Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные и функциональные особенности токсинов и иммунотоксинов, ингибирующих белковый синтез

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурные и функциональные особенности токсинов и иммунотоксинов, ингибирующих белковый синтез"

РГ6 од

МИНИСТЕРСТВО ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ / 3 ^/^¿^ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

ТОНЕВИЦКИЙ Александр Григорьевич

СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ТОКСИНОВ И ИММУНОТОКСИНОВ, ИНГИБИРУЮЩИХ БЕЛКОВЫЙ СИНТЕЗ

03.00.03 — Д\олекулярная биология

Диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва 1993

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов и в Научно-исследовательском институте экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН.

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Г. И. Абелев,

доктор биологических наук, профессор Г. А. Ермолин, доктор биологических паук, профессор-С. В. Машко.

Ведущая организация — Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгсльгардта РАН.

Защита диссертации состоится « У. . » . 1993 г.

в « /У. » часов на заседании специализированного совета Д.098.12.01 при Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Официальные оппоненты:

Диссертация разослана « /л »

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблем«. Цель и задачи исследования. Научная новизна. Научно-практическое значение. Апробация результатов диссертации. Материалы и методы исследования ...................................... 2

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Особен- ->сти структуры токсинов.

Структура оуСъвдикий, влияние дематурирупяшх агентов, взаимодействие о мембранами и рецепте-ами; рекокбииалткая и денатурированная теплой В-цепь

рицина, гипотеза "расплавленной глобулы".................. S

II. Иииунотоксины против В-лимфоцитою. Иммуноглобулины - маркеры лимфоцитов. Кокъогаты ка оокове поли- ииояоклокалькых антител против легких цепей Is человека, сравнение активности. Цитотокси-ческая активность in vivo и in vitro ИТ о аити-влло-тнпическиии антителами против L-цепей 1я крысы.......... 25

III. Иниунотоксины против эритробластов. Идентификация антигена эритробластов. Иниунотоксины на основе иомоклокалъных антител против »того антигена. Нодельная система для проверки активности in vivo.......28

IV. Иниунотоксины против Т-лим»оиитов человека.

Характеристика внтигенов-маркеров, ионоклональных антител и икиунотоксинов на их основе. Роль рецепторов в прояв-■ лении ингибирующей активности коиъюгатов. Способы повышения цитотоксу »ского действия. Обработка костного ноэга человека - одно иэ направлений использования ИТ. Конъвгаты

на основе А-субгединииы растительного токсина вискунина. 30

ЗАКЛЮЧЕНИЕ . . .......................................... 34

ВЫВОДЫ ................................................................................................3$

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЯ ПО ТЕНЕ ДИССЕРТАЦИИ ..................................39

Актуальипптч. проблемы. Чрезвычайно высокая эффективность цитотокоического действия токсинов, ингибируввих белковый синтез * зукариотических клетках, сделала белки этого сеиейства объектом как фуядаивктвдьвых. так и прикладных исследований. С одной оторокы. это связано с там, что эти токсины являртоя причиной тядолых заболеваний, а о другой предприняты

попытки по использованию токсинов и их производных для избирательного удаления определенных популяций клеток, например опухолевых. Развитие этого подхода способствовало как появление гибридоипой техники, так и успехи в изучении механизмов действия токсинов. Кохъогаты токсинов или их каталитических оубьадохиц (фрагментов) о антителами против клеток-мишеней получили название имкунотокоинов (ИТ). Для получения таких "химерных" молекул используот . токсины растительного и бактериального происхождения. Несмотря на различия в аминокислотных последовательностях, токсины иноот иного общего как в структуре, так и в мехакизне действия. Белки состоят из двуг субьединиц (фрагментов), связанных дисульфидной связью и Ьыполчяоцих строго' различные функции. За взаимодействие с рецептором на поверхности клетки отвечает свяэырчсиая субъединица, а модификацию компонентов белок-синтезируюиего аппарата осуществляет каталитическая субъединица. Особый интерес связан со способХостьв этих белков проникать в цитоплазму клетки через плазматическую мембрану. Кеханизм этого процесса пока не установлен. Токсины кохно рассматривать кЬк удобные модельные объекты для изучения белок-белковых и белок-липидних взаимодействий, внутриклеточного транспорта белков. Актуальность работы определяется тем, что она посвящена поиску как новых антител и токсинов, пригодных для получения цитотоксических препаратов направленного действия, так и новых модельных систем для проверки активности полученных ИТ. Комплексное использование различных спектралькнх. биохимических и иммунохимических подходов, использованных в рвботе, позволяет получить ценную информацию о структуре токсинов, расширяет возможность изучения механизмов действия нативнух токсинов, указывает пути повышения активности ИТ.

Пяди и ^ялячи исследования. Настоящая работа, во-п рвых, посвящена изучению оещих' закономерностей избирательного

икгибируюиего действия иимунотоксинов и роли о этом процесса составных частей конъогатов. Во-вторых. - получение яових цитотоксических препаратов направленного действия на основе растительных и бактериальных токсинов, разработке модельных систем, пригодких для изучения свойств конъогатов. В соответствии с этик задачи работы заключились в елвдувивн;

1. Попок новиж векторов и цитотоксических агентов для получения инмукотокоинов.

2. Полученгэ и сравнительное изучение ингибируввих свойств конъогатов, имесаих либо различные антитела, либо токсические части; изучение зависимости действия инунотокенно^ от свойств акткгоков-иарквров.

3. Изучение закономерности структуры токсинов и их изолировании« оубъеднниц; влияние pH, текператури, декатурирувцих агентов; возмоаиооти яовыаакия цитотоксической активности хоиъвгатов.

4. Изучение структурных изменений мембран клеток-кквеией и лилооом при взаимодействии с токсинами и антителами.

5. Изучение избирательности действия подученных коньегатов » модельных системах in vitro и in vivo.

в. Получение препаратов, пригодных для клинического применения при пересадках костного мозга человека. Определение оптимальных условий обработки клеток-мишеней.

йятпры ^rrjiffпгтиния. Нативные и рекоибинаитиые растительные и бактериальные токсины и их изолированные субъединицы были охарактеризованы при помощи ионообменной и аффинной хроматографий, гель-фильтрации. злехтрофореза и

изозлекторофокуеировки в полиакриламидком геле. Физико-химические свойства белков из» ми при помощи методов кругового дихроизма <КД), *Н-ядериого магнитного резонанса lЯИР > и определения собственной флуоресценции триптофаиовых остатков.

Иммунологические свойства белков изучали при помоши поли- и монохлональных антител, используя иепрямув иммунофлуоресиентиую микроскопию и различные иммуиофярнектние и радиоиммунологические методы. Цитотоксических сюйствв препаратов определяли по иигнбировакис включения в клетки-мишени ^С-лейцика либо ^Н-тпмпдима. 6 риботе нсполг-зевались лимфоциты периферической крови, клетки костного мозге и линии клеток ч»?ловека: -имфона Б.ркитта ЕВ-Л. Paufii. Rai i, HOLT. K-J>B?

^аучиая ягмтм_И. ПРПК1ИЧвС.К1>Я. ЦСВИОСТЬ РйбОТЫ • Получены и

изучены кокъвгаты, соответствуоиив четырем поколениям иммунотоксинов. Впервые охарактеризованы дифферекиировочные

а irr vir в кы эрктроблаотов мыт и человека, показана возможность избирательной, эффективной элиминации опухолевых клеток-иишеней, несувих данный антиген , с понощьв иммунотоксинов. Впервые изучена возможность избирательной элиминации В-лимфоцитов о помощью иммунотоксинов па основе анти-аллотипических антител против легких цепей иммуноглобулинов. Впервые получены импуяотоксжш яа основе А-цепи лектина из Viscu» albus и показано, что его активность практически равна активности нативного токсина. Проведены систематические исследования особенностей структуры растительных токсинов рицина и лектина иэ Viscun albus, их изолированных субъединиц. Изучено влияние температуры, денатурируюоих агентов и pH на структуру этих белков и взаимодействие субъедииии. Впервые показана наличие лосвианых N-кониевых участков в молекуле ришта. Впервые получена активная, стабильная рекомбинактная В-цепь рицина и изучена роль гликоэилировакия для ее функционирования. Предложена новая гипотеза о роли В-субъеднницы в транснекбранном перекосе А-субгединицы рицина. Получена

панель иммунотоксинов против опухолевых В- и ■Т-лимфоцитов человека и утвержден протокол клинического применения данных препаратов на базе ОНИ РАКИ. Полученные в данной работе препараты токсинов и иммунотоксинов переданы в Институт иммунологии НЗ России, OHU РАНН, Центр трансплантологии РАМН, KHU РАМН, где они нашли применение для научно-исследовательских и прикладных целей.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с сотрудниками Института канцерогенеза ОНЦ РАМН Е.Б.Нечетнером, сотрудниками Института экспериментальной

кардиологии Т.Л.Бушуевой, В.Н.Бушуевым, Н.А.Найсуряном, сотрудником Института белка РАН С.Ю.Векьяминовым, сотрудником Института иммунологии t России Топтыгиным А.Ю., сотрудниками НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов И.И. Агаповым и Г.В. Ершовой, В.А.Рахмановой, сотрудником Центра по изучение рака и лейкемии госпиталя штата Флорида др. А.Франкелем и сотру..ликом лаборотории фитохимии университета Виттен-Хердеке. Германия др.

У. Пфюллерсм.

»тпЯячия риЛптм. Представленные в диссертации результаты были доложены на различных Всососэкых и международных конференциях и симпозиумах, в тон числе: 16 конференция ФЕКО (Москва, 1984), 10 и 11 международные конференции по лектинан (Прага. 1988, Тарту, 1990), 1 Всесоюзный съезд имнунологов (Сочи, 1989), 2 и 3 международные симпозиумы по имнунотоксимам (Орландо, 1990, 1992). 5 всеросийская конференция "Новые направления биотехнологии" (Пупико, 1892).

