Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином"
На правах рукописи
Грачева Мария Андреевна
РАЗРАБОТКА КОМПОНЕНТНОЙ БАЗЫ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ А- И В-СУБЪЕДИНИЦ РИЦИНА ДЛЯ СОЗД АНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМ, АНТИДОТОВ И ВАКЦИН ПРОТИВ ОТРАВЛЕНИЙ РИЦИНОМ
03.00.23. - биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
□03170 190
Москва-2008
003170190
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им МВ Ломоносова и в лаборатории биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им почетного академика Н Ф Гамалеи РАМН
Научный руководитель: академик РАМН,
доктор химических наук, профессор Виталии Иванович Швец
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор
Сергей Викторович Костров
доктор биологических наук Илья Александрович Шилов
Ведущая организация: НИИ Физико-химической биологии
им А Н Белозерского при МГУ им М В Ломоносова
Защита состоится « июня 2008 года в 15 часов на заседании диссертационного Совета Д 212 120 01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им МВ Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр Вернадского, 86
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им МВ Ломоносова С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте vvwvv mitht ru
if
Автореферат разослан мая 2008 года
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук ^ " ' — д и Лютик
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ"
Актуальность работы Рицин, токсин растительного происхождения из семян клещевины обыкновенной (Ricinus communis), является одним из наиболее сильнодействующих токсинов Минимальная летальная доза рицина для человека может составлять 5 мкг/кг [Bradberry S M, 2003] Семена клещевины (касторовые бобы) используют для выделения касторового масла, которое применяется в промышленности, медицине и косметологии Шрот клещевины, богатый питательными белками, входит в состав комбикормов для сельскохозяйственных животных Присутствие рицина в семенах клещевины осложняет производство данной продукции Согласно ГОСТ 18102-95 (Масло касторовое медицинское Технические условия) и ГОСТ 17290-71 (Шрот клещевинный кормовой Технические условия), реакция на рицин в ней должна отсутствовать
Технология выделения рицина из семян клещевины является простой и доступной, поэтому рицин представляет собой серьезную опасность с точки зрения возможности его использования в качестве химического оружия, в частности, в террористических целях для отравления воздуха в закрытых вентиляционных системах, питьевой воды и запасов продовольствия Этому веществу, как поражающему агенту, был присвоен шифр "W" [Антонов H С, 1994]
Рицин - гликопротеин (62 кДа), белковая часть молекулы которого построена из двух субъединиц - каталитической А-субъединицы (RTA, Ricinus Toxin A-chain) и лектиновой В-субъединицы (RTB, Ricinus Toxin B-chain), соединенных одной дисульфидной связью RTA (30,6 кДа) представляет собой высоко активную N-гликозидазу, отщепляющую консервативный остаток аденина в 28S рРНК эукариот В результате отщепления остатка аденина, рибосомы утрачивают способность связывать факторы элонгации, что ведет к блокированию синтеза новых белков, и, как следствие, к апоптозу и гибели эукариотических клеток RTB (31,4 кДа) - лектин, выполняющий транспортные функции Связываясь с остатками D-галактозы и N-ацетилгалактозамина углеводных цепей рецепторных гликопротеинов и гликолипидов поверхности эукариотических клеток, RTB обуславливает эндоцитоз и
В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие заведующий лабораторией биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им почетного академика H Ф Гамалеи РАМН, к б н В Г Лунин
3
дальнейший внутриклеточный транспорт токсина [Endo Y et al, 1987] Благодаря своей потенциальной токсичности, RTA нашла применение в создании иммунотоксинов - конъюгатов, состоящих из токсина и антитела и обладающих направленным токсическим действием, например, в противоопухолевой терапии [Olsnes S et al, 2001] и терапии ВИЧ [Pincus S H, 1996]
На сегодняшний день не существует препаратов для профилактики и лечения отравлений рицином, в связи с чем, чрезвычайный интерес представляет создание антидотов и вакцин, а также разработка тест-систем для экспресс-индикации рицина в окружающей среде и в организме Наиболее перспективными представляются антидоты, полученные на основе протективных антител к рицину и тест-системы, основанные на иммунохимических методах Производство подобных антидотов, тест-систем, а также вакцин требует получения антигенов рицина
Работа с нативным рицином для получения его антигенов крайне сложна ввиду его высокой токсичности Показано, что RTA, изолированная от RTB, находясь вне клетки, не токсична из-за неспособности проникать в клетку в отсутствии RTB [O'Hare et al, 1987] Также показано, что рекомбинантные RTA и RTB сохраняют многие эпитопы нативного рицина, в том числе и протективные [Carra J H et al, 2007, McGuinness CR et al, 2006, Maddaloni M et al, 2004] Поэтому перспективным подходом к получению антигенов рицина является создание рекомбинантных RTA и RTB Для разработки иммунотоксинов также возможно использование рекомбинантных RTA, но для этой цели необходимо сохранение потенциальной токсичности рекомбинантых RTA и снижение их иммуногенности
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение рекомбинантных антигенов RTA и RTB и исследование их иммуногенных и антигенных свойств
Работа выполнялась в рамках комплексного проекта Федерального агентства по науке и инновациям при Министерстве образования и науки РФ по теме «Разработка технологий, методов и средств обеспечения системы биологической безопасности и противодействия терроризму» (шифр «БТ-00 2/001») по договору №8-Л/05 от 04 05 2005 (ГК 02 467 11 6002 от 12 04 2005)
В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие основные задачи
1 Клонирование и экспрессия в Е coli нуклеотидных последовательностей, кодирующих как аутентичные RTA и RTB, так и их гибриды с белками-носителями,
2 Создание эффективных штаммов-продуцентов Е coli рекомбинантных белков, содержащих RTA и RTB,
3 Разработка технологии выделения и очистки рекомбинантных белков, содержащих RTA и RTB,
4 Исследование иммуногенных и антигенных свойств полученных белков
На\чная новизна На основе идеологии создания многокомпонентных белков, развиваемой в исследовательском коллективе лаборатории биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им H Ф Гамалеи РАМН и в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН под руководством В Г Лунина, были впервые спланированы и сконструированы рекомбинантные гибридные плазмидные ДНК Е coli, позволяющие эффективно осуществлять в клетках Е coli штамма М15 индуцированный биосинтез химерных белков RTA-DHFR, RTB-DHFR и RTAspCBD, RTBspCBD, содержащих А- и В-субъединицы рицина и белки-носители (дигидрофолат редуктазу - DHFR и целлюлозосвязывающий домен - CBD) Впервые получены штаммы-продуценты данных белков Разработана высокоэффективная схема выделения, очистки и иммобилизации рекомбинантных белков RTAspCBD, RTBspCBD на целлюлозном сорбенте, основанная на аффинных свойствах целлюлозосвязывающего домена и позволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 95% Впервые получены в препаративных количествах высокоочищенные рекомбинантные белки RTA-DHFR, RTB-DHFR и RTAspCBD, RTBspCBD, способные индуцировать у кроликов выработку высокого титра специфичных к нативному рицину антител
Практическое значение работы Полученные штаммы-продуценты рекомбинантных белков RTAspCBD, RTBspCBD и разработанный метод выделения, очистки и иммобилизации этих белков на целлюлозе, могут найти применение в области промышленной биотехнологии при создании вакцинных препаратов для
предотвращения отравлений рицином, тест-систем индикации рицина на основе иммунохимических методов, а также для получения антидотов к рицину на основе протективных антител Целлюлозосвязывающий домен позволяет получать иммобилизованные препараты RTAspCBD, RTBspCBD на целлюлозе Белки, иммобилизованные на целлюлозном носителе, обладают большей стабильностью и существенно большей иммуногенностью по сравнению с раствором нативного белка [Волков И Ю и др , 2004] Данные белки могут быть использованы для разработки нового поколения иммунологических диагностикумов, в том числе белковых биочипов, основанных на присоединении к подложке из целлюлозы данных рекомбинантных белков, а также для получения сорбентов на основе целлюлозы, для очистки противорициновых антител В случае сохранения токсичности, связанной с каталитической активностью RTA выщеплять аденин из 28S рРНК эукариот, белок RTAspCBD может найти применение в качестве компонента иммунотоксинов для борьбы со злокачественными опухолями и ВИЧ Белок RTBspCBD может быть использован в качестве адъюванта субъединичных генно-инженерных вакцин
Апробация работы и публикации Основные результаты исследований были представлены на Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2007», Саратов, 26-30 ноября 2007, на VIII Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2 апреля 2008, на Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология», Курск, 29-30 апреля 2008 г, на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008 По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, отражающих основное содержание работы
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 152 страницах печатного текста, содержит 32 рисунка и 3 таблицы, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающей 271 наименование
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1 Получение рекомбшинтных аутентичных А- и В-субъедшшц рицина
Первым эталом работы было клонирование и исследование экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих аутентичные RTA и RTB Для этого на основе экспрессионного вектора pQE6 (Арг) (QIAGEN, США), содержащего высокоэффективные регуляторные элементы - промотор фага Т5, находящийся под контролем Lac-penpeccopa, и терминатор транскрипции, получали генно-инженерные конструкции (плазмиды) pRTA и pRTB (рис 1)
Все олигонуклеотиды для получения последовательностей RTA и RTB планировались на основе известной последовательности гена предшественника рицина из Ricinus communis аннотированного в базе данных GenBank (Accession No ЛОЗ] 79) Синтез олигонуклеотидов проводился ЗАО «Синтол» (Москва) В качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали хромосомную ДНК Ricinus communis, выделенную из ее листьев Ген предшественника рицина не содержит интронов
l)RTA
Nco\
-НИ
Promoter Т5 SD
RTA
Promoter T5 SD
RTB
ВшгШХЬсЛ Terminator
Ajjll Ba^Kpnll
Terminator
Рис 1 Схемы генно-инженерных конструкций pRTA, pRTB Promoter T5 -промотор бактериофага T5, SD последовательность Шайна-Дальгарно, RTA - нуклеотвдная последовательность, кодирующая А-субъединицу рицина, RTB -нуклеотидная последовательность,
кодирующая В-субьединицу рицина, Terminator - терминатор транксрипции
Нуклеотидную последовательность, кодирующую RTA, получали при помощи ПЦР Для ее амплификации была подобрана пара олигонуклеотидных праймеров, в которых были запланированы сайты рестрикции Nco\, Xbal, ВатШ для удобства последующего клонирования, а также инициирующий и терминирующий кодоны Start
RTA-F 5'-TTAGAGGCCATGGGCATATTCCCCAAACAATACCCAATTATAAAC-3', Ntol
RTA-R 5'-CACTGGTCTAGATTACiGATCCAAACTGTGACGATGGTGGAGGTGCG-3' AM Stop BamHl
Плазмиду рЯТА получали встраиванием ПЦР-фрагментов последовательности ЯТА в экспрессионный плазмидный вектор р(}Е6 при помощи эндонуклеаз рестрикции ЫсЫ и ХЬа\.
Нуклеотидную последовательность, кодирующую ЯТВ, конструировали по частям из двух фрагментов (М- и С-концевого) для того чтобы убрать неудобные для дальнейшего клонирования сайты рестрикции Ысо\ и ВатШ, присутствующие в нативной ДНК. Для этого получали плазмиды pNRTB и рСЯТВ (рис. 2).
pNRTB
£c«RI Ncol Л/т BamHl Xba\
-»-ДПИМ-»
Promoter TS SD NRTB Terminator
AeoRI
Promoter Т5 SD RTB Terminator
Рис. 2. Схемы генно-инженерных конструкций jiNRTR, pTR.TB u. pRTB". Promoter T5 - промотор бактериофага T5; SD - последовательность Шайна-Дапьгарно; NRTB - нуклеотидная последовательность, кодирующая N-концевую часть RTB (1219-1982 п.н., GenBank, Accession No. Х03179); CRTB -нуклеотидная последовательность,
кодирующая С-кониевуто часть RTB (19562018 п.н., GenBank, Accession No. Х03179)\ Terminator - терминатор транкерипции.
Promoter Т5 SD CRTB Terminator
pRTB
Ncol Aflll Barnm Kpnll
Нуклеотидную последовательность, кодирующую N-концевую часть RTB, получали методом ПЦР. Для ее амплификации была подобрана пара праймеров, в которых были запланированы сайты рестрикции Nco\, Xba\, ВатШ, AflW, а также инициирующий ко дон:
Start
N-RTB-F: S'-TACCAACCATGGGTGCTGATGTTTGTATGGACCCTGAGCCC-S' iVcol
N-RTB-R:5'-GAGAGGTCT AGATT AGGATCCCTTAAGGCTCGGGTCCGATGCCCTCACAT-3' XbaX Ватт AflW
ПЦР-фрагменты, кодирующие N-концевую последовательность RTB, встраивали в вектор pQE6 при помощи эндонуклеаз рестрикции Ncol и XbaI и получали плазмиду pNRTB (рис. 2). Последовательность, кодирующую С-концевую часть RTB с оптимизированными для синтеза в Е. coli кодонами, получали химико-ферментативпым синтезом из олигонуклеотидов, в которых были запланированы сайты рестрикции fcoRI. BamYft, Крп2\ и AflW, а также терминирующий кодон:
EcoRl (полусайт)
C-RTB-F1 5'-AATTCTTAAGC AGATT ATCCTGTACCCGCTGCA-3' Aj/II
Bumtíl Stop
C-RTB-F2. 5'-TGGCGATCCGAATCAGATCTGGCTGCCGCTGTTTGGAI£QTAAT-3'
Kpnll (полусайт) Stop Bum HI C-RTB-R1 5'-CCGGATTAGGATCCAAACAGCGGCAGCCAGATCTGAT-3'
Afl II
C-RTB-R2 5'-TCGGATCGCCATGCAGCGGGTACAGGATAATCTGCTTAAG-3'
Полученные фрагменты, кодирующие С-концевую часть RTB, встраивали в вектор pQE6 с использованием эндонуклеаз рестрикции EcoRI и Крп2\ и получали плазмиду pCRTB (рис 2) Плазмиду pRTB, несущую последовательность, кодирующую полноразчерную RTB, получали из двух плазмид pNRTB и pCRTB при помощи эндонуклеаз рестрикции EcoRl и Aflll (рис 2) Последовательности всех рекомбинантных генов были подтверждены секвенированием по Сэнгеру
Плазмидные ДНК pRTA и pRTB трансформировали электропорацией в клетки Е coli М15 [pREP4] (QIAGEN, США) Выбранные по результатам секвенирования и рестрикционного анализа штаммы М15 [pREP4, pRTA] и М15 [pREP4, pRTB], выращивали на среде, содержащей ампициллин и канамицин, экспрессию рекомбинантных генов индуцировали добавлением изопропил-ß-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) В дальнейших исследованиях трансформацию, селекцию клонов и индукцию экспрессии проводили аналогичным образом
Индукция экспрессии рекомбинантных генов RTA и RTB в Е coli при помощи ИПТГ не привела к накоплению белковых продуктов ожидаемой молекулярной массы (-30 кДа), что было выявлено при помощи электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) с окраской по Кумасси Отсутствие видимого накопления целевых белков, вероятно, может быть связано с их протеолизом, так как они являются гетерологичными для клеток £ coli
2. Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в цитоплазме Е. coli
Для увеличения уровня продукции, стабилизации и устойчивости к протеолизу гетерологичных рекомбинантных белков в клетках Е coli в генно-инженерной практике часто используют технологию создания слитных (химерных) белков
[Тегре К., 2003], основанную на соединении в одной рамке трансляции нескольких генов, например, гена белка-носителя и гена исследуемого продукта. Белок-носитель при этом может способствовать накоплению целевого белка в клетках и его эффективной очистке на аффинном сорбенте, способствовать его фолдингу и растворимости в цитоплазме клетки. В качестве белка-носителя нами был выбран целлюлозосвязывающий домен (CBD) фермента эндоглюканазы CelD из Anaerocellum thermophilum, который, с одной стороны, может способствовать защите целевого белка от протеолиза. а с другой, обеспечивать возможность высокоэффективной одностадийной очистки, концентрации и иммобилизации целевого белка на дешевом и доступном целлюлозном сорбенте. В результате получения гибридных конструкций, содержащих r одной рамке трансляции пуклеотидные последовательности CBD и целевого белка, удавалось получить продукцию белка, составляющую вплоть до 30% от тотального белка Е. coli [Васекина A.B. и др., 2005; Лящук A.M. и др.. 2006].
На основе вектора pQE6 нами были созданы генно-инженерные конструкции pRTAspCBD и pRTBspCBD, содержащие в своем составе нуклеотидные последовательности, кодирующие аутентичные RTA и RTB, соответственно, слитые с (Gly-Ser^-cneficepoM (sp) и CBD (рис. 3).
Рис. 3. Схемы генно-инженерных конструкций pspCBD,
pRTAspCBD, pRTBspCBD:
Promoter T5 - промотор бактериофага Т5; SD последовательность Шайна-
Дальгарно; RTA - нуклеотидная последовательность, кодирующая А-субъедииицу рицина; RTB -нуклеотидная последовательность, кодирующая В-субъединицу
рицина; sp - нуклеотидная последовательность кодирующая спейсер, состоящий из 5 повторов Gly-Ser; CBD - нуклеотидная последовательность, кодирующая целлюлозосвязывающий домен; Terminator - терминатор транксрипции.
Для этого нуклеотидные последовательности RTA и RTB из плазмид pRTA и pRTB при помощи эндонуклеаз рестрикции Nco\ и ВатШ были встроены в плазмиду
pspCBD
NcoIBamHl
Ni
Promoter T5 SD sp CBD Terminator
pRTAspCBD Ncdl ftimHl Hind\\\
4_I_
—W/////////M-+
Promoter T5 SD RTA sp CBD ^Terminator
pRTBspCBD
«col BamW Hwd\\\
Promoter T5SD RTB sp CBD Terminator
pspCBD, предварительно полученную в два этапа На первом этапе химико-ферментативным синтезом получали нуклеотидную последовательность (Gly-Ser)5-спейсера из олигонуклеотидов, в которых были запланированы сайты рестрикции ВатШ, Bglll и Hmdlll Bamftl
(полу сайт) Bglll
SP-F 5'-GATCCCCGGGTTCTGGCTCCGGCTCTGGTTCCGGTTCTGGCGCCAGATCTA-3'.
ttnJIII (полусайт)
SP-R 5'-AGCTTAGAACTGGCGCCAGAACCGGAACCAGAGCCGGAGCCAGAACCCGGG-3' Полученные фрагменты встраивали в плазмиду pQE6 при помощи эндонуклеаз рестрикции Ваш HI и Hmdlll и получали плазмиду pQE6sp На втором этапе получали нуклеотидную последовательность CBD из гена CelD Для этого специфический участок хромосомной ДНК A thermophilum амплифицировали при помощи специфических праймеров, спланированных на основе последовательности гена CelD A thermophilum, аннотированной в банке данных GenBank (Accession No Z778S5) В праймерах были запланированы сайты рестрикции ВатШ, Bglll и HindiII, а также терминирующий кодон
BamHI
CBD-F 5'-AAAGAAGGATCCAATGCACCTTTAGGCG-3',
Hmdlll Stop ßg/II CBD-R 5'-TCAAAAAGA AGCTTTTAAGATCTAACATTATCTATATAC-3'
Полученный ПЦР-фрагмент гидролизовали эндонуклеазами рестрикции ВатШ и HindiII и встраивали в плазмиду pQE6sp, гидролизованную эндонуклеазами рестрикции Bglll и HindiII, получая плазмиду pspCBD (рис 3) Последовательности всех полученных генов были подтверждены секвенированием по Сэнгеру
Индукция экспрессии рекомбинантных генов в Е coli при помощи ИПТГ не привела к накоплению белков продуктов RTAspCBD и RTBspCBD ожидаемой молекулярной массы (-52 кДа), что было выявлено при помощи электрофореза в 10% ДСН-ПААГ с окраской по Кумасси Отсутствие видимой продукции, возможно, может быть связано с протеолизом в цитоплазме Е colt гегерологтных рекомбинантных белков RTAspCBD и RTBspCBD
Ранее было показано, что белок spCBD продуцируется в Е coli в водорастворимой форме, и его использование в качестве белка-носителя в составе химерных конструкций чаще всего способствует образованию водорастворимых
продуктов. Известно, что водорастворимые продукты подвержены протеолизу в цитоплазме клеток Е. coli в большей степени, чем гидрофобные продукты, образующие тельца включения. В связи с этим следующим этапом работы стало создание химерных белков, образующих тельца включения в Е. coli.
3. Получение химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR и исследование их иммуногенных и антигенных свойств
3.1. Клонирование и экспрессия гибридных генов химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR
Одним из известных подходов к получению рекомбинантных белков с низким
уровнем экспрессии, а также белков, подверженных протеолизу в цитоплазме Е. coli,
является подход, направленный на получение этих белков в форме телец включения,
представляющих собой водонерастворимые обособленные компартменты,
препятствующие действию протеолитических ферментов. В качестве белка-носителя
для RTA и RTB, способствующего образованию телец включения в цитоплазме
клеток, мы использовали мышиную дигидрофолат редуктазу (DHFR).
Рис. 4. Схемы генно-инженерных конструкций pQH 16, pRTA-DHFR, pRTB-DHFR: Promoter T5
- промотор бактериофага T5; SD
- последовательность Шайна-Дальгарно; RTA - нуклеотидная последовательность, кодирующая А-субъединицу рицина; RTB -нуклеотидная
последовательность, кодирующая В-субъединицу рицина; DHFR -нуклеотидная
последовательность, кодирующая мышиную дигидрофолат
редуктазу; 6*His - нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, состоящую из шести остатков гистидина; Tenninator - терминатор транксрипции.
Для получения плазмидных генно-инженерных конструкций pRTA-DHFR и pRTB-DHFR (рис. 4), несущих гибридные гены химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR, последовательности, кодирующие RTA и RTB из плазмид pRTA и pRTB, встраивали в экспрессионный плазмидный вектор pQE16 (Арг) (Q1AGEN, США) при
РОЕ16
EcoYÜ ВатШ -
Promoter Т5 SD DHFR fixllis Terminator
nRTA-DHFR
Ei^Rl ftjяН1
-^ ..шштшЛ-*
Promoter T5 SD RTA DHFR 6*His Terminator
pRTB-DHFR
ftjoRI äcjbHI
I'roIIInter DHFR ( ^ Теrminatnr
помощи эндонуклеаз рестрикции ZTeoRI и Bamlll Вектор pQE16, в свою очередь, содержит последовательность, кодирующую в одной рамке считывания DHFR и пептид из шести аминокислотных остатков гистидина (6xHis) на С-конце DHFR, позволяющий производить очистку рекомбинантных белков на Ni-NTA-содержащих сорбентах Полученные гены были подтверждены секвенированием по Сэнгеру
Наблюдали замедление роста клеток, трансформированных плазмидой pRTA-DHFR по сравнению с ростом клеток, трансформированных плазмидами pRTB-DHFR и pQE16 (рис 5) Кроме того, происходило снижение выхода на 18% биомассы, обладающей замедленным ростом, по сравнению с выходом остальных вариантов биомассы Это может свидетельствовать о токсичности для клеток Е coli, продуцируемого штаммом М15 [pREP4, pRTA-DHFR], накапливающегося в цитоплазме, целевого белка RTA-DHFR, причем токсичность в этот химерный белок привносится именно доменом RTA, а не DHFR Возможно, что в случае экспрессии аутентичной RTA, целевой белок просто не успевал проявить своего токсического действия на клетки в следствие протеолиза, поэтому в том случае не отмечали как замедления роста клеток, так и появления самого продукта
Рис. 5 Динамика роста клеток Е cob штаммов а) М15 [pREP4, pRTA-DHFR], б) М15 [pREP4, pRTB-DHFR] и в) М15 [pREP4, pQElô], инкубация при 37°С, 240 об/мин, в 500-мл колбах, в 100 мл среды LB
S в 450 ■
е V) 4 СО •
«Г)
s 3 эО ■ 3:
о. V
с 100 ■ /Г
Í 2 50 • / /-а
е у у
в 200- / /
е 1 50 • //
г 100 ■ У /
в ОэО ■ У/
е Q 0 00 1
( 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 b 16
Время часы
Механизм токсического действия RTA-DHFR может быть связан с N-гликозидазной активностью RTA, которая, возможно, проявляется не только в цитоплазме эукариот, где ее субстратом является 28S рРНК, но и в цитоплазме прокариот, где ее субстратом может являться 23S РНК [Endo Y et al, 1988], а также другие нуклеиновые кислоты, в том числе плазмидные ДНК [Wang S Т et al, 2005]
После индукции экспрессии рекомбинантных генов в штаммах Е coli Ml5 [pREP4, pRTA-DHFR], E coli Ml5 [pREP4, pRTB-DHFR] обнаруживалось накопление белковых продуктов ожидаемой молекулярной массы (-52 кДа) Уровень продукции целевых белков составил приблизительно 5-7% от общего клеточного
белка при экспрессии после индукции ИПТГ в течении 3 ч при 37°С (рис. 6). Увеличение времени экспрессии свыше 3 ч не способствовало увеличению уровня продукции целевых белков. 12 3 4 5 6 М
52 k la
1 2 3 4 5 6 M
Рис.6. Электрофореграмма белков в 10% ДСН-ПААГ с окрашиванием по Кумасси. Лизаты клеток £ coli M15 [pREP4]: 1 — до индукции; 2 -
-66 кДа
- после индукции. Лизаты клеток £ coli М15 [pREP4, pRTA-DHFR]: 3 — до индукции; 4 --45 кДа после индукции. Лизаты клеток Е. coli М15 [pREP4, pRTB-DHFR]: 5 — до индукции; 6 — после индукции. M - маркеры молекулярной массы; бычий сывороточный альбумин - 66 кДа, овальбумин - 45 кДа.
В пезультате анализа распределения целевых белков RTA-DHFR и RTB-DFÎFR
в клетках Е. coli было показано, что целевые белки накапливаются в них примерно в
равной степени, как в виде телец включения, так и в растворимой форме (рис. 7).
Рис. 7. Электрофореграмма белков в 10% ДСН-ПААГ с окраской по Кумасси. Анализ распределения белка RTA-DHFR в клетках £ coli штамма М15 [pREP4, pRTA-DHFR], 1 -лизат клеток после индукции; 2 - растворимая фракция лизата; 3 - нерастворимая фракция лизата; белка RTB-DHFR в клетках £ coli штамма М15 [pREP4, pRTB-DHFR]: 4 - лизат клеток после индукции; 5 - растворимая фракция лизата; 6 - нерастворимая фракция лизата. M -маркеры молекулярный массы: бычий сывороточный альбумин - 66 кДа, овальбумин -45 кДа.
3.2. Выделение и очистка химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR
Выделение и очистку белков RTA-DHFR и RTB-DHFR проводили как из водорастворимой фракции клеточного лизата, так и из водонерастворимой (из телец включения) на колонке с Ni-NTA-агарозой (Q1AGEN, США). Тельца включения предварительно растворяли в 6 M гуанидин хлориде. Были получены препараты очищенных белков с концентрацией 1 мг/мл. Чистота белков RTA-DHFR и RTB-DHFR составляла не менее 95% (рис. 8). Выход белков составил приблизительно 8 мг из 1 л культуры для RTA-DHFR и приблизительно 10 мг из 1л культуры для RTB-DHFR
66 кДа
52 кДа 45 кДа
Рис. 8. Электрофореграмма белков в 10% ДСН-ПААГ с окраской по Кумасси. Очистка белков RTA-DHFR и RTB-DHFR на колонке с Ni-NTA-агарозой: I - М15 66 кДа [pREP4, pRTA-DHFR] - растворимая фракция лизата;
2 - очищенный белок RTA-DHFR из растворимой ,52 кда фракции; 3 - М15 [pREP4, pRTA-DHFR] -4S кЛа неРаств0Римая Фракция лизата; 4 - очищенный белок ~ RTA-DHFR из нерастворимой фракции; 5 - M15 [pREP4, pRTB-DHFR] - растворимая фракция лизата; б - очищенный белок RTB-DHFR из растворимой фракции; 7 - М15 [pREP4, pRTB-DHFR] -нерастворимая фракция лизата; 8 - очищенный белок RTB-DHFR из нерастворимой фракции. M - маркеры молекулярной массы: бычий сывороточный альбумин - 66 кДа, овальбумин - 45 кДа.
3.3. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR
Очищенными антигенами RTA-DHFR и RTB-DHFR проводили иммунизацию кроликов. Животные остались живыми на протяжении всего курса иммунизации. Можно предположить, что данные белковые препараты не обладают летальной токсичностью в дозировке необходимой для иммунизации. Активность и специфичность антител в кроличьих гипериммунных сыворотках определяли при помощи непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (F№A). где в качестве сенсибилизирующих антигенов были применены химерные белки RTA-DFIFR. RTB-DHFR и нативный рицин.
S t
i
«
а
t
Рис. 9. Определение титра и специфичности антител в гипериммунных сыворотках крови кролика методом непрямого ИФА: РТА-ОНРИ, RTB-DHFR, рицин - антигены, сорбированные на плашке; N5 - предиммунная сыворотка; аА - гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTA-DHFR, аВ - гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTB-DHFR. Титром антител считали обратную величину последнего разведения, в котором оптическое поглощение при длине волны 450 нм (ОП450) исследуемого образца сыворотки в 2 раза превышает 017450 в отрицательном контроле.
8000
Гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTA-DHFR, проявляла активность в разведении 1 12800 как по отношению к исследуемому антигену RTA-DHFR, так и в разведении 1 6400 по отношению к нативному рицину Гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTB-DHFR, проявляла активность в разведении 1 12800 как по отношению к исследуемому антигену RTB-DHFR, так и в разведении 1 6400 по отношению к нативному рицину Наблюдали незначительную перекрестную специфичность в сыворотках (активность в разведении 1 1600), обусловленную присутствием в составе рекомбинантов общей структуры DHFR (рис 9) Полученные результаты показали, что химерные белки RTA-DHFR и RTB-DHFR сохранили антигенные детерминанты нативного рицина
Технология очистки полученных антигенов на Ni-NTA содержащем сорбенте рациональна лишь для их получения в лаборатории в научно-исследовательских целях, но не в производственной практике, из-за высокой стоимости Ni-NTA содержащего сорбента Целлюлоза, в свою очередь, является в десятки раз более дешевым сорбентом и значительно более доступным Поэтому далее было решено добиться накопления в Е coli антигенов рицина с CBD путем их секреции в периплазму
4 Получение химерных белков RTAspCBD 11 RTBspCBD в периплазме Е. coli н исследование их иммуногенных и антигенных свойств
4.1 Клонирование и экспрессия гибридных генов химерных белков SigRTAspCBD н SigRTBspCBD
Накопление гетерологичных белков в растворимой форме в цитоплазме Е coli часто приводит к их протеолизу Известно, что в периплазме Е coli рекомбинантные белки не подвержены протеолизу, а присутствующие в ней ферменты способствуют более правильному сворачиванию белка [Blight MA, et al, 1994] Поэтому следующим этапом нашей работы стало создание штаммов-продуцентов белков RTAspCBD и RTBspCBD, обеспечивающих секрецию этих белков в периплазму Для того чтобы секретировать рекомбинантный белок в периплазму, в генно-инженерной практике в его состав вводят N-концевой сигнальный пептид, который направляет белок в периплазму и при этом отщепляется клеточной сигнальной пептидазой во время транслокации белка через периплазматическую мембрану В качестве сигнального пептида нами был выбран сигнальный пептид L-аспарагиназы II Е coli
16
(Sig), являющийся гомологичным для клеток Е. coli, что должно обеспечивать эффективную секрецию рекомбинантных белков в периплазму и отщепление сигнального пептида.
pSigRTAsnCBD
M"f fßi'I'HI Hiim"
Promoter T5 SD Sig RTA sp CBD
Terminator
pSigRTBspCBD
Muni Ncol BamWl HimAll
4 1 _ 1_
Promoter T5 SD Sig RTB sp CBD
Terminator
Рис. 10. Схемы генно-инженерных конструкций pSigRTAspCBD, pSigRTBspCBD: Promoter T5 -промотор бактериофага T5; SD - последовательность Шайна-Дапьгарно; Sig - нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид L-аспарагиназы 11 I'.. со//; RTA - нуклеотидная последовательность, кодирующая А-субъединицу рицина; RTB - нуклеотидная последовательность, кодирующая В-субъединицу рицина; sp - нуклеотидная последовательность кодирующая спейсер, состоящий из 5 повторов Gly-Ser; CBD - нуклеотидная последовательность, кодирующая целлюлозосвязывающий домен; Terminator - терминатор транскрипции.
Для получения таких штаммов-продуцентов нами были получены плазмиды pSigRTAspCBD и pSigRTBspCBD (рис. 10). Данные плазмиды несут гибридные гены химерных белков, состоящих из А- и В-субъединиц рицина, (Gly-Ser)5-cneftcepa, целлюлозосвязывающего домена и сигнального пептида. Для их получения, в плазмидные конструкции pRTAspCBD и pRTBspCBD встраивали последовательность, кодирующую сигнальный пептид (Sig) при помощи эндонуклеаз рестрикции Мип\ и Nco\. Данную последовательность получали химико-ферментативным способом из олигонуклеотидов, в которых были запланированы сайты рестрикции Muni и Nco\, а также инициирующий кодом: Muni
(полусайт) Start
SIG-Fl:5'-MTIGATTAAAGAGGAGAAATTAACTCTATGGAGTTTTTTAAAAAGACG-3'
SIG-F2:
5'-GCACTTGCCGCACTGGTTATGGGTTTTAGTGGTGCAGCATTGGCATTACCCAATATCAC-3'
SIG-R1:
5'-GTGCGGCAAGTGCCGTCTTTTTAAAAAACTCCATAGAGTTAATTTCTCCTCTTTAATC-3'
Ncol (полусайт)
STG-R2: S'-CATGGTGATATTGGGTAATGCCAATGCTGCACCACTAAAACCCATAACCA-3'
Нуклеотидные последовательности полученных рекомбинантных генов были подтверждены секвенированием по Сэнгеру.
Индукция экспрессии полученных генов в штаммах Е. coli М15 [pREP4, pSigRTAspCBD], М15 [pREP4, pSigRTBspCBD] привела к накоплению белковых продуктов ожидаемой молекулярной массы (~52 кДа). Уровень продукции целевых белков в клетках Е. coli, полученных при экспрессии после индукции с помощью ИПТГ в течении 18-20 ч при 25°С, составил приблизительно 5— 10% от общего клеточного белка. Увеличение температуры до 37°С и уменьшение времени экспрессии отрицательно сказывалось на уровне продукции целевых белков. Анализ распределения целевых белков в клетках Е. coli показал, что целевые белки накапливаются в периплазме, причем исключительно в растворимой форме (рис. 11). Можно предположить, что происходит накопление именно процессированных белков - RTAspCBD и RTBspCBD, не содержащих на N-конце сигнального пептида.
Рис. 11. Электрофореграмма белков в 10% ДСН-ПААГ с окрашиванием по Кумасси. Лизаты клеток Е. culi Ml5 штамма-продуцента RTAspCBD: 1 - до индукции; 2 - после индукции; 3 - растворимая фракция; 4 - тельца включения. Лизаты клеток Е. coli Ml5 штамма-продуцента RTBspCBD: 5 - до индукции; 6 - после индукции, 7 - растворимая фракция; 8 - тельца включения. M - маркеры молекулярной массы: бычий сывороточный альбумин - 66 кДа, овальбумин - 45 кДа.
4.2. Выделение н очистка химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD
Выделение и очистка целевых белков RTAspCBD и RTBspCBD были основаны на аффинных свойствах CBD фермента эндоглюканазы CelD из A. thermophilum, характеризующегося высокой константой связывания с целлюлозой в широком диапазоне ионной силы (0,01-4 M NaCl), pH (4-11) и температуры (0-75°С). Существенной особенностью CBD является сохранение его аффинных свойств при соединении с другими белками [Levy I. et. al., 2002].
Нами была разработана методика очистки белков RTAspCBD и RTBspCBD из растворимой фракции лизата биомассы Е. coli штаммов [pREP4, pSigRTAspCBD] и M15 [pREP4. pSigRTBspCBD], соответственно, с помощью целлюлозного сорбента. В соответствии с методикой: 1) проводили лизис штамма-продуцента; 2) центрифугировали полученный лизат; 3) супернатант смешивали с целлюлозным
1 23 456 7 8 M
52 M;i
' Л4 V
-66 кДа -45 кДа
сорбентом и выдерживали 1 ч при комнатной температуре, далее переносили суспензию в хроматографическую колонку: 4) колонку промывали фосфатным буферным раствором (рН 7.4) с 1% тритоном Х-100 от неспецифических примесей; 5) элюировали связавшиеся белки 8 М мочевиной; 6) ренатурировшти белки при помощи ступенчатого диализа в фосфатный буферный раствор (рН 7.4). Данная технология очистки позволила эффективно выделить и очистить белки ЯТАэрСЕШ и ЯТВзрСЕШ от примесей штамма-продуцента. Их чистота составила не менее 95% (рис. 12).
кДа Рис. 12. Электрофореграмма белков в 10 % ДСН-ПААГ с окрашиванием по Кумасси. Очистка химерных белков Ю~А5рСВО и ЯТВзрСВБ на целлюлозе: 1,3 — лизаты клеток штаммов-продуцентов ИТАзрСВО и КТВБрСВО после индукции ИПТГ; 2, 4 - препараты очищенных на целлюлозе белков ЯТАбрСВО и КТВэрСВО, соответственно. М - маркеры молекулярной массы: бычий сывороточный альбумин - 66 кДа, овальбумин - 45 кДа.
Г2 ^
Были получены препараты очищенных белков с концентрацией 1 мг/мл. Выход белков составил приблизительно 5-10 мг из 1 л культуры. Наличие только одной полосы на ДСН-ПААГ, соответствующей приблизительно 52 кДа. может свидетельствовать о том, что белки полностью процессированы и не содержат примесей непроцессированных белков с 14- концевым сигнальным пептидом (рис. 12). Отсутствие сигнальной последовательности было подтверждено путем анализа трипсинового гидролизата продуктов с использованием МАГ01-Т0Р-масс-спектрометрии.
4.3. Исследование нммуногенных и антигенных свойств химерных белков КТАзрСВО и ИТВврСВО
Очищенными белками КТАэрСВО и ГГГВзрСВБ проводили иммунизацию кроликов. Животные остались живыми на протяжении всего курса иммунизации. Можно предположить, что данные белковые препараты не обладают летальной токсичностью в дозировке необходимой для иммунизации. Анализ активности и специфичности антител в кроличьих гипериммунных сыворотках проводили при помощи непрямого твердофазного ИФА, где в качестве сенсибилизирующих антигенов были применены химерные белки ИТАзрСВО, КТВ$рСВО и нативный рицин. Гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на ЯТАэрСВО. проявляла
активность как в разведении 1:12800 по отношению к ЯТАврСВО, так и в разведении 1:6400 по отношению к нативному рицину при отсутствии активности предиммунной сыворотки к этим же антигенам (рис. 13), Аналогичную картину наблюдали в случае сыворотки, полученной в ответ на ЯТВзрСВО, где она проявляла активность как в разведении 1:12800 по отношению к ЯТВзрСВО, так и в разведении 1:6400 по отношению к нативному рицину. Наблюдали незначительную перекрестную специфичность (активность в разведении 1:3200) в сыворотках, обусловленную присутствием в составе рекомбинантов общей структуры зрСВО. Полученные результаты показали, что химерные белки ЯТАэрСВО и ЯТВзрСВО сохранили антигенные свойства нативного рицина.
Рис. 13. Определение титра и специфичности антител в гипериммунных сыворотках крови кролика методом непрямого ИФА: RTAspCBD, RTBspCBD, рицин - антигены, сорбированные на плашке; Ns - предиммунная сыворотка; аА - гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTAspCBD; аВ - гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTBspCBD. Титром антител считали обратную величину последнего разведения, в котором ОП450 исследуемого образца сыворотки в 2 раза превышает ОП450 в отрицательном контроле.
Таким образом, проведенные нами экспериментальные исследования позволили создать эффективные штаммы-продуценты антигенов рицина - RTA и RTB, в составе химерных белков с CBD (RTAspCBD, RTBspCBD). Введение в состав данных белков N-концевого сигнального пептида, отщепляющегося после транслокации белка в периплазму, сыграло ключевую роль для накопления данных белков в клетках Е. coli. Разработанная методика получения препаратов белков RTAspCBD и RTBspCBD представляет собой простой и технологичный процесс. Преимуществом дальнейшего использования белков RTAspCBD и RTBspCBD перед использованием белков RTA-DHFR и RTB-DHFR является то, что они синтезируются
в Е coli в полностью водорастворимой форме и не требуют дополнительной солюбилизации, а также значительно более низкая стоимость целлюлозного сорбента по сравнению с Ni-NTA содержащими сорбентами Наличие CBD позволяет получать препараты иммобилизованных на целлюлозе антигенов для решения различных биотехнологических задач, таких как создание вакцин, антидотов и тест-систем Поэтому получение препаратов белков RTAspCBD и RTBspCBD является более экономически и технологически целесообразным, чем получение белков RTA-DHFR и RTB-DHFR
ВЫВОДЫ
1 Сконструированы экспрессионные штазмиды, содержащие гибридные гены химерных белков, состоящих из А- и В-субъединиц рицина и дигидрофолат редуктазы, обеспечивающие эффективную продукцию целевых белков как в водорастворимой форме, так и в форме телец включения в цитоплазме клеток Е coli
2 Сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гибридные гены химерных белков, состоящих из А- и В-субъединиц рицина, целлюлозосвязывающего домена и N-концевой сигнальной последовательности, обеспечивающие эффективную продукцию целевых белков в водорастворимой форме в периплазме клеток Е coli
3 Разработана технологичная и высокоэффективная методика выделения, очистки и иммобилизации белков, состоящих из субъединиц рицина и целлюлозосвязывающего домена на целлюлозном сорбенте
4 Изучены иммуногенные и антигенные свойства полученных белков Показано, что они индуцируют выработку высокого титра специфических к нативному рицину антител
5 Предложено использование белков с целлюлозосвязывающим доменом, как наиболее технологически и экономически выгодных, для создания тест-систем, вакцин и антидотов
Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:
1 Грачева М А . Евстифеев В В , Галушкина 3 М, Полетаева Н Н, Лунин В Г, Швец В И Клонирование и экспрессия в Escherichia coli А- и В-субъединиц рицина в составе химерных белков с дигидрофолат редуктазой // Вестник МИТХТ - 2007 -Т 2 -№6 -С 39-46
2 Грачева М А . Попадьин П В , Евстифеев В В , Галушкина 3 М, Полетаева Н Н, Верховская Л В , Лунин В Г, Швец В И Экспрессия в Escherichia coli А- и В-субъединиц рицина в составе химерных белков с целлюлозосвязывающим доменом и их одностадийная аффинная очистка на целлюлозе // Вопр биол, мед и фармацевт химии -2008 -№3 -С 50-56
3 Грачева М А . Лунин В Г, Швец В И Разрабо1ка технолоши получения белковых компонентов для создания тест-систем экспресс-индикации рицина и кандидатной субъединичной противорициновой вакцины // Матер конф, посвященной 120-й годовщине со дня рождения академика Николая Ивановича Вавилова «Вавиловские чтения-2007», Саратов, 26-30 ноября 2007 - Т 1 - С 300
4 Грачева М А . Лунин В Г, Швец В И Получение рекомбинантных А- и В-субьединиц рицина для создания тест-систем, вакцин и антидотов против рицина // Тез докл VIII Молодежной науч конф «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2 апреля 2008 -С 13-14
5 Грачева М А . Лунин В Г, Швец В И Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином // Сб трудов Всероссийской научно-практической конференции посвященной 10-летию биотехнологического факультета Курского государственного медицинского университета «Биомедицинская инженерия и биотехнология», Курск, 29-30 апреля 2008, С 8486
6 Грачева М А . Лунин В Г, Швец В И Получение рекомбинантных субъединиц рицина для создания тест-систем, вакцин и антидотов против рицина // Сб трудов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008 -С 426
Подписано в печать 13 05 2008 г Уел печ л 1 Тираж 100 экз Заказ № 1248 Отпечатано в типографии «АллА Принт» Тел (495) 621-86-07, факс (495) 621-70-09 www allapnnt ru
Содержание диссертации, кандидата химических наук, Грачева, Мария Андреевна
Список сокращений.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. Обзор литературы.
1.1. Характеристика рицина.
1.1.1. Рибосом-инактивирующие лектины.
1.1.2. Строение рицина и его действие на эукариотические клетки.
1.1.3. Биосинтез рицина.
1.1.4. Транспорт рицина в клетках млекопитающих.
1.1.5. Действие А-субъединицы рицина на рибосомы.
1.1.6. Иммунологические свойства рицина.
1.2. Профилактика излечение отравлений рицином.
1.2.1. Воздействие рицина на организм животных.
1.2.2. Разработка антидотов против рицина.
1.2.3. Разработка вакцин против отравлений рицином.
1.2.4. Разработка тест-систем для обнаружения рицина.
1.3. Применение субъединиц рицина в медицине.
1.3.1. Иммунотоксины.
1.3.2. Адьюванты для создания вакцин.47
1.4. Использование технологии создания химерных белков для получения рекомбинантных антигенов.
1.4.1. Аффинные домены и белки-носители.
1.4.2. Применение целлюлозы, как иммуносорбента.
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть.
2.1. Материалы и реактивы.
2.1.1. Плазмидные векторы и олигонуклеотиды.
2.1.2. Бактериальные штаммы и среды.
2.1.3. Ферменты.
2.1.4. Сорбенты.
2.1.5. Другие реактивы.
2.1.6. Буферные растворы.
2.1.7. Лабораторные животные.
2.1.8. Оборудование.л.
2.2. Основные методики.
2.2.1. Выделение ДНК клещевины.7Г
2.2.2. Полимеразная цепная реакция.
2.2.3. Химико-ферментативный синтез.
2.2.4. Сайт-специфический мутагенез.
2.2.5. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами.
2.2.6. Фракционирование.фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.
2.2.7. Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля.
2.2.8. Лигирование фрагментов ДНК.
2.2.9. Выделение и очистка аналитического количества плазмидной ДНК.
2.2.10. Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК.
2.2.11. Определение нуклеотидных последовательностей плазмидных ДНК.76 . 2.2.12. Подготовка компетентных клеток Е. coli для трансформации плазмидной
ДНК электропорацией.
2.2.13. Трансформация клеток Е. coli.
2.2.14. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН.
2.2.15. Выращивание штамма-продуцента и индукция синтеза рекомбинантных белков.
2.2.16. Определение растворимости белков.
2.2.17. Определение периплазматической локализации белков.
2.2.18. Выделение и очистка белков, содержащих ШБе-аффинную метку.
2.2.19. Выделение и очистка белков, содержащих CBD.
2.2.20. Иммунизация кроликов.
2.2.21. Непрямой ИФА.
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Получение рекомбинантных аутентичных RTA и RTB.
3.1.1. Клонирование нуклеотидной последовательности аутентичной RTA.
3.1.2. Клонирование нуклеотидной последовательности аутентичной RTB.
3.1.3. Экспрессия рекомбинантных генов аутентичных RTA и RTB в клетках Е. coli М15.
3.2. Получение рекомбинантной мутантной RTA.
3.2.1. Клонирование нуклеотиднойпоследовательности мутантной RTA.96'
3.2.2. Экспрессия рекомбинантного гена мутантной RTA в клетках Е. coli Ml
3.3. Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в цитоплазме Е. со Ii
3.3.1. Клонирование гибридных генов химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD.
3.3.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в клетках Е. coli Ml 5.
3.4. Получение химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR и исследование их иммуногенных и антигенных свойств.
3.4.1. Клонирование гибридных генов химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR.
3.4.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR в клетках Е. coli Ml 5.108,
3.4.3. Выделение и очистка химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR.
3.4.4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR.
3.5. Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в периплазме Е. coli и исследование их иммуногенных и антигенных свойств.
3.5.1. Клонирование гибридных генов химерных белков SigRTAspCBD и SigRTBspCBD.
3.5.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков SigRTAspCBD и SigRTBspCBD в Е. coli Ml 5.
3.5.3. Выделение и очистка химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD.
3.5.4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином"
Актуальность проблемы. Рицин, токсин растительного происхождения из семян клещевины обыкновенной (Ricinus communis) (рис. 1), является одним из наиболее сильнодействующих токсинов [1]. Его содержание в семенах (касторовых бобах) составляет приблизительно 1-5%. С давних лет известно, что употребление всего двух бобов клещевины может оказаться смертельно опасным для человека.
А. Б.
Рис. 1. Клещевина обыкновенная (Ricinus communis): А. Растение с плодами. Б. Высохший плод (коробочка) и семена (касторовые бобы).
Клещевина обыкновенная представляет собой ценную сельскохозяйственную высокомасличную техническую культуру. В касторовых бобах содержится 48-55% касторового масла, которое отличается высоким содержанием трипшцеридов рицинолевой кислоты (80-85%) и используется в промышленности, медицине и косметологии. Побочным продуктом при производстве касторового масла является шрот клещевины, содержащий 37^40% питательного белка и входящий в компоненты кормов для сельскохозяйственных животных и рыб. Однако присутствие рицина в семенах клещевины осложняет производство касторового масла и шрота клещевины [2, 3, 4].
В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие заведующий лабораторией биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН, к.б.н. В.Г. Лунин.
Обычно рицин удаляют из сырья острым паром [1]. Тем не менее, такая обработка не всегда полностью инактивирует токсин, что в дальнейшем может приводить к отравлению человека и сельскохозяйственных животных. Согласно ГОСТ 18102-95 (Масло касторовое медицинское. Технические условия) и ГОСТ 17290-71 (Шрот клещевинный кормовой. Технические условия), реакция.на рицин, в продукции должна отсутствовать.
Ввиду широкого распространения клещевины как сельскохозяйственной5 культуры и простой технологии выделения, рицин является легко доступным токсином. Из-за своей высокой токсичности и доступности он привлекает внимание военных специалистов в области химического оружия, начиная с 1-ой мировой войны. Технология выделения рицина из жмыха семян клещевины не требует сложного оборудования, и поэтому рицин доступен для производства даже в странах со слаборазвитой химической промышленностью. Разработаны эффективные технологии выделения и очистки рицина до кристаллического состояния.
По оценкам экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) летальная доза неочищенного рицина в аэрозольном состоянии находится на уровне ингаляционной дозы паров зарина, а очищенного - меньше чем летальная, доза вещества VX. Ему как поражающему агенту, был присвоен шифр «W» [5]. Летальные дозы токсина зависят от способа его попадания в организм животных и от вида животных. Наиболее опасной формой рицина является' аэрозоль. Минимальная летальная ингаляционная доза рицина для человека может составлять приблизительно 0,005 мг/кг [6, 7].
В 1978 году рицином был убит болгарский телеведущий Георгий Марков. Токсин был введен журналисту в бедро "уколом" зонтика, в котором была спрятана капсула с рицином. Смерть наступила через 3 дня [8]. В 2003 и 2004 годах рицин был обнаружен в Южной Каролине (США) в почтовом отделении, обслуживающем кабинет сенатора Билла Фриста, и внутри письма, адресованного в Белый Дом (США). Рицин был обнаружен на территории США у лиц, имеющих отношение к антиправительственным группировкам и связанных с террористическими организациями [1]. В начале 2003 года британская полиция арестовала группу террористов, часть которых прошла подготовку в Чечне. В подпольной лаборатории они наладили производство рицина, а между тем, один из задержанных работал на военной базе и имел доступ к приготовлению пищи солдат [9]. Очевидно, что растительный токсин рицин представляет серьезнейшую опасность из-за возможности его использования в качестве химического оружия, в частности, в террористических целях. Он может быть применен для отравления^ воздуха в закрытых вентиляционных системах, питьевой воды и запасов-продовольствия.
Рицин - гликопротеин, белковая часть молекулы которого построена из двух субъединиц - каталитической активной А-субъединицы (RTA, Ricinus Toxin А-chain) [10] и лектиновой связывающей В-субъединицы (RTB, Ricinus Toxin Вchain), соединенных одной дисульфидной связью [11]. RTA ответственна за
-f токсические свойства рицина, а RTB за его транспорт внутрь клетки. Благодаря своей токсической активности RTA нашла применение в создании иммунотоксинов (ИТ) - конъюгатов, состоящих из токсина и антитела и обладающих направленным действием, например в противоопухолевой терапии [11], терапии ВИЧ [12], а также для подавления иммунного ответа при трансплантации органов [13].
На сегодняшний день не существует препаратов для профилактики и лечения отравления рицином, в связи с чем, чрезвычайный интерес представляет создание антидотов и вакцин, а также разработка тест-систем для экспресс-индикации рицина в окружающей среде и в организме. Наиболее перспективными представляются антидоты, полученные на основе протективных антител к рицину, а также тест-системы, основанные на иммунохимических методах. Производство подобных антидотов, тест-систем и вакцин требует получения антигенов рицина.
Работа с нативным рицином для получения его антигенов крайне сложна ввиду его высокой токсичности. Следует отметить, что RTA, изолированная от RTB, находясь вне клетки нетоксична из-за неспособности проникать в клетку без RTB [14]. RTB, сама по себе, также нетоксична [15]. Кроме того, известно, что рекомбинантные RTA и RTB сохраняют многие эпитопы нативного рицина, в том числе и протективные [16, 17]. Поэтому перспективным подходом к получению антигенов рицина является создание рекомбинантных RTA и RTB. Для разработки ИТ также возможно использование рекомбинантных RTA, но для этой цели необходимо сохранение токсичности рекомбинантых RTA и снижение их имму ногенности.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение рекомбинантных антигенов RTA и RTB и исследование их иммуногенных и антигенных свойств. Работа выполнялась в рамках комплексного проекта Федерального агентства по науке и инновациям при Министерстве образования и науки РФ по теме: «Разработка технологий, методов и средств обеспечения-системы биологической безопасности и противодействия терроризму» (шифр «БТ
00.2.001») по договору №8-JI/05 от 04.05.2005 (ГК 02.467.11.6002 от 12.04.2005).
В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие основные задачи:
1. Клонирование и экспрессия в Е. coli нуклеотидных последовательностей, кодирующих как аутентичные RTA и RTB, так и их гибриды с белками-носителями;
2. Создание эффективных штаммов-продуцентов Е. coli рекомбинантных белков, содержащих RTA и RTB; I
3. Разработка технологии выделения и очистки рекомбинантных белков, содержащих RTA и RTB;
4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств полученных белков.
Научная новизна. На основе идеологии создания многокомпонентных белков, развиваемой в исследовательских коллективах лабораторий биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН и молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, заведующим которых является к.б.н. В.Г. Лунин, были впервые спланированы и сконструированы рекомбинантные гибридные плазмидные ДНК Е. coli, позволяющие эффективно осуществлять в клетках Е. coli пггамма М15 индуцированный биосинтез химерных белков RTA-DHFR, RTB-DHFR и RTAspCBD, RTBspCBD, содержащих А- и В-субъединицы рицина и белки-носители (дигидрофолат редуктазу - DHFR и целлюлозосвязывающий домен -CBD). Впервые получены штаммы-продуценты данных белков. Разработана высокоэффективная схема выделения, очистки и иммобилизации рекомбинантных белков ЯТАзрСБШ, ЯТВврСВО на целлюлозном сорбенте, основанная на свойствах целлюлозосвязывающего домена и позволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 95%. Впервые получены в препаративных количествах высокоочищенные рекомбинантные белки ЯТА-ОНГЛ, ЯТВ-ОНТЫ и ЯТАврСВВ,
• ЯТВзрСВО, способные индуцировать у кроликов выработку высокого титра специфичных к нативному рицину антител.
Практическое значение работы. Полученные штаммы-продуценты рекомбинантных белков ЯТАэрСВО, ЯТВБрСВО и разработанный метод выделения, очистки и иммобилизации этих белков на целлюлозе, могут найти применение в области промышленной, биотехнологии при создании вакцинных препаратов для предотвращения отравлений рицином, тест-систем индикации рицина на основе иммунохимических методов, а также для получения антидотов к<, рицину на основе протективных антител. Целлюлозосвязывающий домен позволяет получать иммобилизованные препараты ЯТАзрСВО, ЯТВврСВО на целлюлозе. Белки, иммобилизованные на целлюлозном носителе, как показали данные предварительных испытаний, обладают большей стабильностью и существенно большей иммуногенностью по сравнению с раствором нативного белка [18]. Данные белки могут быть использованы для разработки нового поколения иммунологических диагностикумов, в том числе белковых биочипов, основанных на присоединении к подложке из целлюлозы данных рекомбинантных белков, а также для получения сорбентов на основе целлюлозы, для очистки противорициновых антител. В случае сохранения токсичности, связанной- с каталитической активностью ЯТА выщеплять аденин из 288 рРНК г эукариотических клеток, белок ЯТАврСВО может найти применение в качестве компонента ИТ для борьбы со злокачественными опухолями. Белок ЯТВврСВО. может бьггь использован в качестве адъюванта субъединичных генно-инженерных вакцин. 1
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Грачева, Мария Андреевна
выводы
1. Сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гибридные гены химерных белков, состоящих из А- и В-субъединиц рицина и дигидрофолат редуктазы, обеспечивающие эффективную продукцию целевых белков как в водорастворимой форме, так и в форме телец включения в цитоплазме клеток Е. coli.
2. Сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гибридные гены химерных белков, состоящих из А- и В-субъединиц рицина, целлюлозосвязывающего домена и N-концевой сигнальной последовательности, обеспечивающие эффективную продукцию целевых белков в водорастворимой форме в периплазме клеток Е. coli.
3. Разработана технологичная и высокоэффективная методика выделения, очистки и иммобилизации белков, состоящих из субъединиц рицина и целлюлозосвязывающего домена на целлюлозном сорбенте.
4. Изучены иммуногенные и антигенные свойства полученных белков. Показано, что они индуцируют выработку высокого титра специфических к нативному рицину антител.
5. Предложено использование белков с целлюлозосвязывающим доменом, как наиболее технологически и экономически выгодных, для создания тест-систем, вакцин и антидотов.
Благодарности
Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю, акад. РАМН, д.б.н., проф. В.И. Швецу за умелое руководство и помощь в подготовке к защите данной работы. Автор выражает глубокую признательность заведующему лаборатории биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, к.б.н. В.Г. Лунину, идеалогически и экспериментально обосновавшего данную работу, за любезно предоставленную возможность выполнять работу в лаборатории биологически активных наноструктур, за помощь в ее выполнении и ежедневное умелое руководство. Автор выражает глубокую признательность сотрудникам лаборатории биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН: к.б.н. П.В. Попадьину, к.б.н. З.М. Галушкиной, к.б.н. H.H. Полетаевой, к.б.н. JI.B. Верховской, к.б.н. Н.В. Лавровой, а также В.В. Евстифееву за помощь в постановке экспериментов. Автор благодарит научных сотрудников Т.В. Тихонову и к.х.н. О.В. Сергиенко из лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН за участие в создании плазмиды pspCBD. Автор благодарит научных сотрудников лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН: к.х.н. О.В. Сергиенко, к.б.н. О.Л. Воронину, О.С. Колобову, Е.М. Рязанову, Д.В. Гришина, A.C. Семихина и всех остальных сотрудников за ценные рекомендации и советы, за неизменную доброжелательность, дружеское участие и поддержку при выполнении работы.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Грачева, Мария Андреевна, Москва
1. Audi J., Belson M., Patel M., Schier J., Osterloh J. Ricin poisoning: a comprehensive review.// JAMA. -2005.-V. 294. -N. 18.-P. 2342-2351.
2. Уланова P. Получение пищевой добавки из шрота клещевины. // Комбикорма. -2003.-№5.-С. 29.
3. Кормовые отравления сельскохозяйственных животных: Учебное пособие. 1-е изд. / Лимаренко А.А., Бажов Г.М., Бараников А.И. Санкт-Петербург: Лань, 2007. -С. 276-278.
4. Кононенко С.И. Повышение протеиновой питательности рационов растущих и откармливаемых свиней // Свиноферма. — 2007. -№3.-С. 14-16.
5. Антонов Н.С. Химическое оружие на рубеже двух столетий. М: Прогресс, 1994.-С. 108-111.
6. Doan L.G. Ricin: Mechanism of toxity, clinical manifestations, and vaccine development. // J. Toxicol. Clin. Toxicol. 2004. - V. 42. -N. 2. - P. 201-208.
7. Bradbeiry S.M., Dickers K.J., Rice P., Griffiths G.D., Vale J.A. Ricin poisoning. // Toxicol. Rev. 2003. - V. 22. -N. 1. - P. 65-70.
8. Crompton R., Gall D. Georgi Markov death in a pellet. // Med. Leg. J. - 1980. - V. 48.-N. 2.-P. 51-62.
9. Москалев E.B. Рицин в руках террористов и врачей. // Химия и жизнь XXI век. -2003. -№3,- С. 18-20.
10. Endo Y., Tsurugi К. RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. Mechanism of action of the toxic lectin ricin on eukaryotic ribosomes. // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262.-N. 17.-P. 8128-8130.
11. Olsnes S., Kozlov J.V. Ricin. // Toxicon. 2001 - V. 39. - N. 11. - P. 1723-1728.
12. Pincus S.H. Therapeutic potential of anti-HIV immunotoxins. // Antiviral Res. — 1996.-V. 33.-N. l.-P. 1-9.
13. О'Наге М., Roberts L.M., Thorpe Р.Е., Watson G.J., Prior В., Lord J.M. Expression of ricin A chain in Escherichia coli. IIFEBS Lett. 1987. - V. 216. - N. 1. - P. 73-78.
14. Roberts L.M., Lord J.M. Ribosome-inactivating proteins: entry into mammalian cells and intracellular routing. // Mini Rev. Med. Chem. 2004. - V. 4. - N. 5. - P. 505-512.
15. McGuinness C.R., Mantis N.J. Characterization of a novel high-affinity monoclonal immunoglobulin G antibody against the ricin В subunit. // Infect. Immun. 2006. - V. 74.-N. 6.-P. 3463-3470.
16. Волков И.Ю., Лунина H.A., Великодворская Г.А. Перспективы практического применения субстратсвязывающих модулей гликозолгидролаз // Прикладн. биох. мик. 2004. - Т.40. - № 5. - С. 499-504.
17. Stirpe F., Battelli M.G. Ribosome-inactivating proteins: progress and problems. // Cell Mol. Life Sci. 2006. - V. 63. -N.16. - P. 1850-1866.
18. Sweeney E.C., Tonevitsky A.G., Temiakov D.E., Agapov I.I., Saward S., Palmer R.A. Preliminary crystallographic characterization of ricin agglutinin. // Proteins. — 1997.-V. 28.-P. 586-589.
19. Olsnes S., Stirpe F., Sandvig K., Pihl A. Isolation and characterization of viscumin, a toxic lectin from Viscum album L. (mistletoe). // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. - P. 13263-13270.
20. Sweeney E.C., Tonevitsky A.G., Temiakov D.E., Agapov I.I., Saward S., Palmer R.A. Preliminary crystallographic characterization of ricin agglutinin. // Proteins. — 1997. V. 28. - P. 586-589.
21. Козлов Ю.В., Сударкина О.Ю., Курманова А. Г. Рибосом-инактивирующие лектины растений. // Мол. биол. 2006. - Т. 40. - № 4. - С. 711-723.
22. Montfort W., ViUafranca J.E., Monzingo A.F., Ernst S.R., Katzin В., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R., Robertus J.D. The three-dimensional structure of ricin at 2.8 A. // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262. - P. 5398-5403.
23. Rutenber E., Katzin В J., Ernst S., Collins E .J., Mlsna D., Ready M.P., Robertus J.D. Crystallographic refinement of ricin to 2.5 A. // Proteins. 1991. - V. 10. - N. 3. - P. 240-250.
24. Olsnes S., Pappenheimer A.M., Meren R. Lectins from Abrus precatorius and Ricinus communis. II. Hybrid toxins and their interaction with chain-specific antibodies. // J. Immunol. 1974. - V. 113. -N. 3. - P. 842-847.
25. Сокурова A.M. Особенности строения и фармакокинетика рицина. // Психофамакол. биол, наркол. 2007. - Т. 7. -№ 1. -С. 1484-1487.
26. Попова Е.Н. Взаимодействие рицина с клетками гибридом, секретирующих антитела против его каталитической субъединицы: Дис. . канд. биол. наук. М., 2004. -160 с.
27. Брандг Н.Н., Чикишев А.Ю., Сотников А.И. Савочкина Ю.А., Агапов И.И., Тоневицкий А.Г. Кирпичников М.П. Конформационные различия рицина и агглютинина рицина в растворе и кристалле. // Докл. АН 2001. - Т. 376. - № 5. -С.687-689.
28. Lewis M.S, Youle RJ. Ricin subunit association. Thermodynamics and the role of the disulfide bond in toxicity. // J. Biol. Chem. 1986. - Vol 261. - N. 25. P. 11571-11577.
29. Olsnes S., Pihl A. Different biological properties of the two constituent peptide chainse of ricin, a toxic protein inhibiting protein synthesis. // Biochemistry. 1973. - V. 12.-P. 3121-3126.
30. Katzin B.J., Collins E.J., Robertus J.D. Structure of ricin A-chain at 2.5 A. // Proteins.-1991.-V. 10.-P. 251-259.
31. Robertus J. D., Monzingo A. F. The structure of ribosome-inactivating proteins. // Mini Rev. Med. Chem. 2004. - V. 4. - P. 477-486.
32. Endo Y., Mitsui K., Motizuki M., Tsutugi K. The mechanism of action of ricin and related toxins on eukaryoutic ribosomes.// J. Biol. Chem. 1987. - V. 262. - P. 81288130.
33. Rutenber E., Robertus J.D. Structure of ricin B-chain at 2.5 A resolution. // Proteins. -1991. -V. 10.-P. 260-269.
34. Murzin A.G., Lesk A.M:, Chothia C. ^-Trefoil fold. Patterns of structure and sequence in the Kunitz inhibitors interlieukins-1 P and la and fibroblast growth factors. // J. Mol. Biol. 1992. --V. 223. - P. 531-543.
35. Sphyris N., Lord J.M., Wales R., Roberts L.M. Mutational analysis of the Ricinus lectin B-chains. Galactose-binding ability of the 2 gamma subdomain of Ricinus communis agglutinin B-chain.// J. Biol. Chem. 1995. - V. 27. - N. 35. - P. 20292202937.
36. Wales R., Richardson P.T., Roberts L.M:, Woodland H.R., Lord J.M. Mutational: analysis of the galactose binding ability of recombinant ricin B chain. // J. Biol.Chem: -1991.-V. 266. -N; 29.-P. 19172-19179:
37. Tregear J.W, Roberts L.M. The lectin gene family of Ricinus communis: cloning of a functional ricin gene and three lectin pseudogenes. // Plant Mol. Biol. 1992. - V. 18: -N. 3.-P. 515-525.
38. Lord J.M., Roberts L.M:, Robertus J.D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. // FASEB; J. 1994. - V. 8. - N. 2. - P. 201-208:
39. Youle R.J., Huang A.H. Protein bodies from the endosperm of castor bean: subfractionation, protein components, lectins, and changes during germination. // Plant Physiol. 1976. -V. 58: -N. 6. - P. 703-709.
40. Lamb F.I., Roberts L.M:, Lord J.M: Nucleotide sequence of cloned cDNA coding for preproricin. // Eur. J. Biochem. 1985. - V. 148. - N. 2. - P. 265-270.
41. Ferrini J.BI, Martin M:, Taupiac M.P., Beaumelle B. Expression of functional ricin B chain using the baculovirus system; // Eur. J. Biochem. 1995. - V. 233. - N. 3. - P. 772-773.
42. Lord J.M. Synthesis and intracellular transport of lectin and storage protein precursors in endosperm from castor bean. // Eur. J. Biochem: 1985. -V. 146: -N. 2. — P. 403-409.
43. Lord J.M. Precursors of ricin and Ricinns communis agglutinin. Glycosylation and processing during synthesis and intracellular transport. // Eur. J. Biochem. 1985. - V. 146.-N. 2.-P.411-416.
44. Kimura Y., Hase S., Kobayashi.Y., Kyogoku Y., Ikenaka Т., Funatsu G. Structures of sugar chains of ricin B. // J. Biochem.- 1988.- V. 103.-N. 6. P. 944-949.
45. Harley S.M., Beevers H. Ricin inhibition of in vitro protein synthesis by plant ribosomes. // Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. -N. 19. - P. 5935-5938.
46. Richardson P.T., Westby M., Roberts L.M., Gould J.H., Colman A., Lord J.M; Recombinant proricin binds galactose but does not depurinate 28S ribosomal RNA. // FEBS lett. -1989. V 255. - P. 15-20.
47. Frigerio L., Vitale A., Lord J.M., Ceriotti A., Roberts L.M. Free ricin A chain, proricin, and native toxin have different cellular fates when expressed in tobacco protoplasts. //J. BioL Chem. 1998. - V. 273. -N. 23. -P. 14194^14199^
48. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. Ribosome-inactivating proteins from plants. // Biochim. Biophys Acta. 1993.- V, 1154:-N. 3-4.-P. 237-82: •
49. Lord J.M., Roberts L.M. Toxin entry: retrograde transport throught the secretory pathways. // J. Cell Biol. 1998. - V. 140. - N. 4. - P. 733-736.
50. Челнокова О.В. Конформационные изменения растительных токсинов в ходе внутриклеточного транспорта: Дис. канд. биол. наук. М., 2004. - 122 с.
51. Rodal S.K., Skretting G., Garred О., Vilhardt F., van Deurs В., Sandvig K. Extraction of cholesterol with methyl-beta-cyclodextrin perturbs formation of clathrin-coated endocytic vesicles. //Mol. Biol. Cell:- 1999:-V: 10.-N. 4.-P. 961-974.
52. Simpson J.C., Smith D.C., Roberts L.M., Lord J.M. Expression of mutant dynamin protects cells against diphtheria toxin but not against ricin. // Exp. Cell. Res. 1998. - V. 239.-N. 2.-P. 293-300.
53. Мойсенович M.M., Демина И.А., Агапов И.И. Рицин и вискумин связываются с разными участками клеточной мембраны. // ДАН. 2001. - Т. 379. - № 3. - С. 406410.
54. Cosson P., Letourneur F. Coatomer (COPI)-coated vesicles: role in intracellular transport and protein sorting. // Curr. Opin. Cell Biol. 1997. - V 9. - N. 4. - P. 484487.
55. Munro S., Pelham H.R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. // Cell. 1987. - V. 48. - N. 5. - P. 899-907.
56. Wesche J., Rapak A., Olsnes S. Dependence of ricin toxicity on translocation of the toxin A-chain from the endoplasmic reticulum to the cytosol. // J. Biol. Chem. 1999. -V. 274. - N. 48. - P. 34443-34449.
57. Day P J., Owens S.R., Wesche J., Olsnes S., Roberts L.M., Lord J.M. An interaction between ricin and calreticulin that may have implications for toxin trafficking. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - N. 10. - P. 7202-7208.
58. Johnson. A.E., van Waes M.A. The translocon: a dynamic gateway at the ER membrane. // Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 1999. - V. 15. - P. 799-842.
59. Ellgaard L., Molinari M., Helenius A. Setting the standards: quality control in the secretory pathway. // Science. 1999. - V. 286. -N. 5446. - P. 1882-1888.
60. Simpson J.C., Roberts L.M., Römisch К., Davey J., Wolf D.H., Lord J.M. Ricin A chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. // FEBS Lett. 1999. - V. 459. - N. 1. - P. 80-84.
61. Тоневицкий А.Г., Мириманова H.B., Бушуева Т.JI. Структурные и функциональные особенности термически обработанной связывающей субъединицы растительного токсина рицина. //Мол. биол. -1991.-Т. 25. -Вып. 2. -С. 451-461.
62. Spooner R.A., Watson P.D., Marsden C.J., Smith D.C., Moore K.A., Cook J.P., Lord J.M., Roberts L.M. Protein disulphide-isomerase reduces ricin to its A and В chains in the endoplasmic reticulum. // Biochem. J. 2004. - V. 383. - P. 285-293.
63. Day P.J., Pinheiro T.J., Roberts L.M., Lord J.M. Binding of ricin A-chain to negatively charged phospholipid vesicles leads to protein structural changes and destabilizes the lipid bilayer. // Biochemistry. 2002. - V. 41. - N. 8. - P. 2836-2843.
64. Argent R.H., Parrott A.M., Day P.J., Roberts L.M., Stockley P.G., Lord J.M., Radford S.E. Ribosome-mediated folding of partially unfolded ricin A-chain. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. -N. 13. - P. 9263-9269.
65. Попова E.H. Взаимодействие рицина с клетками гибридом, секретирующих антитела против его каталитической субъединицы: Дис. . канд. биол. наук. М., 2004.-160 с.
66. Ogasawara T., Sawasaki T., Morishita R, Ozawa A., Madin K., Endo Y. A new class of enzyme acting on damaged ribosomes: ribosomal RNA apurinic site specific lyase found in wheat germ. // EMBO J. 1999. - V. 18. - N. 22. - P. 6522-6531.
67. Robertus J. D., Monzingo A. F. The structure of ribosome-inactivating proteins. // Mini Rev. Med. Chem. 2004. - V. 4. - P. 477^86.
68. Olsnes S., Fernandez-Puentes C., Carrasco L., Vazquez D. Ribosome inactivation by the toxic lectins abrin and ricin. Kinetics of the enzymic activity of the toxin A-chains. // Eur. J. Biochem. 1975.- V. 60. - P. 281-288.
69. Eiklid K., Olsnes S., Pihl A. Entry of lethal doses of abrin, ricin and modeccin into the cytosol ofHeLa cells. // Exp. Cell Res. 1980. - V. 12. -N. 2. - P. 321-326.
70. Hartley M.R, Legname G., Osborn R., Chen Z., Lord J.M. Single-chain ribosometinactivating proteins from plants depurinate Escherichia coli 23 S ribosomal RNA. // FEBS Lett. 1991. -V. 290. - P. 65-68.
71. Moazed D., Robertson J.M., Noller H.F. Interaction of elongation factors EF-G and EF-Tu with a conserved loop in 23S RNA. // Nature. 1988. - V. 334. - P. 362-364.
72. Glück A., Endo Y., Wool I.G. Ribosomal RNA identity elements for ricin A-chain recognition and catalysis. Analysis with tetraloop mutants. // J. Mol. Biol. 1992 - V. 226. - N. 2. - P. 411-424.
73. Glück A., Endo Y., Wool I.G. The ribosomal RNA identity elements for ricin and for alpha-sarcin: mutations in the putative CG pair that closes a GAGA tetraloop. // Nucleic Acids Res. 1994. -V. 22. -N. 3. - P. 321-324.
74. Endo Y., Glück A., Wool I.G. Ribosomal RNA identity elements for ricin A-chain recognition and catalysis. // J. Mol. Biol. 1991. - V. 221. - N. 1. - P. 193-207.
75. Larsson S.L., Sloma M.S., Nygard O. Conformational changes in" the structure of domains II and V of 28S rRNA in ribosomes treated with the translational inhibitors ricin or alpha-sarcin. // Biochim. Biophys. Acta. 200. - V. 1577. - P. 53-62.
76. Osborn R.W., Hartley M.R. Dual effects of ricin A chain on protein synthesis in rabbit reticulocyte lysate. Inhibition of initiation and translocation. // Eur. J. Biochem. -1990.-V. 193.-P. 401-407.
77. Correll C.C., Munishkin A., Chan Y.L., Ren Z., Wool I.G., Steitz T.A. Crystal structure of the ribosomal RNA domain essential for binding elongation factors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. N. 23. - P. 13436-13441.
78. Correll C.C., Wool I.G., Munishkin A. The two faces of the Escherichia coli 23 S rRNA sarcin/ricin domain: the structure at 1.11 A resolution. // J Mol Biol. 1999. — V. 292.-N. 2.-P. 275-87.
79. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P.B., Steitz T.A. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. // Science. 2000. - V. 289. - N. 5481.-P. 905-920.
80. Endo Y., Tsurugi K. The RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. The characteristics of the enzymatic activity of ricin A-chain with ribosomes and with rRNA*. // J Biol Chem. 1988. - V. 263. -N. 18. P. 8735-8739.
81. Nicolas E., Beggs J.M., Taraschi T.F. Gelonin is an unusual DNA glycosylase that removes adenine from single-stranded DNA, normal base pairs and mismatches. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - N. 40. - P. 31399-31406.
82. Roncuzzi L., Gasperi-Campani A. DNA-nuclease activity of the single-chain ribosome-inactivating proteins dianthin 30, saporin 6 and gelonin. // FEBS Lett. 1996. -V. 392.-N. l.-P. 16-20.
83. Rajamohan F., Venkatachalam Т.К., Irvin J.D., Uckun F.M. Pokeweed antiviral protein isoforms PAP-I, РАР-П, and PAP-III depurinate RNA of human immunodeficiency virus (HIV)-1. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - V. 260. -N.2.-P. 453—458.
84. Щелкунов C.H. Противовирусные вакцины: от Дженнера до наших дней. // Сорос, образ, жур. Биол. 1998. - №7. - С. 43-50.
85. Chanh Т.С., Romanowski M.J., Hewetson J.F. Monoclonal antibody prophylaxis against the in vivo toxicity of ricin in mice. // Immunol. Invest. 1993. - V. 22. - N. 1. — P. 63-72.
86. Hewetson J.F., Rivera V.R., Creasia D.A., Lemley P.V., Rippy M.K., Poli M.A. Protection of mice from inhaled ricin by vaccination with ricin or by passive treatment with heterologous antibody. // Vaccine. 1993. - V. 11. - P. 743-746.
87. Foxwell B.M., Detre S.I., Donovan T.A., Thorpe P.E. The use of anti-ricin antibodies to protect mice intoxicated with ricin. // Toxicology. 1985. - V. 34. - N. 1. - P. 79-88:
88. Griffiths G.Di, Lindsay C.D., Allenby A.C., Bailey S.C., Scawin J.W., Rice P., Upshall D.G. Protection against inhalation toxicity of ricin and abrin by immunisation. // Hum. Exp Toxicol. 1995. -V. 14. -N. 2. - P. 155-164.
89. GodaltA., Fodstad O., Pihl A. Antibody formation against the cytotoxic proteins abrin and ricin in humans and mice. // Int. J. Cancer. 1983. - V. 32. — N. 4. - P. 515521.
90. Houston L.L. Protection of mice from ricin poisoning by treatment with antibodies directed against ricin. // J. Toxicol. Clin. Toxicol. 1982. - V. 19. - N. 4. - P. 385-389.
91. Lemley P.V., Amanatides P., Wright D.C. Identification and characterization of amonoclonal antibody that neutralizes ricin toxicity in vitro and in vivo. // Hybridoma. i1994.-V. 13.-N.5.-P.41-7-421. .
92. Hewetson J.F., Rivera* V.R., Creasia D.A., Lemley P.V., Rippy M:K., Poli M.A. Protection of mice from inhaled ricin by vaccination with ricin or by passive treatment with heterologous antibody. // Vaccine. 1993. - V. 11. - P. 743-746.
93. Kende M., Yan C., Hewetson J., Frick M.A., Rill W.L., Tammariello R. Oral immunization of mice with ricin toxoid vaccine encapsulated in polymeric microspheres against aerosol challenge. // Vaccine. 2002. - V. 20. - N. 11-12. - P. 1681-1691.
94. Thrush G.R., Lark L.R., Clinchy B.C., Vitetta E.S. Immunotoxins: an update. // Ann. Rev. Immunol. 1996. - V. 14. - P. 49-71.
95. Lebeda F.J., Olson M.A. Prediction of a conserved, neutralizing epitope in ribosome-inactivating proteins. // Int. J. Biol. Macromol. 1999. - V. 24. - N. 1. - P. 1926. ,
96. Maddaloni M., Cooke C., Wilkinson R., Stout A.V., Eng L., Pincus S.H. Immunological characteristics associated withsthe protective efficacy of antibodies to ricin. // J. Immunol. -2004. -V. 172. -N. 10. P. 6221-6228.
97. Mantis N.J., McGuinness C.R., Sonuyi O., Edwards G., Farrant S.A. Immunoglobulin A antibodies against ricin A and В subunits protect epithelial cells from ricin intoxication. //Infect. Immun. -2006. V. 74. -N. 6. - P. 3455-3462.
98. McGuinness C.R., Mantis NJ. Characterization of a novel high-affinity monoclonal immunoglobulin G antibody against the ricin В subunit. // Infect. Immun. 2006. - V. 74.-N. 6. -P. 3463-3470.
99. Тоневицкий А.Г., Топтыгин А.Ю., Агапов И.И., Рахманова В.А., Шамшиев А.Т., Алексеев Ю.О., Пфюллер У., Франкел А. Получение биологически активной рекомбинантной В-субъединицы рицина. // Мол. биол. 1995. — Т. 29. - № 2. - С. 398-406.
100. Bigalke Н., Rummel A. Medical aspects of toxin weapons. // Toxicology. 2005. -V. 214.-P. 210-220.
101. Challoner K.R., McCarron M.M. Castor bean intoxication. // Ann. Emerg. Med. -1990.-V. 19.-N. 10.-P. 1177-1183.
102. Fodstad О., Olsnes S., Pihl A. Toxicity, distribution and elimination of the cancerostatic lectins abrin and ricin after parenteral injection into mice. // Br. J. Cancer. -1976. V. 34. - N. 4. - P. 418-425.
103. Fodstad O., Johannessen J.V., Schjerven L., Pihl A. Toxicity of abrin and ricin in mice and dogs. // J. Toxicol. Environ. Health. 1979. - V. 5. -N. 6. - P. 1073-1084.
104. Верескунов A.M. Фармакологическая и токсикологическая характеристика действия рицина: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Санкт-Петербург, 2005. 24 с.
105. Roy С.J., Hale М., Hartings J.M., Pitt L., Duniho S. Impact of inhalation exposure modality and particle size on the respiratory deposition of ricin in BALB/c mice. // Inhal. Toxicol. -2003. -V. 15. -N. 6. -P: 619-638.
106. Burnett J.C., Henchal E.A., Schmaljohn A.L., Bavari S. The evolving field of biodefence: therapeutic developments and diagnostics. // Nat. Rev. Drug Discov. — 2005. -V. 4. N. 4. - P. 281-97.
107. Pappenheimer A.M.J., Uchida Т., Harper A.A. An immunological study of the diphtheria toxin molecule. // Immunochemistry. 1972. - V. 9. -N. 9. P. 891-906.
108. Yamaizumi M., Uchida Т., Okada Y., Furusawa M. Neutralization of diphtheria toxin in living cells by microinjection of antifiragment A contained within resealed erythrocyte ghosts. // Cell. 1978. - V. 13. - N. 2. P. 227-232.
109. Zucker D.R., Murphy J.R. Monoclonal antibody analysis of diphtheria toxin-I. Localization of epitopes and neutralization of cytotoxicity. // Mol. Immunol. 1984. - V. 21.-N. 9.-P. 785-793.
110. Lemley P.V., Wright D.C. Mice are actively immunized after passive monoclonal antibody prophylaxis and ricin toxin challenge. // Immunology. 1992. — V. 76. - N. 3. — P. 511-513.
111. Dertzbaugh M.T., Rossi C.A., Paddle B.M., Hale M., Poretski M., Alderton M.R. Monoclonal antibodies to ricin: in vitro inhibition of toxicity and utility as diagnostic reagents. // Hybridoma (Larchmt). 2005. - V. 24. -N. 5. - P. 236-243.
112. Guo J.W., Shen B.F., Feng J.N., Sun Y.X., Yu M., Hu M.R. A novel neutralizing monoclonal antibody against cell-binding polypeptide of ricin. // Hybridoma (Larchmt). — 2005. V. 24. - N. 5. P. 263-266.
113. Poli M.A., Rivera V.R., Pitt M.L., Vogel P. Aerosolized specific antibody protects mice from lung injury associated with aerosolized ricin exposure. // Toxicon. 1996. —
114. V. 34. -N. 9. -N. 1037-1044.
115. Vogel P., Rivera V.R., Pitt M.L., Poll M.A. Comparison of the pulmonary distribution and efficacy of antibodies given to mice by intratracheal instillation or aerosol inhalation. //Lab. Anim. Sci. 1996 . - V. 46. -N. 5. -N. 516-523.
116. Rainey G.J., Young J.A. Antitoxins: novel strategies to target agents of bioterrorism. // Nat. Rev. Microbiol. 2004. - V. 2. - N. 9. - P. 721-726.
117. Griffiths G.D., Phillips G.J., Bailey S.C. Comparison of the quality of protection elicited by toxoid and peptide liposomal vaccine formulations against ricin as assessed by markers of inflammation. // Vaccine. 1999. - V. 17. - P. 2562-2568.
118. Marsden C.J., Smith D.C., Roberts L.M., Lord J.M. Ricin: current understanding and prospects for an antiricin vaccine. // Expert. Rev. Vaccines. 2005. - V. 4. - N. 2. -P. 229-37.
119. Piatak M., Lane J.A., Laird W., Bjorn M.J., Wang A., Williams M. Expression of soluble and fully functional ricin A chain in Escherichia coli is temperature-sensitive. // J. Biol. Chem. 1988. -V. 263. -N. 10. - P. 4837-4843.
120. Griffiths G.D., Bailey S.C., Hambrook J.L., Keyte M.P. Local and systemic responses against ricin toxin promoted by toxoid or peptide vaccines alone or in liposomal formulations. // Vaccine. 1998. - V. 16. - N. 5. - P. 530-535.
121. Yoder J.M., Aslam R.U., Mantis NJ. Evidence for widespread epithelial damage and coincident production of monocyte chemotactic protein 1 in a murine model of intestinal ricin intoxication. // Infect. Immun. 2007. - V. 75. - N. 4. - P. 1745-1750.
122. Mantis NJ. Vaccines against the category B toxins, staphylococcal enterotoxin B, epsilon toxin and ricin. // Adv. drug deliv. rev. 2005. - V. 57. - P. 1424-1439.
123. Ready M.P., Kim Y., Robertus J.D. Site-directed mutagenesis of ricin A-chain and implications for the mechanism of action. // Proteins. 1991. - V. 10. - N. 3. - P. 270278.
124. Roberts L.M., Tregear J.W, Lord J.M. Molecular cloning of ricin. // Targeted Diagn. Ther. 1992. - V. 7. - P. 81-97.
125. Smallshaw J.E., Firan A., Fulmer J.R., Ruback S.L., Ghetie V., Vitetta E.S. A novel recombinant vaccine which protects mice against ricin intoxication. // Vaccine. 2002. -V. 20. -N. 27-28. - P. 3422-3427.
126. Monzingo A.F., Robertus J.D. X-ray analysis of substrate analogs in the ricin A-chain active site. // J. Mo.l Biol. 1992. - V. 227. - N. 4. - P. 1136-1145.
127. Kim Y., Mlsna D., Monzingo A.F., Ready M.P., Frankel A., Robertus J.D. Structure of a ricin mutant showing rescue of activity by a noncatalytic residue. // Biochemistry. -1992.-V. 31.-N. 12.-P. 3294-3296.
128. Day P.J., Pinheiro T.J., Roberts L.M., Lord J.M. Binding of ricin A-chain to negatively charged phospholipid vesicles leads to protein structural changes and destabilizes the lipid bilayer. // Biochemistry. 2002. - V. 41. - N. 8. - P. 2836-2843.
129. Schlossman D., Withers D., Welsh P., Alexander A., Robertus J., Frankel A. Role of glutamic acid 177 of the ricin toxin A chain in enzymatic inactivation of ribosomes. // Mol. Cell. Biol. 1989. -V. 9. -N. 11. - P. 5012-5021.
130. Olson M.A., Carra J.H., Roxas-Dunkan V., Wannemacher R.W., Smith L.A., Millard C.B. Finding a new vaccine in the ricin protein fold. // Protein Eng. Des. Sel. — V. 4.-P. 391-397.
131. Chaddock J.A., Roberts L.M. Mutagenesis and kinetic analysis of the active site Glul77 of ricin A-chain. // Protein Eng. 1993. - V. 6. - N. 4. - P. 425-431.
132. Marsden C.J., Knight S„ Smith D.C., Day P.J., Roberts L.M., Phillips G.J., Lord J.M. Insertional mutagenesis of ricin A chain: a novel route to an anti-ricin vaccine. // Vaccine. 2004. - V. 22. - N. 21-22. - P. 2800-2805.
133. McHugh C.A., Tammariello R.F., Millard C.B., Carra J.H. Improved stability of a protein vaccine through elimination of a partially unfolded state. // Protein Sci. 2004. -V. 13.-N. 10.-P. 2736-2743.
134. Smallshaw J.E., Richardson J.A., Pincus S., Schindler J., Vitetta E.S. Preclinical toxicity and efficacy testing of RiVax, a recombinant protein vaccine against ricin. // Vaccine. -2005. -V. 23. -N. 39. P. 4775^784.
135. Vitetta E.S., Smallshaw J.E., Coleman E., Jafri H., Foster C., Munford R., Schindler J. A pilot clinical trial of a recombinant ricin vaccine in normal humans. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2006. -V. 103. -N. 7. P. 2268-2273.
136. Smallshaw J.E., Richardson J.A., Vitetta E.S. RiVax, a recombinant ricin subunit vaccine, protects mice against ricin delivered by gavage or aerosol. // Vaccine. — 2007. — V. 25. -N. 42. P. 7459-7469.
137. Измерение концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны: Сб. метод, указаний МУК 4.1.100-96-МУК 4.1.197-96. / Официальное издание, М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. Вып. 29. — 429 с.
138. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000. - С. 527г536.
139. Griffiths G.D., Newman H.V., Gee D.J. Immunocytochemical detection of ricin. П. Further studies using the immunoperoxidase method. // Histochem. J. 1986. — V. 18. -N. 4.-P. 189-195.
140. Leith A.G., Griffiths G.D., Green M.A. Quantification of ricin toxin using a highly sensitive avidin/biotin enzyme-linked immunosorbent assay. // J. Forensic Sci. Soc -1988 V. 28 - N. 4 - P. 227-236.
141. Shyu R.H., Shyu H.F., Liu H.W., Tang S.S. Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of ricin. // Toxicon. 2002 . — V. 40. — N. 3. -P. 255-258.
142. Market profile: handheld assays for biodefense. // Instrument Business Outlook. -2006. http://www.allbusiness.eom/instrument-business-outlook/l 176843-1 .html
143. Fulton R.E., Thompson H.G. Fluorogenic hand-held immunoassay for the identification of ricin: rapid analyte measurement platform. // J. Immunoassay Immunochem. 2007. - V. 28. - N. 3. - P. 227-241.
144. Cloneya L.P., Spiller L.J., Fong W.K., Harris J.E., Harris P.C. RAMP®: High accuracy from immunochromatographic assays by the use of internal control ratios. // Clinical Chemistry. 2003. - V. 49. - P. 1775-1777.
145. McCoig C., Van Dyke G., Chou C.S., Picker L.J., Ramilo O., Vitetta E.S. An anti-CD45RO immunotoxin eliminates T cells latently infected with HTV-1 in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - N. 20. - P. 11482-11485.
146. Kreitman RJ. Immunotoxins in cancer therapy. // Curr. Opin. Immunol. 1999. -11.-N.5.-P. 570-578.
147. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman RJ., Leppla S.H. Immunotoxin therapy of hematologic malignancies. // Semin. Oncol. 2003. - V. 30. - N. 4. - P. 545557.
148. Frankel A.E., Kreitman R J. CLL immunotoxins. // Leuk. Res. 2005. - V. 29. - N. 9. -P. 985-986.
149. Jain R.K. Delivery of* molecular and cellular, medicine to solid tumors. // Microcirculation. 1997. - V. 4'. - N. 1. - P. 1-23.
150. Тоневицкий A.F., Демина И.А., Агапов И.И. Цитотоксическая активность конъюгатов человеческого трансферрина и А-субъединиц растительных токсинов in vivo и in vitro. II ДАН. 2000. - Т. 374. - № 4: - С. 557-560.
151. Winter G., Harris W.J. Humanized antibodies'. // Immunol. Today. 1993. — V. 14'. -N. 6:-P. 243-246.
152. Laske D.W., Youle R.J., Oldfield E.H. Tumor regression with regional distribution of the targeted toxin TF-CRM107 in patients witbmalignant brain tumors. // Nat. Med. -1997. -V. 3. -N. 12.-P: 1362-1368.
153. Engert- A., Sausville E.A., Vitetta E. The emerging role of ricin A-chain immunotoxins in leukemia and lymphoma. // Curr. Top. Microbiol: Immunol. 1998. — V. 234:-P. 13-33.
154. Zhan J., Chen Y., Wang K., Zheng S. Expression of ricin A chain and ricin A chain-KDEL in Escherichia coli. II Protein Expr. Purif. 2004. - V. 34. - N. 2. - P. 197-201.
155. Choi N.W., Estes M.K., Langridge W.H: Ricin toxin B1 subunit enhancement of rotavirus NSP4'immunogenicity in mice. // Viral Immunol. — 2006. V. 19. - N. Г. - P. 54-63.
156. Beaumelle В., Taupiac M.P., Lord J.M., Roberts L.M. Ricin A chain can transport unfolded«dihydrofolate reductase into the cytosol. // J. Biol. Chem. 1997. —V. 272. — N. 35.-P. 22097-22102.
157. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 60. -N.5.-P. 523-533.
158. Глик Б., Пастернак Д. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. -М.: Мир, 2002.-589 с.
159. Scheich С., Sievert V., Bussow К. An automated method for high-throughput protein- purification applied to« a comparison' of His-tag and GST-tag affinity-chromatography. // BMC Biotechnol; 2003. - V. 3. - N. 1. - P. 12.
160. Hochuli E., Dobeli H., Schacher A. New metal chelate adsorbent selective for, proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. // J. Chromatogr. -1987.-V. 411.-P. 177-184.
161. Blanar M.A., Rutter W.J. Interaction cloning: identification of a helix-loop-helix zipper protein that interacts with c-Fos. // Science. 1992. - V. 256. - N. 5059. - P. 1014—1018.
162. Schmidt T.G.M., Koepke J., Frank R., Skerra A. Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin. // J. Mol. Biol. 1996. — V. 255.-P. 753-766.
163. Keefe A.D., Wilson D.S., Seelig Br, Szostak J.W. One-step purification of recombinant proteins using a nanomolar-affinity streptavidin-binding peptide, the SBP-Tag. // Protein Expr. Purif. 2001. - V. 23. - P. 440-446.
164. Evan G.I., Lewis G.K., Ramsay G., Bishop J.M. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product. // Mol. Cell: Biol. 1985. - V. 5. - P. 3610-3616.
165. Karpeisky M.Y., Senchenko V.N., Dianova.M.V., Kanevsky V. Formation and properties ofiS-protein complex with S-peptidecontaining fusion protein. // FEBS Lett. — 1994. V. 339. - P. 209-212.
166. McCormick M., Berg J. Purification and S-Tag detection'of CBD fusion proteins. // Innovations. 1997. - V. 7. -P: 12-15.
167. Zheng C.-F., Simcox T., XuL., Vaillancourt P. A new. expression vector for high level protein production,1 one step purification and direct isotopic labeling of calmodulin-binding peptide fusion proteins. // Gene. 1997. -V. 186. - P. 55-60:
168. Stofko-Hahn R.E., Carr D.W., Scott J.D. A single step purification for recombinant proteins. // FEBS Lett. 1992. - V. 302. - P. 274-278«
169. Xu Z., Bae W., Mulchandani A., Mehra R.Kt, Chen W. Heavy metal removal by novel CBD-EC20 sorbents immobilized on cellulose: //Biomacromolecules. -2002 . — V.3.-N.3.-P. 462-465.
170. Nock S, Spudich JA, Wagner P. Reversible, site-specific immobilization of polyarginine-tagged fusion proteins on mica surfaces. // FEBS Lett. 1997. -V. 414. — N. 2.-P. 233-238.
171. The QIAexpressionist. A handbook for high-level expressionist and purification of 6xHis-tagged proteins. QIAGEN: -2003. 128 p.
172. Hopp T.P:, Pricket K.S., Price V.L., Libbi R.T., March C.J., Ceretti D.P., Urdal D.L., Conlon P.J. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. // Biotechnology. 1988. - V. 6. - P. 1204-1210. \
173. Einhauer A., Schuster M., Wasserbauer E., Jungbauer A. Expression and purification of homogenous proteins in Saccharomyces cerevisiae based on ubiquitin-FLAG fusion. // Protein. Expr. Purif. 2002. - V. 24. - P. 497-504.
174. Voss S., Skerra A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. // Protein Eng. 1997. - V. 10. - N. 8. - P. 975-982.
175. Skerra A., Schmidt T,G. Use of the Strep-Tag and streptavidin for detection and purification of recombinant proteins. // Methods Enzymol. 2000. - V. 326. - P. 271— 304.
176. Munro S., Pelham H.R. An Hsp70-like protein in the ER: identity with the 78 kd glucose-regulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein. // Cell. -1986. V. 46. - N. 2. - P. 291-300.
177. Kipriyanov S.M., Kupriyanova O.A., Little M., Moldenhauer G. Rapid detection of recombinant antibody fragments directed against cell-surface antigens by flow cytometry. // J. Immunol. Methods. 1996. - V. 196. - N. 1. - P. 51-62.
178. Schiöth H.B., Kuusinen A., Muceniece R., Szardenings M., Keinänen K., Wikberg J.E. Expression of functional melanocortin 1 receptors in insect cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - V. 221 - N. 3. - P. 807-814.
179. Dreher M.L., Gherardi E., Skerra A., Milstein C. Colony assays for antibody fragments expressed in bacteria. // J. Immunol. Methods. 1991. - V. 139. - N. 2. - P. 197-205.
180. Karpeisky M.Y., Senchenko V.N., Dianova M.V., Kanevsky V.Y. Fonnation and properties of S-protein complex with S-peptide-containing fusion protein. // FEBS Lett. — 1994.-V. 339.-N. 3.-P. 209-212.
181. Head J.F. A better grip on calmodulin. II Curr. Biol. 1992. - V. 2. - N. 11. - P. 609-611.
182. Zheng C.F., Simcox Т., Xu L., Vaillancourt P. A new expression vector for. high level protein production, one step purification and direct isotopic labeling of calmodulin-binding peptide fusion proteins. //Gene. — 1997.-V. 186.-N. l.-P. 55-60.
183. Рабинович M.JL, Мельник M.C. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы. // Успехи биол. химии. 2000. - Т. 40. - С. 205—266.
184. Rabinovich M.L.: Materials of Soviet-Finland Seminar on Bioconversion of Plant Raw Materials by Microorganisms. Pushchino: Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, 1984. - P. 31-48.
185. Рабинович M.JL Кинетические аспекты действия карбогидраз (лизоцим и целлюлолитические ферменты): Дис. . канд. хим. наук. М., 1977. — С. 16.
186. Levy I., Shoseyov О. Cellulose-binding domains: biotechnological applications. // Biotechnol. Adv. -2002. -V. 20. -N. 3-4. P. 191-213.
187. Xu Z., Bae W., Mulchandani A., Mehra R.K., Chen W. Heavy metal removal by novel CBD-EC20 sorbents immobilized on cellulose. // Biomacromolecules. 2002 . -V. 3.-N. 3.-P. 462-465.
188. Watanabe Т., Ito Y., Yamada Т., Hashimoto M., Sekine S., Tanaka H. The roles of the C-terminal domain and type III domains of chitinase A1 from Bacillus circulans WL-12 inchitindegradation.//J.Bacterid.- 1994.-V. 176.-N. 15.-P.4465-4472.
189. Szweda P., Pladzyk R., Kotlowski R., Kur J. Cloning, expression, and purification of the Staphylococcus simulans lysostaphin using the intein-chitin-binding domain (CBD) system. // Protein Expr. Purif. 2001. - V. 22. -N. 3. - P. 467-471.
190. Smith D.B., Johnson K.S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. // Gene. 1988. - V. 67. — N. 1. - P. 31—40.
191. Duplay P., Hofiiung M. Two regions of mature periplasmic maltose-binding protein of Escherichia coli involved in secretion. // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - N. 10. - P. 4445-4450.
192. Sachdev D., Chirgwin J.M. Properties of soluble fusions between mammalian aspartic proteinases and bacterial maltose-binding protein. // J. Protein Chem. 1999. -V. 18.-N. l.-P. 127-136.
193. Davis G.D., Elisee C., Newham D.M., Harrison R.G. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. //Biotechnol. Bioeng. 1999. -V. 65.-N. 4-N. 382-388.
194. LaVallie E.R., Lu Z., Diblasio-Smith E.A., Collins-Racie L.A., McCoy J.M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. II Methods Enzymol. Bacteriol. 2000. - V. 326. - P. 322-340.
195. Jungbauer A., Hahn R. Engineering protein A affinity chromatography. // Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2004. - V. 7. - N. 2. - P. 248-256.
196. Goward C.R., Murphy J.P., Atkinson Т., Barstow D.A. Expression and purification of a truncated recombinant streptococcal protein G. // Biochem. J. 1990. - V. 267. - N. l.-N. 171-177.
197. Воробьев A.A., Васильев H.H. Адьюваиты (неспецифические стимуляторы иммуногенеза). М.: Мед. книга, 1969 206 с.
198. Лященко В.А., Воробьев А.А. Молекулярные основы иммуногенности. — М.: Медицина, 1982-271 с.
199. Гурвич А.Е., Капнер Р.Б., Незлин Р.С. Выделение чистых антител при помощи фиксированных на целлюлозе антигенов и изучение их свойств. // Биохимия. -1959.-Т. 24.-С. 142.
200. Гурвич А.Е. Количественное определение содержания антител при помощи белковых антигенов, фиксированных на бумаге. // Биохимия. 1957. - Т. 22. - Вып. 6. - С. 1028. '
201. Gurvich А.Е., Drizlikh G.L Use of antibodies on an insoluble support for specific detection of radioactive antigens. //Nature. 1964. - V. 203. - P. 648-649.
202. Лехтцинд E.B., Гурвич A.E. Синтез высокоемкого иммуносорбента на основе суспензии целлюлозы. // Бюл. экспер. биол. и мед. — 1981. — Т. 92. — Вып. 7. — Р. 6870.
203. Wang W., Malcolm В.А. Two-stage PCR protocol allowing introduction of multiple mutations, deletions and insertions using QuikChange Site-Directed Mutagenesis. // Biotechniques. 1999. - V. 26. - N. 4. - P. 680-682.
204. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М: Мир, 1984. - 479 с.
205. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. - V. 227. -N. 5259. -680-682.
206. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. -1976. -V. 72.-P. 248-254.
207. Hailing K.C., Hailing A.C., Murray E.E., Ladin B.F., Houston L.L., Weaver R.F. Genomic cloning and characterization of a ricin gene from Ricinus communis. // Nucleic Acids Res. 1985.-V. 13.-N. 22.-P. 8019-8033.
208. Hussain K., Bowler C., Roberts L.M., Lord J.M. Expression of ricin В chain in Escherichia coli. И FEBS Lett. 1989. - V. 244. -N. 2. - P. 383-387.
209. Richardson P.T., Hussain K., Woodland H.R., Lord J.M., Roberts L.M. The effects of N-glycosylation on the lectin activity of recombinant ricin В chain. II Carbohydr. Res. 1991.-V. 213.-P. 19-25.
210. Hussain K., Bowler C., Roberts L.M., Lord J.M. Expression of ricin В chain in Escherichia coli. И FEBS Lett. 1989. - V. 244. -N. 2. - P. 383-387.
211. Wales R., Gorham H.C., Hussain K., Roberts L.M., Lord J.M. Ricin В chain fragments expressed in Escherichia coli are able to bind free galactose in contrast to the full length polypeptide. // Glycoconj. J. 1994. - V. 11. - N. 4. - P. 274-281.
212. Гурвич A.E., Корукова A.A., Эльгорт Д.А. Усиление иммуногенности белков путем их присоединения к целлюлозной матрице. // сб. Иммуномодуляторы. -1987. -С.67-76.
213. Лящук A.M. Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4, потенциального компонента генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 2005. 19 с.
214. Васекина А.В., Ершов П.В., Решетова О.С., Тихонова Т.В., Лунин В.Г., Трофимова М.С., Бабаков А.В. Вакуолярный №+/Н+антийортер ячменя: идентификация и реакция на солевой стресс. // Биохимия. 2005. - Т. 70. - № 1. -С. 123-132
215. Wang S.T., Ни M.R., Guo J.W., Feng J.N., Shen B.F. Fusion expression and purification of recombinant ricin A-chain. // Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. -2005.- V.21.-N.2.-P. 137-140.
216. Bardwell J.C. Building bridges: disulphide bond formation in the cell. II Mol. Microbiol. 1994. -V. 14. -N. 2. - P. 199-205.
217. Rudolph R., Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. // FASEB J. 1996. -V. 10.-N. l.-P. 49-56.
218. Blight M.A., Holland I.B. Heterologous protein secretion and the versatile Escherichia coli haemolysin translocator. // Trends Biotechnol. 1994. - V. 12. - N. 11. -P. 450-455.
219. Jennings M.P., Beacham I.R. Analysis of the Escherichia coli. gene encoding L-asparaginase II, ¿z«sB, and its regulation by cyclic AMP receptor and FNR proteins. //
220. J. Bacterid. 1990. - V. 172.-N.3.-P: 1491-1498.
221. Tan S., Wu W., Liu J., Kong Y., Pu Y., Yuan R. Efficient expression and secretion of recombinant hirudin III in E. coli using the L-asparaginase II signal sequence. // Protein Expr. Purif. 2002. - V. 25. - N. 3. - P. 430-436.
222. Гурвич A.E., Кузовлева О.Б., Туманова A.E. Получение белково-целлюлозных комплексов (иммуносорбентов) в виде суспензий, способных присоединять большие количества антител. // Биохимия. — 1961. Т. 26. - Вып. 5. - С. 934-942.
223. Ada G. Overview of vaccines. // Mol. Biotechnol. 1997. - V. 8. -N. 2. - P. 123134.
224. Dertzbaugh M.T. Genetically engineered vaccines: an overview. // Plasmid. 1998. - V. 39.-N. 2.-P. 100-113.
225. Liljeqvist S., Stahl S. Production of recombinant subunit vaccines: proteinimmunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines. // J. Biotechnol — V. 73. —40.48.1. N. l.-P. 1-33.
-
Грачева, Мария Андреевна
-
кандидата химических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.23
- Структурные и функциональные особенности токсинов и иммунотоксинов, ингибирующих белковый синтез
- Получение компонентов иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов
- Особенности внутриклеточного транспорта и биологическая активность рицина
- Гуморальный иммунный ответ на токсины из омелы белой (Viscum album)
- Исследование функциональной активности химически модифицированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека in vitro и in vivo
