Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и клонирование кДНК новой серин/треониновой протеинкиназы МАК-V

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и клонирование кДНК новой серин/треониновой протеинкиназы МАК-V"

 се

СГ

СП

О

■чс

г

СО

г .,.

ба-

На правах рукописи УДК 577.1+599.323.4

КОРОБКО ИГОРЬ ВИКТОРОВИЧ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ кДНК НОВОЙ СЕРИН/ТРЕОНИНОВОЙ ПРОТЕИНКИНАЗЫ МАК-У

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1998

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики рака Института биологии гена РАН

Научные руководители:

академик РАН, доктор биологических наук Т.П. Георгиев кандидат биологических наук С.Л. Киселев

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наукА.П. Рысков кандидат биологических наук М.А. Лагарькова

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 1998 года в ■{(г часов на

заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова 34/5

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова 32

Автореферат разослан '"(({." 1998 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд. фарм. наук Грабовская Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности, и изучение процессов возникновения и прогрессии опухолей стало одним из приоритетных направлений современных исследований.

Протеинкиназы эукариот составляют обширное семейство белков, обладающих структурным и функциональным сходством. Изменение статуса фосфорелирования белков, опосредуемое протеинкиназами, является общепризнанным одним из наиболее важных способов регуляции их функций в эукариотической клетке. В частности, протеинкиназы являются одним из основных компонентов каскадов передачи сигналов, регулирующих жизнедеятельность клетки (пролиферация, дифференцировка, адгезия, апоптоз и т.д.).

Изменение характера экспрессии протеи нкиназ часто наблюдается при приобретении клетками опухолевых свойств, и, в ряде случаев, вносит вклад в формирование опухолевого фенотипа. Более того, изменения в характере экспрессии некоторых протеинкиназ могут вносить вклад в процесс прогрессии опухолей и приобретение ими метастатических свойств.

Эти обстоятельства делают протеинкиназы привлекательным объектом исследования в изучении процесса приобретения опухолями метастатического фенотипа. Идентификация протеинкиназ, дифференциально экспрессирующихся в опухолях с различными метастатическими потенциалами, может привести к более полному пониманию процесса приобретения опухолевыми клетками метастатических свойств, а также иметь потенциальные практические прогностическое и терапевтическое приложения в области онкологии.

Цель работы

Основной целью настоящей работы являлось обнаружение кДНК генов прогеинкиназ, которые преимущественно транскрибируются в высокометастазирующей аденокарциноме молочной железы мыши ВМР-П по сравнению с родственной низкометастазируюшей опухолью ВМР-0.

Научная новизна и практическое значенне работы

В настоящей работе были идентифицированы две протеинкиназы, гены которых преимущественно транскрибируются в высокометастазирующей опухоли ВМР-П по сравнению с родственной низкометастазирующей опухолью ВМР-0.

Одна из идентифицированных протеинкиназ является рецепторной тирозиновой протеинкиназой c-Met, аномальности в экспрессии которой коррелируют с прогрессией широкого спектра опухолей.

Другой идентифицированной протеинкиназой является ранее неизвестная серин/треониновая протеинкиназа, названная MAK.-V. Была клонирована и определена первичная последовательность кДНК mak-v, а также продемонстрирована in vitro протеинкиназная активность кодируемого ей белка. Спектр экспрессии mak-v, потенциальные белки-мишени белка MAK-V, а также определенная вероятная хромосомная локализация гена mak-v человека позволяют предположить, что MAK-V, кроме ее экспрессии в опухолевых клетках, играет роль в развитии и функционировании нервной системы и может быть связана с рядом заболеваний нервной системы.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих симпозиумах: The 3rd International Engelhardt Conference on Molecular Biology, Volga River, 1997; межлабораторный семинар ICGEB, Триест, Италия, 1997 г.; конференции МНТЦ, Токио, Япония, 1997 г.. Российско-французский симпозиум, Монпелье, Франция, 1997 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждения, выводы и список литературы. Библиография включает 230 источников. Работа проиллюстрирована 16 рисунками и 2 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Идентификация протеинкиназ, дифференциально экспрессирующихся в опухолях ВМР-0 и ВМР-П. Для идентификации протеинкиназ, преимущественно транскрибирующихся в высокометастазирующей опухоли ВМР-П по сравнению с родственной низкометастазирующей опухолью ВМР-0, на первом этапе был использована метод обратной транскрипции с последующей ПЦР. В реакции амплификации были использованы РНК опухоли ВМР-П в качестве матрицы и вырожденные праймера на консервативные участки каталитических доменов протеинкиназ. Далее проводилось "вычитание" с целью

/'"вмр'п4,_. ; РТ-ПЦР с вырожденные праймерами!_ /"-' ФрашедтьГЛ ^ 4

РЩ

Гибридизация

• на каталитический домен протеинкиназ'

.., - полиАт РНК

2ibn.Ii. опухоли ВМР-0

Щк?с- и мшус»вдш1 прод^кхов », ПЦР, .самиейвдйше г$о>геяцЫ<н4}ач/ \ ' преийшкствеиноэдаресшрующимс» л опухоли ВМР-П

I

ЙДю<> А Мцн^с-М!» Продуктов * ">, /, ПЦР, еодт$«Ш)юаде даэтеиньинадач, ^ ^ преимущественно экспрессвдюшнмся 1

".В доухояи ВАЯРтП „ •

_ 'Плюс-цепи продуктов ПЦР.

' ""~ветств))ошие прагеинХинтч, ,1* ЫиреСЬйруЙшвдсяв"- , 1 .ощчоЛИ ВМР-0 " - „ '

Биотинилированная V

, полиЛ(+) РНК ; опухоли ВМР-П ,

; Удаление РНК е г помощью. ! стрсгшшидшювых парэмаиштных ' " частии

'•Реамгшификания,—Клонирование в плазмпдный вектор;

Рис. 1. Схема клонирования фрагментов кДНК протеинкиназ, соответствующих транскриптам, преимущественно представленным в опухоли ВМР-П по сравнению с опухолью ВМР-0.

обогащения продуктов амплификации по фрагментам, соответствующим кДНК протеинкиназ, транскрипты которых преимущественно присутствуют в высокометастазирующей опухоли, для чего использовалась полиА(+) РНК. опухоли ВМР-0 (Рис. 1). В результате использования этого подхода были идентифицированы фрагменты кДНК двух протеинкиназ. Компьютерный анализ показал, что один из них соответствует рецепторной тирозиновой протеинкиназе c-Met. Интересно отметить, что аномальная активация c-Met, причиной которой, в частности, может быть повышенная экспрессия, ранее была отмечена во многих опухолях различного происхождения и коррелирует с прогрессией опухолей. Аминокислотная последовательность, соответствующая другому клонированному фрагменту, обладала высокой гомологией с фрагментами каталитических доменов протеинкиназ (Рис. 2). Однако ни нуклеотидная последовательность фрагмента, ни соответствующая ей последовательность аминокислотных остатков не содержатся в базах данных. Это позволило сделать предположить, что данный фрагмент представляет ранее неописанную протеинкиназу, названную MAK-V. Нозерн-блот анализ препаратов РНК опухолей семейства BMP показал, что гены обеих обнаруженных протеинкиназ транскрибируются преимущественно в высокометастазирующих опухолях ВМР-П и ВМР-ЯН по сравнению с низкометастазирующей опухолью ВМР-0 (Рис. 3, 4)-

Клонирование кДНК mak-v. Для клонирования кДНК mak-v были использованы кДНК-библиотеки опухоли ВМР-П (библиотека сконструирована с использованием затравки oligo(dT)] 3) и клеток KCMJI-0 (библиотека сконструирована с использованием затравки Ng), в которых транскрипт mak-v был обнаружен методом Нозерн-гибридизации (Рис. 8).

VIb I I VII I I VIII I

ohrDok+-Nooo-----oko+Dfgo+-----------------g+—o-+pEoo-

MAK-V IHSDLKIENLLbDEDNNIKLIDFGlSNCAGIlGYSD. PFSTQCGSPAYAAPELL. SNF1 VHBDLKPENT,T.T,DEHLMVKIADFGLSNIMIDGN. . . . FLKTSCGSPNYAAPEVI. Cdk2 LHRDLKPQNLLINTEGAIKLADFGLARAFGVPVR. . . TYTHEWTLWYRAPEILL ERK-2 LHRDLKPSNSSLNTTCDLKICDFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWÏRAPEIML

PKA-Ca IYKDLKEENLLIDQQGYIQVTDFGFAKRVKG......RTWTLCGTPEYLAPEII.

S6K lYRDLKPENIMLNHQGHVKLTDFGLCKESiroGT. . .VTHTFCOTIEYMAPEIL.

I X

----о-----Doo+og

MAK-V ARKKYGP. KIDVWSCG SNF1 SGKLYAGPEVDVWSCG

Cdk2 GCKYYST. AVDVWSCG ERK-2 NSKGYTK. SIDIWSVG PKA-Ca LSKGYNK.AVDWWALG S6K MRSGHNR.AVDWWSLG

Рис. 2. Сопоставление аминокислотной последовательности, соответствующей клонированному фрагменту кДНК ранее неописанной протеинкиназы MAK-V, и фрагментов каталитических доменов протеинкиназ и MAK-V. Границы и номера субдоменов обозначены вертикальными чертами и римскими цифрами, соответственно. Над последовательностями инвариантные остатки приведены большими буквами, почти инвариантные - маленькими. Для обозначения других консервативных остатков использованы следующие обозначения: о - остатки неполярных аминокислот, * - остатки полярных аминокислот, и + - остатки малых аминокислот с практически нейтральной полярностью (Hardie & Hanks, 1995).

Скрининг кДНК-библиотеки клеток КСМЛ-0 с использованием клонированного продукта амплификации в качестве зонда привел к идентификации нескольких позитивных клонов. Клоны С6 и СП содержали перекрывающиеся фрагменты кДНК так-ч размером 609 п.н. и 1372 п.н., соответственно, что составляет около 27% определенной по Нозерн-шбридизации длины полной кДНК. Вставка клона СП была использована в качестве зонда для скрининга кДНК-библиотеки опухоли ВМР-П. Проанализированные клоны VI и У2, полученные в результате скрининга кДНК-библиотеки опухоли ВМР-П, содержали вставки размером 2955 п.н. и 4125 п.н., соответственно, с

# # # ^

c-met

GAPDH

Рис. 3. Нозерн-блот анализ c-met в препаратах РНК опухолей семейства BMP. Для анализа было использовано 20 мкг тотальной РНК низкометастазирующей опухоли ВМР-0 (ВМР-О) и высокометастазирующих опухолей ВМР-П (ВМР-П) и BMP-ЯН (BMP-ЯН). Транскрипт c-mei размером 8 т.н. отмечен. GAPDH - гибридизация той же мембраны с зондом кДНК GAPDH.

<г> ^ У

»Я' Л А' # ^

28 S >

_ tnak-v

18 S-

GAPDH

Рис. 4. Нозерн-блот анализ mak-v в препаратах РНК опухолей семейства BMP. Для аначиза было использовано 20 мкг полиА(+) РНК низкометастазирующей опухоли ВМР-0 (ВМР-0) и высокометастазирующих опухолей ВМР-П (ВМР-П) и BMP-ЯН (BMP-ЯН). Транскрипт mak-v размером около 5 т.н. отмечен. GAPDH - гибридизация той же мембраны с зондом кДНК GAPDH.

полиА последовательностями на концах. 5'-конец кДНК mak-v был получен методом 5'RACE, используя полиА(+) РНК клеток линии KCMJ1-0 в качестве матрицы.

Определенные последовательности вставок клонов С6, СП, VI, V2 и 5'RACE позволили реконструировать полную последовательность кДНК так-v (Рис. 5А). Последовательности 5'-нетранслируемой, кодирующей и частично З'-нетранслируемой областей кДНК были проверены по комплементарной цепи. Последовательность кДНК так-V состоит из 5026 п.н., что соответствует размеру транскрипта, детектированному методом Нозерн-гибридизации. кДНК mak-v кодирует серин/треониновую протеинкиназу. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что кДНК mak-v содержит ORF наибольшей длины 2142 нуклеотида, которая кодирует полипептид ожидаемого молекулярного веса 79.6 кД (Рис. 5Б). В области ATG-кодона этой ORF в позиции -3 находится пуриновое основание (в данном случае G), что является достаточным требованием для эффективной инициации трансляции.

Анализ аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого этой ORF, показал, что она содержит протеинкиназный домен, в котором присутствуют все консервативные аминокислотные остатки, типичные для каталитических доменов серин/треониновых протеинкиназ (Рис. 6). Наибольшую гомологию с последовательностью каталитического домена MAK-V имеют последовательности каталитических доменов SNFl-подобных протеинкиназ. Протеинкиназная активность белка MAK-V. Присутствие каталитического домена в полипептпде является достаточно четким указанием на протеинкиназную функцию белка, однако функциональное подтверждение этого факта является предпочтительным. Для экспрессии MAK-V в эукариотических

А.

5'ИАСЕ

СС6

ссч

кДНК так-ъ

ядгмщмиияшияаат

VI

гнязт полил

У2

полиА полиЛ

Б.

1 МРАААСОСЬЬСЕ Р А А Р С й ъ а б А Е О ШР1 А

31 ACEGSFt.PA.WVS в V Э К Е Я ь и вр^н в к и V а N

61 Г А к V к, г в 1». К. V Ъ Т В Е К V А Г

91 ' К V Х.О ЦИКЮФ 1С V т к н ь к к гзо I 0 о м I л н

121 »110111111.21 £ N 3 I г ь V м £1СР ее»» н

151 А Ж К!,1 8М I Э А V шин А

1В1 О V 7 Н Я И I. К X 2 Н Ь ь ь V г с н N I К Ь I в 8 81,8» С

211 хв1ье*!гвр'Г8г 0 с е 5 р А I А АРЕ! У

211 еипуилв»» м у »»и « т ь р р т V е р г з ъ

271 : К Ы И-Р ьи (¡1 г 15 4? ы г ¿8 Й 1>

301 1ЕР ОР V К В Р И I й с А I/ А N в и г »111 Т 13 К V т с

331 Я^ТУРНК! Э Ь Е И Ъ Б Р 3 V V I. н Н Т Е К Ь й У к к в

361 ОУХКТУЬЗПК&С Н I ни Р ъ ь н к к I. Е К. У I, 3

391 Т 0 I Г в I Е К С И А Т к г р у е А

421 3 : О ТИТНОРЕГН А V 0 ТЗ к к Р к Е о Е К К в И Р г. н

451 ИРГ8КК1.0КН1,Р 3 н К о Р 3 р г ытд Г. 0 3 т к А

481 Р в V с «Я1Г К К Т Б К й

511 ЯС7Й!$!«ЕР1Р V Р ! И1 Р к I V к к Ь Е Р Н 2 Р

541 срепиыии р I I. I. 0 К V к ! I > 3 V 0 И Е О Н

511 1П18Р!Н1111 ь э Э Р V 3 Ъ А Н й N Я 3 Е Я Т Ъ 3

601 45И8531!Пв Т Р Ч!1 Ь V Б Р А Н Е Е К N Э р

631 РКЕЕСУСЙРРЕУ Р 3 ЯЕЛ В р ь а я е N С V К Б к

661 СНРРИМСХСОМ!, и к ян (2 3 Р Б Б Е Я 3 Ъ Б А 3

691 Э Р V М А И в V квас

А - Последовательности клонов СС6, СС11, V!, \'2 И

позволяют реконструировать последовательность кДНК так-\> мыши. Б Последовательность белка МАК-У мыши. Последовательность каталитического домена приведена на сером фоне. Нуклеотидная последовательность кДНК так-\> помещена в базу данных нуклеотидных последовательностей ОепеВапк (Асс. # АР055919).

1 I II II II III

о-----og-G -og-V-----------oaoK -о------------------

КР*7Й_H'JMAN YRLLKTIGKG NFAKVXIARH ILTGREVAIK IIDKTQLNPT SLQ.K.LFRE

KEMK_MOUSE XÏI.LKTIGXG NFAKVKLARH XLTGKEVAVK IIDKTQLNSS SLQ.K.LFRE AAK1_RAT YILGDTLGVG TFGKVKVGKH EbTGEKVAVX IIMRQKIRSL DWGK.IRSE AAK2_RAT YVLGDTLGVG TPGKVKJGSH QLTCHKVAVK XUmQKrRSL DWGK.IKRE SNF1_ÏEAST ÏQIVKT1GEG SFGKVKLAYH TÎTGQKVALK IINKKVIAKS DMQGR.IEKE MAK-V LIGSRKLGEG SFAKVREGLH VLTGEKVAIX VIDKKRAKKD TYVTKNLRRE

XP7S_HUMAM

kemxTmouse

AAK1JRAT AAK2_RAT SNFlJfEAST MAK-V

I I

-co---—h-

VRIMXILKHP VRIMKVLNHP ISSbKLFRHP IQNIKLFRHP ISYÏ.RLLRHP GQIQQMIRHP

IV

-oo-o---o-

NIVKLFEVIE NIVKLFEVIE HIIKLYQVIS HIIKLÏOVIS HIIKLYDVIK NITQLLDILE

I I V

----OOOOO* OO--------

TQXTLYLIME ÏASGGKVFDY TEKTLÏLVME YASGGEVFDY TPSDIEMVMS YVSGGELFDY TPIDFFMVME YVSGGELFDY SXDEItMVIE Y.AGNELFDY TENSYYXVME LCPGGNLMHK

I I

LVAHGRMKEK LVAI1CRKKEK ÏCKNGRLDEK ICKHGRVEEV IVQRDKMSEQ IYEKKRUiEA

Via I I VIb I I VII

----o--*o- ~+o-ooh---oohrDok+-M ooo-----ok о+D£go+---

KP7Q_ EitTMAN EARSKFRQIV SAVQYCBQKR IVHRDLKAEN IXLDADHNIK TADFGFSN. . KEMK_MOUSE EARA1SFRQIV LHVQÏCHQKF IVHKKLKAEM Т.Т.ТЛАРМЫХК IADFGFSN.. ■AAX1_RAT ESRRIPXIIL SGVDYCHRBM WBRDLKPEH VLLDAHMNAK IADFGLSN. . AAK? RAT EARRLFQQIL SAVDYCHRHM WHBDLKPEN VLLDACMNAK IADFGLSN., SNF1_YEAST EARRFFQQII SAVEYCHRHK IVKRDLKPEN Т.ТТ.ПЕНЪЫУК IAEFGLSN. . MAK-V EARB.YIRQLI SAVÏHLHRAG WHRDbKIEH LLLDEDNNIK LIDFGLSNCA

I I VIII t I IX

-------------g+—q-+ pEoo----o-----D00+og oooo-o----

KP78_HUMAN .EFTVGGKLD TFCGSPPYAA PELFQGXKYD GPETOVWSX.G VTLÏILVSGS KEMK_MOUSB .EFIFGNKLD TFCGSPPYAA PKLFQGRKID GPEVDVWSLG VlbYTLVSGS AAK1_RAT .MMSDGEFLR TSCGSPHYAA PEVISGRLYA GPEVDIWSSG VILYALLCGT AAK2_RAT . MMSDGEFLR TSCGSPNYAA PEVISGRLYA GPEVDIWSCG VILYALLCGT SMF1_ÏEAST . IMTDGNEXK TSCGSPNYAA PEVISGKLYA GPEVDVWSCG VILYVMLCRR MAK-V GILGYSBPFS TQCGSPAYAA PELLARKKY. GPKIDVWSIG VNWXAMLTGT

I I

I I

XI

—oo-------—OO---О----------О------OO—о о------R-+

KP78_HUMAN I.PFDGO- .NL KELRER.VLR GKYRIPFYMS TDCEHLLKRF LVLNPIKRGT

XEMK_MOUSE 1PFDGQ. .NL KEURER.VLR GKYRIPFYMS TDCENLLKKF 1ILHPSKRGT

AAK1_RAI ЬРИЭШ. . HV PTLFK2C. ICD GIFYTPQYUN PSVISLLKHM LQVDPMÏCRAT

AAK2~RAT 1EFDDE. .HV PTLFKK.IRG GVFYIPEYLN RSIATLLMHM LCVDPLKRAI

SNF1_YEASÏ 1PFBDE. . SI PVLFKN. ISN GVYTLPKFLS PGAAGblKBM LIVNPUIRIS

MAK-V LPFTVESFSL RALÏQKMVDK AMOTLPIQLS ISAVSFLRSb LEPDPVKRPN

KP78__HUMAN KEMK_MOUS2 AA.K1_RAT AAK2_RAT SNF1_YEAST MAK-V

I

tEQIMKDRWI LEQIMKDRWM IXDIREHEW IKDIREHEWP IHEIKQODWF IQQAbANRWL

Рис. 6. Сопоставление аминокислотных последовательностей каталитических доменов серин/треониновых протеинкиназ и MAK-V, выполненное с помощью программы PileUp пакета программ для анализа нуклеотидных и белковых последовательностей GCG Wiskonsin Package. Границы и номера субдоменов обозначены вертикальными чертами и римскими цифрами, соответственно. Над последовательностями инвариантные остатки приведены большими буквами, почти инвариантные - маленькими. Для обозначения других консервативных остатков использованы следующие обозначения: о -остатки неполярных аминокислот, * - остатки полярных аминокислот, и + - остатки малых аминокислот с практически нейтральной полярностью (Hardie & Hanks, 1995).

клетках фрагмент кДНК mak-v 97 - 2909 п.н., кодирующий аминокислоты 33-714, был сшит с сохранением рамки считывания с фрагментом кДНК препроинсулина человека, содержащим часть 5'-нетранслируемой области и ATG-кодон. Полученная конструкция была клонирована в экспрессионный вектор pBK-CMV под контролем CMV-промотора (плазмида pMAK-S). Клетки ВМР-0, транзиторно трансфецированные плазмидой pMAK-S, были использованы в качестве источника белка MAK-V для анализа его протеинкиназной активности in vitro с гистоном HI или основным белком миелина (МВР) в качестве субстрата. Для очистки белка MAK-V использовалась иммунопрецепитация с анти-MAK-V антисывороткой из белковых экстрактов клеток ВМР-0, трансфецированных плазмидами pMAK-S и pBK-CMV (негативный контроль). При использовании гистона HI в качестве субстрата опытный иммунопреиепитат обладал большей протеинкиназной активностью по отношению к гистону HI по сравнению с контрольным иммунопрецепитатом, в реакции с которым наблюдалась только фоновая протеинкиназная активность (Рис. 7А). Кроме того, белок MAK-V обладал специфической протеинкиназной активностью по отношению к белку р20, содержащемуся в использованном препарате гистона HI (около 2% от количества гистона HI по окраске разделенных в ДСН-ПААГ белков Coomassie Brilliant Blue). Фосфорелирование р20 наблюдалось только в реакциях, содержащих иммунопрецепитаты из белковых экстрактов клеток ВМР-0, трансфецированных плазмидой pMAK-S. Фосфорелирование белка р20 и специфическое фосфорелирование гистона HI уменьшалось с уменьшением количества добавленной для иммунопрецепитация анти-MAK-V антисыворотки. Сходные результаты были получены и при использовании МВР в качестве субстрата (Рис. 7Б). Фосфорелирование МВР иммунопрецепитатом из белковых экстрактов клеток ВМР-0,

к 1 МКЛ 0.1 мкл

- + - +

HI Л

р20 ¿ft *

В.

+ MW

МБР-

МВР>

43 кД

Ч 29 кД

Ч18.4кД «14.3кД <9.2 кД

Рис. 7. Анализ протеинкиназной активности белка MAK-V in vitro. В реакцию фосфорелирования добавлялся иммунопрецепитат с анти-MAK-V сывороткой белковых экстрактов клеток ВМР-0, транзиторно трансфецированных плазмвдой pMAK-S (+) или pBK-CMV (-). А - в качестве субстрата был использован гистон HI (HI). Белок р20, содержащийся в препарате гистона HI, отмечен (р20). Для иммунопрецепитации было использовано указанное над дорожками геля количество анти-MAK-V сыворотки. Б - в качестве субстрата был использован основной белок миелина (МБР). Для иммунопрецепитации был использован 1 мкл анти-MAK-V сыворотки. В - белки в геле Б были окрашены Coomassie Brilliant Blue перед сушкой геля и радиоавтографированием для контроля количества нанесенного на гель субстрата. MW- стандарты молекулярных весов.

Рис. 8. Нозсрн-блот анализ так-у в препаратах РНК различных клеточных линий мыши. Для анализа было использовано 20 мкг тотальной РНК клеток. Названия клеточных линий приведены над соответствующими дорожками геля. Транскрипт так-у размером около 5 т.н. отмечен. САРВН - гибридизация той же мембраны с зондом кДНК ОАРОН.

трансфецированных плазмидой pMAK-S, было более сильным по сравнению с наблюдавшимся в контрольной реакции. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что белок MAK-V обладает протеинкиназной активностью in vitro.

Спектр экспрессии mak-v. Анализ препаратов РНК ряда клеточных линий методом Нозерн-блот гибридизации показал, что транскрипт mak-v, кроме клеток линии ВМР-П, присутствует только в клетках линии КСМЛ-0 и не детектируется в других как опухолевых, так и неопухолевых клеточных линиях различного происхождения (Рис. 8). Метод Нозерн-блот гибридизации на препаратах тотальной РНК легких, селезенки, почек, головного мозга, сердца, яичников, тимуса, кожи и печени взрослой мыши не позволил детектировать транскрипт так-\' в этих тканях (данные не приведены). Однако мРНК mak-v была обнаружена в эмбрионах мыши в возрасте 10.5 dpc, 12.5 dpc и 14.5 dpc

А.

Рис. 9. Иммуногистохимический анализ белка MAK-V на парафиновых срезах эмбриона мыши. А - анализ проводился с использованием анти-MAK-V антисыворотки в разведении 1:50. Детекция иммобилизованных антител проводилась с помощью конъюгата вторичных антител с пероксидазой. В качестве субстрата для пероксидазы использовался DAB (коричневая окраска; отмечено стрелками). Б - контрольный препарат, не инкубированный с анти-MAK-V антисывороткой. Приведены части срезов, содержащие фрагменты нервной трубки.

ж

^ лК1

кр -f А*

.V

I I I I I 1

I I I I 1 I

9.49 т.н.« 7.46 т.н.*

4.40 т.н..

2.37 т.н.,, 1.35 t.H.«.

mak-v

Рис. 10. Нозерн-блот анализ mak-v в различных отделах головного мозга крысы. Анализ проводился с использованием Rat Brain Northern Blots (Origene), содержащими равное (20 мкг) количество иммобилизованной тотальной РНК указанных отделов головного мозга.

(данные не приведены). Проведенный иммуногистохимический анализ экспрессии белка МАК-У в эмбрионе мыши (11.5-12 сЗрс, стадия Тайлера 19) с использованием поликлональной сыворотки к фрагменту белка МАК-У показал, что МАК-У присутствует в отдельных клетках белого и серого вещества нервной трубки, состоящих из дифференцирующихся нейрональных и глиальных клеток (Рис. 9).

Детальный анализ экспрессии так-у в различных отделах головного мозга крысы методом Нозерн-блот гибридизации (Рис. 10) показал, что транскрипт крысиного гомолога так-у размером около 5 т.н. присутствует в среднем мозге, обонятельной луковице, фронтальной, задней и энторинальной коре. Наибольшее содержание

А.

Рис. 11. Иммуногистохимический анализ белка MAK-V на криосрезах эмбриона мыши. Анализ проводился с использованием анти-MAK-V антисыворотки в разведении 1:1000. Детекция иммобилизованных на срезе антител проводилась с использованием вторичных антикрысиных IgG антител, сшитыми с биотином и конъюгатом пероксидазы с авшшном. В качестве субстрата для пероксщдаы использовался DAB (коричневая окраска; отмечено стрелками). Белок MAK-V детектируется в гиппокампе (А) и мозжечке (Б). В качестве контролей (данные не приведены) использовались гибридизации без первичной антисыворотки, а также с первичной антисывороткой, прединкубированной в течении ночи при +4°С с раствором рекомбинантного фрагмента белка MAK-V, использованного для иммунизации, в PBS (100 нг белка / 1 мкл первичной антисыворотки).

мРНК mak-v наблюдалось в гиппокампе и мозжечке. Кроме того, следовые количества транскрипта mak-v были обнаружены в препаратах РНК зрительного бугорка, медулы, спинного мозга, Варолиева моста и стриатума. Проведенный иммуногистохимический анализ белка МАК-V на срезах мозга мыши продемонстрировал его присутствие в гиппокампе и мозжечке (Рис. 11).

На функциональную важность MAK-V в клетках нервной ткани указывают и данные, полученные в результате предварительного скрининга кДНК-библиотеки эмбриона мыши в возрасте 14.5 dpc в двугибридной системе в дрожжах. Все идентифицированные таким образом кДНК, кодирующие потенциальные белки, взаимодействующие с MAK-V, экспрессируются в клетках нейронального происхождения (данные не приведены). Анализ последовательностей, гомологичных кДНК mak-v мыши. Анализ баз данных нуклеотидных последовательностей позволил выявить ряд EST, STS и GSS человека, последовательности которых обладают высокой степенью гомологии с кДНК mak-v мыши (Табл. 1). Сопоставляя последовательность кДНК mak-v мыши и последовательности гомологов человека, была частично реконструирована аминокислотная последовательность белка MAK-V человека, и ее сопоставление с последовательностью MAK-V мыши выявило высокую степень их гомологии в области реконструированных участков (Рис. 12).

Идентифицированные STS и GSS человека, гомологичные кДНК mak-v мыши позволяют определить хромосомную локализацию предположительного человеческого гомолога гена mak-v мыши. GSS HMSC10C09, HMSC10B10 и HMSC14G06 соответствуют последовательностями "trapped" экзонов хромосомы 21 человека. GSS 32D2A10 и Q89A6A4 позволяют локализовать ген mak-v на длинном

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности, гомологичные кДНК так-у мыши. Позиции нуклеотидов кДНК так-у приведены, считая первое основание за +]. З'ЦГЛ - З'-нетранслируемая область, кодир. - кодирующая область кДНК так-

V.

Название Acc.# Тип Вия Источник Участок гомологии % гомологии Область гомологии Длина гомолога Длина гомологии

mak-v гомолог

тп04е0ад : 1ААП4653" EST МитсиЩз ' амбрион, 7.5 äpc 4491-4896 1-405 1 99% • i • 3'UTR ' , 405 405 •

Mnc63gfll,ri, . W4I683.1' EST эмбрион, 13.5/14 J dpc. 3S80-4I75 1-298 ' 98% ' ■ 3'UTR 301 • ,298

VeSiflUl , AA412762 EST .эмбрион, 7.5 dpie' 4016-4265 1-250 ■ '9896 , 3'UTR ' 250 250

mn04e08.rl AA819170 EST R.norveg>cus мозг 4637-5008 368-6 90% 3'UTR 421 363

;izw0ma8.ri; '1 . i < ■1 1 AA4265S0 'Л,' .-. EST •Esapiens \ • ( меланоцвтн/ i 1 . > эмбриональное еераце/ • матка при беременности! , 405-803 ' 948-1016 • 1-394 412-4ЙГ ,89% i > , 89% ■ КОДИр^* ( !кодар ,, , 482 ' i, '3?4 ' 69

, '-zwOIhOS.sl AA41S916, EST 1041-1376 337*1. 89%« 1 t кодцр. .'• -342 : ' 33? 1

,yw37fc{>4.si ,, ¿N22405 EST , зародышевая кожтея 4873-5014 ' 147-7 , 86Ä " 3'UTR -242 ' • „• 140

yz381i044K ■f N66354 , ' 1. ' EST Ц. * аародышевая квдгея 4873-5008 4682-4746 139-5 "326-256' 9o%i •• '1 3'UTR 3'üTfe 1, Ч 423 . ,1' i -, ' ' 136 ' '65 •• •

,yb98h09sl_,. . .- it. , ,\T581129' , il ¿ST легкие, . » 4873-4998 4687-4746 •137*13 , 313-254 , ' 90%. " 3'UTR 3'ÜTR 'i; 559 ■ 1 '1 ' " ' 123 ' ' '69 '

.EST796S2 ' AA368352 ■ EST I даацента j 1726-1950 1 225fl и , 8Ö&..., Кодир. 1 -225' 22S

HSMC10C09 X88424 GSS Hsapiens trapped exon, Chr. 21 1070-1232 1-163 90% кодир. 163 163

HSMC10B10 X88425 GSS trapped exon, Chr. 21 948-1069 15-137 87% кодир. 137 122

HSMC14G06 X88390 GSS trapped exon, Chr. 21 1233-1316 1-84 84% кодир. 84 84

32D2A10 AG003295 GSS Геномная ДНК, Chr. 21q 810-934 170-46 89% кодир. 694 124

Q89A6A4 AG004439 GSS Геномная ДНК, Chr. 21 q 669-802 226-359 91% кодир. 696 134

Q89A6A4 AG004422 GSS Геномная ДНК, Chr. 21 q 669-751 120-37 92% кодир. 690 84

Wl-8865 G07022 STS - 4873-4992 4687-4746 137-13 313-254 86% 91% 3'UTR 3'UTR 559 125 69

SHGC-52148 G34717 STS - 4873-4992 4687-4746 137-13 313-254 86% 91% 3'UTR 3'UTR 500 125 69

МАК

МАК

МАК

НМАКР1

МАК

НМАКЕ1

МАК

НМАКР1

КАК

НМАКР1

МАК

МАК

НМАКР1

МАК

НМАКР1

МАК

МАК

МАК

НМАКР2

МАК

НМАКР2

МАК

МАК

МРАААвОСЬЬСЕРЙАРССВСаАЕВТТНРАААСЕСЗт'АМУБетВЯЕКЬК -50

СБ^ННКК^етПГЬТСбЕКЬСЕСЗЕАКУКЕСЬНУЬТСЕКУАХКУХВККБАКК -100

DTYVTÍ®XJÍBEедIÍX^IMMXTгl<LDI^ETEHSYУLVMELCPGaNL^Ш -150 I I I I I II I II II I I I I II И I I I I I I I III 1111 2МГЕНт1Т21ЛП1ЬЕТЕНЗГПУМЕ1,СРШШЬМН -35

К1УЕКЮШЭЕАЕА1ЖУГВ0М8А7ЕНЬН&АеУУН1Ф1,К15ЖДДЛЭЕВ1ТН1 -200 I I I I I I II .1 .1 I I I I I II I I I II I I I I I II I I II II I II I I I II I I I I I

К1ХЕКККЬЕЕ5ЕА1ЖУ1К0Ы5АтаНЬНЕАКУ\Т1НБЬК1ЕИГ,ШЭЕОНМ1 -85

-250

III II I I I II III I I IIII I I I I I II IIII I I I I I III I I I I I II И I I I КХ.ХЕРСЬЗНСАСХЬСУБПРГЗТОССЗРАУААРЕЬЬАКККУСРКХРУГСЗХС -135

У№гаАМЬТСТЬР£ТУЕ1'Г31ЛгАЬУ0КМтаКАМШ,ЬРТ,01,ЗТСАУ11Е,ЬК211 -300

I I I II II I I I I III II I I I I I II II II I I I I I I I I I I I I I I I . 11111

-185 -350

1111111II II 111111111IIIII И 11111111111 1111111111 11 ■ 1лрорук1стхмА1дт!яи1ЕНУТ13Курсытаурот1Х51£П1,ерзутан -235

МТЕКХ|СУККЗВЛГХЮГУХ5ИКАСИ1ЬА1УРШЖКЬЕКУЬ5СКЗОХ0О21С -400 I I I 1 1 I II I II I I I I I I I III II I II I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I . I МТЕ1аеуКН5ВУГЫТта,ЗМ!!АСВ11А1гП,ШККХ.ЕКТХ,ЗекЗП1!ЗСЗЬС -285

ТКТдЬУ21ЕКСВАТК2РУЕА31^Т«ХЕЕГЕГНАУйОККРКЕС£ККСОРЬН -450 III 111111 II II I I I I I II II I I I I I I I I II I I ХКТКЬУС1ЕКУВАРКЕЗгаА5ЬСТИТШЭХЕРНАУ0ОККР -324

ЕКикКТВПгнСИ1338МЕР1РтеРРЕТг!аУККЬЕ?НС2РСРСЗА31ЬРК -550

-600

I I I I I I II И .11. -II I I I I I I I IIII I I I I I I II I II

ОО^ЬгСЗТ.^ГГ^ТРТ.НЗТГ'/ЗРАНЕЕКК^РРК^^С'^еЗУРУ^ЗКОЬЪ^Р -650

II III III 1111 11II11II .1111

ра1.рзС5мзил;:1'.Р1_нрт^згАПЕвкизр -74

31, ГПММЗ ^КООС -714

Рис. 12. Сопоставление аминокислотных последовательностей белка МАК.-У мыши (МАК) и реконструированных фрагментов НМАК1 НМАК2 последовательности белка МАК-У человека. Идентичность аминокислотных остатков показана вертикальной чертой, сходство аминокислотных остатков - точкой.

плече хромосомы 21q, и, наконец, гомология З'-концевой последовательности кДНК mak-v мыши с EST человека и соответствующим им STS WI-8865 (маркер D21S1966) делает возможным определить точную лок&чизацию гена mak-v человека. Высокая степень гомологии З'-концевой последовательности кДНК mak-v мыши с STS WI-8865 (Рис. 13), его уникальность в геноме, и тот факт, что STS WI-8865 находится в гене Hs. 10344 (вывод об этом был сделан на основании кластеринга транскриптов; Genomic DataBase (GDB), John Hopkins University, http://www.gdb.org) позволяют предположить, что ген Hs. 10344 является человеческим гомологом гена mak-v мыши. Ресурсы, предоставляемые GDB, позволяют локализовать маркер D21SI966, содержащийся в контиге WC21.1, в полосе 2Iq22.ll, между генами АРР (ß-amyloid precursor protein, 21q21.2) и ERG (avian erythroblastosis virus E-26 (v-esr) oncogene related; 21q22.2), что соответствует аналогичному району хромосомы 16 мыши (Mouse Genomic Database (MGD), The Jackson Laboratory, http://www.informatics.mgd.org). На генетической карте хромосомы 21 человека предположительный гомолог гена mak-v мыши находится между 32 сМ и 33 сМ (Рис. 14).

Локус хромосомы 21 человека, содержащий предполагаемый гомолог гена mak-v мыши связан с рядом заболеваний человека. Гены района 21q22 связаны с многочисленными ненормальностями в постнатальном развитии, в частности, с интеллектуальным развитием, шизофренией и аутизмом, синдромом Дауна. В дополнение к этому, ассоциированный с геном GRIK1 полиморфизм коррелирует с проявлением одной из форм эпилепсии (juvenile absense epilepsy), а амплимер D21S223, находящийся в непосредственной близости от маркера D21S1966 (Рис. 14), сцеплен с генами, связанными с возникновением семейного амиотрофического латерального склероза

4600

CAGTGGACCC .ATTGAGAGG . . CAAATGAG AACAGGAGGG AGACAAGCTG I I I 1 I I III I I I 111 II I I II I I III

TCCTAAACCC CAGTGAGCGG TGAGGGGGAG TGATGAAAGG GGATCAGCTG

4647

TGTTCTGGGG CGCACATAAA ........CA CCTGACAGAC GAGTC.TAGG

III III I II 111(111 1 II II I

TATTTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGAGCA CCTGACAAA. . . . TCCTATG 4688

AAACCGCGTG AAAGAAGAAA TGTTAAATTC TTTATTGTTT TATTATATTT I I I I I I III I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I III I I I I I I I II I AAACCGAGTG AAAGGAGAAA TGTTAGATTC TTTATTATTT TATTATATTT

1738

ATACGGAAAA TGTGGCTATC CTTTTGTTAA GTGCAGAGTG TATTATCTGT

I I I I I I I I I I I II I I I II I I I I I I II I I I I I I I ATATGGAAAG ATCGACTCTC CCTTTGGTAA GTCCGAAGCA TCTTGTTTGT

4708

TTGACCCATG ACTGrCTGTC CTTCATGAAT GAGTCTTTGC CTGTGATTCT

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

TCGA-CCATG ACTGTCT ■ ТС С........Г CAGTCTGTGC CTGTGATTCC

4838

AGTCAAGCCT GTGGCTACTG ATGGGAACGG CC.GATCTGT CATCATGTGA

I I I I I I I I I I I I I II I I III I II I I I I I I I I I I I I

AGTCA.CCCT GTAGTTACTG ACAGAAATTG ACTGGACTGT CATTGTGTGA 1887

ACTGCAGGAG GAAGAGTCTA TTTTAGTCAT ACGATTTTGG TCATGAGTAA I II I I I I I I III III I II II I I I I II I I I I I I I I I III I I AGTCTAGGAG GAAATGTCCA TTTTAATTGT ATGA.TTTGG TCATAAGTAA

4937

GGACrATATT TATGTCACCA CTATTGAATA TATGTACTTT TATAATGGCT

I I I II I I I I I I I I II I I I II I I I I III II I I I I I I II I I I II I II

GGACTATATT TATGTCACCA TTATTAGATA TATGTACTTT TGTAATGACT

4987

GTGAAATACA CTTTT.TCCT CAC .AAAAAA

I I I I I I I I I I I I I I I III III I I I I И

GTGAAATACA CTiWWCCCCT CACTAAAAAA

majc-v

mak-v

max-v

aak-v

h. cons

rtuik -v

rni-v

mak-v

Рис. 13. Сопоставление З'-концевой последовательности кДНК mak-v мыши и консенсусной последовательности предположительного гомолога человека (h. cons), полученной после анализа З'-концевых последовательностей EST N22405, N66354 и Т58129 человека и последовательностей STS WI-8865 и SHGC-52148 человека. Наибольшая гомология составляет 90% (н.т. 4682 - 4746) и 86% (н.т. 4873-5014). Последовательность амшшмера WI-8865 подчеркнута.

21q21,1 21q21.2 21q21.3

21q22.11

21q22.12 2iq22.I3

21q22.2

2Iq22.3

D21S223

'D2}Si966

APP

B21P1 B21P4

ERG

TIAM1

IFNGR2-

IFNAR2

IFNAR1

SOD

GART

"V. D21S1909

рй i f

GR1K1 DSCR1

V

r ■

•ч v -

¡Ш , t* Ь a

,xh *

" \ ,v . L»

? 3

D21S223

I И f1

UrfJrS) \

' - ■ ' Si

D21S1834 D21S1819 D21S262

,,»< . a

la D2IS 1967

Рис. 14. Фрагмент GBD Comprehensive Map хромосомы 21 человека (http://www.gdb.org).

(FALS, дегенеративная болезнь моторных нейронов). Возникновение FALS в этих случаях коррелирует с присутствием мутаций в находящемся вблизи маркера D21S223 геном SOD1. К настоящему времени описано около 50 мутаций и показано, что некоторые из них могут быть причиной возникновения FALS, однако роль остальных мутаций в формировании FALS не выяснена. Таким образом, принимая во внимание близость на генетической карте потенциального человеческого гомолога гена mak-v мыши и маркера D21S223, нельзя исключить возможность того, что ген mak-v может быть связан в некоторых случаях с возникновением FALS, ассоциированного с хромосомой 21, и спорадического ALS.

Таким образом, совокупность данных о характере экспрессии mak-v в нормальных тканях мыши, данные о потенциальных белках-мишенях, взаимодействующих с MAK-V, а также хромосомная локализации предположительного человеческого гомолога гена mak-v мыши и его возможная связь с заболеваниями нервной системы позволяют предположить, что MAK-V является протеинкиназой, участвующей в развитии и функционировании клеток нервной системы.

выводы

1. Идентифицированы рецепторная тирозиновая протеинкиназа c-Met и серин/треониновая протеинкиназа, названная MAK-V, гены которых экспрессируются преимущественно в высокометастазирующих опухолях семейства аденокарцином молочной железы мыши BMP.

2. Клонирована и определена первичная последовательность кДНК, кодирующей новую протеинкиназу MAK-V. Размер кДНК так-v составляет 5026 нт. и она кодирует белок с ожидаемым размером 714 аминокислотных остатков.

3. Продемонстрирована протеинкиназная активность белка MAK-V in vitro с использованием гистона HI и основного белка миелина в качестве субстратов.

4. Транскрипты mak-v детектированы в высокометастазирующих опухолях ВМР-П и BMP-ЯН и в опухолевых клеточных линиях ВМР-П и KCMJ1-0, а также в различных отделах головного мозга крысы.

5. Белок MAK-V детектирован в отдельных клетках белого и серого вещества нервной трубки эмбриона мыши, а также в различных отделах головного мозга мыши.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коробко, И.В., Кабишев, A.A., Киселев, C.J1. (1997) Идентификация новой протеинкиназы, специфически транскрибирующейся в опухолях мыши с высоким метастатическим потенциалом. Докл. Акад. Наук, 354". 554-556.

2. Korobko, I.V. (1998) Nucleotide sequence of mouse mak-v mRNA. GeneBank Acc. # AF055919.

3. Korobko, I.V., Yamamoto, K., Nogi, Y., Muramatsu, M. (1997) Protein interaction cloning in yeast of the mouse third largest RNA polymerase II subunit, mRPB31. Gene, 185: 1-4.

Отпечатано АОЗТ >

Тираж 100 экз. ОТ.04.98 Заказ № 2257