Публикации По материалам дисоертвции опубликовано 39 статей и обзоров о отечественных и международных изданиях.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

X.. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ТОКСИНОВ.

Все семейотво растительных токсинов, которые используют при получении ИТ можно разделить на две группы [Olsnee et ai., 1969; Маиггулсгак et al., 1991]. В одну входят гетеродимеры, состояаиа из двух субъединии, связанных дисульфидной связью. Субъединицы имеет мол. массу примерно 30 кДа и выполняют с.poro различные Функции. Свяэываввая субъединица - В (binding) лектин, имеющий сродство к концевым остаткам галактозы и обеспечивавший связывание с клетками, каталитическая

субъединица - A (active) - высокоопецифическая N-гликозидаэа. избирательно модифицируете* 26S РНК 60S субъединии »укариотчческнх рибосом, что приводит к остановке белкового синтеза и гибели »етки. Они обнаружены в различных частях систематически далеких видов растений. К белкам этой группы относятся рицин, абрин. иолеиик, вмекумии н др. Вторую группу составляют белки, подобные А-субъединицам как структурно, так и Функционально. Они обнаружены в большинстве исследованных растений, обладают антивирусным действием и, по-видинону. возникли в ходе эволюции как защитное приспособление. К ним относятся гелоним, сапорчи. трихосантмн. монордин и др. В особую группу выделяет бактериальные токсины, которые более гетерогенни по своему строению, ко в них можно i делить Фрагменты (субьедпиицы), выполняющие соответственно -

сеязываоную и каталитическую функцию. Ингибирование белкового синтеза в клетке происходит либо после модификации 2 фактора элонгации (дифтерийный токсин, псевдоманадный токсин), либо после модификации 26Б РНК. В данной работе ооковные иооледования проводились с нативными растительными (рицин, вискунин) и бактериальными (дифтерийный)' токсинами и их изолированными оубъедикицами (фрагментами). Можно выделить четыре этапа механизма действия токсина: связывание о клеткой, рецептор-опосредованный эндоцитоз, трансмембранный перекос каталитической оубъединицы и кодификация рибосом либо второго фактора элонгации. При получении ИТ необходимо заменить овяэывавцур оувъедшшцу токсина на новый вектор, как правило,-антитело против «ктигена-маркера на поверхности клеток-мивеней. При этом механизм действия "переадресованного" токсина подобен действию нативного токсина. Этот факт предопределил и направления исследований. В этой части работы описаны результаты изучения особенностей стуктуры токсинов, их изолированных субъединиц, взаимодействия с рецепторами и мембраной.

В цитоплазму клетки попадают изолированные каталитические субъединицы токсинов. На рис.1 приведены спектры КД РТА и РТВ.

Рис.1. Спектры КД А-цепи (1) и В-цепи (2) рицина при рН 7.0, 10°С; на вставке: спектры КД в ближней УФ области.

Видно, что спектры субъединнц суяественно отличаютоя друг от друга, как в ближней, так и в далекой ультрафиолетовых областях. Спектр КД РТА .соответствует спектру белка со значительным содержанием альфа-спиралей (порядка ЗОХ) во вторичной структуре, а спектр РТВ указывает на очень малое содержанйё альфа-спиралей и, по-видимому, на значительное содержание вета-отруктуры. Необычная форма спектра КД РТВ в далекой УФ-области, по всей вероятности, обусловлена большим вкладом в эту область сигнала от боковых гр; та ароматических аминокислот. В ближней УФ-области спектры 1Щ обеих субъедтшц имеют достаточно больаую амплитуду и сложную форму о тонкой структурой, что указывав- на яесткуо Фикоашю боковых групп ароматических аминокислот а трехмерной структуре оубъединиц и косвенно является доказательством оуяеотвоважия хороао развитой жесткой третичной структуры.

На рио.2 дано сравнение спектра КД нативного рицина и аддитивного сяэктра изолированных субъедикиц.

Рис.2. Спектры К£ рииина(1> и аддитивкии спектр его еубъединии (2) при рН 7.0, 10oC; на вставке: спектры КД в ближней УФ области.

Форма обоих спектров очень близка, а небольвая (ЮХ) разница амплитуд может быть следствием ошибок измерения концентрации исследованных объектов. Такое хорошее совпадение спектров КД нативного рицина со спектром, полученный суммированием спектров изолированных оубъединиц. свидетельствует об отсутствии существенных взаимодействий РТА и РТВ в составе рицина на уровне их вторичной и третичной структуры. Это обстоятельство дает возможность проводить исследования иэолнровакучх субъе, тии и перекосить получеинне результаты на целый рицин.

1

X

■1,1

1)0 Ш

Во время внутриклеточного транспорт» токсины могут проходить оргЬхеллы с нейтральным и кислым рН. Были измерены спектры КД рицина и его оубъодиниц в дальней' и ближней. УФ-областях в зависимости от рН раствора. В диапазоне рН от 4,0 до 7.0 доотоверных, т.е. превышавшие 5%, изменений в спектрах не подучено. Таким образок, на уровне вторичной структуры в указанном диапазона рН не происходит изменений кокформации ни в рицине, ни в его изолированных субъединицах. Однако суцествекиые различия наблюдаются в терноотабидькости рицина в »тон диапазоне рН. Как видно на рио.З, стабильность рицина при изменении рН от 7,0 до 4,0 увеличивается на 12°С. При втом термостабильяости кзодирозъхиих оубьединиц примерно равны между собой, практически зависят от рН и существенно ниже термостабильности целого рицина (25-35°С).

Ш » м

330

ш

1и»

V"

*»о

ми-

га

<Ю

т

уМ

■ <

гг

к

'V

10 *0

во 09 t^,t

Рис.3. Влияние температуры на положение максимума спектра Флуоресценции рицина (а), и его А-цепи (б) и В-цепи (в) при рН 7.4 (1) и при рН 4.0 (2)..

Очевидно, что такая зависимость термостабильности субъединиц и иктактиого рицина от рН должна быть обусловлена явлениями, происходящими в области взаимодействия субъединиц. Возможно, перезарядка Шб-251 Р,В при понижении рН приводит к образование солевой связи с карбоксильной группой РТА. Кроме того, протонирование одной или нескольких карбоксильных групп, находящихся в области контакте, приводит к нейтрализации зь^ядв и усиление гидрофобного контакта между субъединицами.

Другим подходом, поэволяюиин оцетЧвать изменения в структура, является измерение собственной белковой флуоресценции. Пар&кетры опектров флуоресценции рицина н его оубъедикиц при р'Н 7,5 предотавдеви s табл.1.

Таблица 1. Дании» флуоресценции токсинов при 25°С и рИ 7,5.

Белок Длина Длина Ширина Квантовый

волны волны спектра, выход.

юэб. , испуск.,

км *Дии 4.1 им ilOX

Рицин 205 328 50 0,28

280 329 52 0.21

А-цепь 295 320 48 0.29

рицина 200 323 52 0,11

В-цвл* 205 330 50 0.20

рицина 280 330 51 0,20

Дифтерий- 205 327 50 0,085

ккй токе.

Рис.4. Влияние рН на на поло*ет!е максимума (А) и квантовый выход Флуоресценции (Б) токсинов; 1. А-цепь рицина; 2. рицин; 3. В-цепь рицина; 4. дифтерийный токсин. Концентрация tokl ihob - 20 мкМ.

Коротковолновое положение максимумов спектров и высокое значение квантовых выходов флуоресценции указывает на то, что значительное число остатков триптофана не доступны молекулам подии мало подвижны.

Как видно из рис.4 положения максимумов спектров флуоресценции кативмого тдкеина и РТА не зависят от рН в диапазбке от 3 до 8, в то время как изменения этого параметра для РТВ указывает на структурный переход при рН<5. Подобные результаты получены хами дая субъедиииц вискумина. При изменении рН от 7,5 до 4,0 в РТВ и ВТВ увеличивается доступность остатков триптофана тувителю. Это указывает яа то, что происходит разрыхление структуры белка [Буржтейл, 1977].

.Б

г\ Л

V \

а иС1].м

Рис.б. Влияние гуанидингидрохорида на положение максимума (А) и квантовый выход флуоресценции (Б) рицина и его субъединии при рН 7.5; 1, В-цепь рицина: 2, А-цепь рицина; 3, В-цвпь рицина < 50 мН лактозы; 4, риц',.н; 5, ридин + 50 иМ лактозы.

Для выяснения структурной стабильности нативных токсинов н их субьедихиц при двух значениях рН (7,5 и 5.0) исследовали дроцеоо денатурации этих белков под дейотвйей гуанидингидрохлорида (рио.5) и температуры.

Приведенные на рио.5 и в данные показывают, что с увеличением концентрации гуанидингидрхлорида происходит типичный

донагурвциоинмй одаиг положения максимумом спектров до предельного положения, присущего полностью доступному воде остатку тр| лтофана (353 ни). Видно, что при двух различных рН отабильнооть структуры рицина и его субъединий оувеотвеияо различаетоя.

I >

Рис.6. Влияние гуанидингидрохорида на положение максимума (А) и квантовый выход флуоресценции (Б) рицина и его субьедмниц при рН 5.0; 1, В-цепь рицина; 2. В-цепь рицина + 50 мМ лактозы; 3, А-цепь рицина; 4. рицин; 5, рицин ♦ 50 иН лактозы.

Особый интерес представляет наличие обнаруженных нами с помощь» ЯНР подвижных концевых участков молекулы. Подобные

Фрагменты были описаны у РНК-связываювих белков [Bushuev et al., 1089]. Возможно, это связано не только с функционированием РТА как й-гликозидазн, ко и важно для тракснеибранного переноса, так как облегчает вооотановление дисульфилиой связи между субьединииами.

