Ген протеинкиназы MAK-V и ряд других генов с измененной экспрессией в опухолях и их использование в онкологии

Коробко, Игорь Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ген протеинкиназы MAK-V и ряд других генов с измененной экспрессией в опухолях и их использование в онкологии
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Ген протеинкиназы MAK-V и ряд других генов с измененной экспрессией в опухолях и их использование в онкологии"

На правах рукописи

Коробко Игорь Викторович

Ген протеинкиназы МАК-У и ряд других генов с измененной экспрессией в опухолях и их использование в онкологии

Специальности 03.00.26 - «молекулярная генетика» 03.00.03 - «молекулярная биология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2009

003489243

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН (ИБГ РАН)

Научный консультант:

академик РАН, доктор биологических наук,

профессор Георгиев Георгий Павлович

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН, доктор медицинских наук,

профессор Альтштейн Анатолий Давидович

чл.-корр. РАН, доктор химических наук,

профессор Габибов Александр Габибович

доктор биологических наук Надеждина Елена Сергеевна

Ведущая организация

Государственное учреждение Медико-генетический научный центр РАМН

Защита состоится «28» декабря 2009 г. в «11» часов на заседании Диссертационного совета Д002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН (ИБГ РАН) по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан « м

» ноября 2009 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд. фарм. наук

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

Онкологические заболевания в настоящее время являются второй по значимости причиной смертности в мире, следуя за заболеваниями сердца и системы кровообращения и опережая смертность от несчастных случаев. В Российской Федерации в 2006 году было выявлено 1417665 новых случаев новообразований (или 993.1 на 100000 населення), а общее число зарегистрированных больных с новообразованиями составило 5121277 (или 3587.5 на 100000 населения). При этом, несмотря на значительные успехи в терапии онкозаболеваний за последние 50 лет, метастазирующие солидные опухоли остаются в своей основной массе неизлечимыми, и время жизни пациентов часто ограничено месяцами. Онкологические заболевания являются по своей природе гетерогенной патологией, в основе которой лежат изменения в молекулярных процессах в клетке. Это, с одной стороны, делает клетки опухоли уникальными и определяет их устойчивость или чувствительность к определенным видам терапии. С другой стороны, одной из характерных черт опухолевых клеток является нестабильность их генетического аппарата, что обуславливает быстрое появление новых изменений в опухолевых клетках, приводящих к гетерогенности популяции клеток в опухоли и возникновению устойчивости к терапевтическим воздействиям. Увеличение эффективности противоопухолевой терапии в настоящее время связывается с успехами в области молекулярной и клеточной биологии и генетики, а также смежных областях, что позволяет разрабатывать новые способы лечения онкологических заболеваний на рациональной основе. А именно, выявлять молекулярные изменения, характерные для клеток конкретной опухоли и существенные для ее возникновения, прогрессии и жизнеспособности опухолевых клеток, и специфически воздействовать на них. Кроме того, «молекулярный портрет» опухоли, то есть совокупность характерных для нее молекулярных изменений, позволяет проводить диагностику онкологических заболеваний, прогнозировать их развитие и чувствительность опухоли к уже используемым видам терапии, тем самым позволяя повысить эффективность лечения. Поэтому выявление генов, характеризующихся измененной экспрессией в опухолях, исследование значимости изменения их экспрессии для развития и прогрессии опухоли является одной из первостепенных задач, решение которой может послужить отправной точкой для исследований по нескольким направлениям. Во-первых, для разработки новых способов диагностики опухолей и прогнозирования их поведения, а также определения чувствительности к различным видам терапии. Во-вторых, для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе развития и прогрессии опухоли, что

позволяет выявлять новые молекулярные мишени для противоопухолевой терапии. В-

1 /'

третьих, сама измененная транскрипция генов в опухолевых клетках по сравнению с неопухолевыми клетками может быть использована для разработки специфичных генно-терапевтических способов лечения опухолей, основанных на аномальной активности промоторов таких генов в опухолевых клетках (опухоль-специфические промоторы).

Таким образом, понимание молекулярных механизмов прогрессии опухолей и выявление их индивидуальных особенностей является рациональной основой для создания новых диагностических, прогностических и терапевтических средств. Это позволяет повысить эффективность диагностики и лечения онкологических заболеваний, а также способствует практической реализации концепции персонализированной медицины, которая особенно актуальна в онкологии, где необходимо учитывать не только индивидуальные особенности организма пациента, но и индивидуальные особенности опухоли. Исследования молекулярных изменений, происходящих в опухолях, является первым шагом на пути исследования молекулярных механизмов развития и прогрессии опухолей и выявления их особенностей, что позволяет идентифицировать новые мишени для терапии онкозаболеваний и разрабатывать на их основе новые стратегии лечения. Помимо этого, молекулярные особенности опухоли, связь которых с ее возникновением и прогрессией остается неясной, могут быть использованы в диагностических и прогностических целях.

Настоящая работа находится в соответствии с этими тенденциями и посвящена исследованию ряда дифференциально экспрессирующихся в опухолях генов, исследованию возможных последствий их измененной экспрессии для опухолевых клеток и исследованию возможностей и способов использования их свойств в практических целях как диагностических маркеров и/или в качестве основы для разработки новых анти-неопластических средств.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью данной работы является исследование ряда генов с дифференциальной экспрессией в опухолях в связи с возможным использованием их свойств в онкологии. Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Исследовать свойства и функции открытой нами ранее протеинкиназы МАК-У, в частности, с учетом ее возможной роли в канцерогенезе;

2. Исследовать изменения экспрессии гена так-у при раке молочной железы человека и генов Рс1с<14 и Т1 в опухолях легкого человека. Определить их потенциальную практическую значимость;

3. Определить возможность и оптимальные способы применения Рс1сс14 как анти-неопластического средства с использованием генно-терапевтических подходов;

4. Разработать и создать оптимальные экспрессионные модули на основе тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа (НБУ^к) и опухоль-специфического промотора гена теломеразной обратной транскриптазы человека (ИТЕКГ) для противоопухолевой терапии на основе рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов. Разработать оптимальные способы применения аденовирусных препаратов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Протенпкиназа МАК-У. Установление свойств и функций генов и кодируемых ими белков, выявление их роли и связи с определенными клеточными процессами является одной из основных задач современной молекулярной биологии и молекулярной генетики. В свете этого проведенное нами комплексное исследование практически неизученных гена таА-у и кодируемой им протеинкиназы МАК-У является несомненно актуальным в научном плане. Нами был охарактеризован ген так-у (в том числе и в эволюционном аспекте), включая функциональную характеристику его промоторной области. В рамках комплексного исследования протеинкиназы МАК-У была исследована ее внутриклеточная локализация и установлены потенциальные партнеры по взаимодействию с ней, на основании чего было выявлено влияние МАК-У на эндоцитоз. Проведенные исследования позволили впервые установить участие протеинкиназы МАК-V в поддержании жизнеспособности клеток, что является первой функциональной ассоциацией протеинкиназы МАК-У с определенным клеточным ответом на внешние стимулы. Результаты комплексного исследования протеинкиназы МАК-У представляют собой существенный вклад в исследование этой малоизученной протеинкиназы и установление ее функциональной роли в клетке и в организме.

Большое значение имеет открытие участия протеинкиназы МАК-У в поддержании

жизнеспособности клеток, в частности, в ответ на контакт клеток со специфическими

компонентами внеклеточного матрикса. Выявление этого свойства МАК-У даст импульс

для дальнейших исследований в фундаментальном научном аспекте, имеющих целью

установление механизмов действия МАК-У в процессах развития, в которых эта

протеинкиназа предположительно может играть важную роль. А именно, МАК-У-

зависимая регуляция жизнеспособности клеток может являться одной из ключевых

активностей МАК-У в процессах развития, в которых пермиссивные и рестриктивные

сигналы от внеклеточного матрикса играют важную роль. Кроме того, выявление

способности МАК-У позитивно влиять на жизнеспособность клеток имеет значение и в

практическом аспекте. Характеризуясь часто увеличенной экспрессией в опухолях, эта активность МАК.-У может позитивно влиять на жизнеспособность опухолевых клеток в определенных условиях, что может иметь неблагоприятные последствия и служит отправной точкой для выявления значимости увеличенной экспрессии МЛК-У в опухолях как нового потенциального прогностического маркера опухолей.

Дифференциальная экспрессия генов в опухолях. В результате работы было впервые выявлено частое снижение уровня транскрипта гена супрессора опухолевого роста Рс{сс14 в опухолях плоскоклеточного рака легкого (ПРЛ). При этом впервые продемонстрировано, что уровни транскрипта и белка Рс1сс14 при ПРЛ не являются эквивалентными параметрами, что должно приниматься во внимание при разработке диагностических систем, основанных на мониторинге изменения экспрессии Рс!сс14 в опухолях легкого. Аналогичные исследования, проведенные для гена \VIFl, подтвердили ранее выявленное другими исследователями частое снижение уровня его транскрипции при ПРЛ и впервые позволили установить эквивалентность изменения уровней транскрипта и белка \VIF1 в опухолях этого типа, а также локальный характер действия \VIF1. Наконец, впервые был проведен анализ изменения экспрессии так-\ в опухолях и установлено, что уровень белка МАК-У часто увеличен в опухолях молочной железы человека.

Выявленные частые изменения экспрессии так-у, \VIF1 и Рс!сс14 (включая впервые показанную нами независимость изменения уровней транскрипта и белка Р(1сс14) позволяет использовать уровни их экспрессии в качестве молекулярных маркеров опухолей соответствующих типов. Это открывает перспективы их применения для диагностических и прогностических целей, а также использования при персонализированных подходах в онкологии, и является основанием для проведения дальнейших прикладных исследований в этом направлении. В частности, частое снижение уровня транскрипта \VIFX позволяет использовать этот параметр при ПРЛ для диагностических целей.

Супрессор опухолевого роста Рс)с<М как мишень в противоопухолевой терапии.

Супрессор опухолевого роста РсЫ4 рассматривается как перспективная мишень для анти-неопластической терапии. В работе было установлено, что восстановление экспрессии супрессора опухолевого роста РйсЛ4 с использованием кДНК, кодирующей РсЫ4 «дикого» типа, может быть неэффективным подходом, и исследованы причины этого феномена. Па основании полученных результатов предложен рациональный способ

использования супрессора опухолевого роста Pdcd4 в биотерапевтических подходах, состоящий в применении его мутантной версии Pdcd4 (S67,71,457A), что имеет существенное значение в области разработки новых анти-неопластических средств на основе Pdcd4.

Экспрессионные модули для противоопухолевой терапии на основе рекомбинаптных реплмкативно-дефектных аденовирусов. Были созданы экспрессионные модули с кДНК HSV-tk под контролем фрагмента промотора гена hTERT и его модификаций для получения на их основе аденовирусных противоопухолевых препаратов. Проведенный анализ позволил выявить оптимальные модификации промотора гена hTERT для достижения максимально эффективной экспрессии трансгена в опухолевых клетках. На основе двух экспрессионных модулей были созданы аденовирусные препараты Ad-hTERT-TK и Ad-hTERT-CMV-TK и продемонстрирована их активность in vitro как монопрепаратов, а также совместно с рядом традиционных химиотерапевтических противоопухолевых средств. Эти аденовирусные препараты являются прототипами для выпуска опытных партий инновационных противоопухолевых фармпрепаратов для проведения доклинических и клинических испытаний.

Предложен способ увеличения специфичности экспрессии терапевтических белков в опухолевых клетках за счет использования в экспрессионных модулях 3'-нетранслируемых областей, дестабилизирующих транскрипты в неделящихся клетках. Использование этой стратегии при разработке противоопухолевых генно-терапевтических средств позволит снизить их возможное побочное действие на неопухолевые клетки.

Оптимальные способы применения аденовирусных препаратов. Результаты работы позволяют повысить эффективность применения противоопухолевых препаратов на основе рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов, которые в настоящее время занимают свое место в клинической онкологии. Была выявлена способность прототипов перспективных противоопухолевых агентов - ингибиторов киназной активности 2-(4-морфолинил)-8-фенил-4Н-1-бензопиран-4-она (LY294002) и 2-пиперазинил-8-фенил-4Н-1-бензопиран-4-она (LY303511) увеличивать эффективность экспрессии белков, кодируемых рекомбинантными репликативно-дефектными аденовирусами. Более того, была выявлена синергетичность их действия с противоопухолевыми препаратами - ингибиторами топоизомераз. Это открывает пути повышения эффективности применения противоопухолевых препаратов на основе

репликативно-дефектных аденовирусов путем их совместного применения с анти-нсопластическими средствами на основе ЬУ294002/ЬУ303511.

Созданный диагностический набор «Тертоскрин» для определения присутствия транскрипта ИТЕЯТ в образцах опухолевых тканей позволяет прогнозировать эффективность действия аденовирусных противоопухолевых препаратов на основе промотора гена НТЕЯТ А(1-ЬТЕЮ'-ТК и Ай-ЬТЕЯТ-СМУ-ТК и делает возможным их адресное применение для терапии опухолей.

Рекомендации по практическому использованию результатов работы.

1. Снижение уровней транскриптов генов Рс1с<14 и \V1F1 и уровня белка \VIF1 могут использоваться как молекулярные маркеры при плоскоклеточном раке легкого человека.

2. Снижение уровня транскрипа гена \VIF1 может использоваться для диагностики плоскоклеточного рака легкого.

3. Уровни транскрипта и белка Р(1с(14 следует использовать как независимые молекулярные параметры плоскоклеточного рака легкого.

4. Увеличенная иммунореактивность протеинкиназы МАК-У может использоваться в качестве молекулярного маркера рака молочной железы человека.

5. При создании анти-неопластических генно-терапевтических средств, основанных на восстановлении активности супрессора опухолевого роста Р(5с<14, оптимально использование мутантной версий белка Рс)сс14(867,71,457А), а не белка «дикого» типа.

6. Рекомендовано использование З'-нетранслируемых областей транскриптов ДНК мелилтрансферазы 1 человека ОЫМТ1 и топоизомеразы На ТОР02Л для увеличения специфичности продукции терапевтических белков в делящихся клетках при разработке новых генно-терапевтических анти-неопластических препаратов.

7. Применение ЬУ294002/ЬУ303511 и их производных может быть рекомендовано для увеличения эффективности противораковых терапевтических рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов как самих по себе, так и совместно с ингибиторами топоизомераз.

8. Тест-набор «Тертоскрин» может быть рекомендован к использованию для выявления присутствия транскрипта гена теломеразной обратной транскриптазы человека НТЕЯТ и прогнозирования эффективности противоопухолевого действия генно-терапевтических препаратов, зависимых от активности промотора ИТЕЯТ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы работы докладывались на различных отечественных и международных конференциях, рабочих совещаниях и семинарах, в том числе на 5-ом Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Россия, 2009), отчетной конференции по программе фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" (Россия, 2009), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Россия, 2008), конференции "Intracellular Transport and Signal Transduction in Cancer Biomedicine" (Норвегия, 2007), конференции, посвященной 40-летию журнала «Молекулярная биология» (Россия, 2007), семинаре по комплексному проекту "Создание технологии дифференциальной протеомикн и ее использование для получения новых противораковых препаратов", выполняемому в рамках Федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы (Россия, 2005), Шестой научно-практической конференции «Московская наука - проблемы и перспективы» (Россия, 2005), The Second Russia-Novartis Symposium "Genome and Transcriptome targets in Medicine" (Россия, 2005), конференции "Advances in molecular cell biology" (Россия, 2004), ELSO-2003 Conference (Гемания, 2003), международной конференции "Molecular genetics of eukaryotes" (Россия, 2003), международном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология" (Россия-Белоруссия, 2001), VI Международной конференции РФФИ "Результаты Фундаментальных Исследований для Инвестиций. Молекулярная Медицина" (Россия, 2001), The 5th International Engelhard Conference on Molecular Biology (Россия, 2001), симпозиуме "Current Problems of Molecular Genetics and Cell Biology" (Россия, 2000), The 4th International Engelhardt Conference on Molecular Biology (Россия, 1999), межинститутском семинаре "Хромосома" (Россия, 2009), межинститутском семинаре "Современные проблемы генетики человека" (Россия, 2007), семинаре Department of Preclinical Veterinary Sciences, University of Edinburgh (Великобритания, 2002), межлабораторком семинаре School of Biosciences, Cardiff University (Великобритания, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ в научных журналах, 7 - в сборниках материалов конференций и симпозиумов (тезисы сообщений и докладов), получен 1 патент на изобретение Российской Федерации.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 296 страницах машинописного текста и состоит из введения, материалов и методов исследования, 5 тематических глав, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 459 источника. Работа проиллюстрирована 66 рисунком и 8 таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Протеинкиназа MAK-V

Протеинкиназа MAK-V была идентифицирована и впоследствии клонировна нами ранее в результате сравнительного анализа киномов родственных опухолей с различными метастатическими свойствами. Эта же протеинкиназа была независимо клонирована американской группой исследователей при сравнительном анализе опухолей с различными свойствами и получила название HUNK. MAK-V принадлежит к группе АМРК-подобных протеинкиназ и является одним из малоизученных ее представителей, и ее связь с определенными процессами в клетке и в организме, а также молекулярные механизмы действия остаются по большей части неизвестными. Характер экспрессии mak-v в эмбриональном развитии мыши и Xenopus laevis [5] (Примечание. Здесь и далее даны ссылки на работы, опубликованные по теме диссертации), в дифференцировке молочной железы мыши, а также во взрослом организме и в развитии нервной системы [1] предполагают ее роль в процессах развития и в нервной системе. Кроме того, факт идентификации этой протеинкиназы двумя независимыми группами в результате сравнительного анализа опухолей с различными свойствами предполагает ее возможную связь с определенными свойствами опухолевых клеток. Это явилось предпосылкой для детальной характеристики свойств протеинкиназы MAK-V и исследованию ее функций и механизмов действия с целью установления ее возможной роли в опухолевых клетках и перспектив использования ее свойств в практическом аспекте.

1.1. Ген mak-v

Ранее нами и независимо группой американских исследователей было установлено, что ген mak-v находится на хромосоме 21 человека и хромосоме 16 мыши. Анализ базы данных нуклеотидных последовательностей GeneBank позволил полностью реконструировать in silico белок MAK-V человека, который на 92% идентичен и на 95% гомологичен белку мыши, а также установить структуру гена mak-v человека, который занимает около 128 т.п.н. и содержит 11 экзонов [1].

1.1.1. Ген mak-v в эволюционном контексте

Анализ базы данных нуклеотидных последовательностей EST выявил несколько клонов кДНК, кодирующих возможные ортологи mak-v X.laevis, которые можно разбить на две группы на основании незначительных вариаций нуклеотидных последовательностей. Определение нуклеотидной последовательности кДНК одной из групп (последовательность помещена в базу данных нуклеотидных последовательностей GeneBank, Асс. No. AY318877) показало, что кодируемый ей полипептид, состоящий их 691 аминокислотных остатков, имеет существенную гомологию (63% идентичных и 75% гомологичных аминокислотных остатков) с белком MAK-V мыши с еще большей гомологией (94% идентичности) в области каталитического домена. Филогенетический анализ каталитических доменов MAK-V и родственных ей протеинкиназ показал, что каталитический домен этой протеинкиназы X.laevis кластеризуется с доменами MAK-V мыши и человека, что позволяет сделать вывод о том, что этот белок является ортологом MAK-V X.laevis. В белке, кодируемом второй группой кДНК (последовательность помещена в базу данных нуклеотидных последовательностей GeneBank, Асс. No. AY318878), 95% аминокислотных остатков идентичны белку, кодируемому первой группой кДНК. Присутствие двух схожих, но незначительно отличающихся белков, может быть объяснено тетраплоидностьюX.laevis [5].

Дальнейший поиск ортологов MAK-V в различных организмах, проведенный in silico, позволил выявить и полностью реконструировать последовательности ортологов MAK-V рыб (Fugu rubripes) и асцидии (Ciona intestinalis), а также показал отсутствие генов, кодирующих ортологи MAK-V, в геномах беспозвоночных организмов (Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans) [5]. Эти результаты позволяют предположить, что MAK-V является протеинкиназой, кодируемой только геномами хордовых организмов и отсутствующей у беспозвоночных. Это предположение нашло свое подтверждение в опубликованных результатах крупномасштабных анализов киномов различных организмов. Однако более поздние исследования установили присутствие ортолога МАК-V, как и ряда других ранее считавшихся отсутствующими у беспозвоночных протеинкиназ, у морского ежа, наиболее зволюционно близкого к хордовым организма, что указывает на более ранее происхождение MAK.-V в эволюционном контексте. Тем не менее, проведенный анализ показал, что протеинкиназа MAK-V является достаточно «молодой» в эволюционном аспекте, и ее появление могло быть связано с увеличивающейся сложностью организма. В практическом плане отсутствие ортологов MAK-V в таких организмах, как D.melanogaster, C.elegans и в дрожжах, не позволяет

использовать эти хорошо исследованные модельные организмы для изучения данной протеинкиназы.

1.1.2. Характеристика промотора гена mak-v мыши

Идентификация транскрипта mak-v в результате сравнительного анализа опухолей с различными свойствами указывает на возможное изменение транскрипционной активности промотора гена mak-v в опухолевых клетках с различными свойствами. Для исследования механизмов транскрипционной регуляции гена mak-v в результате скрининга геномной библиотеки мыши был клонирован фрагмент геномной ДНК мыши, содержащий его 5'-область. Анализ ее нуклеотидной последовательности длинною 1.2 т.п.н., предшествующей сайту инициации трансляции, выявил отсутствие TATA- и СААТ-боксов. Как характерно для промоторов, лишенных ТАТА-бокса, 5'-область гена mak-v является GC-богатой и содержит СрО-«островок» в своей проксимальной части. Аналогичный анализ последовательности промоторной области гена mak-v человека выявил ее схожее строение. Компьютерный анализ позволил установить потенциальные участки связывания транскрипционных факторов, консервативных для промоторов генов мыши и человека, которые могут принимать участие в регуляции активности промотора (Рис. 1). Используя амплификацию концевых фрагментов кДНК, было установлено, что сайт инициации транскрипции гена mak-v находится на удалении по меньшей мере 152154 нт от сайта инициации трансляции. Интересно отметить, что последовательность, окружающая предполагаемый сайт инициации транскрипции, отличается заменой одного нуклеотида от консенсусной инициаторной /w-последовательности, часто выполняющей роль сайта инициации транскрипции в промоторах, лишенных ТАТА-бокса. Кроме того, эта область окружена консервативными сайтами связывания фактора Spl (Рис. 1), который может играть роль транскрипционного активатора /«г-последовательностей. Суммируя, можно предположить, что эта /«/--последовательность содержит сайт инициации транскрипции гена mak-v, находящийся в 156 нт от сайта инициации трансляции [8].

Анализ промоторной активности 5'-области гена mak-v мыши в клетках РС12, в которых присутствует эндогенный транскрипт mak-v, с использованием репортерного гена люциферазы показал, что область -347...+148, содержащая картированный нами сайт инициации транскрипции и сайты связывания фактора Spl, действительно обладает транскрипционной активностью, а максимальная активность наблюдается при удлинении промоторной области до нт -508 (Рис. 2). Область -508...-347 содержит несколько консервативных для генов мыши и человека потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов, включая 2 сайта связывания факторов семейства E2F (Рис.

Г"-12 39

-113 3 С^АТССТЧ^^АТААТСССТАСбТСТСТСА^

<5X1.? (+) ...^М^^Г'ВагьЦ Ьох/+) -939 АС^ОТ6АС^СТССССТСС(^ССе5ТСС0ССТСАСа^ТССААТ^^^ -839 аСССТС^ТССТАС^ТаССбССАСТАСТОТТАССТСМбССС г»-735

-733 ССТАС^АСССАСССАССС&ТСТТССАО^^

с/ЕВРр.(+)

- 63 9 ССССТСССТАТйСТСССТССТОТТСС'ГСАССАСАТТС

г»-508 -— МуоР ( + )

- 5 3 9 ССТСТТбСССАесССА^АСХССССиТСТАСССССГС^

БАТА-З (+? г'-347

- 4 3 9 7СССОТСТССЛесеА£^2'ССАбТТСССС1ГеТТССССССССССААС<ЗААбеАС(5аСС'Г АСбАвббАТТТСАААбТССТСААОСТССССАбТССАбСТССС.

зрк-)— ......озаг^......

АР-4М

- 33 9 ТТСТ<Ж:СССОСЙСССвСССС^^

- 239

-13 9 ТСХХССГСТССеАССАСЮАХССССТСТТСССТСТС^^

+62 +162 +262

+362 щяшзшгаезтз^^^ +462 ¿УСССССйАС^СТСА^СТСС^^^

+662 бСС!ГССТ«;СССАС6ССА£С6ААааСШУ^АСАС^ +762 ЙО^ТТС&^ТГтеССТвТОСААТаТСС^ +862 ТоеАв<3<^6ТТСС^ССССТСТАА<К:тССХ£ТС^^ +962 АСвАСССАТеСАСТСТАЙА

Рис. I. Нуклеотидная последовательность 5,-фланкирующей области, экзона 1 и 5'-конца интрона А гена так-V мыши. Картированный сайт инициации транскрипции гена так-V отмечен звездочками. 1пг~ последовательность подчеркнута двойной чертой. Последовательность экзона 1 выделена серым фоном. Кодон инициации трансляции взят в рамку. Потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов отмечены линиями над последовательностями со знаками (-) и (+), указывающими на цепь ДНК, на которой находится последовательность сайта. Стрелками отмечены 5'-концы фрагментов геномной ДНК, клонированные в вектор рвО-ВаБЮ.

1). Поскольку ранее было установлено, что ген так-V является мишенью для факторов этого семейства, активирующих его транскрипцию, можно предположить, что именно сайт(ы) связывания факторов Е2Р отвечают за увеличение транскрипционной активности, обеспечиваемой областью -508...-347. Дальнейшее удлинение 5'-области гена так-у (до 2 т.п.н.) приводило к незначительному снижению активности (Рис. 2). Таким образом, изолированная нами 5'-область гена так-у содержит функциональный про мотор гена так-V с основными позитивными регуляторными элементами, расположенными в области -508...-347. Однако нами не было обнаружено регуляторных г/г/с-элементов, которые могли бы обуславливать значительную разницу в уровне транскрипции так-у в клетках различных линий, в то время как анализ панели клеточных линий мыши, человека и хомяка методом Норзерн-блоттинга показал существенную вариабельность в уровне транскрипта так-у в них. В частности, транскрипт так-у присутствует в клетках линии КСМЛ-0 и не выявляется в клетках КСМЛ-100 (Рис. ЗА). При этом профиль активности

pGLi-Btmc ШЖ® рШ/fi- 14Н)(!13 »¡.^яииаа

pi-SWU4ti)<;rj • .............. - »'"»m»™

pf-rjSAi 48)CD ................»и|Ц№Ша

ji(-W9/»MilO'/,.ji ........................... ^МЖЗ

l>(-2.0/+US)GU .. I l 1——.

p(-)13W-WA-213A-m)GIJ -

pt+NSA-Smn.S*

.........

