Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение новых векторных систем для генетической трансформации Chlamydomonas reinhardtii

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение новых векторных систем для генетической трансформации Chlamydomonas reinhardtii"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Л 1

Vil

.'j'j L^j ■

На правах рукописи

ЛАПИНА Татьяна Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ НОВЫХ ВЕКТОРНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ Chlamydomonas reinhardtii

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ- 1995

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Биологического научно-исследовательского института Санкт-Петербургского государственного университета.

Научные руководители:

кандидат химических наук И.А. Сизова,

кандидат биологических наук,старший научный сотрудник

А.В.Козлов

Официальные оппоненты :

доктор биологических наук, ведущий сотрудник Д. А. Перумов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Ю.И.Маслов

Ведущая организация - Санкт-Петербургский государственный технический университет.

Защита диссертации состоится I{ша^п^л. 199¿года на зас дании диссертационного совета К.063.57.12 в Санкт-Петербургск государственном университете: 199034, Санкт-Петербург, Универс тетская наб., 7/9, биолого-почвенный факультет,ауд./33

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке имени A.M. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан 199£г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических £ ¿1 наук ¿Г. ¿/¿¿с/р

Е.В.Ермилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii - фототрофный эукариотический микроорганизм .является модельным объектом для изучения физиологических, генетических, биохимических процессов в эу-кариотической клетке. Прежде всего, это обусловлено простотой приемов работы с С.reinhardtii, относитетельно коротким клеточным циклом, использованием для культивирования простых синтетических сред „ хорошей генетической изученностью и наличием разнообразных мутантов по ядерным, хлоропласт-ным,митохондриальным генам (Hariss,1989). Для современного этапа развития биотехнологий С.reinhardtii представляет большой интерес не только как модельная эукариотическая система , но и как перспективная трансгекная одноклеточная фотосинтезирущая эукариотическая клетка - продуцент белков растительного происхождения или носитель целевых систем биодеградации сцепленных с фотосинтезом.

Разработка эффективной системы генетической трансформации С.reinhardtii по ядерному ( Kindle,1990), хлоропласт-ному (Boynton et. al., 1988) и митохондриальному геномам (Randolph-Anderson et al.,1993) позволила расширить исследования внутриклеточных процессов на молекулярном уровне. Показано, что при интеграции донорной ДНК в ядерный геном С.reinhardtii преобладает механизм негомологичной рекомбинации ( Sodeinde and Kindle, 1993), интеграция донорной ДНК в хлоропластный геном идет по механизму гомологичной рекомбинации (Blowers et al.,1989). Исследуются механизмы регуляции и экспрессии генов (Davies et al.,1992; Blankenshlp and Kindle, 1992) . Предложена методология инсерционного мутагенеза (Kindle et al.,1991; Nelson et al.,1994).До настоящего времени не разработана система стабильной экспрессии гетерологичных генов в ядре С. reinhardtii ( Hall et al., 1993; Blankenshlp and Kindle, 1992).

В настоящее время для трансформации С. reinhardtii используются интегративные плазмкдные векторы, полученные на основе бактериальных плазмид и гомологичных генов , комп-лементирующих мутации ауксотрофности или фототрофности в реципиентных штаммах. Дальнейшее развитие методологии моле-

куляркого клонирования в хламидомонаде нуждается в создании многокопийных репликативных векторных ДНК и поиске новых селективных маркерных гомо- и гетерологичных генов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы были поиск и изучение новых векторных конструкций для трансформации СШатус1отопаз геШЬагсЗШ .содержащих гетерологичные маркерные гены: аргининсукцинатлиазы из дрожжей Зассйагошусез сегеу1Б1ае (агя4), аминоглико-зид-3'-фосфотрансфераз (арЮ из Тп5 и БЪгер1,отусез гшозиз.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи. 1. Изучить возможность создания репликативных векторных плазмид на основе гибридных бактериальных плазмид, несущих селектируемые в хламидомонаде гетерологичные маркеры (агя4, арЬ из Тп5 под регуляторными элементами вируса БУ40) и фрагменты ядерной ДНК С.геНЖапЗШ . Для этого создать клонотеку хромосомной ДНК С. ге1гШагс!Ш в плазмидах рВй325а^4, рЕЖ327агв4, рзу2пео и провести скрининг автономных плазмид в трансформантах водоросли. Провести анализ свойств фрагмента ядерной ДНК - предполагаемого репликатора автономных плазмид в составе плазмиды с гомологичным маркерным геном аргининсукцинатлиазы (а^7). 2. Изучить трансформацию С. геШйагйШ плазмидой р311937. содержащей ген аминогликозид-З'-фосфотрансферазы из Б.гшозиэ и на ее примере .разработать подход к созданию системы стабильной экс-пресии гетерологичных генов в С. геЗлПагйШ.

Научная новизна работы.

Получены автономно поддерживающиеся в С. гетЬагаШ плазмиды, содержащие ядерные фрагменты ДНК хламидомонады. Обнаружено, что в процессе культивирования трансформантов водоросли в селективных по плазмидному маркеру условиях, плазмидная ДНК подвергается разнообразным структурным изменениям, причем последние могут иметь специфический характер. Показана возможность использования плазмиды рзи937, содержащей ген аминогликозид-З'-фосфотрансферазы из 3.г1шозиз в качестве интегративного вектора для хламидомонады.Впервые получены трансформанты С.гекЛагйШ .способные к стабильной экспрессии гетерологичного гена при выращивании в селективных и неселективных условиях по плазмидному маркеру.

Получена коллекция из 12 независимых трансформантов С. reinhard tli и осуществлено тестирование активности аминоглико-зид-З'-фосфотрансферазы в грубых бесклеточных экстрактах трансформантов.

Практическое значение работа.

В дальнейшем ген аминогликозид-З'-фосфотрансферазы из S.rlmosus предполагается использовать в качестве репортер-ного гена при изучении регуляторных элементов хламидомонады.

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались на семинарах кафедры микробиологии Санкт-Петербургского университета, на Международной конференции по фотосинтезу и фотобиотехнологии в Пущино, на 6-ой Международной конференции по клеточной и молекулярной биологии хламидомонады в США, на 9-ом Международном симпозиуме по биологии актиноми-цетов в Москве.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста, включая рисунков 27 . Работа состоит из введения , обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы

В работе использовались следующие бактериальные штаммы: Escherichia coll С-600 /F-, thi-1, thr-1,1еуВ6,lacYl. ton A21,supE44,/(Маниагис и др. 1982).

Е.coli НВ101 / F-,hsd S20(r"b,nf b), гесА13, ага-14. ргоА2, iacYI,galK2.rpsL20,xyl-5,mtl-i,supE44/ (Маниатис и др.,1982). Е.coli JA-209 /argHl, raetE, xyll, trpA36, recA56/ (Clarke and Carbon.1987).

Streptomyces lividans 66, содержащий плазмиду p951, несущую ген аминогликозид-З'-фосфотрансферазы iaph) Streptomyces riiiiosus из коллекции музея культур ГНИИГенетика. В работе использовались штаммы Chlamydomonas relnhardtii 302 / mt+ cw15 arg7-8/ - мутант лииенный клеточной стенки, ауксотрофный по аргинину; 137С rat " - дикий тип из Петергофской генетической коллекции водорослей (Квитко и др. 1983).

Плазмиды: pES-43 /ApRTcR Arg+/; pES-33/ApETcs ArgV

(Tikhomirova et al.,1983) ; pBR327 /Арн/ (Soberon et al.,1980), pBR325 /ApRCmRTc8/(Bolivar, 1978),pSV2neo /ApR KmR/ (Southern and Berg,1982);pSU937 /ApR/,pSU935 /Арк/(Да-ниленко и др. 1992) ;pARG7.8 /Арк/ (Debuchy et al.,1989). Среды. В работе были использованы среды: LB ( Маниатис и др.,1982),ТАР (Gormaп and Levlne,1965) с ацетатом натрия, в случае необходимости содержащей 50 мкг/мл аргинина. YEME (Bibb et al.,1977).

Антибиотики. В работе использовались сульфаты ампици-лина,канамицина, неомицина,генетицина, гентамицина, паромоми-цина, выпускаемые медицинской промышленностью.

Радиоизотопы. В работе были использованы следующие изотопы:гамма-32Р АТФ - 40 МБк и альфа-32Р (дАТФ.дЦТФ) 40 МБк в 50% спиртовых растворах (ГИПХ, Санкт-Петербург).

Методы

Получение компетентных клеток Е. coll и трансформацию Е. coll . а также выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток осуществляли по методам,описанным в руководстве (Маниатис и др.1982).

Рестрикция ДНК эндонуклеазами. Гидролиз плазмидной ДНК ( не более 10 мкг) осуществляли 2-3-кратным избытком зндонуклеаз рестрикции. Для ядерной, суммарной ДНК хламидомонады /не белее 10 мкг/ использовали 5-10-кратный избыток рестриктаз. Для каждого фермента рестрикции использовали условия, предлагаемые фирмой- изготовителем /состав буферной смеси, температура,рН/. Большинство рестрикционных зндонуклеаз и других ферментов получены из НПЦ" Биопол" /г. Москва, Россия/.

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК. Разделение препаратов ДНК проводили при использовании горизонтального геля в 1-кратном ТЛЕ буфере .Концентрация ага-розы (Sigma,США) составляла 0.5-1% в зависимости от размеров разделяемых фрагментов ДНК (Маниатис и др.,1982).

Лигирование. Лигирование осуществляли согласно методу, описанному в руководстве / Маниатис и др., 1982/ с помощью ДНК-лигазы фага Т4.

Трансформация Chiamydomonas rejnhardtll.Трансформацию осуществляли по методам:с полиэтиленгликолем,а также с поли-

L-лизином или поли-Ь-орнитином ( Rocíiaix et al.,lS82); встряхивания со стеклянными шариками (Kindle,1990).

Выделение суммарной ДНК С. relnhardti 1 и ее фракционирование на хлоропластную.митохондриальную, ядерную фракции. Суммарную клеточную ДНК выделяли по методу Роше (Rocha-IX,1980 ) .Препаративное разделение суммарной ДНК С.relnhardti! на хлоропластную,митохондриальную,ядерную фракции осуществляли с помощью равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl в присутствии АТ-специфического агента Хехст 33258 (молярное соотношение ДНК:лиганд -1:1).

Определение аминогликозид-З'-фосфртрансферазной активности. Определение аминогликозид-З'-фосфотрансферазной активности в бесклеточных экстрактах хламидомонады проводили после разделения белков путем неденатурирующего гель-злект-рофореза по методу Рейса (Reiss et al.,1984), а также хроматографическим выделением фосфорилированного антибиотика (Cabanes-Bastos et al.,1989).

Анализ геномной ДНК молекулярной гибридизацией осуществляли путем прямой гибридизации в высушенном агарозном геле (Purrelo and Balazs,1983) или блот-гибридизацией по Саузерну (Southern and Berg,1982).

Определение нуклеотидной_последовательности

BarnHl-EcoRl-фрагмента ядерной ДНК С.relnhardtii (2.4 т.п.н.) проведено на комерческой основе (НПО Вектор, г. Кольцово, Новосибирск) по методу Максама-Гильберта по двум цепям . Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности проводили по программе "DNA-SAH" (пакет программ ГНИИГене-тика, Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.Изучение возможности создания оепликативных векторов на основе бактериальных плазмид и Фрагментов собственной ядерной ДНК хламидомонады.

Ядерную ДНК С.relnhardtii, полученную из суммарной ДНК штамма С.relnhardtii 137С и дважды очищенную на градиенте CsCL (см.материалы и методы), клонировали в плазмидах pBR325arg4, pBR327arg4 по сайтам EcoRI и BamHI соответственно и в плазмиде pSV2neo по сайтам EcoRI-BamHI с замеще-

нием фрагмента плазшды. Суммарные пулы плазмид pBR325arg4fiflflHK, pBR327arg4flflflHK, рБУгпеоядДНК, содержащие случайные фрагменты ядерной ДНК с общей длинной 12,30,20 т.п.н., соответственно, использовали для трансформации С.reiniaardtii 302 .Трансформацию проводили по методам с по-лиэтиленгликолем, а также с поли-Ь-лизином (орнитином). Трансформанты отбирали на минимальной среде без аргинина или на среде с канамидином (50 мкг/мл). Частота трансформации составляла 1-10 трансформантов на 10 мкг плазмидной ДНК. В контрольных экспериментах с соответствующими плазми-дами, не содержащими фрагменты ядДНК,трансформанты не были обнаружены.Для последующего анализа были выбраны два трансформанта с максимальной копийностыо ллазмиды.Анализ выбранных трансформантов (обозначение Е1 и В1) проводили методом гибридизации по Саузерну, а также путем трансформации клеток Е.coll НВ101 препаратами суммарной ДНК трансформантов Е1.В1, выделенных через 48 к 88 суток роста в селективных условиях.

Показано,что клетки трансформантов водоросли содержат автономные ллазмиды, причем при продолжительном культивировании хламидомонады в селективных условиях они претерпезают значительные структурные изменения (рис.1,полосы в,г, д, э,л,м).

Из трансформанта Е1 были выделены плазмиды,обозначенные рЕ1-1 ( 5.4 т.п.н.)- через 48 суток культивирования трансформанта и рЕ1-2 (3.25 т.п.н.) через 88 суток культивирования трансформанта.С целью изучения способности трансформировать хламидомонаду эти плазмиды были трансформированы в С.reinftardtii .Из трансформантов .полученных в опыте с плазмидой рЕ1-1,в свою очередь были выделены плазмиды двух типов.Одна из плазмид по размерам и рестрмкционной карте была полностью аналогична плазмиде рЕ1-2, что свидетельствует в пользу специфического характера структурной перестройки. Другая плазмида (обозначение рЕ1-3)значительно больше (11,7 т.п.н.) плазмид рЕ1-1 и рЕ1-2 и отлична от последних по характеру рестрикции. Анализ трансформантов хламидомонады, отобранных в опыте с плазмидой рЕ1-2, также выявил структурные изменения плазмидной ДНК. В клетках трансфор-

мантов были обнаружены плазмиды трех типов с размерами 5.9;6.2;11.5 т.п.н., различающихся по своим рестрикционным картам. На рисунке 2 предложена схема молекулярных преобразований ллазмидных ДНК в клетках трансформантов.

Рис.1.Анализ ДНК трансформантов С.reinhardtii методом гибридизации по Саузерну с плазмидой 32P-p8R327arg4. Элект-рофоретический анализ в 0.7% агарозном геле (а.в,д, ж, и,л) и радиоавтографы (б, г, е, з, к, м) следующих препаратов: а,б -ДНК из нетрансформированных клеток С.reinhardtii;в,г - ДНК трансформанта Е1-2; д.е -ДНК трансформанта В1;ж,з - ДНК трансформанта Е1-2-1;и, к - ДНК трансформакта Е1-2-2;л,м -ДНК трансформанта В1-1.

Таким образом показано, что плазмиды pBR325arg4, pBR327arg4, содержащие фрагменты ядерной ДНК хламидомонады, способны трансформировать клетки С.reinhardtii с частотой порядка 1Q~8 и автономно поддерживаться при выращивании в селективных по плазмидному маркеру условиях, а также продемонстрирована их высокая структурная лабильность.

Закономерности, обнаруженные в процессе трансформации С.reinhardtii векторными плазмидами pBR32.5arg4flaflHK, pBR327arg4nдДНК, наблюдались также и при трансформации С.reinhardtll плазмидами рБУгпеоядДНК. Среди структурно-нестабильных плазмид," спасенных"в Е.coli была отобрана плаз-мида,рестрикциокная карта которой оставалась неизменной после выращивания трансформанта в течение одного месяца в селективных условиях и соответствовала одной из плазмид пула рБУ2пеоядДНК .Данная плазмида,обозначенная нами pSV2neo2.4, содержит BatnHI-EcoRI- фрагмент ядерной ДНК размером 2.4 т. п.н.

ЕВР Р Н

Р u-i U—i-1

г п ¿ z я

SB

J _

тми.

Е

- ТП Н i ^I ó i Z 3 pEJ-30 ¿

>E<-2

Ер & P »H P

MW II 1 f t, 1 i

p p BH

J_IX

H

_L

5 6

o i Z 3

EHEPB

pEd-г-з Щ

г o 4

5" Т.П.Н.

в РНЕ В

pEJ-Z'Zl-tt j t

I o í 2

/0

В

т.п.и.

E ±

8 э yo

PE E ü_í

3 é

Рис.2. Рестрикционные карты плазмид,выделенных из трансформантов С.reinhardtii, схема преобразований in vivo Обозначения участков узнавания рестриктаз: Е - EcoRI, В -BamHI, Р - PstI.H - HindlII.

Анализ Фрагмента ядерной ДНК, выделенного из гибридной плазмиды psv2neo2. 4.

Проведено изучение способности фрагмента 2.4 т.п.н. ядерной ДНК С.reinhardtii выполнять роль ориджина-решшка-цш плазмиды pARG7.8.2,4, содержащей гомологичный маркерный ген прототрофности по аргинину ( arg7),B клетках трансформантов С.reinhardtii .Плазмида pARG7.8 - эффективный интег-ратквный вектор для трансформации С.reinhardtii. Плазмида pARG7.8.2.4 сконструирована на основе плазмиды pARG7.8 путем переклонирования в нее BamHI-EcoRI фрагмента ядерной ДНК (2.4 т.п.н.) из плазмиды pSV2neo2.4. Для трансформации С.reinhardtii 302 использовали метод встряхивания со стеклянными шариками (Kindle,1990).

Эксперименты по сравнительному изучению эффективности трансформации плазмидами pARG7.8 и pARG8.8.2.4 проводились в предварительно подобранных оптимальных условиях.

3

В таблице 1 приведены результаты трех независимых трансформаций.

Таблица 1. Трансформация С.reinhardtii 302 плазмидами PARG7.8 И BARG7. 8. 2. 4.

Плазмида Концентрация ДНК в трансформационной среде, мкг/мл

10 20 45

PARG7.8 pARG7.8.2.4 1* 2** 1 2 1 2

4. 4x10" 5 445 0.8x10 77 1.2Х10"4 590 4. 8x10"5 240 10"4 3650 5X10"5 1560

*- частота трансформации в расчете на клетку реципиента, ** - частота трансформации на мкг плазмидной ДНК .

Из приведенных данных следует, что во всех опытах частота трансформации плазмидой pARG7. 8.2.4 ниже, чем pARG7.8. хотя различия в эффективности трансформаций не превышают 2-3 раза. Анализ суммарной ДНК из девяти трансформантов, полученных с плазмидой pARG7.8.2.4 показал, что во всех трансформантах, плазмидная ДНК интегрирована в хромосому.В случае трансформанта AI, полученного с плазмидой pARG7.8. наблюдается дискретная зона гибридизации, по подвижности соответствующая релаксированной автономной плазми-де pARG7.8 (рисунок 3).Наличие неинтегрированной копии плазмидной ДНК подтвердили путем" спасению"плазмиды pARG7.8 в Е.coli НВ101 после трансформации суммарной ДНК трансформанта AI. В проанализированных ARG+-трансформантах С. reInhard til плазмида DARG7.8.2.4 в автономном состоянии не обнаружена.

Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента ядерной ДНК (2.4 т.п.н.) (см.материалы и методы) показал, что на анализируемом участке генома отсутствуют области кодирования белковых продуктов С. relnhardtil. Характерной особенностью данной нуклеотидной последовательности является наличие тандемных повторов из трех и более триплетов ЦЦГ и ЦТГ,в различных комбинациях .образующие протяженные ГЦ-обо-гащенные повторы.Обратные повторы нуклеотидных последова-

тельностей. ведущие к образованию шпилечных структур, не обнаружены.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис.3. Блот-гибридизация по Саузерну 32Р-меченой плаз-миды pBR327arg4 с ДНк из трансформантов С.reinhardtii, полученных с плазмидой PARG7.8 (Ai, А2, A3) и плазмидой pARG7.8.2,4 (А10, All, А12).Обозначения: 1 - ДНК из нет-рансформированных клеток; 2 - Al ДНК; 3 - А2 ДНК; 4 - A3 ДНК; 5 - А10 ДНК; 6 - АН ДНК; 7 - А12 ДНК; 8 - pARG7.8 ДНК.

Анализ функций BamHI-EcoRI- фрагмента показал, что он не обладает способностью обеспечивать автономное состояние плазмиды pARG7.8.2.4 в трансформированных клетках водоросли. Возможно, что это связано с особенностями нуклеотидной последовательности гена arg7,которая как нами было обнаружено, способна обеспечивать автономное состояние плазмиды PARG7.8 к по-видимому, обладает свойством слабого автономного репликатора.

2.Трансформация С.reinhardtii плазмидами pSU935, pSU937. На основании близкого Г+Ц-состава и значительного количества одинаковых предпочтительных кодонов для трансформации хламидомонады выбрали ген из S.rimosus. Для изучения трансформации хламидомонады геном aph из S.rlmosus использовали плазмиду pSU937, состоящую из нуклеотидной последовательности плазмиды pUC19 и Kpnl-Kpnl-фрагмента из S.rimosus протяженностью 1723 п.н.с геном aph длинной 777 п.к.. В контрольных опытах использовали плазмиду pSU935, содержащие неактивный ген aph (делеция 300 п.н. с 5'-конца гена). Результаты трех опытов, включающих 6 трансформаций с плазмидой pSU937, приведены в таблице 2.

Для исключения формальной возможности вклада инсерци-онного мутагенеза в устойчивость реципиентного штамма к

- и -

аминогликозидным антибиотикам было проведено сравнение спектра устойчивости полученных Ршн-клонов С.ге1гЛагаШ и субстратная специфичность аминогликозид-З'-фосфотрансферазы из Б.гшозиз. Результаты показали следующее: аминоглико-зид-З'-фосфотрансфераза из Б.гШовиз фосфорилирует паромо-мицин,канамицин.неомивдн, ко практически не активна по отношению к гентамицину и генетицину (С418).

Таблица 2. Трансформация С.reinhardtii 302

плазмидами pSU937,pSU935, pARG7.8. 2.4

N эксп. Плазмида мкг/мл Селектируемый фенотип Ргск Кге* Обозначение Ртк трансформантов

1 PARG7.8.2.4 PARG7.8.2..4 + PSU937 6 8 + 6 0 3.8 X 10'5* 2.0 X 10~5 ТО

2 pSU937 pSU937 20 20 2.0 X 10-7 1.4 X 10" 7 Т1. Т2, ТЗ, Т4, Т5, Т6

3 pARG7. 8. 2. 4 pSU937 PSU937 DSU937 pSU935 10 20 20 20 20 0 6.5 X 10~5 1.6 X 10'7 1.3 X 10"7 1.3 X 10"7 0 Т7, Т8, Т9, Т10, ТИ, Т12

* - частота трансформации в расчете на клетку реципиента.

В таблице 3 приведены минимальные ингибирующие концентрации антибиотиков для трансформантов С.ге1гШагс1Ш.

Таблиц 3. Спектр устойчивости к аминогликсзидным антибиотикам Ртк- трансформантов С.геШйагйШ.

Рган-транс- Антибиотик (мкг/мл)**

Форманты

G418

канами- неоми- паромоми- гентами-

цин цин цин цин

ТО 400 >400 >600 5 40

Т1 н. т. >400 300 5 40

Т2 н. т. 400 200 5 40

Т6 н. т. >400 500 5 40

Т7 н. т. н. т. 500 5 40

Т9 н. т. н. т. >600 5 40

Т10 н. т. н. т. 200 5 40

ТИ н. т. н. т. 200 5 40

Т12 н. т. н. т. 400 5 40

Реципиент 50 120 3 3 40

** - минимальная ингибирующая концентрация - определялась

путем посева 107 клеток в мягком агаре на твердую среду ТАР с аргинином и антибиотиком.

н.т. - на этом антибиотике штамм не тестировался.

Как следует из приведенных данных, трансформанты устойчивы к канамищшу, паромомицину, неомицину, но чувствительны к генгамицину и генетицину, что соответствует субстратному профилю аминогликозид-З'-фосфотрансферазы из Б.г1-шозиз.

Определение аминогликозид-з'-фосфотрансферазной активности в трансформантах С.ге1пЬаг(Ш1. Для доказательства экспрессии гена арИ в клетках трансформантов хламидомонады проводили радиометрическое определение активности аминогликозид-З'-фосфотрансферазы в грубых бесклеточных экстрактах, используя (К-згР)АТФ в качестве субстрата. На рисунке 4 приведены результаты определения паромомицин-,неомицин,гентамицинфосфотрансферазной активности в экстракте трансформанта ТО после разделения белков гель-электрофорезом при неденатурирующих условиях. (¡Мэз еЪ а1., 1984).

Рис.4.Определение паромомицин-,неомицин-,гентамицинфосфотрансферазной активности в грубом бесклеточном экстракте трансформанта ТО после гель-электрофореза при неденатурирующих условиях. А- положительный контроль: экстракт Риг E.coll (pSV2neo). Б - экстракт нетрансформирован-ных клеток С. relnhardtii. В - экстракт Рпг-трансформанта С.reinhardtli.Стрелками показано положение радиомеченных фосфорилированных антибиотиков.

В качестве положительного контроля использовали белковый экстракт из E.coll НВ101,трансформированной плазмидой pSV2neo. Ген aph из Тп5 обладает фосфотрансферазной актив-

Паромомицин Неомицин Гентамицин

АБВАБВАБВ

ностью по отношению к паромомицину.неомицину,гентамицину. Приведенные результаты показывают, что в клетках трансформанта ТО содержиться белок, способный фосфорилировать паро-момицин и неомицин, но не активный по отношению к гентамицину.

Для тестирования аминогликозид-З'-фосфотрансферазной активности в остальных трансформантах С.reinhardtll использовали метод, основанный на выделении радиомеченного фосфо-рилированного антибиотика тонкослойной хроматографией. На рисунке 5 приведены результаты хроматографического тестирования активности аминогликозид-З'-фосфотрансферазы в трансформантах ТО, Т6,Т7,Т9,Т10 и в клетках реципиента.

1 23 4 5 6 7 8 9 10 И12 13 14 1516

AS А Б АБАБ АБ А Б Б А Б А

Рис.5. Демонстрация паромомицин-фосфотрансферазной активности в грубых бесклеточных экстрактах PmR- трансформантов C.relnhardtll Т0.Т1,Т6,Т7,Т9,Т10 с использованием метода тонкослойной хроматографии. Пятна, соответствующие фос-форилированному паромомицину, показаны стрелками . Линии: А-,без внесения антибиотика в реакционную среду;Б- с паро-момицином в реакционной среде .1,2 - экстракт нетрансформи-рованных клеток С.relnhardtli ; 3-12,15, 16 экстракты следующих трансформантов:3,4 - ТО; 5, 6 - Т1; 7 ,8-Т7;9,10 -Т9" 11 12- Т10; 15,16 - Т6; 13,14 -экстракт Рпг S.lividans .

Полученные результаты продемонстрировали, что все PmR-трансформанты С. reinhardtii, в отличии от нетрансформи-розанных клеток содержат паромомиданфосфотрансферазную активность. Качественное сравнение хроматограмм показывает, что наиболее высокий выход радиомеченного антибиотика и,следовательно, уровень аминогликозид-З'-фосфотрансфераз-ной активности характерен для самых устойчивых к паромоми-цину трансформантов - ТО и Т9.

Анализ ДНК трансформантов С. reinhardtil блот-гибриди-зацией.

Для доказательства того, что полученные PmR- клоны С.reinhardtii являются истинными трансформантами, содержащими интегрированные в геном нуклеотидные последовательности гена aph, провели анализ ДНК блот-гибридизацией по Сау-зерну. В качестве зонда использовали радиомеченный Kpnl -Kpnl- фрагмент ДНК из S.rimosus. На рисунке 6, представлены результаты блот-гибридизации ДНК из нетрансформиро-ванных клеток, трансформанта ТО, расщепленной эндонуклеаза-ми EcoRI (рис.бА), BamHI, HindiTI (рис.бБ). EcoRI + BamHI, EcoRl+Kindlll (рис. 6A); трансформанта Т6, расщепленной эн-донуклеазой BamHI (рис.бБ).В случае трансформанта ТО радиомеченный зонд гибридизуется с двумя фрагментами из BamHI-(на рис. 6Б, полосы - 8, 9 - верхняя зона - недорестрикция) и тремя фрагментами из HindiII - переваров ДНК. При дополнительном расщеплении эндонуклеазой EcoRI исчезают один BamHI - и Hindlll- фрагмента ДНК и проявляются по три новых низкомолекулярных гибридизующихся с зондом фрагмента. Причем два низкомолекулярных фрагмента ДНК из вышеуказанных двойных переваров по подвижности соответствуют EcoRI- фрагменту ДНК ( рисунок 6А) - ото показывает, что в трансформанте ТО фрагмент ДНК из S.rimosus интегрировал в два сайта генома С.reinhardtii, причем в один из них в количестве нескольких копий. В ВашН1-гидролизате ДНК из трансформанта Т6 наблюдается гибридизация одного фрагмента ДНК (рисунок 6Б), что свидетельствует в пользу интеграции актиномицетной

ДНК только в один сайт генома. Таким образом, на примере трансформантов ТО,Т6 показано, что полученные Ршк-клоны хламидомонады содержат интегрированные копии в геном ДНК из Б.гшоэиз, в состав которой входит ген арЬ.

А Б

12 т.п.н.

-4.5

-1.8

Рис.6. Блот-гмбридизация ДНК из Ргак-трансформантов Т0.Т6 С. гепШагйШ с радиомеченным ■ Крп1-Крп1-фрагментом ДНК из З.гхшозиз, содержащим ген арЬ.

А- линии: 1 - ДНК из нетрансформированных клеток; 2 -ЕсоРЛ-перевао ДНК ТО; 3 -НтйШ+ЕсоШ-перевар ДНК ТО; 4 -ВатН1+Есо1и-перевар ДНК ТО; 5 - ВатШ+ЕсоН! -перевар р5Ш37; 6 - ВашН1+ЕсоИ1-перевар рАК07.8.2.4.

Б- линии: 7,9,11 -ДНК, выделенная из трансформантов до периода выращивания без селективного давления; 8,10.32 -ДНК, выделенная после выращивания без селективного давления; 7,8 - ВашНЬ перевар ДНК ТО; 9,10 -Н1псШ1-перевар ДНК ТО; 11,12 - ВаМИ-перевар ДНК Т6.

Стабильность признака устойчивости к аминогликозидным антибиотикам у трансформантов С. ге!пЬаг(Ш1.

К настоящему времени аминогликозид-устойчивые трансформанты стабильно поддерживаются на твердой селективной среде в течение : ТО - 20, Т1,Т2, ТЗ.Т4, Т5.Т6, -восьми; Т7,Т8,Т9, Т10, Т11.Т12 - четырех месяцев. При этом сохраняется способность к экспрессии гена арЬ из Б.гшозиз. Определение активности аминогликозид-З'-фосфотрансферазы, результаты которого приведены на рисунке 5 , проводились через

длительное время после получения трансформантов.К моменту тестирования ферментативной активности время роста на селективной среде составляло для ТО - двадцать, Tl, Т2.ТЗЛ4, Т5Л6 - шесть;Т7,Т8,Т9,Т10,ТИ,Т12 - два месяца. Проведен анализ митотической стабильности признака PmR при зыращива-нии трансформантов Т0,Т1Л2,Т6 в течение четырех месяцев (ТО), или одного месяца (Т1Л2.Т6) в неселективной жидкой среде. Анализ 100-160 клонов каждого из трансформантов показал, что все они сохранили способность к рооту на твердой среде с паромомицином. Саузерн-блот-гибридизация ДНК трансформантов ТО и Т6, выделенной до и после периода выращивания без селективного давления, подтвердила, что интегрированная в геном актиномицетная ДНК сохраняется ( рисунок 6Б).

ВЫВОДЫ.

1. Показано,что гибридные бактериальные плазмиды pBR325arg4, pBR327arg4,pSV2neo .содержащие фрагменты ядерной ДНК Chlamydomonas reinhardtii и гетерологичные маркерные гены (аргининсукцинатлиазу из дрожжей Saccharomyces се-revisiae и аминогликозид-З'-фосфотрансферазу из Тп5 под ре-гуляторными элементами вируса SV-4C), способны трансформировать клетки С.reinhardtii с частотой порядка 10~8 и автономно поддерживаться в клетках водоросли. При этом наблюдается высокая' структурная и митотическая нестабильность плазмидной ДНК.

2. Изучена трансформация Chlamydomonas reinhardtii плазмидой pSU937, содержащей ген аминогликозид-З'-фосфот-рансферазы из Streptomyces rimosus к признаку устойчивости к аминогликозидным антибиотикам . Показано, что плазмида pSU937 трансформирует С.reinhardtii с частотой (1.3-2.0) х Ю"7-

3. Получены доказательства стабильной экспрессии гете-рологичного гена (аминогликозид-3'-фосфотрансферазы из S.rimosus) в клетках С.reinhardtii при выращивании культуры в селективных и неселективных условиях по плазмидному маркеру. Стабильная экспрессия гетерологичного гена интегрированного в ядерный геном С.reinhardtii показана впервые.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Сизова И.А.,Клочкова Т.Г..Лапина Т.В.,Т.Г. .Козлов A.B. Препаративное разделение суммарной ДНК Chlamydomonas reln-hardtii на хлоропластную, митохондриальную. ядерные фрак-ции//Биотехнология. 1989. Т5.С.464-469.

2.Сизова И.А. .Лапина Т.В..Клочкова Т. Г..Козлов A.B. Трансформация хламидомонады плазмидами, содержащими фрагменты собственной ядерной ДНК//ДАН. 1989. Т.307.N4. С. 992-995.

3.Лапина Т. В.. Сизова И.А., Козлов А. В. Трансформация хламидомонады плазмидами , содержащими фрагменты, собственной ядерной ДНК //Фотосинтез и фотобиотехнология. Тезисы докладов и сообщений Международной конференции. 1Э91.Пущино.

С.101-102.

4.Сизова И.А. .Лапина Т.В..Козлов A.B. Анализ фрагмента ДНК,изолированного из гибридной автономной плазмиды Chlamydoraortas relnhardtli //Генетика. 1995. Т. 31. N3. С.324-332.

5. Sizova I.A.. Lapina Т.В.. Kozlov F.V., Akopianz,

К.Е.,Danilenko V.N. Expression of kanamycin-resistance gene from Streptomyces rimosus in unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii //9th International Symposium on the biology of Actinomyces. 1994.Theses.Moskow. P-119.