Дисульфидная связь в молекуле рицина образуется между Суа-259 в РТА и Суя'4 я РТВ и экопонирована на поверхности молекулы. Вооотановление S-S связи происходит после ждоцитоза и протекает достаточно быстро: через 10 мин. примерно 20Х , а'через 30 мин -более 30% молекул токсина не имеет дисульфидного мостика (рио.7).

2000

( мин —- II мин — М мин

1000

73 „а

75

30

£5

восставновлениый рицин

0 НО 20 30

время инкубации, мин

Рис.7 Количество постановленного рицина в лмфоцитэх человека.

В отсутствии дисульфидной связи субъедпнпци удерживаются вместе гидрофобнини взаимодействиями, в которых участвуют ?тятки Pro-7, Рго-9 РТВ и Рго-229 РТА. Рте-260. Phe-213, Phe-219 РТВ и

Рго-250 РТА. Избирательность взаимодействия между субъедииицами токсиноп и влияние на этот процесс рН оценили по связыванию РТВ с РТА, ВТА. А-фрагментом ДТ и гвлонином. к'втерояинеры отделяли от изолированных субъединиц о помоаьп гель-фильтрации (рис.в, в). Сродство ВТА иного слабее, чем РТА и характеризуется Ка*2,5хХ04 Н"1 и Ка-=1,3х104 Н"1 при рН 7,4 и 5,5 соответственно. Для РТАДа=1,6х10® Н"1 и 2,9x10е И*1. Достоверного взаимодействия РТВ . ,9,, А-ФРагментом ДТ и гвлонином не обнаружено. Роль взаиирдейст' 'Я оубъедикнц при трансмекбраккон перекоса катпл1$здческой оубъелиницы пока не ясна, но отсутствие взсинодействия между субъединицами коррелирует о «втокоичност&а для клеток химерного белка, оодержаоего А-фрагмаит ДТ, й, как показано нами, невысокой активиостьо химерного токсина РТВ-"вТА.

цин/мцида"'

Рис.в Профиль гель-фильтрации на сефвдексе G-75 смеси С * 11-В-uçnj) рицина и tro А-цепи с молярным соотношением 1:1 (а), смеси [i2j¡}-р.цепи рицина и А-иепи лектина из омелы с молярным соотношением 1:10 (6"» при рН при рН 7.5 < 1 ) и рН 5.5 (2).

Большое значение для процесса трянемвмбранного переноса А-цепи имеет белок-линилное взаимодействие, причем не тол1ко на последней ci алчи попадания каталитической субъединицы в

цитоплазму, ко и при связывании рицина с поверхностью клетки.

Рио.8 Профиль гель-фильтрации ка сефадексе 0-75 смеси [1251]-В-Цепк риимма и галокияа молярным соотношением 1:10, рН 7.5 (а), смеои [li3ï]-B-uemi рицина и А-Фрагмеята дифтерийного токсина с молярным ооотяоаеяием 1:1.0, рН 5.5 (6).

Кроме того, возможно, что вспомогательная роль В-цепи опооредов&ИБ вызываемыми ев изменениями в мембране. Токсин во время внутриклеточного транспорта проходит комлартменты с различными рН. В данной работе определяли влияние рН на связывание рицина и его изолированных субъединиц с клетками (рис.10). При добавлении 50 иН.лактозы т.гибируется peut..тор-опосредованное связывание рицина и РТВ с поверхностью клетки. Видно, что при понижении рН значительно увеличивается связывание изолированных субъединиц и особенно РТА, которое не ингибируется добавлением лактозы.

Оценку изменений в проницаемости липидкого бислоя после взаимодействия с РТА проводили с помощью Флуоресцентного маркера кальцеина, флуоресценция которого резко возрастает при выходе из липосомы [Weinstein et al., 1981]. Проницаемость бислоя изучалась в динамическом режиме - при переходе бислоя из одного фазового состояния в другое. Этот подход обладает .высокой чувствительностью и регистрирует возмущения, которые не обнаруживаются, если липиды находятся в гель- или жидкокристаллическом состогши. Именно тамая ситуация наблюдается в случае РТА, которая вызывает вытекание кальцеина при фазовом переходе (рис.11). Это означает, что РТА может встроиться в мембрану в участке разупорядоченного липидного бислоя.

ера

»000«

м«ев »ем 1 А ' Б

«мое » \ ' \ ч

«юта эбсмо V в

»0000 д

<м«о \

V—

рН

дяиие рН на связывания -велко

-рицин; 2. ♦ 50 мН лактозы.

Рис.10. Вдияни

А - 1. ..........„ --------------

Б - 1, С:,?П-В-цвпь рицина; 2. »ЬО иН лактозы

В - 1, (]-А-цель рицина; 2, »50 иН лактозы

А.

■ с лимфоцитами.

18 22 темперотура (-с)

Рис.11. Изменение интенсивности флуоресценции кальцеина при нагревании кальцеин-содержаонх ДИФХ-липооом; 1. А-иепъ рицина; 2, В-цепь рицина; контроль - липосомы в отсутствии (.¿яков.

В клетках «акторами, влиявпими ка состояние липидного бислоя могут быт» балки, например РТВ. В качестве модельной мембраны вили использован» дипооомы различного состава,, в том числе и сэдэржааие ганглиозид 0в1, который имеет концевую галактозу и является оамым простым рецептором для рицина. Степень упорядоченности можно оценить по светорассеянию суспензии «ипосои. Добавление рицина и РТВ к липооомам, содержяим 2Х 0в1, вызывает увеличение разницы светорассеяния суспензии при температурах фазового перехода (рис.12), что указывает ка слияние «ипосоя а данных условиях. Эти изменения могут быть результатом рецептор-эавиоимого азаимодейотвия, так как слияния не наблюдается в случае липооом баз вв1, под действием РТА и при добавлении £0 мН галактозы.

температура. °С

Рис.12. Влияние рицина (1) и В-цепи рицина <2> на фазовый переход ДНФХ-липосон содержащих 2 ИХ 0Н1 при рН 7.5; 3. липосомы без белков. Фазовый переход регистрировали измерением светорассеяния суспензии.

Другим параметром состояния липидов является кооперативность Фазового перехода, которая зависит от размеров участков липида, находящегося в одинаковых Фазовых состояниях. [Harsh et al., 1977]. Показано, что при увеличении концентрации ганглиозида от 2 до в MX не происходит заметных изменений в свойствах самих липосом, но при добавлении РТВ наблюдается снижение кооперативности фазового перехода, что выражается в его уширемии (рис.13). По-видимому, это вызвано кластеризацией ганглтзидов под действием РТВ.

В Даккой работе показано, чтр подобное действие рицин и РТВ оказывает и на состояние клеточной мембраны. Предложен способ изучения лигакд-рецепторного взаимодействия, основанный -да регистрации с помощь» встроенного в плазматическую мембрану флуоресцентного липидного зонда - антрилвинил-меченкого сфингомиелина изменений в липидном окружении рецептора, мвотупасяих в результате связывания лиганда (Нолотковский, 1888}. При добавлении рицина или РТВ, но не РТА, х клеткам лимфомы. содержании . строенный зонд, повышается поляризация флуоресценции, что свидетельствует об изменении подвижности эемда. Сходны* результаты получены и при добавлении поли-, либо - оноклональных антител, реагирующих о рецепторами на поверхности клеток. Причем, в обоих случаях насыяение наблюдается при оккупации 103! рецепторов и не обнаружено различий в реакции клеток на рицин и антитела. Во* эти результаты указывают на заметное влияние РТВ на состояние лилидиого бислоя.

температура, °С

Рис.13. Влияние ОН 1 ив фазом<й лпреход ДНФХ-липосом в присутствии В-цепи рицина при рН 7.5; I. 2 Н* ОН 1; 2, 4 «X 6Н1; 3, 8 ИХ СИ1. Фазовый переход регистрировали измерением светорассеяния суспензии.

Нп поверхности клеток можно выделить 2 популяции рецепторов для рицина с Ка=!0"8м~1 к Ка- 10- 11'м" * , на которые приходится примерно 95Х и ЬХ мест связывания соответственно [01впез а1.,

1987]. К ним относятся гликолипиды и гликопротеиды, несущие конаевую галактозу Пока не ясно, после связывания с какими из

этих молекул, происходит транснембранкый перенос A-цепи. В имей работе мы попыталиоь оценить вклад гликолипидов и гликопротеидов, как истинных рецепторов,- опосредующих цитотоксическое дейотвие рицина.

.Известно, что обработка иейраминидазой, которая отцепляет концевые сиаловые кислоты, приводит к увеличение числа остатков галактозы на поверхности клетки [Bale et al., 1866]. Обработке клеток лммфомы Бэркиттв ВВ-3 нейраминидазой увеличивает примерно в 20 раз чиоло мест ввязывания рицина, что приводит к повышение чувствительности к токсину в в раз (табл.2). Анализ обвей и дипидсвязанной сиаловой кислоты до и после обработки тшшит м то, что новые рецепторы является в основном г ликопротендами.

Таблица 2. Связывание 1^51-РТВ с клетками линфомы Беркитта, обработанными нейраменнцазой или ганглиозидами

Концентрация Связывание 1^^1-РТВ с клетками / ИЛсп

I-PTB (103 ери мин"1)

(103 ерв .............................................—

мл кик-1) Буфер Клетки обработанные

Нейраменидазой GUI GH3 '

16 2.0/5-10"10 25/5"10"е 5.0/3 • 10"® г.г/вю"1*

70 5.7. 93 13.5 5.2

250 в.в - 2.6• 8 в. 8

Другим способом увеличения мест связывания является обработка клеток ганглиозидом Gnl, который встраивается в плазматическую мембрану. Для клеток ЕВ-3 число мест связывания за счет встраивания ганглиозида Gol увеличивается в 3 раза, а ИД50 не уменьшается, а увеличивается в 2 раза (Табл.2). Известно, что по сродству к рицину ганглиозид Gnl принадлежит к низкоаффинным рецепторам. По-видимому, медиаторами токсического Эффекта являются гликопротеиды, и в частности популяция высокоафинных рецепторов.