Относительные единицы люцифервнюй актиатсти О 0.2 0.J 0.6 IJ.S 1.0

Рис. 2. (А) Схемы плазмидных конструкций, содержащих репортсрный ген люциферазы (Luc) иод контролем различных делеционных мутантов промоторной области гена mak-v. Сайт инициации транскрипции обозначен как {►), направление транскрипции гена mak-v мыши указано стрелкой. (Б) Относительная активность репортерного гена люциферазы под контролем делеционных мутантов промоторной области гена mak-v в клетках линии РС12.

pCLl-iîu\ic 4 pt-347/-H4S)GL. pf-SIIXfrUSlGI., pf-735M4S)(iL} P(-ll.mUS)GÏJ p(-2.1/+14S)GL. p(-1139/+MSi*2M/H0S)CL3

репортерного гена люциферазы под контролем различных фрагментов промотора гена так-у в этих клетках был сходным, хотя абсолютная активность, нормированная на активность раннего промотора цитомегаловируса, в клетках линии КСМЛ-100 была на порядок ниже, чем в клетках линии КСМЛ-0 (Рис. ЗБ). Это предполагает, что репертуар и активность транскрипционных факторов в клетках и/или более дистальные регуляторные элементы могут оказывать существенное влияние на транскрипцию гена так-у. Однако возможно, что различия в активности промотора, наблюдаемые при анализе активности репортерного гена, не являются единственной причиной отсутствия транскрипта так-у в клетках линии КСМЛ-100, что предполагает существование механизмов регуляции активности промотора так-у, которые не оказывают влияния на активность промотора в составе трансфицированной плазмиды. Одним из таких механизмов является метилирование геномной ДНК, приводящее к ингибированию транскрипции. Проведенный предварительный анализ статусов метилирования промоторной области гена пгак-у в клетках линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100 с использованием расщепления геномной ДНК чувствительными к метилированию рестрикционными эндонуклеазами показал, что промоторная область гена так-у метилирована в клетках линии КСМЛ-100, но не в клетках линии КСМЛ-0 (Рис. ЗВ). Таким образом, статусы метилирования промоторной области гена так-у различаются в клетках линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100, и ее избыточное метилирование коррелирует с отсутствием транскрипта так-у. Это позволяет предположить, что метилирование играет существенную роль в регуляции активности промотора гена так-у и, принимая во внимание частое абберантное метилирование геномной ДНК в опухолевых клетках, может вносить вклад в появление наблюдаемых различий в уровне транскриптов так-у в опухолевых клетках [8].

mak-v/ flunk

IGAPDH

KCMJI-fl Относительная пюцифсрюная октичшкть О 0.2 (Ы 0.6 0.S 1.0

рОи-Йаш pr-.uv-us>ai3, Pi-SDS/*14S)GU pf&IAttyCIJ

КС МЛ-100 Омииттемнт ;тци<1#рамая активность О 0.2 0.4 0.6 М 1.0

fGU-Baae р<-347М4Ы;и p(S(IS/*14S/CLS 1>(-2.I/H4S)GU

VI i

с^/ с/

.т.. .

М Н М И

03 т. п.и.

Рис. 3. (А) Норзерн-блот анализ транскрипта mak-v в клетках линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100. Мембрану также гибриднзовали с зондом GAPDH для нормализации нагрузки образцов. (Б) Относительная активность реиортеркого гена люциферазы под контролем делеционных мутантов промоторной области гена mak-v в клетках линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100. (В) Саузерн-блот анализ геномных ДНК, изолированных из клеток линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100 и гидролизованных ресгрикционными эндонуклеазами Not\ и Есо12\. Если указано, ДНК дополнительно расщеплялась рестрикционными эндонуклеазами Mspl (М) или Нра\\ (И). В качестве зонда для гибридизаци был использован меченный фрагмент нт-508 ... -347 промоторной области гена mak-v мыши.

) .2. Внутриклеточная локализация и статус фосфорилирования MAK-V

Функции и активность протеинкиназ часто контролируются посредством их фосфорилирования и изменениями во внутриклеточной локализации. Кроме того, компартментализация белков часто связана с их функциональной ролью в клетке. Поэтому были исследована внутриклеточная локализация протеинкиназы MAK-V в клетке и ее статус фосфорилирования.

1.2.L Локализация MAK-Vна центросоме

Внутриклеточная локализация трансгенно продуцируемой протеинкиназы MAK-V была исследована с помощью метода иммунофлуоресцентного анализа с анти-MAK-V антителами. В клетках линии COS-! MAK-V характеризуется нуклео-цитоплазматической локализацией с отчетливой окраской центросом, выявленных с помощью антител против 7-тубулина (Рис. 4) [6,17]. Аналогичные результаты были получены и с белком MAK-V, продуцируемым как химера с зеленым флуоресцентным белком (EGFP), а также в клетках других линий (ВНК-21, СНО, HeLa В). О специфичности локализации MAK-V на центросоме и ее транспорта в ядро говорит тот факт, что удаление части каталитического

Рис. 4. Нуклеоцитоллазматическая и центросомальная локализация трансгенно продуцируемой нрогеинкиназы МАК-У (А), но не ее мутанта L301Р (Б) в клетках COS-1. Клетки COS-1 транзиторно трансфицировали плазмидами для продукции соответствующих белков и окрашивались антителами к иротеинкиназе MAK-V и у-тубулину. Изображения были получены на конфокальном микроскопе Leica с использованием объектива х!00.

Рис. 5. Детекция эндогенно продуцируемой протеи нкиназы МАК-У в центросомальной фракции белков. Приведены результаты Вестерн-блот анализа с анти-МАК-У антителами суммарных лизатов так-у-негативных клеток КСМЛ-100 (1) и /иаА-у-позитивных клеток КСМЛ-0 (2), а также пост-ядерного (3) и пост-центросомального (5) супернатантов к центросомальной фракции (4), приготовленных из клеток КСМЛ-0. (6) - лизат клеток, трансгенно продуцирующих белок МАК-У с С-концевым РЬАС-эиитопом.

домена в белке ЕвРР-МАК-У или замена инвариантной аминокислоты каталитического домена Ь301Р приводило к отсутствию окраски МАК-У на центросоме и в ядре (Рис. 4). Эти же результаты указывают и на необходимость присутствия интактного каталитического домена для центросомальной и ядерной локализации протеинкиназы ¡МАК-У, что подтверждается центросомальной локализацией белка с удаленным О концевым доменом и ее отсутствию при удалении Ы-концевой части белка МАК-У, содержащей каталитический домен. Центросомальная локализация МАК-У подтверждается присутствием в центросомальной фракции при биохимическом фракционировании клеток линии КСМЛ-0 эндогенной протеинкиназы МАК-У (Рис. 5), выявленной с помощью полученных нами антител, способных детектировать эндогенный белок МАК-У [12]. Таким образом, протеинкиназа МАК-У специфически локализуется на центросомах клеток.

Центросомальная локализация МАК-У в клетке предполагает связь между этой

протеинкиназой и функциями центросомы. Центросома является основным центром

организации микротрубочек, и центросомальная локализация МАК-У может указывать на

связь МАК-У с микротрубочковым цитоскелетом. Интересно отметить, что родственные

МАК-У протеинкиназы МАЯК 1/2 действительно влияют на динамику микротрубочек,

однако продукция MAfi-V не оказывала влияния на архитектуру микротрубочкового цитоекелета и не влияла на процесс сборки микротрубочек после деполимеризации. Другим фундаментальным клеточным процессом, в котором центральную роль играет центросома, является клеточное деление, и фосфорилирование центросомальных белков, опосредованное ассоциированными с центросомой протинкиназами, играет важную роль в контроле клеточного цикла. Это предполагает, что MAK-V может принимать участие в регуляции клеточного цикла. В пользу этой гипотезы говорит выявленная регуляция транскрипции MAK-V факторами транскрипции семейства E2F, которые играют важную роль в прогрессии клеточного цикла. Более того, предположение о роли MAK.-V в регуляции клеточного цикла подтверждается данными Сакаи и соавторов, продемонстрировавших участие MAK-V в контроле пролиферативной активности клеток дистальной части почечных канальцев.

1.2.2. Фосфорилирование протеинкиназы MAK-Vв клетке Фосфорилирование является одним из способов регуляции активности протеинкназ. Дчя анализа статуса фосфорилирования протеинкиназы MAK-V белок «дикого» типа с FLAG-эпитопом и его различные мутанты были транзиторно продуцированы в клетках линии COS-7, иммунопреципитированы и их фосфорилирование было проанализировано с помощью фосфо-специфических антител, В результате анализа было установлено, что белок дикого типа и его мутантные формы фосфорилированы по остаткам серина (Рис. А ! 2 3 4 S Б MW! 2 3 4 5 ! 2 3 4 5 В

№' Р~Ш

Рис. 6. А, Б - Анализ фосфорилирования белка MAK-V-FLAG и его мутантов в клетках линии COS-7. Ahth-FLAG-M2 антитела (А) и анти-фосфосериновые (P-Ser) или анти-фосфотреониновыми (P-Thr) антитела (Б) использовали для Вестерн-блопинга белков, иммуноиреципитированных из лизатов клеток линии COS-7, транзиторно продуцирующих белок MAK-V-FLAG (1) или его мутантные формы AUBA (2), L301P (3), K91R (4), и из лизатов нетрансфицированных клеток (5). Положения маркеров молекулярных весов (MW) отмечены слева, молекулярные веса приведены в кДа. Стрелками в (А) и (Б) отмечены белковые полосы, окрашиваемые только в лизатах клеток, продуцирующих белок MAK-V-FLAG или его мутантные формы. В (А) звездочками отмечены выявляемые при Вестерн-блоттинге цепи aHTH-FLAG-M2 моноклональных антител, частично элюируемые с аффинного матрикса. В - Анализ фосфорилирования белка MAK-V-FLAG в клетках РС12ТеЮп с гетрациклин-регулируемой экспрессией MAK-V-FLAG. Вестерн-блоттинг с aH-ra-FLAG-M2 антителами фракций фосфорилированных (Р+) и нефосфорилированных (Р-) белков клеток PCi2TetOn с индуцированной (+) или неиндуцированной (-) экспрессией белка MAK-V-FLAG. I - суммарные лизагы клеток до очистки на аффинном матряксе.

6А,Б) [10]. Кроме того, было обнаружено, что вместе с белком МАК-У и его мутантами ко-преципитируется фосфобелок с молекулярным весом около 90 кДа (Рис. 6А). Это белок был очищен и идентифицирован с помощью МА1ЛЭ1-ТОР спектрометрии как белок-шаперон Нзр90. При этом иммуноцитохимический анализ транзиторно трансфицированных клеток показал, что белок МАК-У часто детектируется в структурах, предположительно являющихся агресомами, содержащими неправильно сложенные белки. Это предположение подтверждается декорацией этих структур белком-шапероном Шр70, выявленной с помощью иммуноцитохимического анализа (Рис. 7). Поэтому можно сделать вывод о том, что МАК-У при экспрессии в клетках имеет тенденцию к формированию агрегатов, и ассоциация шаперона Шр90 с белком МАК-У является следствием его неправильного фолдинга. Нефизиологичность выявленного взаимодействия МАК-У с Шр90 подтверждается и отсутствием №р90 в комплексе с МАК-У при очистке протеинкиназы из клеток линии РС12ТеЮп с индуцибельной экспрессией МАК-У, в которых МАК-У не формирует агрегатов (см. п. 1.6.1 ниже). Для демонстрации того, что обнаруженное фосфорилирование протеинкиназы МАК-У не является артефактным из-за формирования агрегатов при транзиторной продукции белка, был проведен анализ статуса фосфорилирования МАК-У в клетках РС12ТеЮп, который показал, что значительная часть МАК-У присутствует во фракции фосфобелков (Рис. 6В) [10]. Таким образом, протеинкиназа МАК-У подвержена фосфорилированию в клетке, что является основанием для исследования его роли в регуляции протеинкиназы МАК.-У.

Рис. 7. Ко-локализация белка EGFP-MAK-V и H.sp70 на структурах, схожих с агресомами. Клетки COS-1 транзиторно трансфицировади илазмидой для продукции белка EGFP-MAK-V и окрашивались антителами к Hsp70. Белок EGFP-MAK-V выявляли по зеленой флуоресценции EGFP. Изображения были получены на конфокальном микроскопе Leica с использованием объектива хЮО.

1.3. Потенциальные белки-партнеры по взаимодействию с МАК-У Белок-белковые взаимодействия являются одним из факторов, определяющих биологические функции белков в клетке. Идентификация партнеров по взаимодействию может позволить ассоциировать исследуемый белок с определенными молекулярными процессами и послужить отправной точкой для выявления его роли в определенной цепи молекулярных событий. Поиск потенциальных партнеров по взаимодействию с протеинкиназой МАК-У с использованием двугибридной системы в дрожжах позволил

Таблица 1. Белки, взаимодействующие с протеинкиназой MAK-V в двугибридной системе в дрожжах.

1 (ашание белка Нуклео'гидная i юсяедоватед ьность (GencBank Асс. No.) Функции белка

Rabaptin-5 (включая 5 и 7 изоформы) NM J) 19400 Эффектор малых 1ТФаз - ре1"уляторов раннего эндоцитоза Rab5 и Rab4; выполняет функцию платформы для взаимодействия белков.

Е6ТР1 /signal-induced proliferation-associated 1 like 1 NM_172579 Содержит Rap/Ran GAP-домен.

mFATl NM_001081286 Протокадгерин; суирессор опухолевого роста у D.melanogaster; peiyiwrop динамики актинового цитоскелета и клеточной полярности.

Periphilin-1 NM_ 146062 Необходим для эмбрионального развития и в нервной системе; участвует в регуляции клеточного цикла.

BEN-domain containing protein 5 NM 026279 Неизвестны.

Hypoxia inducible factor 1, alpha subunit inhibitor (FIH-1) NM_017902 Аснарагинил гидроксилаза; взаимодействует с фактором, индуцируемым гиноксией-1а (HlF-la) и ингибирует его транскрииционную активность.

Centaurin-73, изоформа a AF413079 Содержит Arf GAP-домен; потенциальный peiyimop мембранного транспорта и актинового цитоскелета.

идентифицировать ряд таких белков [1-3], суммированных в Таблице 1. Среди изолированных белков, специфически взаимодействующих с МАК-У в дрожжах, присутствует сходный с белком Рабаптин-5 белок, получивший название Рабаптин-58, характеризующийся делецией 40 аминокислот в И-концевой части полипептида по сравнению с Рабаптином-5, не приводящей к сдвигу рамки считывания [2,4]. В дальнейшем было показано, что протеинкиназа МАК-У сохраняет способность взаимодействовать и с самим Рабаптином-5 (Рис. 8), а также с другой его впервые клонированной нами у-изоформой с делецией 43 аминокислотных остатков (Рис. 9А) [4]. Картирование участков белков, опосредующих их взаимодействие, показало, что для взаимодействия необходима 1Ч-концевая часть протеинкиназы МАК-У, содержащая каталитический и Б>Ш/иВА-домен, а в Рабаптине-5 и его изоформах - аминокислоты 407663 в С-концевой части, что объясняет взаимодействие с МАК-У не только Рабаптина-5, но и его изоформ, делеции в которых находятся в И-концевой части полипептидной цепи (Рис. 9). Обнаруженные взаимодействия, требующие дальнейшего исследования, в том числе и проверки их существования в клетке, служат отправной точки для детального исследования связи протеинкиназы МАК-У с молекулярными процессами, в которых участвуют ее идентифицированные потенциальные партнеры по взаимодействию

Рис. 8. Анализ взаимодействия протеинкиназы МАК-У и Рабаптина-5 в дрожжевой двугибридной системе. Приведены результаты анализа активности репортерного гена Ьас2 в дрожжах, продуцирующих химеры МАК-У и Рабаптина-5 с ДНК-связывающим (ОЛЫво; или активирующим транскрипцию (САЬ4ЛВ) доменами фактора транскрипции СА1Д соответственно.

бЛ14,г Рамтш»-*

Рис. 9. Картирование фрагментов белка Рабаптина-5 и его изоформ (А) и протеинкиназы MAK-V (Б), опосредующих их взаимодействие. Сверху приведены схемы строения Рабаптина-5 (А) и протеинкиназы MAK-V (Б) с указанием положения структурных доменов (в аминокислотных остатках). СС1-1...СС2-2 -области coiled-coil в белке Рабаптин-5. Также показаны отсутствующие участки полипептидной цепи в 5 и у изоформах Рабаптина-5 (А). Ниже приведены схематические изображения химер делеционных мутантов Рабаптина-5 с активирующим транскрипцию доменом фактора транскрипции GAL4 ((¡Л1.4,ш) (А) и протеинкиназы MAK-V с ДНК-связывающим доменом GAL4 (GAL4BP) (Б). Справа приведены результаты анализа активности репортерного гена LacZ в дрожжах, ко-продуцирующих соответствующие химеры делеционных мутантов и химеру ДНК-связывающего домена GAL4 с протеинкиназой MAK.-V (аминокислоты 26-714) (А) или химеру Рабаптина-56 (аминокислоты 137-862) с активирующим транскрипцию доменом фактора транскрипции GAL4 (Б).

(Таблица I). В частности, один из таких белков, протокадгерин mFATf, является еупрессором опухолевого роста у Drosophila и играет существенную роль в формировании почек, глаза и нервной головного мозга, органов, в которых протеинкиназа MAK-V играет, как это было продемонстрировано экспериментально, определенную роль.

1.4. МАК-У как регулятор эндоцитоза

Обнаруженное взаимодействие протеинкиназы МАК-У с Рабаптином-5, белком,

который является эффектором малых ГТФаз Т1аЬ5 и ЯаЬ4, ключевых регуляторов раннего

эндоцитоза и рециклинга ранних эндосом, соответственно, позволяет предположить ее

связь с процессами эндоцитоза в клетке. Для проверки этого предположения были

использованы клетки линии ВМР-0, лишенные экспрессии так-у, в которые с помощью

обмена экспрессионными кассетами, опосредованного рекомбиназой Пр, вводилась

кассета для экспрессии протеинкиназы МАК-У, ее каталитически неактивного мутанта,

лишенного М-концевой части, включая фрагмент катштитического домена, или «пустая»

кассета. В клетках, продуцирующих протеинкиназу МАК-У, эндоцитоз жидкой фазы,

измеренный по содержанию эндоцитируемой пероксидазы, в 2 раза превышал уровень

эндоцитоза контрольных клеток или клеток с экспрессией каталитически неактивного

делеционного мутанта МАК-У (Рис. ¡0) [1]. Это указывает на участие протеинкиназы

МАК-У в регуляции процесса эндоцитоза, возможно, за счет взаимодействия и

Б У.Е.Л 2-0-

Рис. 10. Схемы белка МАК-У и его делеционного мутанта, продуцированных в клетках ВМР-0 в результате Е'1р-рекомбинации (А), и количество

эндоцитированной пероксидазы в

клетках (в условных единицах, У.Е.) (Б) после рекомбинации кассеты для экспрессии протеинкиназы МАК-У, ее

.г делециоиного мутанта (МАК-УДкдп) и

' «пустой» кассеты (-).

фосфорилирования Рабаптина-5, тем более что Рабаптин-5 фосфорилируется в клетке. Однако влияние его фосфорилирования на его функции в эндоцитозе, а также протеинкиназы, ответственные за фосфорилирование Рабаптина-5, остаются на настоящий момент неизвестными. Таким образом, выявление потенциальных партнеров по взаимодействию с протеинкиназой МАК-У в двугибридной системе в дрожжах позволило установить участие протеинкиназы МАК-У в регуляции эндоцитоза в клетке.

1.5. Мыши с направленно-нарушенным геном так-у

Для исследования функций протеинкиназы МАК-У в масштабах организма были получены мыши, дефектные по функциональной протеинкиназе МАК-У. Для этого были получены клоны эмбриональных стволовых клеток, в которых в одном аллеле гена так-у был удален экзон 4, кодирующий часть субдомена VII, субдомен VIII и часть субдомена IX каталитического протеинкиназного домена. Кроме того, удаление экзона 4 приводит к сдвигу в рамке считывания, и транслируемый с такого транскрипта белок состоит из 203 Ы-концевых аминокислотных остатков белка МАК-У. Таким образом, делеция экзона 4 гена приводит к продукции нефункционального белка МАК-У. Один из полученных клонов эмбриональных стволовых клеток мыши E14Tg2a с гомологичной рекомбинацией конструкции для делеции экзона 4 гена так-у был использован для получения химерных мышей. В результате последующего скрещивания с мышами линии С57В1/61 были получены мыши с терминальной передачей дефектного аллеля (так-у), которые подверглись скрещиванию с мышами линии С57В1/61 на протяжении б поколений для получения аллеля так-у на «чистом» генетическом фоне. В силу отсутствия антител, пригодных для детекции эндогенного белка МАК-У, был проведен анализ транскрипта так-у в головном мозге мышей, гомозиготных по аллелю так-у, с использованием ПЦР с праймерами, фланкирующими область транскрипта, соответствующей экзону 4. В то время как в мозжечке так-у'/+ мышей детектировался фрагмент размером 826 п.н., соответствующий аллелю так-у «дикого» типа, он отсутствовал при амплификации на матрице РНК мозжечка так-у мышей. Однако, наряду с 690 п.н. фрагментом, соответствующим делеции экзона 4, детектировался дополнительный продукт

Рис. И. (А) Схема фра( мента кДНК mak-v (экзоны 2-7). Праймера, использованные в ОТ-ПЦР, показаны Сфелками. Ниже приведены схемы продуктов амплификации кДНК, транскрибируемых с аллеля mak-v «дикого типа» (и7), направленно нарушенного аллеля без экзона 4 (КОАех4) и без дополнительно делегированного экзона 5 (K()Acx4S-5) с указанием расчетных длин продуктов амплификации. (Б) Результаты ОТ-ПЦР на матрице РНК, изолированной из мозжечков мышей mak-v4' (1), mak-v+!' (2) и muk-т (J). MW - стандарт молекулярных весов ДНК в и.н. ОТ+ и ОТ- обозначают ГЩР на матрице реакций обратной транскрипции с (+) и без {-) добавления обратной транскришазы.

амплификации размером 528 п.н., который после определения его нуклеотидной последовательности был идентифицирован как соответствующий одновременной делеции экзонов 4 и 5 (Рис. 11). Существенно, что делеция экзонов 4 и 5 не приводит к сдвигу рамки считывания и будет приводить к трансляции белка, полностью идентичного МАК-V, но лишенного аминокислот 201-291, входящих в состав каталитического домена, и, поэтому, лишенного каталитической активности. У животных, гетерозиготных по нарушенному аллелю (mak-v '"), преимущественно присутствовал транскрипт аллеля «дикого» типа (Рис. И), причем было продемонстрировано, что это не может быть обусловлено материнской или отцовской селекцией аллеля. Преимущественное присутствие транскрипта аллеля «дикого» типа предполагает существование аллельного переключения для гена mak-v, направленного на продукцию функционального белка, или сниженную стабильность обоих альтернативно сплайсированных транскриптов.

Мыши с направленно нарушенным геном представляют собой уникальный инструмент для выявления роли продукта нарушенного гена в организме. Однако у mak-v и mak-v*'' мышей не было выявлено каких-либо аномалий по сравнению с мышами «дикого» типа, в частности, различий в весе животного, весе почек, фертильности, продолжительности жизни, а также в простых тестах на координацию и активность (grid test и activity camera test). Таким образом, продукция нефункционального как протеинкиназа белка MAK-V не вызывает критических изменений в развитии и функционирования организма на модели мыши. Это наблюдение может быть объяснено существованием компенсаторных механизмов, возможно, с участием родственных МАК-V протеинкиназ, что представляется вероятным с учетом установленной «молодости» гена mak-v в эволюционном контексте. Возможно, что для фенотипического проявления отсутствия функциональной протеинкиназы MAK-V необходимо присутствие сопутствующего дефекта в другом гене(ах), обуславливающем компенсацию функций MAK-V, или экстремальные воздействия на организм, которые превысят его компенсаторные возможности.

1.6. Роль МАК-У в поддержании жизнеспособности клеток

Деления функциональной протеинкиназы МАК-У в организме мыши не позволило на настоящем этапе выявить связанные с этим аномалии. В то же время, модель культур клеток с транзиторной продукцией МАК-У не является адекватной и физиологичной в силу тенденции МАК-У формировать агрегаты. Для возможности исследования влияния МАК-У на клеточные процессы была предпринята попытка создания клеток с индуцибельной экспрессией МАК-У, что, с одной стороны, предоставляет адекватный контроль сравнения в виде клеток без индукции экспрессии, а с другой - позволяет регулировать уровень экспрессии, что может позволить избежать формирования агрегатов. Принимая во внимания возможную роль МАК-У в нервной системе, нами были выбраны в качестве модели клетки линии РС12, способные дифференцироваться по нейрональному пути.

1.6.1. Клетки с индуцибельной экспрессией МАК-У как модельная система

Были получены клоны клеток линии РС12ТеЮп с индуцибельной экспрессией белка МАК-У с С-концевым РЬАО-эпитопом и его каталитически неактивным мутантом К91Я. Для дальнейшей работы были выбраны по одному клону, характеризующихся низким уровнем продукции трансгена без индуктора и наиболее близко соотносящиеся по уровню продукции белков в присутствии индуктора (Рис. 12А). Важно, что по результатам иммуноцитохимического анализа индукция экспрессии белка МАК-У не приводила к формированию агрегатов, а наблюдалась только типичная локализация белка МАК-У на центросомах (Рис. 12Б,В).

А Н анти-ГЬДС нитя-у-губудии

Рис. 12. Клоны клеток с индуцибельной экспрессией МАК-У. (А) Вестерн-блот анализ лизатов клеток РС12ТеЮп (РС12) и их клонов с индуцибельной экспрессией белка МЛК-У-П.АО (клон 14) и его мутанта К91Я (клон КЯ5), обработанных (+) и необработанных (-) индуктором (доксициклин). (Б, В) Иммуноцитохимический анализ клеток клона 14, необработанных (1К)Х-) или обработанных доксицикликом для индукции экспрессии белка МАК-У-РЬАв (ООХ+), с анти-РЬАС антителами и антителами к у-тубулину. Изображения были получены на конфокальном микроскопе КаШапсе2100 (ВюКасГ) с использованием объектива х40.

