Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация гена транскрипционного фактора РАХ8

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация гена транскрипционного фактора РАХ8"

РГБ ОД

- 2 Ш5

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи УДК 575.16:599

ПОЛЕЕВ Андрей Владимирович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНА ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА РАХ8

Специальность 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ-ПУШКИН 1994

Работа выполнена с лаборатории молекулярной цитогенегики Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных и в Институте генетики человека (Университет г. Мюнстера, ФРГ).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

A. Ф. Яковлев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

B. Е. Комар; кандидат биологических наук А. П. Перевозчиков.

Ведущее учреждение — Институт цитологии РАН.

Защита диссертации состоится «.?£»» 199$~г. в '/ ча-

сов на заседании Специализированного совета Д.020.07.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: ¡89620, С.-Петербург—Пушкин, Московское шоссе", 55а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИГРЖ.

Автореферат разослан « 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Ж. Г. Логинов

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМИ. В течение нескольких лет после клонирования генов, кодирующих транскрипционные факторы, был достигнут большой прогресс в понимании природы и роли этих факторов, которую они играит в процессах конститутивной, индуцибельной и тканеспецифичной экспрессии генов; показа' на их вовлеченность в онтогенез и другие патогенетические процессы. Кроме того, глубокое проникновение в молекулярные механизмы функционирования этих факторов позволило получить детальную информации о том, как они осуцествляшт свои ре-гуляторные Функции при сайт-специфичном связывание в пр^мо-торных областях подконтрольных генов, каким образом осуществляется активация или репрессия транскрипции, или как они взаимодействуй с другими компонентами системы регуляции генной экспрессии. Более того, в ряде случаев идентифицированы районы индивидуальных фанторов, которые опосредупт эти эффекты, а также определена отдельные- аминокислота, которые критичны для подобных Функций этих участков. Оказывается, что транскрипционные факторы имепт мультидоменнуп организации, причем различные домены могут взаимодействовать с ДНК или белками. Изучение взаимодействий меяду различными транскрипционными ©анторами, а такяе взаимодействий меяду ними и конролирувцими их функции белками требует более комплексных подходов, чем изучение индивидуальных факторов. Однако на пути изучения йевпротеинових взаимодействий воз-мо8но найти понимание механизмов, которые интегрирует физиологические сигналы с дифференциальной экспрессией геНоа.

РАХ-гены принадлежат к одному из многочисленных классов транскрипционных . факторов, и судя по пространственно-временной картине экспрессии в развитии,- эволиционной консервативности, и связанными с идтацияки в этих генах аномалиями развития,они играштважнуа роль как в эмбриональный, гак и в постнатальнай периоды ^яйвотнвх, •

ЦЕДИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.' Цеяьп данной работы явла-

лось изучение структурно-функциональной организации транскрипционного фактора РАХ8, представителя генного семейства PflX. В частные задачи работы входило:

1. Клонирование и анализ кДНК РАХ8;

2. Анализ экспрессии РАХ8 in vivo;

3. Определение интрон-экзонной организации PñXB-гена;

4. Создание РЙХ8тспецифичного репортера и использование его в экспериментах по трансактивации для выяснения трансак-тивирующего потенциала PftX8.

5. Выяснение структурно-функциональной организации PfiXß: локализация активирующего транскрипции домена ( доменов ).

6. Выяснение трансактивирующей способности РЙХ8 в зависимости от контекста промотора.

7. Определение возможных регуляторов РЙХ8.

НЙ9ЧНЙЯ новизна И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТИ. Клонированы и охарактиризованы 5 изоформных кДНК транскрипционного фактора РАХ8. Определена стрдктура кДНК РАХ8: показано располоаение кодона инициации трансляции и стоп-кодона, polyA-сигнала. На основании изучения геномной организации гена РЙХ8 показан механизм осуществления дифференциального сплайсинга ц РЙХ8. Определено положение 11 экзон/интронных границ в гене РАХ8. Показана экспрессия изофорнных кДНК-транскриптов in vivo. Изолирован .предполагаемый промоторный регион РАХ8 гена. Создана система для тестирования в киль-type клеток клонированных продуктов гена РАХВ, Показан различный трансактивирувяий потенциал изофорн PfiXB. Определены доиен, ответственный за активации транскрипции, и предполагаемый транскрипционный ревдессор. Показана зависимость . трансакти'вирупией способности С-концевого района РАХВ. от контекста активируемого промотора и ДНК-свазыванцего домена .транскрипционного фактора. Определены 2 предполагаемых регулятора РАХВ-продуктов. i .

АПРОБАЦИЯ РЙБОТВ, Материалы диссертации были представлены на конференциях Hou? Molecular Genetics ( Cold Spring Harbor, Neu York,1392 ),Ferst ERBL meeting on transcription ( Heidelberg,1994 ) и Иемдународном симпозиуме " Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных вивотных " ( Санкт-Петербург,1394г.).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликованы 4 работы. .

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Работа изловена на 121 странице машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 5 таблицами и 27 рисцнками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов.' Список цитируемой литературы насчитывает 182 источника.

• 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе были использованы разнообразные иолекцлярио-биологические методы: скрининг Фаговых библиотек; клонирование последовательностей ДНК; рсстрикционный анализ последовательностей ДНК; Southern-blot-анализ; RHAse-протекция; секвенирование; обратная транскрипция; полимеразная цепная реакция; котрансфекции Са-фосфатных преципитатов ДНК в клетки ылекопитанщих и последующий анализ продуктов экспрессии; методы изоляции ДНК и РНК из тканей млекопитаищих и другие,

3,РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ На первом этапе исследований используя кДНК клон мыши с2А, который включает больвуп часть paired box РАХ8 ( Pla-chow et.al. 1990 ) как пробу для скрининга кДНК библиотеки кортекса почек, человека, ыы внделели 16 кДНК клонов. 12 из них содержали последовательности, позволяющие идентифицировать их как кДНК-копии транскриптов человеческого РАХ8 гена. 2 клона ( ИЗ и 119 ) содервали- полную кодирующую последовательность РАХ8, вклшчавцуи flTG, STOP, 3* - нетрансли-руемую область и polyA-сигнал. 7 клонов ( Н8-.Н29.Н1.1112,Н14, Н16.Н34 ) содержали в идентичной 3' участке polyA-сигнал AflTflAA, за который следовала длинная последовательность аде-нозиновых остатков С максимум 33 остатка). Клон Д14 имел 5 дополнительных нуклеидов ( АТСТС ) впереди polyA-сигнала, которые отсутствовали у других клонов. ,.

Два клона кДНК, Н12 и Н1Э, имели делеции в 189 пар ну-клеотидов, соответствуюиуи району И8 1059 - 1247. Три дру^ гих клона, Н и Н16 имели делецип в 79 пар нуклеотидов

- е -

С 1059 - 113? район Н8 ). Н2 и Н11 совпадают с Н8. за ис-клачеяиеи того, что у них отсутствуют 4 нуклеотидэ на, 5* Конце. HI и Н34 уачинаптся в полевении 502 и 320 соответственно относительно Н8. • "

Два иДНК клона ( Н8 й Н2Э ) содераали AU6, с которого моявт транслироваться белок длиной 450 аминокислот (рис.П, Этот Í1UG в полоаепии 161 не окруаен какой-либо Kozak'S consensus seguende С Kozak, 1906 ). Однако, 1G нуклеотидов вверх и 11 нуклеотидов вниз от этого AUG идентичны у иыии и

человека, Такая консервация последовательностей вокруг пер/ ч

вого Пи Б повет говорить о сходстве механизиов трансляции РЙХ8 и обоих видов. Отсутствие строкой токологии ыеяду последовательностями у иыши и человека вверх от половения 140 дополнительно подтвервдает, что QUE в положении 161 является , старт-кодоноы открцтой райки считывания. Эта открытая рамка считывания позволяет транслироваться -белки, содераацену paired doiaain, ДНК-связывашщая активность которого установлена (Zannini et.al., 1992 ), октапептид YSINGLLG, ( blJRRI ET.AL., 1389 ), первая -спираль hoseo-domain, четыре лейциновых остатка, которые могут формировать структуру "leuzine zipper" ( Landshulz et.al,, 1988 ).

Для подтверздения суцествования изофори, полученных путей' скрининга фаговых библиотек, и для идентификации других вариантов, вы использовали технику RT-nested PCR и RNflse-протекции для, анализа общей РНК, изолированной из различных тканей взрослого человека ц клеточная линий. Сравнение результатов RT-nested PCR с РПХ8 кДНК, полученных из 6 образцов тканей взрослого человека показывает, что во всех случаях присутствует фрагненты, соответствувцие 9 сплайс-фо-' риал человеческого РйХВ. ,

Анализ RNfise-протекцией общей РНК из тканей ШвзЧшшг, клеточной линии Hela, .щитовидной • ввлезы и почек взрослого человека с пробами РНК, произведенный)! с клонированных фрагментов H12StuI, HISStuI и H26PWI I/Stul демонстрирует относительные количества РАХВ в различных тканях с рдной стороны, а также количественные соотновения в них различных йэофорв. Сильная экспрессия РАХВ наблюдартся в тканях Hilas' tuBor и фетальной щитовидной велвзв, слабая - в тканях по— чар взрослого человека. Проба H26PwuII/StuI заяииавт тсглько „ один фрагмент, что указывает на то, что дифференциальннй

Рис.1. Результаты сенвеиирования кДНК РПХ8 и частичная экзонная структура. Paired box и октапептид подчеркнуты. Положение интроиов указано цифрами. AG акцептор сплайс-сайт внутри экзона 9 показан звездочкой.

1 TTCAGAAGGAGGAGAGACflCCGGGCCCAGGGCACCCTCGCGGGCGGGCGSACCC

1

AAGCAGTGAGGGCCTGCAGCCGGCCGGCCAGGGCAGCGGCAGGCGCGGCCCGGfl

CCTACGGGAGGAAGCCCCGflGCCCTCGGCGGSCTGCGAGCGACTCCCCGGCGAT

2 Н

GCCTCACAACTCCATCAGATCTGGCCATGGflGGGCTGAACCAGCTGGGASGGGC Р II N S I. R

CTTTGTGAATGGCAGACCTCTGCCGGflAGTGSTCCGCCflGCGCATCGTAGACCT

271 GGCCCACCAGGGTGTAAGGCCCTGCGACATCTCTCGCCAGCTCCGCGTCAGCCA

■3

TGGCTGCGTCAGCAflGATCCTTGGCAGGTACTACGAGACTGGCflGCATCCGGCC

TGGAGTGATAGGGGGCTCCflAGCCCAAGGTGGCCACCCCCAAGGTGGTGGAGflA

GATTGGGGACTACAAACGCCAGAACCCTACCATGTTTGCCTGGEflGATCCGAGA

CCGGCTCCTG6CT&flG&GC6TCTbT£flCftflT6ftCflCT6TCCCCfl6T6TCfteCTC 4,

541 CATTAATAGAATCflTCCGGACCAAflGTGCAGCAACCATTCAACCTCCCTATGGA

CAGCTGCGTGGCCACCAAGTCCCTGflGTCCCGGACftCACfiCTGATCCCCftGCJC-

5

AGCTGTAACTCCCCCGGAGTCACCCCAGTCGGATTCCCTGGGCTCCACCTADTC

CATCAATGGGCTCCTGGGCATCGCTCAGCCTGGCAGCGACflAGAGGflAflATGGA t б ' '' TGACAGTGATCfiGGATAGCTGCCGACTAAGCATTGACTCACAGAGCAGCAGCAG

811 CGGACCCCGAAAGCACCTTCGCACGGATGCCTTCAGCCAGCACCACCTCGAGCC

GCTCGftGTGCCCATTTGAGCGGCflGCftCTftCCCftGAGGCCTftTGCCTCCCCCflG

ccacaccaaaggcgagcagggcctctacccgctgcccttgctcaacagcaccct

ggacgacgggaaggccaccctgaccccttccaacacgccactggggcgcaacct

В

ctcgftctcaccagacctaccccgtggtggcagatcctcactcacccttggccat

1081 aaagcaggaaacccccgaggtgtccagttctagctccaccccttgctctttatc *

tflgctccgcccttttggatctgcagcaagtcggctccggggtcccgcccttcaa

tgcctttccccatgctgcctccgtgtacgggcagttcacgggccaggccctcct

9 '

ctcagggcgagagatggtggggcccacgctgcccggatacccaccccacatccc

• 10

cacca&cggacag&gcagctatgcctcctctgccatcgcaggcatggtggcagg

1351 aagtgaatfictctggcftatgcctatggccacaccccctactcctcctacagcga

11

ggcctggggcttccccaactccfigcttgctgagttccccatflttattacagttc

cacatcaaggccgagtgcaccgcccaccactgccacggcctttgaccatctgta

Stop

gtt&ccatggggacagtg 1530

оплайсинг не затрагивает эду область, Б противополсвность к этому, две другие пробы защищают фрагменты, соответствующие пяти изученным изоформан. Сравнение экспозиционной плотности протектируемых фрагментов показывает, что относительные количества различных изофори варьирует как в пределах одной ткани, так и меяду различными тканяии.

. Половение вырезающихся при сплайсинге интропов на кДНК РАХ8 ( рис.1 ) были-определены после клонирования геномных последовательностей в фаговых векторах, и секвенирования Фрагментов,' содержащих интрон-экзонные границы.

На основании изучения геномной организации РАХ8 в районе располовения зкзонов 8-10 возмовно схематично представить возникновение пяти сплайс-форм ( рис.2 ). S РАХВЬ-изофориы, представленной клонами Н12 и Н19, в результате дифференциального сплайсинга вырезается зкзон 9, который

lictp

АТ02 3 4 J 5 7 g AG • 9 10 11 |A0

4—fe^fe^sl hrf ? i ' 1 —

1 2 3 4 5 6 7

paired box octa

9 10 11 12

PST domain

PAX8a

t 11

PAXSb

i^m^yss i i J

pro-rich domain

SSSSSSSSSSSSSi

pro-rich domain

k\m\\\\\\\N zzx

pro-rich domain

PAX8c

PAX8d

PAXSe

Рис.2.Структура РАХ8 сОЫА и их частичная экзонная композицияЛаложение интроков указана стрелками с номером соответствующего интрона. У изоформ Ь, с, с) и е отсутствующие по сравнению с форкоД а 'секвенция спущены. У формы Ь ухаэана нухлеотидная позиция, используемая как граница экзсна.

- 10 -

кодирует домен с повыаешшм содер*анием пролиновых, серино-вых и треониновых остатков ( РБТ-домен ), Изоформа РЙХ8с, представленная Н1, Н16 и Н14, образуется в результате сплайсинга мевду*5' сплайс-сайтом интрона 8 и 3' сплайс-сайтом внутри зкзона Э.Лоследний сплайс-сайт содераит кон-сенсусный полипирииидиновый тракт, заканчивающийся инвариантным динуклеотидом й£, В результате этого альтернативного сплайсинга возникает сдвиг рамки считывания, и как следствие, С-конец РАХ8с изоформы представлен новым, по сравнении с РАХВ а и Ь, доменом в 99 аминокислот , с высоким содержании пролиновых С 25/99 ) и аргининовых ( 7/99 ) остатков. РАХ8(1 образуется в результате вырезания зкзонов 8 и 9, а РйХ8е - зкзонов 8, 9 и 10, в результате чего возникает сдвиг рамки считывания по типу формы с. Таким образом РйХ8(1 и е изоформы обладапт прогрессивно укорачивающимся пролин-богатам доменом.

Для функциональных экспериментов была выбрана конструкция рлНН/ШШКСЙТ, содержащая 8 ¿опий олигонуклеотида 11/12, который характеризовался умеренной активацией при котрансфекции с экспрессионным вектором с кДНК РАХ8 и обладал низкой базальной активностьи. Титрование РЙХ8 с репортером рШ1/12Щ9ТКСЙТ показывает, что с уменьлением концентрации трансфецируемого зкспрессионного вектора в 125 раз степень экспрессии САТ-гена остается значительной по , сравнению с базальным уровнем, изменяясь линь в 8,6 раза.

Анализ делеционных мутантов мьшиного РАХва в трансакти-вируищих эксперементах показывает., что только форма с ин-тактным С-концевым регионом способна трансактивировать Рах-специфичный репортер. Для более точной локализации активи-рущего района фактора были сконструированы делеционные мутанты РАХВа. Рах - специфичный репортер активировался всеми формами за исклшчением РйХВа*ех1б-12; степень активации значительно сни»алась в отсутствие экстремально концевого участка, кодируемого зкзоноы 12, и в комбинации доменов, кодируемых экзонами 10-12 и 9. При делеции участка, кодируемого зкзонами 10-12 активация репортера не наблюдалась. Химерный фактор с ДНК-связуадам доменом 6Й1.4 в комбинации с С-концевым районы РАХВ мог активировать 1Ж4-специфичный репортер только в случае присутствии домена, кодируемого экзонами 10-11. Эти результата яозволяит установить, что •

активирующий район PflXß в области домена, кодируемого эн-зонами 10-1?.. Этот домен, по-видимому, вносит наибольший вклад в активирующую способность С-концевого района, некоторой трансактивирующей' способностьи облагает, также участок, кодируемый экаоном 12. Домен, кодируемый зкзоном 9 обладает репрессирующей способностью по отношению к активирующему домену.

Сравнение трансактивирунщих способностей пяти изоформ PAXG позволяет выявить некоторые соотношения меяду структурой и свойствами С-концевых районов. Радикальное отличие дву* групп изученных изоформ ( а + Ьис + d + e ) заклича-ется в изменении аминокислотной последовательности С-концевого района, происходящей в связи с изменением рамки считывания. При этой оказывается, что в каждой группе существуют как сильные, так и слабые трансактиваторы. По степени активации репортера рлН11/12Н19ТКСАТ их мошно располояить в следующем порядке: а > b; е > d,с. Химерный транскрипционный фактор ДНК-связывашщим доменом GAL4 и С-концевым регионом РАХ8 активирует БА1,4~специфичний- репортер сходным образом: наибольшими трансактивирушщими свойствами оказываются наделены формы b и е.

В предыдущих экспериментах были использованы 2 вида репортеров, отличашщиеся в проыоторной области: 5xUflS ElbCAT содержит 5 копий олигонуклеотида UAS, с которым специфично связывается GAL4 ДНК-связывающий домен, клонированные впереди .Elb ТАТ.А-злемента; рШ1/12Н19ТКСАТ содеряит 8 копий олигонуклеотида 11/12, клонированных впереди промотора три-мидинкиназы вируса Герпеса, который содеряит 2 сайда для Spl и 1 для CTF ( Jones et.al.,1985 ). Мы наблодаеи, что С-кон-иевые регионы РАХ8 проявляют различные свойства как трансактиваторы при активации этих двух промоторов. Хотя формы b в обоих случаях являются сильными активаторами, а форма с - слабым, Td ае самое нельзя сказать о формах а и d. Сравнение способностей трех изоформ. РЙХВ или их С-концевых районов, соединенных с 6ЙЬ4-ДНК-с1?язувчим доменом, активировать базальные ТК или ElbTATfl-проаоторы выявляет различия меяду изоформами и показывает, что траисактивируащий потенциал РАХ8 зависит от контекста промотора (табл.1 й 2). Для более полного изучения зависимости трансактивирувщего потенциала РАХ8 от контекста промоторной области били созданы и

испытаны в трансфекциях делеционные формы ТК-проыотора. Б присутствии РЙХ8Ь существенно активировался только ТК про-иотор; в присутствии только ТАТА-элемента или ТАТА+5р1-сай-та он не обладал такой способностьп. Химерный Фактор БАЬ4/

РАХВЬ значительно активировал только Е1ЬТАТА-элоыент.'

Использование естественных^промоторов в отличие от искусственных позволяет исследовать свойства транскрипционная факторов в естественном контексте. При контрасфекции РАХ8 с конструкциями, содерващими проноторпые районы четырех генов тиропероксидазы.тироглобулнна, увоморулина и актина, значительно активировался только проыотор увоморулина. Те промо-

Табл.1. Активация РАХ8-специфичных репортеров раН11/12ц1Э ТКСАТ и рШ1/12п19Е1ЬСАТ при контрасфекции с экспрессионныыи векторами, содерващиии кДНК РАХ8а, Ь и с под контролем БИО проиотора в клеточной линии ТК 143В. Средние значения степени индукции репортеров вычеслены на основании 5 независимых эксперементов, выполненных по одинаковой схеме.

кДНК промоторы

ТК Е1Ь

РДХ8а 27,4 +5.1 2,2 + 1.0

рвхаь ■■13.0 + 4,5 1,0 + 0.4

РйХВс 4,3 + 2,6 1,0 + 0,0

Табл.2. Активация (Ж4-спецмфич1шх репортеров 5хЯА5 ТКСАТ и 5х11АХ Е1ЬСАТ при котрансфекции с зкспрессиошшчи векторами, содеряащими химерные кДНК БЛЫ/РАХВа, Ь и с под контролем 5440 промотора в клеточной линии ТК 143В. Средние значения степени индукции репортеров вычеслены на основании 5 независимых экспере-ментов, выполненных по одинаковой схеме.

кДНК промоторы

ТК Е1Ь

СА1.4/РАХва 1,0 + 0,6 4,6 + 3,2

ЕА1.4/РЛХ8Ь . 15,6 + 5,8 60,1 + 15,4

Ш.4/РАХ8с 3.3 + 2,2 5,4 2,4

СЛС4 4,2 + 1,5 20,9 + 11.0

тор активировался слабо, причем в случае Тд-промотора обна-пуяивалась разница в трансактивирущей способности мегду гремя формами, сходная с . РАХ8-специфичннм репортером. Ба-дальиая активность ГРО-промотора во всех изученных случаях репрессировалась в присутствии > РАХ8, что противоречит предыдущим данным ( 2апп1гп е1.а1,, 1992-).

Для изучения роли протеинкиназы Й (РКА) в опосредованных РАХ8 процессах генспецифичной активации транскрипции была использована дефицитная по протвинкиназе А клеточная линия А128, происходящая кз клеточной линии РС12. Ранее было показано, что РБУ и 5040 промоторы не активируются в присутствии РКА. Поэтому для контрасфекций с РКА были использованы кДНК под контролем Бй40 или пройогоров. Химерные факторы 6АЬ4/РАХ8 обладали трансактивируищими способностями только в присутствии РКА, при зтом форма Ь па трансактивирунщему потенциалу значительно лревыаала форма а,

с и е. В отличие от 5xUftS ElbCAT, репортер paHI l/12ril9TKCAT при котрансфекции с РКА активировался в A12G; однако при котрансфекции репортера рлН11/12п19ТКСйТ с РКА и РАХВа его активация была значительно сильнее.