Плотность рецептиров на поверхности клеток-мишеней ается в модельной системе при содержании Gel в липосомах 10НХ. При этом расстояние между рецепторами сравнимо с растоянием между двумя центрами связывания галактозы. Добавление РТВ приводит к резкому увеличению светорассеяния суспензии липосом.

содержааих 10* 0в1, что свидетельствует об их агрегации (рис.14). Этот процесс ихгибируется лактозой либо эквимоляркыи по отковемию к РТВ количеством РТА. Нативный рицин не вызывает агрегации. Не происходит агрегации липосом, содержащих в или 4 ИХ ганглиозиди Оо1. Это указывает ка то, что о в данных условиях с дипосокаии взаимодействует два галактозо-связываюяих центра РТВ и гидрофобный учаоток, расположенный в области контакта субьединиц. Пока не установлена четкая корреляция между степенью агрегации и слиянием мг^бран. Предполагает, что белки, вызывавшие слияние мембран, после связывания о рецептором экспонирует овои гидрофобные участки, которые вызывает так называему- "гидрофовнуо дегидратацию" иежмембрахного пространства. В результате нарушается упаковка липидных молекул и становится возмовиым слияние мембран. Одним из наиболее вероятных мест трансиеибрнного переноса А-цепи токсина является участок слияния, которое индуцировано В-субъединицей [НоекаЪга, 1999].

Рис.14. Влияние концентрации СИ1 на фазовый переход Дг(ФХ-липосом в присутствии В-цепи рицина при рН 7.5. Фазовый переход регистрировали измерением светорассеяния суспензии.

При взаимодействии с мембраной происходят не только изменения в липидном бислое. но и в белковой молекуле. По уменьшение квантового выхода собственной флуоресценции (рис.15) и по изменение анизотропии вращения дянсильной метки (рис.16) видно, что большое значение во взаинодрйствии играют гидрофобные участки

оубьединиц. Важно отметить, что наблюдаемое падение квантового зыхЬда флуоресценции (рио.15) и сдвиг на 1-2 ни спектра

характеризует триптофановых

Флуоресценции в длинноволновую сторону, разворачивание белковой глобулы и экспонирование оотаткоа.

Для некоторых белков было показано существование промежуточного "чаотичио развернутого" оостоякия,

характеризующегося полным или существенным разворачиванием белковой глобулы без потери вторичной отруктуры [Ptltayn, 1987]. При этом молекула белка остается компактной, но третичная отруктура значительно уменьшена. Ранее О.В. Птицынын и ооавт. было высказало пргдлоложекие, что именно в таком состоянии белок приспособлен к взимодействи» о неполярным окружением.

1.1 ■

к

I

1

0.1

I

I 0.1

I I_I I

_I_I-I_

vo.o s а. о П0.0 йипоевма Цепок, мчи

ПОЛ

Рис.15. Изменение относительного квантового выхода флуоресценции отдельных субьединиц.рицина при взаимодействии с липосомани при рН 7.4. 1, В-иепь рицина и липосомы из лецитина и холестерина (9:1); 2, В-цепь рицина и липосомы из вН1, лецитина и холестерина (1:9:1); 3, А-цепь рииина и липосомы из лецитина и холестерина (9:1).

Инкубация РТВ в 12.5 мН боратном буфере с рН 9.0 при температуре 37°С приводит к значительному уменьшению галь..тозо-связываютей активности, но сохранению вспомогательной функции РТЕ

для траноменбрпниого переноса РТА (»акглупсгак е1 а!., 19881. Химически модифицированных аминокислотных остатков аспарагина и глутвмина не выявлено. В данной работ* была изучена структура термически обработанной РТВ (тоРТВ). Установлено, что белок претерпевает значительные структурные изменения и по некоторым параметрам подобен "расплавленной глобуле". Во-первых, происходит длинноволновый сдвиг положения максимума и увирекие опектра триптофвновой флуоресценции (рио.17), во-вторых, не наблюдается четко выра- 'иного температурного перехода (рио.18), в-третьих, денатураиионныА переход, вызванный действием гуанидингидрохлорида характеризуется сниженной кооперативностьв и происходит при иехьаих концентрациях денатурирующего агента (рио.19). Кроме того, т обработанного белка возрасла доступность триптофамою к тувитвлян, увеличилась чувототвительность к действие ионной силы.

о.Ю

3 ».го

с

I

0.10

0.01

/ о

«40 м.0 П0.0

Деяммо / ¡топ, т м

Рис.10 Изменение анизотропии вращения дансильной метки, ковалпнтно присоединенной к белкам, при титровании лилосомами из смеси СН1. леиитина и холестерина (1:9:1) при рН 7.4; 1. рицин; 2. В-цеиь рицина.

Все зто свидетельствует об уменьшении стабильности структуры

тоЕ'ТВ. Анилиэ спс-ктров *Н-ЯНР иатнвной и тоРТВ также подтвердил

наличие изменений в структуре после обработки. Спектр ЯНР РТВ

(рис 20А) содержит широкие перекрывающиеся линии, что является

325

400

350 375 X. пт

Рис.17. Спектр флуоресценции нативной (РТВ) модифицированной (тоРТВ) В-цепи рицина.

ч

термически

2044*0 60 О 70 40 во во

Рис.18. Влияние температуры на квантовый выход (А) и положение максимума флуоресценции (Б) н&тивнойч (РТВ) и термически модифицированной (тоРТВ) В-цепи рицина.

типичным для белков с хорошо развитой третичной структурой подобной мол.массы. Спектр *Н-ЯНР тоРТВ (рис.20Б) в значительной мере отличается от спектра нативного белка и близок, ио не идентичен, спектру белка в денатурированном состоянии (рис.20В). Наблюдается значительное усреднение межостаточных взаимодействий в тоРТВ, но обработка не приводит к полному разворачиванию структуры и часть молекулы имеет учьотки сь^рнут^й структуры. На это указывает ушпреии» и различие г. химических сдвигах некоторых сигн лов в ароматической области спектра тоРТВ. Таким образом, по критериям спектров ^ Н-ЯНЕ' ка&л»д»ьтся

и

изменения конформации тоРТВ, связанные о потерей компактной третичной структуры. Это согласуется с данными, полученными по собственной флуоресценции и круговому дихроизму, которые показывает значительные изменения структуры белка вокруг триптофановых остатков и экспонирование днсульфидных мостиков при отсутствии значительных изменений во вторичной структуре.

Рис.19. Влияние концентрации гуанидиигидрохлорида на квантбвый выход (А) и положение максимума флуоресценции (Б) нативной (РТВ> и термически модифицированной (тоРТВ) В-цепи рицина.

Вместе с тем, у тоРТВ сохраняются все антигенные детерминанты нативного белка. По-видимому, в результате термической обработки молекула РТВ переходит в промежуточное состояние типа "расплавленная глобула", отличавшиеся еше достаточной стабильность», но более развернутой структурой.

На основании всех изложенных фактов' можно предложить такую модель цитотоксического действия рицина. После связывания о гликопротеидом, содержавши концевую галактозу и имеющим высокое сродство с рицином, токсин попадает в эндосому. После восстановления дисульфидной связи происходит диссоциация субъединиц, но РТА адсорбируется на мембране гидрофобным доменом рядом с РТВ, связанной с рецептором(ами). РТВ взаимодействует своим гидрофобным доменом с другими участками мембраны, что вызывает разворачивание РТВ, экспонирование гидрофобных аминокислотных остатков и слияние мембран в этом участке. При этом и происходит трансмембранный перенос РТА.

Экспериментальная проверка предложенной модели возможна с помоаью набора мутвнтных РТВ.

Рис.20. [1Н]-ЯМР спектр нативной (А), термически

модифицированной <г) и денатурированной В-цепи рицина (С).

концентрация белка, Н

Рис.21. Зависимость от концентраиин шпотоксического действия токсинов и изолированных субъедннии на НиТ102 клетки.

Нами впервые была получена рекокбихантиая РТВ (рРТВ), не отличаюпаяся по своим галактозосвязываюжим свойствам от иативкого белка. Ранее утверждалось, что получение активной

негликоаилированной рРТВ невозможно [Нияе1п е! а1. , 1987]. С помояью 4 монАТ показали, что антигенные свойства нативной и рекомбинантной РТВ подобны. Цитотоксическая активность химеры РТА-рРТВ сравнима о активностью нативного рицина (рис.21), а наблюдаемое различие объясняется, по-видимому, больпей чувствительностью к протеазам рРТВ.

II. ИКИУНОТОКСИНЫ ПРОТИВ В-ЛИМФОЦИТОВ.

Выбор клвток-миаеней определяется наличием антигена-маркера на поверхности. Для первого поколения иммуиотоксииов характерны коньюгаты токсинов с поликлональными антителами против целых клеток ГУ11в1Ла а1., 1987]. Избирательность действия таких препаратов невысока. Ко второму поколению иммунотоксиков относятся конъюгаты с поликлональными антителами против определенных антигенов на поверхности клеток. Сложности, связанные с выделением в достаточных количествах поверхностных антигенов-маркеров ограничивают возможность получения поликлональных антител. Иммуноглобулины (1й) присутствуют как на поверхности В-лимфоцитов, так и в большом количестве в плазме крови и являются одними из наиболее изученных клеточных рецепторов. 18 - гликопротеиды, состояшие из двух (Юлегких (мол.масса - 25 кДа) и двух (Н) тяжелых'цепей (мол.масса от 50 до 75 кДа), которые соединены между собой дисульфидными связями. Ьи Н-цепи состоят из доменов (по 110 аминокислот), а в каждой цепи Н-концевой домен обладает уникальной последовательностью, которая характерна голько пяя 1й, синтезируемых одним клоном В-лимфоцитов. Эти уникальные вариабельные районы образуют два актиген-связываюаих центра. Опухолевые В-лимфоциты, несущие на поверхности иммуноглобулины, являются одними из наиболее распространенных злокачественных клеток и представлют огромный интерес как для изучения, так и применения иммунотоксиков [УНе^а е1 а!.. 1991]. В данной работе были использованы поли-и ноноклональные антитела против легких цепей иммуноглобулинов человека. Активность полученных ИТ проверяли на клетках-мишенях.

хесусих и не несущих иммуноглобулины. Лг сазано, что иммунотоксины обладают высокой избирательной активностью (рис.22). Действуюжур концентрацию препаратов определяют по концентрации токсического агента. Величина, которая характеризует активность, определяется как концентрация препарата, при которой наблюдается 50% ингибирование включения метки в клетки-мишени. Ока получила название 50% доза ингибирования и обозначается HfljQ. Активн сть препаратов с поликлональными антителами примерно в 10 раз ниже, чем с ноноклокалькыми. Это объясняется тем, что в гетерогенной популяции поликлок. AT только 10Х молекул взаимодействует о L-цепями -типг на поверхности данных клеток-мишеней. Проведе' о сравнение активности кокьюгатов на основе A-цепи рицина и К-Фрагмента дифтерийного токсина. Цитотоксическое действие препаратов с A-цепью оицина несколько выве. Важно отметить, что эффективность коньюгирования. т.е. X конъюгатов от количества используемых антител, составляет для .'-цепи рицина 7S-85X и значительно ниже для A-фрагмент» дифтерийного токсина - 15-20Х. По-видимому, одна из причин - наличие подвижного фрагмента у N-концевого цистеина. Поэтому, в дальнейшем были использованы препараты с А-цепьп рицина.

Чем выше специфичность антител против иммуноглобулинов. тем меньше популяция нормальных '.леток, которые будут элиминированы вместе с опухолевыми при обработке ИТ. В структуре Ig выделяют легкие и тяжелые цели, у которых имеются межвидовые, несколько уровней внутривидовых различий, а также антигенные детерминанты, характерные только для данного Ig. Описанные выше ИТ не обладали высокой специфичностью для популяции В-лимфоцитов, так кок в плазме имеются иммуноглобулины с такими же антигенными детерминантами. Это ограничивает изучение свойств коньюгатов. in vivo. Применение подобных ИТ эффективно для удаления опухолевых клеток из аутологичного костного мозга при тре плантации. Использование ИТ in vivo - перспективная, но и наиболее трудная задача. Для ее решения разработаны модельные системы., как правило с применением мышей nude. В Даккой работе впервые разработана новая модель с использованием линейных крыс . Вектором ИТ служили моноклональные антитела к одному из аллельных вариантов L-цепей Ig крысы (Igk-la). При скрещивании самок лини» MSU (Igk-lb) с самцами линии AUG (Itfk-la) у гетерозиготного

2,6

потомстве имеются В-лимфоциты, несущие на поверхности le либо с одним, либо другим аллотипами (правило аллельного исключения). На ранней стадии развития новорожденного животного в крови присутствуют в основном только материнские Ig . Это позволяет использовать in vivo ИТ с анти-аллотипическими АТ.

Рис.22. Зависимость от концентрации цитотоксического действия иимунотоксинов и контрольных кснъвгатов на клетки мииени. а: 1, действие иммунотоксина, содержащего моноклональные антитела на клетки лимфомы; 2, действие контрольного коъюгата,содержащие моноклональные антитела, не реагирующие с клетками лимфомы; 3, действие иммунотоксина на опухолевы эритробласты человека К562, не несущие на поверхности 1йв. б: 1, . действие иммунотоксина, содержащего поликлоиальные антитела, на клетки лимфомы; 2, действие контрольного коныогата, содержащего неиммунные 1вб кролика.

Избирательность действия проверили in vitro при обработке спленоцитов гетерозиготных крыс. Дало клеток, несущих L-цепи соответствующего аллельного варианта, ощ-еделяли с помощью иммунофлуоресцекции. Цитотоксическое действие препаратов in vivo оценивали по влиянию на продукцию В-лимфоцитами иммуноглобулинов, содержащих L-цепи определенного аллотйпа. На 10 день после рождения, когда в сыворотке животных концентрация Ig с 1а аллотипом примерно 7x10"^ иг/мл и 5 мг/мл с lb-аллотипом. препараты ИТ, изолированных AT и РТА вводили однократно,

Конимтрация А'цгпа рицина, М

внутрибрюшикко в 0, 5мл ФСБ. Через 20 дней наблюдали примерно двухкратное уменьшение синтеза Xg с 1а аллотипон после обработки МТ (25 мкг не животное). Подобный эффект не наблюдается после заедания 50, мкг РТА. Во всех случаях введение препаратов не влияет на уровень Ig о lb аллотипом. Видно, что эффективность дейотвия ИТ при введении животным значительно ниже, чем .при обработка в культуре. Предложенная модельная система явля :Тоя весьма перспективной, несмотря на имеющиеся технические трудности. В дальнейпеи работа была ограничена модельными системами, » которых клетки-нишени обрабатываются ИТ только in vitro.

III. ИНИУНОТОХСИНН ПРОТИВ ЭРИТРОБЛАСТОВ.

Одно из основных направлений исследований при создании ИТ поиск новых антигенов-маркеров клеток-ми. еней и получение антител против них. В данной работе был идентифицирован и изучен антиген эритробластов ' (АГ-ЭБ). Существование данного маркера ' было описано ранее [Иевлева и соавт., 1976]. Впоследствии были получены монАТ против АГ-ЭБ человека и мыви. С помощью аффинной хроматографии на колонке с фиксированными монАТ НАН9 (против АГ-ЭБ человека) и с помощью метда копреципитаиии (Абелев и соавт., 1988], используя монАТ НАЕ15 (против АГ-ЭБ мыши), были показано, что в обоих случаях АГ-ЭБ - белок с мол.массой примерно 65 КЛа. По-видимому, имеются значительные различия в аминокислотной последовательности, так как не удалось получить AT. реагирующих с обеими молекулами АГ-ЭБ.

Данный антиген присутствует на 36% КОЕ-Е. 93-95Х ядерных г^итроидкых клеток и не обнаружен на ВОЕ-Е, КОЕ-ГЕНН, КОЕ-ГН,- на зрелых неэритоидных гемопоэтичееких клетках и на эритроцитах. Отсутствие его на стволовых клетках и эритроцитах делает данный ант..ген идеальной мишенью для ИТ как при использовании in vitro, так и in vivo. Возможность направленной элиминации клеток, несущий-АГ-ЭБ, было изучено как на опухолевых клетках мыши, так и человека. На рис.23 представлена зависимость цитотоксического действия ИТ от концентрации.

Кроме того, была разработана модельная система, соответствующая требованиям обработки костного мозга при

трансплантации: полков удаление опухолевых клеток и сохранение здоровых стволовых кроветворных клеток, что позволит восстановить нормальный темопоэз у больного, подвергшегося интенсивной химио-и/ияи радиотерапии. Возможность такой избирательной лиминаиии опухолевых клеток изучена в навей работе с помощью метода селезеночных колоний.

Рис.23. Зависимость от концентрации цитотоксического действия НАЕ9/РТА ИТ и контрольного конъюгата на клетки мишени К562.

Использовали перевиваемый клетками печени эритролейкозных мышей линии АКИ штамм РАЛ. При внутривенном введении клеток РАЛ у необлученных мышей в селезенках формируются колонии опухолевых клеток. Число таких колоний линейно зависит от дозы введенных клеток. Клетки РАЛ, несущие АГ-ЭБ, обрабатывали в течение 30 мин при 37°С ИТ и после 2-краткой отнывки вводили внутривенно группам из 6-7 мышей АК1?. Число клеток в пробе - 3,2x10^, каждой мыши вводили по 4x10^ клеток. Колонии подсчитывали на 11-й день после введения клеток РАЛ (табл.З).

По аналогичной схеме проводили опыты по подавлению роста колоний стволовых кроветворных клеток (неспецифическое действие ИТ). Облученным (850 рад) мышам АК(1 вводили по 2x10^ клеток сингенного костного мозга, обработанного ИТ. либо контрольным конъюгатом, содержащим нормальный 1й крысы. Колонии подсчитывали на 9 день после введения костного мозга. Активность ИТ и контрольного коньюгата не различаются. ИТ обладает высоким избирательным цитотоксическим действием на опухолевые клетки, но

не стволовые кроветворные клетки.

Таблица 3. Влияние ИТ, содержащего РТА и НокАТ против дифферекцировочкого АГ »ритробластов мыви на роот in vivo опухолевых эритробластов и нормальных стволовых кроветворных клеток.

Обработка Число колоний опухолевых Чиоло колоний стволрвых

эритробластов на селезенку клеток на селезенку

(без облучения) (облучение - 850 рал)

1. Буфер 10,7 5,5

2. ИТ. 2хЮ~'М

0,0 3,0

1. Контроль-

ный конъ- -

огат» 2x10"'И

4.1 2.8

4. Изолиров.

ИснАТ

против

АГ-Эб мы-

ши. 10"6Н 10,2 5.5

В дальнейшем, полученные результаты и описанные методические подходи были использованы нами при работе о ИТ против Т-

лимфоцитов человека.

IV. ИМНУНОТОКСИНЫ ПРОТИВ Т-ЛИНФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА.

Удаление опухолевых и олоеделенных популяций нормальных Т-линфоцитов человека необходимо при терапии различных заболеваний. Особый интерес вызывает применение ИТ для элиминации Т-клеток из донорского костного мозга ex vivo перед пересадкой для профилактики реакции трансплантант против хозяина (РТПХ). а также при лечении пациентов с тяжелой стероидоустойчивой РТПХ. развившейся после пересадки аллогенного костного мозга [Blakey et al. 1986]. Весьма перспективно применение ИТ при лечении пациентов с ревматоидным артрите« и другими тяжелыми аутоиммунными заболеваниями [Pastan. 1986]. В данной работе- были получены и охарактеризованы ИТ, содержащие А-субьединицу рицина и монАТ против дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов СЛ5. СД7 и общелейкоцитарного - СД45. На примере анти-СД7 ИТ представлены

результаты избирательного цитотокеического действия (Рис.24).

Успешное применение ИТ при обработке костного мозга возможно при условии сохранности стволовых клеток. В табл.4 представлении результаты экспериментов по влияние ИТ на образование Х05-ГМ (колоние-образующие единицы - гранулоцитарный макрофагальиый вариант) клетками костного мозга больных.

Видно, что наблюдается хорошая сохранность стволовых клеток. Известно, что после хинио- и радиотерапии клетки костного мозга весьма чувствительны к различным воздействиям. Это, по-видимому, объясняет значительное уменьшение количества КОЕ-ГН при обработке костного мозга больного лимфосаркомой. Однако, полученные результаты однозначно указывает на возможность клинического применения данных препаратов. После проведения' необходимых токсикологических исследований было показано, что данные ИТ соответствует всем требованиям, предъявляемым к препаратам такого класса, и било получено разрешение нв ограниченные клинические испытания на базе Онкологического научного центра РАМН.

Таблица 4. Образование КОЕ-ГИ в полужидкой среде.

' Обработка Количество КОЕ-ГН на 10ö клеток костного мозга

I II III

среда анти-С05/Рд анти-С07/Ра анти-С045/РА Все ИТ вместе Рицин Ю~10М 20±12 23t8 2?t9 25tl3 27t9 отсутствуют 19t8 22t7 12tl2 9+B 5+2 отсутствуют ll±.l 7±3 отсутствуют

Концентрация ИТ 10~ВМ, смесь ИТ - 3xlO"öH;

I - костный мозг больного хроническим миелолейкозом-,

II - костный мозг больного лимфосаркомой;

III - костный мозг больного лимфогрануломатозом.

Активность ИТ, содержащего РТА, примерно в 100 раз ниже 1 активности нативнлго рицина. Выяснение причины такого различия и поиск способов усиления действия конъюгатов - одна из основных задач данной работн. Была изучена зависимость активности препаратов от числа и скорости интернализации рецепторов. Полученные результаты позволяют выделить следующие тенденции:

активность препарата выше при а) наличии большего числа мест связывания на клетке-мишени, б) более высокой скорости иктерналиэации рецептора-маркера, в) увеличение времени жизни ИТ во внутриклеточных компартментах с помощью лизооомотропных агентов. Последнее положение особенно наглядно представлено при использовании лизосонотропного агента НН^СХ, который при инкубации с клетками способен увеличить рН в лизооомвх до нейтрального, ингибируя протеаэы, находящиеся в этих органеллах.

анти-С01/Р., Н.

Рис.24. Цитотоксическое действие анти-С07/РТА иммунотоксинов на г етки линии УигкаЪ и лимфоиы Бэркитв ЕВЗ. Время инкубации клеток 48 часов.

1, обработке клеток линии Уигка1 ИТ в присутствии 20 мН галактозы; 2, обработка клеток линии Уигка1 ИТ в присутствии 20 мН злактозы и 10 мИ НН4С1; 3. обработка клеток линии ЕВЗ ИТ; 4, обработка клеток линии ЕВЗ ИТ в присутствии 20 нН галактозы; 5. обработка клеток линии ЕВЗ ИТ в присут-твии 20 мН галакто-м» и 10 мН ЫН4С1.

Другим способом повышения активности конъюгатов является использование новых цптотоксических атентов.

Значительная разница в ИД^ц коншгятов с Р'ГА и ришша

указывает на потенциальную возможность получения ИТ с активностью» сравнимой с активностью нативного токсина. Кроме того, и каталитические субъедикицы других растительных токсинов является потенциальными кандидатами на роль цитотоксической части ИТ. Одна из проблем при длительном применении ИТ - появление AT против конъюгата. Успехи, связанные с получением рекомбинанткых Фрагментов AT, позволяют уменьшить антигенность вектора. Отсутствие обоих антигенных детерминант у РТА и ВТА показано с помощью конкурентной ELISA. Это позволит использовать последовательно ИТ о РТА и ВТА.

В напей работе был использован токсический лехтин из Омелы белой (VisQun albuo). Подобно рицину, вискукик состоит из xsys. субъедияиц, связанных дисульфидной связью. ВТА '(А-оубъедшшца вискумина) - выоокоспецифическая В-гликозидаза, а ВТВ '(8-субъедипица вискумина) лектин, имеющий два центра связывания галактозы. Активность ИТ на основе анти-СД5 ионAT и ВТА примерно в 80 раз выше, чем у конъюгата с РТА и сравнима с действием нативного вискумина. С помощью НН4С1 удается еще в .20 раз уменьвить значение ИД50. Эти данные послужили причиной для детального изучения структуры вискумина и особенного ВТА. При изучении с помощью метода собственной флуоресценции влияния pH, температуры, гуанидингидрохлорида на структуру ВТА и РТА на было выявлено значительных различий. Совместно с др. Д.Крэббом была проведена работа по определению аминокислотной последовательности ВТА и ВТВ. Наблюдается гомология до 20Х между соответствующими субъединицами рицина и вискумина.

Для дальнейшего изучения особенностей действия ВТА, как цитотоксической части конъюгатов, был получен "химерный" токсин ВТА-РТВ. Для повышения эффективности конъюгирования SH-группа РТВ была активирована с помощью дитио-бис-нитробекэойной кислоты (реактива Эллмана). После разделения с помощью гель-фильтрации от непрореагировавших молекул РТВ и ВТА гетеродимер был охарактеризован электрофоретически, иммуноблотингом и в конкурентной ELISA. Видно, что РТВ в составе гетеродинера сохраняет свои галактозосвязывающие свойства. Сравнили цитотоксическое действие конъюгата и нативных токсинов (рис.25А). Видно, что активность "химерного" токсина примерно в 3 раза выше

концентрация белка, Н концентрация бедка, Н

Рис.25. Цитотоксичеокое действие рицина (1), гибридного токсина, содержащего А-цепь В1 жумина и В-цепь рицина (2), вискунина (3) на клетки линии Уигкай без (А) и в присутствии хлорида аммония (Б).

активности вискунина, ко значительно ниже активности рицина. Ьднахо добавление 1Ж4С1 значительно увеличивает ИД50 РТВ-ВТА (рис.25Б). Эти результаты указывают на то, что ВТА является весьма перспективным агентом при получении ИТ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Описанные в данной работе токсины и конъюгаты на их основе являются как удобными моде, -«ми для изучения внутриклеточного транспорта и механизма трансмембранного перекоса бел^оь. так новым класссм фармакологических препаратов направленного действия. Одним из результатов работы стало получение стабильной рвкомбинантной В-цепи рицина, что делает возможным с цомьщыо направленного мутагенеза получение новых белков, необходимых для детального изучения механизма траиемембранного переноса каталитических субъединиц. Этому ты-л:е способстьует наличии модели данного процесса, предложенное в работе.

Особый интерес вызывают сравнительные исследования структур различных каталитических субъединиц и ИТ на их основе. Дополнительным толчком этому послужили данные о высокой

цитотоксической активности коныогата с А-цепьг вискумина. Важной задачей, вытекающей из результатов нашей работы, является ' определение аминокислотной последовательности вигкумина и проведение рентгеноструктурного анализа данного белка, получение клеток-мишеней, устойчивых к действии токсинов. Эти вопросы являются предметом дальнейших исследований.

Одним из результатов данной работы стало утверждение двух клинических протоколов на ограниченное применение полученных ИТ. Одно из возможных направлений развития прикладной части связано с созданием универсальных конъсгатов. В данной работе были получены три разных вида универсальных ИГ. Их особенностью является то, что они не оказывают прямого цитотоксического дейотвия на клетки-мишеии, а применяются последовательно с антителами против рецепторов-маркеров. Связывание универсального ИТ и антитела осуществлялось за счет взаимодействия авидин биотин, антиген - антитело и иммуноглобулин - белок А из Staphilococcus aureus. В первом случае в качестве ИТ использовали конъюгат авидина и РТА. Последовательная обработка клеток-нИшеней биотинилированными антителами и коиъюгатом авидин-РТА приводит к избирательному элиминированию, однако эффективность такой обработки примерно в раз ниже, чем прямого ИТ. Примерно подобный результат был получен и при использовании коныогата РТА и поликлональных AT против Ig мыши, котроый также уступает по активности пряному конъюгату анти-СД7 - РТА. При добавлении в культуральную среду HH^Cl наблюдается примерно 10 кратное усиление действия, как и для прямого ИТ. Это указывает на сходный внутриклеточный транспорт, а различия в обоих случаях возможно обусловлены значительным увеличением размеров комплекса ИТ-рецептор.

Особый интерес вызывает получение и изучение цитотоксических свойств ИТ нового поколения - химерных рекомбинантных белков, одним из самых простых является конъюгат А-белка из Staphilococcus aureus, способного взаимодействовать с Ig, и каталитической субъдиницы псевдомонадного токсина. В составе коныогата обе части сохрняют специфические свойства. Однако при последовательной обработке клеток-ммшней антителами и химерным белком не наблюдается избирательного цитотоксического действия. По-видимому, причиной является отсутствие легко восстанавливаемой

яисульфидкой связи между беякои-вект->ром и каталитической субъединиией, что делает ке возможным транснембранный переноо ее з цитоплазму клетки-мишени. Подобный результат получен хами для химерного рекомбинантмого белка, содерхапего в качеств* вектора имтерлейких 2 человека и фрагмент псевдомокадкого токсине. Создание активных химерных токсинов - предмет дАЛЪнейаей работы.

ВЫВОДЫ

X. Проведено изучение особенностей структуры растительных токсинов р1 ина, вискумииа и вбрина и их изолирована"* оубъедикиц; влияние рН, температуры, денатурируюцих агентов. Установлено, что отсутствует сувественкое взаимодействие мвпду РТА и РТВ в составе оицина на уровне их вторичной и третичной структуры. Термостабилькость нативного токсина выше, чем у изолированных субъединиц и увеличивав- ся при понижении рН. Полоаение пах спекторов флуоресценции триптофанов у нативных токсинов не зависят от рН 8 диапазоне от 3 до 6, в то время,' как изменения этого параметра для В-субъединиц рицина и вискумииа указывают на структурный переход при рН<5. При этом увеличивается доступность остатков триптофана тушителям, что свидетельствует о разрыхлении структуры белка

2. Показано, что восстановление дисульфидной связи между субьединицами рицина происходит после эндоцитоза и протекает достаточно быстро: через 10 мик. примерно 20Х , а через 30 мин. более ЗОХ токсина не имеют З-Э связи между субьединицами. Высокая скорость обусловлениа тем, что дисулъфидная связь экспонирована • на поверхности токсина и образована цистеинами, принадлежащими

эдвижиык участкам молекулы. Возможно, наличие таких участков необходимо нг> только для трансмембранного переноса А-субъединиц, но и для их функционирования, как М-гликозидаз.

3. Впервые показана специфичность во взаимодействии субъединиц токсинов. Оценили Ка между РТВ . и различными каталитическими субъединицами и определили влияние рН на этот процесс. Не обнаружено достоверного взаимодействия с гелонином и А-фрагмонтом дифтерийного токсина; Ка с ВТА равна при рН 7,4 и Ь, 5 соответственно, для РТА Ка 1,Вх 106М"и г.ЭхЮ^"1. Обнаружена прямая корреляция между цитотоксической активностью

химерной молекулы и степенью сродства ее составных частей.

4. При связывании токсинов и их субъединиц с клетками можно выделить два типа типа взаимодействия. Одно опосредовано В-субъединицами и ингибируется добавлением в среду галактозы. Показано, что оно зависит от рН среды и имеет оптимум при рН 7.0. На поверхности клеток-мипеней удалось выделить две популяции мест связывания рицина. Примерно 5% высокоаффинных рецепторов имеют Ка 10""*® Н. и 95Х рецепторов - Ка 10~®М. При обработке клеток ганглиозидом <3ш1, принадлежащим ко второй группе рецепторов, удается примере в 5 раз увеличить число мест связывания рицина, однако эффективность действия токсина уменьшается в 3 р&эа. Увеличение в 12 раз мест связывания обоих типов после обработки клеток нейраминидазой приводит к 5-кратному усилении действия рицина. Полученные данные указывают, по-видимому, на важную роль высокоаффинных рецепторов в реализации ингибируюдей активности токсинов.

5. При понижении рН среды уменьшается связывание аативиых токсинов и увеличивается связывание изолированных субъединиц и особенно А-субъединиц, которое не ингибируется галактозой. С помощью флуоресцентного красителя калъцеина показано, что А-субъедииица рицина способна встраиваться в мембрану при фазовом переходе бислоя. В этих же условиях В-субъединица рицина вызывает слияние липосом, содержащих ганглиозид Ов1, который является рецептором для рицина. Кроне того, связывание РТВ приводит к снижению кооперативности Фазового перехода.

8. При концентрации ганглиозида 0и1 10 ИХ РТВ вызывает агрегацию липосом. Этот процесс ингибируется галактозой либо эквимолярным количеством РТА. Нативный рицин и изолированная РТА не вызывают агрегации. Не происходит агрегации липосом, содержащих 2,4,8 МХ ганглиозида.

7. Предложен высокочувствительный метод определения связывания белков с клетками. По изменению подвижности флуоресцентного липидного зонда- антрилвинил-меченного Сфингомиелика, оценили изменения в липидном окружении рецепторов токсинов и антител на клетках-мишенях. В обоих случаях наблюдается повышение поляризации флуоресценции зонда, которое достигает насыщения при аккупации примерно 10Х рецепторов.

8. Изменения в структуре токсинов после связывания с мембраной

оценивали по изменению собственной «лу ресценции и анизотропии вращения лансильной метки. Наблюдается падение квантового выхода и длинноволновый сдвиг спектра флуоресценции, что указывает на разворачивание белковой глобулы и экспонирование триптофаковых остатков.

9. Инкубация РТВ в бораткон буфере с рН 9,0 при 37°С приводит к потере галактозосвязываспай активности, но сохраняет вспомогательные свойства при трансмекбранном перекосе РТА. Проведено изучение особенностей термически обработанной РТВ. Показано, что белок претерпевает значительные структурные изменения: щ исходит длинноволновый сдвиг положения максимума и увирение спектра триптофаковой флуоресценции, денатуроционкый переход, вызванный действиен гуанидингидрохлорида, характеризуется снижгчной кооперативностью и происходит при меньших концентрациях денатурирующего агента, возросла доступность триптофанов к тушителям. В с актре *Н-ЯНР термически обработанной белка наблюдаются уоирение и различия сигналов аромьтическОЙ 'области и значительное усреднение межостат'очных взаимодействий. Но обработка не приводит к полному разворачиванию структуры, сохраняются все антигенные детерминанты нативного белка. Предположено, что в результате обработки РТВ переходит в промежуточное состояние типа "расплавленная глобула". Предложена новая модель цитотоксического действия рицина.

10. Разработан новый метод по ренатурации рекомбинатной РТВ, который может быть применен лля других лектинов. Впервые получена стабильная рекомбинанткая РТВ, не отличающаяся по своим галактозосвязываюпим свойствам от нативного белка. Изучены свойства химерного токсина РТА- рекомбинантная РТВ.

11.' В работе описано четыре поколения иммунотоксинов, которые различаются п'» своей эффективности и избирательности действия на клетки-мишени. В модельных системах, содержащих В-лиифоииты чел века или крысы показано, что кокъюгаты на основе антител против расположенных на поверхности клеток-мишеней, обладают направленным иитотоксическнм действием. Однако активность ИТ на основе РТА примерно в 100 раз ниже активности нативного токсина.

12. Охарактеризованы новые специфические антигены на поверхности эритробластов мыши и человека. В обоих случаях это белки с мол. массой примерно 85 кДа. которые имеют различные аминокислотные

последовательности, так как не удалось выявить обоих антигенных детерминант с помощью поли- и моноклоиальных антител. ИТ, оодержакие имоноклональные антитела против данных антигенов обладает избирательностью действия на соответствующие клетки-мивени и не оказывают заметного цитотоксического действия на стволовые клетки. Разработана новая модельная система для изучения коньюгатов данной специфичности.

13. Получены и охарактеризованы ИТ, содержащие РТк и моноклональные антитела против СЛ5, СД? и СД45 антигенов на поверхности Т-лимфоцитов человека. Коныогаты обладают избирательным цитотохсическим действием на клетки-ииявки и не оказывают значительного влияния на рост стволовых кроветворных клеток. Изучен« роль числа рецепторов, скорости г эндоцитоза а развитии ингибируюиего ■ действия указанных ИТ. Показана возможность повышения активности ИТ с помощью лизосомотропного агента NH4CI. Разработаны оптимальные условия применения данных препаратов при обработке костного мозга перед трансплантацией.

14. Впервые описан ИТ на основе Л-субьединицы растительного токсина вискумина и анти-СД5 антител. Активность данного коньюгата примерно в 80 раз-выше активности ИТ на основе А-субъединицы рицина и сравнима с активностью нативного вискумина. Не обнаружено общих антигенных детерминант у РТА и ВТА. Последовательное применение ИТ с этими белками позволяет избежать проблем при появлении антител против токсинов при многократном введении препарата.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕНЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тоневицкий А.Г., Трахт И.Н. "Циготоксические свойства йниунотоксина, взаимодействующего с миеломными клетками мыви." ДАН, 1984, т.277, н.З, стр.756-759.

2. чл.-корр. АН СССР Гельфандт И.М., Ибрагим э А.Р., Рохлин О.В., Слесзрев А.И., Тоневицкий А.Г. "Исследование характера взаимодействия легких цепей иммуноглобулинов с иммобилиэированными тяжелыми целями." ДАН, 1984, т.274, н.1, стр.202-206.

3. Нечетнер Е.Б., Иевлева Е.С., Ходцев A.C., Тоневицкий А.Г., Розинова Э.Н., Полторанина B.C. "Моноклональные антитела к антигену эритробластоа мыши." ДАН, 1985, т.282, н.2, стр.478-480.

4. Тоневицкий А.Г., Нечетнер Е.Б., Розинова Э.Н., Иевлева Е.С.

"Избирательное иитотксическое дейс чие иммунотоксика на опухолевые эритроидные клетки мыши." ДАН, 1985, т.282, н.2, стр.485-488.

5. Тоневицкий А.Г. "Избирательная цитотокеичность конъюгата антитело-А-цеш> рицина для опухолевых клеток человека." Нол.биол., 1985, т.19, н.4, стр.1054-1041.

6. Накевич E.H., Тоневицкий А.Г., Бергельсон Л.Д. "Изучение связывания В-субьединицы рицина с клетками лимфомы Беркитт с помощью специфических флюоресцентных зондов. Новый подход к исследованию аиганд-рецепторных взаимодействий." Биол.неибр., 1085, т.2, н.5, стр.477-482.

7. Авдохин П.В., Тоневицкий А.Г., Григорян Г.Ю. "Активация входа Са2+ в клет-и В-субъединицей рицина." Биол.мсхбр., 1985, т.' . н.8, отр.800-J05.

8. Брехеотовский П.Д., Бахрамов А.Х., Жукова О.В., Тоневицкий А.Г. "Взаимодействие B-цепи рицина о мембраной вызывает повышение внутриклеточной хояцг 1трации кальция." Биол.мембр., 1985, т.2, к.11, стр.1101-1107.

9. Нечвтнер Е.Б., Тоневицкий А.Г., Иевльва B.C., Розиновь З.Н. , Зорин В.Л. "Ноисклокольное антитело НаЕЗ направлено против антигенной детерминанты гликофорина А человека." Биол.мембр..

1986, т.З, к.8," отр,798-803.

10. Тоневицкий А.Г., Буоуев В.Н. ' "ЯМР-исслодование конформации рицина. Высокая подвижность Н-концевых участков к- и В-субьедикиц." Нол.биол.. 1987, т.21, н.6. стр.1688-1893.

11. Тоневицкий А.Г., Жукова С.С., Тимофеева Н.В., Бергельсон Л.Д. "Влияние ганглиозидлв Gml и Gd3 на связывание, интернализацию и цитотоксическую активность рицина." Нол.биол., 1987, т.21, к.6, стр.1694-1701.

12. Бупуе: 1 Т.Д., Тоневицки. А.Г. "Влияние pH на конформацию и стабильность структуры растительного токсина рицина." Нол.биол..

1987, т.21. н.2. стр.414-420.

13. Тоневицкий А.Г., Накевич E.H.. Жукова О.С . чл.-корр. АН СССР Бергельсон Л.Д. "Изучение взаимодействия антител с клетками с помощью ликидных флюоресцентных зондов." ДАН. 1968. т.286, и.6, стр.1505-1508

14. Бушуева Т.Л., Тоневицкий А.Г., Найсурян H.A. "Сравнение действия pH и температуры на конформации связывающих субьедпикц растительных токсинов рицина и лектина омелы 1." Нол.биол.. 1988, т.22; н.2, стр.493-497.

15. Бушуева Т.Л., Тоневицкий А.Г.. Киндт А.. Франц X. "Стрктура токсичного белка - лектина из омелы - при различных pH: исследование методом собственной флюоресценции." Нол.биол., 1988. т.22. к.3, стр.628-634.

16. Тоневицкий А.Г.. Жукова О.С., Рахманова В.А.. Арсеньева Е.Л..

Богачева Г.Т. "Избирательная цитотоксичность конъпгата антитело-А-цепь рицина для опухолевых В-клеток человека." Нол.биол.. 1988, т.22, н.4, отр.911-916.

17. Тоневицкий А.Г., Топтыгин А.Ю., Маркс У., Филь.ов А.В., Алексеев Л.П. "Избирательная .элиминация Т-лейкозных клеток человека с поноиьо конъюгата А-цепи рицина и ноноклонального антитела против С05-антигена Т-лимфоцитов." ДАН, 1989, т.307, к.6, стр.1507-1511.

18.- Тоневицкий А.Г., Веньяминов С.Ю., Бушуева Т.Л., Найсурян Н.А., Гончарская Н.А. "Влияние рН на структуру изолированных Субъединиц рицина и на их взаимодействие друг с другом." Нол.биол., 1990, т.24, н.2, стр.431-437.

19. Тоневицкий А.Г., Ершова Г.В., Агапов И.И., Топтыгин А.Ю., Короткова 0.В., Шереиков С.Н., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. "Получение и изучение цитотоксических свойств инмунотоксика анти-СР7/А-цепь рицина." ДАН, 1991, т.317, к.З, стр.749-753.

20. Бушуева Т.Л., Урошевич О.И., Иайсурян Н.А., Нириманова Н.В., Тоневицкий А.Г. "Особенность структуры каталитической субъединицы токсинов, ингибирувщих белковый синтез. I.Влияние рН, взаимодействие' с В-цепыэ рицина. Нол .биол . , 1Й91, т.25, н.2, стр.422-429.

21. Тоневицкий А.Г., Нириманова Н.В., Бушуева Т.Л., Омельянеико В.Г., Пфвллер К., Бочков В.Н., Бушуев В.Н. "Структурные и функциональные особенности термически обработанной связывавшей еубъединицы растительного токсина рицина." Нол.биол., 1991, т.25, н.2, стр.451-461.

22. Тоневицкий А.Г., Агапов И.И., Нечетнер Е.Б. "Избирательное цитотоксическое действие иинунотоксина на опухолевые эритроидные клетки человека." Нол.биол., 1991, т.25, н.5. стр.1181-1187.

23. Тоневицкий А.Г., Рахманова В.А., Топтыгин А.Ю., Здановский А.Г., Ершова Г.В., Здановская Н.В., Рункевич Н.Н., Янковский H.R. "Цитотоксические свойства рекомбинантного гибрида А-белка Staphylococcus aureus с фрагментом экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa." Нол.биол., 1991, т.25, н.5, стр.1188-1196.

24. Топтыгин А.Ю., Тоневицкий А.Г. "Имнунотоксины" (обзор). Биотехнология, 1992, 5, с.6-9.

25. Manevich Е.М., Tonevitsky A.G., Bergelson L.D., The Binding of the B-chain of Ricin to Burkitt Lymphoma Cells. A New Approach to Ligand-Receptor Interaction Studies. FEBS Letters. 194:313316, 1986.

26. PrintsevH 0. Yu.., Faernan A.I., Haksimenko A.V., Tonevitsky A.G., Ilinsky O.B., Torchilin V.P., Selective Killing of Smooth Muscle Cells in Culture by Ricin A-chain Conjugated with Honoclonal Antibody to a Cell Surface Antigen via Dextran Bridge. Experientia. 41:1342-1345, 1986.

27. Tonevitsky A.G.. Hechetner E.B., fiosinova E.N., Ievleva E.S.,

Poltoranina V.S., Elimination of Hur'ie Erythroleukenia Sten Cells with a Novel Anti-Erythroid Antibody Conjugated to Ricin A-chain: International Journal of Cancer, 37:263-269, 1966.

26. Hechetner E.B., Tonevitsky AG., Ievleva E.S., Roainova E.H., Popovs O.H.', Identification of a Hunan Erythroid Call Surface Antigen by Monoclonal Antibody KAE9. Exp. Haenatol. 15:355-359, 1987.

29. Bushueva T.L., Tonevitsky A.G. The Effect of pH on confornation and Stability of the Structure of Plant Toxin-Rioin. FEES Letters, 215:155-159, 1987.

30. Bushueva 7.L., Tonevitsky A.G. Sinilarity of Protein Confornation at Low pH and High Tcnpernture Observed for B-chains of Tho Plan* Toxins: Ricin and Hisletoe Lectin 1. FEBS Letter-:. 228:119-122, i.988.

31. Tonevitsky A.Q., Zhukova O.S., Hanevich E.K.. Arson'eva E.L., Bogacheva G.T., Bergelson L.D. Hew Approach to Studies of Cell-Antibody Interaction Using Fluorescent Lipid Probes. FEBS Letters, 238:315-319, 1988.

32. Bushuev V.H., Tonevitsky A.0. High Hobility of N-terninul Parts of A- and B-subunits of Ricin. J. Bionolec, Structure and Dynanics, 6:1061-1070, 1989.

33. Tupitsyn H.H., Hechetner E.B., Baryshinikov A.Y., Drozdova T.S., Frankel H.A., Ievleva E.S:, RiselevA.V., Perilov A.A.. Peterson I.S., P -obatova N.A., Protasova A.K., Roainova E.H., Tonevitsky A.G., G. Volkova H.A. Two Different Anti-Erythroid Monoclonal Antibodies in Irtmunodiagnosis of Hunan Leukenias: a Cooperative Study. Int. J . Ca,.cer , 40. 625-629, 1989. .

34. Tonevitsky A.G., Zhukova O.S., Hirinanova N.V.. Onelyanenko V.G., Tinofeeva H.V., Bergelson L.D. Effect of Gangliosides on Binding, Internalization and Cytotoxic Activity of Ricin, FEBS Lctteres, ;64, 249-252, 1990

35. Bushueva T.L., Hedvedeva N.V., Tonevitsky A.G.. Pfuller U.. Fiedler S., Franz H. Modification of the-Toxin Hisletoe Lectin I by Liquid Salts at Room Temperature. ESP and Fluorescence Stüdies. Studia Biophysica v.138, p.229-236, 1990.

38. Bushuev? T.L., Tonevitsky A.G., Maisuryan N.A., Kindt A.. H.Franz. The Effect of pH on Confornation and Stability of the Stucture of the Toxic Protein - Hisletoe Lectin 2. In: Kocourck J (ed.) Lectins: Biology, Biochemistry, Clinical Biochenistry, v7. Signa Chemical Company, St.Louis Hissouri, USA 179-185, 1990

37,. Tertov V.V., Sobenin I.A., Tonevitsky A.G.. Ocekhov A.H.. Soirnov V.N. Isolation of atherogenic modified (desialylated) low density lipoprotein fron blood of atherosclerotic patients: separation fron native lipoprotein by affinity chromatography. Biochem. Biophys. Res. Commun. . 167, 1122-1127, 1990.

38. Vedernikov Y.P., Graser T.. Vedernikov A.Y., Tonevitsky A.G.

Effeot of Hunan Reconblnant Interlekin-2 on Isolated Rabbit Femoral Artery and Poroine Coronary Artery and Vein. Biomed. Bioohio. Acta v.49. 573-578, 1990.

39. Tonevitsky A.G., Toptygin A.Yu., Pfuller U., BuahuJva T.L., Erahova O.V., Gelbin H., Pfuller K.. Agapov 1.1., Fran« H. Inounotoxin with Hisletoe Lectin A-chain and Ricin A-chain Directed against CDS Antigen of Hunan T-Lynphocytea: Conparison of Efficiency and Specificity. Int.J. Innunophomacology v. 13 1037-1041, 1991