1.6.2. МАК-У и Мп2л-индуцированная цитотоксичность

Клетки РС12 широко используются как модель для анализа токсичности различных веществ, в частности, бивалентных ионов. Проведенный анализ показал, что экспрессия МАК-У задерживает гибель клеток, вызванную ионами Мп2' (Рис. 13), длительное воздействие которых на клетки нервной системы приводит к проявлению черт, характерных для болезни Паркинсона, и сопряжена с уменьшением активации про-апоптотических каспаз, что свидетельствует о супрессии апоптотических процессов при экспрессии МАК-У. Учитывая выраженную экспрессию МАК-У в клетках нервной системы, на основании полученных результатов можно сделать предположение о роли МАК-У в защите клеток нервной системы от ассоциированной с ионами марганца токсичности.

Рис. 13. Экспрессия протеинкиназы МАК-У задерживает Мп~ -индуцированную клеточную гибель. Клетки клона 14 засевали в покрытые ламинином лунки 96-луночного планшета и обрабатывали (ООХ+) или не обрабатывали (ООХ-) доке иди клипом с последующей обработкой 2 м М хлоридом марганца в течение 36 часов. После этого определяли жизнеспособность клеток по количеству внутриклеточного АТФ (А) и активацию каспаз-3/7 (Б) с использованием люминометрических методов анализа. Данные приведены в относительных единицах люминисценции (ОЕ). *,Р=0.0089; **,Р=0.0011.

1.6.3. Влияние МАК-У на дифференцировку клеток РС12Те!Оп по нейрональному

пути

Учитывая возможную роль МАК-У в нервной системе, было исследовано влияние МАК-У на дифференцировку клеток линии РС12ТеЮп по нейрональному пути под действием нейронального фактора роста. Индукция экспрессии МАК-У в клетках, культивируемых на коллагене IV, приводила к появлению большего абсолютного числа клеток с отростками по сравнению с клетками, не обработанными индуктором (Рис. 14). В то же время, было отмечено большее общее число клеток при экспрессии МАК-У к 7-му дню дифференцировки, а доля клеток с отростками была приблизительно одинаковой вне зависимости от экспрессии МАК-У. Это предполагает, что МАК-У не влияет непосредственно на процесс дифференцировки, но увеличивает жизнеспособность клеток, что подтверждается отсутствием различий в средней длине отростков и их усредненном количестве на клетку для популяций клеток, обработанных и не обработанных индуктором.

ОЕ I

400 -1 ^ I

А «К

41» 300

»ох: + - + ООХ:

МаС1,

Рис. 14. Одинаковое количество клеток клона 14 (-30000 клеток) высевали на покрытые коллагеном IV чашки и культивировали в присутствии нейронального фактора роста с (ООХ+) или без (Г)ОХ-) доксициклина. Приведены данные по процентному составу клеток с отростками (А) и общему числу клеток (Б) через 6 дней инкубации для двух независимых экспериментов (Эксп. 1 и Эксп. 2).

1.6.4. МАК-У и клеточный ответ на компоненты внеклеточного матрикса

Увеличение жизнеспособности клеток РС12ТеЮп в ответ на продукцию протеинкиназы МАК-У может быть обусловлено увеличением пролиферативной активности клеток или супрессией их гибели. Анализ жизнеспособности клеток показал, что коллаген IV, но не ламинин, вызывает гибель клональной производной клеток РС12ТеЮп с индуцибельной экспрессией МАК-У. При этом гибель клеток сопровождалась активацией про-апоптотических каспаз и супрессировалась при экспрессии МАК-У (Рис. 15). Специфичность эффекта продукции МАК-У на увеличение жизнеспособности клеток подтверждается отсутствием аналогичного эффекта при продукции каталитически неактивного мутанта МАК-У. Полученные результаты позволяют сделать вывод о положительном влиянии МАК-У на жизнеспособность клеток. Интересно отметить, что этот вывод подтверждается данными двух независимых анализов участия протеинкиназ в поддержании жизнеспособности клеток, выявивших МАК-У как одну из таких протеинкиназ, значимость которой, однако, зависит от типа клеток. Таким образом, продукция протеинкиназы МАК-У может позитивно влиять на жизнеспособность клеток в определенном контексте, в частности, в ответ на контакт клеток с определенным типом внеклеточного матрикса. Поскольку контакты клеток с внеклеточным матриксом играют важную роль в процессе развития, обнаруженный феномен может являться ключом к роли МАК-У в процессах развития, а также быть существенным для опухолевых клеток, характеризующихся увеличенным уровнем продукции протеинкиназы МАК-У.

1.7. Продукция МАК-У в опухолях молочной железы человека Клонирование кДНК протеинкиназы МАК-У и ее способность влиять на жизнеспособность клеток явились предпосылками для исследования экспрессии МАК-У в опухолях. Для анализа были выбраны опухоли молочной железы человека так как

ок

«в

А ОЕ

ктоя £4

+ - ООХ: клон КК5

+ . +

кадлйген iv ламикшз

5 рзсщеидеивая

ОЕ

41«) -3№

ОЕ

(СЛОИ .14

РСЙТеЮп

4- о -3* иолл. IV ламшшн ¡слоя 14

КОЛЛ. IV ЯЯ.ШШЯИ

РСПТсЮя

Рис. 15. Протеинкиназа МАК.-У сунрессирует коллаген 1У-индуцированную апоптотическую гибель клеток РС12ТеЮп. (А) Количество жизнеспособных клеток клонов 14 и К К 5 с индуцибельной экспрессией нротеинкиназы МАК-У или ее мутанта К 9) Г\. соответственно, после инкубации клеток на коллагене IV. (Б) Количество жизнеспособных клеток клона 14 после инкубации клеток на коллагене IV или ламинине. (В) Высвобождение лактат дегидрогеназы в культуральную среду из клеток клона 14 и исходной линии РС12ТеЮп при их культивации на коллагене IV. *, Р<0.0001. (Г) Активность каспаз-3/7 в клетках клона 14 и исходных клетках линии РС12ТеЮп при их культивации на коллагене IV иди ламинине. **, Р-0.0013. (Д) Детекция апонтотических клеток клона 14, культивируемых на коллагене IV, окрашенных аннексином V- НТС, с помощью цитофлуориметрии. (Е) Детекция активной расщепленной каспазы-3 в клетках клона 14, культивируемых на коллагене IV. ООХ+ - клетки, обработанные индуктором экспрессии доксициклином; БОХ- - клетки, не обработанные индуктором экспрессии.

дифференциальная экспрессия так-у наблюдалась в опухолях молочной железы мыши. Иммуногистохимический анализ с анти-МАК-У антителами 17 образцов случайно выбранных опухолей молочной железы человека выявил увеличенную иммунореактивность в 57% случаев. В 4.3% опухолей, а также в прилегающем нормальном эпителии, продукции МАК-У отсутствовала [7,15,16]. При этом не наблюдалось связи между уровнем МАК-У и рядом клинико-патологических параметров

Таблица 2. Увеличенная продукция протеинкиназы МАК-У в опухолевых клетках и клинико-патологические факторы для группы из 17 случайно выбранных опухолей молочной железы человека. Для статистического анализа использовался тест Фишера. Для параметра Возраст величина Р приведена для категорий <60 и > 60. Для параметра Гистотип величина Р приведена для категорий

Число Увеличенная продукции МАК-У/Нипк ВеличинаР

нет да

Возраа (лет) 39-49 50-59 >60 4 5 7 2 3 2 2 2 5 0.3575

Размер опухоли Г, 2.0 см >2.1см 7 9 4 4 3 5 0.6573

Гисготин ДОЛЫЮ8ЫЙ протоковый другие 6 8 3 1 6 1 ^ 2 2 0.0536

Метает азировакие да не[ 6 11 3 5 3 6 1.0000

(Таблица 2) за исключением тенденции к увеличенной продукции МАК-У в опухолях долькового рака по сравнению с протоковым. Исследования 35 образцов протокового рака молочной железы, разбитых на 4 группы по наличию или отсутствию метастазов и по реакции с онкобелком с-ЕгЬВ-2, показали, что, как и при случайной выборке, около половины (54%) образцов были МАК-У-позитивными. Сопоставление статуса продукции МАК-У показало отсутствие его связи с метастазированием, статусом рецепторов стероидных гормонов и окраской ядерного антигена пролиферирующих клеток (РСКА), и выявило преимущественное увеличение продукции МАК-У в опухолях, позитивных по с-ЕтЬВ-2 (Таблица 3), выделяя при этом среди них группу МАК-У-позитивных опухолей [7]. Суммируя, увеличенная продукция МАК-У часто наблюдается в опухолях молочной железы, что позволяет использовать его в качестве молекулярного опухолевого маркера. Кроме того, увеличенная продукция МАК-У уникально выделяет группу опухолей по этому признаку, что может отражать специфические особенности молекулярных процессов в этих опухолевых клетках и в дальнейшем использоваться в прогностических целях или как мишень в противоопухолевой терапии, однако установление таких возможностей требует проведения дальнейших исследований. Существенно, что выявленная способность МАК-У поддерживать жизнеспособность клеток в определенных случаях, в частности, при контактах с молекулами внеклеточного матрикса, может приводить к появлению преимуществ опухолевых клеток с высокой продукцией МАК-У и, соответственно, являться негативным фактором.

Таблиц» 3. Увеличенная продукция протеинкиназы М А К,- V в опухолевых клетках для группы из 35 случаев нротокового рака молочной железы человека. Продукция МАК-У в опухолевых клетках табулировалась как О (отсутствие окраски), 0.5 (слабая окраска, 0.5+). 1 (позитивные по окраске, 1+), 2 (сильно позитивные но окраске, 2-1'), и 3 (очень сильно позитивные по окраске, 3+) и использовалась для вычисления среднего значения и стандартного отклонения (ср.знач.±гт.откп.). Опухоли труппировались по признаку наличия (мет +) или отсутствия (мет-) метастазов, или разбивались на группы с-ЕгЬВ2/Меи-позитивных (3+) и с-ЕгЬВ2/№и-негативных опухолей (А'еиЗ+ и соответственно). Для статистического анализа

Продукция МАК-У Нипк ср.знач..+ Р* Продукция МАК-У/Нипк Продукция МАК-\7НипЬ

0 ,5 1 2 3 СГ.ОТКЛ. 0:4). 5 1:3 !Ь! 2:-?

ме» +

<л~)8) мет- 2 7 5 3 1 0.97+0.80 .6660 9 9 7380 14 4 .7112

Чг.-П) 2 5 5 4 1 1.09+0.83 7 10 12 5

(а 18) 1 5 5 5 2 1.31+0.89 .0343 6 12 .1811 И 7 .1212

3 7 5 2 0 0.74+0.60 10 7 15 2

2. Исследование изменения экспрессии генов при немелкоклеточном раке легкого

Рак легкого занимает одно из первых мест среди онкологических заболеваний при отсутствии в настоящее время эффективных способов его лечения. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе агрессивного поведения опухолевых клеток рака легкого, в том числе и исследование дифференциальной экспрессии генов, позволит, как ожидается, улучшить эффективность лечения за счет персонализации лечения и рационального выбора использующихся терапевтических средств и идентификации новых мишеней для инновационных способов лечения, а также позволит улучшить диагностическую и прогностическую составляющие.

2.1. Супрессор опухолевого роста РёссМ

Экспрессия супрессора опухолевого роста Рс1с<14 часто снижена в опухолях различного происхождения, в том числе и в аденокарциномах легкого, однако снижения экспрессии Рс!сё4 в опухолях плоскоклеточного рака легкого (ПРЛ) ранее установлено не было. Анализ 27 образцов опухолей немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ), 23 из которых являлись ПРЛ, и прилегающих к ним неопухолевых тканей методом полуколичественной ПЦР выявило частую (в 56.5%) и статистически достоверную (Р<0.0001) супрессию транскрипта Рс1сЛ4 при ПРЛ [13,14,19-21]. При этом анализ уровня белка Рскб4 в 14 образцах показал, что уровень белка РсЫ4, несмотря на супрессию транскрипта, часто остается высоким (Таблица 4). Отсутствие падения уровня белка Р(1сс14 было

Таблица 4. Уровни транскриита и белка Pdcd4 в тканях опухолей ПРЛ относительно прилегающих

неопухолевых тканей для 14 проанализированных пар образцов.

Пара (4tp;i !!{;»t Шг1 Ш! ffil #7 IS№ fffil #12 "13 414

Транскрннт 3.3 2.0 1л 0.3 1.9 0 0 0.1 0.04 0.7 0.8 0.3 0.4 0.4

Белок 4.2 3.6 2.3 0.6 4.8 1.7 1.3 1.3 1.1 4.8 >5 >5 >5 >5

подтверждено и с помощью иммуногпстохимического анализа срезов опухолей с анти-Pdcd4 антителами [13]. Этот факт указывает на существование механизмов посттрансляционной регуляции экспрессии Pdcd-4, что подтверждается значительным разбросом значений соотношения уровней транскрипта и белка Pdcd4 в линиях клеток рака легкого. Механизм пост-трансляционной регуляции экспрессии Pdcd4 действительно был выявлен в работах других исследователей, и в нем ключевую роль играет фосфоинозитид 3-киназный (PI3K.)/Akt/mammalian target of Tapamycin (mTOR) сигнальный путь, индуцирующий протеолитическую деградацию Pded4. Возможно, что причиной дерегулированного соотношения уровней транскрипта и белка Pdcd4 в опухолях легкого являются дефекты в системе протеолитической деградации Pdcd4, в частности, потеря PTRCP, субъеднницы ЕЗ убиквитнн лигазы, ответственной за убиквитинилирование Pdcd4, которая часто наблюдается в опухолях легкого. Суммируя, как и в аденокарциномах легкого, при ПРЛ часто наблюдается супрессия транскрипта Pdcd4, что позволяет использовать уровень транскрипта Pdcd4 в качестве молекулярного маркера ПРЛ, например, для персонализации терапии пациентов с ПРЛ. Существенно, что анализ уровня белка Pdcd4 в ПРЛ не может быть использован как эквивалент анализа изменения уровня транскрипта Pdcd4, и уровень белка Pded4 может рассматриваться как независимый молекулярный параметр для ПРЛ.

2.2. Ингибитор Wnt-спгнального пути WIF1

Аномальная активация Wnt-сигнального пути часто наблюдается в опухолях различного происхождения и вносит свой вклад в формирование и прогрессию опухолевого фенотипа, в частности, в случае опухолей легкого. Одним из негативных внеклеточных регуляторов Wnt-сигнального пути является белок WIF1, экспрессия которого часто супрессирована в опухолях различных типов [9]. Анализ 21 образца НМКРЛ (из них 17 - ПРЛ) и прилегающих неопухолевых тканей показал, что в 14 случаях (из них 13 - ПРЛ) наблюдается снижение уровня транскрипта WIF1 в ткани опухоли, что соответствует ранее опубликованным результатам других исследований и дополняет их, увеличивая статистическую значимость [11,19,22]. Анализ уровня белка VVIF1 в 6 парах образцов лизатов тканей опухолей и прилегающих неопухолевых тканей показал, что падение транскрипции WIF1 сопровождается и падением уровня белка [11]. Это

наблюдение позволяет использовать как равнозначные маркеры для диагностических целей уровни транскрипта и белка \VIF1. Существенно отметить, что продукция \VIF1 в прилегающей нормальной ткани оставалась на высоком уровне, что позволяет сделать вывод о локальном характере действия \VIF1 и отсутствии компенсации падения уровня \VIF1 в опухоли за счет его секреции прилегающими тканями [11].

3. Супрессор опухолевого роста Рс1сс14 как мишень для противоопухолевой терапии

Супрессор опухолевого роста Р{Ы4 рассматривается как перспективная мишень для терапии онкологических заболеваний. Это определяется его частой супрессией в опухолях различного происхождения и тем, что в различных модельных системах восстановление экспрессии Рс1сс14 приводило к ингибированию пролиферативнолй активности клеток, снижению их подвижности и инвазивности, апоптотической гибели клеток, их сенсибилизации к действию противоопухолевых агентов и другим анти-неопластическим эффектам [14]. Для ответа на вопрос о возможности использования восстановления экспрессии Р/Зсс14 в опухолях легкого в качестве анти-неопластической терапии были исследованы последствия восстановления экспрессии Р<1а14 в клетках линий рака легкого. Заражение клеток линий N0-111299, N0-11358, Са1и-1 и А549 аденовирусом для продукции химеры белка Рс1сс14 с зеленым флуоресцентным белком (ЕОРР) не приводило к изменению их пролиферативной активности и не влияло на эффективность действия ряда химиотерапевтических средств. Эти результаты предполагают, что экспрессия Р<Лс<14 в клетках рака легкого может быть неэффективной как способ восстановления активности Рс1сс14. Действительно, транзиторкая экспрессия Р<1сс14 при трансфекции экспрессионной конструкции в клетки линии N01-111299 позволяла достичь продукции трансгенного белка Рс1сй4 лишь на низком уровне (Рис. 16) и не оказывало влияния на АР-1-зависимую транскрипционную активность, которая считается основной мишенью для Р<1с<34 как супрессора опухолевого роста (Рис. 17).

EOFP-Pdcd4

PdctU

atnnu~Ptkd4

NPT

анти-NPT

1.0 3.5 4.2 6.Й

Рис. 16. Экспрессия химеры РОГР с Pdcd4 и его мутантами в клетках линии N0-111299. Эндогенный Pdcd4 и трансгенно продуцируемые химеры Pdcd4 с ЕвКР детектировали с помощью анти^1са4 антител. Для нормализации образцов использовали уровень продукции неомицин

фосфотрансферазы II (NPT). кодируемой илазмидой для экспрессии химеры РО г Р с Pdcd4 и его мутантами. Внизу приведены относительные количества химер Pdcd4 и его мутантов с ЕСКР после нормализации на уровень продукции ЫРТ.

йЖШ' ■

: ' !

Щшт- ..............)

Рис. 17. Экспрессия мутанта Pdcd4S67'71 457\ но не белка Pdcd4 «дикою» типа, ингибирует API-зависимую транскрипцию в клетках NCI-HI 299. Приведена активность дюциферазы в клетках, трансфицированных указанными экспрессионными векторами и илазмидой с АР-1-зависимой транскрипцией реиортерного гена люциферазы. *, />=0.002; **, />=0.0075.

Потеря экспрессии Pdcd4 в опухолевых клетках может быть обусловлена супрессией транскрипции гена, в том числе из-за гиперметилирования промоторной области гена, микроРНК m¡R-2I-зависимой деградации транскрипта и ингибирования трансляции, а также поет-трансляционно благодаря PI3K/Akt/mTOR/S6 киназа ! (S6K1)-зависимой протеолитической деградации белка. При транзиторной трансфекции супрессия транскрипции гена Pdcd4 и микроРНК-зависимое ингибирование экспрессии не могут оказать влияния на продукцию трансгенного белка в силу использования гетерологичного промотора и отсутствия в экспрессионной конструкции сайта связывания микроРНК miR-21, соответственно. Однако остается возможной PI3K/Akt/mTORyS6Kl-зависимая деградация белка, которая опосредуется фосфорилированием серина-67 Pdcd4 S6 киназой i с последующим фосфорилированием серинов-71 и -76 и убиквитинилированием белка. Действительно, обработка клеток ингибитором mTOR рапамицином приводила к существенному увеличению уровня как эндогенного, так и транзиторно продуцируемого белков Pdcd4 (Рис. 18, 19). Помимо S6 киназы 1, протеинкиназа Akt может сама фосфорилировать ссрины-67 и -457 Pdcd4, что, как было продемонстрировано ранее, приводит к снижению активности Pdcd4. Замена серинов-67, -71 и -457 на их нефосфорилируемый аналог аланин приводила к выраженному увеличению продукции белка в клетках линии NC1-H1299, на которую не оказывал

- гяр

а-ту&улин мши*** а-туоулин

Рис. 18. EGFP-Pdcd4 (А), но не EGFP-Pdcd4s"J"57 (Б) стабилизируется ранамицином (rap) в клетках NC1-H1299.

If гор MG

„ . Рис. 19. Стабилизация эндогенного белка Pdcd4 в

дай клетках «С1-Н1299 1.У294002 (ЬУ), ранамицином

(тар) и ингибитором протеасом М0132 (МС).

а-тубулнн

влияния рапамицин (Рис. 16, 18). Это указывает на то, что именно активация Р13К/А1я/тТСЖ-сигнального пути, часто происходящая в опухолевых клетках, является причиной супрессии уровня Рс1сс14 в клетках N01-111299. Более того, анализ уровней продукции белков, содержащих только мутацию 8457А, показал, что фосфорилирование серина-457, как и серинов-67 и -71, также приводит к снижению уровню белка, что впервые указывает на роль фосфорилирования Рс1сс14 по серину-457 в контроле его стабильности. При этом было установлено, что максимальный уровень продукции РсЫ4 достигается при комбинации этих мутаций (Рис. 16). Существенно, что экспрессия мутанта Рс1с<14 (567,71,457А) приводила к супрессии АР-1-зависимой транскрипционной активности (Рис. 17), что свидетельствует о восстановлении активности Рс1сс14 как супрессора опухолевого роста. Таким образом, впервые показано, что РБК/Акт/шТОЯ сигнальный путь может вносить существенный вклад в ингибирование активности супрессора опухолевого роста РсЫ4 в опухолевых клетках за счет дестабилизации белка (однако нельзя исключить и непосредственное влияние фосфорилирования на активность Р<1сс}4). Полученные нами результаты демонстрируют, что рациональным способом восстановления активности Рс1сс14 в опухолевых клетках является использование нечувствительного к Р13К/Ак1/тТОК-сигнальному пути мутанта Рёсс14 (867,71,457А) [14,21].

4. Экспрессионные модули на основе тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа для терапии опухолей

Генно-терапевтические подходы являются многообещающими в терапии различных заболеваний, в том числе и онкологических, и некоторые из них уже используются в клинической практике. При лечении онкологических заболеваний одной из основных проблем является проблема специфичности воздействия на опухолевые

клетки, которая может решаться различными путями, в том числе и с использованием свойств генов, активность промоторов которых специфична для опухолевых клеток. Одним из таких дифференциально транскрибируемых генов, транскрипционная активность которого отсутствует в подавляющем большинстве клеток организма и часто (около 85%) присутствует в опухолевых клетках, является ген теломеразной обратной транскриптазы человека (hTERT), промотор которого, по результатам многочисленных работ, может быть использован для обеспечения опухоль-специфической транскрипции терапевтического гена. В рамках практической реализации концепции создания отечественных противоопухолевых генно-терапевтических препаратов были созданы экспрессионные модули для продукции тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа (HSV-tk) под контролем фрагмента промотора гена hTERT и его модификаций.

4.1. Дизайн экспрессиоиных модулей

Хорошо известно, что ~200 п.н. фрагмент промотора гена hTERT достаточен для обеспечения эффективной транскрипции в hTERT-позитивных опухолевых клетках, при этом обеспечивая высокую специфичность транскрипции в них по сравнению с hTERT-негативными клетками. В созданных экспрессиоиных модулях был использован фрагмент промотора, покрывающий 206 п.н. вверх от старта инициации транскрипции. Для увеличения эффективности в промоторную область экспрессиоиных модулей были также включены 37 п.н. гена hTERT вниз от старта транскрипции, что, по результатам ранее проведенного исследования, не оказывает влияния на специфичность промотора, однако, существенно увеличивает его активность в клетках, содержащих белок Е6 вируса папилломы человека (HPV) типа 16. Это, учитывая онкогенность этого вируса, позволяет ожидать повышенной эффективности такой генно-терапевтических конструкций на основе промотора гена hTERT в HPV-позитивных опухолях. Промотор гена hTERT является G/C-богатым и не содержит канонических TATA- и СААТ-мотивов. Ранее было продемонстрировано, что введение в промотор гена hTERT синтетического ТАТЛ-бокса или минимального раннего промотора цитомегаловируса позволяет увеличить его активность без потери специфичности по отношению к hTERT-позитивным клеткам. Поэтому нами были созданы варианты экспрессиоиных модулей с фрагментом промотора гена hTERT -206...+37, а также с его модификациями синтетическим ТАТА-боксом (hTERT-TATÄ) и минимальным ранним промотором цитомегаловируса (hTERT-CMV) для проведения их сравнительного анализа и выбора оптимального варианта. В качестве действующего начала была использована кДНК HSV-tk. В присутствии ганцикловира последний эффективно конвертируется HSV-tk, но не клеточными тимидинкиназами, в

ганцикловир-монофосфат с последующим его фосфорилированием клеточными ферментами в токсичный аналог тимидин-трифосфата, ганцикловир-трифосфат, включение которого в ДНК при репликации приводит к ее остановке и гибели клеток. Помимо прямого действия на клетку, продуцирующую HSV-tk, присутствует и ганцикловир-зависимая гибель близлежащих клеток (bystander effect) за счет попадания ганцикловир-монофосфата и его производных в соседние клетки.

4.2. Оптимизация промоторной активности

Сравнительный анализ транскрипционной активности промотора гена ЪТЕИТ -206...+37 и его модификаций был проведен на панели опухолевых клеточных линий различного происхождения с использованием репортерного гена люциферазы. В результате анализа было установлено, что промоторная активность модифицированного промотора кТЕКТ-СМУ не ниже, а часто превосходит активность немодифицированного промотора и его модификации ТАТА-боксом (за исключением клеток меланомы Ме1Ког) (Таблица 5), что делает предпочтительным использование промотора ИТЕЯТ-СМУ.

Таблица 5. Влияние модификаций промотора ЬТЕКТ на ею активность в опухолевых клеточных линиях. «-» - промотор без модификаций; СМУ - модификация минимальным ранним промотором

Линия штох ча- Ш299 чай; ИСП16 (Л (OgfJ T47U Рапс-1 Asl'C-I Д431 MelKor MelCW

- 1.00+ 0.16 l.Oftfc 0.16 1.00* 0.16 l.Oftfc 0.16 l.oott 0.16 l.Oftfc 0.16 1.00* 0.16 1.00* 0.16 l.Oftfc 0.16 l.Oftfc 0.16

TATA 1Л5± 0.09 1.76* 0.21 2.63* 0.02 1.02± 0.08 0.74± 0.01 1.15* 0.04 1.32* 0.01 1.68* 0.34 2.20* 0.06 0.95± 0.34

CMV 1.97± 0.07 2.51* 0.30 8.05* 0.04 1.76* 0.04 1.42* 0.01 3.41± 0.08 4.39* 0.01 1.33* 0.14 1.47± 0.04 1.33* 0.14

4.3. Эффективность экспрессионных модулей in vitro 4.3.1. Эффективность плазмидных конструкций

Эффективность экспрессионных модулей была оценена в модели ганцикловир-зависимого ингибирования роста транзиторно трансфицированных клеток линии NCI-Н1299 в культуре. Введение плазмид, содержащих экспрессионные модули, приводило к выраженному ганцикловир-зависимому ингибированию роста клеток (Рис. 20). При этом модуль с промотором hTERT-CMV обладал несколько большей активностью, что соответствует результатам анализа транскрипционной активности промотора гена hTERT и его модификаций в клетках NCI-H1299. Таким образом, созданные экспрессионные модули способны обеспечивать продукцию HSV-tk и их введение в опухолевые клетки вызывает ганцикловир-зависимое ингибирование их роста.

