепторов // Тезисы стендовых сообщений III Российского симпозиума «Белки и пептиды», Пущино, 2007, стр. 60.

16. Дмитриева В.Г.. Поварова О.В., Скворцова В.И., Лимборская С.А., Дергунова Л.В. // Действие Семакса и PGP на экспрессию мРНК генов нейротрофинов Bdnf, Nt-З и их рецепторов TrkB, ТгкС в условиях фокальной ишемии мозга крыс // Тезисы стендовых сообщений 1П Российского симпозиума «Белки и пептиды», Пущино, 2007, стр. 68.

17. Dmitrieva V. G.. Dergunova L. V., Vlasova I. V., Povarova О. V., Skvortsova V. I., Limborska S. A. // Semax and its C-terminal Pro-Gly-Pro tripeptide change the transcription profile of growth factors and

their receptors genes after focal cerebral ischemia in rats// European Journal of Human Genetics, 2008, poster NO: 1850.

18. Дмитриева В.Г.. Дергунова JIB., Поварова O.B., Скворцова В.И., Лимборская С.А., Мясоедов Н.Ф.

. // Действие семакса и его С-концевого трипептида Pro-Gly-Pro на экспрессию генов факторов роста и их рецепторов в условиях экспериментальной ишемии мозга крыс /У IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярньк биологов, Новосибирск, 2008, стр. 111.

19. Дергунова Л. В.. Дмитриева В. Г.. Коньков А. С., Рожкова А. В:, Ефимов Е. Д., Лимборская С.А. // Множество альтернативных вариантов транскриптов гена сфингомиелинсингетазы 1 (MOB, ТМЕМ23, SMS1) человека // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, стр.Ш.

20. Дмитриева В.Г., Поварова ОД, Скворцова В.И., Лимборская С.А., Дергунова Л.В., Мясоедов Н.Ф. // Исследование нейропротекгорных свойств семакса и PGP в условиях фокальной ишемии мозга крыс // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, 2009, стр. 193.

Подписано в печать: 27.10.2009

Заказ № 2846 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дмитриева, Вероника Германовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Развитие повреждения при церебральной ишемии.

Гемодинамика в ткани мозга при ишемии.

Морфология ткани мозга при ишемии.,.

Молекулярно-биологические аспекты ишемического повреждения.

Глутамат-кальциевый каскад.

Апоптоз.

Реакция генома на ишемию мозга.

Активация генов при ишемии.

Нейротрофины и их рецепторы.

Ген Egrl.

Ген SAISI.

Патогенетическая терапия при ишемии мозга.

Основные принципы терапии.

Семакс и PGP.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объект исследования.

Реактивы и оборудование.'.

Растворы, буферы.

Дистальная окклюзия средней мозговой артерии у крыс.

Гистологическое исследование срезов мозга крыс.

Анализ экспрессии генов.

Выделение суммарной РНК и обработка ДНКазой I.

Спектрофотометрическое определение количества РНК.

Электрофоретическое разделение суммарной РНК в 1.5% агарозном геле.

Синтез одноцепочечной кДНК.

Подбор праймеров.

Обработка ДНК фага X рестрицирующей эндонуклеазой Pst 1.

Электрофорез продуктов ПЦР в полиакрнламидном геле.

Полу количественный анализ продуктов ПЦР.

Полимеразная цепная реакция.

Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле.

Подбор условий для полукочичественного анализа экспрессии мРНК SMS1.

Статистический анализ данных.

ПЦР в реальном времени.

Полимеразная цепная реакция.

Обработка результатов.

Статистический анализ данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Гистологическое исследование срезов мозга крыс с окклюзией.

Анализ экспрессии мРНК генов, кодирующих нейротрофины и их рецепторы в отделах мозга крыс под действием семакса и PGP в условиях фокальной церебральной ишемии.

Экспрессия гена Bdnf.

Изменение содержания мРНК Bdnf при ишемии.

Содержание мРНК Bdnf при введении семакса.

Содержание мРНК Bdnf при введении PGP.

Экспрессия гена Nt-3.

Изменение содержания мРНК Nt-3 при ишемии.

Содержание мРНК Nt-3 в мозге крыс при введении семакса.

Содержание мРНК Nt-3 в мозге крыс при введении PGP.

Экспрессия гена Ngf.

Ихиенение содержания MPHKNgf при ишемии.

Содержание мРНК Ngf в мозге крыс при введении семакса.

Содержание мРНК Ngf в мозге крыс при введении PGP.

Экспрессия гена TrkB.

Изменение содержания мРНК TrkB при ишемии.

Содержание мРНК TrkB в мозге крыс при введении семакса.

Содержание мРНК TrkB в мозге крыс при введении PGP.'.

Экспрессия гена TrkC.

Изменение содержания мРНК TrkC при ишемии.

Содержание мРНК TrkC в мозге крыс при введении семакса.

Содержание мРНК TrkC в мозге крыс при введении PGP.

Экспрессия гена TrkA.

Изменение содержания мРНК TrkA при ишемии.

Содержание мРНК TrkA в мозге крыс при введении семакса.

Содержание мРНК TrkA в мозге крыс при введении PGP.

Экспрессия генар75.

Изменение содержания мРНКр75 при ишемии.

Содержание мРНКр75 в мозге крыс при введении семакса.

Содержание мРНКр75 в мозгекрыс при введении PGP.

Анализ изменения экспрессии генов нейротрофинов и их рецепторов в мозге крыс с ишемией.

Анализ действия семакса и PGP на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов в мозге крыс.

Анализ экспрессии мРНК Egrl в отделах мозга крыс под действием семакса и PGP в условиях фокальной церебральной ишемии.

Анализ экспрессии мРНК SMS1 в отделах мозга крыс под действием семакса и PGP в условиях фокальной церебральной ишемии.

Анализ действия семакса и PGP на экспрессию генов факторов роста и их рецепторов в условиях фокальной ишемии.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Дмитриева, Вероника Германовна

выводы

2. В условиях фокальной ишемии мозга семакс и PGP воздействуют на экспрессию большого числа генов, кодирующих факторы роста и их рецепторы, - семакс изменил экспрессию 16-х, a PGP — 20-и из 77-и исследованных генов. Активация экспрессии генов, наблюдаемая при введении семакса, свидетельствует о его нейропротективном {Lif, Vgf, Gfral) и ноотропном (Galrl) действии, а также указывает на его роль в формировании сосудов {Nf-1, Npy2r). Снижение экспрессии гена Crhrl под действием семакса подразумевает анксиолитические свойства препарата. Выявленная активация экспрессии генов факторов роста и их рецепторов {Lif, Vgf, Gfral, Fgß, Ntf5 и др.) при введении PGP, обнаруживает нейропротективное действие этого пептида.

4. Профиль изменения транскрипции гена SMS1, кодирующего фермент сфингомиелинсинтазу 1, в разных отделах мозга крыс позволяет отнести его к генам раннего реагирования. При ишемии транскрипция гена SMS1 снижается в очаге повреждения, внося свой вклад в накопление церамнда. Операционный стресс вызывает падение экспрессии SMS1 в подкорковых структурах мозга.

5. В мозге интактных животных семакс снижает экспрессию гена SMS1. У крыс с ишемией семакс действует на экспрессию этого гена спустя трое суток после оперативного воздействия, оказывая разнонаправленное действие в коре - снижение, и в подкорковых структурах — увеличение. В течение первых суток PGP способствует повышению транскрипции гена SMS1 в ишемизированной коре и подкорковых структурах контралатералыюго полушария мозга.

6. В коре мозга животных с ишемией семакс снижает экспрессию гена транскрипционного фактора Egrl через сутки и увеличивает через трое суток после операции, при этом его действие противоположно эффектам PGP. Активирующее воздействие PGP на транскрипцию гена Egrl проявляется в мозге всех исследованных групп животных, что может свидетельствовать о ноотропных свойствах этого пептида.

7. Один из механизмов нейропротективного действия семакса и PGP в мозге в условиях ишемии может быть связан с их воздействием на экспрессию генов системы факторов роста и их рецепторов, обеспечивающих функционирование клеток нервной ткани и сосудов. Эффекты семакса и PGP на транскрипцию генов нейротрофинов, факторов роста и их рецепторов в мозге крыс совпадают лишь частично, а на экспрессию генов SMS1 и Egrl существенно различаются. По-видимому, действие семакса и PGP на экспрессию генов осуществляется как через общие сигнальные пути, так и с использованием специфических для каждого пептида механизмов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе впервые показано влияние еемакеа на экспрессию нейротрофинов, а также других факторов роста и их рецепторов при ишемии. Обнаружено действие PGP на экспрессию генов, кодирующих трофические факторы и их рецепторы в мозге крыс. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в ишемической коре мозга оба исследованных пептида, и семакс, и PGP, оказывают активирующее воздействие на транскрипцию системы нейротрофинов и их рецепторов, обеспечивающих нейропротекцию и выживание клеток нервной ткани при ишемии. Эта индукция экспрессии генов нейротрофинов и их рецепторов наблюдается, преимущественно, через 3 и 24 часа после ишемической атаки, когда клетки пенумбры еще сохраняют свою функциональную активность и имеют потенциал к выживанию (Lipton, 1999; Lu et al., 2003).

Анализ воздействия семакса и PGP в мозге исследованных групп животных (здоровые, ложнооперированные и крысы с ишемией) свидетельствует о том, что действие семакса на транскрипцию генов нейротрофинов и их рецепторов проявляется преимущественно в ишемической коре. В этих структурах наиболее выраженная активация экспрессии под действием семакса зафиксирована для генов Bdnf, Ngf, TrkC, ТгкА. Действие PGP на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов наблюдается в мозге всех исследованных групп животных. При этом большая часть изменений транскрипции исследованных генов выявляется в коре мозга. У здоровых животных в этих структурах под действием PGP зафиксирована наиболее выраженная активация экспрессии генов, кодирующих высокоаффинные рецепторы нейротрофинов ТгкВ и ТгкА. В мозге крыс с окклюзией наиболее выраженная активация экспрессии под действием PGP в ишемизированной коре наблюдается для генов Bdnf, Ngf, ТгкВ, TrkC, ТгкА и р75, в коре контралатеральтерального полушария - для генов Ngf, ТгкА и р75.

Количество наблюдаемых эффектов обоих пептидов в мозге исследованных групп крыс возрастало с тяжестью физиологического состояния животных. Эффекты семакса и PGP во всех исследованных структурах мозга здоровых, ложнооперированных и животных с ишемией совпадали лишь частично. В случае транскрипции гена Egrl, действие PGP, в отличие от семакса, мы также наблюдали в мозге всех исследованных групп животных. Причем PGP способствовал значительной активации экспрессии гена Egrl в коре мозга здоровых и ложнооперированных крыс, а также в коре обоих полушарий мозга животных с окклюзией. Поскольку экспрессию этого гена связывают с запуском различных генных программ в нервной ткани, лежащих в основе обучения, формирования и распознавания долговременной памяти, а также синаптической пластичности, можно предположить, что PGP способствет активации этих процессов в мозге крыс.

При исследовании действия пептидов на экспрессию факторов роста и их рецепторов в ишемической коре мозга выявлено, что семакс и PGP воздействуют на представленность мРНК более 20% исследованных генов факторов роста и их рецепторов, повышая экспрессию одних и снижая уровень других. Среди генов, увеличивших уровень транскрипции под действием семакса, можно выделить гены, функция которых связана с выживанием клеток при ишемии - Lif Vgf, Gfral, гены раннего реагирования Fos и с-тус, гены Nf-1, Npy2r, участвующие в формировании сосудов, а также ген Galrl, играющий роль в обучении и формированием памяти. Ген транскрипционного фактора Stall, препятствующего апоптотической гибели клеток, и ген Crhrl, связанный с формированием поведенческого ответа типа депрессии, беспокойства, страха снизили свою экспрессию при введении семакса. Спектр генов, изменивших свою экспрессию под действием обоих препаратов, также как и в случае генов нейротрофинов и их рецепторов, перекрывался лишь частично. PGP оказывал действие, аналогичное таковому семакса, на экспрессию части перечисленных генов Lif, Vgf, Gfral, с-тус, Nf-1, Crhrl, однако также увеличивал транскрипцию и других факторов роста, имеющих нейропротектиьную функцию (Fgf2, Ntf5).

Принимая во внимание данные о том, что в живом организме семакс подвергается быстрой ферментативной деградации с образованием смеси пептидных дериватов, в которой уже через 1 час после введения семакса преобладает PGP (Шевченко и соавт., 2006), необходимо отметить, что эффекты, наблюдаемые нами при введении семакса, обусловлены действием смеси его дериватов. На основании наших результатов о частичном совпадении действия семакса и PGP в мозге крыс, мы предположили, что некоторые эффекты семакса могут быть опосредованы PGP. Разница в спектрах генов исследованной системы, изменивших свою экспрессию под воздействием семакса или PGP, свидетельствует о том, что механизмы их действия на нервную ткань, вероятно, имеют свои особенности. По-видимому, для семакса и PGP характерны специфические механизмы воздействия на транскрипцию исследованных генов.

Таким образом, семакс активирует транскрипцию нейротрофинов и их рецепторов при ишемии, наглядно демонстрируя нейропротекторное действие, благодаря которому его успешно применяют в клинике для лечения инсульта. Функции других исследованных генов факторов роста и их рецепторов, экспрессию которых активировал семакс, указывают на его ноотропное действие и роль в формировании сосудов. Снижение экспрессии гена Crhrl, связанного с формированием поведенческого ответа типа депрессии, беспокойства, страха генов, наблюдаемое при введении семакса, свидетельствуют о его анксиолитическом действии. Активация экспрессии генов нейротрофинов, других исследованных генов факторов роста и их рецепторов, а также гена Egrl в мозге крыс при введении PGP, обнаруживает нейропротективное и, по-видимому, ноотропное, действие этого пептида.

Один из механизмов действия семакса и PGP в мозге связан с их воздействием на экспрессию генов системы факторов роста и их рецепторов, обеспечивающих функционирование клеток нервной ткани и сосудов.

По результатам нашего исследования профиля транскрипции гена SMS] в мозге крыс этот ген можно отнести к генам раннего реагирования. На содержание транскриптов гена SMS1 в мозге крыс воздействуют как фокальная церебральная ишемия, так и хирургический стресс, при котором транскрипции гена SMS1 падает в подкорковых структурах мозга. Мы предполагаем, что снижение экспрессии гена SMS1, вызванное ишемическим повреждением, вносит свой вклад в накопление церамида, наблюдаемое при ишемии. Обнаружено ингибирующее влияние семакса на транскрипцию гена SMS1 в подкорковых структурах мозга здоровых животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дмитриева, Вероника Германовна, Москва

1. Абрамова М.А., Самонина Г.Е., Ашмарин И.П. // Нейрохимия. 1996. Т. 13. С. 209214.

2. Абрамова М.А., Самонина Г.Е., Мамедов Ч.В., Копылова Г.Н. // Вест. Моск. Ун-та 1997. Т. 16.(2). С. 9-12.

3. Алесенко A.B., Красильников В.А., Бойков П.Я. Сфингомиелин участвует в формировании ДНК связей с ядерным матриксом при репликации // Докл Ак. Наук. 1983. Т. 264. С. 231-234.

4. Ашмарин И.П. Стукалов П.В. Нейрохимия. М. 1996. С. 372-413.

5. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Ляпина Л.А., Самонина Г.Е. Регуляторная активность простейших пролинсодержащих пептидов PG, GP, PGP и GPGG и возможные источники их биосинтеза//Биохимия. 1998. Т. 63(2). С. 149-155.

6. Ашмарин И.П., Левицкая Н.Г., Каменский A.A. и др. // Фарматека. 1997. Т. 4. С. 3233.

7. Владыченская И.П. MOB (ТМЕМ 23) — новый ген человека: особенности строения и функционирования // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 2004.

8. Глазова Н.Ю., Левицкая Н.Г., Андреева Л.А., Каменский A.A., Мясоедов Н.Ф. Ноотропные эффекты нового аналога фрагмента АКТГ(5-10) гексапептида AKTT(5-7)PGP // Доклады Академии Наук. 1999. Т. 367(1). С. 137-140.

9. Гудашева Т.А., Бойко С.С., Акпаров В.Х., Островская Р.У., Розанцев Г.Г., Воронина Т.А. и др. Идентификация в мозге крыс цикло-пролилглицина, нового эндогенного пептида с ноотропной активностью //Доклады Академии Наук. 1996. Т. 350(6). С. 834-836.

10. Гусев Е.И., Коновалов А.Н., Бурд Г.С. Неврология и нейрохирургия. М. Медицина. 2000.

11. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга // М.: Медицина. 2001.

12. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Нейропротекторы в комплексной терапии ишемического инсульта // Лечение нервных болезней. 2002. Т. 3(8).

13. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Современные представления о лечении острого церебрального инсульта // Consilium medicum. 2000. Т.2(2). Доступно на http://www.consilium-medicum.com/media/consilium/n02/60.shtml.

14. Заец Т.Я., Потапова A.A., Руднева В.В., Лобанова И.В. Применение препарата Семакс 0,1% в раннем восстановительном периоде ишемического инсульта // Кремлевская медицина. Клинический вестник. 2001. Т. 2.

15. Золотарев Ю.А., Жуйкова С.Е., Ашмарин И.П., Мясоедов Н.Ф., Васьковский Б.В., Самонина Г.Е. Метаболизм пептида PGP при разных способах введения // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 135(4). С. 423-426.

16. Ивашкин В.Т., Драпкина О.М. Клиническое значение оксида азота и белков теплового шока. М. ГЭОТАР-МЕД. 2001.

17. Левицкая Н.Г., Себенцова Е.А., Глазова Н.Ю., Воскресенская О.Г., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю. и др. // ДАН. 2000. Т. 372(2). С. 268-271.

18. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). М. Медицина. 2001.

19. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии, пер. с англ. М. Мир. 1984.

20. Манских В.Н. Морфологические методы верификации и количественной оценки апоптоза // Бюллетень сибирской медицины. 2004. Т.(1). С. 63-70.

21. Савочкина Л.П.; Скрыпина H.A., Тиофеева A.B., Бибилашвили Р.Ш. Количественное определение малых концентраций кДНК с использованием ПЦР и ампликона в качестве внутреннего стандарта // Молекулярная биология. 1996. Т. 30(4). С. 786800.

22. Сафарова Э.Р. Шрам С.И. Золотарев Ю.А. Мясоедов Н.Ф. Влияние пептида семакса на выживаемость культивируемых клеток феохромацитомы крысы при окислительном стрессе // Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. 2003. Т. 135(3). С. 309-313.

23. Шевченко К.В. и др. Кинетика проникновения семакса в мозг и кровь крыс при интраназальном введении // Биоорганическая химия. 2006. Т. 32(1). С. 64-70.

24. Яковлева Е.В. Кузенков B.C., Федоров В.Н., Скворцова В.И., Кошелев В.Б., Гусев Е.И., Ашмарин И.П. Исследование эффективности семакса при глобальной ишемии мозга in vivo // Бюллетень Экспериментальной биологии и медицины. 1999. Т. 128(8). С. 172-174.

25. Abrous D.N., Koehl М., Le Moal М. Adult neurogenesis: from precursors to network and physiology// Physiol Rev. 2005. V. 85(2). P. 523-569.

26. Agapova T.Y., Agniullin Y.V., Shadrina M.I., Shram S.I., Slominsky P.A., Lymborska S.A., Myasoedov N.F. Neurotrophin gene expression in rat brain under the action of Semax, an analogue of ACTH 4-10 //Neurosci Lett. 2007. V. 417(2). P. 201-205.

27. Akins P.T., Liu P.H., Hsu C.Y. Immediate early gene expression in response to cerebral ischemia. Friend or foe? // Stroke. 1996. V. 27(9). P. 1682-1687.

28. Al-Bader M.D., A-Sarraf H.A. Housekeeping gene expression during fetal brain development in the rat-validation by semi-quantitative RT-PCR // Dev. Brain Res. 2005. V. 156(1). P. 38-45.

29. Albi E., Cataldi S., Bartoccini E., Magni M.V., Marini F., Mazzoni F. et al. Nuclear sphingomyelin pathway in serum deprivation-induced apoptosis of embryonic hippocampal cells // J Cell Physiol. 2006. V. 206(1). P. 189-195.

30. Albi E., Cataldi S., Rossi G., Magni M.V. A possible role of cholesterol-sphingomyelin/phosphatidylcholine in nuclear matrix during rat liver regeneration // J Hepatol. 2003. V. 38(5). P. 623-628. ' .

31. Albi E., Lazzarini R., Magni M.V. Reverse sphingomyelin-synthase in rat liver chromatin //FEBS Lett. 2003. V. 549(1-3). P. 152-156.

32. Albi E., Lazzarini R., Viola Magni M. Phosphatidylcholine/sphingomyelin metabolism crosstalk inside the nucleus // Biochem J. 2008. V. 410(2). P. 381-389.

33. Albi E., Magni M.V. Sphingomyelin synthase in rat liver nuclear membrane and chromatin 11 FEBS Lett. 1999. V. 460(2). P. 369-372.

34. Albi E., Micheli M., Viola Magni M.P. Phospholipids and nuclear RNA // Cell Biol Int. 1996. V. 20(6). P. 407-412.

35. Albi E., Viola-Magni M.P. Chromatin-associated sphingomyelin: metabolism in relation to cell function // Cell Biochem Funct. 2003. V. 21(3). P. 211-215.

36. Alessenko A.V. The role of sphingomyelin cycle metabolites in transduction of signals of cell proliferation, differentiation and death // Membr Cell Biol. 2000. V. 13(2). P. 303-320.

37. Alessenko A.V., Burlakova E.B. Functional role of phospholipids in the nuclear events // Bioelectrochemistry. 2002. V. 58(1). P. 13-21.

38. Arushanian E.B., Popov A.V. Chronotropic activity of semax // Eksp Klin Farmakol. 2008. V. 71(2). P. 14-16.

39. Ashmarin I.P., Liapina L.A., Pastorova V.E. The modulation of hemostatic reactions in vitro and in vivo by representatives of regulatory peptide families // Vestn Ross Akad Med Nauk. 1996. V. 6. P. 50-57.

40. Ashmarin I.P., Nezavibat'ko V.N., Levitskaya N.G., Kamensky A.A. Desing and investigation of ACTH(4-10) analog deprived of D-aminoacids and hydrophobic radicals // Neurosci. Res. Commun. 1995. V. 16. P. 105-112.

41. Asselin J., Knight C.G., Farndale R.W., Barnes M.J., Watson S.P. Monomeric (glyCine-proline-hydroxyproline)10 repeat sequence is a partial agonist of the platelet collagen receptor glycoprotein // VI. Biochem J. 1999. V. 15(339). P. 413-418.

42. Astrup J., Siesjo B.K., Symon L. Thresholds in cerebral ischemia the ischemic penumbra // Stroke. 1981. V. 12(6). P. 723-725.

43. Bankaitis V.A., Morris A.J. Lipids and the exocytotic machinery of eukaryotic cells // Curr Opin Cell Biol. 2003. V. 15(4). P. 389-395.

44. Barbacid M. The Trk family of neurotrophin receptors // J Neurobiol. 1994. V. 25(11). P. 1386-1403.

45. Barzilai A., Kennedy T.E., Sweatt J.D., Kandel E.R. 5-HT modulates protein synthesis and the expression of specific proteins during long-term facilitation in Aplysia sensory neurons //Neuron. 1989. V. 2(6). P. 1577-1586.

46. Bibel M., Barde Y.A. Neurotrophins: key regulators of cell fate and shape in the vertebrate nervous system//Genes&Development. 2000. V. 14. P. 2919-2937.

47. Bonventre J.V., Sukhatme V.P., Bamberger M., Ouellette A.J., Brown D. Localization, of the protein product of the immediate early growth response gene, Egr-1, in the kidney after ischemia and reperfusion // Cell Regul. 1991. V. 2(3). P. 251-260.

48. Bozon B., Davis S., Laroche S. A requirement for the immediate early gene zif268 in reconsolidation of recognition memory after retrieval // Neuron. 2003. V. 40(4). P. 695701.

49. Brown AW. Structural abnormalities in neurones // J Clin Pathol Suppl (R Coll Pathol). 1977. V. 11. P. 155-169.

50. Buisson A., Lesne S., Docagne F., et. al. // Cell Mol Neurobiol. 2003. V. 4-5. P. 539-550.

51. Bustin S., Nolan T. Pitfalls of quantitative Real-Time Reverse-transcription polymerase chain reaction//Journal of biomolecular techniques. 2004. V. 15. P. 155-166. •

52. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using rel-time reverse transcription polymerase chain reaction assays // J.Mol.Endocrinol. 2000. V. 25(2). P. 169-193.

53. Butte M.J., Hwang P.K., Mobley W.C., Fletterick R.J. Crystal structure of neurotrophin-3 homodimer shows distinct regions are used to bind its receptors // Biochemistry. 1998. V. 37(48). P. 16846-16852.

54. Cai F., Li C.R., Wu J.L., et. al. // Mediators Inflamm. 2006. V. 2006(5). P. 1-9.

55. Canossa M., Griesbeck O., Berninger B., Campana G., Kolbeck R., Thoenen H. Neurotrophin release by neurotrophins: implications for activity-dependent neuronal plasticity // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. V. 94(24). P. 13279-13286.

56. Carmichael S.T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism and purpose // Neuro Rx. 2005. V. 2(3). P. 396-409.

57. Charriaut-Marlangue C., Margaill I., Plotkine M., Ben-Ari Y. Early endonuclease activation following reversible focal ischemia in the rat brain // J Cereb Blood Flow Metab. 1995. V. 15(3). P. 385-388.

58. Charriaut-Marlangue C., Margaill I., Represa A., Popovici T., Plotkine M., Ben-Ari Y. Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia: an in situ DNA fragmentation analysis // J Cereb Blood Flow Metab. 1996. V. 16(2). P. 186-194.

59. Chen J., Graham S.H., Zhu R.L., Simon R.P. Stress proteins and tolerance to focal cerebral ischemia // J Cereb Blood Flow Metab. 1996. V. 16(4). P. 566-577.

60. Chen S.C., Soares H.D., Morgan J.I. Novel molecular correlates of neuronal death, and regeneration//Advances in neurology. 1996. V. 71. P. 433-449.

61. Choi D.W. Glutamate receptors and the induction of excitotoxic neuronal death // Progress in brain research. 1994. V. 100(8). P. 47-51.

62. Chollangi S., Wang J., Martin A., Quinn J., Ash J.D. Preconditioning-induced protection from oxidative injury is mediated by leukemia inhibitory factor receptor (LIFR) and its ligands in the retina // Neurobiol Dis. 2009. V. 34(3). P. 535-544.

63. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analytical Biochemistry. 1987. V. 162. P. 156-159.

64. Chopp M., Li Y. Apoptosis in focal cerebral ischemia // Acta Neurochir Suppl. 1996. V. 66. P. 21-26.

65. Christy B.A., Lau L.F., Nathans D. A gene activated in mouse 3T3 cells by serum growth factors encodes a protein with "zinc finger" sequences // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. V. 85(21).P. 7857-7861.

66. Clarke P.G. Developmental cell death: morphological diversity and multiple mechanisms // Anat Embryol (Berl). 1990. V. 181(3). P. 195-213.

67. Cocco L., Martelli A.M., Billi A.M., Cataldi A., Miscia S., Mottola M.R., Manzoli L.f

68. Phospholipids as components of the nuclear matrix: their possible biological significance I I Basic Appl Histochem. 1987. V. 31(3). P. 413-419.

69. Cogswell P.C., Mayo M.W., Baldwin A.S. Jr. Involvement of Egr-l/RelA synergy in distinguishing T cell activation from tumor necrosis factor-alpha-induced NF-kappa B1 transcription // J Exp Med. 1997. V. 185(3). P. 491-497.

70. Collaco-Moraes Y., Aspey B.S., de Belleroche J.S., Harrison M.J. Focal ischemia causes an extensive induction of immediate early genes that are sensitive to MK-801 // Stroke. 1994. V. 25(9). V. 1855-1860.

71. Covey M.V., Levison S.W. Leukemia inhibitory factor participates in the expansion of neural stem/progenitors after perinatal hypoxia/ischemia//Neuroscience. 2007. V. 148(2). P. 501-509.

72. Crain B.J., Westerkam W.D., Harrison A.H., Nadler J.V. Selective neuronal death after transient forebrain ischemia in the Mongolian gerbil: a silver impregnation study // Neuroscience. 1988.V. 27(2). P. 387-402.

73. Curtis R., Adryan K.M., Stark J.L., Park J.S., Compton D.L., Weskamp G. et al. Differential role of the low affinity neurotrophin receptor (p75) in retrograde axonal transport of the neurotrophic// Neuron. 1995. V. 14(6). P. 1201-1211.

74. Davey F., Davies A.M. TrkB signalling inhibits p75-mediated apoptosis induced by nerve growth factor in embryonic proprioceptive neurons // Curr Biol. 1998. V. 8(16). P. 915918.

75. De Wied D. Behavioral effects of pituitary peptides // Acta Physiol Pol. 1977. V. 28(15). P. 77-91.

76. De Wied D. Behavioral pharmacology of neuropeptides related to melanocortins and the neurohypophyseal hormones // Eur J Pharmacol. 1999. V. 375(1-3). P. 1-11.

77. Devuyst G., Bogousslavsky J. Recent progress in drug treatment for acute stroke // J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1999. V. 67(4). P. 420-425.

78. Ding T., Li Z., Hailemariam T., Mukherjee S., Maxfield F.R., Wu M.P., Jiang X.C. -SMS overexpression and knockdown: impact on cellular sphingomyelin and diacylglycerol metabolism, and cell apoptosis // J Lipid Res. 2008. V. 49(2). P. 376-85.

79. Dirnagl U., Iadecola C., Moskowitz M.A. Patliobiology of ischaemic stroke: an integrated view//TrendsNeurosci. 1999. V. 22(9). P. 391-397.

80. Dobrowsky R.T., Werner M.H., Castellino A.M., Chao M.V., Hannun Y.A. Activation of the sphingomyelin cycle through the low-affinity neurotrophin receptor // Science. 1994. V. 265(5178). P. 1596-1599.

81. Dolotov O.V., Seredenina T.S., Levitskaya N.G. et. al. The heptapeptide SEMAX stimulates BDNF expression in different areas of the rat brain in vivo // Dokl. Biol. Sci.2003. V. 39l.P. 292-295.

82. Dragunow M., Faull R.L., Waldvogel H.J., Williams M.N., Leah J. Elevated expression of jun and fos-related proteins in transplanted striatal neurons // Brain Res. 1991. V. 558(2). P. 321-324.

83. El Alwani M., Usta J., Nemer G., El Sabban M., Nasser M., Bitar H. et al. Regulation of the sphingolipid signaling pathways in the growing and hypoxic rat heart // Prostaglandins Other Lipid Médiat. 2005. V. 78(1-4). P. 249-263.

84. El Alwani M., Wu B.X., Obeid L.M., Hannun Y.A. Bioactive sphingolipids in the modulation of the inflammatory response // Pharmacol Ther. 2006. V. 112(1). P. 171-183.

85. Faiz M., Acarin L., Castellano B., Gonzalez B. Proliferation dynamics of germinative zone cells in the intact and excitotoxically lesioned postnatal rat brain // BMC Neurosci. 2005. V. 12. P. 6:26.

86. Ferrer I., Krupinski J., Goutan E., Marty E., Ambrosio S., Arenas E. Brain-derived neurotrophic factor reduces cortical cell death by ischemia after middle cerebral artery occlusion in the rat // Acta Neuropathol. 2001. V. 101. P. 229-238.

87. Fisher M., Finklestein S. Pharmacological approaches to stroke recovery // Cerebrovasc Dis. 1999. V. 9(5). P. 29-32.

88. Fisher N., Takano K. Ballieries clinical neurology cerebrovascular disease // (HachinskiV.Ed.) London. 1995. P. 723-725.

89. Franke T.F., Kaplan D.R., Cantley L.C. PI3K: downstream AKTion blocks apoptosis // Cell. 1997. V. 88(4). P. 435-437.

90. Frebel K, Wiese S. Signalling molecules essential for neuronal survival and differentiation // Biochem Soc Trans. 2006. V. 34(6). P. 1287-1290.

91. Friedman W.J., Greene L.A. Neurotrophin signaling via Trks and p75 // Exp Cell Res. 1999. V. 253(1). P. 131-142.

92. Futerman A.H., Hannun Y.A. The complex life of simple sphingolipids // EMBO Rep. 2004. V. 5(8). P. 777-782.

93. Gao X., Daugherty R.L., Tourtellotte W.G. Regulation of low affinity neurotrophin receptor (p75(NTR)) by early growth response (Egr) transcriptional regulators // Mol Cell Neurosci. 2007. V. 36(4). P. 501-514.

94. Garcia J.H., Liu K.F., Ho K.L. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex // Stroke. 1995. V. 26(4). P. 636-642.

95. Garcia J.H., Yoshida Y., Chen H., Li Y., Zhang Z.G., Lian J., Chen S„ Chopp M. Progression from ischemic injury to infarct following middle cerebral arteryocclusion in the rat // Am J. Pathol.1993. V. 142(2). P. 623-635.

96. Geilen C.C., Wieder T., Orfanos C.E. Ceramide signalling: regulatory role in cell proliferation, differentiation and apoptosis in human epidermis // Arch Dermatol Res. 1997. V. 289(10). P. 559-566.

97. Giulian D., Corpuz M., Chapman S., Mansouri M., Robertson C. Reactive mononuclear phagocytes release neurotoxins after ischemic and traumatic injury to the central nervous system//J Neurosci Res. 1993. V. 36(6). 681-693.

98. Graham S.H., Chen J., Clark RS. Bcl-2 family gene products in cerebral ishemia and traumatic brain injury // J Neurotrauma. 2000. V. 17(10). P. 831 -841.

99. Grivennikov I.A., Dolotov O.V., Gol'dina Iu.I. Peptide factors in processes of proliferation, differentiation, and extended viability of mammalian nervous system cells // Mol Biol (Mosk). 1999. V. 33(1). P. 120-126.

100. Hallbook F. Evolution of the vertebrate neurotrophin and Trk receptor gene families // Curr Opin Neurobiol. 1999. V. 9(5). P. 616-621.

101. Hannun Y.A. The sphingomyelin cycle and the second messenger function of ceramide. // J Biol Chem. 1994. V. 269(5). P. 3125-3128.

102. Hannun Y.A., Luberto C., Argraves K.M. Enzymes of sphingolipid metabolism: from modular to integrative signaling // Biochemistry. 2001. V. 40(16). P. 4893-4903.

103. Hauger R., Risbrough V., Brauns O. et. al. Corticotropin releasing factor (CRF) receptor signaling in the central nervous system: new molecular targets // CNS Neurol. Disord. Drug. Targets. 2006. V. 5(4). P. 453-479.

104. Honkaniemi J., Sharp F.R. Global ischemia induces immediate-early genes encoding zinc finger transcription factors // J Cereb Blood Flow Metab. 1996. V. 16(4). P. 557-565.

105. Hossmann K.A. Disturbances of cerebral protein synthesis and ischemic cell death // Prog Brain Res. 1993. V. 96. P. 161-177.

106. Huang E.J., Reichardt L.F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function // Annu.Rev.Neurosci. 2001. V. 24. P. 677-736.

107. Huang E.J., Reichardt L.F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction // Annu Rev Biochem. 2003. V. 72. P. 609-642.

108. Huggett J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations // Genes Immun. 2005. V. 6(4). P. 279-284.

109. Huitema K., Van Den Dikkenberg J., Brouwers J.F., Holthuis J.C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases // EMBO J. 2004. V. 23(1). P. 33-44.

110. Iadecola C. Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury // Trends Neurosci. 1997. V. 20(3). P. 132-139.

111. Iadecola C. Mechanisms of cerebral ischemic damage, in Cerebral ischemia by Walz W. Humana Press Totowa, New Jersey. 1999.

112. Iadecola C., Zhang F., Casey R., Clark H.B., Ross M.E. Inducible nitric oxide synthase gene expression in vascular cells after transient focal cerebral ischemia // Stroke. 1996. V. 27(8). P. 1373-1380.

113. Iadecola C., Zhang F., Xu X. Inhibition of inducible nitric oxide synthase ameliorates cerebral ischemic damage // Am J Physiol. 1995. V. 268(2). P. 286-292.

114. Inamura K., Olsson Y., Siesjo B.K. Substantia nigra damage induced by ischemia in hyperglycemic rats. A light and electron microscopic study // Acta Neuropathol. 1987. V. 75(2). P. 131-139.

115. Ipatova O.M., Torkhovskaya T.I., Zakharova T.S., Khalilov E.M. Sphingolipids and cell signaling: involvement in apoptosis and atherogenesis // Biochemistry (Mosc). 2006. V. 71(7). P. 713-722.

116. Ivanova D.M., Levitskaya N.G., Andreeva L.A., Kamenskii A.A., Myasoedov N.F. Comparative study of analgesic potency of ACTH4-10 fragment and its analog semax // Bull Exp Biol Med. 2007. V. 143(1). P. 5-8.

117. Jiang X.C., Paultre F.s Pearson T.A., Reed R.G., Francis C.K., Lin M. et al, Tall A.R. Plasma sphingomyelin level as a risk factor for coronary artery disease // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2000. V. 20(12). P. 2614-2618.

118. Jones M.W., Errington M.L., French P.J., Fine A., Bliss T.V., Garel S. et al. A requirement for the immediate early gene Zif268 in the expression of late LTP and long-term memories //Nat Neurosci. 2001. V. 4(3). P. 289-296.

119. Kamiya T., Jacewicz M., Nowak T.S. Jr, Pulsinelli W.A. Cerebral blood flow thresholds for mRNA synthesis after focal ischemia and the effect of MK-801 // Stroke. 2005. V. 36(11). P. 2463-2467.

120. Kaplan, A.Ya., Kochetova, A.G., Nezavibafko, V.N., Rjasina, T.V., Ashmarin, I.P., Synthetic ACTH analogue semax displays nootropic-like activity in humans // Neurosci. Res. Commun. 1996. V. 19. P. 115-123.

121. Kidwell C.S., Liebeskind D.S., Starkman S., Saver J.L. Trends in acute ischemic stroke trials through the 20th century // Stroke. 2001. V. 32(6). P. 1349-1359.

122. Kim J.S. Bilateral perioral sensory symptom after unilateral stroke: does it have a localizing value?//J Neurol Sci. 1996. V. 140(1-2). P. 123-128.

123. Kim M.-W., Bang M.-S., Han T.-R., Ko Y.-J., Yoon B.-W. Exercise increased bdnf and trkB in contralateral hemisphere of the ischemic rat brain // Brain research. 2005. V. 1052. P. 16-21.

124. Kirino T., Sano K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia//ActaNeuropathol. 1984. V. 62(3). P. 201-208.

125. Knapska E., Kaczmarek L. A gene for neuronal plasticity in the mammalian brain: Zif268/Egr-1 /NGFI-A/Krox-24/TIS8/ZENK? // Prog Neurobiol. 2004. V. 74(4). P. 183211.

126. Koistinaho J., Hokfelt T. Altered gene expression in brain ischemia //Neuroreport. 1997. V. 8(2). P. 1-8.

127. Koroleva M.V., Meizerov E.E., Nezavibat'ko V.N., Kamenskii A.A., Dubynin V.A. Effect of the heptapeptide Semax on the human,electroencephalogram // Biull Eksp Biol Med. 1996. V. 121(1). P. 116-117.

128. Kubota M., Narita K., Nakagomi T., Tamura A., Shimasaki H., Ueta N., Yoshida S. Sphingomyelin changes in rat cerebral cortex during focal ischemia //Neurol. Res. 1996. V. 18(4). P. 337-341.

129. Kujubu D.A., Lim R.W., Varnum B.C., Herschman H.R. Induction of transiently expressed genes in PC-12 pheochromocytoma cells // Oncogene. 1987. V. 1(3). P. 257262.

130. Lang R., Gundlach A.L., Kofler B. // Pharmacology & Therapeutics. 2007. V. 115. P. 177-207.

131. Lawrence B.P., Brown W.J. Autophagic vacuoles rapidly fuse with pre-existing lysosomes in cultured hepatocytes // J Cell Sci. 1992. V. 102(3). P. 515-526.

132. Lee C.G., Cho S.J., Kang M.J., Chapoval S.P., Lee P.J., Noble P.W. et al. Early growth response gene 1-mediated apoptosis is essential for transforming growth factor betal-induced pulmonary fibrosis // J Exp Med. 2004. V. 200(3). P. 377-389.

133. Lee E., Michalkiewicz M., Kitlinska J. et. al. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles // J. Clin. Invest. 2003. V. 111. P. 1853-1862.

134. Lee T.H., Kato H., Chen S.T., Kogure K., Itoyama Y. Expression of nerve growth factor and trkA after transient focal cerebral ischemia in rats // Stroke. 1998. V. 29(8). P. 16871696.

135. Lemaire P., Revelant O., Bravo R., Charnay P. Two mouse genes encoding potential transcription factors with identical DNA-binding domains are activated by growth factors in cultured cells // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. V. 85(13). P. 4691-4695.

136. Lev S. Lipid homoeostasis and Golgi secretory function // Biochem Soc Trans. 2006. V. 34(3). P. 363-366.

137. Levitskaia N.G., Kleimenov A.N., Petrosian M.T., Rozenfel'd M.A., Kalikhevich V.N. Effect of low-molecular peptides on the transformation of fibrinogen into fibrin // Biull Eksp Biol Med. 1987. V. 104(8). P. 190-192.

138. Li J.M., Brackmann D.E., Hitselberger W.E., Linthicum F.H. Jr, Lim D.J. Coexpression of neurotrophic growth factors and their receptors in human facial motor neurons // Ann Otol Rhinol Laryngol. 1999. V. 108(9). P. 903-908.

139. Li Y., Chopp M., Jiang N., Yao F., Zaloga C. Temporal profile of in situ DNA fragmentation after transient middle cerebral artery occlusion in the rat // J Cereb Blood Flow Metab. 1995. V. 15(3). P. 389-397.

140. Linnik M.D., Miller J.A., Sprinkle-Cavallo J., Mason P.J., Thompson F.Y. et al. Apoptotic DNA fragmentation in the rat cerebral cortex induced by permanent middle cerebral artery occlusion // Mol. Brain Res. 1995. V. 32. P. 116-124.

141. Lipton P. Ischemic cell death in brain neurons // Physiological reviews. 1999. V. 79(4). P. 1431-1568.

142. Lu A., Tang Y., Ran R., Clark J.F., Aronow B.J., Sharp F.R. Genomics of the periinfarction cortex after focal cerebral ischemia // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2003. V. 23(7), P. 786-810.

143. Lu X.C., Williams A.J., Yao C., Berti R., Hartings J.A., Whipple R. et al. Microarray analysis of acute and delayed gene expression profile in rats after focal ischemic brain injury and reperfusion//J Neurosci Res. 2004. V. 77(6). P. 843-857.

144. Lyapina L.A,. Pastorova V.E., Obergan T.Y. Changes in hemostatic parameters after intranasal administration of peptide Pro-Gly-Pro // Bull Exp Biol Med. 2007. V. 144(4). P. 491-493.

145. Lyapina L.A., Pastorova V.E., Samonina G.E., Ashmarin LP. The effect of prolil-glycil-proline (PGP) peptide and PGP-rich substances on haemostatic parameters of rat blood // Blood Coagul Fibrinolysis. 2000. V. 11(5). P. 409-414.

146. MacManus J.P., Linnik M.D. Gene expression induced by cerebral ischemia: an apoptotic perspective // J Cereb Blood Flow Metab. 1997. V. 17(8). P. 815-832.

147. Marggraf W.D., Kanfer J.N. The phosphorylcholine acceptor in the phosphatidylcholinexeramide cholinephosphotransferase reaction. Is the enzyme a transferase or a hydrolase? // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 793(3). P. 346-353.

148. Matsushima K., Hogan M.J., Hakim A.M. Cortical spreading depression protects against subsequent focal cerebral ischemia in rats // J Cereb Blood Flow Metab. 1996. V. 16(2). P. 221-226.

149. McBean D.E., Kelly A.T. Rodent Models of global cerebral ischemia: A Comparison of two-vessel occlusion and four-vessel occlusion // Gen. Pharmac. 1998. V. 30(4). P. 431434.

150. McDonald JR, Ko C, Mismer D, Smith DJ, Collins F. Expression and characterization of recombinant human ciliary neurotrophic factor from Escherichia coli // Biochim Biophys Acta. 1991. V. 1090(1). P. 70-80.

151. Medhurst A.D., Harrison D.C., Read S.J., Campbell C.A., Robbins M.J., Pangalos M.N. The use of TaqMan RT-PCR assays for semiquantive analysis of gene expression in CNS tissues and disease models// Journal of neuroscience methods. 2000. V. 98. P. 9-22.

152. Micheli M., Albi E., Leray C., Magni M.V. Nuclear sphingomyelin protects RNA from RNase action //FEBS Lett. 1998. V. 431(3). P. 443-447.

153. Milbrandt J. A nerve growth factor-induced gene encodes a possible transcriptional regulatory factor// Science. 1987. V. 238(4828). P. 797-799.

154. Miyamoto S., Murphy A.N., Brown J.H. Akt mediates mitochondrial protection in cardiomyocytes through phosphorylation of mitochondrial hexokinase-II // Cell Death Differ. 2008. V. 15(3). P. 521-529.

155. Morioka T., Kalehua A.N., Streit W.J. Characterization of microglial reaction after middle cerebral artery occlusion in rat brain // J Comp Neurol. 1993. Y. 327(1). P. 123132.

156. Napoli C., Lerman L., Nigris F. et. al. c-Myc oncoprotein: a dual pathogenic role in neoplasia and cardiovascular diseases? // Neoplasia. 2002. Y. 4(3). P. 185-190.

157. Nedergaard M., Hansen A.J. Characterization of cortical depolarizations evoked in focal cerebral ischemia//J Cereb Blood Flow Metab. 1993. V. 13(4). P. 568-574.

158. Neuvians T.P., Jascaw I. et al. Standardization strategy for quantitative PCR in human seminoma and normal testis // J. Biotechnol. 2005. V. 117(2). P. 163-171.

159. Nikam S.S., Tennekoon G.I., Christy B.A., Yoshino J.E., Rutkowski J.L. The zinc finger transcription factor Zif268/Egr-1 is essential for Schwann cell expression of the p75 NGF receptor // Mol Cell Neurosci. 1995. V. 6(4). P. 337-348.

160. Nikolaev E., Kaminska B., Tischmeyer W., Matthies H., Kaczmarek L. Induction of expression of genes encoding transcription factors in the rat brain elicited by behavioral training // Brain Res Bull. 1992. V. 28(3). P. 479-484.

161. Nogawa S., Zhang F., Ross M.E., Iadecola C. Cyclo-oxygenase-2 gene expression in neurons contributes to ischemic brain damage // J Neurosci. 1997. V. 17(8). P. 2746-2755.

162. Norton K., Xu J., Gutmann D.H. Expression of the neurofibromatosis I gene product, neurofibromin, in blood vessel endothelial cells and smooth muscle // Neurobiol. of disease. 1995. V. 2. P. 13-21.

163. Ohtani R., Tomimoto H., Kondo T., Wakita H., Akiguchi I., Shibasaki H., Okazaki T. Upregulation of ceramide and its regulating mechanism in a rat model of chronic cerebral ischemia// Brain Res. 2004. V. 1023(1). P. 31-40.

164. Okuno H., Miyashita Y. Expression of the transcription factor Zif268 in the temporal cortex of monkeys during visual paired associate learning // Eur J Neurosci. 1996. V. 8(10). P. 2118-2128.

165. Olney J.W. New mechanisms of excitatory transmitter neurotoxicity // Journal of neural transmission. Suppl. 1994. V. 43. P. 47-51.

166. Orrenius S., McCabe M.J.Jr., Nicotera P. Ca2+-dependent mechanisms of cytotoxicity and programmed cell death // Toxicology Letters. 1992. V. 64-65. P. 357-364.

167. Park T.S., Panek R.L., Mueller S.B., Hanselman J.C., Rosebury W.S., Robertson A.W. et al. Inhibition of sphingomyelin synthesis reduces atherogenesis in apolipoprotein E-knockout mice // Circulation. 2004. V. 110(22). P. 3465-3471.

168. Park T.S., Panek R.L., Rekhter M.D., Mueller S.B., Rosebury W.S. et al. Modulation of lipoprotein metabolism by inhibition of sphingomyelin synthesis in ApoE knockout mice // Atherosclerosis. 2006. V. 189(2). P. 264-272.

169. Patapoutian A., Reichardt L.F. Trk receptors: mediators of neurotrophin action // Curr opin Neurobiol. 2001. Y. 11(3). P. 272-280.

170. Paxinos G., Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Acad. Press, San Diego. 1997.

171. Pera J., Malgorzata Z., Kaminska B., Szczudlik A. Neurotrophic factor expression after focal brain ischemia preceded by different preconditioning strategies // Cerebrovascular Diseases. 2005. V. 19. P. 247-252.

172. Petito C.K., Pulsinelli W.A. Delayed neuronal recovery and neuronal death in rat hippocampus following severe cerebral ischemia: possible relationship to abnormalities in neuronal processes // J Cereb Blood Flow Metab. 1984. V. 4(2). P. 194-205.

173. Petzold G.C., Haack S., von Bohlen O., Priller J., Lehmann T.N., Heinemann U., Dirnagl U., Dreier J.P. Nitric oxide modulates spreading depolarization threshold in the human and rodent cortex // Stroke. 2008. V. 39(4). P. 1292-1299.

174. Pfaffl M.W. A new mathematical model for ralative quantification in real-time RT-PCR // Nucleic Acids Research. 2001. V. 29(9). P. 2002-2007.

175. Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in realtime PCR // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30(9). P. e36.

176. Portera-Cailliau C., Price D.L., Martin L.J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum // J Comp Neurol. 1997. Y. 378(1). P. 70-87.

177. Potaman V.N., Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Nezavibatko V.N. Degradation of ACTH/MSH(4-10) and its synthetic analog semax by rat serum enzymes: an inhibitor study//Peptides. 1993. V. 14(3). P. 491-495.

178. Potaman V.N., Antonova L.V., Dubynin V.A., Zaitsev D.A., Kamensky A.A., Myasoedov N.F., Nezavibatko V.N. Entry of the synthetic ACTH(4-10) analogue into the rat brain following intravenous injection //Neurosci Lett. 1991. V. 127(1). V. 133-136.

179. Ridgway N.D. Interactions between metabolism and intracellular distribution of cholesterol and sphingomyelin // Biochim Biophys Acta. 2000. Y. 1484(2-3). P. 129-141.

180. Robinson R.C., Radziejewski C., Stuart D.I., Jones E.Y. Structure of the brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin 3 heterodimer// Biochemistry. 1995. V. 34(13). P. 41394146.

181. Rodriguez-Tebar A., Dechant G., Barde Y.A. Binding of brain-derived neurotrophic factor to the nerve growth factor receptor // Neuron. 1990. V. 4(4). P. 487-492.

182. Rossi G., Magni M.Y., Albi E. Sphingomyelin-cholesterol and double stranded RNA relationship in the intranuclear complex // Arch Biochem Biophys. 2007. V. 459(1). P. 2732.

183. Ruvolo P.P. Ceramide regulates cellular homeostasis via diverse stress signaling pathways//Leukemia. 2001. V. 15(8). P. 1153-1160.

184. Samonina G.E., Kopylova G.N., Sergeev V.I., Zhuikova S.E., Bakaeva Z.V. Correction of the stomach blood flow as a mechanism of anti-ulcer effects of short proline-containing peptides // Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova. 2001. V. 87(11). P. 1488-1492.

185. Schabitz W.R., Schwab S., Spranger M., Hacke W. Intraventricular brain-derived neurotrophic factor reduces infarct size after focal cerebral ischemia in rats // J Cereb Blood Flow Metab. 1997. V. 17(5). P. 500-506.

186. Sgambato V., Pages C., Rogard M., Besson M.J., Caboche J. Extracellular signalregulated kinase (ERK) controls immediate early gene induction on corticostriatal stimulation//JNeurosci. 1998. V. 18(21). P. 8814-8825.

187. Silverman ES, Collins T. Pathways of Egr-1-mediated gene transcription in vascular biology. Am J Pathol. 1999. V. 154(3). P. 665-670.

188. Soriano M.A., Tessier M., Certa U., Gill R. Parallel gene expression monitoring using oligonucleotide probe arrays of multiple transcripts with an animal model of focal ischemia // J Cereb Blood Flow Metab. 2000. V. 20(7). P. 1045-1055.

189. Sukhatme V.P., Cao X.M., Chang L.C., Tsai-Morris C.H., Stamenkovich D., Ferreira P.C. et al. A zinc finger-encoding gene coregulated with c-fos during growth and differentiation, and after cellular depolarization // Cell. 1988. V. 53(1). P. 37-43.

190. Sukhatme V.P., Kartha S., Toback F.G., Taub R., Hoover R.G., Tsai-Morris C.H. A novel early growth response gene rapidly induced by fibroblast, epithelial cell and lymphocyte mitogens // Oncogene Res. 1987. V. 1(4). P. 343-355.

191. Suzuki S., Tanaka K., Suzuki N. Ambivalent aspects of interleukin-6 in cerebral ischemia: inflammatory versus neurotrophic aspects // J Cereb Blood Flow Metab. 2009. V. 29(3). P. 464-479.

192. Tenniswood M.P., Guenette R.S., Lakins J., Mooibroek M., Wong P., Welsh J.E. Active cell death in hormone-dependent tissues // Cancer Metastasis Rev. 1992. V. 1(2). P. 197220.

193. Tischmeyer W., Grimm R. Activation of immediate early genes and memory formation // Cell Mol Life Sci. 1999. V. 55(4). P. 564-574.

194. Tomassoni M.L., Albi E., Magni M.V. Changes of nuclear membrane fluidity during rat liver regeneration//Biochem Mol Biol Int. 1999. V. 47(6). P. 1049-1059.

195. Tureyen K., Brooks N., Bowen K., Svaren J., Vemuganti R. Transcription factor early growth response-1 induction mediates inflammatory gene expression and brain damage following transient focal ischemia // J Neurochem. 2008. V. 105(4). P. 1313-1324.

196. Viola Magni M.P., Gahan P.B., Albi E., Iapoce R., Gentilucci P.F. Chromatin phospholipids and DNA synthesis in hepatic cells // Basic Appl Histochem. 1985. V. 29(3). P. 253-259.

197. Vladychenskaya I.P., Dergunova L.V., Dmitrieva V.G., Limborska S.A. Human gene MOB: structure specification and aspects of transcriptional activity // Gene. 2004. V. 338(2). P. 257-265.

198. Vladychenskaya I.P., Dergunova L.V., Limborska S.A. In vitro and in silico analysis of the predicted human MOB gene encoding a phylogenetically conserved transmembrane protein //Biomol. Eng. 2002. V. 18(6). 263-268.

199. Voelker D.R., Kennedy E.P. Cellular and enzymic synthesis of sphyngomyelin // Biochemistry. 1982. V. 21(11). P, 2753-2759.

200. V'yunova T.V., Shevchenko K.V., Shevchenko V.P., Bobrov M.Y., Bezuglov V.V., Myasoedov N.F. Specific binding of semax in different regions of the rat brain // Dokl Biol Sci. 2006. V. 410. P. 376-377.

201. Wang X., Shimizu-Sasamata M., Moskowitz M.A., Newcomb R., Lo E.H. Profiles of glutamate and GABA efflux in core versus peripheral zones of focal cerebral ischemia in mice//Neuroscience letters. 2001. V. 313(3). P. 121-124.

202. Wang X., Yue T.L., Barone F.C., Feuerstein G.Z. Demonstration of increased endothelial-leukocyte adhesion molecule-1 mRNA expression in rat ischemic cortex // Stroke. 1995. V. 26(9). P. 1665-1668.

203. Watts C., McConkey H., Anderson L., Caldwell M. Anatomical perspectives on adult neural stem cells // J Anat. 2005. Y. 207(3). P. 197-208.

204. Wisden W., Errington M.L., Williams S., Dunnett S.B., Waters C., Hitchcock D. et al. Differential expression of immediate early genes in the hippocampus and spinal cord // Neuron. 1990. V. 4(4). P. 603-614.

205. Wishcamper C.A., Brooks D.M., Coffin J.D., Lurie D.I. Focal cerebral ischemia upregulates SHP-1 in reactive astrocytes in juvenile mic e// Brain Research. 2003. V.1 974 P. 88-98.

206. Wu D. Neuroprotection in experimental stroke with targeted neurotrophins // NeuroRx.2005. V. 2(1). P. 120-128.

207. Yamaoka S., Miyaji M., Kitano T., Umehara H., Okazaki T. Expression cloning of a human cDNA restoring sphingomyelin synthesis and cell growth in sphingomyelin synthase-defective lymphoid cells // J Biol Chem. 2004. V. 279(18). V. 18688-18693.

208. Yan P., Liu N., Kim G.M., Xu J., Xu J., Li Q. et al. Expression of the type 1 and type 2 receptors for tumor necrosis factor after traumatic spinal cord injury in adult rats // Exp Neurol. 2003. V. 183(2). P. 286-297.

209. Yan S.F., Fujita T., Lu J., Okada K., Shan Zou Y., Mackman N. et al. Egr-1, a master switch coordinating upregulation of divergent gene families underlying ischemic stress // Nat Med. 2000. V. 6(12). P. 1355-1361.

210. Yan S.F., Lu J., Zou Y.S., Soh-Won J, Cohen D.M., Buttrick P.M. et al. Hypoxia-associated induction of early growth response-1 gene expression // J Biol Chem. 1999. V. 274(21). P. 15030-15040.

211. Yang Z., Khoury C., Jean-Baptiste G., Greenwood M.T. Identification of mouse sphingomyelin synthase 1 as a suppressor of Bax-mediated cell death in yeast // FEMS Yeast Res. 2006. V. 6(5). P. 751-762.

212. Yi J.H., Park S.W., Kapadia R., Vemuganti R. Role of transcription factors in mediating post-ischemic cerebral inflammation and brain damage // Neurochem Int. 2007. V. 50(7-8). P. 101410-27.

213. Yoon S.O., Casaccia-Bonnefil P., Carter B., Chao M.V. Competitive signaling between TrkA and p75 nerve growth factor receptors determines cell survival // J Neurosci. 1998. V. 18(9). P. 3273-3281.

214. Yuen E.C., Howe C.L., Li Y., Holtzman D.M., Mobley W.C. Nerve growth factor and the neurotrophic factor hypothesis // Brain Dev. 1996. V. 18(5). P. 362-368.

215. Zhuikova S.E., Badmaeva K.E., Samonina G.E., Plesskaia L.G. Semax and some glyproline peptides accelerate the healing of acetic ulcers in rats // Eksp Klin Gastroenterol. 2003. V. 4. P. 88-92.

216. ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

217. Vladychenskaya I.P., Dergunova L.V., Dmitrieva V.G., Limborska S.A. Human gene MOB\ structure specification and aspects of transcriptional activity // Gene. 2004. V. 338 (2). P. 257-265.

218. Dmitrieva V.G., Torshina E.V., Yuzhakov V.V., Povarova O.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A., Dergunova L.V. Expression of sphingomyelin synthase 1 gene in rat brain focal ischemia.// Brain Research. 2008. V. 1188. P. 222-227.

219. Особенно хочу поблагодарить заведующую Отделом молекулярных основ гентики человека профессора Лимборскую Светлану Андреевну - за высокий профессионализм, постоянный интерес, ценные советы и помощь в подготовке публикаций и диссертационной работы.

220. Хотелось бы выразить глубокую признательность Мясоедову Николаю Федоровичу за своевременную помощь, оказанную при выполнении настоящей работы.

221. Одновременно я хочу поблагодарить всех сотрудников Отдела молекулярных основ генетики человека, у которых я нашла полное понимание, за теплую атмосферу в коллективе.

222. В заключение хочется выразить благодарность дирекции и Ученому совету Института молекулярной генетики РАН за оказанную поддержку в подготовке диссертационной работы.

Информация о работе

Дмитриева, Вероника Германовна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Изменение экспрессии генов, активных в мозге крыс, в условиях фокальной церебральной ишемии под действием семакса и Pro-Gly-Pro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изменение экспрессии генов, активных в мозге крыс, в условиях фокальной церебральной ишемии под действием семакса и Pro-Gly-Pro - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы