Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные и функциональные особенности рибосом-инактивирующих белков растения Ricinus communis

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савочкина, Юлия Анатольевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературных данных

1.1 Токсины растения Ricinus communis рицин и агглютинин рицина - 9 - представители рибосом-инактивирующих белков II типа.

1.1.1 Строение и ферментативная активность А-субъединицы рицина.

1.1.2 Строение и углевод-связывающая активность В-субъединицы рицина.

1.1.3 Тетрамерный токсин агглютинин рицина и рицин -- родственые белки растения Ricinus communis.

1.2 Особенности внутриклеточного транспорта рибосом-инактивирующих белков II типа. Роль структурных особенностей данных белков при транспорте внутри клетки.

1.2.1 Интернализация токсинов.

1.2.2 Транспорт в эндосомальном компартменте.

1.2.3 Транспорт в аппарат Гольджи.

1.2.4 Ретроградный транспорт в эндоплазматический ретикулум.

1.2.5 Транслокация токсина. 30 1.3 Современные подходы к изучению структуры рибосом- 33 инактивирующих белков. Использование спектроскопических методов для изучения структуры белков в растворе.

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Выделение и очистка рицина, агглютинина рицина и их изолированных субъединиц.

2.2 Твердофазный иммуно-ферментный анализ

2.3 Определение ферментативной активности токсинов 44 в бесклеточной системе синтеза белка.

2.4 Определение цитотоксической активности белков.

2.5 Измерения спектров комбинационного рассеяния токсинов.

2.6 Кристаллизация агглютинина рицина в комплексе с P-D-галактозой.

2.7 Построение модели структуры молекулы агглютинина рицина 47 методом молекулярного замещения.

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

3.1 Изучение структуры рицина и агглютинина рицина в водном растворе с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния.

3.2 Сравнение иммунохимических свойств А-субъединиц рицина агглютинина рицина.

3.3 Сравнение ферментативной активности А-субъединиц рицина агглютинина рицина в бесклеточной системе синтеза белка

3.4 Изучение отдельных этапов внутриклеточного транспорта рицина с помощью гибридом

3.5 Изучение структуры агглютинина рицина в комплексе с P-D- галактозой методом рентгено-структурного анализа.

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурные и функциональные особенности рибосом-инактивирующих белков растения Ricinus communis"

Рибосом-инактивирующие белки II типа являются удобными модельными объектами для изучения механизма внутриклеточного транспорта белков. Данные белки обладают высокой токсичностью для эукариотических клеток, благодаря чему они находят важное практическое применение для получения на их основе фармакологических препаратов иммунотоксинов.

Группа растительных рибосом-инактивирующих белков II типа (РИБ2) включает более 10 различных белков, обладающих высокой степенью гомологии и сходной пространственной структурой, образованной А- и В-субъединицами, соединенными дисульфидной связью.

Каталитически активные А-субъединицы обладают N-гликозидазной активностью в отношении 28S рибосомальной РНК эукариотических клеток. В результате данной активности происходит остановка синтеза белка и гибель клетки. Аминокислотные остатки, входящие в каталитический центр А-субъединиц, являются абсолютно консервативными среди данного семейства. Строение углевод-связывающих центров В-субъединиц также во многом сходно. Однако, эффективность цитотоксического действия различных белков этого класса существенно различается. Так для рицина и агглютинина рицина -родственных белков растения Ricinus communis -степень гомологии которых составляет 89%, цитотоксическая активность на клетках лини Me Wo отличается в 100 раз. Сходные результаты получены и на других клеточных линиях.

Сравнительный анализ структурных и функциональных свойств родственных рибосом-инактивирующих белков - один из эффективных подходов к выяснению механизмов, определяющих различия в их биологической активности. Понимание структурных особенностей, влияющих на цитотоксическую активность данных белков необходимо также для получения эффективных препаратов иммунотоксинов на их основе.

Целью данной работы является изучение структуры тетрамерного рибосом-инактивирующего белка агглютинина рицина и выявление структурных особенностей, влияющих на биологическую активность данного белка.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение структуры рицина и агглютинина рицина в водном растворе методом спектроскопии комбинационного рассеяния.

2. Сравнение ферментативной активности А-субъединиц рицина и агглютинина рицина в бесклеточной системе синтеза белка.