Рис. 20. Жизнеспособность клеток NCI-H1299, трансфицированных плазмидой для экспрессии HSV-tk под контролем промотора hTF.RT без модификаций (hTER7), или модифицированного минимальным ранним промотором цигомегаловируса (hTERT-CMV) или синтетическим ТАТА-боксом (hTERT-TATA), после обработки ганцикловиром (Gane) в указанных концентрациях.

4.3.2. Эффективность аденовирусных препаратов Ас1-кТЕЯТ-Н8У-1к и АЛ-ЬТЕЯТ-СМУ-Н5У-1к

Экспрессионные модули ЬТЕКТ-ШУ-тк и ЬТЕЮГ-СМУ-Н8У-1к были использованы для создания репликативно-дефектных аденовирусов 5 серотипа с целью последующего создания на их основе противоопухолевых препаратов и оценки их безопасности и эффективности в доклинических и клинических испытаниях. Нами была проведена оценка эффективности этих препаратов (Аё-ИТЕЯТ-НЗУчк и Аё-ЬТЕЯТ-СМУ-НЗУчк) на панели клеточных линий рака легкого (клетки линий МС1-И1299, ЫС1-Н358,

Рис. 21. Пример ¡"анциюювир-зависимой гибели опухолевых клеток, зараженных препаратами аденовируса Ad-hTERT-HSV-tk или Ad-hTERT-CMV-HSV-tk. Приведены результаты определения жизнеспособность клеток NCI-Н1299, обработанных препаратом аденовируса Ad-hTERT-HSV-tk (А) и клеток NC1-H358, обработанных аденовирусными препаратами Ad-hTERT-HSV-tk или Ad-hTERT-CMV-HSV-tk (Б) с указанными множественностями заражения (MOI) и ганцикловиром в указанных концентрациях Gane).

С.алс.0 цМ

MOI

"^-SSW

(I I 50 |«а 25»

Cíane.

ИМ

МО!

О 3 30 0 3 30 0 3 30 О i Sti t! 3 30 í<) 3(1 3 1(1

Ad-iTEST-HSV-ÍS Ad-hTEKT-CMV-USV-tk

<íanc, }iM л зо о o зо о о зо о зо « зо o .30 о .зо i} зй о зо о зо о зо о_зо е зо о за & зо oj?o

К . 2_5 Л_4 2.5 7.5 8.1 0.? К - 2_5 I 4 2.5 1.5 9J 0.5

Tltuw.llil, UVKUfl.i. ликсоруйиции, икса.'», ПМСИЛЗГИЙ, докторубиинм,

uM »M ;; M RM IJ.'V! И M UM

Рис. 22. Пример влияния совместной обработки опухолевых клеток аденовирусным и химиотерапевтическими препаратами. Клетки линии А549 обрабатывали Ad-hTERT-CMV-HSV-tk в присутствии или отсутствии ганиикловира (Gane) и химиотерапевтических препаратов в указанных концентрациях. Количество жизнеспособных клеток определяли по их дегидрогеназной активности (MTS-анализ, А) или по количеству внутриклеточного АТФ (Б),

Calu-I и А549). Проведенный анализ показал, что оба препарата при множественности заражения 3-30 бляшкообразующих единиц на клетку вызывают выраженное ганцикловир-зависимое ингибирование роста всех исследованных опухолевых клеток, что свидетельствует об их эффективности (Рис. 21).

4.3.3. Эффективность совместного действия аденовирусных препаратов и химиотерапевтических противоопухолвых средств

Аденовирусные противоопухолевые препараты наиболее эффективны в комбинации с традиционными методами воздействия на опухоль, в частности, в комбинации с химиотерапией. Кроме того, инфекция клеток репликативно-дефектными аденовирусами вызывает активацию сигнальных путей, способствующих выживанию клеток, что может приводить к снижению эффективности действия противоопухолевых средств при их совместном применении с аденовирусными препаратами. Поэтому было проведено исследование эффективности совместного действия аденовирусных препаратов с этопозидом, таксолом, цисплатином и доксорубицином на модели 4-ех клеточных линий рака легкого (NCI-H1299, NCI-H358, Calu-I и А549). В результате проведенных экспериментов было установлено, что применение аденовирусных препаратов совместно с химиотерапевтическими средствами в суб-оптимальиых концентрациях в целом приводит к усилению действия последних (Рис. 22). Исключение составили клетки линии NCI-Н358, в которых аденовирусные препараты не усиливали действия этопозида, и клетки линии Calu-I, в которых аденовирусные препараты ганцикловир-зависимо усиливали действия таксола в концентрации 5 нМ, но ослабляли его действие в концентрации 25 нМ. Суммируя, аденовирусные препараты Ad-hTERT-HSV-tk и Ad-hTERT-CMV-HSV-tk сенсибилизируют клетки к действию исследованных химиотерапевтических агентов. При

этом необходимо принимать во внимание возможность снижения эффективности действия таксола в высоких концентрациях при его применении совместно с аденовирусными препаратами, что, однако, зависит от типа клеток. Природа этого феномена остается неясной и может быть связана с интерференцией механизмов и кинетики гибели клеток, вызываемых Н5У4к в присутствии ганцикловира, и таксола в высоких концентрациях.

5. Повышение эффективности противоопухолевых препаратов на основе рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов

5.1. Селекция кТЕЯТ-позитивных опухолей

Эффект от применения того или иного противоопухолевого средства может значительно различаться в зависимости от индивидуапьных особенностей опухоли, что делает необходимым разработку диагностических средств и критериев для прогнозирования эффективности лечения. В случае с аденовирусными препаратами на основе промотора гена ИТЕЯТ такими параметрами является чувствительность опухолевых клеток к заражению аденовирусом и активность промотора ИТЕЯТ, направляющего экспрессию терапевтического гена, в опухолевых клетках. Так как не все опухоли являются ЬТЕЛТ-позитивными, это делает рациональным проведение селекции /г7£Л7-позитивных опухолей для этого вида терапии. Для этого был создан диагностический набор «Тертоскрин», основанный на реакции обратной транскрипции с последующей ПЦР. Набор позволяет установить факт присутствия транскрипта ЬТЕКГ в

А Опухоль Б Нормальная ткань

м к- о+ О- К+ м к- о+ о- к+

2»« ц.н. I \1 159 ¡1.11.-1

ЮОяГн. 1

Рис. 23. Пример детекции транскрипта ЬТЕЯТ с использованием набора «Тертоскрин» в образце ткани опухоли легкого (А), но не в образце прилегающей к ней условно-нормальной (Б) ткани. «0+» - образец. «О-» - ОТ-контроль реакции обратной транскрипции; «К-» - негативный контроль ПЦР; «К+» -положительный контроль ПЦР; М - стандарт молекулярных весов ДНК.

Рис. 24. Анализ продукции белка dEGFP в клетках линии NC1-«-dFOFP ^ 5299, транзиторно трансфицированных плазмидами для продукции dEGFP с сигналом терминации транскрипции и полиаденилирования вируса SV40 (SV40), 3 '-нетранслируемой + NPT областью транскрипта DNMT1 (DNMT1) или ТОР2А (ТОР2А). Для нормализации образцов использовали уровень продукции неомицин фосфотрансферазы II (NPT), кодируемой плазмидой для экспрессии dEGFP. Внизу приведены относительные количества dEGFP после нормализации на уровень продукции NPT.

ткани опухоли, тем самым позволяя предсказать активность фрагмента промотора в составе генно-терапевтической конструкции (Рис. 23). В настоящее время произведена опытная партия набора «Тертоскрин» для научных исследований с целью апробации его работоспособности и эффективности. Кроме того, присутствие транскрипта hTERT, устанавливаемое с помощью набора, как следует из опубликованных результатов исследований, может использоваться и для других целей, например для дифференциальной диагностики опухолей и в прогностических целях.

5.2. Повышение специфичности экспрессии в опухолевых клетках Обеспечение специфичности воздействия на опухолевые клетки является одной из основных проблем при разработке противоопухолевых средств. Одним из наиболее эффективных способов обеспечения специфичности генно-терапевтических препаратов, действие которых основано на экспрессии терапевтического трансгена, является использование опухоль-специфических промоторов. Однако, несмотря на достаточно высокую опухолевую специфичность, в неопухолевых клетках, тем не менее, может наблюдается низкий уровень транскрипционной активности таких промоторов. Эта активность может быть обусловлена как неспецифической активацией транскрипции с эктопических элементов векторной конструкции, так и присутствием транскрипционных факторов, достаточных для обеспечения транскрипции на невысоком уровне, что может

Рис. 25. Сравнительный анализ влияния З'-нетранслируемых областей

транскринтов DNMT1 и ТОР2А в составе экспрессионного модуля для продукции HSV-tk. Приведены результаты определения жизнеспособности клеток NCI-H1299, трансфицированных

плазмидой для экспрессии HSV-tk под контролем промотора hTERT с сигналом терминации транскрипции и

полиаденилирования вируса SV40 (SV40), З'-негранслируемой областью транскрипта DNMT1 (DNMT1) или ТОР2А (ТОР2А), после обработки ганцикловиром (Gane) в указанных концен трациях.

приводить к продукции в неопухолевых клетках терапевтического белка и иметь нежелательные последствия. Это делает необходимым дальнейшее повышение специфичности продукции терапевтического белка в опухолевых клетках.

Одним из способов контроля продукции белка в клетке является регуляция стабильности транскрипта. В частности, стабильность транскриптов ДНК-метилтрансферазы 1, кодируемой геном йЫМТ1 и топоизомеразы На, кодируемой геном ТОР2А, контролируется за счет их селективной стабилизации в Б- и в Э- и 02/М-фазах клеточного цикла, то есть в процессе клеточного деления, и дестабилизацией транскриптов в других фазах клеточного цикла. Стабилизация транскриптов ОИМТ] и ТОР2А в процессе клеточного деления опосредована их З'-нетранслируемыми областями. Более того, было продемонстрировано, что З'-нетранслируемые области транскриптов 2ЖМ7 и ТОР2А способны обеспечивать аналогичную стабилизацию гетерологичных кДНК в делящихся клетках. Этот факт является рациональной основой для использования фрагментов З'-нетранслируемых областей транскриптов £>ММ77 и ТОР2А в составе генных конструкций для селективной стабилизации трансгенных транскриптов в клетках опухоли, которые в ряде случаев характеризуются активной пролиферацией, и их дестабилизации в неделящихся клетках. Это позволит повысить специфичность продукции трансгенного белка в пролиферирующих клетках-мишенях. Однако, возникает вопрос об эффективности продукции белка в случае включения в экспрсссионную конструкцию таких З'-нетранслируемых областей, что может существенно повлиять на их эффективность из-за возможного снижения продукции терапевтического белка и нивелировать преимущества увеличения специфичности. Поэтому было проведено исследование изменения уровня продукции белка при замене одной из традиционно используемой последовательности терминации транскрипции и полиаденилирования вируса 8У40 на З'-нетранслируемые области транскриптов DNMTI и ТОР2А на примере дестабилизированного варианта белка ЕвРР (с1ЕСРР). В результате анализа было установлено, что замена на 3 '-нетранслируюмую область транскрипта не только

не снижает уровень продукции белка, но и увеличивает его в -1,6 раз, а при использовании З'-нетранслируемой областью транскрипта ТОР2А наблюдалось ~3-ех кратное снижение уровня продуцируемого белка (ИЗДЕР (Рис. 24). Таким образом, использование в составе зкспрессионной конструкции З'-нетранслируемой области транскрипта ОЫМТ1 является оправданным для обеспечения большей специфичности экспрессии терапевтического белка в делящихся клетках. В случае с З'-нетранслируемой областью транскрипта ТОР2А ситуация менее однозначная, и необходимо принимать во внимание 3-ех кратное снижение уровня продукции белка. Тем не менее, использование

обоих З'-нетранслируемых областей в экспрессионных модулях для продукции ШУ-Ис под контролем фрагмента промотора гена ИТЕЯТт оказывало существенного влияния на эффективность ганцикловир-зависимого ингибирования роста транзиторно трансфицированных клеток линии ]ЧС1-Н1299 (Рис. 25). Это еще раз подтверждает эффективность экспрессионных модулей с З'-нетранслируемыми областями транскриптов ОЫМГ1 и ТОР2А, селективно дестабилизирующих транскрипт трансгена в неделящихся клетках.

5.3. Использование ЬУ294002 и ЬУ303511 для увеличения продукции белков, кодируемых репликативно-дефектными аденовирусами

Эффективность действия репликативно-дефектных аденовирусов непосредственно зависит от уровня продукции кодируемых ими терапевтических белков, и обеспечение достаточного для проявления терапевтического эффекта уровня экспрессии трансгена является одной из проблем, поскольку многие промоторы с высокой опухолевой специфичностью не способны обеспечить должного уровня продукции терапевтического белка. Однако известно, что ряд воздействий способны увеличить продукцию белков, кодируемых аденовирусами. К таким воздействиям относятся сопутствующее облучение, гипертермия, совместное применение с аденовирусными препаратами этопозида, топогекана и ингибиторов гистондеацетилаз. Сопутствующие аденовирусной терапии воздействия, приводящие к увеличению продукции кодируемого ими белка, вызывали улучшение эффективности проникновения аденовируса в клетки за счет увеличения экспрессии рецепторов для аденовируса на поверхности клеток (этопозид и ингибиторы гистондеацетилаз), благодаря влиянию на пост-трансдукционные процессы (топотекан) или действуя одновременно на пост-трансдукционном уровне и улучшая эффективность проникновения аденовируса (облучение). Комбинированное применение таких воздействий с рекомбинантными аденовирусами позволяет, с одной стороны, увеличить эффективность аденовирусной терапии, а с другой - сочетать в терапии два противоопухолевых средсгва, что повышает ее общую эффективность. Расширение спектра анти-неопластических средств, обладающих способностью увеличивать эффективность аденовирусной терапии, позволит проводить их подбор для сочетания с аденовирусной терапией с учетом чувствительности к ним опухолевых клеток, что позволит достичь максимального терапевтического эффекта. Это делает актуальным идентификацию новых анти-неопластических средств, которые, помимо своей противоопухолевой активности, способны увеличивать эффективность аденовирусной

& У-

ГП £

JJ Рие. 26. Эффект ингибиторов

= _ PI3K/Akt/mT0R сигнального пути (А) и

§ § ^ ^ LY303511 (Б) на экспрессию GFP,

кодируемого рекомбинантньш

^ р й ^ 'ф репликативно-дефектным аденовирусом,

с* я 8 клетках линии NCI-H1299. Для

¡Ü £, «I им

контроля количеств нанесенных лизатов

—ЗИЁ—'. L......'fjjiLjyi * проводили детекцию а-тубулина. «-»

^□а-о-були» необработанные ингибиторами клетки.

терапии путем увеличения экспрессии кодируемого рекомбинантньш аденовирусом белка.

PI3K/Akt/mT0R сигнальный путь является перспективной мишенью в противоопухолевой терапии, и его различные ингибиторы находятся в настоящее время в различных фазах клинических испытаний. Нами был проведен анализ влияния ингибиторов PI3K/Akt/mT0R сигнального пути на продукцию белков, кодируемых рекомбинантным аденовирусом, с целью выявления их способности, помимо собственной активности по отношению к компонентам PI3K/Akt/mTOR сигнального пути, повышать эффективность аденовирусных препаратов.

Обработка клеток линии NCI-H1299, зараженных рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом Ad-Tet-EGFP, кодирующим зеленый флуоресцентный белок (EGFP) под контролем тетрациклин-регулируемого промотора, ингибитором протеинкиназы GSK3ß VIII, ингибитором протеинкиназы Akt X, ингибитором mTOR рапамицином или ингибиторами фосфоинозитид 3-киназ вортманнином и LY294002 показало, что из исследованных веществ только обработка клеток LY294002 приводит к увеличению уровня продукции EGFP (Рис. 26А). Поскольку другой ингибитор фосфоинозитид 3-киназ, вортманнин, не оказывал эффекта на продукцию EGFP, это позволяет сделать вывод о том, что эффект LY294002 на экспрессию EGFP, кодируемого рекомбинантным аденовирусом, не зависит от способности LY294002 ингибировать фосфоинозитид 3-киназы, а зависит от других активностей LY294002, которые включают в себя способность ингибировать протеинкиназы mTOR, ДНК-зависимую протеинкиназу (DNA-PK) и казеин киназу II. Отсутствие эффекта рапамицина позволяет сделать вывод о том, что комплекс mTORCl также не является мишенью для LY294002 в этом процессе, однако не исключает, что эффект опосредован ингибированием комплекса mT0RC2.

Поскольку эффект LY294002 не зависит от его способности ингибировать активность фосфоинозитид 3-киназ, было исследовано влияние его неактивного в отношении фосфоинозитид 3-киназ аналога, LY303511, на экспрессию EGFP, кодируемого рекомбинантным аденовирусом. Как и LY294002, LY303511 обладал

Рис. 27. Ингибиторы топоизомераз и LY3035U синергетично увеличивают продукцию белков, кодируемых рекомбинантными репликативно-дефектными аденовирусами. Анализ продукции белка EGFP в клетках линии NCI-H1299, зараженных аденовирусом Ad-Tet-EGFP и обработанных указанными ингибиторами или их комбинациями. Для контроля количеств нанесенных лизатов проводили детекцию а-тубулина. «-» - необработанные ингибиторами клетки. LY3 - LY3035U; Eto - этопозид; СРТ -камптотецин.

способностью увеличивать продукцию EGFP в клетках линии NCI-H1299 (Рис. 26Б). Обнаруженная способность LY294002 и LY303511 увеличивать экспрессию рекомбинантных белков, кодируемых аденовирусом, не является узкоспецифичной для исследованной комбинации тетрациклин-регулируемого промотора и зеленого флуоресцентного белка, а также для клеток линии NCI-H1299. Аналогичный эффект наблюдается и для раннего промотора цитомегаловируса и промотора гена теломеразной обратной транкриптазы человека hTERT в комбинации с кДНК HSV-tk, а также при заражении клеток линий А549, NCI-H358 и Calu-I. Далее был исследован эффект совместного применения ингибиторов топоизомераз, которые также увеличивают продукцию рекомбинантных белков, кодируемых аденовирусами, и LY303511 или LY294002. Совместная обработка клеток, инфицированных рекомбинантным аденовирусом, этопозидом или камптотецином с LY303511 обладала синергетическим эффектом и приводила к значительно большему увеличению продукции белка, кодируемого рекомбинантным аденовирусом, чем при обработке этими веществами по отдельности (Рис. 27). Аналогичные результаты были получены и для LY294002 в комбинации с этопозидом. Синергетичность действия ингибиторов топоизомераз и LY294002/LY30351 1 предполагает, что они действуют по различным механизмом, в то время как комбинация ингибиторов топоизомераз I и II (этопозида и камптотецика) не приводила к усилению эффекта (Рис. 27). Таким образом, установлена способность LY294002 и LY303511 по отдельности, а также совместно с ингибиторами топоизомераз, увеличивать продукцию рекомбинантных белков, кодируемых репликативно-дефектными аденовирусами. В частности, этот эффект наблюдался для противоопухолевого аденовирусного препарата Ad-hTERT-HSV-tk. Существенно отметить, что LY294002 и LY30351 1 имеют предпосылки для использования в качестве противоопухолевых средств. Фармакологически приемлемая производная LY294002, SF1126 (Semaphore Pharmaceuticals Inc), является перспективным лекарственным средством и проходит в настоящее время клинические испытания как ингибитор PI3K. LY303511 и его

,Y, LY3 грт СРТ I.Y3 „ СРТ Eto Eto btw

WW». ч%>. AX«« ЧХЯМЛС, w« -Ч- avs.

I смгл'булнн

j EGFP

производные рассматриваются как перспективные средства для ингибирования нежелательной пролиферации клеток, в том числе опухолевых, и в ближайшее время планируется проведение клинических испытаний LY303511 (ЕМ 101, Emiliem Inc.). Выявленный новый эффект LY294002 и LY303511 на экспрессию белков, кодируемых репликативно-дефектными аденовирусами, является основанием для возможного использования анти-неопластических фармацевтических средств на их основе совместно с аденовирусными противоопухолевыми препаратами с целью получения синергетического эффекта от их применения и увеличения эффективности лечения.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

БЛАГОДАРНОСТИ

Исследования проводились при поддержке программ Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» и «Молекулярная и клеточная биология», Российского Фонда Фундаментальных Исследований (инициативные научные проекты), федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники», INTAS Young Scientist Fellowship и The Wellcome Trust Short-Term Travel Grant.

Исследования протеинкиназы MAK-V проводились при участии сотрудников лаборатории молекулярной генетики рака (зав. лаб. С.Л. Киселев) и молекулярной онкогенетики (зав. лаб. И.В. Коробко) ИБГ РАН в соответствии с соавторством опубликованных результатов исследований, а также при поддержке и участии В.Л. Бухмана и H.H. Нинкиной (University of Edinburgh/Cardiff University, Великобритания). Анализ продукции протеинкиназы MAK-V в опухолях молочной железы проводился совместно с РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН (Н.Т. Райхлин) и МНИОИ им. П.А. Герцена (Г.А. Франк, Л.Э. Завалишина). Работы по анализу дифференциальной экспрессии генов в опухолях легкого и созданию аденовирусных препаратов проводились совместно с ИМГ РАН (Е.Д. Свердлов), ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (Е.Д. Свердлов, Т.В. Виноградова, Е.П. Копанцев) (образцы для анализа), ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи (Б.С. Народицкий, Д.Ю. Логунов, М.М. Шмаров) (получение аденовирусов, аденовирус для продукции EGFP), МНИОИ им. П.А. Герцена (Г.А. Франк, Л.Э. Завалишина) (иммуногистохимический анализ с анти-Pdcd4 антителами). Исследования по использованию Pdcd4 как мишени для противоопухолевой терапии и по выявлению и характеризации эффекта LY294002/LY3035I1 на продукцию белков, кодируемых рекомбинантными аденовирусами, проводились при участии Е.В. Коробко.

Автор выражает благодарность всем принявшим участие и помогавшим в проведении исследований, обсуждении их результатов и предоставившим уникальные реагенты для их проведения.

выводы

1. Протеинкиназа MAK-V участвует в регуляции эидоцитоза и является ассоциированным с центросомами клеток белком. Увеличенная экспрессия протеинкиназы MAK-V может способствовать повышению жизнеспособности клеток. Протеинкиназа MAK-V не является необходимой для нормального развития, жизнеспособности и размножения мышей.

2. Уровень протеинкиназы MAK-V часто увеличен в опухолях молочной железы человека и может использоваться как молекулярный маркер опухолей молочной железы человека.

3. Уровень транскрипта Pdcd4 часто снижен в опухолях плоскоклеточного рака легкого человека и может использоваться как молекулярный маркер плоскоклеточного рака легкого человека.

4. Выявлено частое несоответствие уровней транскрипта и белка Pdcd4 в опухолях плоскоклеточного рака легкого человека. Уровни транскрипта и белка Pdcd4 должны использоваться как независимые молекулярные параметры при плоскоклеточном раке легкого человека.

5. Супрессия транскрипта WIF1 при плоскоклеточном раке легкого человека сопровождается сопутствующим локальным снижением содержания белка WIF1 в ткани опухоли. Снижение экспрессии WIF1 может использоваться как молекулярный маркер плоскоклеточного рака легкого человека.

6. Экспрессия трансгена Pdcd4 «дикого» типа может не приводить к восстановлению активности Pdcd4 в опухолевых клетках. Рациональным способом восстановления активности Pdcd4 является использование мутантной версии белка Pdcd4 (S67,71,457A).

7. Созданные модули для экспрессии кДНК тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа под контролем промотора гена теломеразной обратной транскриптазы человека hTERT-206...+37 и его модификации минимальным ранним промотором цитомегаловируса и рекомбинантные репликативно-дефектные аденовирусы на их основе вызывают ганцикловир-зависимое ингибирование роста опухолевых клеток и увеличивают эффективность действия традиционных химиотерапевтических препаратов (таксол, этопозид, цисплатин, доксорубицин) in vitro.

8. Модификация промотора гена теломеразной обратной транскриптазы человека hTERT -206...+37 минимальным ранним промотором цитомегаловируса способствует увеличению эффективности экспрессии трансгсна под его контролем в широком спектре опухолевых клеток.

9. Использование З'-нетранслируемых областей транскриптов ДНК метилтрансферазы 1 человека £>№/77 и топоизомеразы На человека ЮР02А, снижающих уровень транскрипта в неделящихся клетках, не оказывает существенного влияния на эффективность экспрессии трансгена и не приводит к снижению эффективности ганцикловир-зависимого ингибирования роста опухолевых клеток при экспрессии тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа. Использование З'-нетранслируемых областей транскриптов ШЧМТ1 и Т0Р02А может быть рекомендовано для использования в генно-терапевтичских конструкциях для увеличения опухолевой специфичности экспрессии трансгена.

10. Установлена способность протеинкиназных ингибиторов ЬУ294002 и 1^303511 увеличивать экспрессию рекомбинантных белков, кодируемых репликативно-дефектными аденовирусами. Выявлено синергетичеекое действие ЬУ294002 и ЬУ303511 с ингибиторами топоизомеразы II этопозидом и топоизомеразы I камптотецином на увеличение экспрессии рекомбинантных белков, кодируемых репликативно-дефектными аденовирусами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Korobko IV, Korobko EV, Kiselev SL. The MAK-V protein kinase regulates endocytosis in mouse. Mol Gen Genet. 2000; 264: 411-8.

2. Коробко ЕВ, Смирнова ЕВ, Киселев СЛ, Георгиев ГП, Коробко MB, Идентификация нового альтернативно сплайсированного транскрипта Рабаптина-5, взаимодействующего с протеинкиназой MAK-V. Докл. Акад. Наук, 2000, 370: 119-121.

3. Коробко ИВ, Коробко ЕВ, Чупикова НИ, Ванечкин МА, Смирнова ЕВ, Киселев СЛ, Георгиев ГП. Использование двугибридного клонироваения в дрожжах для функциональной характеризации протсинкиназы MAK-V. Мол. Биол. 2002, 36: 491-495.

4. Korobko EV, Kiselev SL, Korobko IV. Multiple Rabaptin-5-like transcripts. Gene. 2002; 292: 191-197.

5. Ruzov AS, Mertsalov IB, Meehan R, Kiselev SL, Buchman VL, Korobko IV. Cloning and developmental expression of MARK/Par-l/MELK-related protein kinase xMAK-V in Xenopus laevis. Dev Genes Evol. 2004; 214: 139-143.

6. Korobko EV, Kiselev SL, Korobko IV. Subcellular localization of MAK-V/Hunk protein kinase expressed in COS-1 cells. Cell Biol Int. 2004; 28: 49-56.

7. Коробко ИВ, Завалишина ЛЭ, Киселев СЛ, Райхлин НТ, Франк ГА. Продукция протеинкиназы MAK-V/Hunk как возможный диагностический и прогностический маркер рака молочной железы человека. Арх. Патол. 2004; 66: 6-9.

8. Коробко ЕВ, Чупикова НИ, Киселев СЛ, Коробко ИВ. Молекулярное клонирование и характеристика промотора гена mak-v/Hunk мыши. Мол. Биол. 2005, 39: 72-79.

9. Шепелев MB, Коробко ЕВ, Коробко ИВ. WIF1: Перспективы применения в онкологии. Мол. Генет. Микробиол. Вирусол. 2006; (4): 3-7.

10. Коробко ИВ, Коробко ЕВ, Нинкина ИН, Бухман ВЛ, Киселев СЛ. Фосфорилирование протеинкиназы MAK-V в клетках млекопитающих. Докл. Акад. Наук, 2007, 412: 555-557.

11. Коробко ЕВ, Калиниченко СВ, Шепелев MB, Зборовская ИБ, Зиновьева MB, Виноградова ТВ, Свердлов ЕД, Коробко ИВ. Супрессия транскрипта и белка WIF1 при немелкоклеточном раке легких. Мол. Генет. Микробиол. Вирусол. 2007; (2): 13-18.

12. Калиниченко СВ, Коробко ЕВ, Коробко ИВ. Мембранная локализация протеицкиназы MAK-V. Биохимия. 2008; 73: 342-348.

13. Kalinichenko SV, Kopantzev ЕР, Korobko EV, Palgova IV, Zavalishina LE, Bateva MV, Petrov AN, Frank GA, Sverdlov ED, Korobko IV. Pdcd4 protein and mRNA level aterations do not correlate in human lung tumors. Lung Cancer. 2008; 62: 173180.

Тезисы сообщений и докладов

14. Коробко ИВ, Коробко ЕВ, Ванечкин МА, Райхлин ИТ, Киселев CJI, Георгиев ГП. Протеинкиназа MAK-V: на пути к функциональной характеристики и фссоциации ее с патологиями человека, материалы Международного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология" (18-21 ноября 2001 г., Москва; 22-24 ноября 2001 г., Минск), с. 85.

15. Коробко ИВ, Коробко ЕВ, Райхлин ИТ, Ванечкин МА, Киселев СЛ. Новая протеинкиназа MAK-V и ее потенциальное применение в онкологии. Тезисы докладов VI Международной конференции РФФИ "Результаты Фундаментальных Исследований для Инвестиций. Молекулярная Медицина" (12-14 сентября 2001 г., Пущино), с. 62-63.

16. Korobko I, Korobko Е, Kiselev S. Structural requirements for subcellular targeting of the ectopically expressed MAK-V/Hunk protein kinase. ELSO-2003 Conference (2024 September 2003, Dresden, Germany), abstract book, p. 178.

17. Korobko IV, Korobko EV, Chupikova N1, Kiselev SL. MAK-V/Hunk, the mammalian MARK/Par-l/Kinl-Iike proem kinase. International conference "Molecular genetics of eucaryotes" (4-7 February 2003, Moscow), abstract book, p. 4.

18. Коробко ЕВ, Шепелев MB, Пальгова ИВ, Коробко ИВ. Разработка экспериментальных образцов систем дифференциальной диагностики плоскоклеточного рака легкого, основанных на экспрессии генов PDCD4, WIF-1 и MAK-V/HUNK. Тезисы семинара по комплексному проекту "Создание технологии дифференциальной протеомики и ее использование для получения новых противораковых препаратов", выполняемому в рамках Федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным напрвлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы (2021 октября 2005 г., Москва). Мол. Генет. Микробиол. Вирусол. 2006; (3): 13.

19. Коробко ИВ. Супрессор опухолевого роста Расс14 как мишень в противоопухолевой терапии. Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая 2008 г., Новосибирск), с. 242.

20. Коробко ИВ. Супрессор опухолевого роста РсЗсс14 как мишень для генной терапии в онкологии. Материалы 5-ого Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (16-20 марта 2009 г., Москва), с. 72-73.

Патенты

21. Коробко И.В., Коробко Е.В., Георгиев Г.П., Зборовская И.Б., Копанцев Е.П., Виноградова Т.В., Зиновьева М.В., Свердлов Е.Д. Способ диагностики немелкоклеточного рака легких и набор для его осуществления. Патент Российской Федерации на изобретение № 2330285, приоритет изобретения 03 октября 2006 г., зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 июля 2008 г.

Подписано в печать 23 ноября 2009 г. Объем 2,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ №1123 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Коробко, Игорь Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. Материалы и методы исследования.

1.1. Культуры клеток.

1.2. Плазмиды.

1.3. Аденовирусы.

1.4. Антитела.

1.5. Ингибиторы, ганцикловир, химиотерапевтические препараты.

1.6. Выделение РНК.

1.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

1.8. Сайт-направленный мутагенез.

1.9. Вестерн-блот анализ.

1.10. Картирование сайта инициации транскрипции гена mak-v.

1.11. Клонирование кДНК Рабаптина-5 и его изоформ.

1.12. Двугибридное клонирование и анализ взаимодействия белков в дрожжах.

1.13. Анти-МАК-V антитела.

1.14. Анти-WIFl антитела.

1.15. AHmu-Pdcd4 антитела.

1.17. Иммунопреципитация.

1.18. Иммунофлуоресценция.

1.19. Recombinase mediated cassette exchange.

1.20. Эндоцитоз в жидкой фазе.

1.21. Получение линии мышей с направленно нарушенным геном mak-v.

1.22. Анализ транскрипта mak-v у мышей с направленно нарушенным геном mak-v.

1.23. Образцы тканей.

1.24. Иммуногистохимический анализ.

1.25. Приготовление лизатов тканей опухолей и прилегающих к ним тканей.

1.26. Приготовление образцов для анализа уровней транскриптов.

1.27. Анализ уровней транскриптов методом полуколичественной ПЦР.

1.28. Анализ активности репортерного гена люциферазы.

1.29. Анализ жизнеспособности клеток линий рака легкого.

1.30. Другие методы исследования.

1.31. Компьютерный анализ и базы данных.

2. Протеинкиназа MAK-V.

2.1. Клонирование кДНК mak-v.

2.2. MAK-V - АМРК-подобная протеинкиназа.

2.3. Функции АМРК-подобных протеинкиназ.

2.3.1. Протеинкиназы АМРК.

2.3.2. Протеинкиназы MARK/Par-1.

2.3.3. Протеиникиназа MELK.'.

2.3.4. Протеиникиназы NUAK.

2.3.5. Протеинкиназы BRSK.

2.3.6. Протеинкиназы SIK.

2.3.7. SNRK-подобные протеинкиназы.

2.4. Протеинкиназа MAK-Ve развитии и в нервной системе.

2.5. Ген mak-v.

2.5.1. Ген mak-v в эволюционном контексте.

2.5.2. Характеристика промотора гена mak-v мыши.

2.5.2.1. Клонирование Б'-области гена mak-v мыши.

2.5.2.2. Картирование сайта инициации транскрипции гена mak-v мыши.

2.5.2.3. Анализ промоторной активности 5'-области гена mak-v мыши.

2.5.2.4. Роль метилирования в регуляции транскрипции гена mak-v.

2.6. Внутриклеточная локализация и статус фосфорилирования MAK-V.

2.6.1. Локализация MAK-Vна центросоме.

2.6.1.1. Характеристика экспрессионных конструкций и антител.

2.6.1.2. Центросомальная и нуклеоцитоплазматическая локализация протеинкиназы MAK-V.

2.6.2. Фосфорилирование протеинкиназы MAK-V в клетке.

2.7. Потенциальные белки-партнеры по взаимодействию с MAK-V.

2.7.1. Функции изолированных потенциальных партнеров по взаимодействию с протеинкиназой MAK-V.

2.7.1.1. Протокадгерин FAT1.

2.7.1.2. Белок E6TP1/SIPA1L1.

2.7.1.3. Перифилин-1.

2.7.1.4. Аспарагинил гидроксилаза FIH-1.

2.7.2. Рабаптин-5 и его изоформы.

2.7.2.1. Клонирование изоформ Рабаптина-5.

2.7.2.2. Рабаптин-5 и его изоформы.

2.7.2.3. Взаимодействие протеинкиназы MAK-V с Рабаптином-5 и его изоформами.

2.7.3. MAK-V как регулятор эндоцитоза.

2.8. Мыши с направленно-нарушенным геном mak-v.

2.8.1. Дизайн конструкции для гомологичной рекомбинации.

2.8.2. Получение клонов эмбриональных стволовых клеток с направленно нарушенным аллелем гена mak-v.

2.8.3. Получение и характеризация линии мышей с направленно нарушенным геном mak-v.

2.9. Роль MAK-Ve поддержании жизнеспособности клеток.

2.9.1. Клетки с индуцибельной экспрессией MAK-V как модельная система.

2.9.2. MAK-Vu Мп2*-индуцированная цитотоксичность.

2.9.3. Влияние МАК-Уна дифференцировку клеток РС12ТеЮп по нейрональному пути.

2.9.4. MAK-Vu клеточный ответ на компоненты внеклеточного матрикса.

2.10. Продукция MAK-Ve опухолях молочной железы человека.

3. Исследование изменения экспрессии генов при немелкоклеточном раке легкого.

3.1. Экспрессия mak-v при немелкоклеточном раке легкого.

3.2. Супрессор Wnt сигнального пути WIF1.

3.2.1. Wnt сигнальный путь.

3.2.2. Ген WIF1.

3.2.3. Белок WIF1.

3.2.4. WIF1 как ингибитор Wnt сигнального пути.

3.2.5. Экспрессия WIF1 в опухолях.

3.2.6. WIF1 как мишень для противоопухолевой терапии.

3.2.7. Экспрессия WIF1 при немелкоклеточном раке легкого.

3.3. Супрессор опухолевого роста Pdcd4.

3.3.1. Ген и транскрипт Pdcd4.

3.3.2. Pdcd4, апоптоз и контроль пролиферации клеток.

3.3.3. Экспрессия Pdcd4 в опухолях.

3.3.4. Pdcd4 и канцерогенез.

3.3.5. Экспрессия Pdcd4 как молекулярный параметр опухолей.

3.3.6. Молекулярные механизмы действия Pdcd4.

3.3.7. Экспрессия Pdcd4 при немелкоклеточном раке легкого.

4. Супрессор опухолевого роста Pdcd4 как мишень для противоопухолевой терапии.

4.1. Регуляция экспрессии и активности Pdcd4.

4.1.1. Регуляция транскрипции Pdcd4.

4.1.2. Регуляция трансляции Pdcd4.

4.1.3. Регуляция стабильности белка Pdcd4.

4.1.4. Внутриклеточная локализация Pdcd4.

4.1.5. Регуляция активности Pdcd4 фосфорилированием.

4.2. Восстановление экспрессии Pdcd4 как противоопухолевое воздействие.

4.2.1. Эффект трансгенной экспрессия Pdcd4 в линиях клеток рака легкого.

4.2.2. Белок Pdcd4 подвержен PI3K/Akt/mTOR-3aeucuMoO деградации в клетках линии NCI-H1299.

4.2.3. Роль серина-457 Pdcd4 в деградации Pdcd4.

4.2.4. Продукция белка Pdcd4(S67,71,457) позволяет восстановить активность Pdcd4 в клетках линии NCI-H1299.

5. Экспрессионные модули на основе тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа для терапии опухолей.

5.1. Концепция отечественного противоопухолевого средства на основе промотора гена hTERT и тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа.

5.1.1. Промотор гена hTERT.

5.1.2. Тимидинкиназа вируса простого герпеса 1 типа.

5.1.3. Рекомбинантные репликативно-дефектные аденовирусы как система доставки.

5.1.4. Экспрессионные модули на основе фрагмента промотора гена hTERT и тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа.

5.2. Эффективность экспрессионных модулей in vitro.

5.2.1. Эффективность плазмидных конструкций.

5.2.2. Эффективность аденовирусных препаратов Ad-hTERT-HSV-tk и Ad-hTERT-CMV-HSV-tk.

5.2.3. Эффективность совместного действия аденовирусных препаратов и химиотерапевтических противоопухолевых средств.

6. Повышение эффективности противоопухолевых препаратов на основе рекомбинантных репликативйо-дефектных аденовирусов.

6.1. Селекция hTERT-позитивных опухолей.

6.2. Повышение специфичности экспрессии трансгена в опухолевых клетках.

6.3. Использование LY294002 и LY303511 для увеличения продукции белков, кодируемых репликативно-дефектными аденовирусами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ген протеинкиназы MAK-V и ряд других генов с измененной экспрессией в опухолях и их использование в онкологии"

Онкологические заболевания в настоящее время являются второй по значимости причиной смертности в мире, следуя за заболеваниями сердца и системы кровообращения и опережая смертность от несчастных случаев. В развитых странах даже отдельные нозологии онкологических заболеваний входят в десятку лидирующих причин смертности населения (WHO Media Centre, 2009). В Российской Федерации в 2006 году было выявлено 1417665 новых случаев новообразований (или 993.1 на 100000 населения), а общее число зарегистрированных больных с новообразованиями составило 5121277 (или 3587.5 на 100000 населения) (Министерство здравоохранения и социального развития РФ и др., 2007). В Российской Федерации новообразования являются второй по значимости причиной смертности - в 2006 году новообразования стали причиной 200.9 из 1520.6 смертей на 100000 населения (Федеральная служба государственной статистики, 2007). При этом, несмотря на значительные успехи в терапии онкозаболеваний за последние 50 лет, метастазирующие солидные опухоли остаются в своей основной массе неизлечимыми, и время жизни пациентов часто ограничено месяцами. Эти факты неоспоримо свидетельствуют об актуальности проблемы повышения эффективности диагностики и лечения онкологических заболеваний, что требует развития новых диагностических и прогностических методов, а также разработок новых эффективных способов лечения опухолей.

В основе онкологических заболеваний лежат изменения в молекулярных процессах в клетках, приводящие к приобретению ими аномальных свойств. Поэтому повышение эффективности лечения онкологических заболеваний в настоящее время связывается с успехами в области молекулярной и клеточной биологии и генетики, а также смежных областях, что позволяет разрабатывать новые способы лечения и диагностики онкологических заболеваний на рациональной основе, то есть на основе выявленных молекулярных особенностей опухолевых клеток. Эффективность такого подхода продемонстрирована многочисленными способами диагностики, мониторинга и лечения онкозаболеваний, используемых в клинической практике.

Существенной чертой онкозаболеваний является их гетерогенность на молекулярном уровне. Каждая опухоль обладает уникальным набором произошедших в ее клетках изменений, что еще больше усложняется гетерогенностью популяции опухолевых клеток в одной опухоли, вызванную нестабильность их генетического аппарата и быстрому появлению новых молекулярных изменений. Выявление молекулярных изменений, характерных для клеток конкретной опухоли и существенных для ее возникновения и прогрессии, а также для жизнеспособности опухолевых клеток, делает принципиально возможным специфически воздействовать на критические для опухолевых клеток молекулярные процессы. Кроме того, «молекулярный портрет» опухоли, то есть совокупность характерных для нее молекулярных изменений, позволяет проводить диагностику онкологических заболеваний, прогнозировать их развитие и чувствительность опухоли к уже используемым видам терапии, тем самым позволяя повысить эффективность лечения. Поэтому выявление генов, характеризующихся измененной экспрессией в опухолях, исследование значимости изменения их экспрессии для развития и прогрессии опухоли является одной из первостепенных задач, решение которой, помимо значимости для фундаментальной науки, может послужить отправной точкой для решения важных практических задач. Во-первых, для разработки новых способов диагностики опухолей и прогнозирования их поведения, а также определения чувствительности к различным видам терапии. Во-вторых, для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе развития и прогрессии опухоли, что позволяет выявлять новые молекулярные мишени для противоопухолевой терапии. В-третьих, сама измененная транскрипция генов в клетках опухоли по сравнению с неопухолевыми клетками может быть использована для разработки специфичных геннотерапевтических способов лечения опухолей, основанных на аномальной активности промоторов таких генов в опухолевых клетках (опухоль-специфические промоторы).

Таким образом, понимание молекулярных механизмов прогрессии опухолей и выявление их индивидуальных особенностей является рациональной основой для создания новых диагностических, прогностических и терапевтических средств. Это позволяет повысить эффективность диагностики и лечения онкологических заболеваний, а также способствует практической реализации концепции персонализированной медицины, которая особенно актуальна в онкологии, где необходимо учитывать не только индивидуальные особенности организма пациента, но и индивидуальные особенности опухоли. Исследования молекулярных изменений, происходящих в опухолях, является первым шагом на пути исследования молекулярных механизмов развития и прогрессии опухолей и выявления их особенностей, что позволяет идентифицировать новые мишени для терапии онкозаболеваний и разрабатывать на их основе новые стратегии лечения. Помимо этого, молекулярные особенности опухоли, связь которых с ее возникновением и прогрессией остается неясной, тем не менее могут быть использованы в диагностических и прогностических целях.

Настоящая работа находится в соответствии с этими тенденциями и посвящена исследованию ряда генов с измененной в опухолях экспрессией, исследованию возможных последствий их измененной экспрессии для опухолевых клеток и исследованию возможностей и способов использования их свойств в практических целях как диагностических маркеров и/или в качестве основы для разработки новых анти-неопластических средств. Задачи, решаемые в рамках работы, охватываю различные этапы на пути от идентификации гена с измененной экспрессией в опухолях к практическому использованию его свойств на примере нескольких генов — от выявления часто измененной экспрессии в опухолях до работ по практической реализации концепции противоопухолевого генно-терапевтического препарата, специфичность действия которого основана на активности промотора гена с часто измененной в опухолях экспрессией. Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Исследовать свойства и функции открытой нами ранее протеинкиназы MAK-V, в частности, с учетом ее возможной роли в канцерогенезе;

2. Исследовать изменения экспрессии гена mak-v при раке молочной железы человека и генов Pdcd4 и WIF1 в опухолях легкого человека. Определить их потенциальную практическую значимость;

3. Определить возможность и оптимальные способы применения Pdcd4 как анти-неопластического средства с использованием генно-терапевтических подходов;

4. Разработать и создать оптимальные экспрессионные модули на основе тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа (HSV-tk) и опухоль-специфического промотора гена теломеразной обратной транскриптазы человека (hTERT) для противоопухолевой терапии на основе рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов. Разработать оптимальные способы применения аденовирусных препаратов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Коробко, Игорь Викторович

выводы

1. Протеинкиназа MAK-V участвует в регуляции эндоцитоза и является ассоциированным с центросомами клеток белком. Увеличенная экспрессия протеинкиназы MAK-V может способствовать повышению жизнеспособности клеток. Протеинкиназа MAK-V не является необходимой для нормального развития, жизнеспособности и размножения мышей.

5. Супрессия транскрипта WIFI при плоскоклеточном раке легкого человека сопровождается сопутствующим локальным снижением содержания белка WIF1 в ткани опухоли. Снижение экспрессии WIF1 может использоваться как молекулярный маркер плоскоклеточного рака легкого человека.

7. Созданные модули для экспрессии кДНК тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа под контролем промотора гена теломеразной обратной транскриптазы человека hTERT -206. +37 и его модификации минимальным ранним промотором цитомегаловируса и рекомбинантные репликативно-дефектные аденовирусы на их основе вызывают ганцикловир-зависимое ингибирование роста опухолевых клеток и увеличивают эффективность действия традиционных химиотерапевтических препаратов (таксол, этопозид, цисплатин, доксорубицин) in vitro.

8. Модификация промотора гена теломеразной обратной транскриптазы человека hTERT -206.+37 минимальным ранним промотором цитомегаловируса способствует увеличению эффективности экспрессии трансгена под его контролем в широком спектре опухолевых клеток.

9. Использование З'-нетранслируемых областей транскриптов ДНК метилтрансферазы 1 человека DNMT1 и топоизомеразы На человека Т0Р02А, снижающих уровень транскрипта в неделящихся клетках, не оказывает существенного влияния на эффективность экспрессии трансгена и не приводит к снижению эффективности ганцикловир-зависимого ингибирования роста опухолевых клеток при экспрессии тимидинкипазы вируса простого герпеса 1 типа. Использование З'-нетранслируемых областей транскриптов DNMT1 и Т0Р02А может быть рекомендовано для использования в генно-терапевтичских конструкциях для увеличения опухолевой специфичности экспрессии трансгена.

10. Установлена способность протеинкиназных ингибиторов LY294002 и LY303511 увеличивать экспрессию рекомбинантных белков, кодируемых репликативно-дефектными аденовирусами. Выявлено синергетическое действие LY294002 и LY303511 с ингибиторами топоизомеразы II этопозидом и топоизомеразы I камптотецином на увеличение экспрессии рекомбинантных белков, кодируемых репликативно-дефектными аденовирусами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установление свойств и функций генов и кодируемых ими белков, выявление их роли и связи с определенными клеточными процессами является одной из основных задач современной молекулярной биологии и молекулярной генетики. В свете этого проведенное комплексное исследование практически неизученного гена mak-v и кодируемой им белка, протеинкиназы MAK-V, является несомненно актуальным в научном плане. Нами был охарактеризован ген так-v (в том числе и в эволюционном аспекте), включая функциональную характеристику его промоторной области. В рамках комплексного исследования протеинкиназы MAK-V была изучена ее внутриклеточная локализация и установлены потенциальные партнеры по взаимодействию с ней, что явилось предпосылкой для выявления влияния MAK-V на эндоцитоз. Проведенные исследования позволили впервые установить участие протеинкиназы MAK-V в поддержании жизнеспособности клеток, что является первой функциональной ассоциацией протеинкиназы MAK-V с определенным клеточным ответом на внешние стимулы. Результаты комплексного исследования протеинкиназы MAK-V представляют собой существенный вклад в исследование этой малоизученной протеинкиназы и установление ее функциональной роли в клетке и в организме.

Большое значение имеет открытие участия протеинкиназы MAK-V в поддержании жизнеспособности клеток, в частности, в ответ на контакт клеток со специфическими компонентами внеклеточного матрикса. Выявление этого свойства MAK-V дает импульс для дальнейших исследований в фундаментальном научном аспекте, имеющих целью установление механизмов действия MAK-V в процессах развития, в которых эта протеинкиназа предположительно может играть определенную роль. А именно, MAK-V-зависимая регуляция жизнеспособности клеток может являться одной из ключевых активностей MAK-V в процессах развития, в которых пермиссивные и рестриктивные сигналы от внеклеточного матрикса играют важную роль. Кроме того, выявление способности MAK-V позитивно влиять на жизнеспособность клеток имеет значение и в практическом аспекте. Проведенный анализ изменения экспрессии mak-v в опухолях позволил впервые выявить частое увеличение уровня белка MAK-V в опухолях молочной железы человека, позволяя рассматривать уровень экспрессии MAK-V как новый молекулярный параметр опухолей этого типа. Обнаруженная способность MAK-V позитивно влиять па жизнеспособность клеток предполагает, что клетки таких опухолей могут иметь определенные преимущества по сравнению с клетками, в которых экспрессия mak-v не изменена. Это служит отправной точкой для установления значимости увеличенной экспрессии MAK-V в опухолях как нового потенциального прогностического маркера опухолей.

В результате исследования экспрессии генов Pdcd4 и WIF1 в опухолях немелкоклсточного рака легкого, супрессия которых часто происходят в опухолях различного происхождения, было впервые выявлено частое снижение уровня транскрипта гена супрессора опухолевого роста Pdcd4 в опухолях плоскоклеточного рака легкого (ПРЛ). При этом впервые продемонстрировано, что уровни транскрипта и белка Pdcd4 при ПРЛ не являются эквивалентными параметрами, указывая на изменения посттранскрипционной регуляции Pdcd4 в опухолях этого типа, что должно приниматься во внимание при разработке диагностических систем, основанных на мониторинге изменения экспрессии Pdcd4 в опухолях легкого. Аналогичные исследования, проведенные для гена WIF1, подтвердили ранее выявленное другими исследователями частое снижение уровня его транскрипции при ПРЛ и впервые позволили установить эквивалентность изменения уровней транскрипта и белка WIF1 в опухолях этого типа, а также локальный характер действия WIF1.

Выявленные частые изменения экспрессии mak-v, WIF1 и Pdcd4 (включая впервые показанную нами независимость изменения уровней транскрипта и белка Pdcd4) позволяет использовать уровни их экспрессии в качестве молекулярных маркеров опухолей соответствующих типов. Это открывает перспективы их применения для диагностических и прогностических целей, а также использования при персонализированных подходах в онкологии, и является основанием для проведения дальнейших прикладных исследований в этом направлении.

Супрессор опухолевого роста Pdcd4 рассматривается как перспективная мишень для анти-неопластической терапии. В работе было установлено, что восстановление экспрессии супрессора опухолевого роста Pdcd4 с использованием кДНК, кодирующей белок Pdcd4 «дикого» типа, может быть неэффективным подходом. Исследование причин этого феномена позволило предложить рациональный способ использования супрессора опухолевого роста Pdcd4 в биотерапевтических подходах, состоящий в применении его мутаптной версии Pdcd4 (S67,71,457A), что позволяет избежать PI3R/Akt/mTOR-зависимого ингибирования активности Pdcd4 и, несомненно, имеет существенное значение для разработки анти-неопластических средств на основе Pdcd4.

Значительная часть работы посвящена практической реализации концепции противоопухолевых генно-терапевтических аденовирусных препаратов. В ходе ее выполнения были созданы экспрессионные модули с кДНК HSV-tk под контролем фрагмента опухоль-специфического промотора гена hTERT и его модификаций. Проведенный анализ позволил выявить оптимальные модификации промотора гена hTERT для достижения максимально эффективной экспрессии трансгена в опухолевых клетках. Была продемонстрирована активность in vitro как монопрепаратов, а также совместно с рядом традиционных химиотерапевтических противоопухолевых средств, аденовирусов Ad-hTERT-TK и Ad-hTERT-CMV-TK, созданных на основе сконструированных экспрессионных модулей. Эти аденовирусы являются прототипами для выпуска опытных партий противоопухолевых фармпрепаратов для проведения их доклинических и клинических испытаний. В качестве сопутствующего диагностикума был разработан диагностический набор «Тертоскрин» для определения присутствия транскрипта hTERT в образцах опухолевых тканей, позволяющий прогнозировать эффективность действия аденовирусных противоопухолевых препаратов на основе промотора гена hTERT и делающий возможным их адресное применение.

В рамках работ по оптимизации применения аденовирусных препаратов и повышения их эффективности и специфичности был предложен оригинальный способ увеличения специфичности экспрессии терапевтических белков в опухолевых клетках за счет использования в экспрессионных модулях З'-нетранслируемых областей, дестабилизирующих транскрипты в неделящихся клетках. Использование этой стратегии при разработке противоопухолевых генно-терапевтических средств позволит снизить их возможное побочное действие на неопухолевые клетки.

На основании результатов работы предложен новый способ повышения эффективности применения противоопухолевых препаратов на основе рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов, которые в настоящее время занимают свое место в клинической онкологии. Была выявлена способность прототипов перспективных противоопухолевых агентов - ингибиторов киназной активности 2-(4-морфолинил)-8-фенил-4Н-1-бензопиран-4-она (LY294002) и 2-пиперазинил-8-фенил-4Н-1-бензопиран-4-она (LY303511) увеличивать эффективность экспрессии белков, кодируемых рекомбинантными аденовирусами. Более того, была выявлена синергетичность их действия с противоопухолевыми препаратами - ингибиторами топоизомераз. Это открывает пути повышения эффективности применения противоопухолевых препаратов на основе репликативно-дефектных аденовирусов путем их совместного применения с анти-неопластическими средствами на основе LY294002/LY303511.

Суммируя, результаты работы, помимо их научной значимости, имеют и существенную практическую ценность, при этом не только являясь основанием для дальнейших исследований прикладной направленности, но и представляя собой конкретные шаги в этом направлении.

БЛАГОДАРНОСТИ

Исследования проводились при поддержке программ Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» и «Молекулярная и клеточная биология», Российского Фонда Фундаментальных Исследований (инициативные научные проекты), ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники», INTAS Young Scientist Fellowship и The Wellcome Trust Short-Term Travel Grant.

Исследования протеинкиназы MAK-V проводились при участии сотрудников лаборатории молекулярной генетики рака (зав. лаб. C.JI. Киселев) и молекулярной онкогенетики (зав. лаб. И.В. Коробко) ИБГ РАН в соответствии с соавторством опубликованных результатов исследований, а также при поддержке и участии В.Л. Бухмана и II.Н. Нинкиной (University of Edinburgh/Cardiff University, Великобритания). Анализ продукции протеинкиназы MAK-V в опухолях молочной железы проводился совместно с РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (Н.Т. Райхлин) и МНИОИ им. П.А. Герцена (Г.А. Франк, Л.Э. Завалишина). Работы по анализу дифференциальной экспрессии генов в опухолях легкого и созданию аденовирусных препаратов проводились совместно с ИМГ РАН (Е.Д. Свердлов), ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (Е.Д. Свердлов, Т.В. Виноградова, Е.П. Копанцев) (образцы для анализа), ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи (Б.С. Народицкий, Д.Ю. Логунов, М.М. Шмаров) (получение аденовирусов, аденовирус для продукции EGFP), МНИОИ им. П.А. Герцена (Г.А. Франк, Л.Э. Завалишина) (иммуногистохимический анализ с анти-Pdcd4 антителами). Исследования по использованию Pdcd4 как мишени для противоопухолевой терапии и по выявлению и характеризации эффекта LY294002/LY303511 на продукцию белков, кодируемых рекомбинантными аденовирусами, проводились при участии Е.В. Коробко. Автор выражает благодарность всем принявшим участие и помогавшим в проведении исследований, обсуждении их результатов и предоставившим уникальные реагенты.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Коробко, Игорь Викторович, Москва

1. Коробко ИВ. 2009а. Супрессор опухолевого роста Pdcd4 как мишень для генной терапии в онкологии. Материалы 5-ого Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (16-20 марта 2009 г., Москва), с. 72-73.

2. Коробко ЕВ. 2009b. Повышение продукции белков, кодируемых терапевтическими аденовирусами. Материалы 5-ого Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (16-20 марта 2009 г., Москва), с. 36-37.

3. Калиниченко СВ, Коробко ЕВ, Коробко ИВ. 2008. Мембранная локализация протеинкиназы MAK-V. Биохимия. 73: 342-8.

4. Коробко ИВ, Коробко ЕВ, Георгиев ГП, Зборовская ИБ, Копанцев ЕП, Виноградова ТВ, Зиновьева MB, Свердлов ЕД. 2008. Способ диагностики немелкоклеточного рака легких и набор для его осуществления. Патент Российской Федерации на изобретение № 2330285.

5. Коробко ИВ. 2008. Супрессор опухолевого роста Pdcd4 как мишень в противоопухолевой терапии. Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая 2008 г., Новосибирск), с. 242.

6. Коробко ИВ, Коробко ЕВ, Нинкина IIH, Бухман BJI, Киселев СЛ. 2007а. Фосфорилирование протеинкиназы MAK-V в клетках млекопитающих. Докл. Акад. Наук. 412: 555-7.

7. Коробко ЕВ, Калиниченко СВ, Шепелев MB, Зборовская ИБ, Зиновьева MB, Виноградова ТВ, Свердлов ЕД, Коробко ИВ. 2007b. Супрессия транскрипта и белка WIF1 при немелкоклеточном раке легких. Мол. Генет. Микробиол. Вирусол. (2): 1318.

8. Коробко ЕВ, Киселев CJI, Коробко ИВ. 2006. Димеризационные свойства Рабаптина-5 и его изоформ. Биохимия. 71: 1607-12.

9. Коробко ЕВ, Чупикова НИ, Киселев CJI, Коробко ИВ. 2005. Молекулярное клонирование и характеристика промотора гена mak-v/Hunk мыши. Мол. Биол. 39: 729.

10. Коробко ИВ, Завалишина ЛЭ, Киселев CJI, Райхлин НТ, Франк ГА. 2004. Продукция протеинкиназы MAK-V/Hunk как возможный диагностический и прогностический маркер рака молочной железы человека. Арх. Патол. 66: 6-9.

11. Коробко ИВ, Коробко ЕВ, Чупикова НИ, Ванечкин МА, Смирнова ЕВ, Киселев CJI, Георгиев ГП. 2002. Использование двугибридного клонироваения в дрожжах для функциональной характеризации протеинкиназы MAK-V. Мол. Биол. 36: 491-5.

12. Коробко ЕВ, Смирнова ЕВ, Киселев CJI, Георгиев ГП, Коробко ИВ. 2000. Идентификация нового альтернативно сплайсированного транскрипта Рабаптина-5, взаимодействующего с протеинкиназой MAK-V. Докл. Акад. Наук. 370: 119-121.

13. Коробко И.В. 1998. Идентификация и клонирование кДНК новой серин/треониновой протеинкиназы MAK-V. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 126 с.

14. Коробко ИВ, Кабишев АА, Киселев СЛ. 1997. Идентификация новой протеинкиназы, специфически транскрибирующейся в опухолях мыши с высоким метастатическим потенциалом. Докл. Акад. Наук. 354: 554-6.

15. Свердлов ЕД. 2006. Краткая характеристика комплексного проекта «Создание технологии дифференциальной протеомики и ее использование для получения новых противораковых препаратов». Мол. Генет. Микробиол. Вирусол. (3): 3-10.

16. Сенин ВМ, Иванов АВ, Афанасьева АВ, Бунцевич AM. 1984. Новые органотропно-метастазирукяцие перевиваемые опухоли мыши и их использование для изучения влияния лазерного излучения на процесс диссеминации. Вестник АМН СССР. 5: 8591.

17. Федеральная служба государственной статистики. 2007. Смертность и продолжительность жизни населения России: современные тенденции и региональные особенности. Статистический бюллетень №9 (139):70-7.

18. Филоненко ЕС, Волчков ПЮ, Муфазалов ИА, Киселев CJI, Лагарькова МА. 2007. Анализ протеинкиназ, преимущественно экспрессирующихся в линиях ЭСК человека в процессе дифференцировки. Цитология. 49(7): 561-5.

19. Afonja О, Juste D, Das S, Matsuhashi S, Samuels HH. 2004. Induction of PDCD4 tumor suppressor gene expression by RAR agonists, antiestrogen and HER-2/neu antagonist in breast cancer cells. Evidence for a role in apoptosis. Oncogene. 23(49):8135-45.

20. Agard C, Ligeza C, Dupas B, Izembart A, El Kouri C, Moullier P, Ferry N. 2001. Immune-dependent distant bystander effect after adenovirus-mediatcd suicide gene transfer in a rat model of liver colorectal metastasis. Cancer Gene Ther. 8(2): 128-36.

21. Aghi M, Hochberg F, Breakefield XO. 2000. Prodrug activation enzymes in cancer gene therapy. J Gene Med. 2:148-64.

22. Ai L, Tao Q, Zhong S, Fields CR, Kim WJ, Lee MW, Cui Y, Brown KD, Robertson KD. 2006. Inactivation of Wnt inhibitory factor-1 (WIFI) expression by epigenetic silencing is a common event in breast cancer. Carcinogenesis. 27(7): 1341-8.

23. Allgayer H. 2009. Pdcd4, a colon cancer prognostic that is regulated by a microRNA.

24. Crit Rev Oncol Hematol. Epub ahead of print. PubMed PMID: 19836969.

25. Alvarado-Kristensson M, Rodriguez MJ, Silio V, Valpuesta JM, Carrera AC. 2009. SADB phosphorylation of gamma-tubulin regulates centrosome duplication. Nat Cell Biol. 11(9):1081-92.

26. Appl H, Klempnauer KH. 2002. Targeted disruption of c-myb in the chicken pre B-cell line DT40. Oncogene. 21(19):3076-81.

27. Aravind L, Koonin EV. 2000. Eukaryote-specific domains in translation initiation factors: implications for translation regulation and evolution of the translation system. Genome Res. 10(8): 1172-84.

28. Azzoni L, Zatsepina O, Abebe B, Bennett IM, Kanakaraj P, Perussia B. 1998. Differential transcriptional regulation of CD161 and a novel gene, 197/15a, by IL-2, IL-15, and IL-12 in NK and T cells. J Immunol. 161(7):3493-500.

29. Baffa R, Fassan M, Volinia S, O'Hara B, Liu CG, Palazzo JP, Gardiman M, Rugge M, Gomella LG, Croce CM, Rosenberg A. 2009. MicroRNA expression profiling of human metastatic cancers identifies cancer gene targets. J Pathol. 219(2):214-21.

30. Bain J, Plater L, Elliott M, Shpiro N, Hastie CJ, McLauchlan H, Klevernic I, Arthur JS, Alessi DR, Cohen P. The selectivity of protein kinase inhibitors: a further update. Biochem J. 408(3):297-315.

31. Barnes AP, Lilley BN, Pan YA, Plummer LJ, Powell AW, Raines AN, Sanes JR, Polleux F. 2007. LKB1 and SAD kinases define a pathway required for the polarization of cortical neurons. Cell. 129(3):549-63.

32. Behrens J, Lustig B. 2004. The Wnt connection to tumorigenesis. Int J Dev Biol. 48(5-6):477-87.

33. Beullens M, Vancauwenbergh S, Mortice N, Derua R, Ceulemans H, Waelkens E, Bollen M. 2005. Substrate specificity and activity regulation of protein kinase MELK. J Biol Chem. 280(48):40003-ll.

34. Biernat J, Wu YZ, Timm T, Zheng-Fischhofer Q, Mandelkow E, Meijer L, Mandelkow EM. 2002. Protein kinase MARK/PAR-1 is required for neurite outgrowth and establishment of neuronal polarity. Mol Biol Cell. 13(11):4013-28.

35. Bitomsky N, Wethkamp N, Marikkannu R, Klempnauer KH. 2008. siRNA-mediated knockdown of Pdcd4 expression causes upregulation of p21(Wafl/Cipl) expression. Oncogene. 27(35):4820-9.

36. Bitomsky N, Bohm M, Klempnauer KH. 2004. Transformation suppressor protein Pded4 interferes with JNK-mediated phosphorylation of c-Jun and recruitment of the coactivator p300 by c-Jun. Oncogene. 23(45):7484-93.

37. Blasi F. 1993. Urokinase and urokinase receptor: a paracrine/autocrine system regulating cell migration and invasiveness. Bioessays. 15(2): 105-11.

38. Blomberg-Wirsehell M, Doxsey SJ. 1998. Rapid isolation of centrosomes. Methods Enzymol. 298:228-38

39. Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, Holt SE, Chiu CP, Morin GB, Harley CB, Shay JW, Lichtsteiner S, Wright WE. 1998. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279(5349):349-52.

40. Bohm M, Sawicka K, Siebrasse JP, Brehmer-Fastnacht A, Peters R, Klempnauer KH. 2003. The transformation suppressor protein Pdcd4 shuttles between nucleus and cytoplasm and binds RNA. Oncogene. 22(31):4905-10.

41. Bouvet M, Fang B, Ekmekcioglu S, Ji L, Bucana CD, Hamada K, Grimm EA, Roth JA. 1998. Suppression of the immune response to an adenovirus vector and enhancement of intratumoral transgene expression by low-dose etoposide. Gene Ther. 5(2): 189-95.

42. Braun GS, Kretzler M, Heider T, Floege J, Holzman LB, Kriz W, Moeller MJ. 2007. Differentially spliced isoforms of FAT1 are asymmetrically distributed within migrating cells. J Biol Chem. 282(31):22823-33.

43. Bright NJ, Thornton C, Carling D. 2009. The regulation and function of mammalian AMPK-related kinases. Acta Physiol (Oxf). 196(1): 15-26.

44. Bryant PJ, Huettner B, Held LI Jr, Ryerse J, Szidonya J. 1988. Mutations at the fat locus interfere with cell proliferation control and epithelial morphogenesis in Drosophila. Dev Biol. 129(2):541-54.

45. Bucci C, Parton RG, Mather IH, Stunnenberg H, Simons K, Hoflack B, Zerial M. 1992. The small GTPase rab5 functions as a regulatory factor in the early endocytic pathway. Cell. 70(5):715-28.

46. Carayol N, Katsoulidis E, Sassano A, Altman JK, Druker BJ, Platanias LC. 2008. Suppression of programmed cell death 4 (PDCD4) protein expression by BCR-ABL-regulated engagement of the mTOR/p70 S6 kinase pathway. J Biol Chem. 283(13):8601-10.

47. Chevray PM, Nathans D. 1992. Protein interaction cloning in yeast: identification of mammalian proteins that react with the leucine zipper of Jun. Proc Natl Acad Sci USA. 89(13):5789-93.

48. Cheeks RJ, Canman JC, Gabriel WN, Meyer N, Strome S, Goldstein B. 2004. C. elegans PAR proteins function by mobilizing and stabilizing asymmetrically localized protein complexes. CurrBiol. 14(10):851-62.

49. Chen L, Jiao ZH, Zheng LS, Zhang YY, Xie ST, Wang ZX, Wu JW. 2009. Structural insight into the autoinhibition mechanism of AMP-activated protein kinase. Nature. 459(7250): 1146-9.

50. Chen Y, Liu W, Chao T, Zhang Y, Yan X, Gong Y, Qiang B, Yuan J, Sun M, Peng X. 2008. MicroRNA-21 down-regulates the expression of tumor suppressor PDCD4 in human glioblastoma cell T98G. Cancer Lett. 272(2): 197-205.

51. Chen Y, Knosel T, Kristiansen G, Pietas A, Garber ME, Matsuhashi S, Ozaki I, Petersen I. 2003. Loss of PDCD4 expression in human lung cancer correlates with tumour progression and prognosis. J Pathol. 200(5):640-6.

52. Chen L, Chen D, Manome Y, Dong Y, Fine HA, Kufe DW. 1995. Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3/MUC1 promoter. J Clin Invest. 96(6):2775-82.

53. Cheng H, Liu P, Wang ZC, Zou L, Santiago S, Garbitt V, Gjoerup OV, Iglehart JD, Miron A, Richardson AL, Hahn WC, Zhao JJ. 2009. SIK1 couples LKB1 to p53-dependent anoikis and suppresses metastasis. Sci Signal. 2(80):ra35.

54. Chodosh LA, Gardner HP, Rajan JV, Stairs DB, Marquis ST, Leder PA. 2000. Protein kinase expression during murine mammary development. Dev Biol. 219(2):259-76.

55. Choi EK, Park HJ, Ma JS, Lee HC, Kang HC, Kim BG, Kang 1С. 2004. LY294002 inhibits monocyte chemoattractant protein-1 expression through a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. FEBS Lett. 559(1-3): 141-4.

56. Chomczynsky P, Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-pheno-chlorophorm extraction. Anal Biochem. 162: 156-9.

57. Chu RL, Post DE, Khuri FR, Van Mcir EG. 2004. Use of replicating oncolytic adenoviruses in combination therapy for cancer. Clin Cancer Res. 10(16):5299-312.

58. Ciani L, Patel A, Allen ND, ffrench-Constant C. 2003. Micc lacking the giant protocadherin mFATl exhibit renal slit junction abnormalities and a partially penetrant cyclopia and anophthalmia phenotype. Mol Cell Biol. 23(10):3575-82.

59. Cmarik JL, Min H, Hegamyer G, Zhan S, Kulesz-Martin M, Yoshinaga H, Matsuhashi S, Colburn NH. 1999. Differentially expressed protein Pdcd4 inhibits tumor promoter-induced neoplastic transformation. Proc Natl Acad Sci USA. 96(24): 14037-42.

60. Cohen D, Rodriguez-Boulan E, Miisch A. 2004a. Par-1 promotes a hepatic mode of apical protein trafficking in MDCK cclls. Proc Natl Acad Sci USA. 101(38): 13792-7.

61. Cohen D, Brennwald PJ, Rodriguez-Boulan E, Miisch A. 2004b. Mammalian PAR-1 determines epithelial lumen polarity by organizing the microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 164(5):717-27.

62. Counter CM, Hirte HW, Bacchetti S, Harley CB. 1994. Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 91(8):2900-4

63. Counter CM, Avilion AA, LeFeuvre CE, Stewart NG, Greider CW, Harley CB, Bacchetti S. 1992. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. EMBO J. 11 (5): 1921-9.

64. Cox DN, Lu B, Sun TQ, Williams LT, Jan YN. 2001. Drosophila par-1 is required for oocyte differentiation and microtubule organization. Curr Biol. 11(2):75-87.

65. Cox B, Hadjantonakis AK, Collins JE, Magee AL 2000. Cloning and expression throughout mouse development of mfatl, a homologue of the Drosophila tumour suppressor gene fat. Dev Dyn. 217(3):233-40.

66. Croce CM. 2009. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat Rev Genet. 10(10):704-14.

67. Crouch SP, Kozlowski R, Slater KJ, Fletcher J. 1993. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J Immunol Methods. 160(l):81-8.

68. Crump JG, Zhen M, Jin Y, Bargmann CI. 2001. The SAD-1 kinase regulates presynaptic vesicle clustering and axon termination. Neuron. 29(1): 115-29.

69. Davis JJ, Wang L, Dong F, Zhang L, Guo W, Teraishi F, Xu K, Ji L, Fang B. 2006. Oncolysis and suppression of tumor growth by a GFP-expressing oncolytic adenovirus controlled by an hTERT and CMV hybrid promoter. Cancer Gene Ther. 13(7):720-3.

70. De Benedetti A, Harris AL. 1999. eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies. Int J Biochem Cell Biol. 31(l):59-72.

71. De Renzis S, Sonnichsen B, Zerial M. 2002. Divalent Rab effectors regulate the sub-compartmental organization and sorting of early endosomes. Nat Cell Biol. 4(2): 124-33.

72. Deneka M, Neeft M, Popa I, van Oort M, Sprang H, Oorschot V, Klumperman J, Schu P, van der Sluijs P. 2003. Rabaptin-5alpha/rabaptin-4 serves as a linker between rab4 and gamma(l)-adaptin in membrane recycling from endosomes. EMBO J. 22(11):2645-57.

73. Detich N, Ramchandani S, Szyf M. 2001. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. J Biol Chem. 276:24881-90.

74. Diep DB, Hoen N, Backman M, Machon O, Krauss S. 2004. Characterisation of the Wnt antagonists and their response to conditionally activated Wnt signalling in the developing mouse forebrain. Brain Res Dev Brain Res. 153(2):261-70.

75. Difilippantonio S, Chen Y, Pietas A, Schliins K, Pacyna-Gengelbach M, Deutschmann N, Padilla-Nash HM, Ried T, Petersen I. 2003. Gene expression profiles in human non-small and small-cell lung cancers. Eur J Cancer. 39(13):1936-47.

76. Ding J, Vlahos CJ, Liu R, Brown RF, Badwey JA. 1995. Antagonists of phosphatidylinositol 3-kinase block activation of several novel protein kinases in neutrophils. J Biol Chem. 270(19): 11684-91.

77. Doerflinger H, Benton R, Shulman JM, St Johnston D. 2003. The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium. Development. 130(17):3965-75.

78. Dorrello NV, Peschiaroli A, Guardavaccaro D, Colburn NH, Sherman NE, Pagano M. 2006. S6K1- and betaTRCP-mediated degradation of PDCD4 promotes protein translation and cell growth. Science. 314(5798):467-71.

79. Dowling RJ, Pollak M, Sonenberg N. 2009. Current status and challenges associated with targeting mTOR for cancer therapy. BioDrugs. 23(2):77-91.

80. Drewes G, Ebneth A, Preuss U, Mandelkow EM, Mandelkow E. 1997. MARK, a novel family of protein kinases that phosphorylate microtubule-associated proteins and trigger microtubule disruption. Cell. 89(2):297-308.

81. D'Souza-Schorey C, Chavrier P. 2006. ARF proteins: roles in membrane traffic and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 7(5):347-58.

82. Du J, Chen Q, Takemori H, Xu H. 2008. SIK2 can be activated by deprivation of nutrition and it inhibits expression of lipogenic genes in adipocytes. Obesity (Silver Spring). 16(3):531-8.

83. Durfee T, Becherer К, Chen PL, Yeh SH, Yang Y, Kilburn AE, Lee WH, Elledge SJ. The retinoblastoma protein associates with the protein phosphatase type 1 catalytic subunit. Genes Dev. 7(4):555-69.

84. Easton JB, Houghton PJ. 2006. mTOR and cancer therapy. Oncogene. 25(48):6436-46.

85. Ebneth A, Drewes G, Mandelkow EM, Mandelkow E. 1999. Phosphorylation of MAP2c and MAP4 by MARK kinases leads to the destabilization of microtubules in cells. Cell Motil Cytoskeleton. 44(3):209-24.

86. Egami T, Ohuchida K, Miyoshi K, Mizumoto K, Onimaru M, Toma H, Sato N, Matsumoto К, Tanaka M. 2009. Chemotherapeutic agents potentiate adenoviral gene therapy for pancreatic cancer. Cancer Sci. 100(4):722-9.

87. Ehrhardt A, Haase R, Schepers A, Deutsch MJ, Lipps HJ, Baiker A. 2008. Episomal vectors for gene therapy. Curr Gene Ther. 8(3): 147-61.

88. Engelman JA. 2009. Targeting PI3K signalling in cancer: opportunities, challenges and limitations. Nat Rev Cancer. 9(8):550-62.

89. Evans JM, Donnelly LA, Emslie-Smith AM, Alessi DR, Morris AD. 2005. Metformin and reduced risk of cancer in diabetic patients. BMJ. 330(7503): 1304-5.

90. Feldherr CM, Akin D. 1994. Role of nuclear trafficking in regulating cellular activity. Int Rev Cytol. 151:183-228.

91. Feng Y, Irvine KD. 2009. Processing and phosphorylation of the Fat receptor. Proc Natl Acad Sci USA. 106(29): 11989-94.

92. Flaherty DM, Hinde SL, Monick MM, Powers LS, Bradford MA, Yarovinsky T, Hunninghake GW. 2004. Adenovirus vectors activate survival pathways in lung epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287(2):L393-401.

93. Frankel LB, Christofferscn NR, Jacobsen A, Lindow M, Krogh A, Lund AH. 2008. Programmed cell death 4 (PDCD4) is an important functional target of the microRNA miR-21 in breast cancer cells. J Biol Chem. 283(2): 1026-33.

94. Freeman SM, Abboud CN, Whartenby KA, Packman CH, Koeplin DS, Moolten FL, Abraham GN. 1993. The "bystander effect": tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified. Cancer Res. 53(21):5274-83.

95. Fritz AF, Cho KW, Wright CV, Jegalian BG, De Robertis EM. 1989. Duplicated homeobox genes in Xenopus. Dev Biol. 131(2):584-8.

96. Ganem NJ, Godinho SA, Pellman D. 2009. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460(7252):278-82.

97. Garcia-Mata R, Bebok Z, Sorscher EJ, Sztul ES. 1999. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. J Cell Biol. 146(6): 1239-54.

98. Gardiner K. 2004. Gene-dosage effects in Down syndrome and trisomic mouse models. Genome Biol. 5(10):244.

99. Gardner HP, Wertheim GB, Ha SI, Copeland NG, Gilbert DJ, Jenkins NA, Marquis ST, Chodosh LA. 2000a. Cloning and characterization of Hunk, a novel mammalian SNF1-relatedprotein kinase. Genomics. 63(l):46-59.

100. Gardner HP, Belka GK, Wertheim GB, Hartman JL, Ha SI, Gimotty PA, Marquis ST, Chodosh LA. 2000b. Developmental role of the SNF1-related kinase Hunk in pregnancy-induced changes in the mammary gland. Development. 127(20):4493-509.

101. Gao Z, Xu Z, Hung MS, Lin YC, Wang T, Gong M, Zhi X, Jablon DM, You L. 2009. Promoter demethylation of WIF-1 by epigallocatechin-3-gallate in lung cancer cells. Anticancer Res. 29(6):2025-30.

102. Gao F, Zhang P, Zhou C, Li J, Wang Q, Zhu F, Ma C, Sun W, Zhang L. 2007. Frequent loss of PDCD4 expression in human glioma: possible role in the tumorigenesis of glioma. Oncol Rep. 17(l):123-8.

103. Gao Q, Singh L, Kumar A, Srinivasan S, Wazer DE, Band V. 2001. Human papillomavirus type 16 E6-induced degradation of E6TP1 correlates with its ability to immortalize human mammary epithelial cells. J Virol. 75(9):4459-66.

104. Gao Q, Srinivasan S, Boyer SN, Wazer DE, Band V. 1999. The E6 oncoproteins of high-risk papillomaviruses bind to a novel putative GAP protein, E6TP1, and target it for degradation. Mol Cell Biol. 19(l):733-44.

105. Gharbi SI, Zvelebil MJ, Shuttleworth SJ, Hancox T, Saghir N, Timms JF, Waterfield MD. 2007. Exploring the specificity of the PI3K family inhibitor LY294002. Biochem J. 404(1):15-21.

106. Giles RH, van Es JH, Clevers H. 2003. Caught up in a Wnt storm: Wnt signaling in cancer. Biochim Biophys Acta. 1653(l):l-24.

107. Glise B, Miller С A, Crozatier M, Halbisen MA, Wise S, Olson DJ, Vincent A, Blair SS. 2005. Shifted, the Drosophila ortholog of Wnt inhibitory factor-1, controls the distribution and movement of Hedgehog. Dev Cell. 8(2):255-66.

108. G6ke R, Barth P, Schmidt A, Samans B, Lankat-Buttgereit B. 2004. Programmed cell death protein 4 suppresses CDKl/edc2 via induction of p21(Wafl/Cipl). Am J Physiol Cell Physiol. 287(6):C1541-6.

109. G6ke A, Goke R, Knolle A, Trushcim H, Schmidt H, Wilmen A, Carmody R, Goke B, Chen YH. 2002. DUG is a novel homologue of translation initiation factor 4G that binds eIF4A. Biochem Biophys Res Commun. 297(l):78-82.

110. Gorfinkiel N, Sierra J, Callejo A, Ibanez C, Guerrero I. 2005. The Drosophila ortholog of the human Wnt inhibitor factor Shifted controls the diffusion of lipid-modified Hedgehog. Dev Cell. 8(2):241-53.

111. Gorvel JP, Chavrier P, Zerial M, Gruenberg J. 1991. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64(5):915-25.

112. Goswami PC, Roti Roti JL, Hunt CR. 1996. The cell cycle-coupled expression of topoisomerase Ilalpha during S phase is regulated by mRNA stability and is disrupted by heat shock or ionizing radiation. Mol Cell Biol. 16:1500-8.

113. Goswami PC, Hill M, Higashikubo R, Wright WD, Roti Roti JL. 1992. The suppression of the synthesis of a nuclear protein in cells blocked in G2 phase: identification of NP-170 as topoisomerase II. Radiat Res. 132:162-7.

114. Graves TK, Patel S, Dannies PS, Hinkle PM. 2001. Misfolded growth hormone causes fragmentation of the Golgi apparatus and disrupts endoplasmic reticulum-to-Golgi traffic. J Cell Sci. 114(Pt 20):3685-94.

115. Green JA, Manson MM. 1992. Production of polyclonal antisera. Immunological Protocols. Ed. M.M. Manson. Totowa, New York. P. 1-5.

116. Gregorieff A, Clevers H. 2005. Wnt signaling in the intestinal epithelium: from endoderm to cancer. Genes Dev. 19(8):877-90.

117. Gu J, Fang B. 2003. Telomerase promoter-driven cancer gene therapy. Cancer Biol Ther. 2(4 Suppl l):S64-70.

118. Gu J, Andreeff M, Roth JA, Fang B. 2002. hTERT promoter induces tumor-specific Bax gene expression and cell killing in syngenic mouse tumor model and prevents systemic toxicity. Gene Ther. 9(l):30-7.

119. Guldberg P, thor Straten P, Ahrenkiel V, Seremet T, Kirkin AF, Zeuthen J. 1999. Somatic mutation of the Peutz-Jeghers syndrome gene, LKB1/STK11, in malignant melanoma. Oncogene. 18(9): 1777-80.

120. Guo S, Kemphues KJ. 1995. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 81(4):611-20.

121. Harhaji-Trajkovic L, Vilimanovich U, Kravic-Stevovic T, Bumbasirevic V, Trajkovic V. 2009. AMPK-mediated autophagy inhibits apoptosis in cisplatin-treated tumor cells. J Cell Mol Med.

122. Hardie DG, Hawley SA, Scott JW. 2006. AMP-activated protein kinase—development of the energy sensor concept. J Physiol. 2006 574(Pt 1):7-15.

123. Hardie DG. 2005. New roles for the LKB1—>AMPK pathway. Curr Opin Cell Biol. 17(2): 167-73.

124. Harle-Bachor C, Boukamp P. 1996. Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis inhuman skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 93(13):6476-81.

125. Не В, Reguart N, You L, Mazieres J, Xu Z, Lee AY, Mikami I, McCormick F, Jablons DM. 2005. Blockade of Wnt-1 signaling induces apoptosis in human colorectal cancer cells containing downstream mutations. Oncogene. 24(18):3054-8.

126. He B, You L, Uematsu K, Xu Z, Lee AY, Matsangou M, McCormick F, Jablons DM. 2004. A monoclonal antibody against Wnt-1 induces apoptosis in human cancer cells. Neoplasia. 6(1):7-14.

127. Heck MM, Hittelman WN, Earnshaw WC. 1988. Differential expression of DNA topoisomerases I and II during the eukaryotic cell cycle. Proc Natl Acad Sci USA. 85:1086-90.

128. Herman JG, Baylin SB. 2003. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. N Engl J Med. 349(21):2042-54.

129. Hilliard A, Hilliard B, Zheng SJ, Sun H, Miwa T, Song W, Goke R, Chen YH. 2006. Translational regulation of autoimmune inflammation and lymphoma genesis by programmed cell death 4. J Immunol. 177(11):8095-102.

130. Hiyoshi Y, Kamohara H, Karashima R, Sato N, Imamura Y, Nagai Y, Yoshida N, Toyama E, Hayashi N, Watanabe M, Baba H. 2009. MicroRNA-21 regulates the proliferation and invasion in esophageal squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 15(6): 1915-22.

131. Ho SN, Hunt HD, Horton RM, Pullen JK, Pease LR. 1989. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77(l):51-9.

132. Hoang BH, Kubo T, Healey JH, Yang R, Nathan SS, Kolb EA, Mazza B, Meyers PA, Gorliek R. 2004. Dickkopf 3 inhibits invasion and motility of Saos-2 osteosarcoma cells by modulating the Wnt-beta-catenin pathway. Cancer Res. 64(8):2734-9.

133. Hockel M, Vaupel P. 2001. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. J Natl Cancer Inst. 93(4):266-76.

134. Hohaus S, Voso MT, Orta-La Barbera E, Cavallo S, Bellacosa A, Rutella S, Rumi C, Genuardi M, Neri G, Leone G. 1997. Telomerase activity in human hematopoietic progenitor cells. Haematologica. 82(3):262-8.

135. Homicsko K, Lukashev A, Iggo RD. 2005. RAD001 (everolimus) improves the efficacy of replicating adenoviruses that target colon cancer. Cancer Res. 65(15):6882-90.

136. H0yer-Hansen M, Jaattela M. AMP-activated protein kinase: a universal regulator of autophagy? 2007. Autophagy. 3(4):381-3.

137. Hsieh JC, Kodjabachian L, Rebbert ML, Rattner A, Smallwood PM, Samos CH, Nusse R, Dawid IB, Nathans J. 1999. A new secreted protein that binds to Wnt proteins and inhibits their activities. Nature. 398(6726):431-6.

138. Hu J, Dong A, Fernandez-Ruiz V, Shan J, Kawa M, Martinez-Anso E, Prieto J, Qian C. 2009. Blockade of Wnt signaling inhibits angiogenesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 69(17):6951-9.

139. Huang TH, Wu F, Loeb GB, Hsu R, Heidersbach A, Brincat A, Horiuchi D, Lebbink RJ, Mo YY, Goga A, McManus MT. 2009. Up-regulation of miR-21 by HER2/neu signaling promotes cell invasion. J Biol Chem. 284(27): 18515-24.

140. Huang CL, Liu D, Ishikawa S, Nakashima T, Nakashima N, Yokomise H, Kadota K, Ueno M. 2008. Wntl overexpression promotes tumour progression in non-small cell lung cancer. Eur J Cancer. 44(17):2680-8.

141. Huelsken J, Behrens J. 2002. The Wnt signalling pathway. J Cell Sci. 115(Pt 21):3977-8.

142. Hughes MK, Hughes AL. 1993. Evolution of duplicate genes in a tetraploid animal, Xenopus laevis. Mol Biol Evol. 10(6): 1360-9.

143. Hunter DD, Zhang M, Ferguson JW, Koch M, Brunken WJ. 2004. The extracellular matrix component WIF-1 is expressed during, and can modulate, retinal development. Mol Cell Neurosci. 27(4):477-88.

144. Hurov J, Piwnica-Worms H. 2007. The Par-l/MARK family of protein kinases: from polarity to metabolism. Cell Cycle.6(l6): 1966-9.

145. Hurov JB, Watkins JL, Piwnica-Worms H. 2004. Atypical PKC phosphorylates PAR-1 kinases to regulate localization and activity. Curr Biol. 14(8):736-41.

146. Jaleel M, Villa F, Deak M, Toth R, Prescott AR, Van Aalten DM, Alessi DR. 2006. The ubiquitin-associated domain of AMPK-related kinases regulates conformation and LKB1-mediated phosphorylation and activation. Biochem J. 394(Pt 3):545-55.

147. Jaleel M, McBride A, Lizcano JM, Deak M, Toth R, Morrice NA, Alessi DR. 2005. Identification of the sucrose non-fermenting related kinase SNRK, as a novel LKB1 substrate. FEBS Lett. 579(6):1417-23.

148. Jansen AP, Camalier CE, Colburn NH. 2005. Epidermal expression of the translation inhibitor programmed cell death 4 suppresses tumorigenesis. Cancer Res. 65(14):6034-41.

149. Jansen AP, Camalier CE, Stark C, Colburn NH. 2004. Characterization of programmed cell death 4 in multiple human cancers reveals a novel enhancer of drug sensitivity. Mol Cancer Ther. 3(2): 103-10.

150. Janus A, Robak T, Smolewski P. 2005. The mammalian target of the rapamycin (mTOR) kinase pathway: its role in tumourigenesis and targeted antitumour therapy. Cell Mol Biol Lett. 10(3):479-98.

151. Jung H, Seong HA, Ha H. 2008. Murine protein serine/threonine kinase 38 activates apoptosis signal-regulating kinase 1 via Thr 838 phosphorylation. J Biol Chem. 283(50):34541-53.

152. Kalinichenko SV, Kopantzev EP, Korobko EV, Palgova IV, Zavalishina LE, Bateva MV, Petrov AN, Frank GA, Sverdlov ED, Korobko IV. 2008. Pdcd4 protein and mRNA level alterations do not correlate in human lung tumors. Lung Cancer. 62(2): 173-80.

153. Kang MJ, Ahn HS, Lee JY, Matsuhashi S, Park WY. 2002. Up-regulation of PDCD4 in senescent human diploid fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 293(1):617-21.

154. Katoh Y, Takemori H, Horike N, Doi J, Muraoka M, Min L, Okamoto M. 2004. Salt-inducible kinase (SIK) isoforms: their involvement in steroidogenesis and adipogenesis. Mol Cell Endocrinol. 217(1-2): 109-12.

155. Kawano Y, Kypta R. 2003. Secreted antagonists of the Wnt signalling pathway. J Cell Sci. 116(Pt 13):2627-34.

156. Kelly L, McDonough MA, Coleman ML, Ratcliffe PJ, Schofield CJ. 2009. Asparagine beta-hydroxylation stabilizes the ankyrin repeat domain fold. Mol Biosyst. 5(l):52-8.

157. Kibardin A, Ossipova O, Sokol SY. 2006. Metastasis-associated kinase modulates Wnt signaling to regulate brain patterning and morphogenesis. Development. 133(15):2845-54.

158. Kim JH, Kim WS, Park C. 2008. SNARK, a novel downstream molecule of EBV latent membrane protein 1, is associated with resistance to cancer cell death. Leuk Lymphoma. 49(7): 1392-8.

159. Kim YH, Choi KH, Park JW, Kwon TK. 2005. LY294002 inhibits LPS-induced NO production through a inhibition of NF-kappaB activation: independent mechanism of phosphatidylinositol 3-kinase. Immunol Lett. 99(l):45-50.

160. Kiselev SL, Kustikova OS, Korobko EV, Prokhortchouk EB, Kabishev AA, Lukanidin EM, Georgiev GP. 1998. Molecular cloning and characterization of the mouse tag7 gene encoding a novel cytokine. J Biol Chem. 1998 Jul 17;273(29): 18633-9.

161. Kishi M, Pan YA, Crump JG, Sanes JR. 2005. Mammalian SAD kinases are required for neuronal polarization. Science. 307(5711):929-32.

162. Kolquist KA, Ellisen LW, Counter CM, Meyerson M, Tan LK, Weinberg RA, Haber DA, Gerald WL. 1998. Expression of TERT in early premalignant lesions and a subset of cells in normal tissues. Nat Genet. 19(2): 182-6.

163. Korobko EV, Palgova IV, Kiselev SL, Korobko IV. 2006. Apoptotic cleavage of rabaptin-5-like proteins and a model for rabaptin-5 inactivation in apoptosis. Cell Cycle. 5(16): 1854-8.

164. Korobko E, Kiselev S, Olsnes S, Stenmark H, Korobko I. 2005. The Rab5 effector Rabaptin-5 and its isoform Rabaptin-5delta differ in their ability to interact with the small GTPase Rab4. FEBS J. 272(l):37-46.

165. Korobko EV, Kiselev SL, Korobko IV. 2004. Subcellular localization of MAK-V/Hunk protein kinase expressed in COS-1 cells. Cell Biol Int. 28(l):49-56.

166. Korobko EV, Kiselev SL, Korobko IV. 2002. Multiple Rabaptin-5-like transcripts. Gene. 292: 191-197.

167. Korobko IV, Korobko EV, Kiselev SL. 2000. The MAK-V protein kinase regulates endocytosis in mouse. Mol Gen Genet. 264(4):411-8.

168. Korobko IV, Yamamoto K, Nogi Y, Muramatsu M. 1997. Protein interaction cloning in yeast of the mouse third largest RNA polymerase II subunit, mRPB31. Gene. 185(l):l-4.

169. Kumar S, Gao L, Yeagy B, Reid T. 2008. Virus combinations and chemotherapy for the treatment of human cancers. Curr Opin Mol Ther. 10(4):371-9.

170. Kurita M, Suzuki H, Kawano Y, Aiso S, Matsuoka M. 2007. CR/periphilin is a transcriptional co-repressor involved in cell cycle progression. Biochem Biophys Res Commun. 364(4):930-6.

171. Kurita M, Suzuki H, Masai H, Mizumoto K, Ogata E, Nishimoto I, Aiso S, Matsuoka M. 2004. Overexpression of CR/periphilin downregulates Cdc7 expression and induces S-phase arrest. Biochem Biophys Res Commun. 324(2):554-61.

172. Kusakai G, Suzuki A, Ogura T, Kaminishi M, Esumi H. 2004 a. Strong association of ARK5 with tumor invasion and metastasis. J Exp Clin Cancer Res. 23(2):263-8.

173. Kusakai G, Suzuki A, Ogura T, Miyamoto S, Ochiai A, Kaminishi M, Esumi H. 2004b. ARK5 expression in colorectal cancer and its implications for tumor progression. Am J Pathol. 164(3):987-95.

174. Kwaepila N, Burns G, Leong AS. 2006. Immunohistological localisation of human FAT1 (hFAT) protein in 326 breast cancers. Does this adhesion molecule have a role in pathogenesis? Pathology. 38(2): 125-31.

175. Kyo S, Takakura M, Fujiwara T, Inoue M. 2008. Understanding and exploiting hTERT promoter regulation for diagnosis and treatment of human cancers. Cancer Sci. 99(8): 152838.

176. LaRonde-LeBlanc N, Santhanam AN, Baker AR, Wlodawer A, Colburn NH. 2007. Structural basis for inhibition of translation by the tumor suppressor Pdcd4. Mol Cell Biol. 27:147-56.

177. Lankat-Buttgereit B, Lenschen B, Schmidt H, Goke R. 2008. The action of Pdcd4 may be cell type specific: evidence that reduction of dUTPase levels might contribute to its tumor suppressor activity in Bon-1 cells. Apoptosis. 13(l):157-64.

178. Lankat-Buttgereit B, Goke R. 2003. Programmed cell death protein 4 (pdcd4): a novel target for antineoplastic therapy? Biol Cell. 95(8):515-9.

179. Lee JH, Koh H, Kim M, Kim Y, Lee SY, Karess RE, Lee SH, Shong M, Kim JM, Kim J, Chung J. 2007. Energy-dependent regulation of cell structure by AMP-activated protein kinase. Nature. 447(7147): 1017-20.

180. Lee AY, He B, You L, Dadfarmay S, Xu Z, Mazieres J, Mikami I, McCormick F, Jablons DM. 2004. Expression of the secreted frizzled-related protein gene family is downregulated in human mesothelioma. Oncogene. 23(39):6672-6.

181. Lee YJ, Lee H, Borrelli MJ. 2002. Gene transfer into human prostate adenocarcinoma cells with an adenoviral vector: Hyperthermia enhances a double suicide gene expression, cytotoxicity and radiotoxicity. Cancer Gene Ther. 9(3): 267-74.

182. Lefebvre DL, Rosen CF. 2005. Regulation of SNARK activity in response to cellular stresses. Biochim Biophys Acta. 1724(l-2):71-85.

183. Legembre P, Schickel R, Barnhart ВС, Peter ME. 2004. Identification of SNF1/AMP kinase-related kinase as an NF-kappaB-regulated anti-apoptotic kinase involved in CD95-induced motility and invasiveness. J Biol Chem. 279(45):46742-7.

184. Leupold JH, Yang HS, Colburn NH, Asangani I, Post S, Allgayer H. 2007. Tumor suppressor Pdcd4 inhibits invasion/intravasation and regulates urokinase receptor (u-PAR) gene expression via Sp-transcription factors. Oncogene. 26(31):4550-62.

185. Li F, Chong ZZ, Maiese K. 2006. Winding through the WNT pathway during cellular development and demise. Histol Histopathol. 21(l):103-24.

186. Li G, D'Souza-Schorey C, Barbieri MA, Roberts RL, Klippel A, Williams LT, Stahl PD. 1995. Evidence for phosphatidyl inositol 3-kinase as a regulator of endocytosis via activation of Rab5. Proc Natl Acad Sci USA. 92(22): 10207-11.

187. Lie DC, Colamarino SA, Song HJ, Desire L, Mira H, Consiglio A, Lein ES, Jessberger S, Lansford H, Dearie AR, Gage FH. 2005. Wnt signalling regulates adult hippocampal neurogenesis. Nature. 437(7063): 1370-5.

188. Lin YC, You L, Xu Z, He B, Yang CT, Chen JK, Mikami I, Clement G, Shi Y, Kuchenbecker K, Okamoto J, Kashani-Sabet M, Jablons DM. 2007b. Wnt inhibitory factor-1 gene transfer inhibits melanoma cell growth. Hum Gene Ther. 18(4):379-86.

189. Lin YC, You L, Xu Z, He B, Mikami I, Thung E, Chou J, Kuchenbecker K, Kim J, Raz D, Yang CT, Chen JK, Jablons DM. 2006. Wnt signaling activation and WIF-1 silencing in nasopharyngeal canccr cell lines. Biochem Biophys Res Commun. 341(2):635-40.

190. Lippe R, Miaczynska M, Rybin V, Runge A, Zerial M. 2001. Functional synergy between Rab5 effector Rabaptin-5 and exchange factor Rabex-5 when physically associated in a complex. Mol Biol Cell. 12(7):2219-28.

191. Lisy K, Peet DJ. 2008. Turn me on: regulating HIF transcriptional activity. Cell Death Differ. 15(4):642-9.

192. Liu P, Xu B, Li J, Lu H. 2008. LY294002 inhibits leukemia cell invasion and migration through early growth response gene 1 induction independent of phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway. Biochem Biophys Res Commun. 377(l):187-90.

193. Lizcano JM, Goransson O, Toth R, Deak M, Morrice NA, Boudeau J, Hawley SA, Udd L, Makela TP, Hardie DG, Alessi DR. 2004. LKB1 is a master kinase that activates 13 kinases of the AMPK subfamily, including MARK/PAR-1. EMBO J. 23(4):833-43.

194. Logan CY, Nusse R. 2004. The Wnt signaling pathway in development and disease. Annu Rev Cell Dev Biol. 20:781-810.

195. LoPiccolo J, Blumenthal GM, Bernstein WB, Dennis PA. 2008. Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway: effective combinations and clinical considerations. Drug Resist Updat. ll(l-2):32-50.

196. Lu Z, Liu M, Stribinskis V, Klinge CM, Ramos KS, Colburn NH, Li Y. 2008. MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene. Oncogene. 27(31):4373-9.

197. Lu R, Niida H, Nakanishi M. 2004. Human SAD1 kinase is involved in UV-induced DNA damage checkpoint function. J Biol Chem. 279(30):31164-70.

198. Lustig B, Behrens J. 2003. The Wnt signaling pathway and its role in tumor development. J Cancer Res Clin Oncol. 129(4): 199-221.

199. Lyle R, Gehrig C, Neergaard-Henrichsen C, Deutsch S, Antonarakis SE. 2004. Gene expression from the aneuploid chromosome in a trisomy mouse model of down syndrome. Genome Res. 14(7): 1268-74.

200. Ma G, Shimada H, Hiroshima K, Tada Y, Suzuki N, Tagawa M. 2008. Gene medicine for cancer treatment: Commercially available medicine and accumulated clinical data in China. Drug Des Dev Therapy. 2:115-122.

201. Magnani I, Novielli C, Bellini M, Roversi G, Bello L, Larizza L. 2009. Multiple localization of endogenous MARK4L protein in human glioma. Cell Oncol. 31(5):357-70.

202. Mandelkow EM, Thies E, Trinczek B, Biernat J, Mandelkow E. 2004. MARK/PAR1 kinase is a regulator of microtubule-dependent transport in axons. J Cell Biol. 167(1):99-110.

203. Manning, G. 2005. Genomic overview of Protein Kinases, WormBook, ed. The C. elegans Research Community, WormBook, p. 1-19, http://www.wormbook.org.

204. Manning G, Whyte DB, Martinez R, Hunter T, Sudarsanam S. 2002. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298(5600):1912-34.

205. Marsin AS, Bouzin C, Bertrand L, Hue L. 2002. The stimulation of glycolysis by hypoxia in activated monocytes is mediated by AMP-activated protein kinase and inducible 6-phosphofructo-2-kinase. J Biol Chem. 277(34):30778-83.

206. Matsuhashi S, Narisawa Y, Ozaki I, Mizuta T. 2007. Expression patterns of programmed cell death 4 protein in normal human skin and some representative skin lesions. Exp Dermatol. 16(3): 179-84.

207. Matsuhashi S, Hori K. 1998. Pr-28 antigen is localized in proliferating cell in nuclei but absent from S phase nuclei. Res Commun Biochem Cell Mol Biol. 2: 19-26.

208. Matsuhashi S, Yoshinaga H, Yatsuki H, Tsugita A, Hon K. 1997. Isolation of a novel gene from a human cell line with Pr-28 MAb which recognizes a nuclear antigen involved in the cell cycle. Res Commun Biochem Cell Mol Biol. 1:109-20.

209. Matsuhashi S, Arai Y, Watanabe T, Hon K. 1989. Preparation of monoclonal antibodies against nuclear antigens in a DNA affinity purified protein fraction from chick embryo extract. Jpn J Exp Med. 59(4): 139-47.

210. Matsuhashi S, Watanabe T, Hori K. 1987. An antigen expressed in proliferating cells at late Gl-S phase. Exp Cell Res. 170(2):351-62.

211. Mattera R, Arighi CN, Lodge R, Zerial M, Bonifacino JS. 2003. Divalent interaction of the GGAs with the Rabaptin-5-Rabex-5 complex. EMBO J. 22(l):78-88.

212. Matz M, Shagin D, Bogdanova E, Britanova O, Lukyanov S, Diatchenko L, Chenchik A. 1999. Amplification of cDNA ends based on templatc-switching effect and step-out PCR. Nucleic Acids Res. 27(6): 1558-60.

213. Mayor T, Mcraldi P, Stierhof YD, Nigg EA, Fry AM. 1999. Protein kinases in control of the centrosome cycle. FEBS Lett. 452(l-2):92-5.

214. Mazieres J, He B, You L, Xu Z, Jablons DM. 2005. Wnt signaling in lung cancer. Cancer Lett. 222(1): 1-10.

215. Mazicrcs J, He B, You L, Xu Z, Lee AY, Mikami I, Reguart N, Rosell R, McCormick F, Jablons DM. 2004. Wnt inhibitory factor-1 is silenced by promoter hypermethylation in human lung cancer. Cancer Res. 64(14):4717-20.

216. McLauchlan H, Newell J, Morrice N, Osborne A, West M, Smythe E. 1998. A novel role for Rab5-GDI in ligand sequestration into clathrin-coated pits. Curr Biol. 8(l):34-45.

217. Meijer AJ, Codogno P. AMP-activated protein kinase and autophagy. 2007. Autophagy. 3(3):238-40.

218. Meley D, Bauvy C, Houben-Weerts JH, Dubbelhuis PF, Helmond MT, Codogno P, Meijer AJ. 2006. AMP-activated protein kinase and the regulation of autophagic proteolysis. J Biol Chem. 281(46):34870-9.

219. Miller JR. 2002. The Wnts. Genome Biol. 3(1):REVIEWS3001.

220. Mirouse V, Swick LL, Kazgan N, St Johnston D, Brenman JE. 2007. LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress. J Cell Biol. 7;177(3):387-92.

221. Mishra A, Ormerod AK, Cibull ML, Spear ВТ, Kraner SD, Kaetzel DM. 2009. PDGF-A promoter and enhancer elements provide efficient and selective antineoplastic gene therapy in multiple cancer types. Cancer Gene Ther. 16(4):298-309.

222. Moeller MJ, Soofi A, Braun GS, Li X, Watzl C, Kriz W, Holzman LB. 2004. Protocadherin FAT1 binds Ena/VASP proteins and is necessary for actin dynamics and cell polarization. EMBO J. 23(19):3769-79.

223. Mokbel K. The evolving role of telomerase inhibitors in the treatment of cancer. 2003. Curr Med Res Opin. 2003;19(6):470-2.

224. Motoshima H, Goldstein BJ, Igata M, Araki E. 2006. AMPK and cell proliferation—AMPK as a therapeutic target for atherosclerosis and cancer. J Physiol. 574(Pt 1):63-71.

225. Muller J, Ory S, Copeland T, Piwnica-Worms H, Morrison DK. 2001a. C-TAK1 regulates Ras signaling by phosphorylating the МАРК scaffold, KSR1. Mol Cell. 8(5):983-93.

226. Nakamura Y, Tahara E, Tahara H, Yasui W, Ide T. 1999. Quantitative reevaluation of telomerase activity in cancerous and noncancerous gastrointestinal tissues. Mol Carcinog. 26(4):312-20.

227. Nakao M. 2001. Epigenetics: interaction of DNA methylation and chromatin. Gene. 278(1-2):25-31.

228. Nakashima T, Liu D, Nakano J, Ishikawa S, Yokomise H, Ueno M, Kadota K, Huang CL. 2008. Wntl overexpression associated with tumor proliferation and a poor prognosis in non-small cell lung cancer patients. Oncol Rep. 19(l):203-9.

229. Ng HH, Bird A. 1999. DNA methylation and chromatin modification. Curr Opin Genet Dev. 9(2): 158-63.

230. Nguyen DX, Chiang AC, Zhang XH, Kim JY, Kris MG, Ladanyi M, Gerald WL, Massague J. 2009. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138(l):51-62.

231. Nicoloso MS, Spizzo R, Shimizu M, Rossi S, Calin GA. 2009. MicroRNAs-the micro steering wheel of tumour metastases. Nat Rev Cancer. 9(4):293-302.

232. Nielsen E, Severin F, Backer JM, Hyman AA, Zerial M. 1999. Rab5 regulates motility of early endosomes on microtubules. Nat Cell Biol. l(6):376-82.

233. Nieves-Alicea R, Colburn NH, Simeone AM, Tari AM. 2009. Programmed cell death 4 inhibits breast cancer cell invasion by increasing tissue inhibitor of metalloproteinases-2 expression. Breast Cancer Res Treat. 114(2):203-9.

234. Paine PL, Moore LC, Horowitz SB. 1975. Nuclear envelope permeability. Nature. 254(5496): 109-14.

235. Palamarchuk A, Efanov A, Maximov V, Aqeilan RI, Croce CM, Pekarsky Y. 2005. Akt phosphorylates and regulates Pdcd4 tumor suppressor protein. Cancer Res. 65(24): 11282-6.

236. Peng CY, Graves PR, Ogg S, Thoma RS, Byrnes MJ 3rd, Wu Z, Stephenson MT, Piwnica-Worms H. 1998. C-TAK1 protein kinase phosphorylates human Cdc25C on serine 216 and promotes 14-3-3 protein binding. Cell Growth Differ. 9(3): 197-208.

237. Perl DP, Olanow CW. 2007. The neuropathology of manganese-induced Parkinsonism. J Neuropathol Exp Neurol. 66(8):675-82.

238. Perris R, Perissinotto D. 2000. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mech Dev. 95(l-2):3-21.

239. Pickard MR, Green AR, Ellis IO, Caldas C, Hedge VL, Mourtada-Maarabouni M, Williams GT. 2009. Dysregulated expression of Fau and MELK is associated with poor prognosis in breast cancer. Breast Cancer Res. 11(4):R60.

240. Pinson KI, Brennan J, Monkley S, Avery BJ, Skarnes WC. 2000. An LDL-receptor-related protein mediates Wnt signalling in mice. Nature. 407(6803):535-8.

241. Poh TW, Huang S, Hirpara JL, Pervaiz S. 2007. LY303511 amplifies TRAIL-induced apoptosis in tumor cells by enhancing DR5 oligomerization, DISC assembly, and mitochondrial permeabilization. Cell Death Differ. 14(10):1813-25.

242. Ponting CP. 2000. Novel eIF4G domain homologues linking mRNA translation with nonsense-mediated mRNA decay. Trends Biochem Sci. 25(9):423-6.

243. Quandt K, Freeh K, Karas H, Wingender E, Werner T. 1995. Matlnd and Matlnspector: new fast and versatile tools for detection of consensus matches in nucleotide sequence data. Nucleic Acids Res. 23(23):4878-84.

244. Queimado L, Obeso D, Hatfield MD, Yang Y, Thompson DM, Reis AM. 2008. Dysregulation of Wnt pathway components in human salivary gland tumors. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 134(1):94-101.

245. Raaijmakers JH, Bos JL. 2009. Specificity in Ras and Rap signaling. J Biol Chem. 284(17):10995-9.

246. Reguart N, He B, Xu Z, You L, Lee AY, Mazieres J, Mikami I, Batra S, Rosell R, McCormick F, Jablons DM. 2004. Cloning and characterization of the promoter of human Wnt inhibitory factor-1. Biochem Biophys Res Commun. 323(l):229-34.

247. Reymond A, Man go V, Yaylaoglu MB, Leoni A, Ucla C, Scamuffa N, Caccioppoli C, Dermitzakis ET, Lyle R, Banfi S, Eichele G, Antonarakis SE, Ballabio A. 2002. Human chromosome 21 gene expression atlas in the mouse. Nature. 420(6915):582-6.

248. Rice P, Longden I, Bleasby A. 2000. EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. Trends Genet. 16(6):276-7.

249. Ross JS, Slodkowska EA, Symmans WF, Pusztai L, Ravdin PM, Hortobagyi GN. 2009. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14(4):320-68.

250. Roth JA, Feng L, Walowitz J, Browne RW. 2000. Manganese-induced rat pheochromocytoma (PC 12) cell death is independent of caspase activation. J Neurosci Res. 61(2): 162-71.

251. Rubino M, Miaczynska M, Lippe R, Zerial M. 2000. Selective membrane recruitment of EEA1 suggests a role in directional transport of clathrin-coated vesicles to early endosomes. J Biol Chem. 275(6):3745-8.

252. Rune A, Osier ME, Fritz T, Zierath JR. 2009. Regulation of skeletal muscle sucrose, non-fermenting 1/АМР-activated protein kinase-related kinase (SNARK) by metabolic stress and diabetes. Diabetologia. 52(10):2182-9.

253. Ruzov AS, Mertsalov IB, Meehan R, Kiselev SL, Buchman VL, Korobko IV. 2004. Cloning and developmental expression of MARK/Par-l/MELK-related protein kinase xMAK-V in Xenopus laevis. Dev Genes Evol. 214(3):139-43.

254. Rybin V, Ullrich O, Rubino M, Alexandrov K, Simon I, Seabra MC, Goody R, Zerial M. 1996. GTPase activity of Rab5 acts as a timer for endocytic membrane fusion. Nature. 383(6597):266-9.

255. Ryu B, Kim DS, Deluca AM, Alani RM. 2007. Comprehensive expression profiling of tumor cell lines identifies molecular signatures of melanoma progression. PLoS One. 2(7):e594.

256. Sahin F, Maitra A, Argani P, Sato N, Maehara N, Montgomery E, Goggins M, Hruban RH, Su GH. Loss of Stkll/Lkbl expression in pancreatic and biliary neoplasms. 2003. Mod Pathol. 16(7):686-91.

257. Sakamoto T, Seiki M. 2009. Mint3 enhances the activity of hypoxia-inducible factor-1 in macrophages by suppressing the activity of factor inhibiting HIF-1. J Biol Chem. Epub ahead of print. PMID: 19726677.

258. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

259. Sanchez-Cespedes M, Parrella P, Esteller M, Nomoto S, Trink B, Engles JM, Westra WH, Herman JG, Sidransky D. Inactivation of LKB1/STK11 is a common event in adenocarcinomas of the lung. 2002. Cancer Res. 62(13):3659-62.

260. Sarkaria JN, Tibbetts RS, Busby EC, Kennedy AP, Hill DE, Abraham RT. 1998. Inhibition of phosphoinositide 3-kinase related kinases by the radiosensitizing agent wortmannin. Cancer Res. 58(19):4375-82.

261. Schlichter U, Kattmann D, Appl H, Miethe J, Brchmer-Fastnacht A, Klempnauer KH. 2001a. Identification of the myb-inducible promoter of the chicken Pdcd4 gene. Biochim BiophysActa. 1520(1):99-104.

262. Schlichter U, Burk O, Worpenberg S, Klempnauer KH. 2001b. The chicken Pdcd4 gene is regulated by v-Myb. Oncogene. 20(2):231-9.

263. Schmid T, Jansen AP, Baker AR, Hegamyer G, Hagan JP, Colburn NH. 2008. Translation inhibitor Pdcd4 is targeted for degradation during tumor promotion. Cancer Res. 68(5): 1254-60.

264. Seibler J, Schiibeler D, Fiering S, Groudine M, Bode J. 1998. DNA cassette exchange in ES cells mediated by Flp recombinase: an efficient strategy for repeated modification of tagged loci by marker-free constructs. Biochemistry. 37(18):6229-34.

265. Shay JW, Bacchetti S. 1997. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer. 33(5):787-91.

266. Sheff DR, Daro EA, Hull M, Mellman I. 1999. The receptor recycling pathway contains two distinct populations of early endosomes with different sorting functions. J Cell Biol. 145(l):123-39.

267. Shiba Y, Takatsu H, Shin HW, Nakayama K. 2002. Gamma-adaptin interacts directly with Rabaptin-5 through its ear domain. J Biochem. 131(3):327-36.

268. Shibahara K, Asano M, Ishida Y, Aoki T, Koike T, Honjo T. 1995. Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is induced upon programmed cell death. Gene. 166(2):297-301.

269. Shirakawa T. Clinical trial design for adenoviral gene therapy products. 2009. Drug News Perspect. 22(3): 140-5.

270. Singh L, Gao Q, Kumar A, Gotoh T, Wazer DE, Band H, Feig LA, Band V. 2003. The high-risk human papillomavirus type 16 E6 counters the GAP function of E6TP1 toward small Rap G proteins. J Virol. 77(2): 1614-20.

271. Smale ST. 1997. Transcription initiation from TATA-less promoters within eukaryotic protein-coding genes. Biochim Biophys Acta. 1351(l-2):73-88.

272. Stenmark H, Olkkonen VM. 2001. The Rab GTPase family. Genome Biol. 2(5):REVIEWS3007.

273. Stenmark H, Vitale G, Ullrich O, Zerial M. 1995.Rabaptin-5 is a direct effector of the small GTPase Rab5 in endocytic membrane fusion. Cell. 3;83(3):423-32.

274. Strazisar M, Mlakar V, Rott T, Glavac D. Somatic alterations of the serine/threonine kinase LKB1 gene in squamous cell (SCC) and large cell (LCC) lung carcinoma. 2009. Canccr Invest. 27(4):407-16.

275. Strutt H, Strutt D. 2002. Planar polarity: photoreceptors on a high fat diet. Curr Biol. 12(1 l):R384-5.

276. Su V, Lau AF. 2009. Ubiquitin-like and ubiquitin-associated domain proteins: significance in proteasomal degradation. Cell Mol Life Sci. 66(17):2819-33.

277. Sun TQ, Lu B, Feng JJ, Reinhard C, Jan YN, Fantl WJ, Williams LT. 2001. PAR-1 is a Dishevelled-associated kinase and a positive regulator of Wnt signalling. Nat Cell Biol. 3(7):628-36.

278. Suzuki A, Ogura T, Esumi H. 2006. NDR2 acts as the upstream kinase of ARK5 during insulin-like growth factor-1 signaling. J Biol Chem. 281 (20): 13915-21.

279. Suzuki A, Kusakai G, Shimojo Y, Chen J, Ogura T, Kobayashi M, Esumi H. 2005b. Involvement of transforming growth factor-beta 1 signaling in hypoxia-induced tolerance to glucose starvation. J Biol Chem. 2005 Sep 9;280(36):31557-63.

280. Suzuki A, Lu J, Kusakai G, Kishimoto A, Ogura T, Esumi H. 2004b. ARK5 is a tumor invasion-associated factor downstream of Akt signaling. Mol Cell Biol. 24(8):3526-35.

281. Suzuki A, Kusakai G, Kishimoto A, Shimojo Y, Miyamoto S, Ogura T, Ochiai A, Esumi H. 2004c. Regulation of caspase-6 and FLIP by the AMPK family member ARK5. Oncogene. 23(42):7067-75.

282. Suzuki A, Kusakai G, Kishimoto A, Lu J, Ogura T, Lavin MF, Esumi H. 2003c. Identification of a novel protein kinase mediating Akt survival signaling to the ATM protein. J Biol Chem. 278(l):48-53.

283. Suzuki H, Gabrielson E, Chen W, Anbazhagan R, van Engeland M, Weijenberg MP, Herman JG, Baylin SB. 2002. A genomic screen for genes upregulated by dcmethylation and histone deacetylase inhibition in human colorectal cancer. Nat Genet. 31 (2): 141-9.

284. Szyf M, Bozovic V, Tanigawa G. 1991. Growth regulation of mouse DNA methyltransferase gene expression. J Biol Chem. 266:10027-30.

285. Tamai K, Semenov M, Kato Y, Spokony R, Liu C, Katsuyama Y, Hess F, Saint-Jeannet JP, He X. 2000. LDL-receptor-related proteins in Wnt signal transduction. Nature. 407(6803):530-5.

286. Tanemura A, Terando AM, Sim MS, van Hoesel AQ, de Maat MF, Morton DL, Hoon DS. 2009. CpG island methylator phenotype predicts progression of malignant melanoma. Clin Cancer Res. 15(5): 1801-7.

287. Tang Y, Zhao DY, Elliott S, Zhao W, Curiel TJ, Beckman BS, Burow ME. 2007. Epigallocatechin-3 gallate induces growth inhibition and apoptosis in human breast cancer cells through survivin suppression. Int J Oncol. 31(4):705-11.

288. Taniguchi H, Yamamoto H, Hirata T, Miyamoto N, Oki M, Nosho K, Adachi Y, Endo T, Imai K, Shinomura Y. 2005. Frequent epigenetic inactivation of Wnt inhibitory factor-1 in human gastrointestinal cancers. Oncogene. 24(53):7946-52.

289. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22(22):4673-80.

290. Timm T, Li XY, Biernat J, Jiao J, Mandelkow E, Vandekerckhove J, Mandelkow EM. 2003. MARKK, a Ste20-like kinase, activates the polarity-inducing kinase MARK/PAR-1. EMBO J. 22(19):5090-101.

291. Titus DE (Ed.). 1991. Promega protocols and application guide (2nd edn). Promega, Madison, Wis.

292. Tomancak P, Piano F, Riechmann V, Gunsalus КС, Kemphues KJ, Ephrussi A. 2000. A Drosophila melanogaster homologue of Caenorhabditis elegans par-1 acts at an early step in embryonic-axis formation. Nat Cell Biol. 2(7):458-60.

293. Touraine RL, Ishii-Morita H, Ramsey WJ, Blaese RM. 1998. The bystander effect in the HSVtk/ganciclovir system and its relationship to gap junctional communication. Gene Ther. 5(12):1705-11.

294. Trinczek B, Brajenovic M, Ebneth A, Drewes G. 2004. MARK4 is a novel microtubule-assoeiated proteins/microtubule affinity-regulating kinase that binds to the cellular microtubule network and to centrosomes. J Biol Chem. 279(7):5915-23.

295. Triplet* JW, Herring BP, Pavalko FM. 2005. Adenoviral transgene expression enhanced by cotreatment with etoposide in cultured cells. Biotechniques. 39(6): 826, 828, 830, passim.

296. Tsai 1С, Amack JD, Gao ZH, Band V, Yost HJ, Virshup DM. 2007. A Wnt-CKIvarepsilon-Rapl pathway regulates gastrulation by modulating SIPA1L1, a Rap GTPase activating protein. Dev Cell. 12(3):335-47.

297. Tsuji T, Nozaki I, Miyazaki M, Sakaguchi M, Pu H, Hamazaki Y, Iijima O, Namba M. 2001. Antiproliferative activity of REIC/Dkk-3 and its significant down-regulation in non-small-cell lung carcinomas. Biochem Biophys Res Commun. 289(l):257-63.

298. Tybulewicz VL, Crawford CE, Jackson PK, Branson RT, Mulligan RC. 1991. Neonatal lethality and lymphopenia in mice with a homozygous disruption of the c-abl proto-oncogene. Cell. 65(7): 1153-63.

299. Tuoc TC, Stoykova A. 2008. Er81 is a downstream target of Рахб in cortical progenitors. BMC Dev Biol. 8:23.

300. Ulukaya E, Ozdikicioglu F, Oral AY, Demirci M. 2008. The MTT assay yields a relatively lower result of growth inhibition than the ATP assay depending on the chemotherapeutic drugs tested. Toxicol In Vitro. 22(l):232-9.

301. Ulukaya E, Colakogullari M, Wood EJ. 2004. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50(l):43-50.

302. Van der Sluijs P, Hull M, Webster P, Male P, Goud B, Mellman I. 1992. The small GTP-binding protein rab4 controls an early sorting event on the endocytic pathway. Cell. 70(5):729-40.

303. VanOosten RL, Earel JK Jr, Griffith TS. 2007. Histone deacetylase inhibitors enhance Ad5-TRAIL killing of TRAIL-resistant prostate tumor cells through increased caspase-2 activity. Apoptosis. 12: 561-71.

304. Veeck J, Wild PJ, Fuchs T, Schiiffler PJ, Hartmann A, Kniichel R, Dahl E. 2009. Prognostic relevance of Wnt-inhibitory factor-1 (WIFI) and Dickkopf-3 (DKK3) promoter methylation in human breast cancer. BMC Cancer. 9:217.

305. Vile RG, Hart IR. 1993. In vitro and in vivo targeting of gene expression to melanoma cells. Cancer Res. 53(5):962-7.

306. Vitale G, Rybin V, Christoforidis S, Thornqvist P, McCaffrey M, Stenmark H, Zcrial M. 1998. Distinct Rab-binding domains mediate the interaction of Rabaptin-5 with GTP-bound Rab4 and Rab5. EMBO J. 17(7): 1941-51.

307. Vlahos С J, Matter WF, Hui KY, Brown RF. 1994. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1 -benzopyran-4-one (LY294002). J Biol Chem. 269(7):5241-8.

308. Vulsteke V, Beullens M, Boudrez A, Keppens S, Van Eynde A, Rider MH, Stalmans W, Bollen M. 2004. Inhibition of spliceosome assembly by the cell cycle-regulated protein kinase MELK and involvement of splicing factor NIPP1. J Biol Chem. 279(10):8642-7.

309. O.Wang W, Guan KL. 2009. AMP-activated protein kinase and cancer. Acta Physiol (Oxf). 196(l):55-63.

310. Wang X, Wei Z, Gao F, Zhang X, Zhou C, Zhu F, Wang Q, Gao Q, Ma C, Sun W, Kong B, Zhang L. 2008a. Expression and prognostic significance of PDCD4 in human epithelial ovarian carcinoma. Anticancer Res.28(5B):2991-6.

311. Wang Q, Sun Z, Yang HS. 2008b. Downregulation of tumor suppressor Pdcd4 promotes invasion and activates both beta-catenin/Tcf and AP-1-dependent transcription in colon carcinoma cells. Oncogene. 27(ll):1527-35.

312. Wang Z, Takemori H, Haider SK, Nonaka Y, Okamoto M. 1999. Cloning of a novel kinase SIK) of the SNF1/AMPK family from high salt diet-treated rat adrenal. FEBS Lett. 453(1-2): 135-9.

313. Watkins JL, Lewandowski KT, Meek SE, Storz P, Toker A, Piwnica-Worms H. 2008. Phosphorylation of the Par-1 polarity kinase by protein kinase D regulates 14-3-3 binding and membrane association. Proc Natl Acad Sci USA. 105(47): 18378-83.

314. Wei ZT, Zhang X, Wang XY, Gao F, Zhou С J, Zhu FL, Wang Q, Gao Q, Ma CH, Sun WS, Fu QZ, Chen YH, Zhang LN. 2009. PDCD4 inhibits the malignant phenotype of ovarian caneer cells. Cancer Sci. 100(8): 1408-13.

315. Wen YH, Shi X, Chiriboga L, Matsahashi S, Yee H, Afonja O. 2007. Alterations in the expression of PDCD4 in ductal carcinoma of the breast. Oncol Rep. 18(6): 1387-93.

316. WHO Media Centre. 2009. The top ten causes of death. The World Health Organization Fact Sheet No. 310.

317. Wingender E, Chen X, Hehl R, Karas H, Liebich I, Matys V, Meinhardt T, Priiss M, Reuter I, Schacherer F. 2000. TRANSFAC: an integrated system for gene expression regulation. Nucleic Acids Res. 28(l):316-9.

318. Wirth T, Zender L, Schulte B, Mundt B, Plentz R, Rudolph KL, Manns M, Kubicka S, Kuhnel F. 2003. A telomerase-dependent conditionally replicating adenovirus for selective treatment of cancer. Cancer Res. 63(12):3181-8.

319. Woods A, Johnstone SR, Dickerson K, Leiper FC, Fryer LG, Neumann D, Schlattner U, Wallimann T, Carlson M, Carling D. 2003. LKB1 is the upstream kinase in the AMP-activated protein kinase cascade. Curr Biol. 13(22):2004-8.

320. Wu ТС, Lin P, Hsu CP, Huang YJ, Chen CY, Chung WC, Lee H, Ко JL. 2003. Loss of telomerase activity may be a potential favorable prognostic marker in lung carcinomas. Lung Cancer. 41 (2): 163-9.

321. Xu B, Hao Z, Jha KN, Zhang Z, Urekar C, Digilio L, Pulido S, Strauss JF 3rd, Flickinger CJ, Herr JC. 2008. Targeted deletion of Tsskl and 2 causes male infertility due to haploinsufficiency. Dev Biol. 319(2):211-22.

322. Yamaguchi K, Lee SH, Kim JS, Wimalasena J, Kitajima S, Baek SJ. 2006. Activating transcription factor 3 and early growth response 1 are the novel targets of LY294002 in a phosphatidylinositol 3-kinase-independent pathway. Canccr Res. 66(4):2376-84.

323. Yang TW. 2005. The AMPK-family protein kinase, Hunk, is required for murine tumorigenesis and metastasis. Dissertation, University of Pennsylvania, USA. ProQuest Paper AAI3197762.

324. Yang HS, Jansen AP, Nair R, Shibahara K, Verma AK, Cmarik JL, Colburn NH. 2001. A novel transformation suppressor, Pdcd4, inhibits AP-1 transactivation but not NF-kappaB or ODC transactivation. Oncogene. 20(6):669-76.

325. Yao Q, Xu H, Zhang QQ, Zhou H, Qu LH. 2009. MicroRNA-21 promotes cell proliferation and down-regulates the expression of programmed cell death 4 (PDCD4) in HeLa cervical carcinoma cells. Biochem Biophys Res Commun. 388(3):539-42.

326. Yaoita E, Kurihara H, Yoshida Y, Inoue T, Matsuki A, Sakai T, Yamamoto T. 2005. Role of Fatl in cell-cell contact formation of podocytes in puromycin aminonucleoside nephrosis and neonatal kidney. Kidney Int. 68(2):542-51.

327. Yi X, White DM, Aisner DL, Baur JA, Wright WE, Shay JW. 2000. An alternate splicing variant of the human telomcrase catalytic subunit inhibits telomcrase activity. Neoplasia. 2(5):433-40.

328. Yoon YS, Seo WY, Lee MW, Kim ST, Koo SH. 2009. Salt-inducible kinase regulates hepatic lipogenesis by controlling SREBP-lc phosphorylation. J Biol Chem. 284(16): 1044652.

329. Yoshinaga H, Matsuhashi S, Fujiyama C, Masaki Z. 1999. Novel human PDCD4 (H731) gene expressed in proliferative cells is expressed in the small duct epithelial cells of the breast as revealed by an anti-H731 antibody. Pathol Int. 49(12):1067-77.

330. You L, He B, Xu Z, Uematsu K, Mazieres J, Mikami I, Reguart N, Moody TW, Kitajewski J, McCormick F, Jablons DM. 2004b. Inhibition of Wnt-2-mediated signaling induces programmed cell death in non-small-cell lung cancer cells. Oncogene. 23(36):6170-4.

331. Zamaraeva MV, Sabirov RZ, Maeno E, Ando-Akatsuka Y, Bessonova SV, Okada Y. 2005. Cells die with increased cytosolic ATP during apoptosis: a bioluminescence study with intracellular luciferase. Cell Death Differ. 12(11): 1390-7.

332. Zamir G, Zeira E, Gelman AE, Shaked A, Olthoff KM, Eid A, Galun E. 2007. Replication-deficient adenovirus induces host topoisomerase I activity: implications for adenovirus-mediated gene expression. Mol Ther. 15(4): 772-8.

333. Zhang S, Li J, Jiang Y, Xu Y, Qin C. 2009. Programmed cell death 4 (PDCD4) suppresses metastastic potential of human hepatocellular carcinoma cells. J Exp Clin Cancer Res. 28:71.

334. Zhang Y, Ohyashiki JH, Takaku T, Shimizu N, Ohyashiki K. 2006c. Transcriptional profiling of Epstein-Barr virus (EBV) genes and host cellular genes in nasal NK/T-cell lymphoma and chronic active EBV infection. Br J Cancer. 94(4):599-608.

335. Zheng B, Cantley LC. 2007. Regulation of epithelial tight junction assembly and disassembly by AMP-activatcd protein kinase. Proc Natl Acad Sci USA. 104(3):819-22.

336. Zhou J, Schmid T, Schnitzcr S, Briine B. Tumor hypoxia and cancer progression. 2006. Cancer Lett. 237(1): 10-21.

337. Zhu S, Wu H, Wu F, Nie D, Sheng S, Mo YY. 2008. MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis. Cell Res. 18(3):350-9.

338. Zhu YY, Machlcdcr EM, Chenchik A, Li R, Siebcrt PD. 2001. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniqucs. 30(4):892-7.

339. Zou W, Yan M, Xu W, Huo H, Sun L, Zheng Z, Liu X. 2001. Cobalt chloride induces PC12 cells apoptosis through reactive oxygen species and accompanied by AP-1 activation. J Neurosci Res. 64(6):646-53.

340. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J, Liu X. 2002. Involvement of caspase-3 and p38 mitogen-activated protein kinase in cobalt chloride-induced apoptosis in PC 12 cells. J Neurosci Res. 67(6):837-43.

Информация о работе

Коробко, Игорь Викторович
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.26

Диссертация

Ген протеинкиназы MAK-V и ряд других генов с измененной экспрессией в опухолях и их использование в онкологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы