Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ района SF12-10A7 у хромосомы Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ района SF12-10A7 у хромосомы Drosophila melanogaster"

российская академия наук

' " ^ СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ; ■•) гр]| . Институт цитологии и генетики

и

На правах рукописи

УДК 575.1:595.773.4

КОЗЛОВА ТАТЬЯНА ЮРЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ РАЙОНА 9К12-10А7 X ХРОМОСОМЫ ПЛОЗОРШЬА НЕЬАИООАВТЕК.

Генетика - оэ.оо.15

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1994

N

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

И.Ф.Жимулев

Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

B.Н.Стегний

НИИ биологии и биофизики Томского государственного университета, г.Томск

кандидат биологических наук

C.С. Богачев

Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт биологии развития

им.Н.К.Кольцова РАН, г.Москва

Защита состоится " 1994 г. на

заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.П.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск-90, проспект • академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферет разослан "

Ученый секретарь >

специализированного совета __—•'--——'

доктор биологических наук ' ! //- А.Д.Груздев

Актуальность проблемы. Вопрос об организации эукариотического генома, количестве генов' в геномах высших организмов и аспектах их регуляции- является фундаментальной проблемой биологии. Тесно связанным с данной проблемой является вопрос о структурно-функциональной организации интерфазных хромосом. Drosophila meianogaster в настоящее- время представляет собой модельную систему, наиболее полно изученную цитологически и генетически, но, несмотря на огромное количество данных, вопросы организации и функционирования генома дрозофилы остаются решенными не до конца. Детальный анализ сравнительно небольших участков генома Drosophila meianogaster, используя комбинацию различных подходов, представляется наиболее информативным для разрешения данной проблемы. Цель и задачи исследования. Целью данной работы является молекулярно-генетический анализ района 9F12-10A7 и характеризация последовательностей индивидуального хромомера - диска ЮА1-2, расположенного в данном районе. Исходя из этого конкретные задачи данного исследования состоят в следующем:

1. Молекулярное клонирование района 9F12-10A7, включенного в делецию Did )v13, методом хромосомной "ходьбы"

2. Локализация точек разрыва хромосомных перестроек в районе на физической карте

3. Локализация инсерций Р-элементов в районе 9F12-10A7 на физической карте.

4. Анализ транскрипционной активности последовательностей диска ЮА1-2 на разных стадиях развития дрозофилы и в разных тканях

5. Более подробная характеризация транскрипционно активных участков, соответствующих "молчащей" ДНК в диске ЮА1-2.

Научная новизна. Молекулярно-генетически проанализирован участок политенной хромосомы, детально изученный ранее цитологически и генетически. Были сопоставлены цитологическая', генетическая и молекулярная карты в районе 10А1-2-10А7. Показано, что "молчащая" ДНК в диске 10А1-2 содержит участки, транскрипционно активные на разных стадиях развития дрозофилы и в нескольлих тканях. Установлено, что ДНК в составе диска 10А1-2 является транскрипционно

неактивной в клетках слюнных желез. Выявлен и охарактеризован новый локус в диске 10А1-2, не обнаруженный при цитогенетическом анализе. На основании проведенных экспериментов предсказано наличие до 20 функционально неродственных единиц (генов) в составе диска ЮА1-2. Получены и частично охарактеризованы кДНКовые клоны, соостветствушие определенным ранее генетическим локусам 1(1)ВР5 и 1(1)ВР8. •Практическая ценность. Полученные в работе результаты имеют теоретическое значение для дальнейшего анализа структурно-функциональной организации интерфазных хромосом и эукариотического генома.

Апробация работы Материалы диссертационной работы были представлены на VI Всесоюзном совещании по структуре и функции хромосом (Пушино,' 1988); 6-ом (Одесса, 1989) совещании по генетике дрозофилы; VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, / 1990); 9-ом Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Гродно, 1990).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в четырех научных публикациях.

Структура и обЪем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, разделенных на параграфы, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Общий объем работы 158 страниц, 2 таблицы и 21 .рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Линии мух. Использованные линии описаны у Линдсли и Цимм (Ыпс1а1еу *& г1гаш, 1992), а также в статьях Жимулева с соавторами (аштЦеу е1; а1, 1981; 1987).

Геномные библиотеки и клоны. В работе были использованы библиотеки, приготовленные из: 1 .Геномной ДНК линии Сап-Ьст-в (Мап1а1;1е е1; а1, 1978) (фаговая серия М); 2.геномной ДНК линии Оге^п-Е, клонированной в фаговый, вектор ЕМВЬ4 (предоставлена проф. Ф.Кафатосом) (фаговая ^ серия К); 3.геномной ДНК линии йр, с1, сп, ъ<н, клонированной в фаговый вектор БАБНИ (предоставлена проф. В.Гелбартом) (фаговая серия Т). Геномные клоны 1А, зв, 40, 11Н, бР, 51>, 2Е из проксимальной части клонированного интервала были получены из лаборатории проф. С.Бензера (Вапегдее еЬ а1, 1987).

Молекулярное клонирование. Началом для ■ молекулярного клонирования района из нескольких точек одновременно послужили избранные микроклоны, локализованные в пределах диска ЮА1-2 ранее (Кокоза и. др., 1990). Геномная "ходьба" велась с избранных микроклонов в обоих направлениях до получения пересекающихся геномных клонов как описано у Бендера (Bender et al, 1983).

Картирование хромосомных перестроек методом гибридизации in situ.Приготовление давленных препаратов политенных хромосом и гибридизация in situ были выполнены согласно стандартной методике (Gall and Pardue, 1971).

Выделение геномной ДНК из мух.Геномная ДНК из мух была

выделена как описано у Бендера (Bender et al, 1983).

Выделение поли (А)+ РНК и Нозерн-блот анализ. Суммарная РНК

из организмов была выделена путем гомогенизации тканей в

сухом льду в пробирке Eppendorf 'с добавлением раствора тм

Трисолв (Trisolv , Biotex Laboratories, Inc.), содержащего-гуанидинтиоцианат. Поли (А)+ РНК из различных стадий развития была выделена, используя Poly(A)Tract mKNA Isolation System (Promega). согласно прилагаемому руководству.

Гель-электрофорез в горизонтальном агарозном геле, содержащем формальдегид, и перенос поли (А)+ РНК на нейлоновую мембрану был произведен как в руководстве Маниатиса (Maniatis et al., 1982).

Саузерн-блот гибридизация с меченой поли (А)+ РНК. Первая цепь кДНК была синтезирована с помощью M-MLV обратной транскриптазы (Gibco BRL) в присутствии меченого 32р дЦТФ в течение 1 часа при 37°С. Реакционная смесь была обработана 10 единицами РНКазы, свободной от ДНКазы, в течение 5 минут при комнатной температуре. Типичная реакционная смесь содержала: 0.1-0.5 мкг поли(А)+ РНК, 0.5 мкг олигоит)15, 50 тМ Трис-HCl, pH 8.3, 7.5 mMKCl, 1 mM каждый ИЗ дНТФ, 3 тМ MgCi2,100 тМ~ дитиотрейтол,- 100 единиц M-MLV обратной транскриптазы. Рестрикция. ДНК рекомбинантных клонов и электрофорез, в агарозном геле выполнен как в руководстве (Maniatis et al, 1982).

Секвенирование кДНКовых клонов. Фрагменты из фаговых кДНКовых клонов были субклониро'ваны в плазмидный вектор pTZi8R.

Секвенирование было выполнено по методу Сэнгера (Sanger et al, 1977). используя стандартные и синтезированные праймеры. Реакции были проведены, используя реактивы из стандартного набора для секвенирования (United States Biochemical) и продукты реакций разделены в 65S полиакриламидном геле, содержащем мочевину в буфере х1 тве. Для анализа последовательностей использовали компьютерные программы Strider и BLAST (Basic local alignment search tool).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика экспериментальной модели

Одним из немногих детально изученных генетическими и цитологическими методами районов политенных хромосом является район 9F12-10A7 X хромосомы D.melanogaster. Цитогенетические данные по организации данного района были получены в работах Лефевра (befevre, 1971; 1981), Гиера (Geer et al, 1983),. а также в многочисленных экспериментах, проведенных в лаборатории молекулярной цитогенетики Института цитологии и генетики СО РАН (Zhimulev et al, 1981 a,b; Zhimulev et al, 1987). Значительное число хромосомных перестроек с точкой разрыва в районе 9Е-ЮА были картированы на уровне световдй и электронной микроскопии, была построена цитологическая карта района (Zhimulev et al, 1981а). Район 9Е-10А был проанализирован, используя различные типы '• мутагенеза (Zhimulev et al, 19S1b; Похолкова, 1983? Zhimulev et al, *l987s Похолкова и Соловьева, 1989) с целью выявления полного спектра мутаций в районе. В результате комплементационного анализа и рекомбинационного картирования мутаций сделан вывод, что в данном районе находятся 12 генетических локусов, причём 7 из них являются существенными для жизнеспособности мух, т.к. в них были обнаружены летальные мутации. 5 локусов в данном районе не влияют на жизнеспособность мух.

Один из самых крупных дисков политенных хромосом дрозофилы - диск ЮА1-2, находится в пределах изученного интервала. Сложная генетическая структура диска ЮА1-2 была выявлена в результате рекомбинационного и делеционного картирования. Последовательности, составляющие диск ЮА1-2 не являются функционально однородными, включают по крайней мере 2 зоны "молчащей" ДНК; последовательности, несущественные для

выживания мух; локус 1(1)ВР4, влияпций на жизнеспособность мух и гены v и sev, определяющие морфологические признаки (Жимулев, 1982). По генетичеким оценкам до 90« ДНК, диска (Похолкова, 1983) приходится на долю "молчащей" ДНК, о роли которой в геноме дрозофилы можно только предполагать.

Молекулярное клонирование диска ЮА1-2

Основой для клонирования последовательностей в районе ЮА послужила библиотека микроклонов, полученная в результате микродиссекции ДНК диска ЮА1-2. Библиотека микроклонов была получена от д-ра В.Пирротта. На первом этапе около 30 микроклонов были картированы в пределах диска 10А1-2 с помощью хромосомных перестроек методом, in situ гибридизации. (Кокоза и др., 1990). Избранные микроклоны (1/7, 1/9, 4/3. 1/20, 4/2, 1/32) послужили начальными точками для полного клонирования последовательностей диска ЮА1-2. Хромосомная "ходьба" велась в обоих направлениях от каждого избранного микроклона до получения перекрывающихся геномных клонов. Рестриктная карта и положение клонов в пределах "ходьбы" показаны на Рис.1. Таким образом, суммарно были клонированы 300 т.п.н. из района 9F12-10A7, содержащего 7 дисков политенных хромосом.

Локализация точек разрыва хромосомных перестроек.

В данной работе быж использованы более 25 делеций, несколько транслокаций и одна инверсия. Методом картирования точек разрыва хромосомных перестроек была гибридизация in situ с политенными хромосомами. Давленные препараты политенных хромосом были приготовлены из слюнных желез личинок III возраста. Личинки, гетерозиготные в отношении данной хромосомной перестройки и балансерной хромосомы FM6 (самки) или самцы с дупликацией района ЮА на Y хромосому (Dp y+Yv+) были использованы для приготовления давленных препаратов. Целые геномные клоны, включая векторные последовательности, были использованы как пробы для гибридизации ■ in situ с политенными хромосомами, несущими перестройки. Использование нескольких пересекашихся клонов для картирования одной и той же хромосомной перестройки значительно увеличивает точность картирования. Соотношение зерен серебра в хромосоме с перестройкой и балансерной

хромосоме было использовано для определения части клона, удаленного перестройкой. Результаты картирования суммированы на Рис.1.

Гибридизация in situ с политенными хромосомами была выбрана нами для картирования хромосомных перестроек, так как эта методика дает дополнительную информацию о характере последовательностей в соответствующих геномных клонах. В наших экспериментах .("строгие" условия гибридизации и отмывки) основным сайтом локализации геномных клонов был район ЮА. Большинство последовательностей в клонированном участке,, действительно, представляют собой уникальную ДНК.

Локализация инсерционных мутаций в районе

Для того, чтобы уточнить положение генов в .клонированном интервале мы локализовали встройки Р-элементов в известные генетические локусы в районе 9F12-10A7. Было проведено картирование инсерций Р-элементов в гены 1(.1)ВР5 (аллели S10, S15, S21, S37, S38),1(1)BP8 (аллели S1, S4, S17, S36) и для гена 1(1)ВР7 (аллель D41). Методом картирования была Саузерн-блот гибридизация: геномная ДНК из линий соответствующего генотипа была обработана эндонуклеазами рестрикции и разделена в агарозном геле. Зондом для гибридизации служили клонированные последовательности из района ЮА1-2-ЮА7. Было установлено, что встройка всех проанализированных Р-элементных инсерций в ген 1(1)ВР5 происходит в пределах одного рестриктного фрагмента Xhol 4.5 т.п.н. геномного клона 5D. Исходя из полученных нами данных, все встройки Р-злементов (кроме, возможно, S26 и S38) являются независимыми событиями.

-'- Для аллелей гена 1(1 )ВР8 встройка Р-элемента в линиях S1, S4. S17 и S36 происходит во фрагмент Xhol 10.0 т.п.н. (позиция 277-287 на рестриктной карте)(Рис.1). Т.к. нам не удалось определить изменения картины рестрикции для данных линий (S1, S4, S36) при гибридизации с крайним правым рестриктным фрагментом клона 5D (Miol - Sali 6.5 т.п.н.), то, вероятно, встройка происходит в пределах 2-3 т.п.н. слева от сайта рестрикции Xhol в позиции 287 в геномном клоне 2Е. Единственная' инсерция Р-элемента в гене 1(1)ВР7 была картирована в фрагменте Xhol 1.5 т.п.н. клона 2Е.

г? т

L3t=

K3.18.2-

мвс

Hff M KT yp " J ИТТТ iw

юо

ST

ab

M203-M5I

СПВ149 K178 . t=3-РЮ.Р22

L2C

LID—

4P i у F

1 Tl " 1

K175

IK1 '

* T Г8? ни

30

lio

I00

1b

I/9-

P22

SHH E E ESE ES S.B S

i£o

Ж

i6o

J__L

K9

203dO-

Tfo~

Iw^o

3L2

В ES EBESESE

-

ESESE

JOL

E S В HBSEB HHEEE E S EXEES ........'III'_I_1_I_l_l_L_1

MO

2iO

Ж

220

,cED3.l

1A-PIC

—I-|КЛГ)а CDwmhr500

2»

2fe0

¿Jll .

aiv2ig

S * * E EX

III III

3I7CC8

2S0

270

290 L3

ЗОО

-11H —dpi

-C3L7

Рис.1.,Карта клонированной геномной ДНК из района 9F12-10A6-7. Расстояния даны в т.п.н., сайты рестрикции показаны буквами: Е - EcoRI, S - Sali, В - BamHI, Н -Hindi II, X - Xhol. Рекомбинантные геномные клоны изображены под соответствующим участком рестриктной карты. -Стрелки указывают направление делеций, погрешность картирования точек разрыва хромосомных перестроек обозначена незачерненными прямоугольниками. Короткие клоны ~ С1/9) представляют собой микроклоны.

К 4.8.1

2Е

Определение мест встроек Р-элементов на физической карте района дает возможность изолировать кДНКовые клоны для соответствующих генов. Мы использовали геномные фрагменты, в которые происходит встройка Р-элементов для групп комплементации 1(1)ВР5 и 1(1)ВР8 в качестве проб для скрининга кДНКовой библиотеки. Анализ ю5 индивидуальных колоний из библиотеки, приготовленной из РНК из яичников взрослых самок, позволил нам выделить 4 кДНКовых клона для гена 1 (1 )ВР5 и один для гена 1(1 )ВР8. Рестриктный анализ данных клонов показ м, .что размер вставок в клонах, соответствующих гену 1(1)ВР5, составляет от 2 до 3 т.п.н., а для 1(1)ВР8 - 2.5 т.п.н.

Определение транскрипционно-активных участков ДНК з пределах диска ЮА1-2

/Молекулярное клонирование последовательностей, лежащих в диске ЮА1-2, описанное в предыдущих разделах, позволило нам начать анализ последовательностей, входящих в состав' индивидуального хромомера. Особенно нас интересовал вопрос о транскрипционной активности "молчащей" ДНК в диске. Методом определения транскрипционной активности последовательностей в диске ЮА1-2 была выбрана гибридизация клонированной ДНК с меченой кДНК, комплементарной различной РНК. РНК с нескольких стадий эмбриогенеза: 0-4 часа; 4-8 часов; 1-16 часов, а также из личинок III возраста была использована в этих экспериментах. Для обнаружения "тканеспецифических транскриптов мы проанализировали 3 различные ткани из личинок III возраста: слюнные железы, имагинальные диски и жировые тела.

17 перекрывающихся геномных клонов, лежащих в пределах диска ЮА1-2, начиная с клона К179, расположенного в дистальной части диска и до клона 4G в. проксимальной части диска, были .использованы в данных экспериментах. Суммарно данные клоны содержат около 200 т.п.н. ДНК из диска ЮА1-2.

Для каждой исследованной стадии развития и в отдельных тканях характерный набор рестриктных фрагментов геномных клонов гибридизуется с меченой кДНК. Были обнаружены 3 отдельных области гибридизации с кДНК из 0-4 часовых эмбрионов. На стадии 4-8 часов эмбриогенеза по крайней мере

12 участков в лиске ЮА1-2 являются транскрилционно активными. Результаты картирования транскрипционно активных зон в диске 10А1-2 с различными РНК суммированы на Рис.2.

Интенсивность гибридизации меченой кДНК с рестриктными фрагментами геномных клонов неодинакова, что косвенно свидетельствует о том, что они содержат разные транскрипционные единицы. Наиболее активно экспрессирущиеся последовательности расположены в дистальной части диска ЮА1-2 (геномные клоны к179, к172) и в средней части диска (клоны М193. к191). Интенсивность гибридизации разных рестриктных фрагментов с одним типом РНК различается приблизительно в 10-20 раз, некоторые фрагменты дают очень слабый гибридизационный сигнал. Возможно, что соответствующие транскрипционные единицы экспрессируются в течение небольшого отрезка времени или в небольшом количестве клеток в организме. Наибольшее число участков, гомологичных РНК, было обнаружено при гибридизации геномного блота с РНК из-эмбрионов 1-1 б часов развития. По крайней мере 16 различных участков в диске ЮА1-2 проявляют транскрипционную активность на данном отрезке эмбриогенеза. Очевидно, что экспрессия отдельных транскрипционных единиц в диске варьирует в зависимости от стадии развития организма. Так, для транскрипционной единицы, расположенной в координатах 72-75 клона к179; 80-90 клонов к179-к172: и 95-97 клона к172 максимум экспрессии приходится на период 4-8 часов эмбриогенеза. На других стадиях экспрессия данных транскрипционных единиц происходит либо на низком уровне, либо отсутствует. Появление дополнительных рестриктных фрагментов при гибридизации с РНК из периода 1-16 часов эмбриогенеза по сравнению с результатами гибридизации с РНК 0-4 и 4-8 •часов эмбриогенеза свидетельствует об активации дополнительных транскрипционных единиц в диске 10А1-2 после 8 часов эмбриогенеза.

10 транскрипционно активных участков в диске ЮА1-2 были обнаружены при анализе РНК из личинок III возраста. Сравнение результатов гибридизации с РНК из отдельных личиночных тканей, в частности, из имагинальных дисков и жировых тел свидетельствует о том, что некоторые транскрипционные единицы

Рис.2 Транскрипционно активнее участки в диске ЮА1-2 показаш прямоугольниками. FB - жировые тела; ЫИ - личинка III возраста; 0-4, 4-8, 1-16 -эмбрионы. Высота прямоугольников отражает интенсивность гибридизации.

активны в различных тканях. В то же время, мы обнаружили, что часть транскриптов, определенных в целой личинке, не экспрессируется в той или иной изолированной ткани. Например для РНК из жировых тел были обнаружены з транскрипционно активных участка, не описанных для других изученных типов РНК. Один из них (координаты 90-95) может соответствовать гену vermilion.

Сигналы, превышающие фоновую гибридизацию, не были обнаружены при гибридизации с меченой кДНК из слюнных желез личинок ill возраста, несмотря на длительные экспозиции и присутствие гибридизационного сигнала в положительном контроле. Таким образом, последовательности диска 10А1-2, по-видимому, не являются транскрипционно активными в клетках слюнных келез. Однако, чувствительность использованного метода не является достаточной для определения транскриптов, экспрессирукщихся на . невысоком уровне. Было оценено, что транскрипты, составляющие менее 0.01$ поли(А)+ РНК, не могут быть определены в подобных экспериментах (Hall et al, 1983). Клонирование и характеристика нового гена в диске 10A1-2

В предыдущих экспериментах было показано, что один из микроклонов (1/9), локализованный в пределах диска 10А1-2, дает интенсивный положительный сигнал при гибридизации с меченой поли(А)+ РНК из личинок III возраста (Кокоза и др. 1990). Мы использовали вставку из данного микроклона для скрининга геномной библиотеки и изолировали геномный клон к191. Также вставка из микроклона 1/9 послужила в качестве зонда для скрининга кДНКовых библиотек из ранней предкуколки (Poole et al, 1985). Анализ 10s независимых рёкомбинантов позволил нам выделить 3 кДНКовых клона. Один из них - с901 содержал вставку размером 1.3 т.п.н. и был выбран для дальнейшего анализа. Была определена первичная последовательность вставки из кДНКового клона С901. Длина' секвенированного фрагмента составляет 1276 т.п.н., поли(А)+ последовательность отсутствует в данном фрагменте. Компьютерный анализ последовательности показал присутствие длинной открытой рамки считывания, содержащей несколько кодонов AbG, кодирующих метионин. Отсутствие поли(А)+ последовательности в секвенированном фрагменте, и то, что

открытая рамка считывания продолжается в N и с направлении' гипотетического белкового продукта, может свидетельствовать о том, что изолированный нами кДНКовый клон является неполным.

Гипотетический продукт трансляции длинной рамки считывания показывает хорошую гомологию с белковыми продуктами, кодируемыми генами Delta и Serrate у D.melanogaster. Отличительной , особенностью , данных полипептидов является присутствие нескольких повторенных единиц длиной 30-40 аминокислотных остатков, имеющих гомологию с эпидермальным ростовым фактором (EGF) млекопитающих. Каждая из повторенных единиц характеризуется присутствием 6 инвариантных остатков цистеина на определенном расстоянии между ними. 8 повторенных единиц, гомологичных эпидермальному ростовому фактору (EGF), расположены в центральной части полипептида, кодируемого клоном с901. (Рис.з). Один неполный повтор находится ближе к ы • концу полипептида и 7 полных повторов следуют за ним.

Мы проанализировали экспрессию последовательностей кДНКового клона с901 в эмбриогенезе дрозофилы. Поли(А)+ РНК из ьйбрионов на нескольких стадиях развития (0-4; 4-8; 1-16; 15-19; 19-23 часов эмбриогенеза) была разделена в агарозном геле и перенесена на нейлоновую мембрану. .Зондом для гибридизации служила ДНК вставки из клона с901. Единственный транскрипт размером около 2.4 т.н. был обнаружен при гибридизации с РНК, приготовленной из 1-16 часовых эмбрионов. Отсутствие данного транскрипта на более ранних стадиях (0-4 и 4-8 часов эмбриогенеза) свидетельствует о том, что транскрипция соответствующего гена начинается после 8 часов эмбриогенеза. Таким образом, мы заключаем, что последовательности клона с901 соответствуют гену в диске ЮА1-2, транскрипционно активному между 8 и 16 часами в-эмбриогенезе дрозофилы.

Рис.З Первичная последовательность вставки из клона с901 и гипдтетический белковый продукт. Полные EGF-подобные повторы подчеркнуты. Неполный повтор подчеркнут штриховой линией. Последовательность сигнального пептида обведена.

1/1 31/11

CTC CCA AAG CGA ICG CAG ACC GAG ACG GAC CGA CGA CAA CAA GCT GCA GTC TTA ACC GTT val pro lys arg ser gin thr glu thr asp arg arg gin glu ala ala val leu thr val

61/21 ______91/31____________

AAA AAT lATGj TTG TCA GAC AAA AAGÍGCC GCT CTC CTG CTG GTG ACC GCG ATT ACC GCC CT¿ lys asn |met| leu 1er asp lys lysjala ala leu leu leu val thr ala lie thr ala lej

121/41 _151/5Г

AAA TTG SAG ЗАД lys leu glu glu

; AAT GCC TAT AGA CGC AAC TTC GAT GCG CGC CAA ACT AGT AAT TCG iasn ala tyr arg arg asn phe asp ala arg gin ser ser asn ser 181/61 211/71

AAT ATT CCA CTC TGG AAA CAG CGA GCC IGT GAG AAA TCA CAG AAA CAG CGG CAA AAT GCA asn lie pro leu trp lys gin arg ala cys glu lys ser gin lys gin arg gin asn ala 241/81 271/91

CAC TAT GTT TGC GAT GAA AAA GGT GAC TTC ACG TGC CTT CCT GGG TGG CAG GGT GAT CTT his tyr val cys asp glu lys gly asp phe thr cys leu pro gly trp gin giy_as£_leu 301/101 331/111 ■ ~

TGC CAG GTG CCT ATG TGT CGA AGG CGC TGT GAC CCG ATG AAT GGT TAT TGC CAG CGA CCC çys^gln_val pro met Jcvs arg arg gl" cys asp pro met asn glv tvr cvs oln arg pro 361/121 . 391/131

GGT GAA TGC AGG TGT CGC АТС GGA TAC.AGC GGC GAA CTC TGC GAC AAG TGC ATT CCG CTT gly glu cys arg cys arg lie gly tyr ser gly glu leu cys asp lys )cys lie pro leu 421/141 451/151

CCQ CTT CCA GGT TGC CAA CAT GGC GGA TGC ACC AAG CCA TTC GAG TGC АТС TGT AAG CCT pro leu pro gly cys gin his gly gly cys thr •lys pro phe glu cys lie cys lys pro 481/161 . 511/171

GGC TGG GCG GGA CTC TTC TGC ACG GAA CCA AGT TGC CGT ACC CGA TGC CAC AGC ACC CGT gly trp ala gly leu phe cys thr glu pro ser leys arg thr gly cys his ser thr arg 541/181 571/191

GGA TAT TGC GAA GCG CCT CGG GAG TGC CGC TGC CGG ATT GGT TAT GCT GGA CGC ACC TGC gly tyr cys glu ala pro gly glu cys arg cys arg lie gly tvr ala gly arg thr cvs 601/201 I 631/211

TCC GAA TGC GCC ACG ATG CCG GGC TGT CAG CAC GCC ACC TGC AAC AAG CCA CTG CAA TGC

661/221 691/231

CTC TGC СТА CCC GGA TAT ACC GGA СТА CTT TGC CAG ACG CCA АТС TGT GAC CCA GAT TGC

leu cys leu pro gly tyr thr ?iy leu leu cys qln thr pro lie И» asp pro asp cys

721/241 751/251

AGC AAG CAG CAC GGA TAT TGC CGC AAA CCT CGC GAG TGC CGC TGC AAG GTG CGC TGG ACS

ser lys gin his gly tyr cys arg lys pro gly glu cys «9 cys lys val gly trp thr

781/261 811/271

GGT AGC CAG TGC GAC AAG TGC TTC GTA TCT CTG GGA TGT GCC AAT GGG GAT TGC GAG GCG

gly ser gin cys asp lys Icvs Ohe val ser leu glv cys ala asn 3lv asp cys glu ala

841/231 871/291

CCA TGG GAG TGC AAC TGC CAT CCC GGC TGG GGC GGA ATG CTG TGC GAC GAG AAG CTC ACC

pro trp glu cys asn cys his pro gly trp gly gly met leu cys aso glu lys leu thr

901/301 931/311

TAC TGC GTG GAG CAT CCG GAT ACG TGC GAA AAC GGG GGC AAG TGC ACA TCG CTG AGT CGC

tyr jsys val glu his pro asp thr cys glu asn gly gly lys cys thr ser leu ser arg

961/321 991/331

CGA GGA TGG AGC TAC CAG TGC CAG TGC CGG CAG GAA TTT CTG CGC AAG AAC TGC GAG ATA

arg glv tro ser tvr gin Cys qln cys arg gin glu phe leu gly lys asn CVS glu ile

1021/341 1051/351

CGC GAT GAC TTT CTG CTG ACC TCA GAG GCG CCA CCG CGA АТС ACA CCG CCC ACA CCC GCT

arg asp asp phe leu leu thr ser glu ala pro pro arg ile thr pro pro thr pro ala

1081/361 1111/371

GAG CTC GTA CTG GAA CT» GAT GGC GAA CTG CAC CAG AAC GGG CAG CAG GAC АТС GGT GCA

glu leu val 1141/381 leu glu leu asp gly glu leu asp gin asn 1171/391 gly qln gln asp ile gly ala

GGT GTG CCC GAT GAC AGС GAG CCA GGA GGC GGG CTG GTT GGG GAA AAG TTG CCG GCG GGT

gly val pro 1201/401 asp asp ser glu pro gly gly gly leu val 1231/411 gly glu lys leu pro ala gly

AAC GAC GCG GAG CGG CGG AAA AAT GAC ACG СТА GCA ACG TGG CAA CCG CAG GAA CTG GAG

asn asp ala glu arg arg lys asn asp thr val ala thr trp gln pro gln glu leu glu

Рис.3

i I

Гомология белкового продукта клона с901 с генами Delta и Serrate (Yassin et al, 1987; Fleming et al, 1990), один из которых (Delta) является "нейрогенным" локусом у D.melanogaater, а также экспрессия нового гена на сравнительно узком отрезке эмбриогенеза, когда происходит пик транскрипции генов Delta и Serrate, являются симптоматичными. Это позволяет нам предположить, что мы определили новый функциональный ген, продукт которого может участвовать в передаче сигнала между соседними клетками в процессе их дифференцировки в онтогенезе дрозофилы.

Диск ЮА1-2 - информационно "сложный" хромомер Если рассматривать все определенные нами транскрипционно активные участки как независимые, то в , диске ЮА1-2 присутствуют около 20 транскрипционных единиц, которые могут соответствовать дополнительным локусам, не выявленным генетически. В пределах так называемой левой "молчащей" зоны (координаты 60-90 на молекулярной карте), находящейся на дистальном краю диска, мы обнаружили 4 транскрипционно

активных участка. В генетических экспериментах было

*

установлено, что мухи с комбинацией двух делеций Dfd )vL1/Df (1 )vK,° являются полностью жизнеспособными и не имеют видимых морфологических нарушений (Zhiimlev et al, 1981Ъ). Таким образом, активно транскрибирующиеся последовательности в координатах 60-78 являются поистине несущественными для жизнеспособности мух.

Ген vermilion находится в дистальной части диска. Соответствущий транскрипт 1.4 т.н. (Walker- et al, 1986) картируется в координатах 90-94 на нашей рестриктной карте. Известно, что ген v экспрессируется в узком наборе тканей, одной из которых является жировое тело. Таким образом, вероятно, что -транскрипционно активный участок, описанный нами в координатах 90-95, при анализе РНК из жировых тел относится к данному гену. Согласно литературным данным (Searles & Voelker, 1986; Walker et al, 1986) .в следущем рестриктйом фрагменте, прилежащем проксимально к гену vermilion, обнаружен erne один транскрипт 2.0 т.н., неродстёенный локусу v. Данный транскрипт может соответствовать гену 1(1)ВР4.

4 транскрипта, лежащие в координатах 120-132 в центральной части диска, были обнаружены нами, размеры их составляют 2.0: 1.6: 1.3; 0.6 т.н. Еще один транскрипт 2.4 т.н. расположен в координатах 131-138 на рестршстной карте. Мы более подробно охарактеризовали данную транскрипционную единицу и показали, что она представляет собой новый локус, не выявленный в генетических экспериментах. Белковый' продукт соответствующего локуса неродственен полипептидам, кодируемым генами V и зеу.

. Согласно данным Банерджи (Вапег^ее е1; а1, 1987 ) 4 дополнительных транскрипта расположены в диске ЮА1-2 дистально по отношению к транскрипту гена зеуеп1езз на правом краю диска. Транскрипты 2.5; 1.0; 3.2; 0.7 т.н. лежат в координатах 210-240 на молекулярной карте. Несколько транскрипционно активных участков были обнаружены нами на этом отрезке ДНК. Вероятно по крайней мере некоторые транскрипты соотносятся с определенными нами транскрипционно активными фрагментами.

Таким образом, в пределах так называемой правой "молчащей" зоны находятся 12 различных транскрипционно активных участков и от 5 до 9 транскриптов. Мы не знаем какому количеству генетических локусов они соответствуют и, к сожалению, генетически невозможно проверить, являются' ли последовательности в центральной части диска ЮА1-2 существенными для жизнеспособности мух из-за отсутствия подходящих делеций.-

Таким образом,, можно предположить, что дйск 10А1-2 представляет собой естественный "сложный" хромомер, содержащий многие функционально неродственные локусы. Формирование таких хромомеров было продемонстрировано экспериментально при использовании некоторых хромосомных перестроек, удаляющих последовательности междисков (Керру & дае1Б11опз, 1980), и предсказано, что "естественные" варианты таких хромомеров существуют в политенных хромосомах. Наконец, согласно нашим экспериментам, последовательности диска 10А1-2 не обладают транскрипционной активностью в клетках слюнных желез. Данный результат в принципе поддерживает динамическую модель организации политенной хромосомы {г11зл1и1еу & Ве1уаеуа,

1975! Gersh, 1975) и согласуется с экспериментальными данными' о положении транскрипционно неактивных в слюнных железах генов в дисках политенных хромосом (Rykowski et al, 1988! Sprsa, 1988! Weeks et al, 1993).

ВЫВОДЫ

1. Проведен молекулярно-генетический анализ индивидуального хромомера политенных хромосом дрозофилы. Клонировано 170 т.п.н. ДНК, входящих в состав диска ЮА1-2. Прокартированы точки разрыва'20 хромосомных перестроек в районе ЮА1-7.

2. Установлено, что "молчащая" ДНК в диске ЮА1-2 является транскрипционно активной. 4 транскрипционно активных участка были обнаружены в левой "молчащей" зоне; 12 транскрипционно активных участков и от б до 9 транскриптов соответствуют правой "молчащей" зоне. Таким образом, диск 10А1-2 представляет собой "сложный" хромомер, содержащий значительное количество функционально неродственных локусов.

3. Новый локус, невыявленный в предыдущих генетических экспериментах,'обнаружен в центральной части диска ЮА1-2. Продукт данного гена гомологичен полипептидам, кодируемым генами Delta и Serrate у дрозофилы.

4. Показано, что последовательности диска ЮА1-2 экспрессируются в тканях личинок ш"возраста, но являются транскрипционно неактивными в клетках слюнных желез. Данный результат согласуется с моделью динамической организации политенной хромосомы, выдвинутой ранее.

5. В результате картирования инсерций Р-элементов в районе было уточнено положение генов 1(1)ВР5, 1(1)ВР8 и 1(1 )ВР7 на физической карте. Были получены кДНКовые клоны, соответствующие локусам 1{1)ВР5 и 1(1)ВР8.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кокоза Е.Б., Козлова Т.Ю., Умбетова Г.Х., Дубровский Э.Б., Пирротта В., Жимулев И.Ф. Молекулярный и цитогенетический анализ диска 10А1-2 D. melanogaster // Генетика. 1990. Т.26. Ы 8. С.1361-1369.

2. Kozlova T.Yu., Semeshin V.F., Tretyakova I.V. ,, Kokoza

Е.В., Pirrotta V., Grafodatkaya V.E., Belyaeva E.S., Zhimulev I.P. Molecular and cytogenetical characterization of 10A1-2 band and adjoining region in the D.melanogaster polytene X chromosome // Genetics. 1994. V.136. P.1063-1073.

3. Козлова Т.Ю,, Кокоза Е.Б., Дубровский Э.Б., Умбетова Г.Х. Молекулярно-генетический анализ индивидуального хромомера политенных хромосом Дрозофилы. // Тезисы докладов vil Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва, 1990. С.29-30.

4. Козлова Т.Ю., Дубровский Э.Б., Кокоза Е.Б. Клонирование и молекулярно-генетический анализ диска ЮА1-2 у Дрозофилы // Тезисы X Всесоюзного симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". Гродно, 1990. С.53.