Особенности внутриклеточного транспорта и биологическая активность рицина

Хапчаев, Шамиль Юсуфович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности внутриклеточного транспорта и биологическая активность рицина
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности внутриклеточного транспорта и биологическая активность рицина"

На правах рукописи

ХАПЧАЕВ Шамиль Юсуфович

ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РИЦИНА

03.00.25-03 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003466210

Работа выполнена на Биологическом факультете Московского Государственного Университета (МГУ) имени М.ВЛомоносова.

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Кандидат биологических наук Мойсеиович Михаил Михайлович МГУ имени М.В .Ломоносова, Москва

Доктор биологических наук Егорова Светлана Григорьевна МГУ имени М.ВЛомоносова, Москва

Доктор биологических наук Воробьёв Ивав Андреевич Гематологический Научный Центр РАМН, Москва

Кандидат биологических наук Домогатский Сергей Петрович

ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедгехнологий, Москва

Ведущая организация:

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Защита состоится «21» апреля 2009 г. в 15 час 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском Государственном Университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы Горы, д.1, корп. 12, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.Н. Калистратова

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Рнщш (R60) - токсин из семян клещевины - состоит из каталитической (Л- или RTA) и лсктиновой (В- или RTB) субъсдшшц. RTB связывается с клеточными рецепторами и обеспечивает эндоцитоз токсина. Активность RTA по отношению к 28S рРНК эукгриот влечёт за собой необратимую остановку синтеза белка и приводит к гибели клетки [Rutenber et al., 1991].

Обязательным этапом интернализации токсинов является попадание в ранний эн-досомальный компартмент, дальнейшая транспортировка из которого зависит от того, с каким рецептором произошло связывание. Показано, что из ранних эндосом незначительная часть токсина попадает в эндоплазматический ретикулум (ЭР) [Rapak et al., 1997], но это количество настолько мало, что не выявляется методами электронной микроскопии [Sandvig and van Deurs, 1996].

Устойчивость гибридом, продуцирующих антитела против эпитопов RTA, экранированных в нативном токсине, показывает необходимость разделения субъединиц токсина для транслокации в цитозоль [Бенедиктова и др, 2005]. Но до настоящего времени выявить свободную RTA в клетке пе удавалось.

Мы предположили, что восстановление дисульфидной связи и транслокация в цитозоль происходит в ранних эндосомах. У рицина не обнаружен механизм создания пор, аналогичный таковому у дифтерийного токсина, но некоторые факты создают предпосылки возможности подобного транспорта из данного компартмента. Так, бблыпая часть ин-тернализованного токсина находится в связанной форме с рецепторами люминальной поверхности мембраны ранних эндосом [Moisenovich et al., 2004]. Наличие гидрофобных участков способно приводить к образованию агрегатов токсинов при их высокой концентрации. Агрегаты токсина, взаимодействуя одновременно с несколькими рецепторами, могут приводить к изменениям структуры и нарушению целостности эндосомальных мембран. Гидрофобные участки белков могут взаимодействовать с мембранами и погружаться в них. Отрезок длиной в 12 аминокислотных остатков на С-концс RTA [Lamb et а)., 1985], экранированный в цельном токсине, взаимодействует с бислойными мембранами лучше других гидрофобных доменов токсина. Оптимальными условиями для такого встраивания являются пониженные значения рН. В ранних эндосомах значение рН находится в таком диапазоне и составляет рН 5,5. Такому встраиванию способствует также высокий уровень содержания ненасыщенных липидов и малое количество сфинголипидов и холестерина в мембранах эндосомального компартмента, приводящий к повышенной лабильности данных мембран. Особенности функционирования эндосом приводят к постоянному отпочковыванию и слиянию везикул, что повышает вероятность нарушения

целостности мембран, дестабилизированных агрегатами токсина.

Т.о., выяснение концентрации рицина, взаимодействующего с люминальной поверхностью эндосомальных мембран, является принципиальным для определения возможности транслокации ОТ А из данного компартмента.

Особый интерес к рицину и родственным ему белкам (РИБ2) вызван возможностью создавать на их основе препараты для терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний. При разработке новых препаратов и совершенствовании существующих лекарственных средств на основе РИБ2 чрезвычайно важно минимизировать возможные побочные действия. В частности, необходимо учитывать тот факт, что РИБ2 являются макромолекулами и, по-видимому, могут оказывать различные воздействия на клетку-мишень. В связи с этим детальное изучение свойств разных представителей этого семейства токсинов, напрямую не связанных с ингибированием синтеза белка, представляет большой научно-практический интерес.

Целью работы было изучение динамики образования свободной ЯТА и её накопления в органеллах клеток, предобработанных рицином.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать тест-систему для выявления свободной КТА внутри клетки. Используя эту тест-систему, изучить динамику накопления ОТА в клетке. Определить ассоциацию А-цепи с клеточными органеллами.

2. Определить концентрацию рицина в эндосомальном компартменте.

3. Сопоставить динамику накопления рицина в клетке с этапами её интоксикации.

4. Изучить эффекты рицина, непосредственно не связанные с остановкой синтеза белка.

Научная новизна работы. На основе полученных моноклональных антител создана уникальная тест-система для определения свободной КТА внутри клетки. Установлено, что время, через которое в клетке выявляется свободная ЯТА, согласуется со временем остановки синтеза белка в предобработанных цельным токсином клетках и составляет =4 часа. Показано влияние А-цепи на митогенную активность и запуск апоптоза.

Практическая значимость. Исследования механизмов взаимодействия рицина с клеткой и, особенно, механизмов транслокации токсина в цитозоль, позволят повысить эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе токсинов; существенно снизить или полностью исключить побочные эффекты, возникающие при их применении; значительно расширить область применения токсинов в клинической практике, в том числе за счет нанотехнологий. Разработанный метод инкапсуляции РИБ2 в полилак-тидную матрицу может быть использован для создания лекарственных препаратов пролонгированного цитотоксического действия.

Апробация результатов и публикации. Результаты работы были доложены на международных конференциях: «Конференция биологического факультета МГУ имели М.В.Ломоносова» (Россия, 2006), «Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology Annual Conference» (USA, 2007), «76й1 Congress of the European Atherosclerosis Society» (Finland, 2007), «Объединенный иммунологический форум» (Россия, 200S), на межлабораторных ссмипарах НИИ трапеплантологии н искусственных органов (НИИТиИО), на межлабораторных семинарах кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ, на межлабораториых семинарах в Биоцсптре Университета им. Гете (Франкфурт-на-Майне, Германия). Апробация диссертации проведена на заседании кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова 24 сентября 2008 г. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура п объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 137 страницах, иллюстрирована 38 рисунками и 3 таблицами. Список литературы содержит 245 источников. .

Материалы и методы

Выявление свободной RTA внутри клеток

Клетки крысиной глиомы С6, мышиных фибробластов ЗТЗ и трансфецированной карциномы человека A431-Rab4-GFP выращивали на покровных стеклах в 2 мл полной среды DMEM + 10% коровьей эмбриональной сыворотки в присутствии токсинов в различных концентрациях при 37°С в течение 24 часов; отмывали от компонентов среды и фиксировали 4,5% ПФА в течение 30 мин. Затем инкубировали с 0,1% Triton Х-100 в течение 10 мин и отмывали 5 раз. Обрабатывали растворами антител в течение часа. Полученные препараты анализировали на микроскопе Zeiss Axiovcrt 200М LSM510Meta («Zeiss», Германия).

Определение концентрации R60 и RTA в лизатах клеток, предобрабо-танных R60.

Клетки линий С6 и ЗТЗ выращивали на чашках Петри 3 суток, после чего добавляли 1 мхг/мл R60 и инкубировали при 37СС и 6% СОг различные временные интервалы. За-

тем клетки отмывали от несвязавшегося токсина холодным раствором лактозы и механически снимали с пластика. Полученную взвесь центрифугировали (7 мин 1500 об/мин). Супернатанты отбирали в новые пробирки, а осадок ресуспендировали в 350 мкл лизи-рующего раствора (0.1М NaCl, 10мМ Na2HP04,1% Triton Х-100 и 1мМ PMSF, рН 7,4), инкубировали при 4°С 20 мин и центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин [Iversen et al., 2001].

Гест-систему lRK2/2RKlbi использовали для определения концентрации R60, а lRAK4/lRAK6bi - для определения концентрации RTA. В качестве контролей использовали лизаты клеток соответствующих линий, не обработанных токсинами.

При построении калибровочных кривых использовали данные для R60 и RTA, разведенных на среде культивирования соответствующих линий клеток. Статистическую обработку результатов проводили в программе «Microsoft Excel 1997».

Получение конъюгатов белков с флуорохромами

Конъюгацию с флуоресцентными красителями проводили по методикам, рекомендованным производителями. Белки переводили в карбонатный буфер (рН 9,0), содержащий 1 М ЫаНСОз, 20 шМ лактозу, и концентрировали до 2 мг/мл. Затем смешивали растворы белка и флуорохромы так, чтобы избыток красителя составлял 25-кратный молярный избыток. Инкубировали с перемешиванием 24 ч при комнатной температуре. С помощью гельфильтрации на колонке PD10 с сорбентом Sephadex G-25 очищали пробы от несвязавшегося красителя. Переводили белок в ФСБ (рН 7,4) и считали соотношение белок / краситель по известным формулам.

Соотношение количества FITC к количеству белка составило: для рицина -4,2; для вискумина - 3,3. Количество групп СуЗ, внесенных в одну молекулу белка, составляло: для рицина - 2,1 группы, для вискумина - 2 группы, для антител серии RAK - 3 группы.

Анализ митогенной активности ингибиторов синтеза белка.

Клетки линии ЗТЗ выращивали на покровных стеклах в 40мм чашках Петри по описанной ранее методике [Rozengurt and Heppel, 1975]. К клеткам в лог-фазе добавляли рицин и цислогексимцд (ЦГИ) в конечной концентрации Ю"10М (для рицина) и 1мкг/мл (для ЦГИ). Через 3 часа после добавления токсинов в чашки Петри добавляли по 20 мкл стокового раствора колхицина (500 мкг/мл) (Fluka AG, Швейцария). Образцы фиксировали 4,5% параформальдегидом и анализировали на конфокальном микроскопе.

Оценка цитотоксических свойств РИБ2. SRB-тест.

Оценку действия цитотоксических агентов проводили путём связывания красителя сульфородамина В с белками по методике [Skchan et al., 1990] с модификациями [Worm et al., 2001].

Клетки в концентрации 10000 кл/мл в 100 мкл среды RPMI1640, ипкубировали в 96-луночных планшетах 24 часа. После этого добавляли по 100 шел токсинов в концентрациях 10"|8-10"'° М для РИБ2 и 0,001-10 мкг/мл доя ЦГИ. Клетки с токсинами инкубировали 5 суток в СОг-инкубаторе в атмосфере, содержащей 6,1% СО2, при 37°С.

Из лунок удаляли 150 мкл среды культивирования. Планшет охлаждали и центрифугировали 7 мин при 300g и температуре 4°С. В лунки добавляли по 150 мкл 20% раствора ТХУ и инкубировали на льду 1 час. Клетки отмывали 5 раз 1% раствором ТХУ и высушивали. Добавляли по 70 мкл SRB в лупку и инкубировали 30 мин в темноте при комнатной температуре. После 4 отмывок 1% раствором ТХУ добавляли по 70 мкл 1М Триса для выхода SRB и 130 мкл дистиллированной воды. Измеряли оптическую плотность при 490 им на спектрофотометре Multiskan ® PLUS - 314.

Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу

Инкапсуляцию вискумина в полилактидный носитель проводили на экспериментальной установке, подробно описанной ранее [Антонов и др., 2008] по алгоритму описанному в статье [Хапчаев и др, 2008]. После выхода токсина из матрицы его свойства анализировали с использованием стандартного МТТ-теста [Agapov et al., 1999].

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

Изображения были получены на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе (Axiovert 200М 510Meta, Zeiss, Германия). Серии оптических срезов получали либо с одного из каналов, либо синхронно с двух. Установку размеров пинхола (pinhole) для получения изображений с высоким разрешением проводили согласно рекомендациям производителей системы. Для получения изображений использовали объективы Plan-Neofluar 40х/1,3 Oil Die, Plan-Apochromat 63x71,4 Oil Die и Plan-Apochromat 100x/l,4 Oil. ГГастройки лазеров и анализирующих фильтров, рекомендованные производителем, подбирались индивидуального для каждого красителя. Диаметр пинхола - 1 диск Эйри (Airy unit), дающий оптимальное соотношение сигнала к шуму. Анализ проводили, используя программное обеспечение Zeiss LSM 51 OMeta Software release 3.2, ImageJ 1.39q, AutoQuant 9.3, Imaris 5.1 и Adobe Photoshop CS2.

Результаты и обсуждение

Тест-система для выявления свободной Я'ГА в клетке.

Для детекции свободной А-субъединицы использовали тест-системы моноклональ-ных антител (монАт) серии ЯАК, дискриминирующей ИГА от цельного токсина [Бенедиктова и др., 2005]. Вероятнее всего, эпитопы, распознаваемые данными антителами, находятся на поверхности области ИГА, экранированной В-субъединицей в составе цельного токсина.

Для разработки тест-системы, способной выявить свободную ИГА в клетке, использовали методы прямой или непрямой иммунофлуоресценции. Показано, что конъюга-ты монАт-флуорохром сохраняют способность выявлять ГОТА (Рисунок 1).

2 т

0.1 0.3 0.5 1 5 10 100 1000

Концентрация антигена (нг/мл)

Рисунок 1. Сохранение ШАК6-СуЗ способности выявлять ИТА.

Конъюгация с СуЗ не изменила свойств монАт 1ЯАК6. После конъюгации антитела распознают свободную ША также как и немодифицированные монАт.

Для выявления свободной ЯТА в клетках использовали метод непрямой иммунофлуоресценции. При использовании прямой иммунофлуоресценции соотношение сигнал/шум оказалось очень низким. Кроме того, было обнаружено неспецифическое взаимодействие конъюгатов с митохондриями. Были выявлены отдельные скопления, содержащие свободную ЮГА (См. Рисунок 2). Детектируемые объекты распределены по всей

цитоплазме и имеют линейные размеры не менее 0,5 мкм, что свидетельствует о том, что это агрегаты из нескольких молекул, либо единичные молекулы ЯТА.

Рисунок 2. Детекция ИТА внутри клетки.

Распределение 1 КАК6-АМ1-А1еха 546 в клетках глиомы Сб. А - изображение клетки в проходящем свете; Б - флуоресцентный сигнал от конъюгатов 1КАК6-АМ1-А1еха 546, изображение получено путем совмещения всех оптических слоев («аПтах»); В - наложение А и Б. Линейка - 10 мкм.

время инкубации с рицином, ч

Рисунок 3. Накопление свободной ИТ А в клетках глиомы С6

Увеличение количества детектируемых объектов во времени. Каждая временная точка - усреднённые значения от подсчета 50 клеток. Динамика накопления ЯТА на других клеточных линиях была аналогичной, и различалась только абсолютными значениями.

Изменение количества RTA в клетке, происходящее во времени, оценивали по количеству детектируемых флуоресцентных объектов. Для этого на изображении, полученном при регистрации флуоресценции от флуорохрома, выделяли объекты, размеры которых превосходили 20 пикселей. После этого подсчитывали количество подобных объектов на 1 клетку. Свободная RTA не детектируется в клетках через час после внесения рицина в среду культивирования. После 2 часов инкубации RTA выявлялась на клетках линий ЗТЗ и Сб. Через 4 часа количество детектируемой свободной RTA возрастает и достигает максимальных значений через 16 часов (См. Рисунок 3).

Использование в ТИФА тест-системы lRAK4/lRAK6-bi позволило выявить А-субъединицы рицина в клеточных лизатах после введения цельного токсина в среду инкубации. Расчёт показал, что на одну клетку приходится от 300 до 450 молекул RTA. Это значит, что детектируемые микроскопическими методами объекты представляют собой единичные молекулы или скопления из 2-3 молекул.

Объём, занимаемый рицином внутри клетки.

Для того, чтобы определить общий объём компартмента, в котором детектируется рицин, было получено 30 наборов оптических срезов с разрешением, при котором реальные размеры пикселя составляют 60 нм. Расстояние между двумя соседними оптическими слоями составило 100 нм. Реальное оптическое разрешение больше данных величин, но такое «избыточное» разрешение необходимо для корректной обработки изображений.

Необработанные данные имели реальное разрешение около 220 нм, однако апертура использованного объектива - 1,4 после математической обработки (деконволюции [Wallace et al., 2001]) позволяет получить виртуальное разрешение =140 нм. После уточнения размеров везикул с помощью деконволюции в программе AutoQuant 9.3. был проанализирован общий объём флуоресцирующих объектов. Для этого обработанные изображения анализировали с использованием программного обеспечения Imaris 5.1. Средний анализируемый объём составляет 540±120 мкм3 до обработки и 215±40 мкм3 после. Ранее показано, что рицин равномерно распределён практически во всём объёме ранних эндосом, положительных по Rab4-FTOa3e [Moisenovich et al., 2004]. Т.о. объём компартмента, содержащего токсин составляет не более 215 мкм3.

время инкубации с рицином, ч

Рисунок 4. Накопление рицина в клетке.

Средние данные по количеству молекул рицина в клетках линии Сб.

Использование твердофазного иммуноферментного анализа позволило определить среднее количество белка в клетке. В течение 4 часов количество рицина в клетке достигает 17000 молекул и остаётся на этом уровне длительное время (См. Рисунок 4).

Показано, что средняя концентрация токсина в везикулярном компартменте, содержащем токсин, составляет не менее 1,31*10"7 М после деконволюции и не менее 5,25*10"8 М в случае необработанных данных. Столь высокая концентрация может приводить к образованию агрегатов из молекул токсина и значительному нарушению целостности мембран, что способно инициировать транслокацию А-цепи в цитозоль.

Количество восстановленной ЯТА составляет 2-3% от количества детектируемого в клетке рицина. Столь малые количества и распределение А-цепи по клетке (отдельные молекулы или кластеры, содержащие несколько молекул), а также отсутствие чувствительных методов детекции, вероятно, и являются причиной того, что раньше обнаружить свободную цепь внутри клетки не удавалось.

Распределенеие свободной ЯТА в клетке

Детекция свободной А-субъединицы в различных клеточных компартментах может свидетельствовать о возможности транслокации КТА из этих компартментов. Ранее показано, что большая часть рицина накапливается в ранне-эндосомальном компартменте [Мо18ештсЬ е! а!., 2004].

Анализ взаимного распределения свободной А-субъединицы рицина и цельного токсина проводили на клетках линий ЗТЗ и Сб. Для этого клетки обрабатывали токсином, конъюгированным с флуоресцентным красителем БИС, после чего выявляли свободную ЯТА и определяли уровень совместного распределения (колокализации).

Рисунок 5. Отсутствие колокализации ЯбО-ПТС и ИТА.

Совместное распределение ЯбО-ПТС (зелёные кластеры) и 1ЛАК6-АМ1-А1еха 546 (красные объекты) на клетках глиомы С6 через 4 часа инкубации с токсином. Перед фиксацией клетки отмыли раствором лактозы для того, чтобы убрать несвязавшийся рицин. Правый рисунок - оптический срез клетки, левый -диаграмма колокализации.

После 4 часовой инкубации с конъюгатом R60-FITC видно, что сигналы от рицина и его А-цепи находятся в непосредственной близости, но в большинстве своем легко различимы. Представлено изображение одной из 50 обработанных клеток (См. Рисунок 5). В левой части рисунка представлена диаграмма, отражающая распределение пикселей обоих цветов. По оси абсцисс отложена интенсивность флуоресценции канала, детектирующего сигнал от RTA (Ch3-Tl), а по оси ординат - интенсивность флуоресценции R60-FITC (Ch2-T2). Уровень сигнала, считаемый шумом (Threshold), выставлен на 50 для обоих каналов. Данная величина представлена на рисунке белой линией. Пересечение 2 линий

Threshold обоих каналов делят диаграмму на 4 части, обозначенные номерами 1, 2, 3 и участок без обозначения. Колокализованными являются только пиксели, попавшие в зону 3 на данной диаграмме. В зонах 1 и 2 находятся пиксели только от одного из каналов, а в зоне без обозначения - пиксели без флуоресцентного сигнала; на правом рисунке - это чёрный фон.

Коэффициенты колокализации рассчитываются как соотношение колокализован-ных пикселей к общему количеству детектируемых в данном канале пикселей и могут быть числами от 0 (нет колокализации) до 1. Расчёт проводят для каждого канала по формулам:

пикселиси8Ci пиксепиСК1ю

Пиксели, с интенсивностью менее уровня Threshold, в подсчёте не участвуют. Интенсивность пикселей роли не играет. Средние значения коэффициентов колокализации для двух каналов равны 0,075±0,009 и 0,329±0,059. Это значит, что 7,5% RTA расположено в тех же компартментах, где и цельный рицин, т.е. большая часть новообразованной RTA практически сразу гранслоцируется из органелл, где накапливается рицин.

Intensity СИ2-Т2

j -щ

О Я 100 150 200 250 Intensity Di3-T1

0 50 1 00 1 50 200 250 Absolute Frequency

Рисунок 6. Распределение Л60 и ИТА через 12 часов инкубации

Клетки глиомы С6 через 12 часов инкубации с токсином. Правый рисунок -оптический срез клетки, левый - диаграмма колокализации. Сигналы от обоих

флуорохромов расположены в одном и том же месте, что внешне выглядит как жёлтые объекты вместо зелёных и красных.

Через 12 часов инкубации с рицином практически весь рицин и его А-цепь оказываются в одном компартменте. 76±4,5% ЯТА и 78±6,3% Я60 находятся в одинаковых ком-партментах, что может быть свидетельством остановки везикулярного транспорта в клетках, обработанных токсином. На диаграмме (См. Рисунок 6) видно, что общее распределение пикселей представляет собой одну область, расположенную на прямой линии, в то время как на начальных этапах интенсивности флуоресценции обоих каналов увеличиваются независимо (См. Рисунок 5). Наличие неколокализованной свободной ИТА объясняется ее выходом из компартмента, содержащего рицин на более ранних этапах. При этом А-цепь распределяется по цитоплазме, что не позволяет увидеть отдельные скопления. Остановка синтеза белка, вызванная ИТ А, транслоцировавшейся ранее, приводит к остановке внутриклеточного транспорта. В результате, новообразующаяся ЛТА остаётся в компартменте, в котором она образовалась и оказывается колокализованной с рицином.

Для определения компартмента, содержащего свободную ЩА, клетки глиомы С6 инкубировали с рицином, фиксировали 4% ПФА и обрабатывали конъюгатом ШАКб-АМ1-А1еха 546 для выявления А-цепи. После этого добавляли маркёры клеточных орга-нелл и анализировали взаимное расположение.

Конканавалин А широко используется в качестве маркёра ЭР. Конъюгат \VGA-ПТС использовали в качестве маркёра ЭР и аппарата Гольджи. Показано, что ЯТА не попадает ни в аппарат Гольджи, ни в эндоплазматический ретикулум (См. Рисунок 7). Также свободная ИТА не обнаружена в ядре, митохондриях и лизосомах.

Накопление рицина в ранних эндосомах показано ранее [М^эепоуюЬ е1 а1., 2004]. Высокий уровень колокализации рицина и его каталитической субъединицы после остановки синтеза бежа и следующей за этим остановки внутриклеточного транспорта, позволяет предполагать, что ЯТА накапливается в ранних эндосомах. Т.о. наиболее вероятным местом в клетке, где происходит восстановление дисульфидной связи с высвобождением ИТА, является ранне-эндосомальный компартмент.

Рисунок 7. Распределение ШАК6-АМ1-А1еха 546 и \VGA-FITC.

Взаимное распределение 1 ЯАК6-АМ1-А1еха 546 и \VGA-FITC в клетках глиомы Сб. А - флуоресцентный сигнал от конъюгатов 1 ЯАК6-АМ1-А1еха 546; Б -флуоресцентный сигнал от конъюгата \VGA-FITC; В - наложение А и Б; Г - наложение В на изображение клетки в проходящем свете. Изображения А, Б и В получены путём совмещения всех оптических слоев («аПтах»), Линейка - 10 мкм.

Митогенное действие рицина

Анализ изображений клеток, предобработанных рицином, выявил незначительное увеличение митотического индекса. Известно, что величина этого показателя для линии ЗТЗ в норме составляет примерно 0,5-1,5%. Для изучения влияния рицина на митотиче-ский индекс культуры и оценки достоверности полученных данных использовали колхицин в концентрации 1 мкМ для увеличения митотического индекса.

25%

Ц 20%

х 2

'| 15%

ь: и

§! 10%

н О ь

5% —

Рисунок 8. Митотический индекс

Клетки инкубировали в присутствии токсинов 4 часа (кроме часовой точки с 1160), после чего добавляли 1 мкМ колхицин, для увеличения митотического индекса.

Инкубация с рицином в концентрации, приводящей к гибели 50% клеток через 24 часа, в 2 раза увеличивает митотический индекс клеток линии ЗТЗ по сравнению с контрольными значениями. Данный эффект связан с активностью свободной ЯТА. Это следует из анализа воздействия смеси свободной ЯТВ и ЦГИ - ¡шзкомолекулярного ингибитора | синтеза белка, который мы использовали в качестве аналога ЯТА. Известно, что ЦГИ инактивирует рибосому так же, как и А-цепь рицина. Воздействие как отдельного ЦГИ, так и в паре с ЯТВ приводит к полному подавлению вступления клеток в митоз.

Обнаружено, что митогенную активность свободная ЯТА проявляет только после транслокации в цитозоль. Так, часовая инкубация с рицином не повышает митотического индекса, а через 4 часа - время, через которое ЯТА накапливается в цитозоле в количествах, достаточных для детекции - митотический индекс повышается (См. Рисунок 8). Данный эффект наблюдается и при воздействии вискумина, что подтвержает наличие подобных свойств у А-цепей других РИБ2. Небольшие различия в действии рицина и вискумина, вероятно, объясняются различными путями внутриклеточного транспорта и могут быть следствием различий в цитотоксической активности данных токсинов.

Было изучено влияние низких нелетальных концентраций рицина и вискумина на пролиферативную активность клеток. Для этого использовали БКВ-тест, позволяющий

определять общее количество белка (См. Рисунок 9). ЦГИ, используемый в качестве положительного контроля в широком диапазоне концентраций (!0"5-10 мкг/мл) в данных условиях не приводил к изменению митотического индекса.

На рисунке видно различие в действии двух РИБ2. Достаточно высокие концентрации Я60 практически не влияют на пролиферативную активность клеток. Но при снижении концентрации токсина эффект воздействия может достигать 400% от значений, полученных на клетках не подвергавшихся обработке токсинами (См. Рисунок 9). Это позволяет сделать вывод, что РИБ2 не только ингибируют синтез белка, но и обладают дополнительными действиями при попадании в цитозоль.

Рисунок 9. Митогенное действие низких концентраций РИБ2

Влияние низких концентраций Л60 и М1Л на пролиферацию. Значения на оси абсцисс - концентрации токсинов 10"'8-10"10 М соответственно.

Апоптотические изменения под действием РИБ2

Инкубация с рицином приводит не только к увеличению митотического индекса, но и к запуску апоптоза. Активация апоптоза происходит при изменении соотношения про- и анти-апоптотических белков в клетке. Остановка синтеза белка приводит к изменению этого соотношения, однако не является единственным условием для запуска апоптоза. Образование фрагментов ДНК с молекулярной массой 180-200 пар нуклеотидов является свидетельством того, что клетки вступили на апоптотический путь гибели и в них уже активированы эффекторные каспазы. Для количественного определения клеток с

фрагмеятированной ДНК использовали метод проточной цитофлуориметрии. Количество деградировавшей ДНК, разрушенной под действием токсинов и достаточное для детекции, наблюдается через 24 часа, и достигает максимальных значений, близких к 100%, через 48 часов (См. Рисунок 10). При этом ни в контрольных клетках, ни в клетках, инкубировавшихся с циклогексимидом, деградации ДНК не выявлена. Вероятно, изменение структуры рибосомы, происходящее под действием РИБ2 и приводящее к риботоксиче-скому стрессу, играет в этом существенную роль.

Рисунок 10. Апоптотические изменения под действием РИБ2

Через 24 часа под действием токсинов детектируются клетки в фазе ЭиЬО!.

Фрагментация ядер является характерным морфологическим признаком поздних стадий апоптоза. Действие рицина приводит к фрагментации 10% ядер уже через 24 часа. При этом наблюдается фрагментация на разпых стадиях, что свидетельствует о том, что апоптотическая реакция началась ранее регистрируемого времени.

Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу.

Высокая токсичность рицина не позволяет использовать его для терапии онкологических заболеваний, однако для вискумина подобные исследования проводятся [ТЫей е1 а!., 2008]. Использование инкапсулированного в полилактидный носитель вискумина может быть более эффективным вследствие биодеградации носителя и постспешюго высвобождения лекарственного препарата.

Нами была получена полилакгидная матрица с инкапсулированным вискумином, которая при деградации высвобождала токсин. Использование нового метода сверхкритической флюидной инкапсуляции позволило сохранить цитотоксические свойства токсина.

Выводы

1. Разработана тест-система на основе панели моноклональных антител против рицина, позволяющая выявлять изолированную А-цепь рицина (К.ТА) внутри клетки.

2. Показано, что совместное распределение нагивного токсина и его свободной А-субъединицы на начальных этапах интоксикации клетки не превышает 10%, а через 18-20 часов достигает практически 80%.

3. При комплексном использовании иммунохимических методов и конфокальной микроскопии установлено, что концентрация токсина в ранних эндосомах может составлять не менее 1,31*10"7 М/л, а в отдельных везикулах достигает величины 10"5 М/л.

4. Показано, что свободная ЯТА не колокализуется с маркёрами эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, лизосом, клеточного ядра и митохондрий.

5. В предварительно обработанных цельным токсином клетках линий ЗТЗ, С6, А431 А-субъединица рицина выявляется через 4 часа, что согласуется со временем остановки биосинтеза белка в этих клетках.

6. Обнаружено, что обработка клеток линий ЗТЗ, С6 и А431 низкими концентрациями (от 10"18 М до Ю'10 М) рицина или вискумина усиливает пролиферацию клеток и через 5 суток увеличивает долю делящихся клеток в два-четыре раза.

7. Включение токсинов в полилактидную матрицу методом «сухой» сверхкритической флюидной инкапсуляции позволяет получать лекарственные препараты пролонгированного действия. Показано, что эта процедура не влияет на иммунохимические и цитотоксические свойства вискумина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бенедиктова О. А, Попова Е.Н., Хапчаев Ш.Ю., Новиков К.Н., Егорова С.Г. Сравнительный анализ цитотоксической активности конътогатов с различными векторными молекулами. Материалы международной научной конференции, Москва, МГУ имени М.ВЛомоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006 г. - М.: МАКС Пресс 2006.-118 с.

2. Хапчаев ШЛО. Взаимодействие рибосом-инактивирующих белков с клеткой-мишенью. Материалы международной научной конференции, Москва, МГУ имени М.ВЛомоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006 г. - М.: МАКС Пресс 2006.-118 с.

3. Е.Н. Попова, ШЛО. Хапчаев, С.Г. Егорова, ИЛ. Демина, О.А. Венедиктова, Н.И. Агапов, М.М. Мойссновнч. Мышиные мопоклональные антитела против рицина не реагируют с агглютинином рицина. Российски! иммунологический журнал, 2007, том 1(10), №. 3-1 с.59-65.

4. A.N. Orekhov, Sh.Y. Khapchaev, O.L. Pustovalova, I.V. Andrianova, M.M. Moisenovich. Lipoprotein Accumulation and Antigen-Presentation in Grossly Normal Human Aorta. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology Annual Conference 2007. Chicago, IL, April 19-21. Arterioscler Thromb Vase Bio!. 2007;27:e35-cl37.

5. Moisenovich M.M., Khapchaev Sh.Y., Pustovalova O.L., Orekhov A.N. Lipoprotein Accumulation and Antigen-Presentation in Human Aorta. 76lh Congress of the European Atherosclerosis Society, Helsinki, Finland, June 10-13, 2007. Atheroscler Suppl 2007 Jun;

6. ШЛО. Хапчаев, А.Ю. Архипова, М.М. Мойсеновнч. Влияние ингибиторов синтеза белка па клетки линий ЗТЗ и А431. Российский иммунологический журнал, 2008, т.2(11), №2-3: с 316.

7. Мойсенович М.М., Пустовалова О.Л., Хапчаев Ш.Ю., Почаев В.А., Орехов А.Н. HLA-DR-положительные клетки в интиме аорты человека. Сборник статей «Инновационные микроскопические методы исследования в образовательном процессе». Издательство «Кволитайп» Москва, 2008, с.27-36.

S. ШЛО. Хапчаев, И.И. Агапов, М.М. Мойсспович, А-А. Рамонова, С.Э.Богородский, И.С.Мусаэляи, В.К.Попов. Цптотоксическая активность вискумина, инкапсулированного в полилактидную матрицу с помощью сверхкритического диоксида углерода. Биотехнология, 2008. т.5: с.43-49.

8(1): 1-234.

Подписано в печать:

16.03.2009

Заказ № 1737 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хапчаев, Шамиль Юсуфович

1 Список сокращений.

2 Введение.

3 Обзор литературы.

3.1 Ингибиторы синтеза белка.

3.1.1 Высокомолекулярные ингибиторы синтеза белка.

3.1.1.1 Рицин.

3.1.1.2 Вискумин.

3.1.1.3 Внутриклеточный транспорт белковых токсинов.

3.1.1.4 Транслокация токсинов.

3.1.2 Низкомолекулярные ингибиторы синтеза белка.

3.1.2.1 Циклогексимид.

3.1.2.2 Различные пути гибели клетки.

3.1.3 Действие РИБ2, отличное от ингибирования синтеза белка.

4 Материалы и методы.

4.1 Материалы.

4.2 Клеточные линии.

4.3 Очистка моноклональных антител.

4.4 Проведение электрофореза.

4.5 Системы ТИФА.

4.5.1 Твердофазный иммуноферментный анализ для определения реакции антител с биотинилированными антигенами.

4.5.2 Сэндвич-ТИФА для выявления свободной каталитической субъединицы рицина.

4.5.3 Определение концентрации И.60 и И.ТА в лизатах клеток, предобработанных Я60.

4.6 Биотинилирование белков.

4.7 Получение конъюгатов белков с флуорохромами.

4.8 Оценка цитотоксических свойств ИСБ.

4.8.1 МТТ-тест.

4.8.2 БЯВ-тест.

4.9 Приготовление 4,5% параформальдегида.

4.10 Анализ митогенной активности ИСБ.

4.11 Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу.

4.12 Исследование кинетики выхода вискумина из полилактидной матрицы.

4.13 Анализ количества вискумина, высвободившегося при деградации полилактида

4.14 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.

5 Результаты и обсуждение.

5.1 Выявление свободной ЯТА в клетках, предобработанных рицином.

5.1.1 Тест-система для выявления свободной КТА в клетке.

5.1.2 Определение свободной каталитической субъедипицы рицина в клетках, предобработанных Я60.

5.1.3 Накопление свободной ЯТА в клетках, предобработанных рицином.

5.1.4 Характеризация компартмента, содержащего свободную ЯТА.

5.1.4.1 Совместное распределение ЯТА с рицином.

5.1.4.2 Совместное распределение ИТ А с эндоплазматическим ретикулумом

5.1.4.3 Совместное распределение с аппаратом Гольджи.

5.1.5 Объём компартмента, содержащего рицин.

5.2 Влияния РИБ, непосредственно не связанные с ингибированием синтеза белка

5.2.1 Митогенное действие рибосом-инактивирующих белков 2 типа.

Подбор митостатика и его концентраций.

5.2.1.1 Влияние времени инкубации с митостатиком на митотический и апоптогический индексы.

5.2.1.2 Митогенная активность ингибиторов синтеза белка.

5.3 Апоптотические изменения под действием токсинов.

5.3.1 Выявление экспозиции фосфатидилсерина во внешнем слое плазматической мембраны с помощью Аппехт V.

5.3.2 Анализ фрагментации ДНК.

5.3.2.1 Анализ деградации ДНК с помощью электрофоретического разделения в агарозном геле.

5.3.2.2 Количественный анализ фрагментации ДНК методом проточной цитофлуориметрии.

5.3.3 Анализ фрагментации ядер.

5.4 Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу.

6 Выводы.

7 Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности внутриклеточного транспорта и биологическая активность рицина"

Многие процессы в клетке определяются взаимодействиями различных молекул как внутри неё, так и на поверхности. На клеточной мембране имеется большое количество различных рецепторов. Лектины специфически взаимодействуют с гликопротеинами мембраны и могут активировать рецепторы клеточной поверхности.Результатом такой активации, в частности, может быть запуск как пролиферации, так и гибель клетки.Известно, что рибосом-инактивирующие белки 2 типа (РИБ2) состоят из двух субъединиц, одна из которых обладает лектиновоГ! активностью и играет ключевую роль в связывании токсина с клеткой. Наиболее полно изучены представители РИБ2 рицин (R60) и вискумин (МЫ). Оба эти токсина имеют сходную структуру, но различаются по ряду характеристик, в частности, по строению галактозосвязывающих центров. Имеющиеся различия приводят к неодинаковому внутриклеточному пути транспорта этих белков [Moisenovich М. et al., 2002]. Обязательным общим этапом интернализации обоих токсинов является попадание в ранний эндосомальный компартмент, дальнейшая транспортировка из которого зависит от того, с каким рецептором произошло связывание. Из ранних эндосом большая часть токсина возвращается к клеточной поверхности, откуда снова попадает в клетку. Таким образом, происходит постоянное движение токсина у клеточной мембраны [Moisenovich М. et al., 2004].Минорная часть интернализовавшихся молекул РИБ2 через аппарат Гольджи (АГ) транспортируется в эидоплазматический ретикулум (ЭР) и далее попадает в цитозоль, где инактивирует рибосомы [Wesche J. el al., 1999]. В пользу такой теории свидетельствуют следующие данные: • введение в RTA сигнальной последовательности KDEL, адресующей белки в ЭР, усиливает цитотоксичность химерной молекулы fZhan J. et al., 1998]; • блокировка везикулярного транспорта с использованием брефелдина А приводит к приобретению клетками устойчивости к рицину [Bilge A. et al., 1995]. • мутантные клетки, в которых заблокирован ретроградный транспорт, также не чувствительны к рицину [Cosson P. and Letourneur P., 1994; Simpson J.С. et al., 1995a].При этом клетки, мутантные по ГТФазам, и клетки, обработанные блокатором везикулярного транспорта, остаются чувствительными к дифтерийному токсину, способному создавать поры в мембранах и транспортироваться в щпозоль, минуя ЭР [Simpson J.C. ct al., 1996].Устойчивость гибридом, продуцирующих антитела против эпитопов RTA. экранированных в нативном токсине, показывает необходимость разделения субъединиц токсинов для транслокации в цитозоль [Tonevitsky A.G. et al., 1995; Малюченко Н.В. и др., 2003; Бенедиктова О.Л. и др., 2005]. Считается, что высвободившаяся R.TA транспортирутся из ЭР, используя существующий путь экспорта дефектных эндогенных белков [Rapak A. et al., 1997].Все вышеизложенное не исключает возможности транслокации свободной RTA на более ранних этапах внутриклеточного транспорта в количествах, достаточных для остановки синтеза белка. Выход А-цени из ранних эндосом может быть обусловлен несколькими причинами. Так, высокий уровень содержания ненасыщенных лип идо в и малое количество сфинголипидов и холестерола приводит к тому, что мембраны эндосомального компартмента оказываются чрезвычайно гибкими и подвижными [Kobayashi Т. et al., 1998; Hussain М.М., 2000]. Повышенная лабильность мембран и их постоянный рециклинг у клеточной поверхности повышает вероятность трансмембранного переноса токсина. Увеличение эффекта возможно также за счет повышенного содержания в данных мембранах трнглицеридов, к которым обнаружена липолитическая активность рицина [Lombard S. ct al., 2001]. Концентрация рицина в ранних эпдосомах, по нашим оценкам, составляет до 10" М. Это может привести к значительному нарушению целостности мембран, что, в свою очередь, возможно, инициирует транслокацию А-цепи в цитоплазму.Таким образом, выявление компартментов, в которых присутствует свободная RTA, может внести существенные изменения в современные представления о транспорт токсинов и может быть использовано при синтезе иммунотоксинов на основе РИБ2.Изучение путей транспорта РИБ2 в клетке привело к открытию ряда их особенностей, которые непосредственно не связаны с ингибированием синтеза белка.Такие свойства как митогенная или липолитическая активность присущи высокомолекулярному токсину и не наблюдаются при воздействии низкомолекулярных ингибиторов синтеза белка [Morlon-Guyot J. et al., 2003]. Данные свойства могут объяснить природу более высокой токсичности РИБ2 по сравнению с низкомолекулярпыми ингибиторами.Целью работы было исследование роли эндосомального компартмепта в транспорте РИБ2 па примере рицина и вискумина, а также возможности восстановления межсубъединичной дисульфидной связи в данном компартменте.Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Разработать тест-систему для выявления свободной R.TA внутри клетки.Используя эту тест-систему, изучить динамику накопления R.TA в клетке.Определить ассоциацию А-цепи с клеточными органеллами.2. Определить концентрацию токсина в эндосомальном компартменте и выявить в нем наличие молекул свободной RTA.3. Изучить действия РИБ, непосредственно не связанные с остановкой синтеза белка. Подобрать методы обнаружения митотической активности клеток и повреждений эндосомных мембран под действием РИБ.

