Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюция систем регуляции транскрипции в геномах бактерий

ВАК РФ 03.01.09, Математическая биология, биоинформатика

Автореферат диссертации по теме "Эволюция систем регуляции транскрипции в геномах бактерий"

005553550

На правах рукописи

ЦОЙ ОЛЬГА ВЛАДИСЛАВОВНА

Эволюция систем регуляции трапскрипции в геномах бактерий

03.01.09 - математическая биология, биоинформатика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2014

2 3 ОКТ 2014

005553550

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в Учебно-научном центре „Биоинформатика" Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем передачи информации им. A.A. Харкевича Российской академии наук.

Научный руководитель - Гельфанд Михаил Сергеевич доктор биологических наук, кандидат физико-математических наук, профессор, заведующий Учебно-научным центром «Биоинформатика», заместитель директора ИППИ РАН по научным вопросам Официальные оппоненты:

Самсонова Мария Георгиевна

доктор биологических наук, профессор начальник отдела компьютерной биологии

Кафедра прикладной математики и Центр перспективных исследований Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет»

Кулаковский Иван Владимирович

кандидат физико-математических наук,

старший научный сотрудник лаборатории вычислительных методов системной биологии

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгелъгардга Российской академии наук

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Защита диссертации состоится»^' 201J^года в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д 002.077.04 прй Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте проблем передачи информации им. A.A. Харкевича Российской академии наук по адресу: 127994, г. Москва, ГСП-4, Большой Каретный переулок, д. 19, стр. 1.

С текстом автореферата и диссертации можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем передачи информации им. A.A. Харкевича Российской академии наук, а также на сайте ИППИ РАН по адресу www.iitp.nj

Автореферат разослан^ Р¡Си&С^иЛ 201 ^года Ученый секретарь диссертационного совета

/J) :

доктор биологических наук, профессор /'"*-■•' •4 ^ > Г.И. Рожкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение Актуальность темы исследования Многие системы в живых организмах образуют биологические сети. Примером такой сети является и система регуляции транскрипции. Самый нижний уровень этой сети составляют наборы взаимодействующих базовых элементов, состоящие из транскрипционного фактора, участка ДНК, с которым он связывается, и регулируемого гена. Объединяясь, на следующем уровне эти наборы образуют регуляторные блоки. Один или несколько регуляторных блоков образуют функциональный модуль, а несколько функциональных модулей составляют всю транскрипционную сеть. Растущее количество данных и экспериментальных методик позволяют изучать организмы в контексте целых сетей, модулей и блоков, а не отдельных функциональных систем. В настоящей работе мы анализировали эту систему на уровне блоков и наборов базовых элементов методами сравнительной геномики.

Методы сравнительной геномики позволяют реконструировать транскрипционную сеть в наборе родственных геномов. Поиск новых регуляторных элементов в бактериальных геномах является одним из наиболее сложных этапов ее изучения. В самом простом случае существуют экспериментальные данные хотя бы для одного генома, опираясь на которые становится возможным изучение других, родственных организмов. Но более частыми бывают ситуации, когда ни локализация, ни структура регуляторных элементов не известна.

Постановка и решение вопросов, связанных с транскрипционной сетью бактериальных генов, необходима для детальной функциональной аннотации генов; реконструкции метаболических путей - не только универсальных, но, в большей степени, таксон-специфичных; изучения роли этих путей в организме; а также исследования эволюции регуляторных систем и организмов в целом. Изучение принципов, лежащих в основе организации регуляторных сетей - неотъемлемая часть понимания молекулярных механизмов жизнедеятельности, в том числе, патогенных бактерий, биотехнологических штаммов, организмов, применяемых в системах биоочистки и.т.п.

Степень разработанности темы В настоящий момент изучению систем регуляции транскрипции посвящено много работ, но они ограничены изучением нескольких модельных организмов (например, Escherichia coli и Bacillus subtilis) или проведены только на уровне отдельных функциональных систем. В то же время в базе данных Genbank содержится несколько тысяч полных последовательностей бактериальных геномов разной степени родства, и еще больше находится в процессе определения последовательности или аннотации. Рост числа геномов делает изучение индивидуальных геномов слишком трудоемким, но, с другой стороны, такое количество информации позволяет реконструировать биологические системы (в том числе, транскрипционные сети) в немодельных организмах, и их изучение представляется интересным уже не просто в рамках отдельных организмов, а в ряду близко родственных геномов, что позволяет проследить за особенностями их эволюции. Для подобного анализа требуется применение компьютерных, а не экспериментальных, методов.

Цели и задачи исследования Целью настоящего исследования была реконструкция и анализ сетей транскрипционных регуляторных элементов в близкородственных геномах с помощью методов компьютерной биологии для немодельных организмов. В рамках поставленной цели решались следующие общие и частные задачи:

Предсказание регуляторных элементов транскрипционной сети de novo на примере пути утилизации этаноламина.

Изучение эволюции регуляторных блоков на примере блока треугольник.

Научная новизна

В настоящей работе были обобщены сведения о закономерностях эволюции транскрипционной регуляторной сети, а также проведено детальное исследование на материале обширной группы близкородственных геномов. Мы впервые показали, что различные регуляторные взаимодействия изменяются по-разному: как в зависимости от положения в транскрипционной сети, так и от свойств транскрипционного фактора.

С помощью методов сравнительной геномики мы обнаружили ранее неизвестные регуляторные элементы в пути утилизации этаноламина, а именно мотив участка связывания транскрипционного фактора АгаС-семейства EutR. Кроме того, нам удалось

показать регуляторную связь этого пути с метаболизмом кобаламина - кофактора основного фермента пути (этаноламин лиазы), а также описать эволюцию генов этого пути.

Теоретическая и практическая значимость На сегодняшний день доступно несколько тысяч полных бактериальных геномов, включая штаммы, и еще больше находится в процессе определения последовательности или функциональной аннотации. Но, несмотря на экспоненциально растущее количество геномов, экспериментальное изучение регуляторных сетей, вследствие его трудоемкости, ограничено несколькими модельными организмами либо отдельными функциональными системами. Таким образом, следствием большого количества данных является необходимость применения методов компьютерной биологии и статистики для их анализа, позволяющих описывать свойства немодельных организмов, основываясь на экспериментально полученных данных по родственным модельным организмам. Более того, применение сравнительно-геномных методов позволяет описывать регуляторные взаимодействия в таксономических группах, не содержащих хорошо изученных модельных организмов.

Методология и методы исследования Для решения поставленных задач использовались разные методы сравнительной геномики. Применялись методы поиска гомологов на основе критерия двустороннего лучшего сходства, поддержанного анализом филогенетических деревьев и анализом структуры оперона, методы анализа аминокислотных, нуклеотидных последовательностей, а также построения множественных выравниваний и филогенетических деревьев методом наилучших соседей с применением статистического размножения выборки. Для проверки статистической значимости использовался критерий X2 и гипергеометрический тест.

Положения, выносимые на защиту 1. Анализ таксономического распределения генов утилизации этаноламина показал, что существует два возможных пути катаболизма использования этаноламина, связанных с типом оперона. Первый, короткий, позволяет использовать этаноламин только в качестве источника азота. Второй, длинный, дает возможность использовать его и как источник азота, и как источник углерода.

2. Исследование эволюции генов утилизации этаноламина показало, что короткий оперон является предковым, из которого путем добавления новых генов образовался длинный тип. В ходе эволюции генов утилизации этаноламина произошло минимум три события горизонтального переноса.

3. В Enterobacteriales и Burkholderiales предсказан мотив участка связывания транскрипционного фактора EutR. В Enterobacteriales участки связывания EutR обнаружены в промоторной области семи оперонов, среди которых есть непосредственно гены утилизации этаноламина, а также гены синтеза кофактора основного фермента пути этаноламинлиазы - кобаламина. Это наблюдение устанавливает связь между путями утилизации этаноламина и синтезом кобаламина за счет EutR-зависимой регуляции. В Burkholderiales участки связывания EutR обнаружены только непосредственно в промоторной области генов утилизации этаноламина.

4. Локальная регуляция является эволюционно подвижной, что согласуется с необходимостью быстрой адаптации к условиям окружающей среды. В штаммах Escherichia coli взаимодействия типа Л—»■ ген (локальный транскрипционный фактор —»-ген) чаще сохраняются в регуляторных блоках, чем вне их. На уровне порядка Enterobacteriales эти взаимодействия консервативнее в парных взаимодействиях, по сравнению с регуляторными блоками, «по может бьггь результатом изменчивости транскрипционной сети.

5. Разные типы треугольников на уровне порядка Enterobacteriales эволюционируют по-разному. Регуляция как глобальными, так и локальными транскрипционными факторами в несогласованном треугольнике оказывается консервативнее, чем в согласованном.

Степень достоверности и апробация результатов По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в международных рецензируемых научных журналах. Результаты работы были представлены на международной конференции МССМВ'09, российских конференциях ИТИС'08, ИТИС'Ю, а также на международных семинарах RECESS'lO, RECESS'll и Chemical, Synthetic And Systems Biology: New Directions Of Biochemistry In The 21st Century'll.

Структура и объем работы Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста и содержит следующий разделы: обзор литературы, материалы и методы, результаты в двух главах, обсуждение и выводы. В конце приведен список литературы. Материал включает 21 рисунок, 14 таблиц и список литературы, содержащий 166 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Предсказание регуляторных элементов транскрипционной сети на примере пути деградации этаноламина

Путь утилизации этаноламина

Одним из источников углерода, азота и энергии для бактерий может служить этаноламин. Путь утилизации этаноламина является частным случаем реакций утилизации диолов с образованием альдегидов (Рисунок 1). Все известные подобные пути требуют наличия кофактора - кобаламина (витамина В12).

Путь утилизации этаноламина экспериментально изучен у Salmonella typhimurium LT2. Основным ферментом пути является этаноламин лиаза (ЕС 4.3.1.7) - белковый комплекс, состоящий из двух субъединиц: большой EutB и малой EutC. Этаноламин лиаза осуществляет главную реакцию пути - расщепление до ацетальдегида и аммиака, который используется как источник азота. Дальнейшее превращение ацетальдегида осуществляется оксидоредуктазой EutE до ацетил-КоА или алкогольдегидрогеназой EutG до этанола. Ацетил-КоА в свою очередь может быть превращен в ацетат с получением одной молекулы АТФ с помощью ферментов ацетат киназы Аск и фосфоацетилтрансферазы EutD либо отправлен в цикл Кребса (Kofoid et al, 1999) (Рисунок la).

Кофактором этаноламин лиазы является аденозилкобаламин, который может бьггь получен извне или из цианокобаламина или гидроксикобаламина, синтезируемых в клетке. Превращение в аденозилкобаламин происходит с помощью аденозилкобаламинтрансферазы EutT (Sheppard et al, 2004). Цианокобаламин и гидроксикобаламин являются ингибиторами этаноламин лиазы. EutA, компонент ферментативного комплекса который обнаружен у многих бактерий, растущих на этаноламине, защищает этаноламин лиазу от их воздействия.

У некоторых бактерий, способных к деградации диолов, обнаружен особый компартмент, так называемая метаболосома (Kofoid et al, 1999, Brinsmade et al, 2005). У таких организмов превращения этаноламина до ацетил-коА происходят внутри этого компартмента. Структурные белки метаболосомы - EutS, EutM, EutN, EutL, EutK -являются гомологами структурных белков карбоксисомы - органеллы цианобакгерий,

ответственной за накопление СОг для фиксации ферментом рибулозобисфосфаткарбоксилазой (Orus et а), 1995) Предположительная роль метаболосом в клетках бактерий - предотвращение потерь альдегидов во время утилизации диолов (Penrod, Roth, 2006).

Зтанопаиин Пропандаюп

EäjtBC I PduCDE I

Ацетальдегвд + NH3 Пропиональдегид + Н20

WuQ

BjtG

▼

p^—KoA-SH

Этанол Ацетил-КоА---fr Цикл Кребса Пропанол Пропионил-КоА---^ Цикл Кребса

Фосфат Фосфат

•je:

ало [

ф^-KoA-SH i4- KoA-SH

Ацеталфосфат Пропионилфо^ат

AcV J WuW Г

фч_АТФ Y—АТФ

Ацетат Пропионат

(а) (б)

Одинаковым цветом показаны химически сходные реакции.

Рисунок 1 - (а) Путь утилизации этаноламина; (б) Путь утилизации пропандиола.

Ранее предпринимались попытки экспериментального изучения регуляции транскрипции eirf-оперона (Roof, Roth, 1992). Для S. thyphimurium была экспериментально показана роль EutR, ген которого также находится в составе еиГ-оперона, в регуляции экспрессии генов утилизации этаноламина (Roof, Roth, 1992). Участки связывания EutR с ДНК не установлены.

Транскрипционный фактор EutR обнаружен далеко не у всех бактерий, содержащих ферменты утилизации этаноламина. Для таких организмов возникает отдельный вопрос о том, как происходит регуляция этого пути. Для таксономической группы Firmicutes ранее замечено, что рядом с генами утилизации этаноламина часто

обнаруживаются гены двухкомпонентной регуляторной системы, например, гены linI136 и linl¡Í7 в Listeria innocua (А. Мушегян, частное сообщение).

Происхождение этой сложной метаболической системы неизвестно. Путь утилизации этаноламина интересен еще и тем, что была показана его связь с пищевым отравлением. Так, обнаружено, что большинство бактерий, вызывающих пищевые отравления, имеют ферменты утилизации этаноламина, а многие также и пропандиола (Korbel et al, 2005).

Поиск ортологов и эволюция генов утилизации этаноламина Ортологи EutB и EutC были обнаружены в более чем 100 видах бактерий из различных таксономических групп: Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Flavobacteria, Lentisphaerae, Planctomycetacia и Fusobacteria. Структура ««/-оперона оказалась различной в разных группах бактерий. Мы выделили два основных типа подобных оперонов - короткий, содержащий минимальный набор генов утилизации этаноламина, и длинный (Рисунок 2).

А

г";

wi^ tHfe- ei^ n^- яйв^

«А/

а»

Ml «ЧС,

■^►f^^ii^^c^ ~ fi^fr1^

Б В Г

Д Е Ж 3 И К Л

м н о п

Короткие опероны: A, Deltaproteobacteria\ Б. Proteobacteria, Chlorophlexi и Bacteroidetes; В, некоторые Proteobacteria и Acidobacteria: Г, Betaproteobacteria (eutR обнаружен отдельно от eutBC и eat). Длинные опероны: Д, Nocardioides sp.; Е, Enterobacteriaceae; Ж, М. aquaeolei\ 3, S. boydii Sb227: И, S. sonnei Ss046; К, S. dysenteriae Sdl97; Jl, Symbiobacterium thermophilum and P. !uminescens\ M, P. fluoresceins Pf-5; H, Clostridiaceae и F. nucleatunr, O, Listeriaceae и Enterococcaceae', П, C.acetobutylicum.

Белым цветом обозначен псевдоген eutB. Предсказанные участки связывания EutR обозначены фиолетовыми овалами.

Рисунок 2 - Разнообразие оперонных структур, содержащих гены eutBC.

Для изучения эволюции этой сложной метаболической системы на основе аминокислотных последовательности ферментов EutB и EutC из полных геномов были построены филогенетические деревья методом объединения соседних пар («neighbour-joining»). Для оценки достоверности наблюдаемого расположения ветвей применялось статистическое размножение выборки («бутстреп-анализ»). Мы обнаружили, что гены из разных типов оперонов, короткого и длинного. Первая ветвь содержит белки из

РгсЯеоЬайепа и АсйпоЬайепа, вторая ветвь - из ЕЩегоЬайепакз, относящихся к РгоГеоЬайела, и РигшсЩев (Рисунок 3). В случае геномов, содержащих два ем-оперона (К. рпетотае. М ациаео1е1, Р. Аиогезсет), еЩВ из оперонов разного типа лежат на разных ветвях.

Цвет ветвей соответствует бутстреп-значениям: зеленый - > 70%, синий - от 50 до 70%, красный-<50%.

Цвет внешнего круга соответствует длине оперона: зеленый - длинный оперон, красный -короткий оперон.

Цвет внутреннего круга соответствует таксономической принадлежности: красный, Alphaproteobacteria; желтый, Betaproteobacteria; зеленый, Gammaproteobacteria; синий, Deltaproteobacteria; фиолетовый, Firmicutes; розовый, Actinobacteria; зелено-желтый, Acidobacteria; светло-фиолетовый, Fusobacteria; голубой, Chlorophlexi.

Овалами обозначены гены, расположение которых на дереве противоречит таксономии, т.е. события горизонтального переноса генов.

Стрелками обозначены ветви, бугстреп-значения которых поддерживают гипотезу горизонтального переноса генов: оранжевая стрелка - бутстреп-значениеешв1, голубая стрелка - бутстреп-значениееи1в2,

Обозначения геномов взяты из базы данных KEGG. Длины ветвей не отражают расстояния между видами.

Рисунок 3 - Сводное филогенетическое дерево EutB, построенное методом объединения соседних пар с бугстреп-анализом.

Случаи, когда расположение ветвей на филогенетическом дереве не согласуется с таксономией, представляют особый интерес (Рисунок 3). Такая топология дерева свидетельствует о возможном событии горизонтального переноса генов.

Первый случай отклонения от таксономии был обнаружен для белков бактерий типа Actinobacteria. Ветвь Actinobacteria оказывается внутри ветви, соответствующей белкам из типа Proteobacteria (бутстреп-значениееищ 1 > 70%, Рисунок 3), в то время как на дереве видов таксоны Actinobacteria и Proteobacteria являются равнозначными. Кроме того, и Actinobacteria, и Proteobacteria имеют короткий тип оперона. Такую топологию можно объяснить следующим образом: вначале произошел горизонтальный перенос короткого оперона генов утилизации этаноламина из Proteobacteria к общему предку Actinobacteria, а далее он распространился по некоторым организмам этого таксона. Таким образом, гены утилизации этаноламина из Actinobacteria являются потомками генов из Proteobacteria.

Второй случай отклонения от таксономии наблюден в Fusobacterium nucleatum. Ветвь, соответствующая белкам из F. nucleatum (тип Fusobacteria), находится внутри ветви Firmicutes (бустреп-значениееи1в2>70%, Рисунок 3). Fusobacteria и Firmicutes являются равнозначными таксонами, поэтому и здесь, вероятно, также имел место недавний горизонтальный перенос из Firmicutes в Fusobacteria. Дополнительным свидетельством недавнего переноса является то, что в остальных четырех представителях Fusobacteria, для которых доступна полногеномная последовательность (Ilyobacter polytropus, Leptotrich/a buccalis, Sebaldella termitidis, Streptobacillus moniliformis), генов утилизации этаноламина не найдено.

Самый яркий пример отличия топологии дерева EutB от дерева таксонов -расщепление ветви Gammaproteobacteria, относящейся к Proteobacteria, на две (Рисунок 3). Расположение одной из ветвей соответствует таксономии (Рисунок 3), а другая ветвь (порядок Enterobacteriales) становится сестринской к Firmicutes. Интересно, что для организмов из первой ветви характерен короткий тип оперона, в то время как организмы второй ветви, как и Firmicutes, содержат длинный тип оперона. Можно предположить две возможные причины возникновения такой топологии. Во-первых, стоит отметить, что только для этих организмов характерно наличие специального компартмента для ферментов утилизации этаноламина - метаболосомы. По этой причине можно предположить, что эволюция ферментов в условиях макромолекулярного комплекса с метаболосомой могла проходить конвергентно в двух таксономически далеких ветвях. Но более вероятной является возможность еще одного события горизонтального перенос генов от Proteobacteria к Firmicutes, или наоборот.

Для детального исследования происхождения такой топологии мы реконструировали вероятное строение оперона eut у предка Firmicutes, предка Proteobacteria и предка Enterobacterial es, используя метод максимальной экономии (maximal parsimony), реализованный в программе MESQUITE. На основании реконструкции составов предковых оперонов можно выдвинуть следующую гипотезу об эволюции генов утилизации этаноламина. Из всех генов утилизации этаноламина только eutBC были у предков всех трех исследумых таксономических групп. Таким образом, предковый оперон с высокой вероятностью состоял только из генов eutBC. Опираясь на тот факт, что похожий тип оперона у ныне живущих бактерий масштабно представлен только у Proteobacteria, мы выдвинули первую гипотезу. Она состоит в том, что гены утилизации этаноламина eutBC были у общего предка всех Proteobacteria. Позднее к ним добавился ген транспортера eat. Далее этот основной набор генов был дополнен геном, кодирующим транскрипционный фактор EutR. В таком виде - eat-eutBC и соседний ген eutR - состав генов утилизации этаноламина сохранился у ныне живущих представителей Proteobacteria. В ветви Enterobacteriales предковый оперон был дополнен структурными генами метаболосомы, геном синтеза аденозилкобаламина eutT и генами расщепления этаноламина до этанола и ацетата с получением АТФ (Рисунок 1).

Что касается Firmicutes, то их еимшероны могли возникнуть в результуте горизонтальных переносов от Enterobacteriales с заменой транскрипционного фактора EutR на двухкомпонентную регуляторную систему. В результате горизонтальных переносов от Enterobacteriales к другим Proteobacteria в геномах М. aquaeolei VT8, К. pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578, P. fluorescens Pf-5 возникло два независимых eut- оперона.

Вторая гипотеза состоит в том, что путь утилизации этаноламина был еще раньше - у гипотетического общего предка Firmicutes и Proteobacteria. Дальнейшая эволюция eut-оперонов в этих ветвях привела к независимому образованию короткого и длинного типов. Короткий тип развился в Proteobacteria, а длинный - в Firmicutes.

Горизонтальный перенос генов от Firmicutes к древней бактерии, предку порядка Enterobacteriales, привел к тому, что у большинства Enterobacteriales возник длинный eut-оперон. Геномы Proteobacteria с двумя еи/-оперонами (М aquaeolei VT8, К. pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578, P. fluorescens Pf-5) являются результатами горизонтальных переносов либо от Firmicutes, либо от Enterobacteriales, при которых собственные гены утилизации этаноламина еще не успели деградировать.

Регуляция утилизации этаноламина Для поиска регуляторных элементов были отобраны группы близкородственных геномов, содержащих ортологи EutR: первая группа содержала бактерии порядка Enterobacteriales (E.coli К12 MG1655, E.coli 0157, C.koseri, K.pneumoniae, S.enterica, S.boydii, S.dysenteriae), вторая - Burkholderiales (B.cepacia, B.cenocepacia, B.mallei, B.pseudomallei, B.vielnamiensis, B. thailandcnsis, B.xenovorans, B.lhailandensis, P.naphthalenivorans, A.avenae, M.petroleiphilum).

У Enterobacteriales еы/-оперон содержит 17 генов, первым из которых является ген eutS. Методом филогенетического футпринтинга в промоторной области гена eutS найдены два консервативных участка. Один из них при детальном рассмотрении обнаружил сходство с участком связывания CRP - wwwTGTGAtyyrgwTCACTtWt. Мы предположили, что вторая консервативная область является участком связывания EutR. Косвенным подтверждением этого предположения является тот факт, что наличие транскрипционного фактора EutR коррелирует с наличием найденного участка связывания

в промоторной области оперона eut (в геномах, не содержащих гена транскриционного фактора EutR, подобного участка найдено не было).

У представителей Burkholderiales оперон содержит ген транспортера этаноламина eat и гены этаноламин лиазы eutBC. В промоторной области гена eat была обнаружена только одна консервативная область. При сравнении обнаруженных участков (Рисунок 4) выявилось их сходство, что также подтверждает наши предположения о том, что это участок связывания именно транскрипционного фактора EutR.

«fflseœor-nrt'iwesffl«

mm

Ы «•> «л

ТТдС

а*

Рисунок 4 - Сравнение диаграмм Лого для предполагаемых участков связывания EutR в регуляторных областях eut- и cob- оперонов: А) Участок связывания EutR в регуляторной области еиг-оперона у Burkholderiales; Б) Участок связывания EutR в регуляторной области еимэперона у Enterobacteriales; В) Участок связывания EutR в регуляторной области со4-оперона у Enterobacteriales.

По горизонтальной оси указан номер позиции нуклеотида, по вертикальной -информационное содержание позиции в битах. Относительная высота каждой буквы соответствует частоте нуклеотида в данной позиции.

На основании полученных последовательностей участков связывания ЕиЖ была построена матрица позиционных весов. Эту матрицу использовали для поиска генов, экспрессия которых может регулироваться ЕиЖ. Поиск охватывал область -400...+100 от старта трансляции.

Сканирование при помощи матрицы позиционных весов обнаружило около 60 генов из 7 регулонов, относящихся к разным метаболическим путям (Таблица 1). Похожая консервативная область обнаружена перед геном сЫЛ - первым геном оперона синтеза кобаламина. Кобаламин является кофактором основного фермента утилизации этаноламина, поэтому этот случай представляет особый интерес (Тогауа, 2000) (Таблица 1).

Таблица 1 Участки связывания ЕиЖ. перед потенциальными членами регулона. Условные

обозначения: «+» - обнаружен потенциальный участок связывания перед опероном; «-» -

потенциальный участок связывания перед опероном не найден;

«0» - ортологов данных генов не обнаружено.

Условные обозначения геномов взяты из базы данных КЕОО.

Гены Геномы Функция

kpn sty cko eco sdy

yabB-mraZW-ftsLI-murEF-mraY-murD-fts W-murGC-ddlB-flsQAZ-lpxC + + - + + Деление клетки/синтез клеточной стенки

cbiA- cbiBCDETFGHJKLMN QOP-cobUST + + + 0 0 Синтез кобаламина Неизвестный белок

yciW - + + + +

yhhM - + + + + Белок внутренней мембраны

xylFGHR + 0 + + - ABC транспортер ксилозы

eutSPQTDMNEJGHAB + + + + + Утилизация этаноламина

CKLR

stpA + + + + + ДНК-связывающий белок

Обнаруженный участок связывания EutR перекрывается с одним из участков связывания PocR. Видимо, как и в случае утилизации пропандиола, транскрипционный фактор EutR также может одновременно контролировать утилизацию этаноламина и синтез необходимого для этого кофактора - кобаламина

2. Регуляторные блоки в сетях регуляции транскрипции

Транскрипционную сеть можно рассматривать как направленный граф, в вершинах которого находятся транскрипционные факторы и регулируемые гены, а ребра отображают связь факторов с регулируемыми генами. Особенностью графа на основе биологических сетей является наличие внутренних структур, повторяющихся чаще, чем в случайном графе. Такие подграфы, частота которых в биологическом графе значимо больше, чем в случайном графе, получили название «структурных мотивов» («network motif») (Shen-Orr et al, 2002). В данной работе мы будем называть такие подграфы «регуляторные блоки», чтобы отличать этот объект от мотива участков связывания транскрипционных факторов.

Для различных биологических сетей характерны разные регуляторные блоки. Было показано, что в транскрипционных сетях самыми частыми регуляторными блоками являются «треугольник» (feed-forward loop) и «веер» («bi-fan») (Shen-Orr et al, 2002). В настоящей работе мы рассматривали регуляторный блок из трех элементов -«треугольник». Это структура их трех генов, два из которых являются транскрипционными факторами. Один из этих транскрипционных факторов (X, так называемый, общий) регулирует другой (Y, специальный), а вместе они регулируют ген (Z) (Рисунок 5). Несмотря на то, что всего существует 13 возможных способов связать три вершины в направленном графе (Рисунок 6), показано, что в транскрипционных сетях среди блоков с тремя вершинами перепредставлен только «треугольник» (Shen-Orr et al, 2002).

Так как транскрипционный фактор может быть активатором или репрессором, существует восемь различных подтипов подобного регуляторного блока треугольник

(Mangan. Alón, 2003). В зависимости от того, какие транскрипционные факторы находятся в вершинах треугольника, различают согласованные и несогласованные треугольники (Рисунок 7). Мотив является согласованным, если прямой эффект общего транскрипционного фактора имеет тот же знак (положительный или отрицательный), что и непрямой эффект, опосредованный специальным фактором. Если знаки не совпадают, такой треугольник называется несогласованным.

X

/\

У—-Z

Рисунок 5 - Общая схема регуляторного блока типа «треугольник».

А А

/\ /\

В С В С В С

AAA

/\ /\ /

в—с в—с в—с

AAA

/ /\ А

в—с в—-с в—с

AAA

/ /\ 'С в — с в—-с

А

/\ в—с

Рисунок б - Возможные регуляторные блоки с тремя элементами. Оранжевым выделен «треугольник».

Y—-Z Y—-Z Y-iZ

C1 C2 C3

XXX

Y-iZ Y-Z Y

H1 H2 H3

Рисунок 7 - Типы согласованных (С) и несогласованных (Н) треугольников.

Взаимодействия внутри треугольников можно разделить по природе образующего его транскрипционного фактора, В научной литературе принято разделять транскрипционный факторы на так называемые локальные и глобальные, хотя единого формального критерия разделения не существует. Одно из первых определений: глобальный транскрипционный фактор - это такой фактор, который участвует в регуляции нескольких метаболических путей (Gottesman, 1984, Martínez-Antonio, Collado-Vides, 2003). Другой подход основан на количестве регулируемых генов или оперонов (Shen-Orr et al, 2002, Madan Babu, Teichmann, 2003). Недавно был предложен структурный подход, в котором транскрипционная регуляция рассматривалась как сеть, а глобальным считался фактор, который регулирует несколько модулей в этой сети (Ма, Buer, Zeng, 2004). Тип транскрипционных факторов моет быть важен потому, что глобальные и локальны транскрипционные факторы по-разному сохраняются в ходе эволюции.

Определение локальных и глобальных транскрипционных факторов Мы объединили несколько подходов для определения глобальных транскрипционных факторов. Транскрипционный фактор считался глобальным, если он, во-первых, принимает участие в регуляции более 20 оперонов, и, во-вторых, эти опероны принадлежат разным метаболическим путям. Этим критериям соответствуют восемь транскрипционных факторов: CRP, 1HF, FNR, Fis, ArcA, Lrp, H-NS и FUR.

Функциональная аннотация треугольников

Регуляторные блоки могут быть неравномерно представлены в метаболических путях. Анализ функциональных категорий по базе данных COG (Tatusov et al, 2003) генов, входящих в состав треугольников, показал, что, в треугольниках перепредставлены гены, участвующие в производстве энергии (р-значенне 0), транспорте и метаболизме Сахаров (р-значение 7,3х10"7). Для оценки статистической значимости использован гипергеометрический тест. Этот результат объясняется тем, что большинство треугольников образовано глобальными транскрипционными факторами дыхания Fnr и АтсА или катаболизма Сахаров CRP (Gelfand, 2006).

Эволюция регуляторного блока типа треугольник в близкородственных организмах на примере штаммов Escherichia coli и в Enterobacteriales

Эволюция мотива треугольник в близкородственных организмах была изучена на примере 25 штаммов Е. coli. Для анализа мы отобрази такие межгенные участки, которые сохраняются по крайней мере в 10 штаммах. Мы считали, что межгенный участок сохраняется, если, во-первых, сохраняются оба гена, между которыми он расположен, во-вторых, ориентация этих генов осталась неизменной. Кроме того, здесь мы полагали, что участок связывания исчезает, если в нем возникает хотя бы одна замена. Для очень близких организмов со степенью схожести последовательности более 95%, событие замены происходит очень редко, поэтому необходимо использовать такие жесткие критерии, чтобы таким образом фиксировать редкие события изменения последовательности участка связывания.

Информация о регуляторных взаимодействиях была получена из базы данных RegulonDB (Gama-Castro et al, 2011). В 25 штаммах E.coli содержится 335 регуляторных взаимодействий, принимающих участие в образовании треугольников, и 367 прочих взаимодействий, которые мы назвали парными. В 335 взаимодействиях из треугольников у 194 в вершине находится глобальный транскрипционный фактора у 161 - локальный. В парных взаимодействиях в вершинах 105 взаимодействий находится глобальный транскрипционный фактор, а в вершинах 262 - локальный (Таблица 2).

Таблица 2. Количество различных типов регуляторных взаимодействий в 25 штаммах E.coli.

Треугольники (всего) Треугольники (консервативные) Парные (всего) Парные (консервативные)

Глобальные 194 102 105 63

Локальные 161 109 262 152

Всего 335 211 367 215

Анализ консервативности участков связывания транскрипционных факторов показал, что из 199 глобальных взаимодействий сохранилось 165: 63 парных и 102 из треугольников. Из 421 локального взаимодействия сохранилось только 261 взаимодействие: 152 парных и 109 из треугольников. Оказалось, что локальные взаимодействия более консервативны в треугольниках, чем в парных взаимодействиях (статистическая значимость 0.047 согласно тесту х2)-

Аначиз был сделан на 25 штаммах Е. coli. Так как их число постоянно растет, возникает вопрос, насколько может измениться полученный результат, если анализировать большее число организмов. Мы проанализировали, как меняется доля консервативных регуляторных взаимодействий в зависимости от числа штаммов и обнаружили, что она практически не меняется, начиная с 15 ± 2 штаммов, в зависимости от типа взаимодействия.

В Enterobacteriales мы проанализировали частоту всех возможных механизмов изменения регуляторного взаимодействия:

• сохранение всех трех элементов - транскрипционного фактора, гена и участка связывания (обозначено в таблицах 3-6 как «Консервативная регуляция»)

• исчезновение транскрипционного фактора («Нет транскрипционного фактора»)

• исчезновение регулируемого гена («Нет регулируемого гена»)

• исчезновение участка связывания: хотя бы одного или всех в случае множественного регуляции («Нет участка связывания»); исчезновение участка связывания определялось как сильное уменьшение его веса, определяемого с помощью матрицы позиционных весов.

Информация по регуляторным взаимодействиям, как и при анализе штаммов Е.

coli, была использована из базы данных RegulonDB.

Сила связывания с транскрипционным фактором может бьпъ примерно оценена при помощи матрицы позиционных весов - чем выше вес участка связывания, тем выше может бьпъ его сила связывания с транскрипционным фактором. В настоящей работе вес участка связывания рассчитывался с помощью матрицы позиционных весов. Числа в ячейках такой матрицы - это позиционные веса (вес каждого нуклеотида в каждой позиции участка связывания), которые вычисляются по формуле:

W (b,k) = log (N (b, к) + 0,5) - 0,25 Е;.а,с,с,т log (N (/, к) + 0,5),

где N (Ь, к) - количество нуклеотидов Ъ в позиции к в обучающей выборке. Первый член в формуле зависит от того, сколько раз данный нуклеотид встретился в данной позиции, второй - от консервативности самой позиции. Вес участка связывания определяется суммой соответствующих позиционных весов, и измеряется в единицах стандартного отклонения распределения весов на случайных последовательностях.

Чтобы принять во внимание изменения в силе связывания (т.е. веса) участка связывания, мы анализировали только такие транскрипционные факторы, для которыз матрица позиционных весов есть в базах данных RegPrecise (Novichkov et al, 2012) или ее можно создать на основе последовательностей участков связывания в RegulonDB. Таким образом, для анализа было использовано 96 транскрипционных фактора. Участок связывания считался консервативным в данном организме, если его вес уменьшился не более чем на две единицы по сравнению с весом аналогичного участка в Escherichia coli К12.

На основе данных из RegulonDB для Enterobacteriales мы получили 473 парных и 418 взаимодействий, образующих треугольник. Разделив их в зависимости от типа транскрипционного фактора, мы получили 6 видов взаимодействий: Г (глобальный транскрипционный фактор)—»• регулируемый ген, J1 (локальный транскрипционный фактор)-* регулируемый ген, Г-+Т, Г-+-Л, Л-*Л, Л->Г. Оказалось, что взаимодействия типа Л-► Г встречаются очень редко, а взаимодействия типа Г-*- Г характерны только для треугольников и не встречаются в парах. Таким образом, мы изучили оставшиеся четыре типа регуляторных взаимодействий. В таблицах указано количество определенных событий, произошедших с каждым типом взаимодействия (Таблицы 3-4).

Таблица 3. Количество событий, произошедших с парными взаимодействиями в порядке ЕтегоЬас1епа1ез

Г-»-Л Л-*-Л Г-*-ген Л—*-ген Л—»-ген (" S.enterica)

Нет транскрипционного фактора 0 73 0 240 45

Нет регулируемого гена 31 8 607 674 26

Нет участка связывания (хотя бы одного) 7 62 708 1201 14

Нет участка связывания (всех) 1 25 596 746 11

Консервативная регуляция 51 321 840 2522 250

Всего 89 452 2155 4637 335

Таблица 4. Количество событий, произошедших с треугольниками в порядке Enterobacteriales

Г—►Л Л-* Л Г—*-ген Л—*тен Л-*-ген (в S.entericä)

Нет транскрипционного фактора 0 189 0 208 44

Нет регулируемого гена 281 82 572 193 15

Нет участка связывания (хотя бы одного) 186 117 828 395 17

Нет участка связывания (всех) 105 44 536 186 8

Консервативная регуляция 290 483 1310 596 110

Всего 757 871 2710 1371 186

Для всех проанализированных организмов взаимодействие с локальным транскрипционным фактором оказалось более консервативным в парных взаимодействиях. Статистическая значимость теста х2 для Salmonella enterica равна 0.006.

Для других организмов результат не значим, но наблюденное отклонение сохраняется. Консервативность регуляторных взаимодействий, образованных глобальными транскрипционными факторами, не различалась между треугольниками и парами. Таким образом, ддя подобных регуляторных взаимодействий наличие структурного мотива не влияет на их консервативность.

Далее мы изучили поведение самых частых треугольников согласованного (С1) и несогласованного (Н1) типа Согласованный треугольник оказался менее консервативным, чем несогласованный: участки связывания в таком треугольнике исчезают быстрее (Таблицы 5-6). Статистическая значимость теста х2 равна 0,021 для глобальных взаимодействий, и 6,7x10"7 для локальных.

Таблица 5. Количество событий, произошедших с согласованными треугольниками типа С1

Г-»-Л Л-*-Л Г-»-ген Л—»-ген

Нет транскрипционного фактора 0 72 0 138

Нет регулируемого гена 157 15 131 32

Нет участка связывания (хотя бы одного) 50 40 282 184

Нет участка связывания (всех) 10 14 178 77

Консервативная регуляция 87 107 483 147

Всего 294 234 896 501

Таблица 6. Количество событий, произошедших с несогласованными треугольниками типаН!

Г-*Л Л-+-Л Г—►ген Л—*ген

Нет транскрипционного фактора 0 193 0 100

Нет регулируемого гена 135 50 245 92

Нет участка связывания (хотя бы одного) 154 58 367 131

Нет участка связывания (всех) 57 30 166 26

Консервативная регуляция 271 258 712 276

Всего 560 559 1324 599

Выводы

1. Анализ таксономического распределения генов утилизации этаноламина показал, что существует два возможных пути катаболизма использования этаноламина, связанных с типом оперона. Первый, короткий, позволяет использовать этаноламин только в качестве источника азота. Второй, длинный, дает возможность использовать его и как источник азота, и как источник углерода.

2. Исследование эволюции генов утилизации этаноламина показало, что короткий оперон является предковым, из которого путем добавления новых генов образовался длинный тип. В ходе эволюции генов утилизации этаноламина произошло минимум три события горизонтального переноса.

3. В Enterobacteriales и Burkholderiales предсказан мотив участка связывания транскрипционного фактора EutR. В Enterobacteriales участки связывания EutR обнаружены в промоторной области семи оперонов, среди которых есть непосредственно гены утилизации этаноламина, а также гены синтеза кофактора основного фермента пути этаноламинлиазы - кобаламина. Это наблюдение устанавливает связь между путями утилизации этаноламина и синтезом кобаламина за счет EutR-зависимой регуляции. В Burkholderiales участки связывания EutR обнаружены только непосредственно в промоторной области генов утилизации этаноламина.

4. Локальная регуляция является эволюционно подвижной, что согласуется с необходимостью быстрой адаптации к условиям окружающей среды. В штаммах Escherichia coli взаимодействия типа Л —»-ген (локальный транскрипционный фактор —► ген) чаще сохраняются в регуляторных блоках, чем вне их. На уровне порядка Enterobacteriales эти взаимодействия консервативнее в парных взаимодействиях, по сравнению с регуляторными блоками, что может быть результатом изменчивости транскрипционной сети.

5. Разные типы треугольников на уровне порядка Enterobacteriales эволюционируют по-разному. Регуляция как глобальным, так и локальными транскрипционными факторами в несогласованном треугольнике оказывается консервативнее, чем в

согласованном.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи в научных журналах

1. Tsoy О., Ravcheev D., Mushegian A. «Comparative genomics of ethanolamine utilization». // Journal of Bacteriology. - 2009 - V. 191(23) - P. 7157-7164.

2. Tsoy O.V., Pyatnitskiy M.A., Kazanov M.D., Gelfand M.S. «Evolution of transcriptional regulation in closely related bacteria». // BMC Evol Biol. - 2012 - V. 12(1) - P. 200.

Тезисы конференций

1. Tsoy О., Ravcheyev D., Mushegian A. «Comparative genomics of the ethanolamine utilization pathway». // 4-th Moscow Conference on Computational Molecular Biology'09. Book of abstracts. - 2008 - P.352

2. Tsoy O., Mushegian A. «Ethanolamine utilization: comparative genomics of spoiled food». // Regulation and Evolution of Cellular Systems (RECESS, 2010), Germany, June 20-23.

3. Цой О., Остерман И. Эволюция регуляторных взаимодействий в бактериях. // Информационные технологии и системы (ИТиС'Ю). Сборник тезисов. - 2010 -с.343-344.

4. Tsoy О. «The evolution of transcriptional regulation in bacteria». // Regulation and Evolution of Cellular Systems (RECESS, 2010), Germany, May 10-13.

5. Tsoy O., Gelfand M. «Evolution of transcriptional regulation in Enterobacteriales». // ASBMB Symposia. Chemical, Synthetic and Systems Biology: New Directions of Biochemistry in the 21st Century, Utah, USA, October 12-16.

Подписано в печать:

01.10.2014

Заказ № 10257 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \улу\¥.аи1огеГега1. ги