Влияние РКА на активность РАХВ было сравнено с влиянием двух протоонкогенов: RAF-1 и retT. Raf-1-серин/треонин ки-наза, передатчик в Ras-пути преобразования экстрацеллиляр-ных сигналов, после активации мигрирует в ядро и активирует ядерные транскрипционные факторы, или ихнегативные регуляторы ( Bruder et.al., 19Э2 ). RetT является трансмембранным белком, экстрацеллилярные домены которого связывают лиганды, а интрацеллюлярные являются тиразин-киназами (van Heyningen, 1994 ). Данные показывают, что РАХ8 активируется в присутствии retT, но не Raf-i. Эти данные могут указывать на то, что РАХВ является нинелевацим звеном для retT-пути.

ВЫВОДЫ

1. Клонированы и охарактеризованы 12 кДНК-клонов гена транскрипционного фактора РАХВ. Определены кодирующий район кДНК.ро1уА-сигнал,кодоны инициации ( ATG ) и остановки ( STOP ) трансляции, а также район,подвергающийся дифференциальному сплайсингу.

2. Показано существование 5- сплайс-вариантов гена РАХВ, На основании клонирования геномных последовательностей показан механизм их образования. Форма b отличается от формы а отсутствием зкзона 9; у форм с, d и е в результате дифференциального сплайсинга происходит сдвиг рамки считывания, в результате чего образуется новый С-концевой регион по сравнении с формами а и Ь.

3. Клонирован предполагаемый" проиоторный регион гена РАХ8, .

4. С помощьв методов RNAse-протекции и RT-Nestcd PCR показано существование 5 изоформ гена РАХ8 In vivo.

5. Создана й испытана в трансактивирующих экпериментах система репортеров и зкспрессионных векторов, позволяющая тестировать продукты гена РАХ8.

6. На основании экспериментов по трансактивации искусственных репортеров определена локализация домена гена РАХВ, ответственного за активации транскрипции, который кодируется экзонами 10-12 .

- 15 -

7. Определена локализация предполагаемого репессора протеинового продцкта РАХ8, который кодируется зкзоноа 9 этого гена. , .

8. Показаны: функциональные различия ме!Ду нзофориаыи гена РАХ8, Формы РАХ8а; b и е обладают' максимальным траысак-тивирусщим потециалои.

3. Показано, что трансактивирукщие способности С-конце-вого региона гена PflXfl зависят от ДНК-связывас^его доне-иа и контекста активируемого репортера.

10; Определены два предполагаемых регулятора РЙХ8-про-дуктов, контрасфекция с которыми повышает трансактивирушщуш способность РАХ8.

СПИСОК ОПУБЛИКОВЙННЙХ РАБРТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Plachov.D,, Fickenscher.H,, Poleev.A, Three isoforns created by alternative splicing of the PAX8 gene can act as transcription activators. House nolecular genetics, 1992, Cold Spring Harbor, Neil York,p.163,

2.Poleev.A., Fickenscher. H.MundloS,S., Hinterpacht.A., Zabel.B., Fildlef,A., Sruss.P., Plachov.D. PAX8,a hunan paired box gene: isolation and expression in developing thyroid, kidney and Hilas'tunors. Developaent, 1992, 116, 611-623,

3.Tavassoli,K., Poleev.A., Zannini.S., Feliciello.A., Husti,A,H.,Plachov,D. functiotional analysis of the hunan РЛХ2 and Paxf? transcription factors. In: First EHBL aeeting on transcription, 2P August-1 September 1994, EHBL, Heidelberg, p.103, .

4.А.Полеев, Иария Стелла Занини, Д.Плахов, Три изофориы транскрипционного фактора РАХ8 показывают различные Функциональные свойства. Материала Международного Симпозиума

" Молекулярная генетика и биотехнология ff оценке и изменении Геномов сельскохозяйственных животных ", Санкт- Петербург-Пушкин 994, 81-82,

?ТП.Т1Ш.ВЙ?^Зак.425.Ткр.1Ю. 28.11.24.