3. Сравнение иммунохимических свойств А-субъединиц рицина и агглютинина рицина.

4. Изучение внутриклеточного транспорта рицина с помощью гибридом, продуцирующих антитела к его А-субъединице.

5. Получение кристаллов агглютинина рицина в комплексе с галактозой и изучение структуры агглютинина рицина методом рентгено-структурного анализа.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Савочкина, Юлия Анатольевна

Выводы

1. Анализ спектров комбинационного рассеяния рицина и агглютинина рицина свидетельствует об отсутствии существенных различий вторичной структуры этих двух белков. Дисульфидная связь, соединяющая связывающую и ферментативно активную субъединицы рицина, в водном растворе имеет транс-гош-транс конформацию.

2. Обнаружены различия во взаимодействии А-субъединиц рицина и агглютинина рицина с моноклональными антителами 5Н11 а также с моноклональными антителами 5С9, свидетельствующие о различиях в структуре соответствующих эпитопов в рицине и агглютинине рицина.

Эпитопы, распознаваемые моноклональными антителами 5С9 и 5Н11 не принимают непосредственного участия в механизме ферментативного действия А-субъединиц рицина и агглютинина рицина на 28S рибосомальную РНК.

3. Показано, что доза рицина, вызывающая гибель 50% клеток гибридомы 5Н11, продуцирующей моноклональные антитела 5Н11 к А-субъединице рицина, в 80 раз выше, чем для клеток контрольной гибридомы. Устойчивость гибридомы 5Н11 свидетельствует о том, что до транслокации в цитозоль происходит восстановление дисульфидной связи и диссоциация А- и В-субъединиц рицина.

4. Получены кристаллы комплекса агглютинина рицина с (3-D- галактозой. По данным рентгенодифракционного набора методом молекулярного замещения определена структура молекулы агглютинина рицина в комплексе с P-D-галактозой с разрешением 2,5 А. Показано, что в области, соответствующей второму углевод-связывающему центру рицина в В-субъединице агглютинина рицина галактоза отсутствует. Таким образом, в данном сайте агглютинина рицина отсутствует углевод-связывающая активность.

В области контакта А- и В-субъединиц агглютинина рицина присутствуют три дополнительных гидрофобных контакта по сравнению с рицином.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савочкина, Юлия Анатольевна, Москва

1. Агапов И.И.// Диссертация «Рибосом-инактивирующие белки II типа: структура, биологическая активность, внутриклеточный транспорт, использование для синтеза иммунотоксинов» д-ра биологических наук, М: Государственный научный центр РФ ГОСНИИГЕНЕТИКА, 1997

2. Агапов И.И., Тоневицкий А.Г., Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Гусарова В.Ю. // Диссоциация каталитической и связывающей субъединиц вискумина при транслокации через мембрану // ДАН, v. 363(6), pp. 823-826, 1998

3. Бушуева, Урошевич О.И., Майсурян Н.А. и др.// Особенности структуры катаалитических субъединиц токсинов, ингибирующих белковый синтез. .Влияние рН, взаимодействие с В-цепью рицина //Молекуляр. биология. Т.25. С. 422-429, 1991

4. Agapov I.I., Tonevitsky A.G., Maluchenko N.V., Moisenovich M.M., Bulakh (Savochkina) Y.A., Kirpichnikov M.P.// Mistletoe lectin A-chain unfolds during the intracellular transport. // FEBS Lett., v. 464(1-2), no 24, pp63-66, 1999

5. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. Ribosome-inactivating proteins from plants// Biochim. Biophys. Acta., v.l 154, pp. 237-282. 1993

6. Bilge A., Howell-Clark J., Ramakrishman S., et al// Degradation of ricin A-chain by endosomal and lysosomal enzymes: the protective role of ricin B-chain// Ther. Immunol., V. 1, PP. 197-204, 1994

7. Bilge A., Warner C., Press O. //Translocation of ricin A-chain into proteoliposomes reconstituted from Goli and endoplasmic reticulum// J. Biol. Chem., V.270, PP 23720-23725, 1995

8. Brodsky J.L., McCracken A.A.//Er-associated and proteasome-mediated protein degradation: how two topologically restricted events came together.//Trends Cell Biol., V. 7, PP 151-156, 1997

9. Bolognesi, A., Tazzari, P. L., Olivieri, F., Polito, L., Falini, В., and Stirpe, F. Induction of apoptosis by ribosome-inactivating proteins and related immunotoxins. // Inter.J.Cancer, V. 68(3), PP. 349-355. 11-4-1996.

10. Bicknell-Brown E., Lim B.T., Kimura T. Laser Raman spectroscopy of adrenal iron-sulfur apoprotein: the anomalous tyrosine residue at position 82. // Biochemical and Biophysical Research Communications, v.101, №1, pp.298-305, 1981

11. Citores L., Ferreras J.M., Iglesias R., Carbajales M.L., Arias F.J. // Molecular mechanism of inhibition of mammalian protein synthesis by some four chain agglutinins // FEBS Lett., v. 329, n. 1,2, pp. 59-62, 1993

12. Van Deurs В, Tonnessen TI, Petersen ОW, et al// Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex// J.Cell Biol V. 102, PP. 3747, 1986

13. Van Deurs В., Sandvig K., Petersen O.W. et all // Estimation the amount of internalizated ricin that reaches the trans-Golgi network// J.Cell Biol., V.106, PP. 253-267, 1988

14. Van Deurs В., Sandvig K., Petersen O.W. et all //The ways of endocytosis // Int. Rev. Cytol, V. 117, PP. 131-177,1989

15. Eiklid K., Olsnes S., Phil A.//Entry of lethal doses of abrin, ricin and modeccin into the cytosol of HeLa cells// Exp. Cell Res., V. 126, PP. 321326, 1980

16. Endo Y., Mitsui K., Motizuki M., et al // The mechanism of action of ricin and related toxic lectins on eukaryotic ribosomes. // J. Biol. Chem., V. 262, PP. 5908-5912, 1987

17. Endo Y., Tsurugi K., Franz H. // The site of action of the A-chain of mistletoe lectin I on eukaryotiic ribosomes. The RNA N-glycosidase activity of the protein. //FEBS Letters., V.231, PP. 378-380. 1988

18. Eschenburg S., Krauspenhaar R., Mihailov A., et al //Primary structure and molecular modelling of mistletoe lectin I from Viscum album //Biochem. Biophys. Res. Comm., V. 247, PP367-372, 1998

19. Fu F-N., DeOliveira D.B., Trumple W.R., Sakar H.K., Singh B.R. // Applied Spectroscopy, 1994, v.48, pp.1432.

20. Goldstein 3.L., Brown M.S., Anderson G.W. et al. //Receptor-mediated endocytosis: concepts emerging from the LDL receptor systems// Ann.Rev.Cell.Biol., V.l, PP. 1-39,1985

21. Gluck A., Endo Y., Wool I. The ribosomal RNA identity elements for ricin and for alpha-sarcin: mutations in the putative CG pair that close a GAGA tetraloop. // Nucleic Acids Res., v. 22, pp. 321-324. 1994

22. Green S.A., Setiadi H., McEver R.P. // The cytoplasmic domain of P-selectin contains a sorting determinant that madiates rapid degradation in lysosomes// J/ Cell Biol., V.l24, PP. 435-448, 1994

23. Hazes В., Read R.J. //Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells// Biochem., V. 36, PP 11051-11054, 1997

24. Hudson Т.Н., Grillo F.G.// Brefeldin A enchancer ricin A-chain immunotoxins and blockade of intact ricin, modecin and abrin// J.Biol. Chem., V. 266, PP. 18586-18592, 1991

25. Humphrey J.S., Peters P.J., Yuan L.C et al //Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine containing sequence// J. Cell Biol., V. 120, PP. 1123-1135, 1993

26. Hwang C., Sinskey A.J. and Lodish H.F. Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum. // Science, v. 257, pp. 1496-1502. 1992.

27. Jameson B.A., Wolf H.// The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants// Comput. Appl. Biosci., V.4. PP. 181-186, 1988

28. Johannes L., Tenza D., Antony C. // Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga-toxin//J.Biol.Chem., V. 272, PP 19554-10561, 1997

29. Kim Y., Robertas J.D., Analysis of several key active site residues of ricin A-chain by mutagenesis and X-ray crystallography.// Protein Eng., v.5, pp.775779, 1992.

30. Kitagawa Т., Azuma Т., Hamaguchi K. // Biopolymers, v.l8, pp.451, 1979

31. Llorente A., Rapak A., Schmid S, et al // Expression of mutant dynamin inhibits toxicity and transport of endocytosed ricin to the Golgi apparatus// J.Cell Biol., V. 140, PR 553-563,1998

32. London E. //How bactreial protein toxins enter cells: the role of partial infolding in membrane translocation// Mol. Microbiol., V.6, PP. 3277-3282, 1992

33. Lord J.M., Hartley M.R. and Roberts L.M.// Ribosome-inactivating proteins of plants. // Sem. Cell. Biol., V. 2, PP. 15-22, 1991

34. Lord J.M., Roberts L.M. // The intracellular transport of ricin: why mammalian cells are killed and how Ricinus cells servive.// Plant Physiol Biochem., V. 34 (2), PP. 253-261. 1996.

35. Lord J.M., Roberts L.M. //Retrograde transport: going against the flow// Curr. Biol, V. 8, PP R56-R58, 1998

36. Majoul I.V, Bastianes P.I, Soiling H.D.// Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells.// J.Cell Biol., V. 133, PP. 777-789, 1996

37. Majoul I. V, Ferrari D, Soiling H.D. //Reduction of protein disulfide bonds in an oxidizing enviroment. The disulfide bridge of cholera toxin A subunit is reduced in the endoplasmic reticulum // FEBS Lett, V. 401, PP. 104-108, 1997

38. Mellman I// Endocytosis and molecular sorting// Ann. Rev.Cell.Dev.Biol, V.12, PP. 575-625, 1996

39. Monzingo A.F. and Robertus J.D.// X-ray analysis of substrate analogs in the ricin A-chain active site // J.Mol.biol., v.227, pp. 1136-1145, 1992

40. Montfort W., Villifranca J.E., Monzingo A.F., Ernst S., Katzin В., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R., Robertus J.D. The three-dimensional structure of ricin at 2,8 A. // J. Biol. Chem., v.262, pp.5398-5403. 1987.

41. Mossman T.//Rapid colometric assay for cellular growth and survave: application to proliferation cytotoxity assayes//J.Immunol.Methods, V.65, PP. 55-63, 1983

42. Mukherjee S., Ghosh R.N., Maxfield F. // Endocytosis // Physiol. Reviews, V. 77, PP 759-803, 1997

43. Navaza J.// AmoRe: an automated package for molecular replacement //Acta cryst., v.50, pp 157-163, 1994

44. Nicolson G.L., Blaunstein J. // The interaction of Ricinus communis agglutinin with normal and tumor cell surfaces. // Biochem. Biophys. Acta., V.266, PP. 543-547, 1972

45. Olson M.A. and Cuff L. // Free energy determinants of binding the r RNA substrate and small ligands to ricin A-chain // Biophysical Journal, v.16, pp. 28-39, 1999

46. Provencher S.W. and Glockner J. //Biochemistry, v.20, pp 33, 1981

47. Pelham H.R., Roberts L.M., Lord J.M. // Toxin entry: how reversible is the secretory pathway? // Trends Cell Biol., V. 2, PP. 183-185, 1992

48. Pelham H.R., Munro S.// Sorting of membrane proteins in the secretory pathway // Cell, V. 75. PP. 603-605, 1993

49. Rapak A., Falnes P., Olsnes S. //Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol.//Proc.Natl.Acad.Sci.USA, V. 94, PP. 3783-3788, 1997

50. Riederer M.A. Soldati T, Shapiro AD, Lin J, Pfeffer SR // Lysosome biogenesis requires Rab9 function and receptor recycling from endosomes to the trans-Golgi network // J. Cell Biol., V. 125, PP 573-582, 1994

51. Riezman H. // The ins and out of protein translocation// Science, v. 278, PP. 1728-1729, 1997

52. Rohrer J., Schweizer A., Johnson K.F. // A determinant in the cytoplasmic tail of cation-dependent mannose -6-phosphate receptors prevents trafficking to lysosomes// J. Cell Biol., V.130, PP 1297-1306, 1995

53. Rutenber and Robertus // Structure of ricin B-chain at 2,5 A resolution // Proteins, v.10, pp.260-269, 1991

54. Rothman J.E. // Mechanisms of intracellular protein transport// Nature, V. 372, PP. 55-63, 1994

55. Rutenber E., Ready M., Robertus J.D. // Structure and evolution of Ricin B-chain. //Nature, V.326, PP.624-626, 1987

56. Sandvig K., van Deurs // Endocytosis, intracellular transport and cytotoxic action of shiga toxin and ricin// Phys. Reviews, V. 76, PP. 949-966, 1996

57. Simpson J.C., Dascher C., Roberts L.M., et al //Ricin cytotoxicity is sensitive to recycling between the endoplasmic reticulum and the Golgi complex// J. Biol. Chem., V. 270, PP 20078-20083, 1995a

58. Simpson J.C., Lord J.M., Roberts L.M. // Point mutation in the hydrophobic C-terminal region of ricin A chain indicate that Pro250 plays key role in the membrane translocation// Eur. J. Biochem., V. 232, PP 458-463, 1995b

59. Simpson J.C., Roberts L.M., Lord J.M. //Free ricin A-chain reaches an early compartment of the secretory pathway before it enters the cytosol// Exp. Cell Res., V. 229, PP. 447-451, 1996

60. Soler M.H., Stoeva S., Schwamborn C., Wilhelm S„ .Stifel T, Voelter W. Complete aminoacid sequence of the A-chain of mistletoe lectin I.// FEBS lett., v. 399, pp.153-157, 1996.

61. Soler M.H., Stoeva S., Voelter W. Complete aminoacid sequence of the B-chain of mistletoe lectin I.// Biochem. Biophys. Res. Commun. v. 246, pp.596-601, 1998.

62. Sreerama N. and Woody R.W. // J. Mol.Biol., v.242, pp. 497, 1994

63. Sweeney E.C., Rex A.P., Pfuller U., et al // Dimerisation of mistletoe lectin I occurs by non-covalent association of two molecules// COST 98, V. 5, PP.69-75,1998a

64. Sweeney E.C., Tonevitsky A.G., Palmer R.A., Niwa H., Pfueller U., Eck J., Lentzen H., Agapov I.I., Kirpichnikov M.P., Mistletoe lectin I forms a double trefoil structure.// FEBS lett., v. 431, pp. 367-370, 1998

65. Tahirov Т., Lu Т., Liaw Y., Chen Y., Lin J. Crystal structure of abrin-a at 2.14 A. // J.Mol.Biol., v. 250, pp. 354-367, 1995.

66. Teasdalae R.D., Jackson M.R.//Signal-mediated sorting of membrane proteins between the endoplasmic reticulum and the the Golgi apparatus// Ann.Rev.Cell Dev.Biol., V.12, PP. 27-54, 1996

67. Tonevitsky A., Shamshiev A., Prokoph'ev S., et al. Hybridoma cell producing antibodies against A-chain of mistletoe lectin I are resistant to this toxin // J.Immun.Lett., v.46, pp. 5-8, 1995.

68. Van Deurs В., Sandvig K., Petersen O.W. et all // Estimation the amount of internalizated ricin that reaches the trans-Golgi network// J.Cell Biol., V.106, PP. 253-267, 1988

69. Wales R., Richardson P.T., Roberts L.M., et al// Mutational analysis of the galactose binding ability of recombinant ricin В chain // J. Biol. Chem., V. 266, PP. 19172-19179, 1991

70. Wesche J., Rapak A., Olsnes S. Dependence of ricin toxicity on translocation of the toxin A chain from the endoplasmic reticulum to the cytosol. // J.Biol. Chem., v, 274, pp. 34443-34449, 1999.

71. Weston S., Tucker A., Thatcher D., Derbishire D., Pauptit R.// X-ray structure of recombinant ricin A-chain at 1,8A resolution II J.Mol.Biol., v.244, pp. 410422, 1994

72. Youle R.J,Colombatti M.// Hybridoma cells containing intracellular anti-ricin antibodies show ricin meets secretory antibody before entering the cytosol //J.Biol.Chem, V.262. P.4676-4682, 1987

73. Yu TJ, Lippert J.L, Peticolas W.L. Laser Raman studies of conformational variations of poly-L-lysine. // Biopolymers, 1973, v.12, pp.2161-2176.