4. Сопоставить динамику накопления токсинов в клетке с этапами её интоксикации.Научная новизна работы. На основе полученных моноклональиых антител создана уникальная тест-система для определения свободной R.TA внутри клетки.Установлено, что период, через который в клетке выявляется свободная RTA, согласуется со временем остановки синтеза белка в предобработанных цельным токсином клетках и составляет =4 часа. Показан широкий спектр действия РИБ2 на клетку-мишень: снижение её устойчивости к физическим воздействиям, таким как центрифугирование и изменение рН среды; разрушение актиповых филаментов; запуск апоптоза.Практическая значимость. Исследования механизмов взаимодействия рицина с клеткой и, особенно, механизмов транслокации токсина в цитозоль позволят повысить эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе токсинов; существенно снизить или полностью исключить побочные эффекты, возникающие при их применении; значительно расширить область их применения в клинической практике, в том числе за счёт нанотехнологий. Разработанный метод инкапсуляции РИБ2 в полилактидпую матрицу может быть использован для создания лекарственных препаратов пролонгированного цитотоксического действия.3 Обзор литературы 3.1 Ингибиторы синтеза белка 3.1.1 Высокомолекулярные ингибиторы синтеза белка Многие растения синтезируют и накапливают в семенах, зелёных частях и коре токсические белки, относящиеся к семейству белков, ннактивнрующнх рибосомы (РИБ). Биологические эффекты этих белков известны с давних времен вследствие высокой токсичности семян клещевины (Ricimis communis) и растения Abrusprecalorius, листьев омелы {Viscum album) и коры бузины (Samhucus лул). а также активности таких растений как Trichosanthes kirillowii и Momordica charunla, приводящей к абортам у млекопитающих. В 1888 году X. Стиллмарк идентифицировал токсическую основу семян клещевины - белок, названный рицином. С тех пор найдено и охарактеризовано множество белков, структурно и функционально сходных с рицином.Термин «рибосом-нпактивирующий белок» (Ribosome Inactivating Protein) введён до того, как были изучены структура и ферментативные свойства РИБ для обозначения белков, которые инактивируют рибосомы животных. После выяснения способа действия РИБ на рибосомы, это название применяется исключительно для Nгликозидаз.На основании строения рибосом-инактивиругащие белки могут быть разделены на три группы - РИБ1-3 [Peumans W.J. et al., 2001].1. РИБ первого типа (РИБ1) состоят из одной субъединицы с молекулярной массой 25-30 кДа, проявляющей N-гликозидазную активность [Barbicri L. el al., 1993].РИБ1 были обнаружены у множества однодольных и двудольных растений.Сейчас известно около 140 видов различных РИБ1 [Girbes Т. et al., 2004].Наиболее известные РИБ1 - бриодин из Bryonia dioica, гелонин из Gelonium multiflorum, момордин и бета-моморхарин из растения Momordica charantia и сапорин из Saponaria officinalis.2. РИБ второго типа (РИБ2) представляют собой гетеродимерные гликопротеины с молекулярной массой около 60 кДа, состоящие из двух субъединиц, соединённых дисульфидной связью. А-субъединица является ферментом N-гликозидазой, а Всубъединица проявляет лектиновые свойства и взаимодействует с углеводными остатками на поверхности клеток-мишеней. За счёт углеводсвязывающей субъединицы РИБ2, в отличие от РИБ1, цитотоксичны [Stirpc F., 2004]. Найдено около 40 видов РИБ2, из них наиболее известны РИБ2 - рицин из семян клещевины Ricinus communis, абрин из семян растения Abnts precatorius, токсические лектины МЫ (вискумин), MLII и MLIII из зелёных частей омелы Viscum album [Olsnes S. et al., 1974; Franz H. et al., 1981; Stirpe F. et al.. 1985; Girbes T. et al., 1993; Van Damme E.J. et al., 1996; Kaku H. et al., 1996; Van Damme E.J. et al., 1997]. Рентгеноструктурный анализ (PCA) рицина, абрина, вискумина и агглютинина рицина выявил структурное сходство этих белков [Rutenber Е. and Robertus J.D., 1991; Tahirov Т.Н. el al., 1995; Sweeney E.C. et al., 1998; Krauspenhaar R. et al., 1999]. Для некоторых растений, в частности, двух видов из рода Sambucus. Cinnamomum camphora и Iris hollcmdica отмечено одновременное присутствие РИБ1 и РИБ2 [Girbes Т. et al., 2004].3. Определение РИБЗ ввёл в 2001 году Пеуманс с соавторами [Peumans W.J. et al., 2001] для белков с молекулярной массой 60 к Да, состоящих из N-концевого гликозидазного домена, сходного с А-субъединицей РИБ2, и ковалентно связанного с ним С-концевым доменом с неизвестной функцией. РИБЗ найдены только у двух видов зерновых растений: кукурузы Zea mays и ячменя Hordcum vulgare [Walsh Т.A. et al., 1991].4. Циторес с соавторами предложил ввести определение РИБ четвёртого типа для тетрамерных токсинов, состоящих из двух типов полипептидных цепей: двух каталитически активных А-субъединиц и двух углеводсвязывающих Всубъединиц [Chores L. et al., 1993]. По строению молекула РИБ4 напоминает сдвоенную молекулу РИБ2. Данные белки были обнаружены в растениях Abrusprecatorius, Ricinus communis, Viscum album и Momordica charanta и названы агглютининами за способность агглютинировать эритроциты млекопитающих [Stirpe F. et al., 1992]. Однако, до сих пор РИБ4 относят то к отдельной группе, то вносят в состав РИБ2.3.1.1.1 Рицин Рицин (R60) входит в группу рибосом-инактивирующих белков второго типа (РИБ2). Это гетеродимерный белок, состоящий из двух субъедипиц (каталитической A, RTA и лектиновой - В, RTB), соединённых одной дисульфидпой связью (см.1 1 Рисунок 1). Токсичность данного белка обусловлена N-гликозидазной активностью Лсубъединиц по отношению к 28S рибосомальной РНК эукариот. приводящей к необратимой потере рибосомой сродства к фактору элонгации II. Ото вызывает остановку синтеза белка и гибель эукариотической клетки. В-субъсдиницы связываются с гликозилированными рецепторами на клеточной поверхности, что необходимо для эндоцитоза токсина. Ондоцитированные белки транспортируются от поверхности клетки в цитоплазму к их рибосомальной мишени.Рисунок 1, Структура рицина На рисунке видно 3 домена. Синий и фиолетовый домены входят в состав связывающей, а коричневый - каталитической субъединиц рицина. Зелёные стрелки - ос-спирали, жёлтые стрелки - R-слои. Модель построена с помощью программного обеспечения Cn3D v.4.1 на основе структуры молекулы рицина из протеомной базы данных национального центра биотехнологической информации [NCBI Entrez's Structure Database - 25 18].Структура рицина изучена подробнее структур других РИБ2. Принимая во внимание гомологию аминокислотной последовательности РИБ2. данные рентгеноструктурного анализа рицина часто используются для определения структуры других РИБ2 методом молекулярного замещения.3.1.1.1.1 Структура связывающей субъединицы рицина Связывающая В-субъединица рицина (RTB) представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 31 кДа и состоит из 262 аминокислотных остатков, которые образуют два отдельно свёрнутых домена сферической формы диаметром 30 А (см. Рисунок 2). Каждый из доменов состоит из четырех субдоменов: X, а, В и у [Montfort W. et al., 1987; Bai Y. et al., 2009J. Субдомены a, p и у гомологичны (20%) между собой и имеют сходную конфигурацию. Они содержат около 40 аминокислотных остатков и образуют структуру «трилистника». Субдомены X образованы первыми 16 аминокислотными остатками каждого домена (1-16 и 135-150 соответственно). Структура связывающей субъединицы рицина стабилизирована сетью гидрофобных взаимодействий между азотистыми основаниями субдоменов, а также четырьмя дисульфидными связями, образованными Cys20-Cys39 и Cysl 51 -Cys 164 (внутри a-субдоменов) и Cys63-Cys80 и Cysl90-Cys207 внутри (Ь-субдоменов. Ещё одна, пятая, дисульфидная связь в молекуле рицина образована Cys4 В-субъединицы и Cys259 А-субъединицы. В каждом домене В-субъединицы имеется галактозосвязывающий участок. Определены критически важные для взаимодействия с галактозой аминокислоты в двух сайтах связывания сахара [Wales R. et al., 1991].Между доменами В-субъединицы рицина наблюдается выраженная гомология (32%) аминокислотных остатков [Villafranca J.E. and Robertus J.D., 1981].Рисунок 2. Третичная структура RTB RTB состоит из двух гомологичных на 32% доменов. В их состав входят только Р-слои [NCB1 Entrez's Structure Database - 2518].В-субъединица R60 содержит два хорошо охарактеризованных аналогично устроенных углеводсвязывающих центра. Первый локализован в субдомене 1а, второй - в субдомене 2у [Rutenber Е. et al.. 1991]. Имеются также свидетельства существования третьего, неидентичного двум первым, углеводсвязывающего центра, расположенного в 1 (3 субдомене [Frankel A. et al., 1996b; Steeves R.M. ct al.. 1 999].Первый и второй галактозосвязывающие центры представляют собой неглубокие карманы на поверхности белка; дно кармана образовано консервативным трипептидом, включающим 24-26 а.о. в первом сайте и 236-238 а.о. - во втором. В верхней части кармана расположена ароматическая боковая группа Тгр37 (в первом сайте) и Тгр248 (во втором). Положение молекулы галактозы фиксировано сетью водородных связей с боковыми группами нескольких полярных аминокислотных остатков, локализованных в углеводсвязывающих сайтах, и гидрофобным взаимодействием с боковой группой соответствующего аминокислотного остатка Тгр.Консервативные а.о. Asp22 в первом сайте и а.о. Asp234 во втором являются ключевыми для первичного взаимодействия с сахарами. Атом OD1 этих остатков образует водородную связь с СЗ-гидроксилом связываемого сахара. При этом положение боковой группы Asp фиксируется водородной связью. Атом OD2 - с NE2 консервативного амида GIn47 в первом углеводсвязывающем сайте и Gln256 - во втором. Каждый СЗ-гидроксил галактозы также формирует сильные водородные связи с атомами ND2 Asp46 в первом сайте и Asp255 - во втором. В сайте 2 аналогом Gln35 является Пе246 и образует гидрофобный контакт с атомом С6 сахара. Сеть водородных связей в первом углеводсвязывающем сайте более сложная, чем в сайте 2, в котором NE2 Gln35 образует раздвоенную водородную связь с С4- и Сб-гидроксилами.Вторичная структура лектиновой субъединицы токсина характеризуется отсутствием ос-спиральных участков и наличием (3-складок и неупорядоченных цепей.Расстояние между двумя галактозосвязывающими участками рицина (70 А) не позволяет одной молекуле рицина одновременно взаимодействовать с двумя концевыми остатками галактозы одного олигосахарида.Согласно данным сайт-специфического мутагенеза, рекомбинантные RTB, несущие замены в субдоменах 1а и 2у, сохраняли лектиповую активность. В ю время как В-цепь рицина, которая имела замены в субдомснах 1а, 1)3, 2у по аминокислотам, участвующим в стекинг-взаимодействиях, Trp37—>Ser, Tyr248—>His, Tyr78—>His, теряла способность связываться с галактозидами, находящимися как в составе асиалофетуииа, так и на поверхности клетки [Frankel A. et al., 1996а; Frankel A. et al., 1996b]. При изучении биологической активности in vitro и in vivo гетеродимеров, содержащих мутантпую RTB, показано, что при вышеуказанных заменах происходит значительное снижение токсичности химерных белков. Величина LD.so в экспериментах на клеточной линии лейкемии человека HUT102 составила 5*10" М, в экспериментах in vivo LD50 составила 10 MKg/мышь. Тогда как эти показатели для рицина составили 4*10" "М и 75 иг/мышь соответственно [Fu Т. et al., 1996]. Однако, в субдомене 1В отсутствуют остатки, эквивалентные Asp22 и Asp46 ( la) Asp234 и Asp255 (2у), которые образуют водородные связи с гидроксильными группами при атомах СЗ и С4 галактозы. Возможно, возникновение комплекса с галактозой обусловлено полярными взаимодействиями боковых радикалов аминокислот с ОН-группами при атомах С2 и С4, и, таким образом, нельзя ожидать, что аминокислоты, занимающие аналогичное положение в пространстве, будут консервативны как для сайта 1В, так и для хорошо изученных сайтов la и 2у.3.1.1.1.1.1 Связывание токсинов с клеткой Любая клетка является потенциальной мишенью для растительных РИБ2, так как имеет на поверхности концевые остатки галактозы, поэтому эти белки действуют неизбирательно. Количество рецепторов для разных токсинов на поверхности клеток отличается. Например, на мембране клеток Не1а имеется 3*107 рецепторов для рицина и абрина и только 2* 10s - для вискумина [Тоневицкий А.Г. et al., 1995]. При изучении взаимодействия рицина с клетками-мишенями выяснилось, что на поверхности клеток различных популяций существуют как низкоаффинные, так и высокоаффипные рецепторы [Leonard J.E. et al., 1988; Decastel M. et al., 1989]. Кроме того, на эндотелиальных клетках печени и макрофагах показано, что рицин связывается не только с рецепторами, содержащими концевые остатки галактозы, но и с поверхностными маннозными рецепторами через остатки маннозы олигосахаридов, входящих в состав рицина. Это обеспечивает альтернативный путь поступления токсина в клетку [Simmons В.М. et al., 1986; Magnusson S. et al., 1991].Рицин связывается с концевой галактозой поверхностных гликопротеинов и/или гликолипидов клеток. Токсин связывает простые сахара, такие как галактоза и лактоза.Бензигер и Фиете в 1979 году показали, что константа связывания рицина с концевой галактозой в составе олигосахаридов в 1000 раз превышает константу связывания с отдельной молекулой галактозы или лактозы [Baenziger J.U. and Fietc D., 1979]. Рицин не взаимодействует с олигосахаридами, содержащими концевой Nацетилгалактозамин. Сиаловая кислота, присоединенная к галактозе в положении а2—>6, в 2-4 раза снижает константу связывания рицина с Gal. Наибольшая константа связывания рицина с сахаром (14,4* 106 М"1) наблюдается при взаимодействии с олнгосахаридом, содержащим три остатка галактозы.Галактозидсвязывающую активность рицина изучали методом рентгеноструктурного анализа, используя разветвлённый олигосахарид с двумя концевыми остатками галактозы [Rutenber Е. and Robertus J.D., 1991]. Расстояние между двумя галатзосвязывагощими участками рицина (70 А) не позволяет одной молекуле рицина одновременно связывать два концевых остатка галактозы одного олигосахарида. Однако концевые остатки Gal олигосахарида связывают две молекулы рицина. Таким образом, разветвленные рецепторы могут взаимодействовать с разными молекулами рицина без стерических затруднений.Большинство галактозо-содержащих олигосахаридов клеточной поверхности имеют структуру, очень схожую с той, которой обладают углеводные цени фетуина.Олигосахариды белка асиалофетуина взаимодействуют с рицином, причем константа 7 1 аффинности превосходит 10 М" . [Steeves R.M. et al., 1999] предполагают, что для лиганда подобной структуры характерны многоточечные взаимодействия с поверхностью всего углеводсвязывающего субдомепа, а не только с самим «карманом». Возможно, ото и объясняет 1000-крагное увеличение константы аффинности при связывании олигосахаридов.Было показано, что рицин способен связывать N-ацетилгалактозамин, но чолько в сайте 2. Рутенберг с соавторами отмечали, что N-ацетильная группа галатозамина и остаток Asp44 могли бы создать стерические напряжения в сайте 1 [Rutenber Е. and Robertus J.D., 1991], тогда как в сайте 2 N-ацетильная группа экспонирована в водную фазу [Baenziger J.U. and Fiete D., 1979].3.1.1.1.2 Структура каталитической субъединицы рицина Каталитическая субъединица R60 представляет собой глобулярный гликопротеин с двумя сайтами гликозилирования. Существуют две, в разной степени гликозилированные, формы Л-субъедипиц рицина, которые выявляются с помощью SDS-PAGE-злектрофореза в виде двух полос, соответствующих примерно 29 кДа [Hegde R. and Podder S.K., 1998]. Структура RTA сформирована тремя доменами: первый включает 1-1 17, второй - 1 18-210 и третий - 21 1-267 аминокислотные остатки.Первый домен содержит пять (3-складчатых участков и две а-спнрали. второй - только 5 гх-спиралей, а третий - одну а-спираль, осуществляя взаимодействие с двумя другими доменами и с В-субъединицей (Рисунок 3) [Rutenber Е. and Robertas J.D., 1991]. Каталитическая субъединица рицина не имеет внутренних дисульфидных связей и её третичная структура стабилизируется сетью полярных и гидрофобных взаимодействий [Bai Y. et al., 2009].А-субъединица R60, как и других РИБ2, это N-гликозидаза, субстратом которой являются рибосомальпые 28S РНК эукариот. Они осуществляют вьпцеплепие аденина. входящего в состав полностью консервативного тетрануклеотида GAGA, расположенного в петле или стеблевой части 28S РНК [Endo Y. et а!.. 1987; Gluck A. et al., 1994]. Распознавание А-субъединицей консервативного тетрапептида GAGA, повидимому, зависит от его коиформации в рибосоме. Так, для выщспления аденина из очищенной 28S рибосомальной РНК или 20-35-члснных синтетических олигонуклеотидов, включающих сайты депуринизации а-сарцина-рицина, требуются более высокие концентрации RTA, чем для депуринизации нативной рибосомы [Endo Y. et al., 1988]. Кроме того, несмотря на консервативность сайта депуринизации, чувствительность рибосом разного происхождения к RTA заметно различается: растительные намного устойчивее к RTA, чем рибосомы клеток млекопитающих и дрожжей, а рибосомы прокариот- полностью резистентны [Lord J.M. et al., 1991].Представление о механизме ферментативного катализа, осуществляемого Асубъединицей, основано на данных рентгеноструктурного анализа рицина и комплекса рекомбинантной А-субъединицы рицина с аналогами субстрата адепил-(3'-5')гуанозином и формицин монофосфатом, а также сведений о ферментативной активности мутантных форм А-субъединицы [Monzingo А.Г. and Robertus J.D., 1992].Данная модель построена по аналогии с детально охарактеризованным механизмом расщепления АМФ-нуклеозидазой связи между аденином и рибозой в АМФ. Рисунок 3. Структура каталитической субъединицы рицина Маленькие шарики — аминокислотные остатки, зелёные стрелки - сиспирали, жёлтые стрелки - р-слои. Модель построена с помощью программного обеспечения Cn3D v.4.1 на основе структуры молекулы рицина из протеомной базы данных национального центра биотехнологической информации [NCBI Entrez's Structure Database - 25 18].Согласно модели, предложенной в 1992 году, консервативные Glul77 и Argl80 непосредственно участвуют в депуринизации [Monzingo A.F. and Robertus J.D., 1992]. ArgI80 протонирует N3 атомом адснозина, образуя водородную связь, что облегчает разрыв гликозидиой связи N9-C1. Gki 177 поляризует молекулу воды, локализованную в активном центре. Затем происходит реакция нуклеофильного замещения: атом кислорода поляризованной воды атакует связь N9-C1 и замещает атом N9 адснозина, протон воды переходит к N9 атому аденозина.Результаты, полученные с помощью сайт-специфического мутагенеза RTA, свидетельствуют, что в случае замены Glu 177—>А1а роль Glul77 может выполнять Glu208, также локализованный в кармане активного центра, хотя такой мутант в 5 раз менее активен, чем белок дикого типа, а замена Glu208— >Asp не влияет на ферментативную активность R.TA. Двойной мутант Glu 177—>А1а Glu208— >Asp практически не активен [Frankel A. et al., 1990]. Участие положительно заряженной боковой группы Argl80 в ферментативном катализе показана на мутантной RTA, в которой Argl80 заменён на Lys или на His [Frankel A. et al., 1990]. Ферментативная активность мутанта Argl 80—>Lys была только в 4 раза ниже, а мутанта Argl 80—s-His - в 1000 раз ниже активности нативной RTA.Инвариантные ароматические аминокислотные остатки Туг80 и Туг 123 участвуют в связывании субстрата [Ready М.Р. et al., 1991]. В комплексе рекомбинантпой А-субъединицы рицина с адепш^З'-б^-гуанозином и формиципмонофосфатом нурпновое кольцо субстрата фиксируется между ароматическими кольцами Туг80 и Туг 123 с помощью стекинг-взаимодействия. При этом плоскость пуринового кольца практически параллельна ароматическому кольцу Туг80.Положение Туг80 в комплексе отличается от его положения в свободной Асубъединице поворотом, для которого необходим разрыв водородной связи с Glyl21.Замена инвариантных Туг80 и Туг123 на ароматический Phe снижала ферментативную активность RTA в 15 и в 7 раз соответственно. В то время как их замена на Ser снижала активность мутантов в 160 и 70 раз соответственно [Ready М.Р. et al., 1991].Инвариантный Туг21 принимает участие в формировании структуры активного центра, образуя водородную связь с атомом кислорода Mctl74. В данном сайте спираль Е образует изгиб, в результате чего ключевые для ферментативного катализа аминокислотные остатки G1 u177 и ArgI80 оказываются на поверхности кармана активного центра.Кроме описанных инвариантных аминокислотных остатков А-субъединицы РИБ2 содержат другие высококонсервативные аминокислотные остатки, например Asn78, Argl34, Glnl73, Glu208 и Asn209, функция которых пока не известна. Возможно, они также участвуют в формировании и стабилизации структуры активного центра или связывании каталитической субъединицы с субстратом.3.1.1.1.3 Межсубъсдиничные взаимодействия в молекуле рицина Каталитическая и лектиновая субъединицы рицина соединяются дисульфиднон связью, образуемой 259 в А-субъединицах и 4 в В-субъединицах остатками цистеина [Montfort W. et al., 1987; Weston S.A. et al., 1994]. Показано, что область контакта между А- и В-субъединицами рицина равна 1600 Л, что составляет примерно 14% от общей поверхности каждой субъединицы [Katzin B.J. et al., 1991]. А- и В-субъедипицы рицина, кроме ковалентной S-S-связи. удерживаются вместе сетью полярных, гидрофобных и стеккинг-взаимодействий боковых групп аминокислотных остатков в зоне контакта [Krauspenhaar R. et al., 1999].После разделения субъединиц экспонируются скрытые в нативном токсине гидрофобные участки субъединиц. Свободная RTA способна взаимодействовать с липидными мембранами за счёт гидрофобного участка, экранированного в нативном токсине [Utsumi Т. et al., 1989; Ramalingam T.S. et al., 1994; Simpson J . С et al., 1995c].Возможно, погружение RTA в мембрану инициирует процесс её транслокации в цитоплазму, однако, не исключено, что встроенная в мембрану RTA может транспортироваться к месту транслокации за счёт рециркуляции мембран.Предполагается, что встроившись в мембрану, RTA приобретает копформацию «расплавленная глобула» и после завершения трансмембранного переноса в цитоплазме происходит восстановление глобулярной структуры RTA. сопровождающееся перегруппировками в субстратсвязывающем сайте, необходимыми и для активации фермента [Argent R.H. et al., 2000; Zhang H. ct al., 2009J.3.1.1.2 Вискумин В листьях и побегах омелы содержатся три вида РИБ2, очень схожих между собой. Токсические лсктины омелы МЫ (вискумин), MLI1 и ML1II являются основными белками в водных экстрактах из омелы, которые давно используются при терапии онкологических заболеваний [Franz Н. et al., 1981]. Наибольшее распространение имеет вискумин.Молекула вискумина, как и другие РИБ2, состоит из двух субъединиц.Молекула ML1 имеет размеры порядка 120А х 80А х 70А. В то время как А21 субъединица состоит из а- и (3-элементов вторичной структуры, в В-субъединице обнаруживаются только [3-тяжи (Рисунок 4). Было отмечено, что третичная структура вискумина демонстрирует значительное сходство со структурой молекулы рицина. описанной с разрешением 2.8А [Montfort W. et al.. 1987]. При наложении углеродных Са-скелетов этих молекул обнаруживается практически полное их совпадение [EschenburgS. etal., 1998].Рисунок 4. Трёхмерная модель молекулы вискумина (MLI) А-субъединица представлена двумя доменами (синий и фиолетовый), состоящими из а-спиралей и Р-слоев. в В-субъединице. также состоящей из двух доменов, обнаруживаются только (3-слои. Показаны также олигосахариды. Модель построена с помощью программного обеспечения Cn3D v.4.1 на основе структуры молекулы рицина из протеомной базы данных национального центра биотехнологической информации [NCBI Entrez's Structure Database - 23554].10-11% молекулярного веса вискумина составляют углеводы, которые по структуре сходны с олигосахаридами других растительных токсинов [Franz Н. et al., 1981]. Вискумин содержит глюкозу, галактозу, маннозу, N-ацетилглюкозамин, Nацетилгалактозамин, N-ацетилманнозамин, фукозу и ксилозу.3.1.1.2.1 Строение В-субъединицы вискумина Углеводсвязывающая В-еубъединица вискумина состоит из 264 аминокислотных остатков. Шесть из семи цистеинов образуют три дисульфидпые связи внутри В-субъединицы, а один связан с цистсином А-субъсдиницы: Cys64Cys81, Cysl52-Cysl65 и Cysl92-Cys209. В аминокислотной последовательности Всубъединицы вискумина идентифицировано три потенциальных сайта гликозилирования в положениях 61, 96 и 136, в которых находятся остатки аспарагнна.Однако, исследования степени гликозилирования В-субъединицы МЫ говорят о наличии только двух гликановых частей в молекуле [Eschenburg S. et al., 1998].Уточненная структура кристалла МЫ в комплексе с галактозой была описана с разрешением 3,0 A [Niwa Н. et al., 2003]. В-субъединица МЫ состоит из двух гомологичных глобулярных доменов. Каждый домен диаметром около 30 А составлен тремя субдоменами (а, р\ у) и содержит углсводсвязывающий сайт. Линксрпьтс участки, обозначаемые Х\ и Х2. соединяют А- и В-субъединицы токсина и два лектиновых домена соответственно [Krauspenhaar R. et al., 1999]. Хотя предполагается, что субдомены а, (3 и у произошли от общего галактозевязывающего пептида, только субдомены a l и у2 сохранили способность связывать углеводный остаток [Villafranca J.E. and Robertus J.D., 1981]. Данные функциональные субдомены различаются между собой по аффинности к связываемому углеводу (субдомен a l является низкоаффинным) из-за различия в аминокислотных последовательностях [Krauspenhaar R. et al., 1999].Рисунок 5. Строение углеводсвязывающих сайтов В-субъединицы вискумина А - N-концевой сайт, Б - С-концевой сайт. Показаны элементы вторичной структуры и связанная галактоза (синяя сетчатая поверхность) [Palmer R.A. and Niwa Н., 2003].В-субьединица вискумина специфически связывается с гликолипидами и/или гликопротеидами, содержащими терминальную галактозу [Ziska P. and Franz Н.. 1981].С помощью моно-. ди- и олигосахаридов показано, что вискумин обладает высокой аффинностью к терминальной галактозе, связанной по альфа- или бета- положению, и слабо взаимодействует с 1М-ацетилгалактозамином [Franz Н., 1986; Wu A.M. el al., 1992].3.1.1.2.2 Строение А-субъединицы вискумина Аминокислотная последовательность А-субъединицы вискумина (MLA) включает 254 остатка [Huguet S.M. et al.. 1996]. Единственный остаток цистеина Cys247 участвует в образовании дисульфидной связи с Cys5 В-субъединицы.Внутренние дисульсуфидные связи в MLA отсутствуют. В аминокислотной последовательности А-субъединицы вискумина идентифицирован один потенциальный сайт гликозилирования в позиции Asn I 12 в составе триплета аминокислот Asn-X-Ser/Thr. Исследования степени гликозилирования А-субъединицы МЫ подтвердили, что белок содержит один гликановый остаток.В составе А-субъединицы впскумина можно выделить три домена. Домен I включает 110 N-копцевых аминокислот и состоит из одного спирального участка и шести р-тяжей, домен II (111-203 аминокислотные остатки) составлен четырьмя спиральными участками, домен III (204-254 аминокислотные остатки) содержит один спиральный участок и два антипаралелльных [3-тяжа и взаимодействует как с двумя другими доменами, так и с В-субъединицей [Krauspenhaar R. et al., 1999].Данные РСА свидетельствуют, что в построении каталитического аденинсвязывающсго центра впскумина участвуют все три домена. При сравнении аминокислотных последовательностей А-субъсдиниц различных РМБ2 - впскумина. рицина и абрина - были обнаружены абсолютно консервативные аминокислотные остатки, составляющие активный центр молекул. В А-субъединице впскумина это остатки Туг76, Туг 115, Glul65, ArgI68 и Trpl99 [Huguet S.M. et al., 1996].Аминокислоты Asn74, Argl26, Gin 162 и Glul97, формирующие окружение активного центра, участвуют в поддержании его структуры [Katzin B.J. et al., 1991].3.1.1.2.3 Взаимодействие между субъедшшцами виску мина Единичная дисульфидная связь соединяет Cys247 А-субъединицы и Cys5 Всубъединицы нативного гетеродимера впскумина. Помимо неё для стабилизации ассоциированных субъединиц существует большое количество нековалентных взаимодействий. В таблице показаны полярные, гидрофобные и ароматические взаимодействия между аминокислотными остатками субъединиц.Во взаимодействии субъединиц впскумина со стороны А-субъединицы в основном участвуют а.о. С-концевого участка, а со стороны В-субъединицы аминокислоты линкерных участков W и XI, а также С-концевые а.о.3.1.1.3 Внутриклеточный транспорт белковых токсинов Для достижения своей цитоплазматической мишени токсины проходят несколько ступеней внутриклеточного транспорта [Lord J.M. et al., 2003].Интернализация токсинов внутрь клетки осуществляется посредством рецепторопосредованного эндоцитоза. В этом процессе принимают участие как клеточные рецепторы, содержащие галактозу, так и рецепторы, связывающие концевую маннозу олигосахаридов [Simmons В.М. et al., 1986; Magnusson S. ct al., 1991; Rutenber E. and Robertus J.D., 1991].Для некоторых токсинов место и механизм транслокации известны, для других всё ещё остаётся под вопросом. Для многих РИБ2, в частное!и, рицина и вискумина, место транслокации пока не установлено. Возможно, они используют системы ретро[ранслокации для выхода из эндоплазматического ретикулума в цитоплазму [Hazes В. and Read R.J., 1997; Sandvig К. and Van Deurs В., 2000].3.1.1.3.1 Интернетизация токсинов в клетку-мишень Большинство белков, связывающихся с рецепторами на поверхности клетки, эндоцитируются с помощью клатрин-зависимого механизма [Mellman 1., 1996], но есть и рецепторы, интернализующиеся клатрин-независимыми способами: макропиноцитоз, фагоцитоз и захват внеклеточного материала, опосредованный липидпыми рафтами и кавеолами [Johannes L. and Lamaze С , 2002].Взаимодействие токсина с клетками начинается со связывания с рецепторами на поверхности клетки. Основным способом связывания РИБ2 являс1ся взаимодействие В-субъединпцы с галактозосодержащими рецепторами благодаря её лектиновой активности [Lord J.M. et al., 2005]. На клетках млекопитающих имеется огромное количество рецепторов, с которыми могут связываться токсины. Так, было подсчитано, что для рицина число соответствующих рецепторов колеблется от 2 до 80 млн. на клетку, а для вискумина почти в 2 раза меньше [Barbieri L. et al., 1993]. Среди этого количества обязательно найдутся рецепторы, которые в норме попадают внутрь клетки, используя различные механизмы как клатрин-зависимого, так и клатриннезависимого эндоцитоза [Montesano L. et al., 1982; Sandvig К. and Olsnes S., 1982a; Sandvig K. and Olsnes S., 1982b].Это предположение подтверждается большим количеством фактов: интернализация рицина продолжается при нарушении формирования клатринокаймленных везикул и блокировании клатрин-зависимого эндоцитоза [Simpson J.С. et al., 1995а; Sandvig К. and Van Deurs В., 1996].

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Хапчаев, Шамиль Юсуфович

6 Выводы

1. Разработана тест-система на основе панели моноклональных антител против рицина, позволяющая выявлять изолированную А-цепь рицина (ЯТА) внутри клетки.

2. Показано, что совместное распределение нативиого токсина и его свободной А-субъединицы па начальных этапах интоксикации клетки не превышает 10%, а через 18-20 часов достигает практически 80%.

3. При комплексном использовании иммунохимических методов и конфокальной микроскопии установлено, что концентрация токсина в ранних эндосомах может составлять не менее 1,3 1 * 10"7 М/л, а в отдельных везикулах достигает величины 10"5 М/л.

6. Обнаружено, что обработка клеток линий ЗТЗ, С6 и А431 низкими концентрациями (от 10~|8М до 10"'° М) рицина или вискумина усиливает пролиферацию клеток и через 5 суток увеличивает долю делящихся клеток в два-четыре раза.

7 Благодарности

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю Мойсеновичу Михаилу Михайловичу за постоянную и неоценимую помощь в проведении данной работы.

Я искренне признателен моему научному консультанту профессору Егоровой Светлане Григорьевне за помощь и участие в обсуждении полученных данных.

Сердечно благодарю своих коллег A.A. Рамонову, А.Ю. Архипову, к.б.н. O.A. Бенедиктову, к.б.н. К.Н. Новикова за советы и помощь в проведении ряда экспериментов.

Выражаю признательность всем сотрудникам кафедры физиологии микроорганизмов за доброжелательность и создание в коллективе дружеской атмосферы.

Благодарю своих родных за веру, терпение и помощь, оказанную при подготовке работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хапчаев, Шамиль Юсуфович, Москва

1. NCBI Entrez's Structure Database Электронный ресурс. / National Library of Medicine: 2003 Режим доступа:http://www.nc bi.nlm.nih.^ov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?Liid= 1 QQL.

2. NCBI Entrez's Structure Database Электронный ресурс. / National Library of Medicine: 1993 Режим доступа:http://www.ncbi.nlm. nih .go v/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=2A Al.

3. Бенедиктова, О.А., Попова, Е.Н., Егорова, С.Г., Демина, И.А. и Мойсенович, М.М. Выявление свободной А-цепи рицина в супернатантах клеток, предобработанных нативным токсином. / Биотехнология. 2005. -V.6, Р.83-89.

4. Гумеров, Ф.М., Сабирзянов, А.Н. и Гумерова, Г.И. Суб- п сверхкритические флюиды в процессах переработки полимеров. М. 2000.

5. Темяков, Д.Е., Агапов, И.И., Мойсенович, М.М., Прокофьев,

6. С.А., Малюченко, Н.В., Егорова, С.Г., Пфюллер, У., Зинке, X. и Тоневицкий, А.Г. Изучение гетерогенности каталических субъедипиц лектинов омелы белой с помощью моноклональных антител. / Молекулярная биология. 1997.- V.31, Р.536-541.

7. Хапчаев, Ш.Ю., Архипова, АЛО. и Мойсенович, М.М. Влияние ингибиторов синтеза белка на клетки линий ЗТЗ и А431. / Российский иммунологический журнал. 2008b. - V.2(11), Р.316.

8. Abraham, А.К. and Pihl, A. Effect of protein synthesis inhibitors on the fidelity of translation in eukaryotic systems. / Biochim.Biophys.Acta. 1983.- V.741, P.197-203.

9. Agapov, 1.1., Tonevitsky, A.G., Maluchenko, N.V., Moisenovich, M.M., Bulah, Y.S. and Kirpichnikov, M.P. Mistletoe lectin A-chain unfolds during the intracellular transport. / FEBS Lett. 1999a. - V.464, P.63-66.

10. Alessenko, A.V., Boikov, P.Y., Filippova, G.N., Khrenov, A.V., Loginov, A.S. and Makarieva, E.D. Mechanisms of cyclohcximide-induced apoptosis in liver cells. / FEBS Lett. 1997. - V.416, P. I 13-1 16.

11. Arcon-Vargas, D. and Ronai, Z. c-Jun-NH2 kinase (JNK) contributes to the regulation of c-Myc protein stability. / J Biol Chem. 2004. - V.279,1. P.5008-5016.

12. Argent, R.H., Parrott, A.M., Day, P.J., Roberts, L.M., Stockley, P.G., Lord, J.M. and Radford, S.E. Ribosome-mediated folding of partially unfolded ricin A-chain. / J.Biol.Chem. 2000. - V.275, P.9263-9269.

13. Argent, R.H., Roberts, L.M., Wales, R., Robertus, J.D. and Lord, J.M. Introduction of a disulfide bond into ricin A chain decreases the cytotoxicity of the ricin holotoxin. / J.Biol. Chem. 1994. - V.269, P.26705-267 1 0.

14. Baenziger, J.U. and Fiete, D. Structural determinants of Ricinus communis agglutinin and toxin specificity for oligosaccharides. / J.Biol.Chem. -1979. V.254, P.9795-9799.

15. Bai, Y., Monzingo, A.F. and Robertus, J.D. The X-ray structure of ricin A chain with a novel inhibitor. / Arch.Biochem.Biophys. 2009. - V.483, P.23-28.

16. Bakhshi, J., Weinstein, L., Poksay, K.S., Nishinaga, B., Bredesen, D.E. and Rao, R.V. Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program in mouse melanoma cells: effect of curcumin. / Apoptosis. 2008. -V.13, P.904-914.

17. Barbieri, L., Battel I i, M.G. and Stirpe, F. Ribosome-inactivating proteins from plants. / Biochim.Biophys.Acta. 1993. - V.1154, P.237-282.

18. Ban, M.Y. and Draper, R.K. Ricin intoxicates End4 mutants that have an aberrant Golgi complex. / J.Biol.Chem. 1993. - V.268, P-. 1 9939-1 9942.

19. Beaumelle, B., Alami, M. and Hopkins, C.R. ATP-dependent translocation of ricin across the membrane of purified endosomes. / J.Biol.Chem. 1993. - V.268, P.23661-23669.

20. Beaumelle, B., Taupiac, M.P., Lord, J.M. and Roberts, L.M. Ricin A chain can transport unfolded dihydrofolate reductase into the cytosol. / J.Biol.Chem. 1997. - V.272, P.22097-22 I 02.

21. Bharali, D.J., Mousa, S.A. and Thanavala, Y. Micro- and nanoparticle-based vaccines for hepatitis B. / Adv.Exp.Med.Biol. 2007. - V.601, P.4 I 5-42 I.

22. Bilge, A., Warner, C.V. and Press, O.W. Translocation of ricin A-ehain into proteoliposomes reconstituted from Golgi and endoplasmic reticulum. / J.Biol.Chem. 1995. - V.270, P.23720-23725.

23. Blom, W.M., de Bont, II.J., Meijcrman, I., Mulder, G.J. and Nagelkerke, J.F. Prevention of cycloheximide-induced apoptosis in hepatocytes by adenosine and by caspase inhibitors. / Biochem.Pharmacol. 1999. - V.58, P.1891-1898.

24. Borisy, G.G. and Taylor, E.W. The mechanism of action of colchicine. Colchicine binding to sea urchin eggs and the mitotic apparatus. I J Cell Biol. 1967. - V.34, P.535-548.

25. Broker, L.E., Kruyt, F.A.E. and Giaccone, G. Cell Death Independent of Caspases: A Review. / Clinical Cancer Research. — 2005. — V.ll, P.3155-3 162.

26. Cammue, B.P., Broekaert, W.F., Kellens, J.T., Raikhel, N.V. and Peumans, W.J. Stress-Induced Accumulation of Wheat Germ Agglutinin and Abscisic Acid in Roots of Wheat Seedlings. / Plant Physiol. 1 989. - V.91, P.1432-1435.

27. Cande, C., Cecconi, F., Dessen, P. and Kroemer, G. Apoptosis-inducing factor (AIF): key to the conserved caspase-independent pathways of cell death? / J Cell Sci. 2002. - V.115, P.4727-4734.

28. Canman, C.E. and Kastan, M.B. Signal transduction. Three paths to stress relief. / Nature. 1996. - V.384, P.213-214.

29. Carlini, C.R. and Grossi-de-Sa, M.F. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. / Toxicon. 2002. - V.40, P. 15 15-1 539.

30. Catsicas, M., Pequignot. Y. and Clarke, P.G. Rapid onset of neuronal death induced by blockade of cither axoplasmic transport or action potentials in afferent fibers during brain development. I J Neurosci. 1992. - V.12, P.4642-4650.

31. Cavigelli, M., Li, W.W., Lin, A., Su, B., Yoshioka, K. and Karin, M. The tumor promoter arsenite stimulates AP-1 activity by inhibiting a JNK phosphatase. / EMBO J. 1 996. - V.15, P.6269-6279.

32. Chow, J.M. Huang, G.C., Lin, H.Y., Shen, S.C., Yang, L.Y. and Chen, Y.C. Cytotoxic effects of metal protoporphyrins in glioblastoma cells: Roles of albumin, reactive oxygen species, and heme oxygenase-1. / Toxicology Letters. 2008. - V.177, P.97-107.

33. Cosson, P. and Letourneur, F. Coatomer interaction with di-lysine endoplasmic reticulum retention motifs. / Science. 1994. - V.263, P. 1 629 -1 63 1.

34. De la Cruz, R.R., Pastor, A.M. and gado-Garcia, J.M. Effects of target depletion on adult mammalian central neurons: functional correlates. / Neuroscience. 1994. - V.58, P.81-97.

35. Debatin, K.M. Apoptosis pathways in cancer and cancer therapy. / Cancer Immunol.Immunother. 2004. - V.53, P. 153-1 59.

36. Decastel, M., Haentjens, G., Aubery, M. and Goussault, Y. Differential entry of ricin into malignant and normal rat hepatocytes. / Exp.Cell Res. 1989. - V.180, P.399-408.

37. Derijard, B., Hibi, M., Wu, I.H., Barrett, T., Su, B., Deng, T., Karin, M. and Davis, R.J. JNK1: a protein kinase stimulated by UV light and Ha-Ras that binds and phosphorylates the c-Jun activation domain. / Cell. 1994. - V.76, P.1025-1037.

38. Devary, Y., Gottlieb, R.A., Smeal, T. and Karin, M. The mammalian ultraviolet response is triggered by activation of Src tyrosine kinases. I Cell. -1992. V.71, P.1081-1091.

39. Elsasser-Beile, U., Ruhnau, T., Freudenberg, N., Wetterauer, U. and Mengs, U. Antitumoral effect of recombinant mistletoe lectin on chemically induced urinary bladder carcinogenesis in a rat model. / Cancer. 2001 . - V.91, P.998-1004.

40. Endo, Y. Mechanism of action of ricin and related toxins on the inactivation of eukaryotic ribosomcs. / Cancer Treat .Res. 1988. - V.37, P.75-89.

41. Endo, Y. and Tsurugi, K. RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. Mechanism of action of the toxic lcctin ricin on eukaryotic ribosomes. / J.Biol.Chem. 1987. - V.262, P.8128-8130.

42. Endo, Y., Tsurugi, K. and Lambert, J.M. The site of action of six different ribosome-inactivating proteins from plants on eukaryotic ribosomcs: the RNA N-glycosidase activity of the proteins. / Biochem.Biophys.Res.Comnuin. -1988.- V.150, P.1032-1036.

43. Eschenburg, S., Krauspenhaar, R., Mikhailov, A., Stocva, S., Betzel, C. and Voellcr, W. Primary structure and molecular modeling of mistletoe lectin 1 from Viscum album. / Biochem.Biophys.Res.Commun. 1998. - V.247, P.367-372.

44. Faye, L., Greenwood, J.S. and Chrispeels, M.J. Urease in jack-bean (Canavalia ensiformis (L.) DC) seeds is a cytosolic protein. / Planta. 1986. -V.168, P.579-585.

45. Frankel, A., Tagge. E., Chandler, J., Burbage, C., Hancock, G., Vescly, J. and Willingham, M. Characterization of single site ricin toxin B chain mutants. / Bioconjug.Chem. 1996a. - V.7, P.30-37.

46. Frankel, A., Tagge, E., Chandler, J., Burbage, C. and Willingham, M. Double-site ricin B chain mutants retain galactose binding. / Protein Eng. -1996b. V.9, P.371-379.

47. Frankel, A., Welsh, P., Richardson, J. and Robertus, J.D. Role of arginine 180 and glutamic acid 177 of ricin toxin A chain in enzymatic inactivation of ribosomes. / Mol.Cell Biol. 1990. - V.10, P.6257-6263.

48. Frankel, A.E., Fu, T., Burbage, C., Chandler, J., Willingham, M.C. and Tagge, E.P. 1L2 fused to lectin-deficient ricin is toxic to human leukemia cells expressing the 1L2 receptor. I Leukemia. 1997a. - V.ll, P.22-30.

49. Franz, H. Mistletoe lectins and their A and B chains. / Oncology. -1986. V.43 Suppl 1, P.23-34.

50. Franz, H., Ziska, P. and Kindt, A. Isolation and properties of three lectins from mistletoe (Viscum album L.). / Biochem.J. 1 981. - V.195, P.481 -484.

51. Fujita, H., Morita, I. and Murota, S. A possible involvement of ion transporter in tumor necrosis factor alpha and cycloheximide-induced apoptosis of endothelial cells. / Mediators.Inflamm. 1999.-V.8, P.2 11-218.

52. Galcheva-Gargova, Z., Derijard, B., Wu, I.H. and Davis, R.J. An osmosensing signal transduction pathway in mammalian cells. / Science. 1994.- V.265, P.806-808.

53. Ginn, S.R. and Peterson, G.M. Studies related to the use of colchicine as a neurotoxin in the septohippocampal cholinergic system. / Brain Res. 1992. - V.590, P.144-152.

54. Girbes, T., Ferreras, J.M., Arias, F.J. and Stirpe, F. Description, distribution, activity and phylogenetic relationship of ribosome-inactivating proteins in plants, fungi and bacteria. / Mini.Rev.Med.Chem. 2004. - V.4, P.461-476.

55. Gluck, A., Endo, Y. and Wool, l.G. The ribosomal RNA identity elements for ricin and for alpha-sarcin: mutations in the putative CG pair that closes a GAGA tetraloop. / Nucleic Acids Res. 1994. - V.22, P.32 1-324.

56. Gong, J., Li, X. and Darzynkiewicz, Z. Different patterns of apoptosis of HL-60 cells induced by cycloheximide and camptothecin. / J.Cell Physiol. 1993. - V.157, P.263-270.

57. Goiiich, D., Hartmann, E., Prehn, S. and Rapoport, T.A. A protein of the endoplasmic reticulum involved early in polypeptide translocation. / Nature.- 1992. V.357, P.47-52.

58. Graves, R.A., Poole, D., Moiseyev, R., Bostanian, L.A. and Mandal, T.K. Encapsulation of indomethacin using coaxial ultrasonic atomizationfollowed by solvent evaporation. / Drug Dev.Ind.Pharm. — 2008. V.34, P.419-426.

59. Green, D.R. and Reed, J.C. Mitochondria and apoptosis. / Science. -1998. V.281, P.1309-1312.

60. Griesinger, C.B., Richards, C.D. and Ashmore, J.F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. / Eur.J Neurosci. -2004. V.20, P.41-50.

61. Griffith, L.G. Polymeric biomaterials. / Acta Materialia. 2000. -V.48, P.263-277.

62. Haas, S. and Kaina, B. c-Fos is involved in the cellular defence against the genotoxic effect of UV radiation. / Carcinogenesis. 1995. - V.16, P.985-991.

63. Hacker, G. The morphology of apoptosis. / Cell Tissue Res. 2000. - V.301, P.5-17.

64. Hansen, S.H., Sandvig, K. and Van Deurs B. Molecules internalized by elathrin-independent endocytosis are delivered to endosomes containing transferrin receptors. / J Cell Biol. 1993. - V.123, P.89-97.

65. Hartley, M.R. and Lord, J.M. Cytotoxic ribosome-inactivating lectins from plants. / Biochim.Biophys.Acta. 2004. - V.1701, P. 1-14.

66. Hasirci, V., Vrana, E., Zorlutuna, P., Ndreu, A., Yilgor, P., Basmanav, F.B. and Aydin, E. Nanobiomaterials: a review of the existing science and technology, and new approaches. I J.Biomater.Sci.Polym.Ed. 2006. - V.17, P.1241-1268.

67. Hatakeyama, T., Yamasaki, N. and Funatsu, G. Evidence for involvement of tryptophan residue in the low-affinity saccharide binding site of ricin D. / J.Biochem. (Tokyo). 1986. - V.99, P.1049-1056.

68. Hazes, B. and Read, R.J. Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated proteindegradation pathway to enter target cells. / Biochemistry. 1997. - V.36, P.1 1051-1 1054.

69. Hegde, R. and Podder, S.K. Evolution of tetrameric lectin Ricinus communis agglutinin from two variant groups of ricin toxin dimers. / Eur.J.Biochem. 1998. - V.254, P.596-601.

70. Helmy, M., Lombard, S. and Pieroni, G. Ricin RCA60: evidence of its phospholipase activity. / Biochem.Biophys.Res.Commun. 1999. - V.258,1. P.252-255.

71. Heus, H.A. and Pardi, A. Structural features that give rise to the unusual stability of RNA hairpins containing GNRA loops. / Science. 1991. -V.253, P.191-194.

72. Hibi, M., Lin, A., Smeal, T., Minden, A. and Karin, M. Identification of an oncoprotein- and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain. / Genes Dev. 1993. - V.7, P.2135-2148.

73. Horisberger, M. Colloidal gold : a cytochemical marker for light and fluorescent microscopy and for transmission and scanning electron microscopy. / Scan Electron Microsc. 1981,- P.9-3 1.

74. Hubbell, J.A. Bioactive biomaterials. / Curr.Opin.Biotechnol. -1999. V.10, P.123-129.

75. Hudson, T.H. and Grillo, F.G. Brefeldin-A enhancement of ricin A-chain immunotoxins and blockade of intact ricin, modeccin, and abrin. / J.Biol.Chem. 1991. - V.266, P. 1 85 86-1 8592.

76. Huguet, S.M., Stoeva, S., Schwamborn, C., Wilhelm, S., Stiefel, T. and Voelter, W. Complete amino acid sequence of the A chain of mistletoe lectin 1. / FEBS Lett. 1996. - V.399, P.153-157.

77. Hunziker-Basler, N., Zuzak, T.J., Eggenschwiler, J., Rist, L., Simoes-Wust, A.P. and Viviani, A. Prolonged cytotoxic effect of aqueous extracts from dried viscum album on bladder cancer cells. / Pharmazie. 2007. - V.62,1. P.237-238.

78. Hussain, M.M. A proposed model for the assembly of chylomicrons.

79. Atherosclerosis. 2000. - V.148, P.l-15.

80. Iordanov, M.S., Pribnow, D., Magun, J.L., Dinh, T.H., Pearson, J.A. and Magun, B.E. Ultraviolet radiation triggers the ribotoxic stress response in mammalian cells. / J.Biol.Chem. 1998. - V.273, P. 1 5794-1 5803.

81. Iversen, T.G., Skretting, G., Llorente, A., Nicoziani, P., van, D.B. and Sandvig, K. Endosome to Golgi transport of ricin is independent of clathrin and of the Rab9- and Rabl 1-GTPases. / Mol.Biol.Cell. 2001. - V.12, P.2099-2107.

82. Jacobson, M.D., Weil, M. and Raff, M.C. Programmed cell death in animal development. / Cell. 1997. - V.88, P.347-354.

83. Johannes, L. and Lamaze, C. Clathrin-dependent or not: is it still the question? / Traffic. 2002. - V.3, P.443-451.

84. Johnson, G.L. and Lapadat, R. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. / Science. 2002. -V.298, P.191 1-1912.

85. Kageyama, A., Kusano, I., Tamura, T., Oda, T. and Muramatsu, T. Comparison of the apoptosis-inducing abilities of various protein synthesis inhibitors in U937 cells. / Biosci.Biotechnol.Biochem. 2002. - V.66, P.835-839.

86. Katzin, B.J., Collins, E.J. and Robertus, J.D. Structure of ricin A-chain at 2.5 A. / Proteins. 1991. - V.10, P.25 1-259.

87. Kerr, R.O., Cardamone, J., Dalmasso, A.P. and Kaplan, M.E. Two mechanisms of erythrocyte destruction in penicillin-induced hemolytic anemia. / N.Engl.J Med. 1972. - V.287, P. 1322-1325.

88. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergcnsis. /

89. J.Gen.Microbiol. 1958. - V.19, P.497-506.

90. Kuroki, D.W., Bignami, G.S. and Wattenberg, E.V. Activation of stress-activator protein kinase/c-Jun N-terminal kinase by the non-TPA-type tumor promoter palytoxin. / Cancer Res. 1996. - V.56, P.637-644.

91. Kuwana, T., Mackey, M.R., Perkins, G., Ellisman, M.H., Latterich, M., Schneiter, R., Green, D.R. and Newmeyer, D.D. Bid, Bax, and lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane. / Cell. 2002. - V.lll, P.331-342.

92. Kyriakis, J.M., Banerjee, P., Nikolakaki, E., Dai, T., Rubie, E.A., Ahmad, M.F., Avruch, J. and Woodgett, J.R. The stress-activated protein kinase subfamily of c-Jun kinases. / Nature. 1 994. - V.369, P. 1 56-1 60.

93. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. / Nature. 1 970. - V.227, P.680-685.

94. Leonard, J.E., Grothaus, C.D. and Taetle, R. Ricin binding and protein synthesis inhibition in human hematopoietic cell lines. / Blood. 1988. -V.72, P.1357-1363.

95. Levine, B. and Klionsky, D.J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. / Dev.Cell. 2004. - V.6, P.463-477.

96. Lindenboim, L., Diamond, R., Rothenberg, E. and Stein, R. Apoptosis induced by serum deprivation of PC12 cells is not preceded by growth arrest and can occur at each phase of the cell cycle. / Cancer Res. 1995. - V.55, P.1242-1247.

97. Liu, Z.G., Baskaran, R., Lea-Chou, E.T., Wood, L.D., Chen, Y., Karin, M. and Wang, J.Y. Three distinct signalling responses by murine fibroblasts to genotoxic stress. / Nature. 1996. - V.384, P.273-276.

98. Lombard, S., Helmy, M.E. and Pieroni, G. Lipolytic activity of ricin from Ricinus sanguineus and Ricinus communis on neutral lipids. / Biochem.J. -2001. V.358, P.773-781.

99. Lord, J.M., Davey, J., Frigerio, L. and Roberts, L.M. Endoplasmic reticulum-associated protein degradation. / Semin.Cell Dev.Biol. 2000. - V.ll, P.159-164.

100. Lord, J.M., Hartley, M.R. and Roberts, L.M. Ribosome inactivating proteins of plants. / Semin.Cell Biol. 1991. - V.2, P.15-22.

101. Lord, J.M., Jolliffc, N.A., Marsden, C.J., Pateman, C.S., Smith, D.C., Spooner, R.A., Watson, P.D. and Roberts, L.M. Ricin. Mechanisms of cytotoxicity. / Toxicol.Rev. 2003. - V.22, P.53-64.

102. Majoul, I., Ferrari, D. and Soling, II.D. Reduction of protein disulfide bonds in an oxidizing environment. The disulfide bridge of cholera toxin A-subunit is reduced in the endoplasmic reticulum. / FEBS Lell. 1997. -V.401, P.104-108.

103. Manders, E.M.M., Verbeek, F.J. and Aten, J.A. Measurement of collocalization of objects in dual-colour confocal images. I J.Microscopy. 1993. - V.169, P.375-382.

104. Martin, S.J., Lcnnon, S.V., Bonham, A.M. and Cotter, T.G. Induction of apoptosis (programmed cell death) in human leukemic HL-60 cells by inhibition of RNA or protein synthesis. / J.Immunol. 1 990. - V.145, P. 1 8591867.

105. McLaren, A.C. Alternative materials to acrylic bone cement for delivery of depot antibiotics in orthopaedic infections. / Clin.Orthop.Relal Res. -2004. P.101-106.

106. Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. / Annu.Rev. Cell Dev.Biol. 1996. - V.12, P.575-625.

107. Moisenovich, M., Tonevitsky, A., Agapov, I., Niwa, H., Schevve, H. and Bereiter-Hahn, J. Differences in endocytosis and intracellular sorting of ricin and viscumin in 3T3 cells. / Eur.J.Cell Biol. 2002. - V.81, P.529-538.

108. Moisenovich, M., Tonevitsky, A., Maljuchenko, N., Kozlovskaya,-N., Agapov, I., Volknandt, W. and Bereiter-Hahn, J. Endosomal ricin transport: involvement of Rab4- and Rab5-positive compartments. / Histochem.Cell Biol. -2004. V.121, P.429-439.

109. Montesano, L., Cawley, D. and Herschman, H.R. Disuccinimidyl suberate cross-linked ricin does not inhibit cell-free protein synthesis. / Biochem.Biophys.Res.Commun. 1982. - V.109, P.7-13.

110. Montfort, W., Villafranca, J.E., Monzingo, A.F., Ernst, S.R., Katzin, B., Rutenber, E., Xuong, N.H., Hamlin, R. and Robertus, J.D. The three-dimensional structure of ricin at 2.8 A. / J.Biol.Chem. 1 987. - V.262, P.5398-5403.

111. Monzingo, A.F. and Robertus, J.D. X-ray analysis of substrate analogs in the ricin A-chain active site. / J.Mol.Biol. 1 992. - V.227, P. 1 1361 145.

112. Morlon-Guyot, J., Helmy, M., Lombard-Frasca, S., Pignol, D., Pieroni, G. and Beaumelle, B. Identification of the ricin lipase site and implication in cytotoxicity. / J.Biol.Chem. 2003. - V.278, P. 17006-1701 1.

113. Mosmann, T. Rapid eolorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. /

114. J.Immunol.Methods. 1983. - V.65, P.55-63.

115. Moulin, A., Teissere, M., Bernard, C. and Pieroni, G. Lipases of the euphorbiaceae family: purification of a lipase from Euphorbia characias latex and structure-function relationships with the B chain of ricin. /

116. Proc.Natl. Acad.Sci. U.S.A. 1994. - V.91, P.l 1328-1 1332.

117. Murphy, K.M., Ranganathan, V., Farnsworth, M.L., Kavallaris, M. and Lock, R.B. Bcl-2 inhibits Bax translocation from cytosol to mitochondria during drug-induced apoptosis of human tumor cells. / Cell Death.Differ. 2000.- V.7, P.102-1 11.

118. Nakagawa, T. and Yuan, J. Cross-talk between two cysteine protease families. Activation of caspase-12 by calpain in apoptosis. / J Cell Biol. 2000.- V.150, P.887-894.

119. Nakagawa-Yagi, Y. Induction of apoplotic cell death in differentiating neuroblastoma SH-SY5Y cells by colchicine. / Biochem.Biophys.Res. Commun. 1994. - V.199, P.807-817.

120. Narayanan, S., Surendranath, K., Bora, N., Surolia, A. and Karande, A.A. Ribosome inactivating proteins and apoptosis. / FEBS Lett. 2005. - V.579, P.1324-1331.

121. Niwa, H., Tonevitsky, A.G., Agapov, 1.1., Saward, S., Pfuller, U. and Palmer, R.A. Crystal structure at 3 A of mistletoe lectin I, a dimeric type-II ribosome-inactivating protein, complexcd with galactose. / Eur.J.Biochem. -2003. V.270, P.2739-2749.

122. Nunez, G., Benedict, M.A., Hu, Y. and Inohara, N. Caspases: the proteases of the apoptotic pathway. / Oncogene. 1998. - V.17, P.3237-3245.

123. Obrig, T.G., Culp, W.J., McKeehan, W.L. and Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. / J.Biol.Chem. 1971. - V.246, P.174-181.

124. Okada, H. and Mak, T.W. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells. / Nat.Rev.Cancer. 2004. - V.4, P.592-603.

125. Olivier, J.C. Drug transport to brain with targeted nanoparticles. / NeuroRx. 2005. - V.2, P. I 08-1 19.

126. Olsnes, S., Refsnes, K. and Pihl, A. Mechanism of action of the toxic lectins abrin and ricin. / Nature. 1974. - V.249, P.627-631.

127. Orlov, S.N., Thorin-Trescases, N., Kotelevtsev, S.V., Tremblay, J. and Hamet, P. Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle at a site upstream of caspase-3. / J Biol Chem. 1 999. -V.274, P.16545-16552.

128. Padanilam, B.J. Cell death induced by acute renal injury: a perspective on the contributions of apoptosis and necrosis. / Am.J Physiol Renal Physiol. 2003. - V.284, P.F608-F627.

129. Palmer, R.A. and Niwa, H. X-ray crystallographic studies of protein-Iigand interactions. / Biochemical Society Transactions. 2003. - V.31, P.973-979.

130. Peumans, W.J., Hao, Q. and Van Damme, E.J. Ribosome-inactivating proteins from plants: more than RNA N-glycosidases? / FASEB J. 200 I. - V.15, P.1493-1506.

131. Ramalingam, T.S., Das, P.K. and Podder, S.K. Ricin-membrane interaction: membrane penetration depth by fluorescence quenching and resonance energy transfer. / Biochemistry. 1994. - V.33, P. 12247-12254.

132. Raman, M., Chen, W. and Cobb, M.H. Differential regulation and properties of MAPKs. / Oncogene. 2007. - V.26, P.3 100-31 12.

133. Rao, R.V., Ellerby, H.M. and Brcdesen, D.E. Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program. / Cell Death.Dijfer. 2004. - V.ll, P.372-380.

134. Rao, S.S. and Grollman, A.P. Cycloheximide resistance in yeast: a property of the 60s ribosomal subunit. / Biochem.Biophys.Res.Commtin. 1967. -V.29, P.696-704.

135. Rapak, A., Falnes, P.O. and Olsnes, S. Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. / Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1997. - V.94, P.3783-3788.

136. Ready, M.P., Kim, Y. and Robertus, J.D. Site-directed mutagenesis of ricin A-chain and implications for the mechanism of action. / Proteins. — 1991.- V.10, P.270-278.

137. Reed, J.C. and Green, D.R. Remodeling for demolition: changes in mitochondrial ultrastructure during apoptosis. / Mol.Cell. 2002. - V.9, P. 1 -3.

138. Romisch, K. Peptide traffic across the ER membrane: TAPs and other conduits. / Trends Cell Biol. 1994. - V.4, P.311-314.

139. Rozengurt, E. and Heppel, L.A. Serum rapidly stimulates ouabain-sensitive 86-RB+ influx in quiescent 3T3 cells. / Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. — 1975. V.12, P.4492-4495.

140. Rudiger, H. and Gabius, H.J. Plant lectins: occurrence, biochemistry, functions and applications. / Glycoconj.J. 2001. - V.18, P.589-613.

141. Rutenbcr, E., Katzin, B.J., Ernst, S., Collins, E.J., Mlsna, D., Ready, M.P. and Robertus, J.D. Crystallographic refinement of ricin to 2.5 A. / Proteins.- 1991. V.10, P.240-250.

142. Rutenber, E. and Robertus, J.D. Structure of ricin B-chain at 2.5 A resolution. / Proteins. 1991. - V.10, P.260-269.

143. Sandvig, K., Garred, O., Holm, P.K. and Van Deurs B. Endocytosis and intracellular transport of protein toxins. / Biochem.Soc. Trans. 1993. - V.21 ( Pt 3), P.707-71 1.

144. Sandvig, K. and Olsnes, S. Entry of the toxic proteins abrin, modeccin, ricin, and diphtheria toxin into cells. I. Requirement for calcium. / J.Biol.Chem. 1982a. - V.257, P.7495-7503.

145. Sandvig, K. and Van Deurs, B. Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. / EMBO J. 2000. -V.19, P.5943-5950.

146. Sandvig, K. and Van Deurs, B. Endocytosis, intracellular transport, and cytotoxic action of Shiga toxin and ricin. / Physiol Rev. 1996. - V.76,1. P.949-966.

147. Sandvig, K. and Van Deurs, B. Delivery into cells: lessons learned from plant and bacterial toxins. / Gene Ther. 2005. - V.12, P.865-872.

148. Schmid, S.L. and Cullis, P.R. Membrane sorting. Endosome marker is fat not fiction. / Nature. 1998. - V.392, P.135-136.

149. Schneider, E.M. and Sievers, A. Concanavalin A binds to the endoplasmic reticulum and the starch grain surface of root statocytes. / Planta. -1981. V.152, P.177-180.

150. Schreiber, M., Baumann, B., Cotten, M., Angel, P. and Wagner, E.F. Fos is an essential component of the mammalian UV response. / EMBO J. 1 995. - V.14, P.5338-5349.

151. Shu, J., Hitomi, M. and Stacey, D. Activation of JNK/SAPK pathway is not directly inhibitory for cell cycle progression in N1H3T3 cells. / Oncogene. 1996. - V.13, P.2421-2430.

152. Sikriwal, D., Ghosh, P. and Batra, J.K. Ribosome inactivating protein saporin induces apoptosis through mitochondrial cascade, independent of translation inhibition. / Int.J Biochem.Cell Biol. 2008. - V.40, P.2880-2888.

153. Simmons, B.M., Stahl, P.D. and Russell, J.H. Mannose receptor-mediated uptake of ricin toxin and ricin A chain by macrophages. Multiple intracellular pathways for a chain translocation. / J.Biol.Chem. 1986. - V.261, P.7912-7920.

154. Simpson, J.C., Dascher, C., Roberts, L.M., Lord, J.M. and Balch, W.E. Ricin cytotoxicity is sensitive to recycling between the endoplasmic reticulum and the Golgi complex. / J.Biol.Chem. 1995a. - V.270, P.20078-20083.

155. Simpson, J.C., Lord, J.M. and Roberts, L.M. Point mutations in the hydrophobic C-terminal region of ricin A chain indicate that Pro250 plays a key role in membrane translocation. / Eur.J.Biochem. 1995b. - V.232, P.458-463.

156. Simpson, J.C., Roberts, L.M. and Lord, J.M. Free ricin A chain reaches an early compartment of the secretory pathway before it enters the cytosol. / Exp.Cell Res. 1996. - V.229, P.447-451.

157. Simpson, J.C., Roberts, L.M. and Lord, J.M. Catalytic and cytotoxic activities of recombinant ricin A chain mutants with charged residues added at the carboxyl terminus. / Protein Expr.Purif. 1995c. - V.6, P.665-670.

158. Singh, B.J., Singh, J., Kamboj, S.S., Nijjar, K.K., Agrewala, J.N., Kumar, V., Kumar, A. and Saxena, A.K. Mitogenic and anti-proliferative activity of a lectin from the tubers of Voodoo lily (Sauromatum venosum). /

159. Biochim.Biophys.Acta. 2005. - V.1723, P. 163-1 74.

160. Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J.T., Bokesch, H., Kenney, S. and Boyd, M.R. New

161. Colorimetric Cytotoxicity Assay for Anticancer-Drug Screening. / JNCl Journal of the National Cancer Institute. 1990. - V.82, P. 1 107-1 1 12.

162. Spadoro-Tank, J.P. and Etzler, M.E. Heath Shock Enhances the Synthesis of a Lectin-Related Protein in Dolichos biflorus Cell Suspension Cultures. / Plant Physiol. 1988. - V.88, P.l 131-1 135.

163. Steeves, R.M., Denton, M.E., Barnard, F.C., Henry, A. and Lambert, J.M. Identification of three oligosaccharide binding sites in ricin. / Biochemistry. 1999. - V.38, P.l 1677-1 1685.

164. Stirpe, F. Ribosome-inactivating proteins. / Toxicon. 2004. - V.44, P.371-383.

165. Stirpe, F., Barbieri, L., Abbondanza, A., Falasca, A.I., Brown, A.N., Sandvig, K., Olsnes, S. and Pihl, A. Properties of volkensin, a toxic lectin from Adenia volkensii. / J.Biol. Chem. 1985. - V.260, P. 14589-14595.

166. Stirpe, F., Barbieri, L., Battelli, M.G., Soria, M. and Lappi, D.A. Ribosome-inactivating proteins from plants: present status and future prospects. / Biotechnology (N.Y.). 1992. - V.10, P.405-412.

167. Suzuki, Y., Takeda, M., Obara, N. and Suzuki, N. Colchicine-induced cell death and proliferation in the olfactory epithelium and vomeronasal organ of the mouse. / Anal.Embryol.(Berl). 1998. - V.198, P.43-51.

168. Sweeney, E.C., Tonevitsky, A.G., Palmer, R.A., Niwa, II., Pfueller, U., Eck, J., Lentzen, H., Agapov, I.I. and Kirpichnikov, M.P. Mistletoe lectin I forms a double trefoil structure. / FEBS Lett. 1998. - V.431, P.367-370.

169. Tahirov, T.H., Lu, T.H., Liaw, Y.C., Chen, Y.L. and Lin, J.Y. Crystal structure of abrin-a at 2.14 A. / J.Mol.Biol. 1995. - V.250, P.354-367.

170. Thies, A., Dautel, P., Meyer, A., Pfuller, U. and Schumacher, U. Low-dose mistletoe lectin-I reduces melanoma growth and spread in a scid mouse xenograft model. / Br. J.Cancer. 2008. - V.98, P. 106-1 12.

171. Todaro, G.J. and Green, H. Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines. / J.Cell Biol. 1963. - V. 17, P.299-3 13.

172. Urech, K., Buessing, A., Thalmann, G., Schaefermeyer, H. and Heusser, P. Antiproliferative effects of mistletoe (Viscum album L.) extract in urinary bladder carcinoma cell lines. / Anticancer Res. 2006. - V.26, P.3049-3055.

173. Utsumi, T., Ide, A. and Funatsu, G. Ricin A-chain induces fusion of small unilamellar vesicles at neutral pH. / FEBS Lett. 1 989. - V.242, P.255-258.

174. Van Damme, E.J., Roy, S., Barre, A., Rouge, P., Van, L.F. and Peumans, W.J. The major elderberry (Sambucus nigra) fruit protein is a lectin derived from a truncated type 2 ribosome-inactivating protein. / Plant J. 1997. - V.12, P. 1251-1260.

175. Van Deurs, B., Sandvig, K., Petersen, O.W., Olsnes, S., Simons, K. and Griffiths, G. Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-Golgi network. I J.Cell Biol. 1988. - V.106, P.253-267.

176. Van Deurs, B., Tonnessen, T.I., Petersen, O.W., Sandvig, K. and Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. / J. Cell Biol. 1986. - V.102, P.37-47.

177. Vaux, D.L., Whitney, D. and Weissman, I.L. Activation of physiological cell death mechanisms by a necrosis-causing agent. / Microsc.Res. Tech. 1996. - V.34, P.259-266.

178. Vettor, M., Perugini, P., Scalia, S., Conti, B., Genta, I., Modena, T. and Pavanetto, F. Poly(D,L-lactide) nanoeneapsulation to reduce photoinactivation of a sunscreen agent. / Int.J.Cosmel.Sci. 2008. - V.30, P.2 1 9227.

179. Villafranca, J.E. and Robertus, J.D. Ricin B chain is a product of gene duplication. / J.Biol. Chem. 1981. - V.256, P.554-556.

180. Waetzig, V. and Herdegen, T. A single c-Jun N-terminal kinase isoform (JNK3-p54) is an effector in both neuronal differentiation and cell death. / J Biol Chem. 2003. - V.278, P.567-572.

181. Walchli, S., Skanland, S.S., Gregers, T.F., Lauvrak, S.U., Torgersen, M.L., Ying, ML, Kuroda, S., Maturana, A. and Sandvig, K. The Mitogen-activated protein kinase p38 links Shiga Toxin-dependent signaling and trafficking. /

182. Mo I. Bio I Cell. 2008. - V.19, P.95-104.

183. Wales, R., Richardson, P.T., Roberts, L.M., Woodland, H.R. and Lord, J.M. Mutational analysis of the galactose binding ability of recombinant ricin B chain. I J.Biol.Chem. 1991. - V.266, P. 1 9 1 72-1 9 1 79.

184. Wallace, W., Schaefer, L.H. and Swedlow, J.R. A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy. / Biotechniques. 2001. - V.31,1. P.1076-8, 1080, 1082.

185. Waskicwicz, A.J. and Cooper, J.A. Mitogen and stress response pathways: MAP kinase cascades and phosphatase regulation in mammals and yeast. / Curr. Opin. Cell Biol. 1995. - V.7, P.798-805.

186. Wesche, J. Retrograde transport of ricin. / Int. J.Med.Microbiol. -2002. V.291, P.517-521.

187. Wesche, J., Rapak, A. and Olsnes, S. Dependence of ricin toxicity on translocation of the toxin A-chain from the endoplasmic reticulum to the cytosol. / J.Biol. Chem. 1999. - V.274, P.34443-34449.

188. Weston, S.A., Tucker, A.D., Thatcher, D.R., Derbyshire, D.J. and Pauptit, R.A. X-ray structure of recombinant ricin A-chain at 1.8 A resolution. / J.Mol.Biol. 1994. - V.244, P.4 10-422.

189. White, J.K., Stewart, A., Popoff, J.F., Wilson, S. and Blackwell, J.M. Incomplete glycosylation and defective intracellular targeting of mutant solute carrier family 1 1 member 1 (Slcl lal). / Biochem.J. 2004. - V.382, P.811-819.

190. Woese, C.R., Winker, S. and Gutell, R.R. Architecture of ribosomal RNA: constraints on the sequence of "tetra-loops". / Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1990. V.87, P.8467-8471.

191. Wool, I.G., Gluck, A. and Endo, Y. Ribotoxin recognition of ribosomal RNA and a proposal for the mechanism of translocation. / Trends Biochem.Sci. 1992. - V.17, P.266-269.

192. Wu, A.M., Chin, L.K., Franz, H., Pfuller, U. and Herp, A. Carbohydrate specificity of the receptor sites of mistletoe toxic lectin-1. / Biochim.Biophys.Acta. 1992. - V.1117, P.232-234.

193. Xia, Z., Dickens, M., Raingeaud, J., Davis, R.J. and Greenberg, M.E. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. / Science. -1995. V.270, P.1326-1331.

194. Yi, X., Yin, X.M. and Dong, Z. Inhibition of Bid-induced Apoptosis by Bcl-2. tBid INSERTION, Bax TRANSLOCATION, AND Bax/Bak OLIGOMERIZATION SUPPRESSED. / Journal of Biological Chemistry. 2003. - V.278, P.16992-16999.

195. Youle, R.J. and Colombatti, M. Hybridoma cells containing intracellular anti-ricin antibodies show ricin meets secretory antibody before entering the cytosol. / J.Biol.Chem. 1987. - V.262, P.4676-4682.

196. Zhan, J., Stayton, P. and Press, O.W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (K.DEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. / Cancer1.munol.Immunother. 1998. - V.46, P.55-60.

197. Zhang, B., Ramonell, K., Somerville, S. and Stacey, G. Characterization of early, chitin-induced gene expression in Arabidopsis. / Mol.Plant Microbe Interact. 2002. - V.15, P.963-970.

198. Zhang, H., Zukowski, E., Balu, R. and Gregurick, S.K. A dynamics study of the A-chain of ricin by terahertz vibrational calculation and normal modes analysis. / J Mol.Graph.Model. 2009. - V.27, P.655-663.

199. Ziska, P. and Franz, H. Studies on the interaction of the mistletoe lectin I with carbohydrates. / Experientia. 1981. - V.37, P.219.

200. Zuzak, T.J., Rist, L., Eggenschwiler, J., Grotzer, M.A. and Viviani, A. Paediatric medulloblastoma cells are susceptible to Viscum album (Mistletoe) preparations. / Anticancer Res. 2006. - V.26, P.3485-3492.

Информация о работе

Хапчаев, Шамиль Юсуфович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.25

Диссертация

Особенности внутриклеточного транспорта и биологическая активность рицина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы