Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание векторных конструкций, содержащих гены фунгицидно-бактерицидных пептидов, и анализ полученных с их помощью трансгенных растений

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание векторных конструкций, содержащих гены фунгицидно-бактерицидных пептидов, и анализ полученных с их помощью трансгенных растений"

ОЦ'ЗЬОЯО

На правах рукописи

СЕРДОБИНСКИИ Леонид Александрович

СОЗДАНИЕ ВЕКТОРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ГЕНЫ ФУНГИЦИДНО-БАКТЕРИЦИДНЫХ ПЕПТИДОВ, И АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ С ИХ ПОМОЩЬЮ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

03.00.03 — Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2002

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии растений Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук ЛУНИН В.Г. Научный консультант: доктор биологических наук АГРАНОВСКИЙ A.A.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42.

С диссертацией можно ознако-.. < ься в библиотеке ВНИИСБ РАСХН.

ВЫСОЦКИЙ В.А. кандидат биологических наук СОЛОВЬЕВ A.A.

Ведущая организация

Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН

Зашита диссертации состоится «_»

» 2003 г. в_часов

Автореферат разослан «_»

» 2002 г.

Ученый секретарь ДИССерТЙ* энного кандидат биологическ «йук

МЕЛИКОВА С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В сельском хозяйстве остро стоит проблема поражаемости культивируемых растений различными заболеваниями. В свяги с этим создание трансгенных растений, устойчивых к грибным и бактериальным патогенам, является одним из приоритетных направлений генной инженерии культурных растений. Для получения растений с такими свойствами в их геном вводят чужеродные гены, кодирующие защитные белки (PR) других растений, либо подобные белки животного и бактериального происхождения. Нужно отмстить, что использование генов из растений имеет преимущества по сравнению с применением генов из других источников, поскольку в данном случае не требуется оптимизация яуклеотндного состава для стабильной экспрессии генов.

Среди известных PR белков наибольший практический интерес представляют короткие (30-50 а.к.) цистеин-богатые пептиды, к которым, в частности, относятся дефензины и хитинсвязывающие белки растений. Данные пептиды обладают широким спектром антимикробной активности я оказывают воздействие на патогенные грибы и Грам+ бактерии в микромалярных количествах (10-40 мкг). Важной особенностью этих пептидных антибиотиков является то, что они в отличие от других защитных белков не проявляют токсического действия на клетки животных и человека [Broekaert et al., 1992, 1993]. Поэтому гены этих белков достаточно перспективны для трансгеяоза важнейших сельскохозяйственных культур.

На сегодняшний день выявлено, что среди данных антимикробных пептидов растений высокой фунгицидной активностью обладают дефензины. выделенные из семян редькн {Raphanus sativus) - Rs-AFPl и Rs-AFP2, а фунлщидно-бактерицидной активностью - хитинсвязывающие белки из семян амаранта (Amarcnthus caudatus) Ас-АМР1 и Ас-АМР2. Группой ученых Бельгийского Католического Университета были получены трансгенные растения табака, трансформированные векторами с участками кДНК, кодирующими белки Rs-AFP2 и Ас-АМР2. Показано, что растения, экспресскрутошие белок редьки, проявляли устойчивость по отношению к Грибному патогену Alternaría longipes [Tenas F.R.G. et aL, 1995], Однако, использованная в данных исследованиях нуютеотидная последовательность кДНК дефензина редьки не содержит интрона, наличие которого в кодирующей последовательности гена, как показано, способствует повышению уровня экспрессии белка и стабильности гена в трансгенных растениях [Callis J. et al., 1987, Mascarenhas D. et al., 1990].

В связи с этим представляет практический интерес клонирование геномных копий, кодирующих пептидные антибиотики редькн и амаранта, получение трансгенных растений, содержащих эти гены, дальнейшее изучение их наследования и функционирования в семенном потомстве.

Цель н задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы являлось создание векторных конструкций с природными генами хитинсвязывающего белка амаранта ас-ар, дефензина редьки гз-ар и изучение на модельном растении табаке {ШсоНапа шЬасит) интеграции в геном и функционирования этих генов. Для достижения цели были поставлены следующие задачи;

1. Клонировать и секвенировать полученные геномные копии ас-ар и п-ар, кодирующие пептидные антибиотики амаранта и редьки соответственно;

2. На основе стандартного бинарного вектора рРСУ002 н полученного во ВНИИСБ вектора рН22Кпео создать генетические конструкция, содержащие геномные копии ас-ар и гз-ар под контролем растительных регуляторных элементов, а также - маркерный ген прШ\

3. Получить трансгенные растения табака, содержащие гены ас-ар и гх-ар антимикробных белков амаранта и редыси;

4.Сравнить эффективность трансформации растений при помощи стандартного вектора рРСУ(Ю2 и вектора рН22Кпео, содержащих ген г$-ар\

5. Получить семенное поколение Т| от трансгенных растений с генами ас-ар и гз-ар для изучения наследования и экспрессии этих генов.

Научная новизна. Впервые былн клонированы геномные копии кодирующие дефензин редьки Из-АТРЗ и хиткневяэывающий белок амаранта Ас-АМР2, определены размеры и нуклеотидные последовательности нитронов гена га-ар дефензина редыси Кз-АРРЗ и гена « дефензина редьки Ка-АРР2.

На примере трансгенных растений табака, полученных с помощью созданных нами конструкций, показано, что природные гены антимикробных белков из амаранта и редьки стабильно наследуются при получении семенного потомства путем самоопыления. Наследование происходит согласно законам Менделя и в геноме трансгенных растений данные гены присутствуют в виде единичных копий.

Практическая пеиность работы. В ходе данной работы созданы генетические конструкции, содержащие природные гены антимикробных белков из амаранта и редьки, с помощью которых возможно проведение агробакгериальной трансформация ряда сельскохозяйственных культур. Создана система комплексной молекулярно-генетической оценки трансгенных растений с генами белхов из амаранта и редьки.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы к методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы (156 названий). Работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 5 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Гены антимикробных пептидов из редьки (rs~ap\ и амаранта (aç-ap).

Нуклеогидные последовательности, кодирующие пептидный антибиотик (дефензин) нз редьки, а также - хитинсвязывающнй белок амаранта были получены А,А.Шаденкоаым с помощью ПЦР-амплификадии геномной ДНК в лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ. Полученные нуклеогидные последовательности были клонированы по стандартным методикам [Маниатис с соавт., 1984, Дрейпер с соавт., 1991] в плазмнде pGEM3Z по сайтам Eco RI и ХЪа I, а затем секвенированы по модифицированному методу Сэнгера для определения их первичной структуры [Sanger et al, 1977].

Бактериальные штаммы и ллазмиды.

В работе были использованы штамм Kcoli СА161, и следующие штаммы Agrobacierium tumefaciens: С58С1 (pGV3850), в дальнейшем обозначаемый LGV3850; LBA4404; GV3101 (pMP90RK) и 6000К (или GV31G1 (рМРбОООК)).

Выращивание клеток Kcoli проводили на среде LB, а клеток агробактерий - на среде УЕВ. Молекулярное субклонирование б Е.соН проводили по стандартным методикам [Маниатис с соавт., 1984]. Трансформацию агробактерий проводили на основе метода An G. [1988]. Наличие рекомбинантных ДНК в агробактерик проверяли путем выделения плазмвдной ДНК методом щелочного лизиса [Bimboim et al., 1979] и последующего рестрикционкого анализа.

В работе использовали следующие векторные плазмиды:

pRT104 - плазмидз размером 3,34 т.н.п., содержащая в своем составе 3SS промотор вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК), который обеспечивает конститутивную экспрессию чужеродных генов в растениях, а также -терминатор гена VI ВМЦК;

pPCV002 - стандартный бинарный вектор размером 8,56 т-л.п., с маркерным геном nptîl под контролем промотора P„„ гена копалинсинтазы [Koncz, Schel!, 1986];

pH22Kneo - бинарный вектор размером 8,51 т.н.п, с маркерным геном nptll под контролем тандема из промотора Рцу бактериофага Т5 и î9S-npoMoropa ВМЦК. Данный вектор создан в лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ на основе плазмиды широкого крута хозяев RSF1010 [Шаденков с соавт., 1996].

Методика получения тран^генных растений табака.

Семена табака (Nicotiana tabacum Samsun SRI) проращивали на агаризованной среде Мурасиге-Скуга (МС) в стерильных условиях. Агробактернальную трансформацию проводили при помощи метода инкубирования листовых дисков с агробахтериальной суспензией с

последующей регенерацией фертильных растений [Дрейпер и др, 1991]. Первичную селекцию трансформантов проводили на среде MC с добавлением 50-100 мкг/мл канамицнна. Наличие генов антимикробных белков амаранта я редыш в растениях определяли при помощи ПЦР-анализа с использованием соответствующих праймеров. Часть выявленных трансгенных растений табака высаживали в землю и получали от них семена путем самоопыления. Семенное поколение Т| анализировали при помощи комплексного молекулярного анализа (ПЦР, Саузерн-блоттинг, Вестерн-блотгинг, ОТ-ПЦР).

Методы молекулярного «иализа трансгенных Растений.

Выделение геномной растительной ДНК для ПЦР-анализа проводили по модифицированной экспресс-методике [Edwards et al, 1991]. ПЦР проводилась по стандартной методике на приборах «Терцик» и MJ Research [Методические рекомендации ВНИИСБ, 1998]. Подбор праймеров проводили с использованием компьютерной программы «OLIGO». Синтез праймеров осуществлялся ЗАО «Сивтол». Для анализа трансгенных растений с геном редьки rs-ap использовали праймер PI (5'-ctgccgacagiggtcccaa3gatggaccc-3'), комплиментарный участку 355-промотора, и праймер Р2 (5-tgctctagagrtaacaagggaaataacagatacacttg-3'), комплиментарный концевому участку rs-ap гена. А для анализа трансгеяных растений с геном амаранта ас-ар, использовали праймер PI и праймер РЗ {S'-cgttaacct-ggactaccagcaccagcaagtttag-З'), комплементарный концевому участку ас-ар гена.

Режим амплификации при анализе растений был использован следующий: предварительна« денатурация при 94°С, 5 мин.,-далее проводили 30 циклов амплификации - денатурация при 93°С, 30 сек., отжиг праймеров при 52*С, 1 мин. для гена амаранта (55°С, 1 мин. для гена редьки), синтез при 72°С, I мин., завершающий цикл - 94°С, 30 сек.; 52°С, 5 мин.; 72 С, 5 мин. Продукты ПЦР анализировали после электрофореза в 1% агарозном геле, окрашенном раствором бромистого этвдия.

Для проведения fuioT-гибрмднзации по Саузерну тотальную ДНК выделяли из растений с использованием стандартной методики [Дрейпер и др., 1991]. Перенос HindHI фрагментов растительной ДНК из 1% агарозного геля после электрофореза на фильтр Hybond N+ ("Amersham", Англия) проводили капиллярным путем в 0,4 М NaOH. ДНК зонда метпи с помощью ПЦР в присутствия меченых (¿-[Р32]- дАТФ производства НПО (Обнинск). Радиоавтограф закладывали в кассету Storage phosphor screen и экспонировали в течение 2,5 суток. Сканирование изображения с экрана кассеты проводили при помощи Variable Mode Imager Typhoon 9200 ("Ameisham", Англия).

Наличие экспрессии гена дефешнна редыси определяли с помощью иммунофермеитного анализа (BecveptHwiormitra) по методике Тоубина [Towbm et al.,1979] с применением поликлональных антител кролика (получены в лаборатории молекулярной вирусологии ВНИИСБ) специфичных к гибридному Rs-тиоредоксин белку (получен в лаборатории генной инженерии животных ВНИИСБ). Белковые экстракты из растений получали

экстрагированием в TBS-T буфере в течение I часа при комнатной температуре. Фракционирование белков проводили при помощи электрофореза в ПААГ а трис-трици новой системе в присутствии SDS [Shagger and Von Jagow, 1987].

Транскрипцию генов rs-ap и ас-ар определяли при помощи метода ОТ-ПЦР. Выделение тотальной РНК проводили методом фенолъной экстракции [Comczynskiy, 1993] с использованием набора реактивов, любезно предоставленных лабораторией генной инженерии животных ВНИИСБ, Синтез кДНК осуществляли по стандартной методике [Молекулярная клиническая диагностика. Методы, 1999]. Для определения наличия транскрипции целевого гена, проводили амплификацию кДНК с использованием праймеров Р4 (5'-agtggccaccatgggcgagct- 3') и РЗ к гену ас-ар, Р5 (5f-cagctcggtacceccgaatt- 3') и Р2 к гену rs-ap. Реакционную смесь прогревали 3 мин при +94 °С и проводили 30 циклов амплификации:+94 °С, 15 сек.; +60<|С) 1 мна.;+72°С, 1 мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1 .Анализ нуклеотидных последовательностей генов антимикробных белков редьки н-^марант».

Ген ас-ар хитин-связывающего белка из амаранта и ген rs-ap дефензина редьки были проанализированы при помощи секвенирования по методу Сэнгера с последующим анализом фрагментов ДНК на автоматическом секвенэторе ALF express II (Amersham Biosciences corp., USA) совместно с группой анализа геномов ВНИИСБ.

MVNMKCVALXVIV

atg gtg aac atg aag tgt gtt gea ttg ata gtt ata gtt

М atg к atg A gcg F ttt M atg M atg V gtg D gat P cca S tea M atg G gga

V <stq G qqa E aaa С tot V qtq R aqa G qqa R cqt С P cca 3 aqt G qq<3 M atq

С tq-t С t QC S aut Q caa F ttt G У tao С tgt G q<jt К aaa G que P cca К аа<т

Y tae С tflt G R cgt A gcc 5 agt T act T act V gtg D gat a cac □ caa A get

D gat V gtt A get A gcc T acc К aaa T act A gec к aag N «at P cct T acc D aat

Я get к aaa L ctt A get G sgt A get G ggt s agt P cca G ggt taa

Рисунок 1. Нуклеоткдная последовательность гена ас-ар и соответствующий ему белок (подчеркнута последовательность, кодирующая зрелый пептид; замены аминокислот и нуклеотидов выделены).

Анализ гена ас-ар показал, что его размер - 261 н.п., а нуклеотидная последовательность почти полностью соответствует последовательности кДНК, кодирующей белок амаранта АС-АМР2 [Broekaert et al., 1992]. На основе полученных данных можно говорить о том, что данный ген кодирует сигнальный пептид из 25 а.к., зрелый пеггтид из 30 а.к. и С-концевоЙ пептид из 32 а.к. (рис. 1).

Отличия между последовательностью гена ас-ар и кДНК белка амаранта Ас-АМР2 выявлены в области, кодирующей C-коицевой пептид: I - в этой области ген ас-ар длиннее на триплет ggt, кодирующий глицин (G), 2 - 22-й триплет этой области гена - aat, кодирует аспарагин (N), а не gat, кодирующий аспарагиновую кислоту (D). Выявленные аминокислотные замены не могут влиять на функциональную роль белкового продукта гена ас-ар, поскольку они находятся в последовательности С-концевого пептида, который не отвечает за антимикробную активность.

Анализ клонов К coli содержащих плазмиду pGEM3Z с клонированным в ней геном дефензива редьки показал их неоднородность. Секвенироваяне нуклеотидной последовательности гена пептидного антибиотика из Raphanus sattvus из клонов 1 и 2, получившей название rs-ap, показало, что она обладает размером 237 н.п. и имеет высокую гомологию (99%) с кДНК, кодирующей белок из листьев редьки Rs-AFP3 [Broekaert eta!., 1993). На основе этого можно утверждать, что первые 29 триплетов гена rs-ap кодируют сигнальный пептид, который отвечает за транспорт в апопласт растительной клетки зрелого антимикробного белка, состоящего из 50 аминокислот.

Между 21 и 22 кодирующими триплетами сигнального пептида нами был выявлен интрон из 91 н.п., последовательность которого не была известна ранее (рис. 2).

ggtgagtaac gattttetet tagegegaaa taaegagtet taaattttcc attteagaet atgtgataat ttaacatgat atatatgtge a

Рисунок 2. Нуклеотидная последовательность нитрона г«на rs-ap.

Также нами была проанализирована нуклеотидная последовательность геномной копии дефензнна редьки из клона 3, в результате чего была выявлена ее гомологичность с кДНК, кодирующей белок из семян редьки Rs-AFP2 [Broekaert et al., 1993]. На основе проведенного анализа впервые было показано, что данный ген rs содержит интрон из 100 н.п., который не имеет гомологии с нитроном гена rs-ap (рис.3). Место локализации данных нитронов одинаково.

gtgagtataa tgaccttatc acaagcatgg gttttttttc tttttegtat tatttgataa ttagecttgt gggatatgtg taattaatat gtataaacag

Рисунок 3. Нуклеотидная nоследовательность нитрона m гена rs, гомологичного кДНК, кодирующей белок из семян редьки R.S-AFP2.

S

В отличие от гена rs-ap, ген из клона 3 не был использован для дальнейшего клонирования из-за ряда делений и замен в его нуклеотндной последовательности.

После клонирована« гена rs-ap в бинарных векторах pPCV002 и рН22Кпео было проведено повторное секвенирование, которое показало, что в последовательности гена rs-ap, кодирующей С-терм и нирующую область зрелого пептида, имеется одна нуклеотидная замена цитозина на тимин б позиции -13, которая не оказывает влияние на аминокислотный состав белка, а в позиции от стоп-кодона taa имеется делеция - отсутствует цитотин (рис.4).

MAKFASIVAX.LFAALV atg get aag ttt get tct ate gtc gcc ctt ctc ttc get get ctt gtt

VFAAFEAPTVVEAKLC gtc ttt get get ttt¡&7aa gca сса аса gtg gtg gaa gca aag ttg tac

ERS. SGTWSGVCGSNNA gag acq tea aqt qqa аса tqq tea qaa gtc tgt qqa aae aat aac gca

CKtJQCIRLEGAQHGSC tqc aaq aat cag tgc att cqa ctt qaa qga gca caa eat qqa tct tgc

NYVFPAHKCICYFbVN aac tat gtg tte eet get cae aaq tgt ate tgt tat ttjett gtt aac

SRVRKKHQSLSTtJLSL tct aga gtc eye aaa aat csc сад tct ctc tct sea aat eta tct ctc

SIFLQNNV tct att ttt etc сёд aat aat gtg tga

Рисунок 4. Нуклеоткдная последовательность гена rs-ap и соответствующий ему белок: | - место интрона; | - место делеции; замены аминокислот и нуклеотидов выделены; нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый пептид подчеркнута; нуклеотидная последовательность, кодирующая дополнительные 25 ак. выделена курсивом.

В результате данного изменения можно предположить наличие трансляции терминаторной последовательности, которая приведет к удлинению зрелого пептида на 25 аминокислот. При этом в С-терм инирующей области зрелого пептида будет происходить замена прелина (Р) на лейцин (L), а также - на валин (V) 8-го остатка цистеина (С), который принимает участие в образовании одного из четырех дисульфидиых мостиков третичной структуры зрелого пептида.

Тем не менее, получение трансгеняых растений табака с геном rs-ap является целесообразным для того, чтобы:

во-первых, определить эффективность трансформация модельных I растений табака при помощи стандартного бинарного вектора pPCVOOl и

, вектора pK22rs, который обладает совершенно другим механизмом переноса

генов в растительный геном; j во-вторых, изучить стабильность этого гена в трансгенных растениях и его

1 наследование в семенном поколении.

I

2. Создание векторных конструкций, содержащих гены антимикробны! белков редьки и «маранта.

Для конструирования векторов, обеспечивающих перенос генов rs-ap и ас-ар в растения и экспрессию этих генов, использовали элементы плазмид pRT104, pPCVOÖ2 и pH22Kneo. Плазмида pRT104 содержит последовательности промотора 35S и терминатора гена VI вируса мозаики цветной капусты, которые определяют высокоэффективную экспрессию гетерологичных геноа в растениях. Плазмида рЩ2Кпео создана в лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ и представляет собой бинарный вектор для агробакгериальной трансформации растений. Плазмида рН22Кпео способна к репликации в агробактериях и содержит шоЬА-опТ систему природной плазмиды RSF1010, которая позволяет осуществлять VirD2-независимый перекос целевого гена в ядро растительной клетки, что повышает эффективность трансформации растений, Плазмида рН22Кпео несет также уникальные сайты рестрикции BamHI, Sad, Kpnl, Hindlll, Xbal, которые удобны для клонирования дополнительных маркерных и целевых генов ДЛЯ придания трансгенкым растениям дополнительных полезных признаков. Маркерным геном для селекции рШ2Квео как в бактериях, так и в растениях служит ген неомицйнфосфо7рансферазы nptll [Шаденков A.A. и др., 1996].

Бинарный стандартный вектор pPCV002 сходен с вектором рН22Кпео по размеру (8,56 kBp) и селективному маркеру для растений (nptfl)t но перенос целевого гена в геном растения целиком зависит от продуктов vir-области, находящейся в хелперной плззмиде [Koncz, Schell, 1986), В связи с этим данные векторы были использованы для клонирования генов антимикробных пептидов для дальнейшего их сравнения при трансформации растений.

Для клонирования гена rs-ap в векторах рН22Кпео и pPCV002, а также -гена ас-ар в векторе рН22Кпео, была предложена единая схема. Клонированную в pGEM3Z нуклеотидную последовательность целевого гена гидролизовалн рестрикционными эндонуклеазами EcoRI и Xbal, а затем ее клонировали по сайтам рестрикции EcoRI и Xbal в рИТ104 под контролем промотора 35S и терминатора гена VI ВМЦК. Затем ДНК такой плазмиды и бинарный вектор pH22Kneo (pPCV002) гидролизовалн рестрикщтонной зндонуклеазой HmdUI. ffindIII-фрагмент из плазмиды pRT104, включающий в себя последовательности 35$ промотора, целевого гена и терминатора гена VI ВМЦК клонировали в pH22Kneo (pPCVÖffi). При помощи рестрикционного

анализа отбирали плаамнды, которые включают в себя вектор размером 8,5 т.н,п. н ШшПП- фрагмент размером 1030 н.п (для гена п-ар) или 950 н.п. (для гена ас-ар).

Таким образом, были получены оригинальные конструкции рК22г$, рРСУ002гя, рК22ас, несущие природные гены антимикробных белков из редьки и амаранта (рис, 5), Структура данных векторов была подтверждена рестрикционным картированием, а также - выборочным секвенярованием нуклеотидных последовательностей, входящих в их состав.

Рисунок 5. Генетические карты созданных векторных конструкций с генами антимикробных белков редьки {п-ар) и амаранта (ас-ар).

Полученные векторные конструкции были перенесены в штаммы А^гоЬас!епит Гите/асгепз методом прямой трансформации бактериальных

и

культур, в результате которой были получены следующие штаммы: ЬСУ3850/ рК22гй; 1ХУУ3850/ рК22ас, ЬВА4404/ рК22ге; 6000К/ рК22г$ и вУЗЮ!/ рРСУСККге. С помощью данных штаммов была проведена трансформация растений табака.

3. Анализ пол ученных рнстений-регеиерантов

Первичную селекцию полученных в результате трансформации растений табака проводили на среде, содержащей 100 мкг/мл канамицнна. Наличие генов гз-ар и ас-ар в растениях определяли методом ПЦР (рис. 6 и 7). Предварительно растения выращивали на среде МС без цефотаксима для того, чтобы исключить из анализа нетрансгенные растения, дающие положительный результат по ПЦР за счет остаточной контаминации агробактериямн.

1234 $6789 10 И

Рисунок 6. Результаты ПЦР-аналнза растений табака, трансформированных штаммом ЬС\'3850/рК22ас: 1-маркер молекулярной массы фрагментов ДНК риС18/т$р1; 2-вода; 3-плазмида рК22ас; 4- рК22ас+ ДНК нетрансгенного табака; 5- ДНК нетрзнсгенного табака; 6-11 - ДНК растений-трансформантов (№№ 1,3,7,8,9,10).

Рисунок 7. Результаты ПЦР-аналига растений табака, трансформированных агробяктернальными штаммами, содержащими векторы с геном гь-арх 1-маркер молекулярной массы фрагментов ДНК риС18Лщр1; 2- вода; 3- плазмяда рК22г$; 4-7 - ДНК растений, трансформированных штаммом ШУ3850/рК22п; {№№ 3, б, 7, 14); 8 - ДНК нетрансгенного табака; 9-11 - ДНК растений, трансформированных штаммом ОУЗМ1/рРСУСЮ2ге (№№ 1,2,6).

В связи с тем, что в исследуемых растениях могут присутствовать собственные гены пептидных антибиотиков, гомологичные введенным трансгенам, для идентификации трансгенных растений методом ПЦР мы использовали праймеры, комплиментарные промоториой области 35Б вируса мозаики цветной капусты и концевому участку гена п-ар (или концевому участку гена ас-ар). Длина амплифицируемого фрагмента в случае гена редьки-528 н.п., а в случае гена амаранта - 514 н.п.

Результаты трансформации приведены в таблице 1. Из представленных данных следует, что трансформация при помощи штаммов 1Х}У 3850, 6000К и ЬВА 4404, содержащих конструкцию рК22г$, вдет с большей эффективностью, чем при помощи штамма вУ 3 101 /рРС У002гз.

Таблица 1.

Результаты трансформации растений Nicotiana tabacum SRI с помощью конструкций, содержащих гены ас-ар и rs-ap.

Конструкция Штамм агробактернй Кол-во эксплан-тов Кол-во Кш-уст. растений Кол-во трансгенных растений <пцр+) Эффективность трансформации ПЦР+/ Кт-уст. (%)

pK22rs LGV3850 55 18 6 33,3

6000К {GV3101 (рМРбОООК)) 80 23 4 17,4

LBA4404 80 39 б 15,4

pPCV002rs GV3101 (pMP90RK) 55 30 3 10

рК22ас LGV3850 97 10 4 40

Отличительной особенностью вектора рК22гз является то, что он содержит тоЬА-опТ систему плазм иды К5Й010, при участии которой осуществляется перенос целевого гена. Данная система позволяет осуществить трансгеноз и в случае УЫЭ2 дефектного штамма бОООК/ рК22гз, поскольку белок МоЬА выполняет "пилотную" функцию вместо Уц--02 белка.

Штаммы бУЗЮ! и 6000К (ОУЗЮ1 (рМРбОООК)) наиболее близки по своим характеристикам. Эффективность трансформация табака штаммом

6000К/рК22гз в 1,7 раза выше эффективности трансформации штаммом

СУ3101/рРСУ002г$. В связи с этим можно утверждать, что использование векторной конструкции созданной на основе бинарного вектора рН22Кпео для переноса целевого гена в геном растения более эффективно по сравнению со стандартным бинарным вектором.

Из 19 отобранных по ПЦР растений, содержащих ген дефензина редьки, в 2-х образцах с помощью метода Вестерн-блотшнга была обнаружена экспрессия Яб-АР белка (рис.8). При этом отмечено, что полученные нами данные Вестерн-блоттинга показывают сходство в молекулярных массах белкового продукта гена гх-ар из трансгенных растений табака и Ия белка выделенного из семян редьки (5 кД). Подобные результаты были получены при изучении экспрессии гена п-ар в трансгениых томатах [Парашина Е.В., 1999]. Эти данные не соответствуют нашему предположению об увеличении трансгенного белка на 25 аминокислотных остатка (3 кД), сделанному при анализе нуклеотмдной последовательности гена гз-ар. Возможно, этот участок подвергается процессиигу, как это происходит в случае С-концевого пептида белков амаранта.

12 3 4

Рисунок 8. Результаты Вестерн-блоттинга растений

табака, трансформированных штаммом Ьй У3850/рК22 гя:

1- К5 белок из семян редьки (5 кД);

2- белок нз листьев трзксгенного табака (3850гз №3);

3- белок из листьев трансгенного табака (3850ге №7); 4- белок из листьев нетрал стенного табака.

От 10 растений с геном дефензина редьки и от 2 растений с геном антимикробного белка амаранта путем самоопыления было получено семенное поколение Т).

4. Сегрегация семенного поколения

Для изучения наследования генов п-ар и ас-ар в поколении Т| семена линий линий 3850ге-7, 002п-1, 4404гз-1, 3850ас-7, 3850ас-1 и семена кетрансгекных растений, были высажены на среду МС для проращивания без канамицина.

Среди полученных растений при помощи ПЦР-амплификаиин был проведен сегрегационный анализ. Соотношение между трансгенными и нетрансгеннымн по гену га-ар растениями у линий 3850га-7 и 002г&-1 близко к соотношению 3:1, что свидетельствует о моногенном характере наследования этого гена (табл.2).

н

Таблица 2.

Анализ семенного поколения Т] трансгенных растений табака« содержащих ген дефектна редьки п-ар.

Линия Количество исследованных растений Количество растений, содержащих ген г$-ар (ПЦР+) Расщепление по гену п-вр (ПЦР+/ ПЦР-)

3850га-7 55 43 3,3:1

002«-1 40 29 2,6:1

4404ге-1 41 34 5:1

Контроль (дикий тип) 51 — —

Поскольку в случае линии 4404ге-1 наблюдается отклонение от расщепления 3:1, была проведена оценка соответствия между наблюдаемыми и ожидаемыми распределениями по критерию (табл.3). Таким образом, было выявлено, что расщепление по гену г$-ар в потомстве линии 4404ге-1 носит также моногенный характер.

Таблица 5.

Вычисление теоретически* частот и критерия соответствия (хг) для расщепления в семенном потомстве табака Т] трансгенной _линии 4404гу1 по наличию гена п-ар._

Показатель Растения Сумма

ПЦР+' ПЦР-

Ожидаемое расщепление (Но) 3 1 4

Наблюдаемые частоты (0 34 7 41

Ожидаемые частоты (Р) 30,75 10,25 41

Разность 17) -3,25 3,25 —

Квадрат разности (£■ Р)"1 10,56 10,56 —

Отношение (Г- 0,343 1,03 1,373

Вывод ^=1,373< ^м=3,84; Но ке отвергается

Отклонение от менделевского расщепления нами было обнаружено и в семенном потомстве Т) двух трансгенных линий табака с геном ас-ар (табл.4).

Таблица 4.

Анализ семенного поколения Т| трансгенных растений табака, содержащих ген хнтинсвязываюшего пептида амаранта ас-ар.

Линия Количество исследованных растений Количество растений, содержащих ген ас-ар (ПЦР+) Расщепление по гену ас-ар (ПЦР+/ПЦР-)

3850ас-7 53 32 1,5:1 6,044

3850ас-1 43 27 1,6:1 3,419

Контроль (дикий тип) 42 -- - -

Х**=3,84 Р=0,05, п=2).

Для опенки достоверности совпадения полученных данных с соотношением расщепления при моногенном наследовании был использован метод Значение X для линии 3850ас-1 ниже значения х? при вероятности Р=0,05, следовательно, полученное расщепление среди растений этой линии действительно является отклонением от соотношения 3:1. Оценка по методу показала, что наследование гена ас-ар в потомстве линии 3850ас-7 не является моногенаым.

Для определения количества копий генов ас-ар и г$-ар в геноме исследуемых растений нами был проведен Саузерн-блоттинг, при проведении которого наряду .с изучаемыми образцами на фильтр были перенесены 2 образца контрольной ДНК из нетрансгенного табака, к хоторым были добавлены эквиваленты 1 и 5 копий гена ас-ар {пор) на каждый гаплоидный геном растения [Дж, Дрейпер к др.,1991], Радиоактивно меченые гены ас-ар и гх-ар гибридизовались с ДНК изучаемых растений (ТО во всех образцах, за исключением контроля, в виде одной полосы одинаковой подвижности. Для гена амаранта длина фрагмента составляет 950 н.п., а для гена редьки-1030 н.п. Интенсивность полос в исследованных образцах соответствует интенсивности полосы контрольного образца с 1 копией (рис. 9 и 10).

В связи с полученными данными можно говорить о том, что наследование генов гз-ар и ас-ар в изученных линиях трансгенных растений табака происходит согласно законам Менделя, встроенные гены представлены в геноме растений одной копией.

1 2345 б 7 8 9 10

950 н.п..

Рисунок 9, Б-ют-гнбрнднзация по Саузерну геномных ДНК растений поколения Т] трансгенной линии табака 3850ас-1:1-7 - растения №№ 41,40, 34, 22, 16, 8, 6; 8- ДНК нетрансгенного табака; 9- 5 копий гена ас-ар; 10- 1 копия гена ас-ар.

Рисунок 10. Блот-гибриднзация по Саузерну геномных ДНК растений поколения Т] трансгенных линий табака с геном гз-ар: 1-2 - растения линии 002г5-1 (ДУГ® 9, 8); 3-4 — растения линии 3850г$-7 (№№ 3,2); 5-6 - растения линии 4404гв-1 (№№ 8, 34); 7- ДНК нетрансгенного табака; 8- 5 копий гена п-ар; 9- 1 копия гена гз-ар.

При проведении Вестерн-блоттинга среди растений с геном rs-ap поколения Tt, отобранных по ПЦР, соответствующего Rs-AP белка в растениях обнаружено не было. Проведение ОТ-ПЦР показало наличие транскрипта соответствующего по размеру мРНК гена rs-ap (240 н.п.) только в растениях линии 4404rs-I (рис.Ц).

В трансгенных растениях линий 385Örs-7 и 002гз-1, как и в случае нетрансгенного табака, характерный продукт реакции отсутствовал. При проведении реакции с плазмидой pK22rs был получен фрагмент размером 331 н.п., который соответствует гену rs-ap с интроном (240 + 91 н.п.).

Вероятно, в семенном поколении происходит замолкание экспрессии гена дефензипа редьки, а в случае растений с наличием экспрессии образующиеся количества соответствующего Rs-AP белка невелики и их невозможно определить методом Вестсрн-блоттинга.

При помощи ОТ-ПЦР было проанализировано 8 растений семенного поколения Т| липни 3850ас-1 с геном ас-ар на наличие продукта транскрипции этого гена. В результате ПЦР с полученной кДНК во всех 8-ми образцах был выявлен фрагмент размером 270 н.п. соответствующий транскрияту гена ас-ар, который отсутствовал у нетрансгенного табака (рис. 12).

12345 6789

1030 н.п.

Цш щ у

1234 56 789 10 И

240 н.п.

«-331 н.п.

Рисунок 11. Результаты ОТ-ПЦР анализа растений табака с геном гъ-ар поколения Т^ 1« 11 -маркер молекулярной массы фрагментов ДНК риС1$/пвр1; 2-вода; 3 - ДНК нетрансгенного табака; 4-6 растения линии 3850ге-7 (№№ 3, 2, 8); 7-8 растения линии 4404гз-1 (№№ 4, 8); 9- растение линии 002ге-1 (№9); 10- плазмида рК22г$.

Таким образом, можно говорить о наличии транскрипции гена ас-ар в растениях семенного потомства трансгенных Табаков, а также - предположить трансляцию этого гена и экспрессию антимикробного белка Ас-АР в этих растениях.

Рисунок 12. Результаты ОТ-ПЦР анализа растений табака с геном ас-ар поколения Т| линии 3850ас-1: 1- маркер молекулярной массы фрагментов ДНК р11С1 б/пир]; 2 - вода; 3- ДНК нетрансгенного табака; 4-11 растения №№ 2, б, 8,16,23,34,35,40; 12- плазмида рК22ас.

Результаты, полученные в итоге проделанной работы, подтверждают эффективность использования созданных векторных конструкций рК22ге, рРСУ0О2ге, рК22ас для трансформации растений генами дефензина редьки г-$-ар и хитинсвязываюшего белка амаранта ас-ар. Данные гены, интегрированные в геном растения, транскрибируются и экспресснруются, а также стабильно наследуются в семенном поколении.

Созданная система комплексной мслекулярно-генетическоё оценки трансгенных растений с генами ас-ар и п-ар в настоящее время широко используется для анализа трансгенных растений различных культур с генами антимикробных белков амаранта и редьки.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

270 н.п.-*

выводы

1. Впервые лроклонированы геномные копии ас-ар и к-ар, кодирующие хитинсвязывающий белок амаранта Ас-АМР2 и дефензин редьки Кз-АБРЗ, соответственно, определены их нуклеотидЕые последовательности, в том числе- нуклеотндная последовательность нитрона гена гз-ар. Определена нуклеотидная последовательность гена м, гомологичного «ДНК дефензина редьки Кл-АГК, и содержащегося в нем нитрона. Выявлено, что интрон гена пч1р состоит из 91 н.п., а интрон гена га - из 100 н.п. и последовательности данных нитронов не гомологичны.

2. Созданы векторные конструкции рК22ге, рК22ас, рРСУ002гз, содержащие гены ас-ар и гз-ар антимикробных пептидов из амаранта и редьки под контролем конститутивного 358-промотора и терминатора гена VIВМЦК, а также маркерный ген пр(П. Показано, что данные конструкции позволяют осуществлять эффективный перенос генов антимикробных белков амаранта и редьки в геном двудольных растений.

3. Установлено, что использование конструкции рК22ге, созданной на основе вектора рН22Кпео, позволяет осуществлять более эффективную трансформацию растений геном гз-ар, по сравнению с конструкцией, созданной на основе стандартного бинарного вектора рРСТ002.

4. Показано, что в поколении То трансгенных растений табака ген гз-ар экспрессируется, в результате чего образуется соответствующий Яа-АР белок, а в поколении Т| экспрессии этого гена не наблюдается. Гены ас-ар и гз-ар транскрибируются в трансгенных растениях семенного поколения Т|.

5. Выявлено, что в геноме растений табака семенного поколения Ть полученных путем самоопыления от трансгенных растений с генами ас-ар и гз-ар, данные гены представлены одной копией. Путем проведения сегрегационного анализа установлено, что гены антимикробных белков амаранта и редьки ас-ар и гз-ар стабильно наследуются согласно законам Менделя.

6. Создана система комплексной молекулярно-генегаческой оценки трансгенных растений с генами ас-ар и гз-ар антимикробных белков из амаранта и редьки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сердобннский ЛЛ, Ковалева М.В., Аветисов В.А. Определение наследования гена пептидного антибиотика редьки в поколении Ti трансгенных растений табакаЛТезисы докладов Международной конференции ((Молекулярные механизмы генетических процессов н биотехнология», Москва-Минск, 18-21 ноября 2001 г., с. 278.

2. НародицкиЙ B.C., Лунин В.Г., Анисимова С.С., Сердобннский JIA., Лаврова Н.В., Ковалева М.В. Ген rs-ap из Raphanus sativus, вектор для трансформации растений и способ получения трансгенного растения. Патент РФ Jfe 2176669, С12N 15/29, 15/82,2001; Б.И. №34,2001.

3. Сердобннский Л.АЧ Ковалева М.В., Аветисов В.А. Определение наследования генов пептидных антибиотиков амаранта и редьки в поколении Ti трансгекных растений табака.// Тезисы докладов II -ой Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 18-19 октября 2000 г., с.228.

4. Е.В. Парашина, Д. А. Сердобннский, Е.Г. Калле, Н.В. Лаврова, В.А.Аветисов, ВХ.Лунин, Б.С .НародицкиЙ. (2000), Получение трансгенных растений рапса и томата, экспрессирутащих ген дефензина редьки. Физиология растений, т. 47, .Ns3, с.471-478.

5. S.V. Dolgov, V.G.Lebedev, S.S. Anisimova, N.V. Lavrova, L-A. Serdobinskiy, et al. (1999). Phytopathogen resistance improvement of horticultural crops by plant-defensin gene introduction. Developments in plant breeding. Genetics and breeding for crop quality and resistance, p. 111-118,

6. Serdobinskiy LA, Shadenkov A.A., Kovalyova M.V., Lavrova N.V., Limin V.G.. Transgenic tobacco plants carrying rs and ac genes of antimicrobial peptides (defenstns).// In proceeding IX International Congress "Molecular and Plant Microbe Interactions", Amsterdam, July 25-30, 1999, p. 148.

7. Сердобннский Л.А., Шаденков A.A., Ковалева M.B., Лунин В.Г. Создание генетических конструкций, содержащих гены дефензиков и анализ трансформированных с помощью них растений табака.// Тезисы докладов IV съезда Общества Физиологов Растений России, Москва, 4-9 октября 1999 г., с. 693.

8. Шаденков А.А, Ляпкова Н.С., Сердобннский Л.А,, Ковалева MS, Майсурян А.Н., Шемякин М.Ф. Получение трансгенного табака н хрена, несущих ген фунгицидного пептида амаранта. // Тезисы докладов И-го Международного Симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования». Пугцино, 16-20 июня 1997 г., Т.1, с. 89.

9. Лунин В,Г., Анисимова С.С., Шаденков A.A., Сердобннский Л.А, Хитин-связывающие пептиды из семян Amaranthus caudatus L.// Тезисы докладов 11-го Международного Симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования». Пущино, 16-20 июня 1997 г., Т.1, с. 88.

Объем 1,25 п.л.

Зак.519

Тираж 100 экз.

АНО «Издагельство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сердобинский, Леонид Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Плазмиды Agrobacterium как векторная система для введения гетерологичных генов в высшие растения.

1.1. Плазмиды агробактерий и опухолеобразование у высших растений.

1.2. Процесс переноса Т-ДНК из агробактерии в растительную клетку.

1.3. Интеграция Т-ДНК в геном растения.

1.4. Конструирование бактериальных векторов для введение генов в растения.

1.4.1. Т-ДНК как природный экспрессионный вектор.

1.4.2. Коинтегративные векторы и бинарные векторы.

1.4.3. Маркерные гены.

1.4.4. Промоторы.

Глава 2. Антимикробные белки и их использование для защиты растений.

2.1. Классификация антимикробных белков.

2.2. Растительные дефензины.

2.2.1. Структура растительных дефензинов.

2.2.2. Экспрессия дефензинов в органах растений.

2.2.3. Антимикробные свойства растительных дефензинов.

2.2.4. Механизм действия растительных дефензинов.

2.3. Антимикробные белки амаранта.

2.3.1. Структура хитинсвязывающих белков амаранта.

2.3.2. Антимикробная активность белков амаранта.

2.4. Получение трансгенных растений с генами антимикробных белков.

2.4.1. Трансгенные растения, устойчивые к патогенным бактериям.

2.4.2. Трансгенные растения, устойчивые к грибным патогенам.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Методы молекулярного клонирования в бактериях.

3.1.1. Бактериальные штаммы и используемые среды.

3.1.2. Клонирование плазмидной ДНК в агробактериях.

3.1.3. Анализ клонированных генов.

3.2 Методика получения трансгенных растений табака.

3.3. Методы анализа трансгенных растений.

3.3.1 Выделение растительной геномной ДНК.

3.3.2. Полимеразная цепная реашщя (ПЦР).

3.3.3. Блот-гибридизация растительной ДНК (по Саузерну).

3.3.4. Реакция обратной транскрипции с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР).

3.3.5. Иммуноферментный анализ (Вестерн-блоттинг) трансгенных растений с геном rs-ap.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 4. Создание векторных конструкций с генами антимикробных белков.

4.1. Создание векторной конструкции с геном амаранта ас-ар.

4.2. Создание векторных конструкций с геном редьки rs-ap.

Глава 5. Анализ полученных трансгенных растений табака с генами антимикробных белков редьки и амаранта.

5.1. Определение эффективности трансформации табака при помощи созданных векторных конструкций с генами антимикробных белков редьки и амаранта.

5.2. Изучение наследования генов rs-ap и ас-ар в поколении Ti трансгенных растений табака.

5.3. Изучение транскрипции и трансляции встроенных генов rs-ap и ас-ар в поколениях Т0 и Ti трансгенных растений табака.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание векторных конструкций, содержащих гены фунгицидно-бактерицидных пептидов, и анализ полученных с их помощью трансгенных растений"

В сельском хозяйстве остро стоит проблема потери урожая вследствие заражения культурных растений бактериальными и грибными патогенами и до недавнего времени она была трудно разрешима. Новые возможности в решении этих вопросов были получены благодаря активному изучению механизмов защиты растений против фитопатогенов и выявлению важной роли белков в этом процессе. Интенсивное изучение структуры и функций антимикробных пептидов, исследование их генетической обусловленности может помочь в создании методами генной инженерии трансгенных культурных растений, устойчивых к различным заболеваниям.

Создание трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам, является в последние годы одним из главных направлений генной инженерии культурных растений. Это достигается главным образом путем введения в них чужеродных генов, кодирующих защитные белки, накопление которых в тканях растений губительно для патогенов. Однако большинство известных защитных генов могут придавать устойчивость к одному или нескольким патогенам. В связи с этим, для защиты растений от патогенных грибов и бактерий очень перспективны гены, отвечающие за синтез пептидов, обладающих широким спектром фунгицидно-бактерицидного действия. К таким белкам принадлежат короткие цистеин-богатые белки, получившие название дефензины (от англ. defense - защита), а также - хитинсвязывающие белки.

В растениях дефензины были открыты в 1990 году [Colilla et al, 1990, Mendez et al.,1990]. Дефензины обнаружены у многих представителей таких важных для сельского хозяйства семейств, как Злаки, Крестоцветные, Сложноцветные, Бобовые, Пасленовые и других. Растительные дефензины -новый класс антимикробных пептидов, проявляющих структурную и функциональную гомологию с их двойниками у животных - дефензинами насекомых и млекопитающих, чье участие в защите организма хорошо установлено. Ряд доказательств подтверждают представление о том, что растительные дефензины - важные компоненты защитной системы растений: во-первых - нахождение на периферии различных органов, во-вторых - их производство в случае заражения патогеном, в-третьих - трансгенные растения, конститутивно экспрессирующие эти белки, обладают повышенной устойчивостью к заболеваниям. Для хитинсвязывающих белков также показана ингибирующая активность по отношению к патогенным микроорганизмам, а также - насекомым. Положительным моментом в характеристике этих белков является то, что они воздействуют на патогены в микромолярных количествах (10-40 мкг/мл). Среди известных на сегодняшний момент растительных дефензинов высокой антимикробной активностью обладают дефензины редьки (в частности - Rs-AFP2, R.S-AFP3), а среди хитинсвязывающих белков - белки амаранта (Ас-АМР2) [Broekaert et al., 1992а; Terras et al., 1995].

Поскольку эти пептиды короткие и состоят из 30-50 а.к., кодирующие их гены также обладают небольшими размерами (200-400 н.п.). Такая организация значительно облегчает процессы клонирования этих генов и трансформации ими растений.

В последнее время достаточно остро стоит вопрос биобезопасности в отношении получаемых генетически модифицированных организмов (ГМО): будут ли данные организмы опасны при попадании в окружающую среду и в качестве пищи для человека? В связи с этим необходимо отметить, что отличительной особенностью дефензинов редьки и антимикробных белков амаранта является то, что они не проявляют токсического действия на клетки животных и человека [Broekaert et al, 1992а, 1993].

Все выше сказанное о белках из редьки и амаранта предполагает возможность эффективного, а главное - безопасного применения генов этих белков для трансгеноза важнейших сельскохозяйственных культур.

Агробактериальная трансформация известна как наиболее оптимальный способ введения чужеродных генов в двудольные растения. В связи с этим, достаточно актуальна проблема создания генетических конструкций, обеспечивающих высокий уровень трансформации и экспрессии целевого гена. 7

От патогенов в большей степени страдают вегетативные органы растений. Поэтому экспрессия в них генов антимикробных белков, особенно -обладающих более высокой физиологической активностью пептидов из других растений, должна способствовать появлению необходимой устойчивости к патогенам у всего растения.

Нужно отметить, что несмотря на достаточную изученность строения и свойств антимикробных белков редьки и амаранта, в настоящее время насчитывается небольшое количество работ по получению растений экспрессирующих эти белки [Terras et al., 1995, De Bolle et al., 1996, De Bondt et al, 1998].

В связи с вышеизложенным, настоящая работа посвящена анализу полученных при помощи ПЦР амплификации в лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ геномных копий ас-ар и rs-ap, кодирующих хитинсвязывающий белок амаранта и дефензин редьки соответственно, созданию векторных конструкций с этими генами для проведения агробактериальной трансформации растений, а также - изучению на модельном растении табаке (Nicotiana tabacum) интеграции в геном и функционирования этих генов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сердобинский, Леонид Александрович

ВЫВОДЫ

1. Впервые проклонйрованы геномные копии ас-ар и rs-ap, кодирующие хитинсвязывающий белок амаранта Ас-АМР2 и дефензин редьки Rs-AFP3, соответственно, определены их нуклеотидные последовательности, в том числе - нуклеотидная последовательность интрона гена rs-ap. Определена нуклеотидная последовательность гена rs, гомологичного кДНК дефензина редьки Rs-AFP2, и содержащегося в нем интрона. Выявлено, что интрон гена rs-ap состоит из 91 н.п., а интрон гена rs - из 100 н.п. и последовательности данных интронов не гомологичны.

2. Созданы векторные конструкции pK22rs, рК22ас, pPCV002rs, содержащие гены ас-ар и rs-ap антимикробных пептидов из амаранта и редьки под контролем конститутивного 358-промотора и терминатора гена VI ВМЦК, а также маркерный ген nptll. Показано, что данные конструкции позволяют осуществлять эффективный перенос генов антимикробных белков амаранта и редьки в геном двудольных растений.

3. Установлено, что использование конструкции pK22rs, созданной на основе вектора рН22Кпео, позволяет осуществлять более эффективную трансформацию растений геном rs-ap, по сравнению с конструкцией, созданной на основе стандартного бинарного вектора pPCV002.

4. Показано, что в поколении Т0 трансгенных растений табака ген rs-ap экспрессируется, в результате чего образуется соответствующий Rs-AP белок, а в поколении Ti экспрессии этого гена не наблюдается. Гены ас-ар и rs-ap транскрибируются в трансгенных растениях семенного поколения Ть

5. Выявлено, что в геноме растений табака семенного поколения Ть полученных путем самоопыления от трансгенных растений с генами ас-ар и rs-ap, данные гены представлены одной копией. Путем проведения сегрегационного анализа установлено, что гены антимикробных белков амаранта и редьки ас-ар и rs-ap стабильно наследуются согласно законам Менделя.

6. Создана система комплексной молекулярно-генетической оценки трансгенных растений с генами ас-ар и rs-ap антимикробных белков из амаранта и редьки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что введение в геном растений гетерологичных генов устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам может приводить к значительному положительному результату. Среди генов устойчивости представляют практический интерес гены, кодирующие короткие цистеин-богатые белки из амаранта и редьки. Структура данных белков хорошо изучена, показана их антимикробная активность к широкому кругу бактериальных и грибных патогенов растений in vitro. Также были получены трансгенные растения при помощи векторных конструкций содержащих кДНК антимикробных белков из семян амаранта Ас-АМР2 и редьки Rs-AFP2 [Broekaert et al., 1992,1995].

В связи с этим проведена работа по анализу и клонированию геномных копий кодирующих хитинсвязывающий белок амаранта Ас-АМР2 и дефензина из листьев редьки Rs-AFP3, При этом впервые были определены нуклеотидные последовательности и размеры интронов геномных копий дефензинов редьки RS-AFP2 и RS-AFP3.

Гены из амаранта (ас-ар) и редьки {rs-ap) были получены при помощи ПЦР в лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ. Затем ген rs-ap под контролем 325S промотора и терминатора ВМЦК был клонирован в бинарных векторах pPCV002 и рН22Кпео, а ген ас-ар под контролем тех же регуляторных элементов - в рН22Кпео. Вектор рН22Кпео, созданный в лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ, осуществляет перенос целевых генов за счет MobA-OriT системы плазмиды RSF1010, что отличает ее от стандартных бинарных векторов (в частности - от вектора pPCV002).

При помощи созданных конструкций была проведена агробактериальная трансформация растений табака, анализ которой показал, что перенос гена rs-ap в растения осуществляется более эффективно при помощи конструкции, созданной на основе рН22Кпео, Подобные результаты были получены и другими исследователями [Парашина 1999, Лебедев 2000].

81

Полученные векторные конструкции рК22ас, pK22rs, pPCV002rs нашли применение для агробактериальной трансформации растений таких сельскохозяйственных культур как томаты, картофель, капуста, малина, рапс, клевер, люцерна, кукуруза, свекла, яблоня, груша, земляника, морковь.

От трансгенных растений табака с генами rs-ap и ас-ар путем самоопыления было получено семенное поколение Ть растения которого были подвергнуты комплексному молекулярному анализу (ПЦР, ОТ-ПЦР, Саузерн- и Вестерн-блоттинг).

Изучение наследования генов rs-ap и ас-ар показало, что оно происходит согласно законам Менделя и гены присутствуют в геноме растений в виде единичных копий.

Экспрессия гена rs-ap, обнаруженная у двух трансгенных растений табака, в поколении этих растений не сохранялась, что можно объяснить за счет явления «замолкания » генов в семенном поколении трансгенных растений. Для гена ас-ар в поколении Ti линии 3850ас-1 и для гена rs-ap в поколении Tj линии 4404rs-l показано наличие транскрипции.

Таким образом, была создана система комплексной молекулярно-генетической оценки трансгенных растений с генами ас-ар и rs-ap. Данная система в настоящее время широко используется для анализа трансгенных растений различных культур с генами антимикробных белков амаранта и редьки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сердобинский, Леонид Александрович, Москва

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки /М.: Мир, 1994, Т.2. С. 15-16.

2. Дрейпер Дж„ Скотт Р., Кумар А. и др. Генная инженерия растений. / Под ред. А. М. Колчинского. М,: Мир, 1991, С, 262,277-303.

3. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская А.А. и др. Нестабильность экспрессии маркерного гена nptll у трансгенных растений табака// Физиология растений. 2000. - Т. 47. - №3. - С. 446-452.

4. Зверева С.Д., Романов Г,А. Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования// Физиология растений. 2000, - Т, 47, - №3. - С. 479-484.

5. Клонирование ДНК. Методы,/ Под ред, Гловера Д. М.: Мир,- 1988.-С.144-147, 317-345, 363.

6. Лебедев В.Г. Генно-инженерные методы в селекции груши обыкновенной на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам.// Автореф. канд. дисс., 2000.

7. Левенко Б. Генная инженерия растений/ М.: Школьник, 2000.

8. Ли А,, Тинланд Б, Интеграция Т-ДНК в геном растений: прототип и реальность, // Физиология растений. 2000. - Т. 47. - №3. - С. 354-359,

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование,/ Под ред. Баева А. А. и Скрябина К. Г. М.: Мир, 1984.

10. Ю.Молекулярная клиническая диагностика. Методы./ Под редакцией С. Херрингтона и Дж, Макли, М,: Мир, 1999, С. 354-357.

11. П.Парашина Е.В. Создание и характеристика трансгенных форм томатов, экспрессирующих ген дефензина редьки Rs-AFP2// Автореф. канд. дисс., 1999.

12. Пирузян Э.С., Адрианов В.М. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений./М.:Наука, 1985, С.62-73.

13. Рыбчин В.Н, Основы генетической инженерии/СПб,: СПбГТУ, 1999, С.372-380.

14. Современные методы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. Методические рекомендации ВНИИСБ/М,;МСХА, 1998.-С. 59-66, 71-75.

15. Шаденков А. А., Ковалёва М. В., Кузьмин Е. В. и др. Vir D2 независимый, но Mob-A зависимый перенос ДНК плазмиды широкого круга хозяев RSF 1010 из агробактерии в ядро растительной клетки. // Молекулярная биология. 1996. - Т. 30. - Вып. 2. - С. 458-464.

16. Alexander D., Goodman R.M., Gut-Rella М. et al. Increased tolerance to two Oomycete pathogens in transgenic tobacco expressing pathogenesis-related protein la// Proc. Natl. Acad.Sci.USA.- 1993.-V.90.- P.7327-7331.

17. Allen A.K., Neuberser A, and Sharon N. The purification composition and specificity of wheat-germ agglutinin// Biochem, J.-1973.- V.131.- P.155-162.

18. An G., Ebert P.R., Mitra A., Ha S.B. Binary vectors.// Plant molecular biology manual. Ed. Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dodrecht: Kluwer Acad. Publ.-1988.-P.l-19.

19. Barrell P.; Conner A.; Hickford J. Transformation of potato (Solarium tuberosum L) with magainin II/ Abstracts of the 9th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, Amsterdam, 1999.- P. 194-195.

20. Benfey, P.N. & Chua, N.H. The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants// Sci.- 1990.- V. 250.-P. 959-966.

21. Benfey, P.N., Ren, L. & Chua, N.H. Tissue-specific expression from CaMV35S enhancer subdomains in early stages of plant development// European Molecular Biology Organization Journal.- 1990a.- V.9.- P.1677- 1684.

22. Benfey, P.N., Ren, L. & Chua, N.H. Combinatorial and synergistic properties of CaMV 35S enhancer subdomains.// European Molecular Biology Organization Journal.- 1990b.-V. 9.-P. 1685- 1696.

23. Bevan M.V. Binary agrobacterium vectors for plant transformation,// Nucl. Acids Res. 1984. V.22. P. 8711-8712.

24. Binns A.N., Thomashow M.F. Cell biology of Agrobacterium infection and transformation of plants// Ann. Rev, Microbiol.- 1988.- V.42.- P.575-606,

25. Bloch C., Richardson M. A new family of small (5kDa) protein inhibitors of insect a-amylases from seeds of sorghum (Sorghum bicolor (L) Moench) have sequence homologies with wheat y-purothionins// FEBS Lett.- 1991.-V.279,-P. 101-104.

26. Bohlmann H., Apel K. Thionins// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.-1991.-V.42.-P.227-240.

27. Boman H.G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity// Annu Rev Immunol.- 1995.- V.13.- P.61-92.

28. Broekaert W. F. et al. Biocidal Proteins.// WO 92/21699 1992.a

29. Broekaert W, F„ Marien W., Terras F. R, G. et al. Antimicrobial Peptides from Amaranthus caudatus Seeds with Sequence Homology to the Cysteine/Glycine-Rich Domain of Chitin- Binding Proteins//Biochemistry.- 1992b.- V.31.-P.4308-4314.

30. Broekaert W. F. et al. Biocidal Proteins.// WO 93/05153 1993.

31. Broekaert W. F. et al. Biocidal Chitin-Binding Proteins.// WO 94/11511 1994.

32. Broekaert W. F., Terras F. R. G., Cammue B. P. A., Osborn R. W. Plant Defensins: Novel Antimicrobial Peptides as Components of the Host Defense System, // Plant Physiol. 1995. - V. 108. - P. 1354-1358.

33. Broekaert W. F,, Cammue B,P,A. et al. Antimicrobial Peptides from Plants// Critical Reviews in Plant Sciences.- 1997.- V.16.- №3,- P.299-308, 312-315.

34. Broglie K., Chet I., Holliday M. et al. Transgenic Plants with Enhanced resistance to the Fungal Pathogen Rhizoctonia solani// Science.- 1991.- V.254.-P.l 194-1197.

35. Broglie K., Biddle P., Broglie R.Functional analysis of DNA sequences responsible for ethylene regulation of a bean chitinase gene in transgenic tobacco/ZPlant Cell- 1989.- V.I.- P.599-607.

36. Buchanon-Wollaston V., Passiatore J.E., Cannon F. The mob and oriT mobilizsation functions of a bacterial plasmid promote its transfer to plants// Nature- 1987.- V.328.- P.172-175.

37. Callis J., Fromm M., Walbot V. Introns increase gene expression in cultured maize cells// Genes and Development.- 1987.- V.I.- P. 1183-1200.

38. Cammue B.P.A., Thevissen K., Terras F. R. G. et al. Isolation and characterization of a novel class of plant antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa L. seeds// J. Biol. Chem.-1992.-V.267.-P.2228-2233.

39. Carmona M.J., Molina A., Fernandez J.A., Lopez-Fando J,J„ Garcia-Olmedo F. Expression of the alpha-thionin gene from barley in tobacco confers enhanced resistance to bacterial pathogens,// Plant J. 1993. V.3. P.457-62.

40. Cheysen G., Villarroel R,, van Montagu M. Illegitimate Recombination in Plants: a Model for T-DNA integration// Genes Dev.-1991.- V.5.- P.287-297.

41. Chiang M.M., Hadwiger L.A., Horovitz D.Molecular characterization of a pea beta-l,3-glucanase induced by Fusarium solani and chisan chellenge// Plant Molecular Biology.-1992.-V.20,№4.- P.609-618.

42. Chiang M.M., Hadwiger L.A. The Fusarium solani-mdnced exspressionof a pea gene family encoding high cysteine content proteins.// Mol. Plant Microbe Interact-1991.- V.4.- P.324-331.

43. Collila F.J., Rocher A., Mendez E. Gamma-purothionins: amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm// FEBS Lett.-1990.-V.270.-P. 191 -194.

44. Comczynskiy P. A reagent for the single-step simultaneosus isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples// Biotechniques,- 1993.- V.15.-№3.- P.532-534, 536-537.

45. Cutt J.R., Harpster M.H., Dixon D.C. et al. Desease response to tobacco mosaic virus in transgenic tobacco plants that constitutively express the pathogenesis-related PR-lb gene//Virology.- 1989.-V.173.-P.89-97.

46. De Bolle, M.F.C., David K.M.M., Rees S.B. et al. Cloning and characterization of a cDNA clones encoding an antimicrobial chitin- binding proteins from amaranth, Amaranthus caudatus//V\mX Mol. Biol.- 1993.- V.22.- P.l 187-1190.

47. De Bolle, M.F.C., Osborn R. W,, Goderis I.J. et al. Antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa and Amaranthus caudatus: expression, processing, localization and biological activity in transgenic tobacco// Plant Mol. Biol.- 1996.- V.31.-P.993-1008.

48. Derbyshire K.M., Willetts N. Mobilization of the nonconjugative plasmid RSF1010: a genetic analysis of its origin of transfer// Mol. Gen. Genet- 1987.-V.206.- P.l 54-160.

49. De Samblanx G.W., Goderis I.J. Mutational analysis of a plant defensin from radish (Raphanus sativus L.) reveals two adjacent sites important for antifungal activity,// J, of Biological Chemistry.- 1997,- V.272.- №2.- P.l 171-1179.

50. Douglas C.J., Staneloni R.J., Rubin R.A, and Nester E.W, Identification and genetic analysis an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence region// J. Bacterid.- 1985.- V.161.- P.850-860.

51. During, K.; Porsch, P.; Fladung, M.; Lorz, H. Transgenic potato plants resistant to the phytopathogenic bacterium Erwinia carotovorai! Plant Journal.- 1993.-V.3.- P. 587-598.

52. Edwards K., Johnstone C., Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.// Nucleic Acids Res. 1991. V.19. P.l349.

53. Epple P., Apel K., Bohlmann H. An Arabidopsis thaliana thionin gene is inducible via a signal transduction pathway different from that for pathogenesis-related proteins// Plant Physiology.- 1995.- V.109.- P.813-820.

54. Fischer W,, Christ U„ Baumgartner M., Erismann K.H., Mosinger E. Pathogenesis-related proteins of tomato. Biochemical and immunological characterization// Physiol. Mol. Plant Pathol.- 1989.- V.35.-P.67-83.

55. Flor H.H. Current status of the gene-for-gene concept.// Ann. Rev. Phytopathol. 1971. V.9. P.275-296.

56. Garbe T.R., Barathi J., Barnini S,, Zhang Y„ Abou-Zeid C,, Tang D., Mukherjee R., Young D.B. Transformation of mycobacterial species using hygromycin resistance as selectable marker.// Microbiology. -1994. -V.140.-P.133-138.

57. Garcia-01medo F„ Molina A., Segura A., Moreno M. The defensive role of nonspecific lipid-transfer proteins in plants// Trends in Microbiology.- 1995.-V.3.- P. 72-74.

58. Ganz Т., Lehrer R.I. Defensins// Curr Opin Immunol.- V.6.- P. 584-589,

59. Gatz C., Lenk I.Promoters that respond to chemical inducers// Trend Plant Sci.-1998.- V.3.- P.352-358.

60. Gao A.-G., Hakimi S, M., Mittanck C. A, et al. Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide. // Nature biotechnology. -2000.-V. 18.-P. 1307-1310.

61. Green P.J., Mun-Heng Y., Cuozzo M. et al. Binding site requirement for pea nuclear protein factor GT-1 correlate with sequences required for light-dependent transcriptional activation of the rbcS-ЗА gene// EMBO J.- 1988.-V.7.- №13.- P.4035-4044

62. Goldman MHS, Goldman G.H. Trichoderma harzianum transformant has high extracellular alkaline proteinase expression during specific mycoparasitic interactions// Genetics and Mol. Biolgy.- 1998.- V.21.- P.329-333,

63. Gu Q,, Kamata E.E., Morse M,J. Wu H.M., Cheung A.Y. A flower-specific c-DNA encoding a novel thionin in tobacco// Mol. Gen. Genet.- 1992.- V.234.-P.89-96.

64. Hammond-Kosack K.E., Jones J.D.G. Resistance Gene-Dependent Plant Defense Responses.// Plant Cell,- 1996,- V. 8.-P.1773-1791.

65. Haran S., Schickler H,, Chet I. Molecular mechanisms of lytic enzymes involved in the biokontrol activity of Trichoderma harzianum!I Microbiology.-1996.- V.142.- P.2321-2331.

66. Heberle-Bors E., Charvat В., Thompson D. et al. Genetic analysis of T-DNA insertions into tobacco genome // Plant Cell Rept,-1988.- V.7.- P.571-574.

67. Herrera-Estrella L., Depicker A., Van Montagu M,, Schell J. Expression of chimaeric genes transferred into plants cells using a Ti-plasmid-derived vector// Nature.-1983.- V. 303.- P.209-213.

68. Hoekema A., Hooykaas P., Schilperoort R. Transfer of octopine T-DNA segment to plant cells mediated by different types of Agrobacterium tumor- orroot-inducing plasmids: generality of virulence systems// J, Bact- 1984.-V.158.- P.383-385.

69. Hoffmann J.A., Hetru C. Insect defensins: inducible antibacterial peptides.// Immunol. Today.- 1992.- V.13.- P.411-415.

70. Hooykaas P.J.J., Den Dulk-Ras H., Schilperoort R.A, The Agrobacterium tumefaciens T-DNA gene 6b is an one gene.// Plant. Mol. Biol.- 1988.- V.ll.-P.791-794.

71. Hooykaas P.J.J, Beijersbergen AGM. The virulence system of Agrobacterium tumefaciens// Ann. Rev. Phytopathol.- 1994.- V. 32.- P. 157179.

72. Jung J.L., Friting В., Hahne G. Sunflower (Helianthus annuus L.) pathogenesis-related proteins// Plant Physiol.- 1993.- V.101, №3.- P.873-880.

73. Malik V.S., Saroha M,K. Marker gene controversy in transgenic plants// J. Plant Biochem. Biotechnol.- 1999.- V.8.- P.l-13.

74. Mannerlof M., Terming P. Variability of Gene Expression in Transgenic Tobacco// Euphytica.-1997.-V.98.-P. 133-139.

75. Martini N., Egen M,, Runtz I., Strittmatter G. Promoter sequences of a potato pathogenesis related gene madiate transcriptional activation selectively upon fungal infection//Mol. Gen. Genet.- 1993.- V.236.- №2.- P.179-186.

76. Mascarenhas D., Mettler I.J., Pierce D. Lowe H. Intron-mediated enchancement of geterologous gene expression in maize// Plant Mol. Biol.- 1990.- V.15.-P.913-920.

77. Meyer P., Heidmann I. Epigenetic Variants of Transgenic Petunia Line Show Hypermethylation in Transgene DNA: an Inactivation for Specific Recognition of Foreign DNA Transgenic Plants//Mol. Gen. Genet-1994.-V.243.-P.390-399.

78. Mitra A,, Zhang Z. Expression of a human lactoferrin cDNA in tobacco cells produces antibacterial protein(s).//Plant Physiol.- 1994.- V.106.-№3.-P.977-981.

79. Molano J., Polasheck I., Duran A., Cabib E. An endochitinase from wheat germ. Activity on nascent and preformed chitin.// J. Biol. Chem.- 1979.-V.254.- P. 4901-4907.

80. Molina A., Segura A., Garcia-Olmedo F, Lipid-transfer proteins (nsLTPs) from barley and maize leaves are potent inhibitors of bacterial and fungal plant pathogens// FEBS Lett.- 1993.- V.316.- P. 119-122.

81. Moreno M., Segura A., Garcia-Olmedo F. Pseudothionin-Stl, a potato peptide active against potato pathogens// Eur. J. Biochem.-1994.- V.223,-P.135-139.

82. Moiseyev G.P., Fedoreyeva L.I,, Zhuravlev Y.N, et al. Primary structures of two ribonucleases from ginseng calluses. New members of the PR-10 family of intracellular pathogenesis-related plant protein// FEBS Lett.-!997.- V.407.- P.207-210.

83. Murashige T, and Skoog F. A revised medium of rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiologia Plantarum. 1962. - V. 15.-P. 473-497.

84. Murdock L.L., Huesing J.E., Nielsen S.S., Pratt R.C., Shade R.E. Biological effects of plant lectins on the cowpea weevil.// Phytochemistry.-1990.-V.-29.- P.85-89.

85. Nakaya K., Omata K., Okahashi I,, Nakamura Y. et al. Amino acid sequence and disulfide bridges of an antifungal protein isolated from Aspergillus giganteus.//Eur J Biochem.- 1990.- V.193.- P.31-38.

86. Nap J.P., Bijvoet J., Stiekema W.J. Biosafety of kanamycin-resistant transgenic plants.// Transgenic Res, 1992 . V.6. P.239-249.

87. Osborn R. W., De Samblanx G. W., Thevissen K. et al. Isolation and characterisation of plant defensins of Asteracea, Fabacea, Hippocastanacea and Saxifragacea. I I FEBS Lett. 1995. - V. 368. - P. 257-262.

88. Penninckx I.A.M.A,, Eggermont K„ Terras F.R.G. et al. Pathogen-induced systemic activation of a plant defensin gene in Arabidopsis follows a salicylic acid-independent pathway// Plant Cell.-1996.-V.8.-P.2309-2323.

89. Stinissen H.M., Carlier A.R.Isolation and partial characterization of wheat-germ-agglutinin-like lectins from rye (Secale cereale) and barley (Hordeum vulgare) embryos// Biochem J.- 1982 V.203 (1).- P.239-243.

90. Peumans W.J., Van Damme E.G.M. Lectins as plant defense proteins// Plant Physiol.- 1995,- V.109.- P.347-352.

91. Raikhel N.V., Lee H.I., Broekaert W. F, Structure and function of chitin-binding proteins.// Annu.Rev.Plant Physiol. Plant Mol. Biol.-1993.-V.44.-P.591-615.

92. Rommens C.M., Salmeron J.M., Baulcombe D, et al, Intergeneric transfer and functional expression of the tomatodisease resistance gene Ptoll Plant Cell.- 1995,- V.7.- №10,- P.1537-1544.

93. Rossi L., Hohn В., Tinland B. The VirD2 protein of Agrobacterium tumefaciens carries nuclear localization signals important for transfer of T-DNA to plants// Mol. Gen. Genet.- 1993.- V.239.- P.345-353.

94. Rossi L., Hohn В., Tinland B.Integration of Complete Transferred DNA Units Is Dependent on the Activity of Virulence E2 Protein of Agrobacterium tumefaciens//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1996.-V.93.- P.126-130.

95. Roth D.B., Wilson J. Nonhomologous Recombination in Mammalian Cells: Role for Short Sequence Homologies in the Joining Reaction// Mol. Cell. Biol.- 1986.- V.6.- P. 4295-4304.

96. Ryan C. Protease inhibitors in plants: genes for improving defenses against insects and pathogens// Annu. Rev. Phytopathol.- 1990.- V.28.- P.425-449.

97. Salter M.G., JA Paine, KV Riddell, I Jepson, AJ Greenland, MX Caddick and AB Tomsett, Characterisation of the ethanol-inducible ale gene expression system for transgenic plants// The Plant Journal.- 1998,- V. 16,- P. 127-132.

98. Shagger H. and von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.// Anal. Biochem.- 1987.- V.166.- №2.- P.368-375.

99. Schlumbaum A„ Mauch F,, Vogeli U,, Boiler T. Plant chitinase inhibitor of fungal growth//Nature.- 1986,- V.324,- P.365-367.

100. Shibuya N„ Goldstein U,, Peumans W,J,, Broekaert W. F. Carbohydrate binding properties of the stinging nettle (Urtica dioica) rhizome lectin// Arch Biochem Biophys.- 1986.- V.249(l).- P.215-224.

101. Shinshi, H., D, Mohnen and F. Meins. Regulation of plant pathogenesis-related enzyme: Inhibition of chitinase and chitinase mRNA accumulation in cultured tobacco tissues by auxin and cytokinin// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1987.-V. 84.-P.89-93.

102. Singh N.K., Nelson D,E., Kuhn D., Hasegawa P.M, Bressan R.A. Molecular cloning of osmotin and regulation of its expression by ABA and adaptation to low water potential// Plant Physiol.- 1989,- V.90.- P. 1096-1101.

103. Stachel S.E., Nester E.W., Zambryski P. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression// Proc.Natl. Acad.Sci.USA.-1986.- V.83.- p.379-383,

104. Sweetman J. Chengcai Chu, Nan Qu, Andrew J. Greenland, Uwe Sonnewald and Ian Jepson. Ethanol Vapor Is an Efficient Inducer of the ale Gene Expression System in Model and Crop Plant Species// Plant Physiology. -2002.- V.-129.- P. 943-948.

105. Su, P. H„ S. M. Yu and Chen C. S. Spatial and temporal expression of a rice prolamin gene RP5 promoter in transgenic tobacco and rice.// J, Plant Physiol,-2001.- V, 158,-P. 247-254.

106. Terras F. R. G., Eggermont K., Kovaleva V. et al. Small Cysteine-Rich Antifungal Proteins from Radish: Their Role in Host Defense. // Plant Cell. -1995.-V. 7.-P. 573-588.

107. Terras F. R. G., Schoofs H. M. E„ De Bolle M. F. C. et al. Analysis of two novel classes of antifungal proteins from radish ( Raphanus sativus L.) seeds. //J. Biol. Chem. 1992. -V. 267. - P. 15301-15309.

108. Terras F. R. G., Torrekens S., Van Leuven F. et al. A new famili of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicae-species. // FEBS Lett. -1993.-V. 316.-P. 233-240.

109. Terras F. R. G., Penninckx I.A.M.A., Goderis I.J., Broekaert W.F. Evidence that the role of plant defensins in radish defense responses is independent of salicylic acid// Planta.- 1998,- V.206.- P.l 17-124.

110. Tinland В., Hohn B. Recombination between Prokaryotic and Eukaryotic DNA: Integration of T-DNA into Plant Genome// Genetic Engineering,- 1995.- V.17.- P.209-229.

111. Thevissen K., Ghazi A,, De Samblanx G. W, et al. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins, // The journals of Biological Chemistry. 1996. - V. 271. - № 25 - P. 15018-15025.

112. Thevissen K., Terras F. R., Broekaert W, F. Permeabilization of fungal membranes by plant defensins inhibits fungal growth. // Appl. Environ Microbiol. 1999. -V. 65. - №12. - P. 5451-5458.

113. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from acrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some application. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350-4354.

114. Tsuda M. Purification and characterization of a lectin from rice bran.//J Biochem.-1979.- V.86 (5).- 1451-1461.

115. Van Loon L.C., Gerrittsen Y.A.M., Ritter C.E. Identification, purification and characterization of pathogenesis-related proteins from virus-infected Samsun NN tobacco leaves// Plant Mol.Biol.-1987.-V.9.-P.593-609.

116. Van Loon L.C., Pierpoint W.S., Boiler Т., Conejero V. Recommendations for naming plant pathogenesis-related proteins// Plant Mol. Biol. Reporter.- 1994,- V.12.- P.245-264.

117. Van Loon L.C., Van Strien. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins.// Physiological and Molecular Plant Pathology.- 1999.- V.55.- P.85-97.

118. Van Parijs J., Broekaert W.F., Goldstein I.J., Peumans W.J. Hevein: an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex//Planta.- 1991.-V.183.- P.258-264.

119. Vaucheret H., Beclin C., Elmayan T. et al. Transgene-induced gene silencing in plants// The Plant Journal.- 1998.- V.16.- №6.-652-653

120. Vigers A.J., Roberts W.K., Selitrennikoff C.P. A new family of plant antifungal proteins// Mol. Plant Microbe Interact,-1991.- V.4.- P.315-323.

121. Vigers A.J., Wiedemann S,, Roberts W.K. et al. Thaumatin-like pathogenesis-related proteins are antifungal// Plant Sci.- 1992.- V.83.- P.155-161.

122. Wang Y., Nowak G., Culley D, et al. Constitutive expression of pea defense gene DRR206 confers resistance to blackleg {Leptosphaeriamaculans) disease in transgenic canola (Brassica napus)// Mol. Plant-Microbe Interact.-1999.-V.12.-P.410-418

123. Woloshuk C.P., Meulenhoff J.S., Sela-Buurlage M.B. et al. Pathogen-induced proteins with inhibitory activity toward Phytophthora infestansll Plant Cell.- 1991.-V.3.- P.619-628.

124. Wu G,, Shortt B.J., Lawrence E.B. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding HbCVgenerating glucose oxidase in transgenic potato plants.// Plant Cell.- 1995.- V.7.- P.1357-1368.98

125. Zambryski P., Joos H,, Genetello C. et al. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capaciti// EMBO J.-1983.-P.2143-2150.

126. Zhu B.s Chen T.H.H., Li P.H. Activation of two osmotin-like protein genes by abiotic stimuli and fungal pathogen in transgenic potato plants// Plant Physiol.- 1995.- V.108.- P. 929-937.

127. Zhu В., Chen T,H,H., Li P.H.Expression of an ABA-responsive osmotin-like gene during the induction of freezing tolerance in Solanum commersonii//Plant Mol. Biol.- 1993.- V.21.- P.729-735

128. Zupan J.R., Zambryski P. Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the Plant Cell// Plant Physiol. 1995.- V.107.- P. 1041-1047,