Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточные структуры, вовлеченные в транспорт рибосом-инактивирующих белков II типа

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Клеточные структуры, вовлеченные в транспорт рибосом-инактивирующих белков II типа"

На правах рукописи

I

Козловская Наталия Валерьевна

КЛЕТОЧНЫЕ СТРУКТУРЫ, ВОВЛЕЧЕННЫЕ В ТРАНСПОРТ РИБОСОМ-ИНАКТИВИРУЮЩИХ БЕЛКОВ II ТИПА

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

I

I

Авгорефера! диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2003

Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета Московского Государственного Университета (МГУ) им. М.В. Ломоносова и в лаборатории дизайна и инженерии белков Центра «Биоинженерия» РАН.

Научные руководители: Доктор биологических наук,

С.Г. Егорова

Кандидат биологических наук, М.М. Мойсенович

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

профессор В.Г. Галактионов

Кандидат биологических наук С.П. Домогатский

Ведущая организация: Институт иммунологии МЗ РФ

Защита состоится « » 2003 г. в мин на

заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы Горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « /(Р» М ОЯ^РЛ^ 2003 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, у

кандидат биологических наук —Е.Н. Калистратова

2ооЗ-А

Актуа

Актуальность темы. Рибосом-инактивирующие белки II типа (РИБП) представляют собой гетеродимеры, состоящие из субъединиц двух типов: В-субъединицы, обладающей лектиновой активностью благодаря наличию как минимум двух углевод-связывающих центров, и А-субъединицы, обладающей N-гликозидазной активностью по отношению к 28S-pPHK эукариот. Действие РИБИ приводит к остановке синтеза белка и последующей гибели эукариотических клеток [Barbieri et al., 1993].

РИБИ, строение и лектиновая природа которых позволяют им взаимодействовать с большим количеством клеточных рецепторов, используются особенно интенсивно в качестве инструментов для изучения особенностей связывания лектинов с углеводами и их внутриклеточного транспорта. Данные белки широко применяются при исследовании структурной организации плазматической мембраны, а также при изучении особенностей везикулярного транспорта, сортинга, рециклинга и дислокации белков из эндоплазматического ретикулума (ЭР). Интерес к РИБИ также вызван возможностью создания на их основе вакцин нового поколения и иммунотоксинов - препаратов, избирательно элиминирующих определенные клеточные популяции [Kreitman, 2000].

Описан внутриклеточный путь рицина, включающий такие этапы, как клатрин-зависимый и клатрин-независимьте пути эндоцитоза, доставка в ранние эндосомы, сортинг, рециклинг, ретроградный транспорт в ЭР через аппарат Гольджи (АГ) и транслокация токсина или его А-субъединицы в цитозоль для обеспечения цитотоксического воздействия на рРНК эукариотических клеток [Sandvig, van Deurs, 2000]. Однако существующие в настоящее время литературные данные, описывающие взаимодействие с рецепторами, интернализацию и внутриклеточный путь рицина, не дают полного представления об участии различных клеточных структур в транспорте данного токсина с плазматической мембраны к рибосоме. Более того, та фракция интернализованного рицина, которая достигает АГ и затем ЭР, составляет не более 5% всего пула внутриклеточного рицина. При этом транспорт рицина в АГ не зависит от гаЬ9 и rabil [Iversen et al., 2001]. Остается неясным, куда поступают оставшиеся 95%, хотя в литературе есть свидетельства того, что большая фракция интернализованного рицина

подвергается транспорту в лизосомы.

Особенности интернализации и внутриклеточного транспорта вискумина исследованы менее детально по сравнению с рицином, но из-за структурного сходства с рицином для вискумина предполагают механизмы эндоцитоза и внутриклеточного транспорта, аналогичные таковым у рицина.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследование клеточных структур, участвующих в транспорте РИБИ.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить взаимодействие сходных по структуре РИБП: рицина и вискумина - с клетками-мишенями.

2. Разработать модельные системы для изучения особенностей взаимодействия лектинов с углеводами, организованными в трехмерные надмолекулярные структуры.

3. Получить клеточные линии, экспрессирующие малые ГТФазы как маркеры функциональных доменов эндосомального компартмента. Использовать полученные клеточные линии для изучения ранних этапов транспорта токсинов.

4. Выявить внутриклеточные компартменты, вовлеченные в транспорт токсинов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые приведена сравнительная характеристика особенностей связывания с клеточной поверхностью, интернализации и внутриклеточного транспорта рицина и вискумина. Впервые показано, что, несмотря на структурное сходство, данные токсины связываются с различными участками плазматической мембраны; при этом специфичность к той или иной структуре на поверхности клетки определяется не только сродством лектина к определенным углеводным остаткам, но и пространственным расположением молекул, составляющих клеточные структуры, а также различной трехмерной организацией лектинов. Также показано, что после интернализации с разных участков плазматической мембраны рицин и вискумин, даже находясь в составе одной клеточной структуры, занимают в ней разные домены. Впервые проведено детальное исследование распределения рицина во внутриклеточных структурах после его интернализации. Показано, что рицин, интернализуемый с помощью как клатрин-зависимОго, так и клатрин-независимых механизмов эндоцитоза,

поступает в гаЬ5/гаЬ4-содержащие ранние эндосомы и не проходит в rabl 1-позитивный перинуклеарный рециклинговый компартмент (ГТРК), участвующий в транспорте трансферрина (Тф), внутриклеточный путь которого был подробно описан ранее [Sönnichsen et al., 2000]. Структуры, с которыми длительное время ассоциирован большой пул интернализованного рицина, впервые охарактеризованы как гаЬ5/гаЬ4-позитивные. Впервые показано, что лишь малая часть интернализованных рицина и вискумина проходит в лизосомы. Полученные результаты могут быть использованы для решения ряда прикладных задач, таких как создание препаратов направленного действия и вакцин нового поколения, а также изучение направленной доставки этих препаратов к клеткам-мишеням и особенностей их внутриклеточного транспорта.

Апробация результатов и публикации. Результаты работы были доложены на международной конференции «55th Harden Conference -Dynamics of Membrane Traffic meeting» (Ambleside, UK, 2002), на международной конференции «12th Internationa] Conference on Scanning Tunelling Microscopy/Spectrocopy and Related Techniques» (Eindhoven, the Netherlands, 2003), на межлабораторном семинаре Центра «Биоинженерия» РАН (Москва), на межлабораторных семинарах НИИ трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО) и ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва), на межлабораторных семинарах в Биоцентре Университета им. Гете (Франкфурт-на-Майне, Германия). Апробация диссертации проведена на заседании кафедры физиологии микроорганизмов Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. По материалам диссертации было опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 158 страницах, иллюстрирована 34 рисунками и 3 таблицами. Список литературы содержит 312 источников.

Материалы и методы

Клетки и белки. В работе были использованы следующие клеточные линии: клетки фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ и клетки эпидермальной карциномы человека линии А431 (Университет им. Гете, Франкфурт-на-Майне, Германия; культивировали при 37°С в присутствии 6.1% СО2 в среде DMEM (Gibco Laboratories, Германия), содержащей 10% сыворотки плода коровы (СПК) (Gibco Laboratories, Германия)); клетки Т-лимфомы человека линии Jurkat и клетки миеломы линии sp2/0 (Институт Канцерогенеза, Москва; культивировали при 37°С в присутствии 6.1% С02 в среде RPMI-1640 (Flow Laboratories, Великобритания), содержащей 10% СПК); полученные в ходе работы гибридомы (культивировали при 37°С в присутствии 6.1% С02 в среде ГАТ, а затем переводили на среду RPMI-1640; обе среды содержали 10% СПК). Кроме полученных в работе моноклональных антител (монАТ), использовали рицин из семян клещевины Ricinus communis и вискумин из листев омелы белой Viscum album (НИИТиИО, Москва).

Получение гибридом, продуцирующих монАТ, взаимодействующие с рицином и вискумином по принципу «лектин-лиганд», и очистка монАТ. Для получения гибридом мышей линии Balb/c (питомник «Столбовая», Москва) иммунизировали 5 раз внутрибрюшинно суспензией (в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (здесь и далее рН 7.4)) клеток Т-лимфомы человека линии Jurkat (2-3 млн. клеток - на иммунизацию 1-ой мыши). Слияние иммуных селезеночных В-лимфоцитов и миеломы sp 2/0 проводили на 3-ий день после последней иммунизации в полиэтиленгликоле (Mr 4000) по [Davidson, Gerald, 1977]. Скрининг гибридом проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА). МонАТ выделяли из асцитной жидкости мышей методом аффинной хроматографии на протеин А-сефарозе (LKB-Pharmacia, Uppsala, Швеция). Чистоту препаратов контролировали с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях по [Laemmli, 1970]. Активность полученных монАТ оценивали в ТФИФА.

Трансфекция клеток линии А431. Использовали конструкции на основе вектора pEGFP СЗ, кодирующие rab4a-GFP, rab5a-GFP, rabl 1-GFP (Институт

Макса Планка, Дрезден, Германия), и набор F.ffectene Transfection Kit (QIAGEN Inc., Нидерланды). Трансфекцию проводили согласно рекомендациям производителя. Стабильных трансфектов отбирали на селективной среде, содержащей 1 мг/мл G418 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Германия), до появления колоний и в дальнейшем культивировали на той же среде. Оценку возможных изменений везикулярного транспорта в трансфецированных клетках по сравнению с клетками дикого типа проводили с помощью цитотоксического МТТ-теста по [Mosmann, 1983].

Получение конъюгатов рицина и вискумина с флуоресцентными красителями ФИТЦ и А1еха568. Для конъюгации с А1еха568 использовали набор Molecular Probes (Leiden, Нидерланды); конъюгацию проводили согласно рекомендациям производителя. Для конъюгации с ФИТЦ (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Германия) смешивали сконцентрированные до 2 мг/мл растворы белков в карбонатном буфере и ФИТЦ, разведенный в диметилсульфоксиде (брали разные молярные избытки ФИТЦ). С помощью гель-фильтрации на колонке PD-10 с сорбентом Sephadex G-25 (LKB-Pharmacia, Uppsala, Швеция) очищали пробы от несвязавшегося с белком ФИТЦ. Переводили белки в ФСБ. Оценку возможных изменений молекулярной массы, конформации и биологической активности проводили с помощью электрофореза в 8% и 12% ПААГ (в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях соответственно) по [Laemmli, 1970], с помощью ТФИФА и цитотоксического МТТ-теста по [Mosmann, 1983].

Изучение поливалентного связывания лсктинов с лигандами.

Изучение поливалентного связывания пектинов с лигандами проводили с помощью ТФИФА. 96-луночную плату сорбировали гликозилированными монАТ, разведенными в разных концентрациях. Вносили разные концентрации биотинилированных токсинов. Вносили конъюгат стрептавидин-пероксидаза (ИМТЕК, Россия). В качестве хромогснного маркера пероксидазной реакции использовали о-ортофенилендиамин (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Германия). Калориметрические измерения проводили на униплане «Пикон» при длине волны 492 нм.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (KJICM). Для экспериментов клетки линий NIH ЗТЗ и А431 как дикого типа, так и

трансфецированные выращивали на покровных стеклах при 37°С в присутствии 6.1% С02. Протоколы обработки клеток лигандами описаны в подписях к рисункам в главе «Результаты и обсуждение». Перед получением изображений клетки фиксировали 4%-параформальдегидом и заключали в Мовиол. Для наблюдения за живыми клетками и получения временных серий изображений клетки выращивали на покровных стеклах, заключали в камеры для наблюдения, наполненные средой DMEM, содержащей или не содержащей 10% СПК и забуференной HEPES. В процессе получения изображений живых клеток их содержали в инкубационной камере микроскопа при 37°С в присутствии 6.1% С02. Цифровые изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Confocal Laser Scanning Microscope - CLSM (LEICA TCS 4D, Leica Bensheim, Германия)), оборудованного аргон-криптоновым лазером. Серии оптических срезов получали либо с одного из каналов, либо синхронно с двух. Для возбуждения использовали 488-нм и 568-нм полосы лазера. Использовали как 40х, так и 1 ООх объективы Fluotar (LEICA, Leica Bensheim, Германия). Установку размеров pinhole для получения изображений с высоким разрешением проводили согласно рекомендациям производителей системы, для получения временных серий pinhole был открыт полностью для достижения максимальной глубины резкости. Для деконволюции изображений и подсчета колокализации использовали программное обеспечение Imaris 1, Imaris 3 и «Huygens» (Bitplane, Zurich, Швейцария). Дальнейшую обработку проводили с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop 7.0. Для оценки количества GFP-позитивных эндосом, содержащих меченые лиганды, использовали секционные и полные изображения клеток. Для каждой экспериментальной точки было обработано минимум 400 эндосом.

Атомно-силовая микроскопия. Детекцию макромолекул производили полуконтактным методом на микроскопе Solver Р47Н (NT-MDT, Россия), оборудованном атомарной приставкой. Использовали кантилеверы NSG11S (NT-MDT, Россия). Начальная амплитуда колебаний кантилевера лежала в диапазоне от 5 до 15 нм, величина рабочей точки составляла от 1 до 10% от начальной амплитуды колебаний кантилевера. Наносили 10 или 20 мкл монАТ, разведенных в ФСБ до концентрации 0.5-100 мкг/мл, на твердую

подложку - свежеочищенную слюду (8*8 мм). При исследовании образцы заземляли.

Результаты и обсуждение

В транспорте РИБ II участвуют как структуры поверхности клетки, так и внутриклеточные компартменты. Гликозилированные молекулы, с которыми связываются РИБП, собраны в кластеры на клеточной поверхности и образуют надмолекулярные трехмерные структуры, характеризующиеся многими параметрами, такими как гетерогенность углеводов, расстояние между терминальными остатками углеводов, латеральная подвижность гликозилированных молекул и подвижность их олигосахаридных компонентов. В процессе жизнедеятельности клетки микрорельеф ее поверхности постоянно меняется.

Изучение взаимодействия рицина и вискумина с клеточными структурами проводили на живых и фиксированных клетках, в дополнение к которым использовали бесклеточные модельные системы. Модель на .основе фиксированных клеток позволила исключить из системы такие параметры, как изменение микрорельефа клетки, подвижность углеводной части и латеральная подвижность рецепторов. При этом в модельной системе на основе фиксированных клеток сохраняется гетерогенность Сахаров и микрорельеф, для исключения которых использовали бесклеточные системы, моделирующие надмолекулярные структуры . клеточной поверхности. При создании одной из бесклеточных систем использовали полученные в ходе выполнения работы гликозилированные моноклональные антитела, карбогидратная часть которых взаимодействует с углевод-связывающими центрами рицина и вискумина. • -

Конъюгация рицина и вискумина с ФИТЦ и А1еха568 не привела к изменениям их иммунохимических, биохимических и цитотоксических свойств.

Конъюгация макромолекул может привести к изменению их свойств, что было продемонстрировано на примере внутриклеточного транспорта конъюгатов рицина с золотом и пероксидазой хрена [Van Deurs В. et al., 1986]. В связи с этим были подобраны условия конъюгации рицина и вискумина с флуоресцентными красителями, которые не приводят к

изменениям их биохимических, иммунохимических и биологических свойств, необходимых для связывания с лигандами и внутриклеточного транспорта (рис. 1).

Рисунок 1. Изображение клетки линии №Н ЗТЗ, полученное с помощью КЛСМ. Клетки инкубировали одновременно в присутствии вискумина-ФИТЦ (Б) и вискумина-А1еха568 (В) (по 500 нг/мл) в течение 1 ч. После инкубации клетки отмывали, фиксировали 4% параформальдегидом и заключали в Мовиол. А — фазовый контраст. Маркер, 10 мкм

Взаимодействие рицина и вискумина с рецепторами в модельных системах.

Рицин и вискумин взаимодействуют с разными участками плазматической мембраны.

Рицин практически не взаимодействовал с периферией мембраны и связывался в основном с участками мембраны, расположенными в центре клетки: преимущественно вокруг клеточного ядра и реже непосредственно над ядром. На поверхности клетки рицин выявлял отдельные крупные кластеры; при этом диффузного окрашивания тела клетки рицином не наблюдали (рис. 2 Б).

Вискумин также окрашивал отдельные кластеры на клеточной поверхности. В отличие от структур, выявленных рицином, данные кластеры были расположены не только в пределах клеточного тела, но и на периферии клетки. Часть вискумина была диффузно распределена по всей клеточной поверхности. Наиболее интенсивно вискумин окрашивал мембранные

1С

структуры, локализованные вокруг клеточного ядра, а также расположенные на отдельных участках периферии мембраны, в том числе в области ламеллоподий (рис. 2 Г).

Двойное окрашивание клеток двухдневной культуры линии МЫ ЗТЗ с использованием конъюгатов вискумин-А1еха568 и рицин-ФИТЦ показало, что в области клеточного тела лишь часть токсинов связывается с одними и теми же структурами клеточной поверхности. На участке клеточной мембраны, расположенном около или непосредственно над ядром, было выявлено значительное количество кластеров, окрашенных только одним из токсинов. При этом в данной области наблюдали незначительную колокализацию обоих токсинов (рис. 3).

Аналогичные различия в распределении рицина и вискумина на клеточной поверхности также были выявлены и на живых клетках линии Ы1Н ЗТЗ. Непосредственно после добавления флуоресцентномеченого рицина в культуральную среду данный токсин визуализировали в области клеточного тела, в то время как связывание вискумина с плазматической мембраной происходило на периферии клетки (рис. 4). При этом, в отличие от фиксированных клеток, на живых клетках (рис. 4) наблюдали токсины, как связанные с поверхностью клеток, так и локализованные во внутриклеточных структурах.

Рицин Вискумин

Рисунок 2. Взаимодействие рицина (Б) или вискумина (Г), меченых А1еха568, с фиксированными клетками линии №Н ЗТЗ, 72 часа культивирования до фиксации 4% параформальдегидом. А и В - фазовый контраст. Изображения клеток получены с помощью КЛСМ. Объектив 100. Маркер, 10 мкм (для А и Б) и 15 мкм (для В и Г)

в

Рисунок 3. Изображение клетки линии №Н ЗТЗ, полученное с помощью КЛСМ. Клетки, фиксированные 4% параформальдегидом, коинкубировали в растворе, содержащем желатин (0.2%), в присутствии как вискумина-ФИТЦ (Б), так и рицина-А1еха568 (В) в течение 30 мин при комнатной температуре. А - фазовый контраст. Маркер, 10 мкм

Рисунок 4. Изображение клетки линии Ы1Н ЗТЗ, полученное с помощью КЛСМ. Временные серии отражают связывание с поверхностью клетки и эндоцитоз флуорохром-меченых рицина (А-Г) и вискумина (А'-Г'). Концентрация обоих токсинов 500 нг/мл. Инкубацию проводили при 37°С. Время после добавления токсинов к клетке: 30 сек (А, А'), 2 мин (Б, Б'), 5 мин (В, В'), 10 мин (Г, Г'). Связывание токсинов с клеточной поверхностью и их локализация в эндосомальных структурах показаны совместно спустя 30 сек, 2, 5 и 10 мин после добавления меченых токсинов. Маркер, 20 мкм

А'

С '" ' В'

У /

I" ... г

Связывание пектинов с лигандами в бесклеточных модельных системах.

Были получены 5 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, взаимодействующие с рицином и вискумином по принципу «лектин-лиганд» и не взаимодействующие по принципу «антиген-антитело». Связывание рицина и вискумина с данными антителами происходит благодаря взаимодействию между углевод-связывающими центрами токсинов и карбогидратной частью антител. Из полученных пяти моноклональных антител для дальнейшей работы было выбрано одно: 3F12A6B5D11.

На основе данных антител была разработана модельная система, где взаимодействие между антителами и токсинами происходит за счет связывания углевод-связывающих центров лектинов с карбогидратной частью антител. При сорбции монАТ 3F12A6B5D11 на твердую фазу в малой (1 мкг/мл) концентрации наблюдали более сильное взаимодействие карбогидратной части данных антител с вискумином, чем с рицином (рис. 5 А). Увеличение концентрации сорбированных на иммунологическую плату антител приводило к усилению связывания с ними рицина, и при сорбции антител на твердую фазу в концентрации 50 мкг/мл наблюдали одинаковое взаимодействие углевод-связывающих центров рицина и вискумина с карбогидратной частью гликозилированных антител (рис. 5 Б).

Организацию "трехмерных надмолекулярных структур, образованных гликозилированными антителами, изучали с помощью атомно-силовой микроскопии. При сорбции антител па твердую фазу (слюду) в количестве 0.005 мкг наблюдали распределение антител на твердой фазе на расстоянии друг от друга 20-40 нм и более (рис. 6), что во много раз превосходит расстояние между галактоз-связыпающими центрами как рицина (75 А, или 7.5 нм) [Wales et al., 1991], так и вискумина (табл. 1). Увеличение количества сорбированных на слюду антител до 0.02 мкг приводило к сближению соседних молекул антител на расстояние 5-15 нм, при этом между некоторыми молекулами антител сохранялось расстояние 20-40 нм (рис. 6). При повышении количества антител до 1 мкг наблюдали сближение соседних молекул антител на расстояние менее 1 нм и образование трехмерных надмолекулярных структур высокой плотности (рис. 6).

Концентрация токсинов, мкг/мл

Концентрация токсинов, мкг/мл

- R60bi

■MLIbi

А

-R60bi

•MLIbi

Рисунок 5. Взаимодействие биотинилированных рицина (1160Ы) и вискумина (МЫЫ) с монАТ ЗР12А6В5011, сорбированными на твердую фазу в концентрации: А - 1 мкг/мл; Б - 50 мкг/мл. ОП, 492 нм - оптическая плотность, измеренная при длине волны 492 нм

1 мкг

~ 1 нм и меньше

0.02 мкг

5-15 нм

0.005 мкг С

20-40 нм min

Рисунок 6. Полученные с помощью атомно-силовой микроскопии изображения молекул антител, сорбированных на твердую фазу в разных концентрациях. С - количество монАТ, нанесенное на слюду (8*8 мм) (мкг); min - минимальное расстояние между соседними молекулами антител (нм)

»

Домены В-субъединицы Центры Расстояние, А (нм)

В1 -ВГ al -al' 15(1.5)

В2 - В2' у2 - у2' 87 (8.7)

В1 -В2 al - у2 47 (4.7)

В1 - В2' al - у2' 47 (4.7)

Таблица 1. Расстояние между углевод-связывающими центрами гомодимера вискумина (АВ)2 [Niwa et al., 2003]

Результаты, представленные на рисунках 2-4, иллюстрируют связывание рицина и вискумина с разными участками плазматической мембраны. Ранее было показано, что рицин и вискумин, с одинаковой аффинностью связывающие галактозу в растворе, обладают разной специфичностью к дисахаридам [Wu et al., 1995]. В результате гетерогенности углеводов, входящих в состав кластеров, и неоднородного распределения данных кластеров на плазматической мембране специфичность рицина и вискумина к тому или иному кластеру может различаться, обусловливая разницу в локализации данных токсинов.

Результаты, полученные в бесклеточных системах (рис. 5, 6), показывают, что во взаимодействие рицина и вискумина с трехмерными структурами клеточной поверхности вносит вклад не только специфичность углевод-связывающих центров по отношению к определенным углеводным остаткам или дисахаридам, но и пространственная организация В-цепи вцелом. Трехмерная структура вискумина может накладывать ограничения на взаимодействие с надмолекулярными кластерами рецепторов, связывание с которыми возможно для рицина, и наоборот (рис. 2-4). j Трехмерная организация рицина и вискумина и пространственное

расположение их углевод-связывающих центров обусловливает возможность ! их поливалентного взаимодействия с лигандами. Данное взаимодействие

является более сильным, чем моновалентное [Fulton et al., 2002].

Разница в расстоянии между галактоз-связывающими центрами у рицина и вискумина, а также их взаимное расположение, способность лектинов к тетрамеризации и образованию ассоциатов могут объяснять различное

взаимодействие рицина и вискумина с надмолекулярными структурами клеточной поверхности (рис. 2-4) и смоделированными в бесклеточных системах на основе гликозилированных антител (рис. 5, 6).

Различное распределение рицина и вискумина во внутриклеточных компартментах.

Рицин и вискумин связываются с разными участками клеточной поверхности (рис. 2-4) и, следовательно, интернализуются с разных областей плазматической мембраны (рис. 4). Спустя 5 минут после добавления в культуральную среду оба токсина могли быть выявлены в тубулярных и везикулярных структурах, локализованных в разных участках клетки (рис. 4 В, Г, В', Г).

После часовой инкубации в присутствии рицина-А1еха568 и вискумина-ФИТЦ на клетках линии №Н ЗТЗ детектировали различное распределение данных лектинов в тубулярных и везикулярных внутриклеточных структурах. При этом рицин и вискумин, находясь даже внутри одной и той же структуры, не перемешивались в ней, а занимали отдельные ее области (рис. 7).

Вискумин Рицин

Рисунок 7. Изображения участка эндосомального компартмента клетки линии Ы1Н ЗТЗ, полученные с помощью КЛСМ через 1 час после 5-минутной инкубации клеток в присутствии виску мин а-ФИТЦ и рицина-А1еха568 (оба в концентрации 500 нг/мл) при 37°С. Связанные с клеточной поверхностью токсины были удалены при инкубации клеток в присутствии

10 мМ лактозы. Были сделаны временные серии изображений, каждое из которых было получено через интервал в 1 сек. Временной интервал между изображениями, представленными на данном рисунке, составляет 21 сек. Цифры слева отображают время (в сек) после начала получения временных серий изображений. Звездочками (*) обозначены структуры, содержащие только рицин; квадратами (Q) - структуры, содержащие только вискумин. Маркер, 1 мкм

Полученные данные можно объяснить разной трехмерной организацией токсинов и отличиями в их специфичности к рецепторам и надмолекулярным структурам клеточной поверхности, в результате которых токсины, подвергаясь эндоцитозу с разных участков плазматической мембраны, транспортируются в сортинговый компартмент, оставаясь связанными с теми участками мембраны, откуда прошла их интернализация.

В результате сортинга в ранних эндосомах интернализованный материал может частично рециркулировать к клеточной поверхности, а также поступает либо в поздние эндосомы и лизосомы для деградации [Sorkin, 2001; Woodman, 2000], либо в АГ [Mallard et al., 1998], либо в ПРК [Sönnichsen et al., 2000].

После часовой инкубации клеток линии NIH ЗТЗ в присутствии рицина-А1еха568 или вискумина-А1еха568 наблюдали незначительную ассоциацию I токсинов с АГ, мембраны которого визуализировали с помощью церамида,

меченого красителем Bodipy. Полученные результаты согласуются с литературными данными о прохождении в АГ только 5% интернализованного рицина [Sandvig, van Deurs, 1996; Llórente et al., 1998].

После часовой инкубации клеток линии NIH ЗТЗ в присутствии рицина и вискумина не наблюдали значительной ассоциации токсинов с компонентами LAMP2-no3HTHBHoro лизосомального компартмента. Более , того, даже после двухчасовой инкубации клеток линии А431 в присутствии

рицина не более 5% рицин-содержащих везикул были позитивны по маркеру лизосом "LysoTracker" (Molecular Probes, Leiden, Нидерланды) (рис. 8).

l.vsoTracker

LysoTracker

LvsnTrackcr

Рисунок 8. Изображения клетки линии А431, полученные с помощью КЛСМ. Клетки инкубировали с рицином-ФИТЦ в течение 10 мин, а затем в среде без токсина. ЬуБоТгаскег добавляли за 20 мин до окончания инкубации. Слева указано общее время инкубации клеток с рицином-ФИТЦ (в мин). Перед фиксацией рицин-ФИТЦ, связанный с клеточной поверхностью, отмывали ледяным ФСБ, содержащим 100 мМ лактозу. Маркер, 5 мкм

Участие эидосомального компартмента в транспорте рицина.

Изучение внутриклеточного транспорта токсинов проводили с помощью КЛСМ. Для исследования внутриклеточного транспорта рицина клетки линии А431 были трансфецированы генетическими конструкциями, кодирующими малые ГТФазы rab4-, гаЬ5- и rabll-GFP. Влияние трансфекции на везикулярный транспорт и, следовательно, внутриклеточный путь рицина в клетках А431, экспрессирующих rab4-, гаЬ5- и rabll-GFP, оценивали с помощью цитотоксического МТТ-теста. Показали, что внутриклеточный транспорт в трансфецированных клетках не изменился по сравнению с клетками дикого типа.

На клетках линии А431, экспрессирующих rab5-GFP, показали, что рицин колокализован с гаЬ5 непосредственно после добаления его к клеткам и с течением времени уровень колокализации pacici, незначительно уменьшаясь к 15-й минуте с момента связывания токсина с клеточной поверхностью (рис. 9).

На клетках линии А431, экспрессирующих rab4-GFP, отчетливую колокализацию рицина и гаЬ4 наблюдали, начиная со 2-й минуты после связывания токсина с мембраной клетки. С течением времени количество везикул, содержащих только рицин, уменьшалось, и на 15-й минуте

количество рицин-, гаЬ4-позитивных эндосом составляло 50% от общего количества структур, содержащих рицин; остальные рицин-меченые везикулы находились в непосредственной ассоциации с гаЬ4 (рис. 9).

На клетках линии А431, экспрессирутощих rabll-GFP, наблюдали низкий уровень колокализации рицина и rabil до 15-й минуты после взаимодействия рицина с клеточной поверхностью. Однако, в указанный временной интервал многие эндосомы. содержащие рицин, находились в непосредственной близости от rabí 1-позитивных структур (рис. 9).

Время инкубации в среде без токсина (мии)

Рисунок 9. Ассоциация рицина с rab5-, гаЬ4- или rabí 1-мечеными структурами клеток линии А431, экспрессирующих или rab5-, или гаЬ4-*или rabll-GFP. Инкубацию клеток с рицином-А1еха568 проводили в течение 2 мин, а затем инкубировали клетки в среде без токсина в течение: 0, 2, 10 и 15 мин. Указан процент рицин/гаЬ-содержаших структур от общего количества структур, меченых рицином

Таким образом, ранние этапы эндосомального транспорта рицина опосредованы гаЬ5/гаЬ4-позитивными эндосомами, характеризующимися низким содержанием rabí 1. Такое распределение данных ГТФаз типично для сортирующих эндосом [Trischler et al., 1999]. Полученные результаты показывают, что ранние эндосомы представляют собой гу эндомембранную систему, которая отвечает за стадии транспорта рицина, происходящие непосредственно после интернализации.

1S

На клетках линии А431, экспрессируюших гаЬ4-СРР, показали, что спустя 30 мин после связывания с рецепторами клеточной поверхности рицин продолжает занимать гаЬ4-позитивный компартмент (рис. 10).

Рисунок 10. Изображение клетки линии А431, экспрессирующей гаЬ4-GFP, полученное с помощью КЛСМ. Клетки инкубировали 5 мин в присутствии рицина-А1еха568 с последующей 15-минутной отмывкой в среде DMEM и 10-минутной инкубацией в присутствии 10 мМ лактозы. При этом практически весь рицин детектировали в гаЬ4-позитивном компартменте. Прямоугольник в верхнем правом углу каждого изображения иллюстрирует эндосомы с большим увеличением. Маркер, 5 мкм

Было показано, что транспорт рицина в АГ не зависит от гаЬ9 и rabil [Iversen et al., 2001]. Однако, это не исключает возможности существования транспорта рицина в ПРК, что может быть одним из способов, позволяющих избежать деградации в лизосомах, что было описано для трансферрина [Sonnichsen et al., 2000].

На клетках линии А431, экспрессирующих rab 11-GFP, показали, что в течение 30 минут с момента интернализации сохраняется низкий уровень колокализации (около 6%) рицина с rabí 1 (рис. 11).

Сравнение поздних этапов транспорта рицина и трансферрина, транспорт которого через rab5-, гаЬ4- и rabí 1-содержащие структуры был хорошо охарактеризован ранее [Sonnichsen et al., 2000], показывает практически полное отсутствие колокализации рицина с Тф, находящимся в ПРК (рис.

Рисунок 11. Колокализация Тф- или рицин-позитивных везикул с гаЬП-содержащими структурами клеток линии А431, экспрессирующих гаЫ1-вРР. Клетки инкубировали в присутствии Тф-А1еха568 (1) или рицина-А1еха568 (2) в течение 30 мин или с Тф-А1еха568 или рицином-А1еха568 в течение 20 мин с последующей 10-минутной инкубацией в присутствии немеченого Тф (1') или в присутствии 10 мМ лактозы (2') соответственно

3 л й*

зо -

25

20

В* =

С *

" р!

а

в о

х в

к а «

з <в £ 10

1 | 5

Рисунок 12. Процент рицин-позитивных структур, содержащих Тф, в клетках линии А431 дикого типа. 1 - Высокий уровень колокализации рицина и Тф. Клетки инкубировали в условиях, для которых ранее было показано присутствие практически всего Тф в ранних эндосомах с

небольшой фракцией в ПРК [Sörmichsen et al., 2000]. 2 - Небольшое уменьшение количества структур, содержащих и рицин и Тф. Клетки инкубировали в условиях, для которых ранее было показано присутствие Тф как в ранних эндосомах, так и в ПРК [Sönnichsen et al., 2000]. 3 -Значительное уменьшение количества структур, содержащих и рицин и Тф. Клетки инкубировали в условиях, для которых ранее было показано присутствие всего Тф в ПРК [Sönnichsen et al., 2000].

Полученные данные показывают, что рицин избегает транспорта в ПРК и судьба практически всего внутриклеточного пула рицина не зависит от rabil.

Рицин остается в гаЬ4-позитивных структурах даже после четырехчасовой инкубации с клетками А431. Возможно, причинами столь долгого присутствия рицина в ранних эндосомах являются способность токсина осуществлять поливалентные взаимодействия и присущее его молекулам свойство формировать ассоциации и проходить в мембрану везикул благодаря гидрофобным силам [Venkatesh, Lambert, 1997; Steeves et al., 1999; Sweeney et al., 1998; Agapov et al., 1997; Ramalingam et al., 1994; Day et al.. 2002]. Поливалентные взаимодействия могут приводить к формированию стабильных комплексов «токсин-мембрана», затрудняющих подвижность токсина и его выход из ранних эндосом в составе везикул, в норме предназначенных для слияния с лизосомами, ПРК и мембранами Гольджи.

Выводы

1. При взаимодействии с клеточными структурами рицин и вискумин проявляют специфичность, которая выражается в их ассоциации с разными доменами плазматической мембраны и эндосомального компартмента.

2. На специфичность взаимодействия токсинов с клеточными структурами влияют особенности взаимного расположения терминальных Сахаров гликозилированных молекул.

3. Функциональные домены ранних эндосом, содержащие малые ГТФазы гаЬ5 и гаЬ4, опосредуют начальные этапы внутриклеточного транспорта и сортинг рицина.

4. В отличие от коиъюгатов рицина с пероксидазой хрена или с коллоидным золотом, основная фракция внутриклеточного флуоресцентномеченого рицина детектируется в ранних эндосомах, а не в лизосомах.

5. Перинуклеарный рециклинговый компартмент и малая ГТФаза rabl 1 не участвуют в транспорте рицина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. М.М. Мойсенович, С.Г. Егорова, О.В. Челнокова, И.А. Демина, Е.Р. Полосухина, Н.В. Козловская, Е.Н. Попова, Г.В. Фаттахова, О.Н. Солопова, И.И. Агапов. // Влияние схемы иммунизации на эпитопную направленность моноклональных антител, взаимодействующих со связывающей субъединицей вискумина. [М.М. Moisenovich, S.G. Egorova, O.V. Chelnokova,

I.A. Demina, E.R. Polosukhina, N.V. Kozlovskaya, E.N. Popova, G.V. Fattakhova, O.N. Solopova, I.I. Agapov // Importance of protocol immunization in epitope selectivity of monoclonal antibodies interacting with binding subunit of viscumin.] // Russian Journal of Immunology, vol. 5, № 4, pp. 375-384, 2000

2. М.М. Мойсенович, И.И. Агапов, С.Г. Егорова, О.В. Челнокова, Н.В. Козловская, Г.В. Фаттахова, Ю. Бирайтер-Хан, А.Г. Тоневицкий. // Внутриклеточные антитела не оказывают влияния на транспорт белковых токсинов. // Доклады Академии Наук, т. 379, № 3, стр. 406-410, 2001

3. М.М. Мойсенович, И.А. Демина, И.И. Агапов, О.В. Челнокова, Н.В. Козловская, Ю. Бирайтер-Хан, А.Г. Тоневицкий, акад. РАН В.И. Шумаков. // Рицин и вискумин связываются с разными участками клеточной мембраны. // Доклады Академии Наук, т. 383, №6, стр. 175-178,2002

4. М. Sawateev, N. Kozlovskaya, М. Moisenovich, A. Tonevitsky, I. Agapov, V. Bykov, M. Kirpichnikov. // Atomic force microscopy for investigation of ribosome-inactivating proteins' type II tetramerization. // Book of Abstracts «12th International Conference on Scanning Tunelling Microscopy/Spectrocopy and Related Techniques» (July 21-25, 2003, Eindhoven, the Netherlands), p. Mo-Pos-

II,2003

5. Н.В. Малюченко, А.Г. Тоневицкий, M.H. Савватеев, В.А. Быков, М.М. Мойсенович, И.И. Агапов, Н.В. Козловская, B.C. Архипова, С.Г. Егорова, М.П. Кирпичников. // Исследование структурных особенностей белков

прерывисто-контактным методом атомно-силовой микроскопии. // Биофизика, т. 48, вып. 5, стр. 830-836, 2003

Работа финансировалась грантами В МБР 0081/99 1314/7516, РФФИ 693-126, 693-1-116 и совместным Российско-Американским грантом С1ШР Ю\Ч-403.

Список сокращений

АГ - аппарат Гольджи

ГАТ - среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин

ГТФаза — гуанозин-трифосфатаза

KJICM - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

монАТ — моноклональные антитела

МТТ - 3-(4,5,-диметилтиозолил-2-ил)-2,5-дифенилтетрозолий бромид

ОП - оптическая плотность

ГТААГ - полиакриламидный гель

Г1РК - перинуклеарный рециклинговый компартмент

РИБ11 - рибосоминактивирующий(-ие) белок(-ки) второго типа

СПК - сыворотка плода коровы

Тф - трансферрин

ТФИФА - твердофазный иммуноферментный анализ

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭР - эндоплазматический ретикулум

CLSM - Confocal Laser Scanning Microscope

GFP - green fluorescent protein

LAMP2 - lysosomal associated membrane protein-2

MLI - виску мин

MLIbi - биотинилированный вискумин

R60 - рицин

R60bi - биотинилированный рицин

Подписано в печать 15.11.2003 Формат 60x88 1/16. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 107. Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ. к. 102

2¿>© j-А i&éfg

№ 18 6 98

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Козловская, Наталия Валерьевна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Клатрин-зависимый эндоцитоз

1.2. Клатрин-независимый эндоцитоз

1.2.1. Макропиноцитоз

1.2.2. Эндоцитоз, опосредованный липидными рафтами и кавеолами

1.3. Везикулярный транспорт, сортинг и рециклинг

1.3.1. Малые ГТФазы гаЬ

1.3.2. Ранние, или сортинговые, эндосомы

1.3.3. Перинуклеарный рециклинговый компартмент

1.3.4. Внутриклеточный транспорт структур, опосредующих клатрин-независимую интернализацию молекул

1.3.4.1. Структуры, эндоцитоз которых опосредован кавеолами и липидными рафтами

1.3.4.2. Структуры, интернализованные посредством макропиноцитоза

1.3.5. Ретроградный транспорт

1.4. Основные этапы гликозилирования мембранных и секреторных белков в клетках млекопитающих

1.4.1. К-связанные олигосахариды

1.4.2. О-связанные олигосахариды

1.4.3. Гликозилирование в АГ

1.5. Рибосом-инактивирующие белки II типа как инструмент для изучения внутриклеточных процессов

1.5.1. Рицин

1.5.2. Вискумин

1.5.3. Взаимодействие РИБИ с плазматической мембраной и внутриклеточный транспорт токсинов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Клетки

2.3. Получение моноклональных антител, взаимодействующих с токсинами не по принципу «антиген-антитело», а по принципу «лектин-лиганд»

2.4. Трансфекция клеток линий А431 и ЗТЗ

2.5. Получение конъюгатов рицина и вискумина с флуорохромами ФИТЦ иА1еха

2.6. Проведение электрофореза

2.7. Изучение поливалентного связывания лектинов с лигандами

2.8. Оценка возможных конформационных изменений, произошедших в результате конъюгации рицина и вискумина с флуоресцентными красителями

2.9. Определение лектиновой активности рицина и конъюгатов рицина и вискумина

2.10. Оценка цитотоксической активности конъюгатов рицина и вискумина с флуорохромами

2.11. Оценка возможных изменений внутриклеточного транспорта рицина, произошедших в результате трансфекции, с помощью МТТ-теста

2.12. ТФИФА на клетках

2.13. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

2.14. Иммунофлуоресценция

2.15. Атомно-силовая микроскопия (АСМ)

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Конъюгация рицина и вискумина с флуоресцентными красителями ФИТЦ и А1еха568 не привела к изменениям их иммунохимических, биохимических и биологических свойств

3.2. Взаимодействие рицина и вискумина с рецепторами клеточной поверхности в модельных системах

3.2.1. Рицин и вискумин взаимодействуют с разными участками поверхности фиксированных клеток

3.2.2. Связывание лектинов с лигандами в бесклеточных модельных системах

3.2.2.1. Получение гибридом, продуцирующих гликозилированные моноклональные антитела, с кардогидратной частью которых взаимодействуют углевод-связывающие центры рицина и вискумина

3.2.2.2. Взаимодействие рицина и вискумина с гликозилированными моноклональными антителами

3.2.2.3. Взаимодействие рицина и вискумина с асиалофетуином

3.2.2.4. Изучение организации трехмерных структур, создаваемых гликозилированными антителами

3.3. Различное распределение рицина и вискумина во внутриклеточных компартментах

3.4. Участие эндосомального компартмента в транспорте рицина

3.4.1. Трансфекция клеток линии А431 не влияет на внутриклеточный транспорт рицина

3.4.2. После интернализации рицин проходит через rab4/rab5-позитивный эндосомальный компартмент, характеризующийся низким содержанием rabil

3.4.3. Трансферрин и рицин проходят через одни и те же ранние эндосомы

3.4.4. Пути рицина и трансферрина расходятся на поздних этапах эндосомального транспорта

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточные структуры, вовлеченные в транспорт рибосом-инактивирующих белков II типа"

Клетка представляет собой многофункциональную систему, все компоненты которой находятся под строгой регуляцией. Исследование физиологии клетки предполагает изучение строения и функционирования ее структур, участвующих в процессах движения клеток, обмена мембран и транспорта белков.

Физиологические процессы как отдельной клетки, так и многоклеточного организма определяются взаимоотношениями различных молекул между собой. Особую роль играют взаимодействия «лектин-лиганд», вовлеченные в такие процессы, как адгезия и подвижность клеток, межмолекулярные и межклеточные взаимодействия, поддержание структуры ткани, передача внутриклеточных сигналов (сигнальная трансдукция). Многие биологические процессы, включая адгезию клеток и сигнальную трансдукцию, опосредованы мультивалентными взаимодействиями, благодаря которым возможны несколько одновременных контактов между молекулами лектинов и лигандов.

Лектиновая природа рибосом-инактивирующих белков II типа (РИБП) позволяет использовать данные белки в качестве инструмента для изучения клеточных струтур и процессов, опосредованных ими. К семейству РИБН относятся белки, в состав которых входят субъединицы двух типов. Классическим представителем данного семейства является рицин, представляющий собой гетеродимер, состоящий из двух ковалентно связанных субъединиц: каталитически активной (active) А-субъединицы (A-цепи) и связывающей (binding) В-субъединицы (В-цепи), опосредующей взаимодействие данного лектина с углеводами. Содержание двух галактоз-связывающих центров в В-субъединице обусловливает осуществление как moho-, так и бивалентного взаимодействия «рицин-лиганд».

Другой представитель семейства РИБП - вискумин - может иметь как димерную, так и тетрамерную организацию. Возможность существования вискумина как тетрамера и наличие четырех углевод-связывающих центров в одной его молекуле также создают предпосылки для осуществления мультивалентного взаимодействия данного лектина с разнообразными лигандами.

Строение РИБИ позволяет использовать их при изучении особенностей связывания лектинов, в том числе и мультивалентных взаимодействий, с углеводами, а также при исследовании структурной организации плазматической мембраны, отличающейся гетерогенностью и неоднородностью распределения элементов на ее поверхности.

После связывания с рецепторами клеточной поверхности РИБП подвергаются как клатрин-зависимому, так и клатрин-независимому эндоцитозу. Данные процессы опосредованы разными клеточными структурами, предопределяющими дальнейшую внутриклеточную судьбу интернализованных молекул. В литературе описан внутриклеточный путь рицина, включающий такие этапы, как доставка в ранние эндосомы, сортинг, рециклинг и ретроградный транспорт в эндоплазматический ретикулум (ЭР) через аппарат Гольджи (АГ) [Sandvig, van Deurs, 2000]. Финальным этапом внутриклеточного транспорта рицина является диссоциация от В-субъединицы A-цепи и транслокация ее в цитозоль, где A-цепь действует как фермент, выщепляя остаток аденина из 28S рибосомальной РНК, что приводит к остановке синтеза белка в клетке [Barbieri et al., 1993]. Механизм и место транслокации А-субъединицы в цитозоль в настоящее время изучены не полностью. Существует ряд доказательств осуществления транслокации из ЭР в цитоплазму с использованием механизмов экспорта неправильно свернутых белков для последующей деградации [Klausner, Sitia, 1990; Rapak et al., 1997]. Из-за структурного сходства с рицином для вискумина предполагают механизмы интернализации и внутриклеточного транспорта, аналогичные таковым у рицина.

Использование РИБН в качестве меток для изучения клеточных структур и биологических процессов, опосредованных ими, может способствовать решению ряда фундаментальных задач, включая исследование взаимодействий «лектин-лиганд» и особенностей внутриклеточного транспорта лектинов, а также изучение физиологически важных внутриклеточных процессов, таких как везикулярный транспорт, сортинг, рециклинг, дислокация белков из ЭР. Кроме того, изучение внутриклеточного транспорта токсинов и структур, опосредующих его, может быть полезно для решения ряда прикладных задач, включая создание препаратов направленного действия (иммунотоксинов) и противовирусных вакцин нового поколения.

Целью работы было исследование клеточных структур, участвующих в транспорте РИБП.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить взаимодействие сходных по структуре РИБИ: рицина и вискумина - с клетками-мишенями.

2. Разработать модельные системы для изучения особенностей взаимодействия лектинов с углеводами, организованными в трехмерные надмолекулярные структуры.

3. Получить клеточные линии, экспрессирующие малые ГТФазы как маркеры функциональных доменов эндосомального компартмента. Использовать полученные клеточные линии для изучения ранних этапов транспорта токсинов.

4. Выявить внутриклеточные компартменты, вовлеченные в транспорт токсинов.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Козловская, Наталия Валерьевна

ВЫВОДЫ

При взаимодействии с клеточными структурами рицин и вискумин проявляют специфичность, которая выражается в их ассоциации с разными доменами плазматической мембраны и эндосомального компартмента.

На специфичность взаимодействия токсинов с клеточными структурами влияют особенности взаимного расположения терминальных Сахаров гликозилированных молекул.

Функциональные домены ранних эндосом, содержащие малые ГТФазы гаЬ5 и гаЬ4, опосредуют начальные этапы внутриклеточного транспорта и сортинг рицина.

В отличие от конъюгатов рицина с пероксидазой хрена или с коллоидным золотом, основная фракция внутриклеточного флуоресцентно меченого рицина детектируется в ранних эндосомах, а не в лизосомах.

Перинуклеарный рециклинговый компартмент и малая ГТФаза гаЬ 11 не участвуют в транспорте рицина.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор работы очень признателен и выражает глубокую благодарность своим родителям: Галине Николаевне и Валерию Дмитриевичу Козловским - за поддержку и помощь, оказанные ими во время выполнения и оформления диссертационной работы.

Автор данной работы искренне благодарен научным руководителям: Светлане Григорьевне Егоровой и Михаилу Михайловичу Мойсеновичу — за доброе отношение и ценные советы, которые были получены при выполнении и оформлении диссертационной работы.

Автор данной работы также хотел бы искренне поблагодарить всех сотрудников кафедры физиологии микроорганизмов МГУ им. М.В. Ломоносова, в том числе М.В. Гусева, К.В. Фрезе, М.Н. Мерзляка, Т.Г. Корженевскую, В.Д. Самуилова, A.B. Киташова, сотрудника кафедры Биоинженерии МГУ им. М.В. Ломоносова Н.В. Малюченко, сотрудника фирмы NT-MDT М.Н. Саватеева, сотрудника Университета им. Гете Ю. Бирайтера

• Хана, сотрудников НИИТиИО А.Г. Тоневицкого, И.А. Демину, сотрудников лаборатории дизайна и инженерии белков Центра «Биоинженерия» РАН И.С. Комолова, О.В. Челнокову, сотрудников ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов И.И. Агапова, E.H. Попову, а также B.C. Архипову, М.Н. Юркову, А.Н. Федорова.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведен сравнительный анализ особенностей связывания с клеточной поверхностью, интернализации и внутриклеточного транспорта двух растительных РИБН: рицина и вискумина. Показано, что, несмотря на структурное сходство, данные лектины взаимодействуют с различными участками клеточной поверхности. Такая специфичность к структурам плазматической мембраны определяется не только сродством лектина к определенным углеводным остаткам, но и пространственным расположением углеводных компонентов гликозилированных молекул клеточной поверхности, а также особенностями трехмерной организации лектинов. Показано, что после интернализации с разных участков плазматической мембраны рицин и вискумин, даже находясь в составе одной клеточной структуры, занимают в ней разные домены.

Проведено детальное исследование распределения рицина во внутриклеточных структурах после его интернализации; при этом в качестве дополнительного трейсера использовали трансферрин, внутриклеточный путь которого был хорошо охарактеризован ранее. Показано, что рицин, интернализуемый с помощью как клатрин-зависимого, так и клатрин-независимых механизмов эндоцитоза, поступает в гаЬ5/гаЬ4-содержащие ранние эндосомы.

Показано, что лишь малая часть интернализованных рицина и вискумина ассоциированы с мембранами АГ, что соответствует литературным данным о прохождении в АГ около 5% внутриклеточного пула рицина.

Показано, что только небольшая фракция внутриклеточных рицина и вискумина проходит в лизосомы. При этом рицин не проходит в rabí 1-позитивный перинуклеарный рециклинговый компартмент, транспорт в который может быть одним из способов избежать деградации в лизосомах, что описано для трансферрина. Структуры, с которыми длительное время ассоциирован большой пул интернализованного рицина, охарактеризованы как гаЬ5/гаЬ4-позитивные.

Полученные результаты могут быть использованы для решения ряда прикладных задач, таких как создание препаратов направленного действия и вакцин нового поколения, а также изучение направленной доставки этих препаратов к клеткам-мишеням и особенностей их внутриклеточного транспорта.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козловская, Наталия Валерьевна, Москва

1. Abeijon С., Hirschberg C.B. // Topography of glycosylation reactions in the endoplasmic reticulum. // Trends Biochem Sci, v. 17, pp. 32-36, 1992

2. Agapov I.I., Tonevitsky A.G., Shamshiev A.T., Pohl E., Pohl P., Palmer R.A., Kirpichnikov M.P. // The role of structural domains in RIP II toxin model membrane binding. // FEBS Lett, v. 402, pp. 91-93, 1997

3. Allison A.C., Davies P., De Pétris S. // Role of contractile microfilaments in macrophage movement and endocytosis. //Nature New Biol, v. 232, pp. 153155, 1971

4. Alpuche-Aranda C.M., Racoosin E.L., Swanson J.A., Miller S.I. // Salmonella stimulate macrophage macropinocytosis and persist within spacious phagosomes. //J Exp Med, v. 179, pp. 601-608, 1994

5. Anderson H.A., Chen Y., Norkin L.C. // MHC class I molecules are enriched in caveolae but do not enter with simian virus 40. // J Gen Virol, v. 79, pp. 14691477, 1998

6. Anderson R.G.W. // The caveolae membrane system. // Annu Rev Biochem, v. 67, pp. 199-225, 1998

7. Araki N., Hatae T., Yamada T., Hirohashi S. // Actinin-4 is preferentially involved in circular ruffling and macropinocytosis in mouse macrophages: analysis by fluorescence ratio imaging. // J Cell Sci, v. 113, pp. 3329-3340, 2000

8. Araki N., Johnson M.T., Swanson J.A. // A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. // J Cell Biol, v. 135, n. 5, pp. 1249-1260, 1996

9. Arreaza G., Brown D.A. // Sorting and intracellular trafficking of a glycosylphosphatidylinositol-anchored protein and two hybrid proteins with the same ectodomain in MDCK kidney epithelial cell. // J Biol Chem, v. 270, pp. 23641-23647, 1995

10. Atwood W.J., Norkin L.C. // Class I major histocompatibility proteins as cell surface receptors for simian virus 40. // J Virol, v. 63, pp. 4474-4477, 1989

11. Babiychuk E.B., Draeger A. // Annexins in cell membrane dynamics: Ca2+-regulated association of microdomains. // J Cell Biol, v. 150, pp. 1113-1123, 2000

12. Baird B., Sheets E.D., Holowka D. // How does the plasma membrane participate in cellular signaling by receptors for immunoglobulin E? // Biophys Chem, v. 82, pp. 109-119, 1999

13. Barbero P., Bittova L., Pfeffer S.R. // Visualization of Rab9-mediated vesicle transport from endosomes to the trans-Golgi in living cells. // J Cell Biol, v. 156, pp. 511-518,2002

14. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. // Ribosome-inactivating proteins from plants. // Biochim Biophys Acta (BBA), v. 1154, pp. 237-282, 1993

15. Bar-Sagi D., Feramisco J.R. // Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. // Science, v. 233, pp. 10611068, 1986

16. Beaumelle B., Taupiac M.P., Lord J.M., Roberts L.M. // Ricin A Chain Can Transport Unfolded Dihydrofolate Reductase into the Cytosol. //J Biol Chem, v. 272, pp. 22097-22102, 1997

17. Beck K.A., Buchanan J.A., Malhotra V., Nelson W.J. II Golgi spectrin: Identification of an erythroid a-spectrin homolog associated with the Golgi complex. // J Cell Biol, v. 127, pp. 707-723, 1994

18. Beck K.A., Keen J.H. // Interaction of phosphoinositide cycle intermediates with the plasma membrane-associated clathrin assembly protein AP-2. // J Biol Chem, v. 266, pp. 4442-4447, 1991

19. Beck K.A., Nelson W.J. // The spectrin-based membrane skeleton as a membrane protein sorting machine. // Am J Physiol, v. 270, pp. C1263-1270, 1996

20. Benmerah A., Gagnon J., Begue B., Megarbane B., Dautry-Varsat A., Cerf-Bensussan N. //The tyrosine kinase substrate epsl5 is constitutively associated with the plasma membrane adaptor AP-2. // J Cell Biol, v. 131, pp. 1831-1838, 1995

21. Bennett V., Gilligan D.M. // The spectrin-based membrane skeleton and micron-scale organization of the plasma membrane. // Annu Rev Cell Biol, v. 9, pp. 2766, 1993

22. Boll W., Ohno H., Songyang Z., Rapoport I., Cantley L.C., Bonifacino J.S., Kirchhausen T. // Sequence requirements for the recognition of tyrosine-based endocytic signals by clathrin AP-2 complexes. // EMBO J, v. 15, n. 21, pp. 5789-5795, 1996

23. Bottger G., Nagelkerken B., van der Sluijs P. // Rab4 and Rab7 define distinct nonoverlapping endosomal compartments. // J Biol Chem, v. 271, pp. 2919129197,1996

24. Bretscher M.S., Munro S. // Cholesterol and the Golgi apparatus. // Science, v. 261, pp. 1280-1281, 1993

25. Brodsky J.L. // Post-translational protein translocation: not all hsc70s are created equal. // Trends Biochem Sci, v. 21, pp. 122-126, 1996

26. Brown D.A., London E. // Functions of lipid rafts in biological membranes. // Annu Rev Cell Dev Biol, v. 14, pp. 111-136,1998

27. Brown D.A., London E. // Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. // J Biol Chem, v. 275, pp. 17221-17224, 2000

28. Bucci M., Gratton J.-P., Rudic R.D., Acevedo L., Roviezzo F., Crino G., Sessa W.C. // In vivo delivery of the caveolin-1 scaffolding domain inhibits nitric oxide synthesis, and reduces inflammation. //Nat Med, v. 6, pp. 1362-1367, 2000

29. Chamberlain L.H., Burgoyne R.D., Gould G.W. // SNARE proteins are highly enriched in lipid rafts in PC 12 cells: implications for the spatial control of exocytosis. // Proc Natl Acad Sci USA, v. 98, pp. 5619-5624, 2001

30. Chen A., AbuJarour R.J., Draper R.K. // Evidence that the transport of ricin to the cytoplasm is independent of both Rab6A and COPI. // J Cell Sci, v. 116, pp. 3503-3510,2003

31. Chen Y., Norkin L.C. // Extracellular simian virus 40 transmits a signal that promotes virus enclosure within caveolae. // Exp Cell Res, v. 246, pp. 83-90, 1999

32. Choice C.V., Howard M.J., Poy M.N., Hankin M.H., Najjar S.M. // Insulin stimulates ppl20 endocytosis in cells co-expressing insulin receptors. // J Biol Chem, v. 273, pp. 22194-22200, 1998

33. Chubb J.R., Wilkins A., Thomas G.M., Insall R.H. // The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement. //J Cell Sci, v. 113, pp. 709-719, 2000

34. Colombatti M., Johnson V.G., Skopicki H.A., Fendley B., Lewis M.S.,Youle R.J. // Identification and characterization of a monoclonal antibody recognizing a galactose-binding domain of the toxin ricin. // J Immunol, v. 138, № 9, pp. 33393344, 1987

35. Cremona O., Di P.G., Wenk M.R., Luthi A., Kim W.T., Takei K., Daniell L„ Nemoto Y., Shears S.B., Flavell R.A., McCormick D.A., De Camilli P. //

36. Essential role of phosphoinositide metabolism in synaptic vesicle recycling. I I Cell, v. 99, pp. 179-188, 1999

37. Cresswell P., Hughes E. A. // Protein degradation: the ins and outs of the matter. // Curr Biol, v. 7, pp. R552-R555, 1997

38. Davidson R.L., Gerald P.S. // Induction of mammalian somatic cell hybridization by polyethylene glycol. // Methods Cell Biol, v. 15, pp. 325-338, 1977

39. Davies P.F., Ross R. // Mediation of pinocytosis in cultured arterial smooth muscle and endothelial cells by platelet-derived growth factor. // J Cell Biol, v. 79, pp. 663-671, 1978

40. Day P.J., Owens S.R., Wesche J., Olsnes S., Roberts L.M., Lord J.M. // An interaction between ricin and calreticulin that may have implications for toxin trafficking. //J Biol Chem, v. 276, pp. 7202-7208, 2001

41. Day P.J., Pinheiro T.J., Roberts L.M., Lord J.M. // Binding of ricin A-chain to negatively charged phospholipid vesicles leads to protein structural changes and destabilizes the lipid bilayer. // Biochemistry, v. 41, pp. 2836-2843, 2002

42. De Matteis M.A., Morrow J.S. // The role of ankyrin and spectrin in membrane transport and domain formation. // Curr Opin Cell Biol, v. 4, pp. 542-549, 1998

43. Deneka M., van der Sluijs P. // 'Rab'ing up endosomal membrane transport. // Nat Cell Biol, v. 4, pp. E33-E35, 2002

44. Dessy C., Kelly R.A., Balligand J.-L., Feron O. // Dynamin mediates caveolar sequestration of muscarinic cholinergic receptors, and alteration in NO signaling. // EMBO J, v. 19, pp. 4272-4280, 2000

45. Djinovic'-Carugo K., Young P., Gautel M., Saraste M. // Structure of the a-actinin rod: Molecular basis for cross-linking of actin filaments. // Cell, v. 98, pp. 537-546,1999

46. Endo Y., Tsurugi K. // RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. // J Biol Chem, v.262, pp.8128-8130, 1987

47. Endo Y., Tsurugi K., Franz H. // The site of action of the A-chain of mistletoe lectin I on eukaryotiic ribosomes. The RNA N-glycosidase activity of the protein. // FEBS Lett, v. 231, pp. 378-380, 1988

48. Field K.A., Holowka D., Baird B. // Compartmentalized activation of the high affinity immunoglobulin E receptor within membrane domains. //J Biol Chem, v. 272, pp. 4276-4280, 1997

49. Fielding C.J., Fielding P.E. // Cholesterol, and caveolae. Structural and functional relationships. // Biochim Biophys Acta (BBA), v. 1529, pp. 210-222, 2000

50. Fielding C.J., Fielding P.E. // Intracellular cholesterol transport. // J Lipid Res, v. 38, pp. 1503-1521, 1997

51. Foger N., Marhaba R., Zoiler M. // Involvement of CD44 in cytoskelton rearrangement and raft reorganization in T cells. // J Cell Sci, v. 114, pp. 11691178, 2001

52. Fra A.M., Williamson E., Simons K., Parton R.G. // Detergent-insoluble glycolipid microdomains in lymphocytes in the absence of caveolae. // J Biol Chem, v. 269, pp. 30745-30748, 1994

53. Francis C.L., Ryan T.A., Jones B.D., Smith S.J., Falkow S. // Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. // Nature, v. 364, pp. 639-642, 1993

54. Frankel A.E., Burbage C., Fu T., Tagge E., Chandler J., Willingham M.C. // Ricin toxin contains at least three galactose-binding sites located in B chain subdomains 1 alpha, 1 beta, and 2 gamma. // Biochemistry, v. 35, pp. 1474914756, 1996

55. Franz H. // Mistletoe lectins and their A and B chains. // Oncology, v. 43, pp. 2334, 1986

56. Franz H. // Viscaceae lectins. // In: Franz H. (ed.) Advances in lectin research/Berlin, VEB, Verlag volk und Gesundheit, v. 2, pp. 28-59, 1989

57. Fulton D.A., Cantrill S.J., Stoddart J.F. // Probing polyvalency in artificial systems exhibiting molecular recognition. // J Org Chem, v. 67, pp. 7968-7981, 2002

58. Futter C.E., Pearse A., Hewlett L.J., Hopkins C.R. // Multivesicular endosomes containing internalized EGF-EGF receptor complexes mature and then fuse directly with lysosomes. //J Cell Biol, v. 132, pp. 1011-1023, 1996

59. Gaidarov I., Santini F., Warren R.A., Keen J.H. II Spatial control of coated-pit dynamics in living cells. //Nat Cell Biol, v. 1, pp. 1-7, 1999

60. Galbiati F., Razani B., Lisanti M.P. // Emerging themes in lipid rafts and caveolae. // Cell, v. 106, pp. 403-411, 2001

61. Gallusser A., Kirchhausen T. // The beta 1 and beta 2 subunits of the AP complexes are the clathrin coat assembly components. // EMBO J, v. 12, pp. 5237-5244,1993

62. Gemmill T.R., Trimble R.B. // Overview of N- and O-linked oligosaccharide structures found in various yeast species. // Biochim Biophys Acta (BBA), v. 1426, pp. 227-237, 1999

63. Gheber L.A., Edidin M. // A model for membrane patchiness: lateral diffusion in the presence of barriers and vesicle traffic. // Biophys J, v. 77, pp. 3163-3175, 1999

64. Ghosh R.N., Mallet W.G., Soe T.T., McGraw T.E., Maxfield F.R. // An endocytosed TGN38 chimeric protein is delivered to the TGN after trafficking through the endocytic recycling compartment in CHO cells. // J Cell Biol, v. 142, pp. 923-936, 1998

65. Gkantiragas I., Brugger B., Stuven E., Kaloyanova D., Li X.-Y., Lohr K., Lottspeich F., Wieland F.T., Helms J.B. // Sphingomyelinenriched microdomains at the Golgi complex. // Mol Biol Cell, v. 12, pp. 1819-1833, 2001

66. Gleeson P. A. // Complex carbohydrates of plants and animals a comparison. // Curr Top Microbiol Immunol, v. 139, pp. 1-34, 1988

67. Gleeson P.A. // Targeting of proteins to the Golgi apparatus. // Histochem Cell Biol, v. 109, pp. 517-532, 1998

68. Gluck A., Endo Y., Wool I. // The ribosomal RNA identity elements for ricin and for alpha-sarcin: mutations in the putative CG pair that close a GAGA tetraloop. // Nucleic Acids Res, v. 22, pp. 321-324, 1994

69. Goodman O.B.Jr., Keen J.H. // The alpha chain of the AP-2 adaptor is a clathrin binding subunit. // J Biol Chem, v. 270, pp. 23768-23773, 1995

70. Gorvel J.P., Chavrier P., Zerial M., Gruenberg J. // Rab5 controls early endosome fusion in vitro. // Cell, v. 64, pp. 915-925, 1991

71. Grimmer S., van Deurs B., Sandvig K. // Membrane ruffling and macropinocytosis in A431 cells require cholesterol. // J Cell Sci, v. 115, pp. 2953-2962, 2002

72. Gruenberg J., Maxfield F.R. // Membrane transport in the endocytic pathway. // Curr Opin Cell Biol, v. 7, pp. 552-563, 1995

73. Hacker U., Albrecht R., Maniak M. // Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium.//J Cell Sci,v. 110, pp. 105-112, 1997

74. Haigler H.T., McKanna J.A., Cohen S. // Rapid stimulation of pinocytosis in human carcinoma cells A-431 by epidermal growth factor. //J Cell Biol, v. 83, pp. 82-90, 1979

75. Hammond C, Helenius A. // Quality control in the secretory pathway. // Curr Opin Cell Biol, v. 7, pp. 523-529, 1995

76. Harder T., Scheiffele P., Vekade P., Simons K. // Lipid domain structure of the plasma membrane revealed by patching of membrane components. // J Cell Biol, v. 141, pp. 929-942, 1998

77. Harrison S.C., Kirchhausen T. // Clathrin, cages, and coated vesicles. // Cell, v. 33, pp. 650-652,1983

78. Heath J.P., Holifield B.F. // Cell locomotion: new research tests old ideas on membrane and cytoskeletal flow. // Cell Motil Cytoskel, v. 18, pp. 245-257, 1991

79. Hewlett L.J., Prescott A.R., Watts C. // The coated pit and macropinocytic pathways serve distinct endosome populations. // J Cell Biol, v. 124, pp. 689703, 1994

80. Hill E., van Der Kaay J., Downes C.P., Smythe E. // The role of dynamin and its binding partners in coated pit invagination and scission. // J Cell Biol, v. 152, n. 2, pp. 309-323,2001

81. Hinners I., Moschner J., Nolte N., Hille-Rehfeld A. // The orientation of membrane proteins determined in situ by immunofluorescence staining. // Anal Biochem, v. 276, pp. 1-7, 1999

82. Hinshaw J.E., Schmid S.L. // Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. // Nature, v. 374, pp. 190-192, 1995

83. Hirschberg C.B., Snider M.D. // Topography of glycosylation in the rough endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. // Annu Rev Biochem, v. 56, pp. 63-87, 1987

84. Hojo H., Nakahara Y. // Recent progress in the solid-phase synthesis of glycopeptide. // Curr Protein Pept Sci, v. 1, pp. 23-48, 2000

85. Hopkins C.R. // Intracellular routing of transferrin and transferrin receptors in epidermoid carcinoma A431 cells. //Cell, v. 35, pp. 321-330, 1983

86. Horisberger M. // Colloidal gold : a cytochemical marker for light and fluorescent microscopy and for transmission and scanning electron microscopy. // Scan Electron Microsc, pt. 2, pp. 9-31, 1981

87. Huang C.S., Zhou J., Feng A.K., Lynch C.C., Klumperman J., DeArmond S.J., Mobley W.C. // Nerve growth factor signaling in caveolae-like domains at the plasma membrane. // J Biol Chem, v. 274, pp. 36707-36714, 1999

88. Huttner W.B., Zimmerberg J. // Implications of lipid microdomains for membrane curvature, budding and fission. // Curr Opin Cell Biol, v. 13, pp. 478484,2001

89. Ikonen E. // Roles of lipid rafts in membrane transport. // Curr Opin Cell Biol, v. 13, pp. 470-477,2001

90. Ikonen E., Parton R.G. // Caveolins, and cellular cholesterol balance. // Traffic, v. 1, pp. 212-217,2000

91. Innamorati G., Gouill C., Balamotis M., Birnbaumer M. // The long and the short cycle.//J Biol Chem, v. 276,pp. 13096-13103, 2001

92. Isshiki M., Anderson R.G. // Calcium signal transduction from caveolae. // Cell Calcium, v. 26, pp. 201-208, 1999

93. Iversen T.-G., Skretting G., Llorente A., Nicoziani P., van Deurs B., Sandvig K. // Endosome to Golgi transport of ricin is independent of clathrin and of the Rab9- and Rabl 1-GTPases. // Mol Biol Cell, v. 12, pp. 2099-2107,2001

94. Johannes L., Lamaze C. // Clathrin-Dependent or Not: Is It Still the Question? // Traffic, v. 3, pp. 443-451, 2002

95. Jonas L., Walzel H. // Comparative studies on internalization of gold-labelled mistletoe lectin I, its subunits, as well as of an immunotoxin in murine L 1210 leukemia cells. // Acta Histochem Suppl, v. 41, pp. 73-79, 1991

96. Jones A.T., Mills I.G., Scheidig A.J., Alexandrov K., Clague M.J. // Inhibition of endosome fusion by wortmannin persists in the presence of activated rab5. // Mol Biol Cell, v. 9, pp. 323-332, 1998

97. Jung G., Wu X., Hammer J.A. // Dictyostelium mutants lacking multiple classic * myosin I isoforms reveal combinations of shared and distinct functions. // J Cell

98. Biol, v. 133, pp. 305-323, 1996

99. Kartenbeck J., Stukenbrok H., Helenius A. // Endocytosis of simian virus 40 into the endoplasmic reticulum. //J Cell Biol, v. 109, pp. 2721-2729, 1989

100. Kawabuchi M., Satomi Y., Takao T., Shimonishi Y., Nada S., Nagai K., Tarakhovsky A., Okada M. // Transmembrane phosphoprotein Chp regulates the activity of Src-family of tyrosine kinase. //Nature, v. 404, pp. 999-1003, 2000

101. Khomutovskii O.A., Perederei O.F., Lutsik M.D., Klimashevskii V.M., Gulaia N.M., Govseeva N.N. // The characteristics of lectin binding to the surface of differentiated neuroblastoma C 1300 cells. // Eksp Onkol, v. 12, pp. 38-43, 1990

102. Kitajima K., Suzuki T., Kouchi Z., Inoue S., Inoue Y. // Identification and distribution of peptide:N-glycanase (PNGase) in mouse organs. // Arch Biochem Biophys, v. 319; pp. 393-401, 1995

103. Klausner R.D., Sitia R. // Protein degradation in the endoplasmic reticulum. // Cell, v. 62, pp. 611-614, 1990

104. Kopito R.R. // ER quality control: the cytoplasmic connection. // Cell, v. 88, pp. 427-430, 1997

105. Kornfeld R., Kornfeld S. // Comparative aspects of glycoprotein structure. // Annu Rev Biochem, v. 45, pp. 217-237, 1976

106. Kornfeld R., Kornfeld S. // Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. // Annu Rev Biochem, v. 54, pp. 631-664, 1985

107. Kovbasnjuk O., Edidin M., Donowitz M. // Role of lipid rafts in Shiga toxin 1interaction with the apical surface of Caco-2 cells. // J Cell Sci, v. 114, pp. 40254031,2001

108. Kreitman R.J. // Immunotoxins. // Expert Opin Pharmacother, v. 1, pp. 11171129, 2000

109. Kurzchalia T.V., Parton R.G. // Membrane microdomains and caveolae. // Curr Opin Cell Biol, v. 11, pp. 424-431, 1999

110. Laemmli U.K. // Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature, v. 227, pp. 680-685, 1970

111. Lafont F., Verkade P., Galli T., Wimmer C., Louvard D., Simons K. // Raft association of SNAP receptors acting in apical trafficking in Madin-Darby canine kidney cells. // Proc Natl Acad Sci USA, v. 96, pp. 3734-3738, 1999

112. Lamaze C., Dujeancourt A., Baba T., Lo C.G., Benmerah A., Dautry-Varsat A. // Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. // Mol Cell, v. 7, pp. 661-671,2001

113. Lang T., Bruns D., Wenzel D., Riedel D., Holroyd P., Thiele C., Jahn R. // SNAREs are concentrated in cholesterol-dependent clusters that define docking and fusion sites for exocytosis. // EMBO J, v. 20, pp. 2202-2213, 2001

114. Lavoie J. N., Hickey E., Weber L., Landry J. // Modulation of actin microfilament dynamics and fluid-phase pinocytosis by phosphorylation of heat shock protein 27. //J Biol Chem, v. 268, pp. 24210-24214, 1993

115. Lawe D.C., Patki V., Heller-Harrison R., Lambright D., Corvera S. // The FYVE domain of early endosome antigen 1 is required for both phosphatidylinositol 3-phosphate and Rab5 binding. // J Biol Chem, v. 275, pp. 3699-3705, 2000

116. Le P.U., Guay G., Altschuler Y., Nabi I.R. // Caveolin-1 is a negative regulator of caveolae-mediated endocytosis to the endoplasmic reticulum. // J Biol Chem, v. 277, pp. 3371-3379, 2002

117. Lee R.T., Gabius H.J., Lee Y.C. // The sugar-combining area of the galactose-specific toxic lectin of mistletoe extends beyond the terminal sugar residue: comparison with a homologous toxic lectin, ricin. // Carbohydr Res, v. 254, pp. 269-276, 1994

118. Lennarz W.J. // Protein glycosylation in the endoplasmic reticulum: current topological issues. // Biochemistry, v. 26, pp. 7205-7210, 1987

119. Llorente A., Rapak A., Schmid S.L., van Deurs B., Sandvig K. // Expression of mutant dynamin inhibits toxicity and transport of endocytosed ricin to the Golgi apparatus. //J Cell Biol, v. 140, pp. 553-563, 1998

120. Lobie P.E., Sadir R., Graichen R., Mertani H.C., Morel G. // Caveolar internalization of growth hormone. // Exp Cell Res, v. 246, pp. 47-55, 1999

121. Lord J., Roberts L., Robertus J. // Ricin: structure, mode of action some current application. // FASEB J, v.8, pp.201- 208,1994

122. Lord J.M., Roberts L.M. // The intracellular transport of ricin: why mammalian cells are killed and how Ricinus cells servive. // Plant Physiol Biochem, v. 34 (2), pp. 253-261, 1996

123. Lord J.M., Roberts L.M. // Toxin entry: retrograde transport through the secretory pathway. // J Cell Biol, v. 140, № 4, pp. 733-736, 1998

124. Luzio J.P., Rous B.A., Bright N.A., Pryor P.R., Mullock B.M., Piper R.C. // Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. // J Cell Sci, v. 113, pp. 1515-1524, 2000

125. MacDonald R.I. // Action of detergents on membranes: differences between lipid extracted from red cell ghosts and from red cell lipid vesicles by Triton X-100. // Biochemistry, v. 19, pp. 1916-1922, 1980

126. Mallard F., Antony C., Tenza D., Salamero J., Goud B., Johannes L. // Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of Shiga toxin B-fragment transport. // J Cell Biol, v. 143, pp. 973-990, 1998

127. Mallard F., Tang B.L., Galli T., Tenza D., Saint-Pol A., Yue X., Antony C., Hong W., Goud B., Johannes L. // Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. // J Cell Biol, v. 156, pp. 653-664, 2002

128. Maréchal V., Prévost M.-C., Petit C., Perret E., Heard J.-M., Schwartz O. // Human immunodeficiency virus type 1 entry into macrophages mediated by macropinocytosis. // J Virol, v. 75, pp. 11166-11177, 2001

129. Matlack K.E., Plath K., Misselwitz B., Rapoport T.A. // Protein transport by purified yeast Sec complex and Kar2p without membranes. // Science, v. 277, pp. 938-941,1997

130. Matsudaira P. // Modular organization of actin crosslinking proteins. // Trends Biochem Sci, v. 16, pp. 87-92, 1991

131. McBride H.M., Rybin V., Murphy C., Giner A., Teasdale R., Zerial M. // Oligomeric complexes link Rab5 effectors with NSF and drive membrane fusion via interactions between EEA1 and syntaxin 13. // Cell, v. 98, pp. 377-386, 1999

132. McLauchlan H., Newell J., Morrice N., Osborne A., West M., Smythe E. // A novel role for Rab5-GDI in ligand sequestration into clathrin-coated pits. // Curr Biol, v. 8, pp. 34-45, 1997

133. McNiven M.A. // Dynamin: a molecular motor with pinchase action. // Cell, v. 94, pp. 151-154, 1998

134. Mellman I. // Endocytosis and molecular sorting. // Annu Rev Cell Dev Biol, v. 12, pp. 575-625, 1996

135. Metzler M., Legendre-Guillemin V., Gan L., Chopra V., Kwok A., McPherson P.S., Hayden M.R. // HIP1 functions in clathrin-mediated endocytosis through binding to clathrin and adaptor protein 2. // J Biol Chem, v. 276, pp. 3927139276,2001

136. Micheva K.D., Kay B.K., McPherson P.S. // Synaptojanin forms two separate complexes in the nerve terminal. Interactions with endophilin and amphiphysin. // J Biol Chem, v. 272, pp. 27239-27245,1997

137. Misura K.M.S., May A.P., Weis W.I. // Protein-protein interactions in intracellular membrane fusion. // Curr Opin Struct Biol, v. 10, pp. 662-671, 2000

138. Mitchison T.J., Cramer L.P. // Actin-based cell motility and cell locomotion. // Cell, v. 84, pp. 371-379, 1996

139. Moffett S., Brown D.A., Linder M.E. // Lipid-dependent targeting of G proteins into rafts. //J Biol Chem, v. 275, pp. 2191-2192, 2000

140. Mohrmann K., Gerez L., Oorschot V., Klumperman J., van der Sluijs P. // Rab4 function in membrane recycling from early endosomes depends on a Membrane to cytoplasm cycle. // J Biol Chem, v. 277, pp. 32029-32035, 2002

141. Moisenovich M., Tonevitsky A., Agapov I., Niwa H., Schewe H., Bereiter-Hahn J. // Differences in endocytosis and intracellular sorting of ricin and viscumin in 3T3 cells. // Eur J Cell Biol, v. 81, pp. 529-538, 2002

142. Montfort W., Villafranca J.E., Monzingo A.F., Ernst S.R., Katzin B., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R., Robertus J.D. // The three-dimensional structure of ricin at 2,8 A. //J Biol Chem, v.262, pp.5398-5403, 1987

143. Mosmann T. // Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. // J Immunol Methods, v. 65, pp. 55-63, 1983

144. Mu F.-T., Callaghan J.M., Steele-Mortimer O., Stenmark H., Parton R.G., Campbell P.L., McCluskey J., Yeo J.-P., Tock E.P.C., Toh B.-H. // EEA1, an early endosome-associated protein. // J Biol Chem, v. 270, pp. 13503-13511, 1995

145. Mullock B.M., Bright N.A., Fearon C.W., Gray S.R., Luzio J.P. // Fusion of lysosomes with late endosomes produces a hybrid organelle of intermediate density and is NSF dependent. //J Cell Biol, v. 140, pp. 591-601, 1998

146. Nichols B.J., Kenworthy A.K., Polishchuk R.S., Lodge R., Roberts T.H., Hirschberg K., Phair R.D., Lippincott-Schwartz J. // Rapid cycling of lipid raft markers between the cell surface and Golgi complex. // J Cell Biol, v. 153, pp. 529-541,2001

147. Nicolson G.L., Blaustein J. // The interaction of Ricinus communis agglutinin with normal and tumor cell surfaces. // Biochim Biophys Acta (BBA), v. 266, p. 543, 1972

148. Niwa H., Tonevitsky A.G., Agapov I.I., Saward S., Pfuller U., Palmer R.A. // Crystal structure at 3 A of mistletoe lectin I, a dimeric type-II ribosome-inactivating protein, complexed with galactose. // Eur J Biochem, v. 270, pp. 2739-2749, 2003

149. Norbury C.C., Hewlett L.J., Prescott A.R., Shastri N., Watts C. // Class I MHC presentation of exogenous soluble antigen via macropinocytosis in bone marrow macrophages. //Immunity, v. 3, pp. 783-791, 1995

150. Norkin L.C., Anderson H.A., Wolfrom S.A., Oppenheim A. // Caveolar endocytosis of Simian Virus 40 is followed by brefeldin A-sensitive transport to the Endoplasmic Reticulum, where the virus disassembles. // J Virol, v. 76, pp. 5156-5166, 2002

151. Ohno H., Stewart J., Fournier M.C., Bosshart H., Rhee I., Miyatake S., Saito T., Gallusser A., Kirchhausen T., Bonifacino J.S. // Interaction of tyrosine-based sorting signals with clathrin-associated proteins. // Science, v. 269, pp. 18721875, 1995

152. Ojcius D.M., Bravo D.A., Kanellopoulos J.M., Hawkins R.A., Kelly K.A., Rank R.G., Dautry-Varsat A. // Internalization of Chlamydia by dendritic cells and stimulation of Chlamydia-specific T cells. // J Immunol, v. 160, pp. 1297-1303, 1998

153. Olsnes S., Fernabdez-Puentes C., Caarrasco L., Vasquez D. // Ribosome inactivation by the toxic lectins abrin and ricin. Kinetics of the enzyme activity of the toxin A-chains. // Eur J Biochem, v. 60, pp.281-288, 1975

154. Olsnes S., Pihl A. // Toxic lectins and related proteins. // In Molecular Action of Toxins and Viruses. P. Cohen and S. Van Heyningen. eds. Elsevier/North Holland, Amsterdam, pp. 51-105, 1982

155. Otto J.J. // Actin-bundling proteins. // Curr Opin Cell Biol, v. 6, pp. 105-109, 1994

156. Paccaud J.-P., Siddleg K., Carpentier J.-L. // Internalization of the human insulin receptor.//J Biol Chem, v. 267, pp. 13101-13106, 1992

157. Parton R.G. // Caveolae and caveolins. // Curr Opin Cell Biol, v. 8, pp. 542-548, 1996

158. Parton R.G., Joggerst B., Simons K. // Regulated internalization of caveolae. // J Cell Biol, v. 127, pp. 1199-1215, 1994

159. Parton R.G., Lindsay M. // Exploitation of major histocompatibility complex class I molecules and caveolae by simian virus 40. // Immunol Rev, v. 168, pp. 23-31, 1999

160. Pelkmans L., Helenius A. // Endocytosis via caveolae. // Traffic, v. 3, pp. 311320, 2002

161. Pelkmans L., Kartenbeck J., Helenius A. // Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular transport pathway to the ER. // Nat Cell Biol, v. 3, pp. 473-483,2001

162. Pereira-Leal J.B., Seabra M.C. // The mammalian Rab family of small GTPases: definition of family and subfamily sequence motifs suggests a mechanism for functional specificity in the Ras superfamily. //J Mol Biol, v. 301, pp. 10771087,2000

163. Pilon M., Schekman R., Romisch K. // Secôlp mediates export of a misfolded secretory protein from the endoplasmic reticulum to the cytosol for degradation. // EMBO J, v. 16, pp. 4540-4548, 1997

164. Predescu S.A., Predescu D.N., Palade G.E. // Endothelial transcytotic machinery involves supramolecular protein-lipid complexes. // Mol Biol Cell, v. 12, pp. 1019-1033,2001

165. Prevostel C., Alice V., Joubert D., Parker P.J. // Protein kinase Ca actively downregulates through caveolae-dependent traffic to an endosomal compartment. //J Cell Sci, v. 113, pp. 2575-2584, 2000

166. Prinetti A., Chigorno V., Tettamanti G., Sonnino S. // Sphingolipid-enriched membrane domains from rat cerebellar granule cells differentiated in culture, a compositional study. // J Biol Chem, v. 275, pp. 11658-11665, 2000

167. Racoosin E.L., Swanson J.A. // Macropinosome maturation and fusion with tubular lysosomes in macrophages. //J Cell Biol, v. 121, pp. 1011-1020, 1993

168. Racoosin E.L., Swanson J.A. // M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. //J Cell Sci, v. 102, pp. 867-880, 1992

169. Radhakrishna H., Klausner R. D., Donaldson J. G. // Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF-6 GTPase. // J Cell Biol, v. 134, pp. 935-947, 1996

170. Ramalingam T.S., Das P.K., Podder S.K. // Ricin-membrane interaction: membrane penetration depth by fluorescence quenching and resonance energy transfer. // Biochemistry, v. 33, pp. 12247-12254, 1994

171. Rapak A., Falnes P.O., Olsnes S. // Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. // Proc Natl Acad Sci USA, v. 94, pp. 3783-3788, 1997

172. Rapoport T.A., Jungnickel B., Kutay U. // Protein transport across the eukaryotic endoplasmic reticulum and bacterial inner membranes. // Annu Rev Biochem, v. 65, pp. 271-303,1996a

173. Rapoport T.A., Rolls M.M., Jungnickel B. // Approaching the mechanism of protein transport across the ER membrane. // Curr Opin Cell Biol, v. 8, pp. 499504, 19966

174. Ridley A.J. // Membrane ruffling and signal transduction. // Bioessays, v. 16, pp. 321-327, 1994

175. Ringerike T., Blystad F.D., Levy F.O., Madshus I.H., Stang E. // Cholesterol is important in control of EGF receptor kinase activity but EGF receptors are not concentrated in caveolae. // J Cell Sci, v. 115, pp. 1331-1340, 2002

176. Ringstad N., Nemoto Y., De Camilli P. // The SH3p4/Sh3p8/SH3pl3 protein family: binding partners for synaptojanin and dynamin via a Grb2-like Src homology 3 domain. // Proc Natl Acad Sci USA, v. 94, pp. 8569-8574, 1997

177. Robinson M.S. // The role of clathrin, adaptors and dynamin in endocytosis. // Curr Opin Cell Biol, v. 6, pp. 538-544, 1994

178. Rodgers W., Crise B., Rose J.K. // Signals determining protein tyrosine kinaseand glycosyl-phosphatidylinositol-anchored proteins targeting to a glycolipid-enriched membrane fraction. // Mol Cell Biol, v. 14, pp. 5384-5391, 1994

179. Rodman J.S., Wandinger-Ness A. // Rab GTPases coordinate endocytosis. // J Cell Sci, v. 113, pp. 183-192,2000

180. Romisch K., Ali B.R. // Similar processes mediate glycopeptide export from the endoplasmic reticulum in mammalian cells and Saccharomyces cerevisiae. // Proc Natl Acad Sci USA, v. 94; pp. 6730-6734, 1997

181. Rupper A., Lee K., Knecht D., Cardelli J. // Sequential activities of phosphoinositide 3-kinase, PKB/Akt, and Rab7 during macropinosome formation in Dictyostelium. II Mol Biol Cell, v. 12, pp. 2813-2824, 2001

182. Rutenber E., Robertus J.D. // Structure of Ricin B-chain at 2.5 A Resolution. // Proteins, v. 10, pp. 260-269, 1991

183. Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. // Kinetics of binding of the toxic lectins abrin and ricin to surface receptors on human cells. // J Biol Chem, v. 251, pp. 39773984,1976

184. Sandvig K., Prydz K., Hansen S.H., van Deurs B. // Ricin transport in brefeldin A-treated cells: correlation between Golgi structure and toxic effect. // J Cell Biol, v. 115, pp. 971-981, 1991

185. Sandvig K., van Deurs B. // Endocytosis and intracellular sorting of ricin and Shiga toxin. // FEBS Lett, v. 346, pp. 99-102, 1994

186. Sandvig K., van Deurs B. // Endocytosis and intracellular transport of ricin: recent discoveries. // FEBS Lett, v. 452, pp. 67-70, 1999

187. Sandvig K., van Deurs B. // Endocytosis, intracellular transport, and cytotoxicaction of Shiga toxin and ricin. // Physiol Rev, v. 76, pp. 949-967, 1996

188. Sandvig K., van Deurs B. // Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. // EMBO J, v. 19, pp. 5943-5950, 2000

189. Sandvig K., van Deurs B. // Toxin-induced cell lysis: protection by 3-methyladenine and cycloheximide. // Exp Cell Res, v. 200, pp. 253-262, 1992

190. Sansonetti P.J. // Microbes and microbial toxins: paradigms for microbial-mucosal interactions III. Shigellosis: from symptoms to molecular pathogenesis. // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, v. 280, pp. G319-G323, 2001

191. Scheiffele P., Roth M.G., Simons K. // Interaction of influenza virus hemagglutinin with sphingolipid-cholesterol membrane domains via it transmembrane domain. // EMBO J, v. 16, pp. 5501-5508, 1997

192. Schmid S.L., Damke H. // Coated vesicles: a diversity of form and function. // FASEB J, v. 9, pp. 1445-1453, 1995

193. Schmid S.L., McNiven M.A., de Camilli P. // Dynamin and its binding partners: a progress report. // Curr Opin Cell Biol, v. 10, pp. 504-512, 1998

194. Schmidt A., Hall M.N. // Signaling to the actin cytoskeleton. // Annu Rev Cell Dev Biol, v. 14, pp. 305-338, 1998

195. Schnitzer J.E., Liu J., Oh P. // Endothelial caveolae have the molecular transport machinery for vesicle budding, docking, and fusion including VAMP, NSF, SNAP, annexins, and GTPases. //J Biol Chem, v. 270, pp. 14399-14404, 1995

196. Schutz G.J., Kada G., Pastushenko V.P., Schindler H. // Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. II EMBO J, v. 19, pp. 892-901, 2000

197. Seastone D.J., Harris E., Temesvari L.A., Bear J.E., Saxe C.L., Cardelli J. // The WASp-like protein Scar regulates macropinocytosis, phagocytosis and endosomal membrane flow in Dictyostelium. IIJ Cell Sci, v. 114, pp. 2673-2683, 2001

198. Sever S., Muhlberg A.B., Schmid S.L. // Dynamin:GTP controls the formation of constricted coated pits, the rate limiting step in clathrin-mediated endocytosis. // J Cell Biol, v. 150, pp. 1137-1148, 2000

199. Sever S., Muhlberg A.B., Schmid S.L. // Impairment of dynamin's GAP domain stimulates receptor-mediated endocytosis. // Nature, v. 398, pp. 481-486, 1999

200. Sheets E.D., Jacobson K., Simson R., Lee G.M. // Transient confinement of a glycosylphosphatidylinositol-anchored protein in the plasma membrane. // Biochemistry, v. 36, pp. 12449-12458, 1997

201. Shin J.-S., Abraham S.N. // Co-option of endocytic functions of cellular caveolae by pathogens. // Immunology, v. 102, pp. 2-7, 2001

202. Shin J.-S., Gao Z., Abraham S.N. // Involvement of cellular caveolae in bacterial entry into mast cells. // Science, v. 289, pp. 785-788, 2000

203. Shupliakov O., Low P., Grabs D., Gad H., Chen H., David C., Takei K., De Camilli P., Brodin L. // Synaptic vesicle endocytosis impaired by disruption of dynamin-SH3 domain interactions. // Science, v. 276, pp. 259-263, 1997

204. Silberstein S., Gilmore R. // Biochemistry, molecular biology, and genetics of the oligosaccharyltransferase. // FASEB J, v. 10, pp. 849-858, 1996

205. Simon S.M., Peskin C.S., Oster G.F. // What drives the translocation of proteins? // Proc Natl Acad Sci USA, v. 89, pp. 3770-3774, 1992

206. Simons K., Ikonen E. // Functional rafts in cell membranes. // Nature, v. 387, pp. 569-572, 1997

207. Simons K., Ikonen E. // How cells handle cholesterol. // Science, v. 290, pp. 1721-1726, 2000

208. Simons K., van Meer G. // Lipid sorting in epithelial cells. // Biochemistry, v. 27, pp. 6197-6202, 1988

209. Smart E.J., GrafG.A., McNiven M.A., Sessa W.C., Engelman J.A., Scherer P.E., Okamoto T., Lisanti M.P. // Caveolins, liquid-ordered domains, and signal transduction. // Mol Cell Biol, v. 19, pp. 7289-7304, 1999

210. Soler M.H., Stoeva S., Voelter W. // Complete amino acid sequence of the B-chain of mistletoe lectin I. // Biochem Biophys Res Commun, v. 246, pp. 596601, 1998

211. Sonnichsen B., De Renzis S., Nielsen E., Rietdorf J., Zerial M. // Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized bymulticolor imaging of Rab4, Rab5, and Rabl 1. // J Cell Biol, v. 149, pp. 901913,2000

212. Sorkin A. // Endocytosis and intracellular sorting of receptor tyrosine kinases. // Front Biosci, v. 3, pp. D729-738, 1998

213. Sorkin A. // Internalization of the epidermal growth factor receptor: role in signaling. // Biochem Soc Trans, v. 29, pp. 480-484, 2001

214. Sorkin A., Waters C.M. // Endocytosis of growth factor receptors. // Bioessays, v. 15, pp. 375-382, 1993

215. Sowa G., Pypaert M., Sessa W.C. // Distinction between signaling mechanisms in lipid rafts vs. caveolae. // Proc Natl Acad Sci USA, v. 98, pp. 14072-14077, 2001

216. Sphyris N., Lord J.M., Wales R., Robers L.M. // Mutational analysis of the Ricinus lectin B chains. Galactose binding ability of the 2 y subdomain of Ricinus communis agglutinin B chain. // J Biol Chem, v.270, pp.20292-20297, 1995

217. Stang E., Kartenbeck J., Parton R.G. // Major histocompatibility complex class I molecules mediate association of SV40 with caveolae. // Mol Biol Cell, v. 8, pp. 47-57, 1997

218. Steeves R.M., Denton M.E., Barnard F.C., Henry A., Lambert J.M. // Identification of three oligosaccharide binding sites in ricin. // Biochemistry, v. 38, pp. 11677-11685, 1999

219. Stossel T.P. // On the crawling of animal cells. // Science, v. 260, pp. 1086-1094, 1993

220. Swanson J.A. // Phorbol esters stimulate macropinocytosis and solute flow through macrophages. // J Cell Sci, v. 94, pp. 135-142, 1989

221. Swanson J.A., Johnson M.T., Beningo K., Post P., Mooseker M. and Araki N. // A contractile activity that closes phagosomes in macrophages. // J Cell Sci, v. 112, pp. 307-316, 1999

222. Swanson J.A., Watts C. // Macropinocytosis. // Trends Cell Biol, v. 5, pp. 424427, 1995m

223. Sweeney E.C., Palmer R.A., Pfuller U. // Crystallisation of the ribosome inactivating protein MLI from Viscum album (Mistletoe) complexed with b-D-galactose. // J Mol Biol, v. 234, pp. 1279-1281, 1993

224. Sweeney E.C., Tonevitsky A.G., Palmer R.A., Niwa H., Pfiieller U., Eck J., Lentzen H., Agapov I.I., Kirpichnikov M.P. // Mistletoe lectin I forms a double trefoil structure. // FEBS Lett, v. 431, pp. 367-370, 1998

225. Takei K., Slepnev V.I., Haucke V., De Camilli P. // Functional partnership between amphiphysin and dynamin in clathrin-mediated endocytosis. // Nat Cell Biol, v. l,pp. 33-39, 1999

226. Tang Q., Edidin M. // Vesicle trafficking and cell surface membrane patchiness. // Biophys J, v. 81, pp. 196-203, 2001

227. Thomsen P., Roepstorff K., Stahlhut M., van Deurs B. // Caveolae are highly immobile plasma membrane microdomains, which are not involved in constitutive endocytic trafficking. // Mol Biol Cell, v. 13, pp. 238-250,2002

228. Titus M.A. // The role of unconventional myosins in Dictyostelium endocytosis. // J Eukaryot Microbiol, v. 47, pp. 191-196, 2000

229. Torgersen M.L., Skretting G., van Deurs B., Sandvig K. //Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. // J Cell Sci, v. 114, pp. 37373747, 2001

230. Tregear J., Roberts L. // The lectin gene family of Ricinus communis: cloning of a functional ricin gene and three lectin pseudogen. // Plant Mol Biol, v.l 8, pp. 515-525, 1992

231. Trischler M., Stoorvogel W., Ullrich O. // Biochemical analysis of distinct Rab5-and Rabl 1-positive endosomes along the transferrin pathway. // J Cell Sci, v. 112, pp. 4773-4783, 1999

232. Tse W.T., Lux S.E. // Red blood cell membrane disorders. // Br J Haematol, v. 104, pp. 2-13, 1999

233. Tulley R., Beevers H. // Protein bodies of Castor bean endosperm (Isolation, fractionation and characterisation of protein components). // Plant Phisiol, v.58, pp.710-716, 1976

234. Tuvim M.J., Adachi R., Hoffenberg S., Dickey B.F. // Traffic control: Rab GTPases and the regulation of interorganellar transport. //News Physiol Sci, v. 16, pp. 56-61,2001

235. Ullrich O., Horiuchi H., Bucci C., Zerial M. // Membrane association of rab5 mediated by GDP-dissociation inhibitor and accompanied by GDP/GTP exchange. //Nature, v. 368, pp. 157-160, 1994

236. Vainio S., Heino S., Mansson J.-E., Fredman P., Kuismanen E., Vaarala O., Ikonen E. // Dynamic association of human insulin receptor with lipid rafts in cells lacking caveolae. // EMBO Rep, v. 3, pp. 95-100, 2002

237. Van der Sluijs P., Hull M., Zahraoui A., Tavitian A., Goud B., Mellman I. // The small GTP-binding protein rab4 is associated with early endosomes. // Proc Natl Acad Sci USA, v. 88, pp. 6313-6317, 1991

238. Van Deurs B., Sandvig K., Petersen O.W., Olsnes S., Simons K., Griffiths G. // Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-Golgi network. // J Cell Biol, v. 106, pp. 253-267, 1988

239. Van Deurs B., Tonnessen T.I., Petersen O.W., Sandvig K., Olsnes S. // Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. // J Cell Biol, v. 102, pp. 37-47, 1986

240. Van Meer G. // Caveolin, cholesterol, and lipid droplets? // J Cell Biol, v. 152, pp. F29-F34, 2001

241. Veithen A., Amyere M., Van Der Smissen P., Cupers P., Courtoy P.J. // Regulation of macropinocytosis in v-Src-transformed fibroblasts: cyclic AMP selectively promotes regurgitation of macropinosomes. // J Cell Sci, v. Ill, pp. 2329-2335, 1998

242. Veithen A., Cupers P., Baudhuin P., Courtoy P.J. // v-Src induces constitutive macropinocytosis in rat fibroblasts. //J Cell Sci, v. 109, pp. 2005-2012, 1996

243. Venkatesh Y.P., Lambert J.M. // Galactose-induced dimerization of blocked ricin at acidic pH: evidence for a third galactose-binding site in ricin B-chain. // Glycobiology, v. 7, pp. 329-335, 1997

244. Vlahos C. J., Matter W. F., Hui K. Y., Brown R. F. // A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-l-benzopyran-4-one (LY294002). It J Biol Chem, v. 269, n. 7, pp. 5241-5248, 1994

245. Mutational analysis of galactose binding ability of recombinant ricin B chain. // J Biol Chem, v. 266, pp. 19172-19170, 1991

246. Walzel H., Jonas L., Rosin T., Brock J. // Relationship between internalization kinetics and cytotoxicity of mistletoe lectin I to L1210 leukaemia cells. // Folia Biol (Praha), v. 36, pp. 181-188, 1990

247. Wang L.H., Sudhof T.C., Anderson R.G.W. // The appendage domain of alpha-adaptin is a high affinity binding site for dynamin. // J Biol Chem, v. 270, pp. 10079-10083, 1995

248. Wang X., Kumar R., Navarre J., Casanova J.E., Goldenring J.R. // Regulation of vesicle trafficking in Madin-Darby Canine Kidney cells by Rabl la and Rab25. // J Biol Chem, v. 275, pp. 29138-29146, 2000

249. Warnock D.E., Hinshaw J.E., Schmid S.L. // Dynamin self-assembly stimulates its GTPase activity. // J Biol Chem, v. 271, pp. 22310-22314, 1996m

250. Warnock D.E., Schmid S.L. // Dynamin GTPase, a force-generating molecular switch. // Bioessays, v. 18, pp. 885-893, 1996

251. Wary K.K., Mainiero F., Isakoff S.J., Marcantonio E.E., Giancotti F.G. // The adaptor protein She couples a class of integrins to the control of cell cycle progression. // Cell, v. 87, pp. 733-743, 1996

252. Wary K.K., Mariotti A., Zurzolo C., Giancotti F.G. // A requirement for caveolin-1 and associated kinase Fyn in integrin signaling and anchorage-dependent cell growth. // Cell, v. 94, pp. 625-634, 1998

253. Watts C. // Capture and processing of exogenous antigens for presentation on MHC molecules. // Annu Rev Immunol, v. 15, pp. 821-850, 1997

254. Wei Y., Yanf X., Liu Q., Wilkins J.A., Chapman H.A. // A role for caveolin and the urokinase receptor in integrin-mediated adhesion and signaling. // J Cell Biol, v. 144, pp. 1285-1294, 1999

255. Weston S., Tucker A., Thatcher D., Derbyshire D, Pauptit R. // X-ray structure of recombinant ricin A-chain at 1,8 A resolution. // J Mol Biol, v.244, pp.410-422,1994

256. Wiertz E.J., Jones T.R., Sun L., Bogyo M., Geuze H.J., Ploegh H.L. // The human cytomegalovirus US11 gene product dislocates MHC class I heavy chains from the endoplasmic reticulum to the cytosol. // Cell, v. 84, pp. 769-779, 1996a

257. Wiertz E.J., Tortorella D., Bogyo M., Yu J., Mothes W., Jones T.R., Rapoport T.A., Ploegh H.L. // Sec61 -mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. // Nature, v. 384, pp. 432-438, 19966

258. Wigge P., McMahon H.T. I I The amphiphysin family of proteins and their role in endocytosis at the synapse. // Trends Neurosci, v. 21, pp. 339-344, 1998

259. Wigge P., Vallis Y., McMahon H.T. // Inhibition of receptor-mediated endocytosis by the amphiphysin SH3 domain. // Curr Biol, v. 7, pp. 554-560, 1997

260. Wilcke M., Johannes L., Galli T., Mayau V., Goud B., Salamero J. // Rabl 1 regulates the compartmentalization of early endosomes required for efficient transport from early endosomes to the trans-Golgi network. // J Cell Biol, v. 151, 1207-1220,2000

261. Woodman P.G. // Biogenesis of the sorting endosome: the role of Rab5. // Traffic, v. 1, pp. 695-701, 2000

262. Wu A.M., Lin S., Chin L., Chow L., Lin J. // Defining the carbohydrate specificities of Abrus precatorius agglutinin as T Gal(l-3)GalNAc. > I/II [Gal(l-3/4)GlcNAc]. //J Biol Chem, v. 267, pp. 19130-19139, 1992

263. Wu A.M., Song S.C., Hwang P.Y., Wu J.H., Pfuller U. // Interaction of mistletoe toxic lectin-I with sialoglycoproteins. // Biochem Biophys Res Commun, v. 214, pp. 396-402, 1995a

264. Xu J., Ziemnicka D., Merz G.S., Kotula L. // Human spectrin Src homology 3 domain binding protein 1 regulates macropinocytosis in NIH 3T3 cells. // J Cell Sci, v. 113, pp. 3805-3814, 2000

265. Xue M., Zhang B. // Do SNARE proteins confer specificity for vesicle fusion? // Proc Natl Acad Sci USA, v. 99, pp. 13359-13361,2002157г Ф

266. Yamabhai М., Anderson R.G.W. // Second cysteine-rich region of epidermal growth factor receptor contains targeting information for caveolae/rafts. // J Biol Chem, v. 277, pp. 24843-24846,2002

267. Youle R., Huang A. // Protein bodies of Castor bean endosperm. // Plant Phisiol, v.58, pp.703-709, 1976

268. Yu H., Kaung G., Kobayashi S., Kopito R.R. // Cytosolic degradation of T-cell receptor alpha chains by the proteasome. // J Biol Chem, v. 272; pp. 2080020804, 1997

269. Zhang J.Z., Davletov B.A., Sudhof T.C., Anderson R.G. // Synaptotagmin I is a high affinity receptor for clathrin AP-2: implications for membrane recycling. // Cell, v. 78, pp. 751-760, 1994

270. Ziska P., Franz H. // Studies on the interacion of the mistletoe lectin I with carbogidrates. //Experimentia, v. 37, p. 219, 1981

271. Брандт Н.Н., Чикишев А.Ю., Сотников А.И., Савочкина Ю.А., Агапов И.И., Тоневицкий А.Г., Кирпичников М.П. // Конформационные различия рицина и агглютинина рицина в растворе и кристалле. // Доклады Академии Наук, т. 376, стр. 687-689, 2001

272. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. // Справочник биохимика. / пер. с англ. B.J1. Друцы, О.Н. Королевой. // М.: Мир, 544 е., 1991

273. Зенгбуш П. // Молекулярная и клеточная биология. / пер. с нем. JI.B. Алексеевой, JI.C. Шляхтенко / под ред. В.А. Энгельгардта. // М.: Мир, т.1, 1982