Создание бактериальной тест-системы для скрининга ингибиторов протеинкиназ на основе генов фосфотрансфераз

Беккер, Ольга Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание бактериальной тест-системы для скрининга ингибиторов протеинкиназ на основе генов фосфотрансфераз
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Создание бактериальной тест-системы для скрининга ингибиторов протеинкиназ на основе генов фосфотрансфераз"

БЕККЕР ОЛЬГА БОРИСОВНА

СОЗДАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ СКРИНИНГА ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНКИНАЗ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ ФОСФОТРАНСФЕРАЗ

03.02.07 - генетика.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011.

1 Д ДПР 2011

4843880

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им. НИ. Вавилова РАН

доктор биологических наук, профессор Даниленко Валерий Николаевич УРАН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

доктор биологических наук, профессор Киселев Сергей Львович РНЦ «Курчатовский институт»

доктор биологических наук, профессор Лось Дмитрий Анатольевич УРАН Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Защита диссертации состоится » Ct^e^C 2011 года b /JT часЗ& мин, на заседании диссертационного Совета (Д 002.214.01) при Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, 3, факс (499)132-89-62, E-mail: aspirantura@vigg.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН

Автореферат разослан » JUQ^J^^—■ 2011 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Секретарь

диссертационного Совета, кандидат биологических наук

, 6С(Л Т.А. Синелыцикова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Серин/треониновые протеинкиназы (СТГЖ) - универсальные регуляторы клеточного метаболизма эукариотов. Им принадлежит ключевая роль в контроле таких процессов, как апоптоз, пролиферация и дифференцировка клеток, транспорт веществ из клетки и др. Нарушение функционирования СТПК связано с развитием таких заболеваний человека, как диабет, сердечно-сосудистые расстройства, опухоли, нарушения иммунитета. СТПК эукариотического типа обнаружены у бактерий, включая формы, патогенные для человека. СТПК участвуют в формировании вирулентности, образовании бактериальных биопленок, поддержании толерантности и персистирования патогенных микроорганизмов. Интенсивно развивается биомишень-направленный поиск модуляторов (ингибиторов) протеинкиназ как потенциальных лекарственных препаратов нового поколения. Особое значение придают разработке высокопродуктивного, чувствительного, быстрого и дешевого скрининга библиотек химических соединений для обнаружения веществ, перспективных для терапии. При этом использование культур клеток, лабораторных животных, в отличие от бактерий, в тест-системах представляется неэффективным по временным затратам и стоимости.

Цель работы: изучение возможности использования фермента аминогликозидфосфотрансферазы типа VIII (aphVIII) актинобактерий, определяющего устойчивость к антибиотикам, и фосфорилирующих его СТПК для создания тест-систем для скрининга лекарственных средств нового поколения; разработка эффективной тест-системы на основе aphVIII и СТПК - биомишеней для будущих лекарств - ингибиторов СТПК.

В работе поставлены следующие задачи: 1. Охарактеризовать компоненты тест-системы. Для этого:

- провести фосфорилирование aphVIII in vitro протеинкиназами S. coelicolor A3(2).

идентифицировать протеинкиназу S. coelicolor A3(2), фосфорилирующую aphVIII.

- идентифицировать протеинкиназу, фосфорилирующую aphVIII в S. lividans aphVIII+.

- провести клонирование и экспрессию нуклеотидной последовательности каталитического домена протеинкиназы рк25 штамма S. coelicolor в Е. coli

- провести аутофосфорилирование каталитического домена рк25.

2. Охарактеризовать тест-систему S. lividans TK24(66)aph VlII+ICTilK с использованием известных ингибиторов СТПК.

3. Провести скрининг потенциальных ингибиторов протеинкиназ человека и бактерий.

4. Сконструировать тест-систему E.coli aphVIII/pk25. С этой целью:

- модифицировать область Ser-146 aphVIII - сайт фосфорилирования рк25.

- создать экспрессионную конструкцию, содержащую ген aphVIII с модифицированным сайтом фосфорилирования и нуклеотидную последовательность каталитического домена рк25.

5. Валидировать тест-систему E.coli aphVIII/pk25 и определить возможности ее использования.

Научная новизна

Впервые показана возможность фосфорилирования aphVIII протеинкиназами S. coelicolor A3(2), и идентифицирована протеинкиназа рк25, фосфорилирующая aphVIII. Впервые обнаружена протеинкиназа, фосфорилирующая aphVIII в клетках S. lividans ТК24(66); показана ее способность к аутофосфорилированию in vitro. Используя уникальные свойства полученных молекул, впервые проведен анализ более 500 веществ различных химических классов - потенциальных ингибиторов СТПК в тест-системе S. lividans TK24(66)aphVIII+/CTIIK и отобраны вещества,

оказавшиеся селективными ингибиторами эукариотических СТПК. Впервые показана возможность создания тест-систем на основе aphVIII и СТПК и создана бактериальная тест-система, содержащая два компонента: уникальный фермент aphVIII, определяющий устойчивость к антибиотикам, и СТПК, фосфорилирующую aphVIII.

Прастическая значимость работы

Впервые создана бактериальная тест-система для скрининга ингибиторов СТПК, включающая aphVIII и фосфорилирующую его СТПК. Сконструированная тест-система позволяет проводить эффективный скрининг ингибиторов СТПК для идентификации и последующей разработки новых лекарственных препаратов. Созданная тест-система является важным элементом усовершенствования в технологической платформе скрининга ингибиторов СТПК.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на 4-м съезде Общества биотехнологов России им Ю.А. Овчинникова, (Москва 2006 г); международной конференции Inovacni podnikani & transfer technologii (Прага, 2007 г); 2-м международном Конгресс-Партнеринге и выставке по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио-2010». (Москва 2010 г); научном семинаре отдела генетических основ биотехнологии ИОГен РАН 2010 г.

Декларация личного участия автора

Фосфорилирование аминогликозидфосфотрансферазы VIII протеинкиназами S. coelicolor А3(2) и аутофосфорилирование белка каталитического домена протеинкиназы рк25 было проведено в соавторстве с к.б.н. Елизаровым С.М. Результаты по идентификации генов, клонированию и экспрессии генов, модификациям гена aphVIII, созданию конструктов для тест-системы, анализу тест-системы, скринингу на бактериальных тест-системах и биоинформатическому анализу получены автором

самостоятельно. Участие автора в получении результатов исследования 80 процентов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, включенных в перечень научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК РФ (Микробиология, 2008 г.; Journal of Medicinal Chemistry 2008 г.; ActaNature, 2010 г.) и 3 тезисов конференций, в которых полностью изложен материал диссертации.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, включает 19 таблиц, 35 рисунков. Библиография содержит 220 публикаций (9 отечественных источников и 211 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В разделе «Обзор литературы» изложены литературные данные о функциях, строении, классификации серин/треониновых протеинкиназ, клонированию и гетерологичной экспрессии генов серин/треониновых протеинкиназ рода Sireptomyces-, строении и классификации различных классов ингибиторов протеинкиназ, структурах

аминогликозидфосфотрансфераз бактерий и данные об известных биологических тест-системах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и векторы. Использованы штаммы Sireptomyces coelicolor А3(2) (ВКПМ, г. Москва), Sireptomyces lividans ТК24 (66)aphVIII+ (лаб. музей), Е. coli DH5a (Promega), Е. coli BL21(DE3) (Novagen). Применяли плазмидные векторы pET16b, pET22b и pET32a (Novagen).

Среды, реактивы и условия культнвирования. Для выращивания S. coelicolor А3(2) и S. lividans TK24(66)aphVIlI+ использованы среды YSP и YEME [Kieser Т., Bibb M.J., 2000]. Для выращивания Е.соН использовали среду Лурия (L-бульон), NZCYM. Для определения чувствительности S. lividans TK24(66)aphVIIl+ к канамицину и модуляторам протеинкиназ и кальциевых каналов тестированием на чашках Петри использовали агаризованную среду МГ (модифицированная среда Гаузе). Для определения чувствительности Е.соН aphVIIII46-I/pk25 к канамицину и модуляторам СТПК использовали агаризованную среду М9 с 1.5% раствором глицерина. Клетки Е. coli BL21(DE3) и Е. coli DH5a культивировали при 37° С [Mierendorf R., Yeager К., 1994], S. coelicolor А3(2) и S. lividans ТК24(бб) aphVIII+ при 28°С [Kieser Т., Bibb M.J., 2000]. Использовали коммерческие препараты ингибиторов протеинкиназ, кальциевых каналов, кальций-связывающих белков и антибиотиков.

Молекулярное клонирование. Выделение тотальной ДНК S.coelicolor А3(2) и S.lividans TK24(66)aphVIII+ проводили согласно руководству [Kieser Т., Bibb M.J., 2000]. Для выделения плазмидной ДНК, приготовления компетентной культуры Е.соН, трансформации и анализа рекомбинантных плазмид использовали стандартные методы [Sambrook J., Fritsch E.F., 1989]. Амплификацию ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили с использованием набора «Амплификация» фирмы "Dialat Ltd" на приборе Терцик ТП4-ПЦР01 ("ДНК-Технология"). Синтез олигонуклеотидов проводили в компании «Синтол». Нуклеотидную последовательность ДНК определяли секвенированием по методу Сэнгера. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программы BLAST (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast).

Рестрикцию и лигироваиие проводили с учетом рекомендаций фирм-изготовителей ферментов (Fermentas, Promega).

Электрофорез и выделение ДНК из геля. Электрофорез в агарозном геле проводили в трис-ацетатном буфере (Sambrook J., Fritsch E.F., 1989). Очистка фрагментов ДНК, выделенных из агарозного геля, производилась с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).

Электрофорез в полиакриламидном геле (SPS-PAGE). Содержание белка определяли по методике Брэдфорд [Bradford М.М., 1976]. Электрофорез белковых образцов проводили в 12 % полиакриламидном геле по методу Лэммли [Laemmli U.K., 1970]. Электрофореграммы белков сканировали на лазерном денситометре Ultrascan 2205 LKB. Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле, масс-спектры были получены в отделе протеомных исследований НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot (www.rnatrixscience.com).

Получение экстрактов клеток Streptomvces и К coli. Клетки суспендировали в буфере с фенилметилсульфонилфторидом и дитиотрейтолом и разрушали ультразвуком. Экстракты инкубировали в присутствии панкреатических РНКазы и ДНКазы и удаляли дебрис центрифугированием (20000xg, 30 мин).

Аффинное выделение протеинкиназ. Белки экстрактов адсорбировали на голубую сефарозу CL-6B (Pharmacia Biotech); смолу отмывали, и элюированные белки фракционировали и очищали на колонке с сефадексом G-20, откапиброванной по стандартному набору белковых маркеров для гель-фильтрации (Pharmacia).

Анализ фосфорилирования aphVHI. Фосфорилирование белка проводили в течение 10 мин. при 28°С в реакционной смеси (50 мкл), содержащей 10 мкг белков частично очищенного препарата протеинкиназ в буфере с добавлением 0.25 мМ [у-32Р]АТФ (150 Бк/пмоль; Обнинск, РФ) и определяли включение радиоактивной метки в aphVIII.

Сайт-направленный мутагенез области Ser-146 aphVIII выполнен по методу точковых мутаций Нельсона [Nelson R. M., Long G. L., 1989].

Определение устойчивости трансформантов E.coli BL2HDE3) к канамицину. С помощью репликатора клоны трансформантов, устойчивые к ампициллину, переносили на чашки Петри с LB-средой, содержащей различные концентрации канамицина и индуктор изопропил-ß-D-l-тиогалактопиранозид, и фиксировали рост колоний через 25 часов культивирования при 37°С.

Определение активности ингибиторов протеинкиназ проводили методом бумажных дисков на агаризованной среде МГ (для Streptomyces lividans TK24(66)aphVIII+) или на среде М9 с глицерином (для Е. coli BL21 (DE3)aph Vlll/pk25).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Фермент aphVIII опосредует устойчивость стрептомицетов к аминогликозидным антибиотикам - канамицину, неомицину, мономицину, -вследствие фосфорилирования этих антибиотиков в клетках. Ранее из генома актинобактерий Streptomyces rimosus был выделен ген aphVHI, клонирован в векторе рЕТ16Ь и экспрессирован в штамме Escherichia coli BL21(DE3) [Алексеева М.Г., Елизаров, 2010]. Устойчивость полученного штамма Е. coli к канамицину увеличилась с 0.5 до 300 мкг антибиотика на 1 мл среды. Также установлено повышение устойчивости бактерий к канамицину при активации эндогенных Са2+-зависимых СТПК и проведено

фосфорилирование aphVIII in vitro протеинкиназами экстрактов S. rimosus [Elizarov S.M., Sergienko O.V., 2005]. Определены потенциальные сайты фосфорилирования aphVIII: Ser-95, Ser-215, Ser-146 и Ser-160 и проведены замены каждого серинового остатка на нейтральный аланиновый. Обнаружено, что фосфорилирование только Ser-146 придает ферменту aphVIII 70% канамицин-киназной активности. Штамм Streptomyces lividans ТК 24(66) был трансформирован плазмидным вектором pSU23, несущим ген

aphVIII. Устойчивость к канамицину трансформантов S. lividans, содержащих ген aphVIII, увеличилась в 10 раз.

1. Са2+-зависимое фосфорилирование aphVIII in vitro протеинкиназами S. coelicolor A3(2).

Протеинкиназы в клеточном экстракте и суммарном препарате протеинкиназ S. lividans ТК24(66) фосфорилируют aphVIII с незначительной эффективностью. Поэтому дальнейшие опыты проводили с использованием экстрактов клеток S. coelicolor А3(2) - штамма, близкородственного S. lividans ТК24(6б). Использовали суммарный препарат протеинкиназ 5. coelicolor А3(2) из культур стационарной фазы, выращенных в присутствии Са2+, после инкубации с меченым АТФ. Обнаружили 9 меченых фосфопротеинов. Фосфорилирование 81-, 41- и 32- кДа белков стимулировалось Са2+. Для анализа фосфорилирования aphVIII in vitro был получен рекомбинантный белок HislO-aphVIII (Mr 306,25). Очищенный HislO-aphVIII инкубировали в присутствии и в отсутствии Са2+ с [у-32АТФ] и суммарным препаратом протеинкиназ культуры S. coelicolor А3(2), выращенной на средах с Са2+ и в отсутствии Са2+. Во всех случаях обнаружили один главный фосфопротеин с молекулярной массой около 31.5 кДа. Максимальное мечение исследуемого белка происходило в присутствии Са2+ в рабочей смеси, содержащей протеинкиназы из культур, выращенных в присутствии Са2+ в среде. Исключение Са2+ из среды для культивирования приводило к 2-кратному снижению активности СТПК (49.3±4%), фосфорилирующих aphVIII в клетках S. coelicolor A3(2). Исключение Са2+ из смеси для анализа активности СТПК снижало их активность по отношению к aphVIII еще в 2.5 раза (21.1±3%).

Таким образом, эндогенные СТПК S. coelicolor А3(2) фосфорилируют белок HislO-aphVIII, и фосфорилирование стимулируется ионами кальция.

Для идентификации СТПК их суммарный препарат разделяли в геле с предварительно полимеризованным в него белком ШвЮ-арЬУШ, ренатурировали киназы и инкубировали с меченым АТФ. Материал из зоны геля, содержащей меченые белки, экстрагировали и подвергали реэлектрофорезу. После этого анализировали фосфорилирование ШэЮ-арЬУШ. Анализ показал, что только в зоне киназы с молекулярной массой около 41 кДа после реэлектрофореза обнаруживается меченый компонент с молекулярной массой 31.5 кДа, соответствующий ЖзЮ-арЬУШ (Рис. I). Таким образом, доказано, что СТПК массой около 41кДа фосфорилирует белок арЬУШ.

I 2

рк 25

41 кДа *— арЬУШ 31.5 кДа ^

Рисунок 1. Фосфорилирование арЬУШ протсинкиначой рк25. 1 -окраска белков Кумасси. 2 - ауторадиограмма.

Для идентификации протеинкиназы был проведен биоинформатический анализ протеинкиназ 51. соеНсо!ог. Анализ молекулярных масс протеинкиназ (39 кДа, 53 кДа, 55 кДа, 58 кДа, 63 кДа, 64кДа, 71 кДа, 72 кДа, 74 кДа), в которых найдены потенциальные области связывания с Са2+ и кальмодулином, показал, что фосфорилировать белок арЬУШ может только протеинкиназа рк25 8С04778 (39 кДа) 5. соеИсо1ог АЗ (2).

2. Идентификация протеинкиназы, фосфорилирующей белок арИУШ в 5. 1Мс!ат арИУШ+.

Для идентификации протеинкиназы, фосфорилирующей белок арЬУШ в клетках 5. 1М<Лат аркУШ+, проведено сравнение гена рк25 Б. соеПсо/ог

А3(2) с геномом S. lividans ТК24(бб), и обнаружена киназа, гомологичная рк25 на 99.8%. Мы клонировали и секвенировали гены СТПК S. coelicolor A3(2) и S. lividans ТК24(66). В результате ПЦР-амплификации с тотальной ДНК S. coelicolor и S. lividans фрагменты соответствующих ДНК были клонированы в экспрессионный вектор рЕТ32а (по сайтам рестриктаз Hindlll и £coRI) и экспрессированы в Е. coli DH5a. После секвенирования ДНК-фрагменты идентифицировали как рк25. При сравнении генов рк25 S. coelicolor и S. lividans найдено 5 нуклеотидных замен. Данные замены не приводят к аминокислотным заменам в белковой последовательности. Таким образом, аминокислотные последовательности полноразмерного продукта гена рк25 S. coelicolor и S. lividans являются идентичными.

3. Клонирование и экспрессия нуклеотидной последовательности каталитического домена pk25 S. coelicolor в клетки Е. coli.

Для клонирования нуклеотидной последовательности каталитического домена рк25 были синтезированы два олигонуклеотида, которые содержали сайты для рестриктаз Nde I и Hindlll. Полученный в результате амплификации фрагмент клонировали в Е. coli DH5a в составе экспрессионного вектора рЕТ22Ь. Рекомбинантными плазмидами трансформировали штамм Е. coli BL21(DE3). Для изучения экспрессии каталитического домена протеинкиназы в клетках трансформантов проводили гель-электрофорез растворимой фракции клеточных белков в денатурирующих условиях. В качестве контроля использовали фракцию белков из клеток штамма Е. coli BL21(DE3), содержащих pET22b. В клетках Е. coli, содержащих плазмиду pET22b-pk25 (рис.2А) с последовательностью каталитического домена рк25, наблюдалась единственная по сравнению с контрольными клетками дополнительная фракция белка с молекулярной массой около 28 кДа (рис. 2Б). Эта величина соответствует расчетной молекулярной массе (27.8 кДа) каталитического домена pk25 S. coelicolor

А3(2). По данным сканирования, содержание белка в дополнительной фракции составляет до 3.5 % от суммарного белка.

Рисунок 2. А. Вектор, содержащий последовательность каталитического домена рк25. Б. Электрофорез растворимой фракции белков штамма E.coli BL21(DE3). I-маркеры, 2 - контроль (фракция белков штамма E.coli BL21(DE3) pET22b), 3-10 -клоны E.coli, содержащие плазмиду pET22b-pk25. ('-фракция, соответствующая каталитическому домену рк25).

4. Анализ аутофосфорилирования в активационной петле каталитического домена рк25.

Белковую фракцию каталитического домена рк25, клонированного и экспрессированного в клетках Е. coli, выделяли из лизата бактерий и анализировали его способность к аутофосфорилированию in situ. После электрофоретического разделения значение молекулярной массы анализируемого фрагмента составляло 28 кДа, что хорошо совпадает с расчетным значением для клонированного домена. В присутствии [у-,2Р]АТФ белок включает меченый фосфат. Полученные данные указывают на то, что выделенный каталитический домен рк25 является ферментативно активным и способен к аутофосфорилированию.

Таким образом, по крайней мере, одна СТПК S. lividans способна фосфорилировать белок aphVIII в клетках S. lividans TK24(66)aphVIII+ и данный штамм можно использовать как тест-систему для поиска ингибиторов СТПК.

5. Тест-система 5. ИШат ТК24(66)ар1гУШ+1СТПК.

Механизм действия тест-системы & \hndans ТК24(6б)арЬУ1П+/СТПК заключается в фосфорилировании некоторой СТПК белка арИУШ, который фосфорилирует и инактивирует канамицин. Следовательно, устойчивость к канамицину культуры, содержащей фосфорилированный арИУШ, возрастает. Добавление в тест-систему ингибитора СТПК приводит к снижению уровня фосфорилирования белка арИУШ, снижению его канамицин-киназной активности и уменьшению устойчивости клеток к канамицину (рис.3).

СИГНАЛ МЕМБРАНА

Рисунок 3. Механизм действия тест-системы .1.1тйапэ ТК24(66)ариУ111+1СТПК.

Анализировали влияние стандартных модуляторов активности СТПК, и веществ, изменяющих концентрацию ионов кальция или АТФ в клетках, на чувствительность штамма 5. Гшйат арИУШ+ к канамицину (рис.4). Тестирование испытуемых веществ (100 нмоль на диск), показало, что бис-индолилмалеимид I (бис-1) наиболее сильно понижает устойчивость клеток X 1Ыйат арИУШ+ к канамицину. Ингибиторы кальмодулина - прениламин лактат и хлорпромазин, а также ингибитор Са2+-каналов верапамил, достоверно уменьшали устойчивость бактерий к канамицину.

Bcpan.ir.uuj

4 .X

Бис-1 гк.ж.шицНн

К.1Н.1МИЦИН

Рисунок 4. Зоны нш нбированмя роста штамма S. Ividuns apliVIII+ под действием ингибитора СТПК -бис-индолилмалеимида I и блокатора кальциевых каналов верапамила.

В то же время, независимые от Са2+ активатор аденилатциклазы форсколин, ингибитор СТПК казеинового типа II - 5,6-дихлорбензилимидазолрибозид (ДРБ) и активатор циклоАМФ-зависимых СТПК - дибутирил-цАМФ не влияли на чувствительность клеток к канамицину. Понижение устойчивости клеток S. Ividans aphVIII+ к канамицину в присутствии ингибиторов Са2+-зависимого фосфорилирования белков и ингибитора синтеза АТФ указывает на возможное участие Са2+-зависимых СТПК в посттрансляционной регуляции активности белка aphVIII.

6. Скрининг потенциальных ингибиторов СТПК человека и бактерий.

В тест-системе S. lividans aphVIII+ тестировали 537 веществ различных химических классов (табл. 1). Класс индолилмалеимидов показал наибольший процент активных соединений - потенциальных ингибиторов СТПК человека и бактерий. 53 вещества, протестированных на 5. lividans aphVIII+, были проверены на панели эукариотических протеинкиназ in vitro. 44 из них показали активность как ингибиторы эукариотических протеинкиназ с различной степенью селективности. В большинстве случаев селективные ингибиторы СТПК в тест-системе S. lividans aphVIH+ показывают зоны ингибирования роста диаметром 9-11 мм. Вещества,

показывающие зоны более 12.5 мм, с большей вероятностью могут быть ингибиторами бактериальных СТПК.

Таблица 1. Скрининг потенциальных ингибиторов СТПК человека и бактерий.

Химический класс Количество тестированных веществ % активных веществ Перспективны как ингибиторы

Бензодиазины 10 3(30) СТПК человека

Бензофталазины 10 1(10) Наименее активный класс

Карбораны, замещенные 14 10(71) Новый перспективный класс

Цнклопентендионы, дигетарил-замещенные 271 34(12) СТПК человека и бактерий

Индолилмалеимиды 129 109 (85) Классические ингибиторы СТПК. СТПК человека и бактерий

Малеимиды, дигетарил-замещенные 6 5(83) СТПК человека

Пиридазины 2 1(50) СТПК человека

Пиразолы 29 9(31) СТПК человека

Хиноксалины 4 1(25) СТПК человека

Гиазолы 11 5(54) СТПК человека и бактерий

Гиазолы, дигетарил-замещенные 17 5(29) СТПК человека и бактерий

Гиазолтетразины 34 13 (38) СТПК человека

Итого 537 соединений

7. Конструирование тест-системы Е. coli ар It VIII/pk25.

В геноме Streptomyces coelicolor А(3) (NC_003888), близкородственном штамму Streptomyces lividans ТК24(66) (ACEY01000000), идентифицированы и аннотированы гены 34 СТПК. Как мы установили, одна из них -протеинкиназа рк25 (код доступа NCBI Reference Sequence: Protein NP 628936.1) - способна фосфорилировать aphVIII. Возможно, другие СТПК также участвуют в фосфорилировании белка aphVIII. Для исключения неспецифического действия ингибиторов на другие СТПК Streptomyces lividans ТК24(бб), предположительно способные фосфорилировать aphVIII, сконструирована тест-система на основе фермента aphVIII и каталитического

домена протеинкиназы pk25 в штамме Е. coli. Отсутствие в Е. coli СТГЖ эукариотического типа делает тест-систему более чувствительной и позволяет отбирать ингибиторы, специфичные к рк25 и ее близким гомологам.

7.1. Модификация области S-146 белка aphVIIl - сайта фосфорилирования протеинкиназой рк25.

По литературным данным, исследование фосфорилирования серин/треониновых протеинкиназ М. tuberculosis показало, что 10 из 11 киназ аутофосфорилируются по остаткам треонина и серина, располагающимся в активационной петле каталитического домена СТПК. Аминокислотные замены Thr на Ala в активационной петле приводили к 300-кратному уменьшению киназной активности протеинкиназы pknB [Durán R., Villarino А., 2005]. Сайт аутофосфорилирования в активационной петле протеинкиназы pk25 S. coelicolor был определен путем сравнения с соответствующим районом pknB М. tuberculosis:

pknB DFGI ARAIAD SGN^VTQIAAVGTAQYLSPE рк25 DFGV AQVAGA TTLTESGJ|FVGSPEYTAPE

Для оптимизации конструкции тест-системы Е. coli aphVllI/pk25 мы провели модификацию потенциального сайта фосфорилирования AVAEGSneVDLED в активационной петле aphVIIl. Целью было приблизить сайт Ser-146 aphVIIl по своей структуре к сайту аутофосфорилирования киназы рк25. Для этого проведены модификации окружения Ser-146 фермента aphVIIl. Полученные мутантные варианты гена aphVIIl вводили в вектор pETlób и клонировали в штамм Е. coli DH5a. Рекомбинантными плазмидами pETlóbaphVlIIml (рис. 6) трансформировали штамм Е. coli BL21(DE3). В клетках Е. coli, содержащих плазмиды pETlóbaphVlIIml, экспрессировапись белки с молекулярной массой около 31 кДа, что соответствует расчетной молекулярной массе белка aphVIIl (31.5 кДа).

рЕПЯирМЛП ml 4 »■

Cotei pBR322origin ■

.S. ftdKlf

\ V(\nai4 |

Рисунок 6. Векторные конструкции, содержащие: а - модифицированные гены aphVIII: aphVIII146-1, aphVIII146-2, aphVIII 146-3, aphVlI1146-S, б - ген pk25 и модифицированные гены aphVIII.

7.2. Создание конструкции, содержащей гены aphVIII ирк25.

Амплификацию нуклеотидной последовательности каталитического домена рк25 проводили с помощью праймеров Pk25NBgl и Pk25CBgl, с ДНК плазмидного вектора pET22b-pk25. Праймер Pk25NBgl содержит сайт связывания с рибосомой (RBS) и кодон atg для нуклеотидной последовательности каталитического домена рк25. В плазмидные векторы pETlôbaphVIIIml, содержащие описанные ранее варианты aphVIII, лигировали по сайту BamHI амплифицированную и рестрицированную по сайту Bglll последовательность рк25. Отбирали клоны с требуемой J ориентацией фрагментов амплификацией с праймеров AphN и Рк25СС, ориентируясь на величину вставки. Полученными плазмидами рЕТ16АРС (рис.66) трансформировали штамм Е. coli BL2I(DE3). В индуцирующих | условиях проверяли экспрессию генов aphVIII и рк25 посредством гель- I электрофореза. Во всех вариантах были видны дополнительные фракции, j соответствующие по молекулярным массам белкам рк25 и aphVIII. Масс- | спектроскопическое исследование показало, что более тяжелая фракция j содержит аминокислотную последовательность aphVIII ( gi| 10242466

aminoglycoside-O-phosphotransferase VIII). Более легкая фракция содержит аминокислотную последовательность, соответствующую каталитическому домену pk25 (gi|21223157 serine/threonine protein kinase Streptomyces coelicolor A3(2)).

7.3. Анализ устойчивости к канамицину клеток Е. coli BL21 (DE3), содержащих модификации гена aph VIII и их комбинации с геном рк25.

У всех созданных конструкций был исследован уровень устойчивости к канамицину (табл. 2). Штамм BL21 (DE3), содержащий плазмиду рЕТ16Ь с геном aphVIII (исходный вариант), был устойчив к канамицину (325 мкг/мл).

Замены, произведенные в варианте aphVIII146-l, снижали устойчивость к канамицину на 48%. У варианта aphVIII 146-2 устойчивость снижалась на 54%. Уровень устойчивости варианта aphVIII 146-3 с заменой Ser-146 на Thr-146 не изменялся. В случае замены Ser-146 на А1а-146 (aphVIII 146-4), т.е. полной инактивации сайта фосфорилирования Ser-146, уровень устойчивости к канамицину падал на 70%.

Все конструкции aphVIII с рк25 обладали более высокой активностью. Устойчивость к канамицину возрастала на 91% в случае aphVIII146-l/pk25, на 83% в случае aphVIII 146-2/pk25, на 23% при замене Ser-146 на Thr-146 и в случае с диким типом aphVIII - aphVHI/pk25 (табл. 2).

Таблица 2. Устойчивость к канамицину клеток E.coli BL21(DE3), содержащих различные варианты гена aphVIII.

Название Модифицированные конструкты белка aphVIII в области S-146 Устойчивость к канамицину трансформантов E.coli, мкг/мл

aphVIII aphVIII+pk25

146-S AVAEGS146VDLED 325±5 400±10

146-1 АУАТСТцб VSLED 170±10 325±5

146-2 A VATG S иб VSLSD 150±10 275±10

146-3 AVAEGTiWVDLED 325±5 400±10

146-4 AVAEGAuiVDLED 100±5 -

7.4. Выбор и валидация тест-системы Е. coli aphVIII/pk25.

Принципиально важным при создании новой тест-системы Е. coli aphVIII/pk.25 является диапазон изменений устойчивости к канамицину, определяемый конструкциями, содержащими только aphVHI и aphVIIl/pk25. Наибольшая разница устойчивости к канамицину наблюдается у варианта 146-1. Поэтому для тест-системы нами выбрана конструкция Е. coli aph Villi 46-1/рк25.

Для валидации тест-системы Е. coli aphVIII146-l/Pk25 были использованы ранее описанные ингибиторы СТПК класса индолилмалеимидов: LCTA-1385, LCTA-1398, LCTA-1425 и Bis-1. Все исследованные вещества снижают уровень устойчивости к канамицину.

Активный Bis-t

• V

Рисунок 7. Тест-система Е.соИ арЬУ1П/Рк25 для скрининга ингибиторов СТПК. Валидация тест-системы с использованием классического ингибитора В18-1 и неактивного аналога добавление В1$-1 к канамицину приводит к увеличению диаметра зоны роста, добавление не изменяет диаметр зоны.

Bis-5 Bis-!

+ Канэмицин + Кэмамицин

Вещества из библиотеки класса индолилмалеимидов LCTA-1033, LCTA-1196, Bis-5 (Рис. 7), не проявляющие активности в тест-системе 5. lividans TK24(66)aphVIII+/CTllK, не дают позитивного результата и в тест-системе Е. coli aphVIll 146-l/pk25, что подтверждает адекватность использованной тест-системы.

8. Возможности использования тест-системы Е. coli aphVIII 146-1/рк25 для скрининга ингибиторов СТПК.

Сконструированная тест-система может быть использована для первичного отбора (прескрининга) АТФ-конкурентных низкомолекулярных

ингибиторов [Cohen Р., 2002], способных диффундировать в агаризованной среде через клеточную стенку Е. coli и взаимодействовать с аденин-связывающим карманом каталитического домена киназы рк25. Селективность отбираемых ингибиторов будет определяться сродством лигандов ингибитора к аминокислотам аденин-связывающего кармана протеинкиназы. Известно, что идентичность функционально сходных аминокислотных последовательностей позволяет предполагать сходство их пространственной структуры, в том числе лиганд-связывающих карманов, отвечающих за селективность ингибиторов [Wehenkel А., Fernandez Р., 2006; Scherr N., Honnappa S., 2007]. Сравнение аминокислотных последовательностей каталитического домена рк25 с каталитическими доменами бактериальных СТГЖ, в том числе патогенных микроорганизмов с помощью Genomic BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom table.cgp. позволяет выявить 13 белков с идентичностью более 35%. Среди них присутствуют представители СТГЖ Mycobacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas. Аналогичное сравнение с СТПК человека выявляет 19 белков с идентичностью более 30%. Среди них имеются протеинкиназы семейств SAD, BR, NUAK (SNF), DAPK3, PNCK, САМК2, САМК1, Zip, РКА, HUNK, РАК2, Mark-PARl, SIK2, ОРК NimA. В лаборатории генетики микроорганизмов проведена классификация СТПК грам-положительных бактерий [Zakharevich N.V., Osolodkin D.I., 2010], основанная на физико-химических свойствах боковых цепей 9 вариабельных аминокислот аденин-связывающего кармана каталитического домена. В настоящей работе мы использовали этот критерий для выбора СТПК патогенных бактерий и человека, которые могут модулироваться ингибиторами, отобранными в тест-системе E.coli aphVHI/pk25. В таблице 3 представлены 9 из 13 потенциальных лиганд-связывающих последовательностей СТПК патогенных бактерий и 6 из 19 последовательностей СТПК человека.

Таблица 3. Лиганд-связывающие аминокислоты аденинового кармана СТПК бактерий и человека.

Протеинкнназа Функции, связанные с физиологией и патогенезом. Аминокислоты аденинового кармана Существенност замен

СТПК бактерий

pk25 Str.coelicolor Модуляция устойчивости арЬ гена LVAVMLVLT Оригинал

pknA M.tuberculosis Синтез клеточной стенки IVAIMLVLT Несущественна

pknj M.tuberculosis Персистенция в организме хозяина LVAIMFVLS Несущественна

stkl S.agalactiae Регуляция клеточной сегрегации ОВБ и вирулентности IVAIMYVLT Несущественна

stkP S.pneumonia Участок сигнального пути, вовлеченного в патогенез пневмонии. IVAIMYVLT Несущественна

sp-stk S.pyogenes Деление клетки, участие в вирулентности IVAIMYVLT Несущественна

ppkA P.aeruginosa Регуляция экспрессии фактора вирулентности LVATMYLLS Существенна

pknB/stkl S.aureus subsp. aureus Регуляция пуринового биосинтеза, аутолиза, процессов центрального метаболизма LVAIMYILE Существенна

pknB M.tuberculosis Деление клетки, ингибирование слияния лизосом LVAIMYVMM Существенна

СТПК человека

РКА Аллергия, болезни миокарда LVALMYVLT Несущественна

CaM kinase ID Диабет II типа LVAIMLVLS Несущественна

Pac2 Заболевания клеток эпидермиса по действием УФ IVAIMYLLT Несущественна

BR kin 1 Регуляция клеточного гомеостаза LVAVLHVLA Существенна

NUAK SNF1-11 Индукция "ШРа1р11ав нормальных и раковых клетках LVAIMYALA Существенна

CaMKII Индукция долговременной синаптической памяти LVAIMYALA Существенна

Критерием отбора служило наличие не более 4 аминокислотных замен

из 9 в положениях вариабельных аминокислот в аденин-связывающем

кармане pk25 S. lividans (S. coelicolor) LVAVMLVLT (табл. 3).

Существенными считали замены неполярных аминокислот на полярные в первых 4-х и 8-м положениях (=); все замены, кроме подобной аминокислоты на подобную - в девятом положении (=), любые замены в 5-м положении (gatekeeper) - (_). Замены в положении 6 (зона шарнира) и 7 менее существенны (-). Наличие несущественных замен не изменяет характер взаимодействия ингибиторов с аденин-связывающей последовательностью протеинкиназы. Поэтому рк25 может служить основой для отбора ингибиторов 5 из 13 СТПК патогенных бактерий и 3 из 19 СТПК человека. Таким образом, сконструированная тест-система может быть использована для прескрининга ингибиторов СТПК патогенных микроорганизмов, например pknA, pknJ М. tuberculosis, stkP Streptococcus pneumonia, sp-stk Streptococcus piogenes, а также некоторых СТПК человека, например, протеикиназы А и казеинкиназы 1.

ВЫВОДЫ

1. Установлено фосфорилирование аминогликозидфосфотрансферазы VIII протеинкиназами S. coelicolor А3(2), и идентифицирована одна из них -серин/треониновая протеинкиназа эукариотического типа рк25.

2. Идентифицирована протеинкиназа, фосфорилирующая aphVIII в клетках S. lividans ТК24(бб). Клонирована и экспрессирована в клетках Е. coli BL21 (DES) нуклеотидная последовательность каталитического домена киназы рк25, показана его способность к аутофосфорилированию in vitro.

3. Валидирована тест-система S. lividans ТК24 (66) aphVUI+ICTFlKи проведен скрининг более 500 веществ различных химических классов -потенциальных ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ.

4. Сконструирована и валидирована тест-система E.coli BL21(DE3) aphVIII/ pk 25.

5.0пределены возможности использования тест-системы E.coli BL21 (DE3)aphVIII/pk25. Данная тест-система позволяет проводить отбор ингибиторов СТПК человека и бактерий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Danilenko V.N., Elizarov S.M., Bekker О.В., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N. Streptomyces: Novel Test Systems for Mechanism-Based Drug Design // 10th Int. Symp. "Genetics of industrial Microorganisms", Praque, Czech Republic, 2006, P. 221.

2. Алексеева М.Г., Беккер О.Б., Елизаров C.M., Серегина Т.А., Даниленко В.Н. Клонирование, экспрессия в Е. coli и структурно-функциональная характеристика серин/треониновых протеинкиназ Streptomyces // Материалы 3-ей международной научно-практической школы-конференции МЕДБИОТЕК «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине» 2006г. Москва, С.8-9.

3. Беккер О.Б., Елизаров С.М., Алексеева М.Т., Любимова И.К., Даниленко

B.Н. Са2+ - зависимая модуляция устойчивости к антибиотикам у Streptomyces lividans 66 и Streptomyces coelicolor А3(2) // Микробиология. 2008 ,1.11. 5. С.630-638.

4. Danilenko V.N., Simonov A.Y., Lakatosh S.A., Kubbutat M.H.G., Totzke F„ Schachtele C., Elizarov S.M., Bekker O.B., Printsevskaya S.S., Luzikov Y.N., Reznikova M.I., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N. Search for inhibitors of bacterial and human protein kinases among derivatives of diazepines[l,4] annelated with maleimide and indole cycles // J. Med. Chem. 2008. V.51, P.7731-7736.

5. Беккер О. Б., Алексеева М. Г., Осолодкин Д. И. Палюлин В. А., Елизаров

C. М., Зефиров Н.С., Даниленко В. Н. Новая тест-система для скрининга ингибиторов серин-треониновых протеинкиназ: конструкт Escherichia coli aphVIII/pk25 // ActaNature 2010, T.2 №3(6), C.126-39.

6. Беккер О. Б., Алексеева М. Г., Елизаров С. М., Даниленко В. Н. Новая тест-система для скрининга ингибиторов серин-треониновых протеинкиназ: Escherichia coli aphVIII/pk25 // Конгресс ЕвразияБио-2010, С.24-26.

Подписано в печать: 15.03.2011

Заказ №124 Тираж - 70 экз Печать лазерная Типография «Копимастер» ИНН 7706737529 119049, г. Москва, Калужская пл. д.1, корп.1 (495)229-56-62 www.copymaster.biz

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Беккер, Ольга Борисовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1.

Протеинкиназы.

1.1. Характеристика некоторых серин/треониновых протеинкиназ человека и бактерий.

1.1.1. Функции некоторых серин/треониновых протеинкиназ человека.

1.1.2. Функции некоторых бактериальных серин/треониновых протеинкиназ.

1.2. Классификация прокариотических протеинкиназ, осуществленная для выяснения потенциальной биологической активности киназ.

1.3. Структура серин/треониновых протеинкиназ эукариотического типа

1.4. Ингибиторы протеинкиназ.

1.5. Классификация прокариотических протеинкиназ, основанная на селективных профилях ингибиторов протеинкиназ.

1.6. Серин/треониновые протеинкиназы Б^ерШтусея соеНсо1ог.

1.7. Клонирование и гетерологичная экспрессия генов серин/треониновых-протеинкиназ Б^ер^тусез в клетках Е.соН.

1.8. Кальций-зависимые серин/треониновые протеинкиназы Бр-ерготусеБ

1.9. Области взаимодействия с ионами кальция у кальций-связывающих белков бактерий.

Глава 2. Бактериальные аминогликозидфосфотрансферазы (арЬ).

2.1. Механизм действия аминогликозидфосфотрансфераз.

2.2. Структура аминогликозидфосфотрансфераз.

2.3.Характеристика аминогликозидфосфотрансферазы арЬУШ

Б^ерЮтусея птозиэ.

Глава 3. Биологические тест-системы.

Глава 4. Материалы и методы.

4.1. Бактериальные штаммы, среды, антибиотики, модуляторы активности СТПК.

4.2. Праймеры, использованные в работе.

4.3 Процедуры молекулярного клонирования и амплификации.

4.4. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE).

4.5. Получение экстрактов клеток Streptomyces и Е. coli.

4.6. Афинное выделение протеинкиназ.

4.7. Очистка белка aphVIII в нативном виде.

4.8. Анализ фосфорилирования белка aphVIII in vitro.

4.9. Фосфоаминокислотный анализ.

4.10. Анализ протеинкиназ в геле.

4.11. Выделение клонированного в Е. coli каталитического домена протеинкиназы рк25.

4.12. Анализ аутофосфорилирования выделенного белка каталитического домена рк25.

4.13. Процедура клонирования в экспрессионные вектора рЕТ32а, рЕТ22Ь и рЕТ16Ь и конструирование рекомбинантных плазмид.

4.14. Процедура сайт-направленного мутагенеза области Ser-146 аминогликозидфосфотрансферазы aphVIII.

4.15. Определение уровня устойчивости к канамицину трансформантов E.coli BL21(DE3), содержащих гены aphVIII ирк25.

4.16. Методика определения активности ингибиторов протеинкиназ в бактериальной тест-системе.

Глава 5. Результаты и обсуждение.

5.1 Характеристика аминогликозидфосфотрансферазы VIII (aphVIII).

5.2. Характеристика серин/треониновой протеинкиназы рк25 в S. lividans ТК24(66) и S. coelicolor A3(2).

5.2.1. Идентификации протеинкиназы, фосфорилирующей белок aphVIII в штамме S. lividans aphVIII+.

5.2.2. Клонирование и экспрессия нуклеотидной последовательности каталитического домена протеинкиназы рк25 штамма S.coelicolor A3(2) в клетки Е. coli в экспрессионном векторе рЕТ22Ь.

5.2.3. Анализ аутофосфорилирования в активационной петле каталитического домена протеинкиназы рк25.

5.3. Тест-система S. lividans ТК 24 (66) aph УШ+ЮТПК.

5.3. 1. Механизм действия тест-системы. ç>g

5.3.2. Валидация тест-системы S. lividans ТК 24 (66) aphVIII+ICTIIK. gg

5.3.3. Скрининг потенциальных ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ человека и бактерий. ^qj

5.4. Конструирование тест-системы E.coli aphVIII/pk 25. ^

5.4.1. Модификация области S-146 аминогликозидфосфотрансферазы aphVIII - сайта фосфорилирования киназой рк25. ^^

5.4.2. Создание конструкции, содержащей гены aphVIIIvi протеинкиназы рк25.

5.4.3. Анализ уровня устойчивости к канамицину клеток Е. coli BL21 (DES), содержащей различные модификации гена aphVIII и их комбинации с геном рк25.

5.5. Выбор и валидация тест-системы Е. coli aphVIII/pk25.

5.6. Потенциальные возможности использования тест-системы Е. coli aph Villi 46- 1/рк25 для скрининга ингибиторов СТПК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание бактериальной тест-системы для скрининга ингибиторов протеинкиназ на основе генов фосфотрансфераз"

Серин/треониновые протеинкиназы (СТПК) — универсальные регуляторы клеточного метаболизма эукариот [Manning G., Whyte D.B.,2002., Cohen P. 2002, Levitzki A. 2003]. Им также принадлежит ключевая роль в контроле таких процессов, как апоптоз, пролиферация и дифференцировка клеток, транспорт веществ из клетки и др. Нарушение функционирования киназ ассоциировано с развитием таких заболеваний человека, как диабет [D'Alessandris С., Lauro R., 2007], шизофрения [Barbier Е., Zapata А., 2007], сердечно-сосудистые расстройства [Shirai Н., Autieri М., 2006], канцерогенез [Collins I., Workman P.,2006] и нарушения иммунитета [Ishida A., Kameshita I., 2007]. В последние десятилетия интенсивное развитие получил биомишень-направленный поиск модуляторов (ингибиторов) протеинкиназ как потенциальных лекарственных препаратов нового поколения [Goldstein D.M., Gray N.S., 2008; Bain J., Plater L., 2007; Liu Y., Gray N.S., 2006].

Серин/треониновые протеинкиназы эукариотического типа обнаружены у бактерий, включая патогенные для человека [Shi L., Potts М., 1998; Pereira S. F., Dworkin J., 2011]. Установлено, что СТПК участвуют в формировании вирулентности, бактериальных биопленок, поддержании толерантности, персистирования патогенных микроорганизмов. Показано ключевое значение СТПК в формировании вирулентности Streptococcus pneumonia, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и ряда других патогенных бактерий [Shi L., Potts M., 1998; Echenique J., Kadioglu A., 2004; Cozzone A.J. 2005]. Установлено их участие в модуляции устойчивости к антибиотикам у М. tuberculosis [Perez J., Garcia R., 2006]. В последнее время проводится интенсивная работа по скринингу ингибиторов СТПК [Drews S.J., Hung F., 2005; Wehenkel A., Bellinzoni M., 2007; Wäczek F., Szabadkai I., 2008]. Одна из основных современных задач фармацевтики состоит в обнаружении высокоспецифичных терапевтических мишеней, позволяющих разрабатывать новые лекарственные средства. Выявление наиболее подходящих, связанных с болезнями мишеней является определяющим для уменьшения времени и финансовых затрат при разработке новых лекарств. Особое значение при этом придают разработке высокопродуктивного скрининга лекарственных препаратов как определяющего обнаружение перспективных терапевтических средств. Проведение массового скрининга потенциальных ингибиторов протеинкиназ на лабораторных автоматических станциях экономически невыгодно. К недостаткам существующих клеточных тест-систем на основе трансформированных или опухолевых линий человека относятся отсутствие стабильных соответствующих нормальных клеточных линий человека, нестандартность и недоступность первичных культур специализированных клеточных линий человека, ограниченные возможности генно-инженерных манипуляций. Проведение массового скрининга потенциальных лекарств на млекопитающих представляется неэффективным по скорости и стоимости. Первоначальный отбор потенциальных ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ (прескрининг) должен проводиться на тест-системах, обеспечивающих чувствительный, быстрый и дешевый скрининг будущих лекарств.

Цель работы: изучение возможности использования фермента аминогликозидфосфотрансферазы типа VIII актинобактерий, определяющего устойчивость к антибиотикам, и фосфорилирующих его серин/треониновых протеинкиназ при создании оригинальных тест-систем для скрининга лекарственных средств нового поколения, разработка эффективной оригинальной тест-системы на основе фермента аминогликозидфосфотрансферазы типа VIII актинобактерий, и фосфорилирующих его серин/треониновых протеинкиназ - целевых биомишеней для искомого лекарственного препарата - для скрининга ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ.

Задачи:

1. Охарактеризовать компоненты тест-системы. Для этого: провести фосфорилирование фермента aphVIII in vitro протеинкиназами S. coelicolor A3(2). идентифицировать протеинкиназу S. coelicolor A3(2), фосфорилирующую aphVIII.

- идентифицировать протеинкиназу, фосфорилирующую aphVIII в S. lividans aphVIII+. провести клонирование и экспрессию нуклеотидной последовательности каталитического домена pk25 S.coelicolor в клетки Е. coli.

- провести аутофосфорилирование каталитического домена рк25.

2. Валидировать тест-систему S. lividans TK24(66)aphVIII+/CTIIK.

3. Провести скрининг потенциальных ингибиторов протеинкиназ человека и бактерий.

4. Сконструировать тест-систему E.coli aphVIII/pk25. Для этого:

- модифицировать область S-146 аминогликозидфосфотрансферазы VIII -сайт фосфорилирования киназой рк25.

- создать экспрессионную конструкцию, содержащую ген aphVIII с модифицированным сайтом фосфорилирования и нуклеотидную последовательность каталитического домена киназы рк25.

5. Валидировать тест-систему E.coli aphVIII/pk25 и определить потенциальные возможности использования тест-системы E.coli aphVIII/pk25.

Научная новизна работы. Впервые показано фосфорилирование аминогликозидфосфотрансферазы VIII протеинкиназами S. coelicolor A3(2) и идентифицирована протеинкиназа рк25, фосфорилирующая aphVIII. Впервые обнаружена протеинкиназа, фосфорилирующая aphVIII в S. lividans ТК24(бб), в результате проведенных исследований показана ее способность к аутофосфорилированию in vitro. Используя уникальные свойства полученных молекул, впервые проведен анализ более 500 веществ различных химических классов - потенциальных ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ в тест-системе S. lividans TK24(66)aph VIII+/СТПК и отобраны вещества, впоследствии показавшие себя селективными ингибиторами эукариотических СТПК. Впервые показана возможность создания тест-систем на основе аминогликозидфосфотрансферазы VIII и серин/треониновых протеинкиназ и создана бактериальная тест-система, содержащая два компонента: фермент аминогликозидфосфотрансферазу VIII, определяющий устойчивость к антибиотикам, и серин/треониновую протеинкиназу, фосфорилирующую аминогликозидфосфотрансферазу VIII.

Практическая значимость.

Впервые создана бактериальная тест-система, включающая фермент аминогликозидфосфотрансферазу VIII и серин/треониновую протеинкиназу, фосфорилирующую aphVIII, как целевую биомишень для искомого лекарственного препарата. Добавление в тест-систему ингибитора СТПК приводит к снижению ее активности относительно аминогликозидфосфотрансферазы VIII и, как следствие, аминогликозидкиназной активности в отношении антибиотика канамицина, что позволяет отбирать эффективные ингибиторы СТПК. Сконструированные оригинальные тест-системы позволяют проводить эффективный скрининг ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ для идентификации и последующей разработки новых лекарственных препаратов. Созданные тест-системы являются важным элементом усовершенствования в технологической платформе скрининга ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Беккер, Ольга Борисовна

Выводы.

1. Установлено фосфорилирование аминогликозидфосфотрансферазы VIII протеинкнназамн S. coelicolor A3(2) и идентифицирована одна из них -серин/треониновая протеинкиназа эукариотического типа рк25.

2. Идентифицирована протеинкиназа, фосфорилирующая белок aphVIII в S. lividans ТК24(66). Клонирована и экспрессирована в Е. coli BL21 (DE3) нуклеотидная последовательность каталитического домена рк25 и показана его способность к аутофосфорилированию in vitro.

3. Валидирована тест-система S. lividans TK24(66)aph УШ+/СТПК и проведен скрининг 537 веществ различных химических классов -потенциальных ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ в тест-системе S. lividans TK24(66)aph VIII+ICTIIK.

4. Сконструирована и валидирована тест-система E.coli BL21 (DE3)aphVIII/ pk25.

5. Определены потенциальные возможности использования тест-системы E.coli BL21(DE3)aphVIII/pk25. Данная тест-система позволяет проводить отбор ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ человека и бактерий.

Заключение.

Разработаны оригинальные тест-системы для скрининга ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ на основе штамма S. lividans aphVIII+ и Е. coliaphVIII/pk25.

Фосфорилирование фермента аминогликозидфосфотрансферазы VIII (aphVIII), инактивирующего аминогликозидные антибиотики, протеинкиназами, в частности протеинкиназой рк25, увеличивает устойчивость бактерии к антибиотику канамицину. Ингибиторы протеинкиназ, напротив, снижают резистентность клеток бактерий к нему. Тест-система S. lividans ТК 24 (66) aphVIII+/CTIJK, валидированная с помощью известных модуляторов активности специфических серин/треониновых протеинкиназ, позволила отобрать селективные ингибиторы эукариотических протеинкиназ РКСа, Pim, CDK. Получены модификации белка aphVIII, в которых фосфорилируемый рк25 киназой в aphVIII Ser-146 включен в каноническую последовательность аутофосфорилирования pk25 S. coelicolor. Модифицированные и исходный гены aphVIII клонированы в Е. coli одновременно с нуклеотидной последовательностью каталитического домена рк25 каждый. При экспрессии этих генов в клетках происходит накопление кодируемых ими белков. Выделенный каталитический домен рк25 сохраняет киназную активность полноразмерной протеинкиназы. Варианты Е. coli, содержащие одновременно гены aphVIII и рк25, имеют более высокий уровень устойчивости к канамицину, чем варианты, несущие только ген aphVIII. Ингибиторы протеинкиназ класса индолилмалеимидов подавляют активность рк25 и понижают устойчивость клеток к канамицину.

Разработанная оригинальная тест-система может быть использована для первичного отбора АТР-конкурентных низкомолекулярных ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ бактерий и человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Беккер, Ольга Борисовна, Москва

1. Adindla S., Inampudi K.K., Guruprasad К., Guruprasad L. Identification and analysis of novel tandem repeats in the cell surface proteins of archaeal and bacterial genomes using computational tools. Comp Funct Genomics. 2004, V.5: P.2-16.

2. Ambudkar S.V., Kim I.W., Sauna Z.E. The power of the pump: mechanisms of action of P-glycoprotein (ABCB1). Eur J Pharm Sci. 2006 Apr;27(5): P.392-400.

3. Aravind L., Ponting C.P. The GAF domain: an evolutionary link between diverse phototransducing proteins. Trends Biochem Sci. 1997, V.22: P.458-459.

4. Aramburu J., Heitman J., Crabtree G.R. Calcineurin: a central controller of signalling in eukaryotes. EMBO reports. 2004,V. 5, N 4.

5. Av-Gay Y., Everett M. The eukaryotic-like Ser/Thr protein kinases of Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiol. 2000, V.8: P.238-244.

6. Av-Gay Y., Jamil S., Drews S.J. Expression and characterization of the Mycobacterium tuberculosis serine/threonine protein kinase PknB. Infect Immun. 1999, Nov;67(ll): P.5676-82.

7. Azucena E., Mobashery S. Aminoglycoside-modifying enzymes: mechanisms of catalytic processes and inhibition. Drug Resist Updat. 2001, Apr;4(2): P. 106-17.

8. Bain J., Plater L., Elliott M., Shpiro N., Hastie C.J., McLauchlan H., Klevernic I., Arthur J.S., Alessi D.R., Cohen P. The selectivity of protein kinase inhibitors: a further update. Biochem. J. 2007, V.408. P. 297-315.

9. Barbier E., Zapata A., Oh E., Liu Q., Zhu F., Undie A., Shippenberg Т., Wang J.B. Supersensitivity to Amphetamine in Protein Kinase-C Interacting

10. Protein/HINTl Knockout Mice. Neuropsychopharmacology. 2007, Aug;32(8): P.1774-1782.

11. Banu L.D., Conrads G., Rehrauer H., Hussain H., Allan E,. van der Ploeg J.R. Streptococcus mutans serine/threonine kinase PknB regulates competence development, bacteriocin production and cell-wall metabolism. Infect Immun. 2010 May;78(5): P.2209-2220.

12. Bateman A., Murzin A.G., Teichmann S.A. Structure and distribution of pentapeptide repeats in bacteria. Protein Sci. 1998, V.7: P.1477-1480.

13. Baumann U., Wu S., Flaherty K.M., McKay D.B. Three-dimensional structure of the alkaline protease of Pseudomonas aeruginosa: a two-domain protein with a calcium binding parallel beta roll motif. EMBO J. 1993, Sep;12(9): P.3357-3364.

14. Bentley S.D., Chater K.F., Cerdeno-Tarraga A.M., Challis G.L., Thomson N.R., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 2002, V.417: P.141-147.

15. Boch J., Nau-Wagner G., Kneip S., Bremer E. Glycine betaine aldehyde dehydrogenase from Bacillus subtilis: characterization of an enzyme required for the synthesis of the osmoprotectant glycine betaine. Arch Microbiol. 1997, Oct; 168(4): P.282-289.

16. Boudsocq M., Willmann M.R., McCormack M., Lee H., Shan L., He P., Bush J., Cheng S.H., Sheen J. Differential innate immune signalling via Ca(2+) sensor protein kinases. Nature. 2010, Mar 18;464(7287): P.418-422.

17. Bourn W.R., Babb B. Computer assisted identification and classification of streptomycete promoters. Nucleic Acids Res. 1995, Sep 25;23(18), P.3696-3703.

18. Bradford M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 1976, Y.72: P.248-254.

19. Brettar I., Christen R., Hofle M.G. Shewanella denitrificans sp. nov., a vigorously denitrifying bacterium isolated from the oxic-anoxic interface of the Gotland Deep in the central Baltic Sea. Int J Syst Evol Microbiol. 2002, V.52: P.2211-2217.

20. Bridges A J. Chemical inhibitors of protein kinases. Chem Rev. 2001, Aug; 101(8): P.2541-2572.

21. Brown-Elliott B.A., Wallace R.J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clin Microbiol. 2002, Rev 15: P.716-746.

22. Bruns R.F., Miller F.D., Merriman R.L., Howbert J.J., Heath W.F., Kobayashi E.,Takahashi I., Tamaoki T., Nakano H. Inhibition of protein kinase C by calphostin C is light-dependent . Biochem Biophys Res Commun. 1991, Apr 15;176(1): P.288-293.

23. Burk D.L., Hon W.C., Leung A.K., Berghuis A.M. Structural analyses of nucleotide binding to an aminoglycoside phosphotransferase. Biochemistry. 2001, Jul 31;40(30): P.8756-8764.

24. Cerdeno-Tarraga A.M., Efstratiou A., Dover L.G., Holden M.T., Pallen M., et al. The complete genome sequence and analysis of Corynebacterium diphtheriae NCTC13129. Nucleic Acids Res 2003, V.31: P.6516-6523.

25. Chaurasiya S.K., Srivastava K.K. Downregulation of protein kinase C-alpha enhances intracellular survival of Mycobacteria: role of PknG. BMC Microbiol. 2009 Dec 24; V.9:P.271.

26. Chen L., Brugger K., Skovgaard M., Redder P., She Q., et al. The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota. J Bacteriol. 2005, V. 187: P .4992-4999.

27. Chen C., Gao M., Liu J., Zhu H. Fungal symbiosis in rice requires an ortholog of a legume common symbiosis gene encoding a Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase. Plant Physiol. 2007, Dec;145(4): P.1619-1628.

28. Cohen P. Protein kinases—the major drug targets of the twenty-first century? Nat Rev Drug Discov. 2002, Apr;l(4): P.309-315.

29. Cole S.T., Brosch R., Parkhill J., Gamier T., Churcher C., et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature. 1998, V.393: P.537-544.

30. Collins I., Workman P. Chemical inhibitors of protein kinases .Nat. Chem. Biol. 2006, V.2: P.689-700.

31. Cowley S., Ko M., Pick N., Chow R., Downing K.J., et al. The Mycobacterium tuberculosis protein serine/threonine kinase PknG is linked to cellular glutamate/glutamine levels and is important for growth in vivo. Mol Microbiol. 2004, V.52: P.1691—1702.

32. Cozzone A.J. Role of protein phosphorylation on serine/threonine and tyrosine in the virulence of bacterial pathogens. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2005, V.9. P. 198-213.

33. D'Andrea L.D., Regan L. TPR proteins: the versatile helix. Trends Biochem Sci.2003 V.28: P.655-662.

34. Danilenko V.N., Mironov V.A., and Elizarov S.M. Calcium as a regulator of intracellular processes in actinomycetes: Prikl Biokhim Mikrobiol. 2005, V.41: P.363-375.

35. Dasgupta A., Datta P., Kundu M., Basu J. The serine/threonine kinase PknB of Mycobacterium tuberculosis phosphorylates PBPA, a penicillinbinding protein required for cell division. Microbiology. 2006, V.152: P.493-504.

36. Davis S.P., Reddy H., Caivano M. Cohen P. Specificity and mechanism of action of some commonly usedprotein kinase inhibitors Biochem. J. 2000, V.351: P.95-105.

37. D'Costa V.M., Griffiths E., Wright G.D. Expanding the soil antibiotic resistome: exploring environmental diversity. Curr Opin Microbiol. 2007, 0ct;10(5): P.481-489.

38. Deol P., Vohra R., Saini A.K., Singh A., Chandra H., et al. Role of Mycobacterium tuberculosis Ser/Thr kinase PknF: implications in glucose transport and cell division. J Bacteriol. 2005, V.187: P.3415-3420.

39. Deutscher J., Saier M.H. ATP-dependent protein kinase-catalyzed phosphorylation of a seryl residue in HPr, a phosphate carrier protein of the phosphotransferase system in Streptococcus pyogenes. Proc Natl Acad Sci U S A . 1983, V.80: P.6790-6794.

40. Drews S.J., Hung F., Av-Gay Y. A protein kinase inhibitor as an antimycobacterial agent. FEMS Microbiol Lett. 2001, V.205: P.369-374.

41. Duran R., Villarino A., Bellinzoni M. Conserved autophosphorylation pattern in activation loops and juxtamembrane regions of Mycobacterium tuberculosis Ser/Thr protein kinasesBiochem Biophys Res Commun. 2005, Aug 5;333(3). P.858-867.

42. Durocher D., Henckel J., Fersht A.R., Jackson S.P. The FHA domain is a modular phosphopeptide recognition motif. Mol Cell. 1999, V.4: P.387-394.

43. Echenique J., Kadioglu A., Romao S., Andrew P.W., Trombe M.C. Protein serine/threonine kinase StkP positively controls virulence and competence in Streptococcus pneumoniae. Infect Immun. 2004, Apr;72(4): P.2434-2437.

44. Eeken J.C., Klink I., van Veen B.L., Pastink A., Ferro W. Induction of epithelial tumors in Drosophila melanogaster heterozygous for the tumor suppressor gene wts. Environ Mol Mutagen. 2002, V.40(4): P.277.

45. Elizarov S.M., Michurina T.A., Danilenko V.N. Serine/threonine type protein kinase activity in cell-free extracts of Streptomyces lividans. Antibiot Khimioter. 1998, V.43: P.3-8.

46. Elizarov S.M., Sergienko O.V., Sizova I.A., Danilenko V.N. Dependence of aminoglycoside 3'-phosphotransferase VIII activity on protein serine/threonine kinases in Streptomyces rimosus. Mol Biol (Mosk). 2005, Mar-Apr;39(2): P.255-263.

47. Elizarov S.M., Danilenko V.N. Multiple phosphorylation of membrane-associated calcium-dependent protein serine/threonine kinase in Streptomyces fradiae. FEMS Microbiol Lett. 2001, Aug 7;202(1): P.135-138.

48. Elizarov S.M., Mironov V.A., Danilenko V.N. Calcium-induced alterations in the functioning of protein Ser/Thr and Tyr kinases in Streptomyces fradiae. Life. 2000, V. 50 P. 139-143.

49. Fernandez P., Saint-Joanis B., Barilone N., Jackson M., Gicquel B., Cole S.T., Alzari P.M. The Ser/Thr protein kinase PknB is essential for sustaining mycobacterial growth. J Bacteriol. 2006, V.188: P.7778-7784.

50. Fong D.H., Lemke C.T., Hwang J., Xiong В., Berghuis A.M. Structure of the antibiotic resistance factor spectinomycin phosphotransferase from Legionella pneumophila! J Biol Chem. 2010, Mar 26;285(13): P.9545-9455.

51. Fong D.H., Berghuis A.M., Structural basis of APH(3')-IIIa-mediated resistance to N1-substituted aminoglycoside antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 2009, Jul;53 (7):3049-55

52. Galyov E.E., Hakansson S., Forsberg A., Wolf-Watz H. A secreted protein kinase of Yersinia pseudotuberculosis is an indispensable virulence determinant. Nature. 1993, V.361: P.730-732.

53. Gauger A.K., Goldstein L.S. The Drosophila kinesin light chain. Primary structure and interaction with kinesin heavy chain. J Biol Chem. 1993, Jun 25;268(18): P.13657-13666.

54. Goldstein D.M., Gray N.S., Zarrinkar P.P. High-throughput kinase profiling as a platform for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2008, May;7(5): P.391-397.

55. Good M.C., Greenstein A.E., Young T.A., Ng H.L., Alber T. Sensor domain of the Mycobacterium tuberculosis receptor Ser/Thr protein kinase, PknD, forms a highly symmetric beta propeller. J Mol Biol. 2004, V.339: P.459^169.

56. Gopalaswamy R., Narayanan S., Jacobs W.R., Av-Gay Y. Mycobacterium smegmatis biofilm formation and sliding motility are affected by the serine/threonine protein kinase PknF. FEMS Microbiol Lett. 2008, Jan;278(l): P.121-7.

57. Greenstein A.E., MacGurn J.A., Baer C.E., Falick A.M., Cox J.S., et al. M. tuberculosis Ser/Thr protein kinase D phosphorylates an anti-anti-sigma factor homolog. PLoS Pathog. 2007, 3: e49.

58. Grundner C., Gay L.M., Alber T. Mycobacterium tuberculosis serine/ threonine kinases PknB, PknD, PknE, and PknF phosphorylate multiple FHA domains. Protein Sci. 2005, V.14: P.1918-1921.

59. Hamada K., Kato M., Shimizu T., Ihara K., Mizuno T., Hakoshima T. Crystal structure of the protein histidine phosphatase SixA in the multistep His-Asp phosphorelay. Genes Cells. 2005, V.10: P. 1-11.

60. Hanks S.K., Quinn A.M., Hunter T. The protein kinase family: conserved features and deduced phylogeny of the catalytic domains. Science. 1988, Jul 1;241(4861): P.42-52.

61. Hazes B. The (QxW)3 domain: a flexible lectin scaffold. Protein Sci. 1996, Aug;5(8): P.1490-1501.

62. Hirakata T., Kieser H., Hopwood D., Urabe H., Ogarawa H. Putative protein serine/threonine kinase genes are located in several positions on the chromosome of Streptomyces coelicolor A3(2). FEMS Microbiol Lett. 1998 Febl;159(l): P.l-5.

63. Hogan D.A., Sundstrom P. The Ras/cAMP/PKA signaling pathway and virulence in Candida albicans. Future Microbiol. 2009, Dec;4: P.1263-1270.

64. Hudson M.E., Zhang D., Nodwell J.R. Membrane association and kinase-like motifs of the RamC protein of Streptomyces coelicolor. J Bacteriol. 2002, Sep; 184(17): P.4920-4924.

65. Ichimura T., Wakamiya-Tsuruta A., Itagaki C., Taoka M., Hayano T., Natsume T., Isobe T. Phosphorylation-dependent interaction of kinesin light chain 2 and the 14-3-3 protein. Biochemistry. 2002, Apr 30;41(17): P.5566-5572.

66. Ishida A., Kameshita I., Sueyoshi N., Taniguchi T., Shigeri Y. Recent advances in technologies for analyzing protein kinases. J Pharmacol Sci. 2007, Jan; 103(1) : P. 5-11.

67. Iyer L.M., Aravind L. The emergence of catalytic and structural diversity within the beta- clip fold. Proteins. 2004, V.55: P.977-991.

68. John T.R., Smith L.A., Kaiser I.I. Genomic sequences encoding the acidic and basic subunits of Mojave toxin: unusually high sequence identity of non-coding regions. Gene. 1994, V.139 (2): P.229-234.

69. Kamei A., Yuasa T., Orikawa K., Geng X.X., Ikeuchi M. A eukaryotic-type protein kinase, SpkA, is required for normal motility of the unicellular Cyanobacterium synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol. 2001, V.183: P.1505—1510.

70. Kami K., Takeya R., Sumimoto H., Kohda D. Diverse recognition of non-PxxP peptide ligands by the SH3 domains from p67(phox), Grb2 and Pexl3p. Embo J . 2002, V.21: P.4268-4276.

71. Kang J, Tseng T.T. Analysis of S-adenosylmethionine binding to Afsk, a protein kinase from Streptomyces coelicolor. FEMS Microbiol Lett. 2007, Jun;271(l): P.l-2.

72. Kannan N., Taylor S.S., Zhai Y., Venter J.C., Manning G. Structural and functional diversity of the microbial kinome. 2007, PLoS Biol 5: el 7.

73. Kalman S., Mitchell W., Marathe R., Lammel C., Fan J., et al. Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis. Nat Genet. 1999, V.21: P.385-389.

74. Kari L., Whitmire W.M., Carlson J.H., Crane D.D., Reveneau N., et al. Pathogenic diversity among Chlamydia trachomatis ocular strains in nonhumanprimates is affected by subtle genomic variations. J Infect Dis.2008, V.197: P.449-456.

75. Kameshita I., Fujisawa H. A sensitive method for detection of calmodulin-dependent kinase II activity in sodium dodecyl sulfate polyacrylamyde gel. Analyt. Biochem. 1989, V. 183. P. 139-143.

76. Kehoe D.M., Grossman A.R. Similarity of a chromatic adaptation sensor to phytochrome and ethylene receptors. Science.1996, V.273: P.1409-1412.

77. Kieser T., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater K.F., Hopwood D.A. Practical Streptomyces Genetics. Norwich, John Innes Foundation. England. 2000. P.613.

78. Kno'lker H-.J, Reddy K.R. Isolation and synthesis of biologically active carbazole alkaloids. Chem Rev. 2002, V.102: P.4303^1428.

79. Kunze B., Kohl W., Hofle G., Reichenbach H. Production, isolation, physico-chemical and biological properties of angiolam A, a new antibiotic from Angiococcus disciformis (Myxobacterales). J Antibiot (Tokyo). 1985, V.38: P. 1649-1654.

80. Kunze B., Kemmer T., Hofle G., Reichenbach H. Stigmatellin, a new antibiotic from Stigmatella aurantiaca (Myxobacterales). I. Production, physico- hemical and biological properties. J Antibiot (Tokyo). 1984, V.37: P.454-461.

81. Lagarkova M.A., Volchkov P.Y., Lyakisheva A.V., Philonenko E.S., Kiselev S.L. Diverse epigenetic profile of novel human embryonic stem cell lines. Cell Cycle. 2006, Feb;5(4): P.416-420.

82. Lagarkova M.A., Volchkov P.Y., Philonenko E.S., Kiselev S.L. Efficient differentiation of hESCs into endothelial cells in vitro is secured by epigenetic changes. Cell Cycle. 2008, Sep 15;7(18): P.2929-2935.

83. Laemmli U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970, V.227(5259): P.680-685.

84. Levitzki A. Protein kinase inhibitors as a therapeutic modality. Acc Chem Res. 2003, Jun;36(6): P.462-469.

85. Liao J.J. Molecular recognition of protein kinase binding pockets for design of potent and selective kinase inhibitors. J Med Chem. 2007 Feb 8;50(3): P.409-424.

86. Liman R., Akyil D., Eren Y., Konuk M. Testing of the mutagenicity and genotoxicity of metolcarb by using both Ames/Salmonella and Allium test. Chemosphere. 2010, Aug;80(9): P. 1056-1061.

87. Lin Y., Hupp T.R., Stevens C. Death-associated protein kinase (DAPK) and signal transduction: additional roles beyond cell death. FEBS J. 2010, Jan;277(l): P.48-57.

88. Liu Y., Gray N.S. Rational design of inhibitors that bind to inactive kinase conformations. Nat. Chem. Biol. 2006, V.2: P. 358-364.

89. Magnet S., Blanchard J.S. Molecular insights into aminoglycoside action and resistance. Chem. Rev. 2005, V.105, P.477-497.

90. Madec E., Laszkiewicz A., Iwanicki A., Obuchowski M., Seror S. Characterization of a membrane-linked Ser/Thr protein kinase in Bacillus subtilis, implicated in developmental processes. Mol Microbiol. 2002, V.46: P.571-586.

91. Manning G., Plowman G.D., Hunter T., Sudarsanam S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends Biochem. Sci. 2002, V.27: P.514-520.

92. Manning G., Whyte D.B., Martinez R., Hunter T., Sudarsanam S. The protein kinase complement of the human genome. Science 2002,V.298. P.1912-1934.

93. Makemson J.C., Fulayfil N.R., Landry W., Van Ert L.M., Wimpee C.F., et al. Shewanella woodyi sp. nov., an exclusively respiratory luminous bacterium isolated from the Alboran Sea. Int J Syst Bacteriol. 1997, V.47: P. 1034-1039.

94. Matsumoto A., Hong S.K., Ishizuka H., Horinouchi S., Beppu T. Phosphorylation of the AfsR protein involved in secondary metabolism in Streptomyces species by a eukaryotic-type protein kinase. Gene. 1994, V.146: P.47-56.

95. Michiels J., Xi C., Verhaert J., Vanderleyden J. The functions of Ca(2+) in bacteria: a role for EF-hand proteins? Trends Microbiol. 2002 Feb; 10(2): P.87-93.

96. Mierendorf R., Yeager K., Novy R. Innovations. Newsletter of Novagen, Inc. 1994, V. l.P. 1-3.

97. Mongodin E.F., Shapir N., Daugherty S.C., DeBoy R.T., Emerson J.B., et al. Secrets of soil survival revealed by the genome sequence of Arthrobacter aurescens TCI. 2006, PLoS Genet. 2: e214.

98. Monot M., Honore N., Gamier T., Zidane N., Sherafí D., et al. Comparative genomic and phylogeographic analysis of Mycobacterium leprae. Nat Genet. 2009, V.41: P.1282-1289.

99. Morth J.P., Gosmann S., Nowak E., Tucker P.A. A novel two-component system found in Mycobacterium tuberculosis. FEBS Lett. 2005, V.579: P.4145-4148.

100. Munoz-Dorado J., Inouye S., Inouye M. A gene encoding a protein serine/threonine kinase is required for normal development of M. xanthus, a gramnegative bacterium. Cell. 1991, V.67: P.995-1006.

101. Nadvornik R., Vomastek T., Janecek J., Technikova Z., and Branny P. Pkg2, a novel transmembrane protein Ser/Thr kinase of Streptomyces granaticolor. J Bacteriol. 1999, V.181: P. 15-23.

102. Nariya H., Inouye S. Activation of 6-phosphofructokinase via phosphorylation by Pkn4, a protein Ser/Thr kinase of Myxococcus xanthus. Mol Microbiol. 2002, V.46: P.1353-1366.

103. Nariya H., Inouye S. An effective sporulation of Myxococcus Xanthus requires glycogen consumption via Pkn4-activated 6-phosphofructokinase. Mol Microbiol. 2003, V.49: P.517-528.

104. Nakano H., Omura S. Chemical biology of natural indolocarbazole products: 30 years since the discovery of staurosporine. J Antibiot (Tokyo). 2009, Jan;62(l): P. 17-26.

105. Neer E.J., Schmidt C.J., Nambudripad R., Smith T.F. The ancient regulatory-protein family of WD-repeat proteins. Nature. 1994, V.371: P.297-300.

106. Nelson R. M., G. L. Long. A general method of site-specific mutagenesis using a modification of the Thermus aquaticus polymerase chain reaction. Anal. Biochem. 1989, V.180: P.147-151.

107. Nelson M.R., Thulin E., Fagan P.A., Forsen S. The EF-hand domain: A globally cooperative structural unit. Protein Science. 2002, V.ll: P. 198-205.

108. Neu J.M., MacMillan S.V., Nodwell J.R., Wright G.D. StoPK-1, a serine/ threonine protein kinase from the glycopeptide antibiotic producer Streptomyces toyocaensis NRRL 15009, affects oxidative stress response. Mol Microbiol. 2002, V.44: P.417-430.

109. Nystrom T., Neidhardt F.C. Expression and role of the universal stress protein, UspA, of Escherichia coli during growth arrest. Mol Microbiol. 1994, V.ll: P.537—544.

110. O'Connor T.J., Nodwell J.R. Pivotal roles for the receiver domain in the mechanism of action of the response regulator RamR of Streptomyces coelicolor. J Mol Biol. 2005, Sep 2;351(5): P. 1030-1047.

111. O'Connor T.J., Kanellis P., Nodwell J.R. The ramC gene is required for morphogenesis in Streptomyces coelicolor and expressed in a cell type-specific manner under the direct control of RamR. Mol Microbiol. 2002, Jul;45(l): P.45-57.

112. Ono-Saito N., Niki I., Hidaka H. H-series protein kinase inhibitors and potential clinical application. Pharmacol Ther. 1999, V.82: P. 123-131.

113. Ortiz-Lombardia M., Pompeo F., Boitel B., Alzari P.M. Crystal structure of the catalytic domain of the PknB serine/threonine kinase from Mycobacterium tuberculosis. J Biol Chem. 2003, V.278: P. 13094-13100.

114. Oren A. A proposal for further integration of the cyanobacteria under the Bacteriological Code Int J Syst Evol Microbiol. 2004, V.54: P. 1895-1902.

115. Oubrie A., Rozeboom H.J., Kalk K.H., Olsthoorn A.J., Duine J.A., Dijkstra B.W. Structure and mechanism of soluble quinoprotein glucose dehydrogenase. J Mol Biol. 1999, Jun 4;289(2): P.319-333.

116. Pajak B., Turowska A., Orzechowski A., Gajkowska B. Bisindolylmaleimide IX facilitates extrinsic and initiates intrinsic apoptosis in TNF-alpha-resistant human colon adenocarcinoma COLO 205 cells. Apoptosis. 2008, Apr; 13(4): P.509-522.

117. Pearce L.R., Komander D., Alessi D.R. The nuts and bolts of AGC protein kinases.Nat Rev Mol Cell Biol. 2010, Jan;l 1(1): P.9-22.

118. Pérez J., Garcia R., Bach H., de Waard J.H., Jacobs W.R., Av-Gay Y., Bubis J., Takiff H.E. Mycobacterium tuberculosis transporter MmpL7 is a potential substrate for kinase PknD. Biochem Biophys Res Commun. 2006, Sep 15;348(1): P.6-12.

119. Petrickova K., Tichy P., Petricek M. Cloning and characterization of the pknA gene from Streptomyces coelicolor A3(2), coding for the Mn2+ dependent protein Ser/Thr kinase. Biochem Biophys Res Commun. 2000, V.279: P.942-948.

120. Pillonel C. Evaluation of phenylaminopyridines as antifungal protein kinase inhibitors. Pest Manag Sci. 2005, V.61: P. 1069-1076.

121. Pindur U., Kim Y.S., Mehrabani F. Advances in indolo2,3-a.carbazole chemistry: design and synthesis of protein kinase C and topoisomerase I inhibitors. Curr Med Chem. 1999, V6: P.29-69.

122. Pouliot P., Olivier M. Opposing forces in asthma: regulation of signaling pathways by kinases and phosphatases. Crit Rev Immunol. 2009, V.29(5): P.419-442.

123. Rampersaud A., Utsumi R., Delgado J., Forst S.A., Inouye M. Ca -enhanced phosphorylation of a chimeric protein protein kinase involved with bacterial signal transduction. J. Biol. Chem. 1991, V. 266. P. 7633-7637.

124. Rajagopal L., Vo A., Silvestroni A., Rubens C.E. Regulation of purine biosynthesis by a eukaryotic-type kinase in Streptococcus agalactiae. Mol. Microbiol. 2005, V.56: P.1329-1346.

125. Rajagopal L., Vo A., Silvestroni A., Rubens C.E. Regulation of cytotoxin expression by converging eukaryotic-type and two-component signaling mechanisms in Streptococcus agalactiae. Mol Microbio. 2006, V.62: P.941-957.

126. Rajkarnikar A., Kwon H.J., Ryu Y.W., Suh J.W. Two threonine residues required for role of AfsKav in controlling morphogenesis and avermectin production in Streptomyces avermitilis. J Microbiol Biotechnol. 2007, Sep; 17(9): P.1563-1567.

127. Rigdenl D.J., Galperin M.Y. The DxDxDG Motif for Calcium Binding: Multiple Structural Contexts and Implications for Evolution. J. Mol. Biol. 2004, V.343:P.971-984.

128. Rodig H., Kloep F., Weissbach L., Augustin C., Edelmann J., Hering S., Szibor R., Götz F., Brabetz W. Evaluation of seven X-chromosomal short tandem repeat loci located within the Xq26 region. Forensic Sei Int Genet. 2010, Apr;4(3): P.194-199.

129. Rosenshine I., Duronio V., Finlay B.B. Tyrosine protein kinase inhibitors block invasion-promoted bacterial uptake by epithelial cells. Infect Immun. 1992, V.60:P.2211-2217.

130. Saini D.K., Tyagi J.S. High-throughput microplate phosphorylation assays based on DevR-DevS/Rv2027c 2-component signal transduction pathway to screen for novel antitubercular compounds. J Biomol Screen. 2005, Apr;10(3): P. 215224.

131. Sanchez C., Mendez C., Salas J.A. Indolocarbazole natural products: occurrence, biosynthesis, and biological activity. Nat Prod Rep. 2006, V.23: P. 1007-1045.

132. Sanchez-Weatherby J., Southall S., Oubrie A. Crystallization of quinoprotein glucose dehydrogenase variants and homologues by microseeding. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2006, Jun l;62(Pt 6): P.518-521.

133. Eukaryote-Like Serine/Threonine Kinases and Phosphatases in Bacteria Sandro Pereira S. F., Dworkin J. Microbiol. Mol. Biol. Rev. March 2011,V. 75, P.192-212.

134. San-Juan-Vergara H., Peeples M.E., Lockey R.F., Mohapatra S.S. Protein kinase C-alpha activity is required for respiratory syncytial virus fusion to human bronchial epithelial cells. J. Virol. 2004, V.78 (24), P.13717-13726.

135. Sawai R., Suzuki A., Takano Y., Lee P.C., Horinouchi S. Phosphorylation of AfsR by multiple serine/threonine kinases in Streptomyces coelicolor A3(2). Gene. 2004, Jun 9;334: P.53-61.

136. Sensen C.W., Charlebois R.L., Chow C., Clausen I.G., Curtis B., et al. Completing the sequence of the Sulfolobus solfataricus P2 genome. Extremophiles. 1998, V.2: P.305-312.

137. Serova M., Ghoul A., Benhadji K.A., Cvitkovic E., Faivre S., Calvo F., Lokiec F., Raymond E. Preclinical and clinical development of novel agents that target the protein kinase C family. Semin Oncol. 2006, Aug;33(4): P.466-478.

138. Scheeff E.D., Bourne P.E. Structural evolution of the protein kinase-like superfamily. PLoS ComputBiol. 2005, Oct;l(5): e49.

139. Shakir S.M., Bryant K.M., Larabee J.L., Hamm E.E., Lovchik J., et al. Regulatory Interactions of a Virulence-Associated Serine/Threonine Phosphatase-Kinase Pair in Bacillus anthracis. J Bacteriol. 2010, Jan; 192(2): P.400-409.

140. Shi L., Potts M., Kennelly P.J. The serine, threonine, and/or tyrosine-specific protein kinases and protein phosphatases of prokaryotic organisms: a family portrait. FEMS Microbiol. Rev. 1998, V.22: P.229-253

141. Shirai H., Autieri M., Eguchi S. Small GTP-binding proteins and mitogen-activated protein kinases as promising therapeutic targets of vascular remodeling. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2007, Mar; 16(2): P. 111-115.

142. Shoen C.M., Chase S.E., DeStefano M.S., Harpster T.S., Chielewski A.J., Cynamon M.H. Evaluation of rifalazil in long-term treatment regimens for tuberculosis in mice. Antimicrob Agents Chemother. 2000, V.44: P. 1458-1462.

143. Shtil A.A., Azare J. Redundancy of biological regulation as the basis of emergence of multidrug resistance. Int Rev Cytol. 2005, V.246: P. 1-29.

144. Smith R.J. Calcium and bacteria. Adv. Microb. Physiol. 1995, V.37. P.83-133.

145. Smith T.F., Gaitatzes C., Saxena K., Neer E.J. The WD repeat: a common architecture for diverse functions. Trends Biochem Sci. 1999, V.24: P.181-185.

146. Tatevossian R.G., Lawson A.R., Forshew T., Hindley G.F., Ellison D.W., Sheer D. MAPK pathway activation and the origins of pediatric low-grade astrocytomas. J Cell Physiol. 2010, Mar;222(3): P.509-514.

147. Tauch A., Trost E., Tilker A., Ludewig U., Schneiker S., et al. The lifestyle of Corynebacterium urealyticum derived from its complete genome sequence stablished by pyrosequencing. J Biotechnol. 2008, V.136: P.11-21.

148. Tereshko V., Teplova M., Brunzelle J., Watterson D.M., Egli M. Crystal structures of the catalytic domain of human protein kinase associated with apoptosis and tumor suppression. Nat Struct Biol. 2001, 0ct;8(10), P.899-907.

149. Tisa L.S., Adler J. Calcium ions are involved in Escherichia coli chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, V. 89. P. 11804-11808.

150. Thomson N.R., Holden M.T., Carder C., Lennard N., Lockey S.J., et al. Chlamydia trachomatis: genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 2008, V. 18: P. 161-171.

151. Thompson C.J., Gray G.S. Nucleotide sequence of a streptomycete aminoglycoside phosphotransferase gene and its relationship tophosphotransferases encoded by resistance plasmids. Proc Natl Acad Sci USA. 1983, Sep;80(17): P.5190-5194. ATCC 10745

152. Yonekawa T., Ohnishi Y., Horinouchi S. A calmodulin-like protein in the bacterial genus Streptomyces. FEMS Microbiology Letters. 2005, V.244: P.315-321.

153. Toth M., Vakulenko S., Smith C.A. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of Enterococcus casseliflavus aminoglycoside-2"-phosphotransferase-IVa. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2010, Jan l;66(Pt 1): P.81-84.

154. Toth M., Chow J.W., Mobashery S., Vakulenko S.B. Source of phosphate in the enzymic reaction as a point of distinction among aminoglycoside 2"-phosphotransferases. J Biol Chem. 2009, Mar 13;284(11): P.6690-6696.

155. Toth M., Frase H., Chow J.W., Smith C., Vakulenko S.B. Mutant APH(2")-IIa enzymes with increased activity against amikacin and isepamicin. Antimicrob Agents Chemother. 2010, Apr;54(4): P. 1590-1595.

156. Trombe M.C. Mutations which alter the kinetics of calcium transport after the regulation of competence in Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol. 1994, V. 176. P. 1992-1996.

157. Tussavainen H., Permi P., Annila A. NMR solution structure of calerythrin, an EF-hand calcium-binding protein from Saccharopolyspora erythraea. Eur. J. Biochem. 2003, V.270(6): P.2505-2512.

158. Tyagi N., Anamika K., Srinivasan N. A Framework for Classification of Prokaryotic Protein Kinases. PLoS ONE , V.5 , Issue 5, el0608, P. 1-9.

159. Ueda K., Umeyama T., Beppu T., Horinouchi S. The aerial myceliumdefective phenotype of Streptomyces griseus resulting from A-factor deficiency is suppressed by a Ser/Thr kinase of S. coelicolor A3(2). Gene. 1996, V. 169: P.91-95.

160. Udo H., Munoz-Dorado J., Inouye M., Inouye S. Myxococcus xanthus, a gram-negative bacterium, contains a transmembrane protein serine/threoninekinase that blocks the secretion of beta-lactamase by phosphorylation. Genes Dev. 1995, V.9: P.972-983.

161. Umeyama T., Lee P.C., Horinouchi S. Protein serine/threonine kinases in signal transduction for secondary metabolism and morphogenesis in Streptomyces. Appl Microbiol Biotechnol. 2002, V.59: P.419-425.

162. Umeyama T., Lee P.C., Ueda K., Horinouchi S. An AfsK/AfsR system involved in the response of aerial mycelium formation to glucose in Streptomyces griseus. Microbiology. 1999, Sep;145 ( Pt 9): P.2281-2292.

163. Umeyama T., Horinouchi S. Autophosphorylation of a bacterial serine/threonine kinase, AfsK, is inhibited by KbpA, an AfsK-binding protein. J Bacterid. 2001, Oct;183(19): P.5506-5512.

164. Urabe H., Ogawara H. Cloning, sequencing and expression of serine/threonine kinase-encoding genes from Streptomyces coelicolor A3(2) Gene. 1995, Feb 3;153(1): P.99-104.

165. Venkateswaran K., Dollhopf M.E., Aller R., Stackebrandt E., Nealson K.H. Shewanella amazonensis sp. nov., a novel metal-reducing facultative anaerobe from Amazonian shelf muds. Int J Syst Bacteriol. 1998, V.48 Pt 3: P.965-972.

166. Verma A., Maurelli A.T. Identification of two eukaryote-like serine/ threonine kinases encoded by Chlamydia trachomatis serovar L2 and characterization of interacting partners of Pknl. Infect Immun. 2003, V.71: P.5772-5784.

167. Vieth M., Higgs R.E., Robertson D.H., Shapiro M., Gragg E.A., Hemmerle H. Kinomics-structural biology and chemogenomics of kinase inhibitors and targets. Biochim Biophys Acta. 2004, Mar 11; 1697(1-2): P.243-257.

168. Walburger A., Koul A., Ferrari G., Nguyen L., Prescianotto-Baschong C., Huygen K., Klebl B., Thompson C., Bacher G., Pieters J. Protein kinase G from pathogenic mycobacteria promotes survival within macrophages. Science. 2004, V.304: P.1800-1804.

169. Watkins N.J., Knight M.R., Trewavas A.J., Campbell A.K. Free calcium transients in chemotactic and non-chemotactic strains of Escherichia coli determined by using recombinant aequorin. Biochem J. 1995, Mar 15;306 ( Pt 3): P.865-869.

170. Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc Natl Acad Sci USA. 1990, V.87: P.4576-4579.

171. Wright G.D., Thompson P.R. Aminoglycoside phosphotransferases: proteins, structure, and mechanism. Front Biosci. 1999, V.4: P.D9-21.

172. Yang J., Cron P., Good V.M., Thompson V., Hemmings B.A., Barford D. Crystal structure of an activated Akt/protein kinase B ternary complex with GSK3-peptide and AMP-PNP. Nat Struct Biol. 2002, Dec;9(12), P. 940-4.

173. Yeats C., Finn R.D., Bateman A. The PASTA domain: a beta-lactam-binding domain. Trends Biochem Sci. 2002, Sep;27(9): P.438.

174. Young T.A., Delagoutte B., Endrizzi J.A., Falick A.M., Alber T. Structure of Mycobacterium tuberculosis PknB supports a universal activation mechanism for Ser/Thr protein kinases. Nat Struct Biol. 2003, V.10: P. 168-174.

175. Yu X-C., Margolin W. Ca -mediated GTP-dependent dynamic assembly of bacterial cell division protein FtsZ into asters and polymer networks in vitro. EMBOJ. 1997, V.16: P.5455-5463.

176. Zhang W., Munoz-Dorado J., Inouye M., Inouye S. Identification of a putative eukaryotic- like protein kinase family in the developmental bacterium Myxoccus xanthus. J Bacteriol. 1992, V.174: P.5450-5453.

177. Zhang W., Inouye M. Reciprocal regulation of the differentiation of Myxococcus xanthus by Pkn5 and Pkn6, eukaryotic-like Ser/Thr protein kinases. Mol Microbiol. 1996, V.20: P.435-447.

178. Zheng J., He C., Singh V.K., Martin N.L., Jia Z. Crystal structure of a novel prokaryotic Ser/Thr kinase and its implication in the Cpx stress response pathway. Mol Microbiol. 2007, V.63: P. 1360-1371.

179. Zhulin I.B., Nikolskaya A.N., Galperin M.Y. Common extracellular sensory domains in transmembrane receptors for diverse signal transduction pathways in bacteria and archaea. J Bacteriol. 2003, V.185: P.285-294.

180. Лакатош С.А., Преображенская M.H. Методы синтеза индоло2,3-а.пирроло[3,4-с]карбазолов, родственных бис(индол-3-ил)малеимидов и их аналогов. "Избранные методы синтеза и модификации гетероциклов" под ред. Карцева В.Г. 2005.

181. Потехин Я.А., Даниленко В.Н. Детерминант устойчивости к канамицину Streptomyces rimosus: амплификация в составе хромосомы и обратимая генетическая нестабильность. Молекулярная биология, 1985, Т. 19, №.3, С.805-816.

182. Симонов А. Ю., Лакатош С. А., Лузиков Ю. Н., Резникова М. И.,

183. Сусова О. Ю., Штиль А. А., Елизаров С. М., Даниленко В. Н.,

Информация о работе

Беккер, Ольга Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Создание бактериальной тест-системы для скрининга ингибиторов протеинкиназ на основе генов фосфотрансфераз - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы