Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли связывающих субъединиц в механизме действия растительных токсинов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли связывающих субъединиц в механизме действия растительных токсинов"



ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ О ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ

ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ -

и-1 '

\ ^

На правах рукописи

ШАМШИ Е В

Абдижапар Турабыевич

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ СВЯЗЫВАЮЩИХ СУБЪЕДИНИЦ В МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТОКСИНОВ

03. 00. 03 — Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии Научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель доктор биологических наук Тоневицкий А. Г.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Алексеев Л. П., кандидат химических наук Комиссаров А. А.

Ведущая организация — Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского.

Защита диссертации состоится « ... » . . . 1994 г. / У

в « .» часов на заседании специализированного совета Д 098.12.01 при Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Диссертация разослана « . . . » . . . / . . . 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

¿£XXSJ-kUCCT?> та.чи^ Растительные токсины яви>датси уникалькчп мрдвль» для фунда-лантальних исследований взаииодойнтрмя и транспорта болкоз через нек£р&ну. Рцбооом-инегсгивируБПИв 3.»лки (иол. наиоа около 30 кДа) I клаось, ингиЗируот белок-оиотвзир'/адяЛ аппарат клеток, но неспособны самостоятельно проникать чаряз понораиу. Другие белки, сеи<зйство дектинаа, ппогпСгн сйязцвятьоя с. поверхноотигши углепода::и клеток, но ив обладает хзтадитичоокоЯ &кти=цостью. Раститольнн» текоиаи п ¡гискуишг пр1Шйллесаг к риЗосон-ниакти&жзукаито бвякак II кльооа (и-л. ::ассс. около. 80 г.Яа), которая оа^плеют одпсврвиелно этиии лвуни caoftcvsa».«".. Зти Звлки состоят из «цуг суЭДвдишш и с-псо сваи саностохтвзто проникать чзрез квпЯ^япу и аыгквать ГНЬйЛЪ клеток.

Рикич иъ аьцлч и«о<овв.:ии Rioir.ua Coanunin и виокукмя из ополи СвпоР. Visoua Album, оостоят ил каталитически кхтнэиоД А~ оуб-ьоди<си1Л-". и свгг.».1!воа;лчй В-оуЗъвдиккцц. А-субъчдиннцц (30 к Да) tokohsios ЯЬДНЮТОЯ ГаООКООПОЦИ^МЧвОКНМИ Н-ГЛИКОЭИДВЗОНН и

анявп^яэт пцлчил в полоззнии 432-1 255 cPHR рибосомы эукагиотичаог.сД клртки. В-оубьздииицы (32 кДа) сзяэиэастоя о рлцеяторьии, оодбряочнми хоццпвуп галактозу'" иа поверхности клотох. Путем р-гн-эптор-оноерэдокаиизго эндоцктоэа токсина тюг>здазт п клетку. Нвхеииэи трансмакбраикого ягренос» А-рубье^химш; из внутриклеточных везикул ио устаноэлон. Выоокая »««охтинкооть ии'-отсксичвского дпйстзия л-субьойиниц сделала эти агентами длч получения зоиъш'атоэ с антителами,' называемыми ^ккуиотокогшгкн, которые могут попользоваться яля избирательной

I

^яниияации олр^далошшч локудяций ¡слета«.

Цитотоксическак активность иммуиотоксичоэ о А-суЗьедшшцаии токсинов киле активности н&тивяого токсина и усичизаэтоя при добавлении В-субъединицы иди иккунзтохсикое с З-оубъздияицей. Боэлояно, в нннунотоксииах нарушена тракслолги.ц'я А-субъсдипицн через немброну, которая е полной керз оеуксствяяэгся в катгажок Токсине посредствен 8-субъедикици. Работа пое-рящека »:эучеяио роли связываювих субъедикий в кехакизие действие токсинов, что дает направление поиска новых иммукстоксиков, иоззоляэт повысить активнооть ранее полученных коньогатов, понять детальный механизм действия растительных токсинов.

Пели и задачи рзботн. Цевью данной работы является изучение роли В-субъединиц риаина и вигкукиха в исханиэие действия токсинов, в частности, в трансиембрьнном переноса каталитически активной субъединииа.

Для достижения этой цели.были поставлены елгдуэвне задачи:

1. Получение химерного токсина, оостояпс» о из Л-субъединкци виокуница и В-сувьединицы рицина, изучений его свойств.

2. Сравнение цитотоксической активности химерного и натизнкх токсинов с активностью иммунотоксинов на основе А-субъеяиниц рицина и вискумина.

3. Получение рекомбинантной В-субьединицы рицкка, исследование ез свойств, стабильности структуры и биологической активности. Изучение роли олигосахаридов В-субьединицы рицина.

4. Получение моноклональных антител против В-субьединицы вискумина, исследование внутриклеточного транспорта вискумина на гибридомах, сиктезириующих антитела против этого токсина.

»'■у'г.'.-я иовкг-уп_ррбатч^ Вперило получек хииерныП токсин,

ооотойикй кз Л-оуЗгсЕ'л::ицы вмсхукика н В-субьолмницы рицина. ОбпЕругана "зэииткая" роль В-субъедипицы рицина. Подучеия роко:«6ииапт:тг) Енояогмческя активная В-субъедштиа рицина и нгуче:;а роль олипсахяридоз я поддеряаним стабильности хог.дорнеинн н биоиогичгскоЯ актигасети белка. 'Изучен нвханиэн оворс-чиеяиия (Го1с11п2) В-субъединиии рицина, роль отдедышх ЗЯЧГ.СК.КСЛ0Т 5 »то-.', ^роцгсоа. Вперзив лояучеиц гибрид охи н .ионохлояпльиыв аятитая& нротиз разтитеяьисго токеича пискумина.

Рпяктичягкяя пяттупятт. рпУот" Получении» рлз7лътаты изучения роли Б-суб-ьедиииц таксисов яаэт нсисе иапраслеяиэ поиска и:1ну5!0т0кс1{«02 и позаоляст повисит* ектияность уз« получвичыз коньюгатов. Получечм мДТ ТВЗЗ, Т635, ТВ? и ТВ12 гуявлясние 3-оуйъогиянцу зккупм!'".. Разработай« нетодн опр-»велсда/.л аиокунт:« в экстргиткз онв«и, что пгзроляот стандартизовать акодогическке г.репарата.

йдадйаиия—дадудьтатоп....и ихбликацци-ь. Результата иастог.иой работ« докдаднаались ка мозлабораторном семинаре ВНИИ Генетики, кг Всероссийской конференции "Новое направление биотехнологии" (Пусийо, 1892). на Международной конференции по трансплантации (йззйцария, 1994).

Оснозыо материалы диссертации опубликозаки в 4 печатных РЕ.ботзя.

I _ Диссертация состоит иа оледугпин

разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводи н описок лцтературы. Работа проиллюстрирована 19-рисунками и 2 таблицами.

ИаТЕРМЛН И НЕГО ли

__Й-оуЯ'чг»яи»и» - Рицин

экстрагировали из секдн клчщевияа Ricinus coosiunis по методике, опноаиной ранее [liicolson G.L. and Blaunstpin J., 1872]. Изолированные Д- и В-субъздиницы вцдэяяли по катох.нкз, опией:;>ток в [Pultdn R.S. et al., 1980]. Лекткк кз о:;члы белой (Viecun albur) - виокушш и ere А - с у бг. з дун > ни г били предоставлены сотрудниками Университети Биттац/Хердекко, Гермалья. Получения хиияриого тптпинв. Химеркмй токсил к.з А-суйъодикицы виекукина и В-cytíbeдипниы рицида получи.'.,: с покоила реакции тиолдисудъфидного ебчваа. Изосироваину» В - су бг> едипмщ' ришшг. инкубировали о присутствии 5 нК реагента Зллмзнп (ЯТНВ). А-суйъоаиницу сиспуника активировали г поморья 1.0 и(! дитиотрвитода. Модифицированные субъел: ¡чпцы г-окс;гаоо az'b-jmnziuiti и инкубировали. Очистку полученного хж-.дри^го «m::.p¿. проъ-одил» гельфильтрацией. Чистоту полученных toübíiHob и и:; субъеди::иц оиепив&ли о локоцыэ электрофореза в нрпиак.рил1»ниднои голь (ПААГ) 5 присутствии додзцилсудьоата На (ЛДС-Нз> по Нэннлн.

рицина в pUC12 плазмидах, pAKG, была любезно предоставлена Др. Е.Weaver (Университет Канзаса, США). Для соз;;аы:я РТЕ ВаюШ Фрагментов использовали пелинераэчую цепную реакции. Продукт реакции субклснирозали в pet3a. Pet,3a-PTB бнла попользована для трансформации ытахша BL21CD3) E.coli. С помощью сз'Лт-специфического кутагвнеза были получены апи мутаитнче ®оркы. Галактоэосвязивыаюшую активность токсинов оценизали izo г-вязивэки»: с асиало^етуиион методон имиунофернентзкц о анализа (Kv-&>.

Актигенкыо свойотза токсинов и их су0з>вд.чииц определяли о псмоньо лоно- и ао.чиклоквлълнх антител методом ИФА. Структуру йояков изучали методом совотрэнаой ^луорвсавиции на опехтрофяуорииотра "Днмико' 5РР-500".

Дмхидчия--схЯрутпп—Л_цаашшщяшг. шггцхад—Для

'получения гиЗридон бньн нсподьэоваяи клетки йишаой «излома ЗРЯ/0 и еедеэегаи: имиулиаирсванкык ккпеЯ линии Ва1Ь/о. Теотированиа клоиоа, оиктвэируезих антитзда против А- н В-оубъединиц виокуикяа, пропояиаи натолои ИФА. Очиотку конАТ из асцита проводили хроматографией яа 0ЕЛВ-Туорваг1-650И. Афсиплорть нонАТ ТВ12 опредолили радиолиггшдкы;« «отодои.

Научна_глкг.шша_11.25.Х ]_ц_ _аагшдаанча_а__клахадяц^ Печения

токси'.юь рпдиоакгиэкым йодом проаолнлм о помопьо иодогвнв [Ргакяг и БрвсИ, 1832] в присутствии 50 мМ «актоэи. Связывание меченых

Колков о клв-дани енаяиаировали э г.оорлкиэт** Скэтчардз. Охо г.д алюи< а Л'Ж д~г ашчаайда-^т я в а о о т Цитотокснчвс^ов

Лвйегзив токоико» сиениаади по выживаемости кяеток согласно методике [Мозвс&п Т., 1283], по ингиЗироз&ниэ включения С^Н]-ткиилаяа или (^Н]-лзйаииь.

результаты :: обсузджш г.. азягчиш и сбсйства пглер:;ого тамлшд из а-субъкякшщн с?'<ж?иичл и п-субъздшиш г:пип1л.

| 6 результат? тиолдиоудь®идного оЗиеив. при ичкубации й-

I

^убмлиницц рнцинз. (РТВ, 34кДа) о акткэироваииоГ! диоул^идноП »рупгой >: А-субъееииния вмокуинна (БТА, 29 гЗа) обрязслчдея ГЧТвроДИИвр , НСДОб'.ШИ ивтивным токсинам. Предварительна било

определено, что в данных условиях выход гонодимеров не более 5$. Гельфильтрация иикуб&ционкой оивси иояифици^"оубъ^днкиц на колонке Зирег<1йх-75 СИ 10/30)показала, что примерно 30? материала составлял белок о иол. каосой 60 кДь. Электрофорез (рио. 1,а) в ПААГ показав, что полученный здкъогй- о ион. кассой 60 нЯ* с о от опт двух оубъединиц, и более «егздя га них (20 кЛл) выявляется на имиукоблоттннге мок£Т против ВТ А (рис. 1,6).

Шх1СГ

—97

—63

UKÜO

—яг

т-66

—31

—«4

- •' —31 ■

-14

Ъ)

Рио.2. Электрофоре» а ПААГ (12%) (а) и инмуноблрттикг (6) химерного токсина; 1 - в буфере без нерпапто^тгнола, -2 -в буфере с иеркяятоэтоколок, (Ь - нонАТ ТА5 выявляют А-субъадшгииу виокуимла). '

Галактозосвязывавщая активность химерного токоика .не отличается от таковой кативного рицина, что было показано по ингибированио связывания меченого биотикои рицина о асиадофетуикои. Таким образом,, получен химерный токоин, состоящий из : ВТА и РТВ. связанных дисульфидной связью.

г

Цитотоксическую активность химерного и нативных токоинов оценивали по иг'гибировапип включения [3Н]-тинидина на клетках линии ,7игН&1:. Оказалось, что цитотоксическая активность нативного рицина примерно в 30 раз выше, чем активность нативного вискумила '(рис. 2,А). Цитотоксичяость химерного токсина, имеющего теку» же связывающую активность, что И рицин, лиже, чем цнтстоксичность нативного рицина и незначительно вы4е активности иатизяого вискукина (рис. 2,А).

Концентрация белка (М)

-Ч ,0-14 10-" кг" ю" 10" Концентрация белка (М)

Рис.2. А - Цитотоксическое действие- нативного рицина (1>, химерного токсина (2) и вискумина (3) на клетки линии .1игса<:. В - Цитотоксическое действие токсинов в присутствии . 10 мН НН^О; рицин (1), химерный токсин (2) и вискумия (3).

Как известно, в процессе цйтотоксического'действия на клетки токсины проходят четыре этапа: связывание с рецептором, интврнализация, транспорт к месту трансмембранного переноса (в области комплекса Гольджи), и транслокация А-субъединицы в цитоплазму. Сравнили первый этап взаимодействия токсинов с

клетками. Дли »того врооодили коанчвогвекку» оиег.ку !свЛзивдоми^ ивот иа поверхности юяатох «о Связывании С^-^^ХЗ-рииииа м виокуммка ка клетк&х ¿книи .ТигсаЬ к адскока гипсфизв' человека. На -, рис. 3 показаны рваультьты овязкэакия бел^оэ .' кг. клетках ЛигсаЬ ь координатах Скэтчарда. Параметры сьтаивания представлена в табл. 1. '

Рис.3. Связывание рииика (о) и t3Z5Xl-»искумина (о) с клетками лкяик Jurcat в координатах Скэтчарда. В - количество (нг) связанного . токсина («а 3.5х105 клеток); F -• количество свободного

токсина (кг-).

В (нг)

ТабД! 1. Паракетрн связывания рицина и вискуиика с клвтп"ик.

клетки число нест связывания

. - на клетке

рицин виокумик

ЛигсаЬ . 8,8x10е. 5,4*10^

аденома гипофиза 15,0x10° 7,4к106

"(И"'1)

рицин

7,7x10? 8x10е

виснуиик

7,0x10? 4,0x10°

Как видно из таблицы 1. параметры овязыаакия (константа связывания и. число нест связывания) рицина и Иискумика ни клетках отличаются незначительно. Такие известно, , что изолированные А-субъединииы рицина (РТА) и эискуиина обладают одинаковой активностью. Незначительная разница в количество «ест связывания не объясняет высокую активность рицина

Были получены коньигаты рта и вта г. монежлональииии антителвм-и против поверхностных антиг-нг.в мтти-СЛ5/ТТА и

СЯ5/ВТА. Для кдоток-ииввией Jurcat MIjq иипунотокоина анти-СД5/РТА ссотьэлял ЗлЮ"*0 Н. Имнукотокоия анти-СД5/ВТА оказался р 00 pas и'лтквнва (ИД50=2а10"^1 И) коньвгата анти-СД5/РТА. Срвэнитолышй анализ ЭФвехтияиости коиьпгатов с яатквиыми

токеячани показал, что актиьиость р1<цина в 1000 раз выие

/

ак-гивиости икмунотоксина пнтн-СД5/РТА. ИД50 »искуиииа ооотавлял Н, что незначительно отяншетоя от активности анти СДЗ/ВТА, несмотря на то, что количество СД5 антигенов на поверхности кйвток, значительно кииа (8,3x10^ па клетку). Эти даилыэ по^золяит делать готол о том, что роль В-оубъедмтщ рицине и вискуиина т> состаао яатиышх токсичос нвидентичиа.

а присутствии лизосомотролного агента ttH^Cl, котогкй нейтрализует pH лиэосон и ингибирует лойотвив протеолитичвеких оериоктоз, ахтивцость ьисхумина усидиваатоя а 10 раз, тогда как ахтизиоотъ рицина sie изизняется (рис. 2,Б). Цнтотокоичнооть химарнсто токсина в присутствии NH4C] усиливается и сравнима с активность» рицина (рис. 2,В). Значительное уенлакие яктиьмости обълоикзтея уканьзацмэм процесса деградации кихьрнпго токсина ■под действием ттротволитическик ферменте» лиэосон'. Незначительное елияние üiijjCX на а::тивяост?> иативно^о рицина оиидэтельствучт о теи, что voxokv маиеа пелзеряен деградгции э процессе транспорта s иео..гу грамслокашш А-субъединииы, Это указывает на то, что В-оу5ъедикииа рицина я составе натнвного токсина заииаает А-

¿убъедмки,л' от деградации протоолитическими феривптгпй пифосом.

i

З.-от ".га^нтний" оегект «ля иммунетокемнов и хинеркогэ токсина

познп получить с понопь» KH4CI. Важно откзткть, усиление

HvtToiоксическоП активности иммунстохсинов о А-субъедикицчй рицина

i 0

при добавлении В-субъединицы. Такое потекциируюдее влияние, по-, видимому, моано объяснить защитной рольп В-субъедиинцы.

2. ПОЛУЧЕНИЕ РБКОНБИНЫШгаЙ В-СУБЪЕДШПНШ П ИЗУЧЕНИЕ

ЕЕ АНТНГЕННОСТИ И ГАЛАИОЗССВЯЗЦВАЖСИ &$СТКЗН0СТИ После индуцирования о покощ>ю ИПТГ, клетки бактерии, трансформированные РТВ-экспреосирувщей плазки£ой, продуцировали рекомбинантнуп РТВ (рРТВ) в тельцах включения (рио. 4, е.). Электрофорез в ПААГ в присутствии ДДС-На поклэад, что з тельцах включения содержится белок 29 кДа, который выявляется на икнукоблоттинге антителами против РТВ (ркс. 4,Ь). ВыявлненыЙ антителами белок с молекулярной массой около 20 кДа, вероятно, является гродуктом протеолиза.

Рис.4 Электрофорез в ПААГ (а) нммуноблоттикг (Ь>: экстракт клеток. E.coli - 1 ; растворимый экстракт кэ E.coli - 2; белки телец включения - 3; РТВ - кативная В-су8ъединииа рицина; И стандартные белки (цветные стандарты в Ъ).

Реиатурэцив рРТВ проводили при низких кокцетрациях белка в

присутствии 20 н1) лактози, 2,5 »И восстановленного глотатиоиа и 0,5 нН окиалонного глютатиона. Затем белок, концентрировали и наносили ка колонку с иммобилизованной лактозой. Связанный белок элаировали 20 иИ лактозой. Элюат анализировали с поиоиью электрофореза в ПАйГ и гельоильтраиией на колонке Зирегйех 6-75. НовЛЯ" против РТВ на иммуноблоттикге реагировали о рРТВ. Значительная часть реконбииаитного белка (около 605!) не связывалась с лактозой, видимо, это происходит в результате образования внутримолекулярных дисулы>идких ксотиков. нехарактерных для нативкой кокформаиии. Рекокбинпнтный продукт о чол. массой 29-30 кДа, которий связавалоя о иммобилизованной лактозой использовали для дальнейших исследований.

Сравнивали антигекность и галактозоовязывоюцуп активность рРТВ и РТВ. Для »того белки «вносили на иммобилизевагпшй асиБДо©етуии и выявляли с помоаь» нонАТ против РТВ. Иа рио. 5 показано, что рРТВ овязцваетоя о аоналофвтуииом и реагирует оо олеяуоамни мокАТ, выязляюдини РТВ - ТНВ-1, Р2-Н4-Р10. Р8-А6-0X2 и Р8-Н10-А11 (рио. 5). I

рРТВ рте

Б я

8.. *

Рис. 5. Свядиваенио РТВ <-о-) , и' рРТВ <-•-) р асиалофетуином. Вцявллли о

т помощью биотинилированиих

ао»

о.>

«О нонАТ протсв РТВ - ТНВ-1.

Концентрация белка, (ыкг/мл)

Чти результаты указывают не акт иг о иную идектичкоот?. рокоибикантиой РТВ о кативной РТ», и кокаэиаьрт, что - плпк.то'ьосвягывапяая активность роьоиЗинвкткой и нативиой РТВ кв отличаются. По-видимому, зиЗракзшв уолович рен^тураиии (низкая кттоктрация белка, присутствие . дактоэи и гяотатнряя) чпосчбот^увт оворьчивьикю рвкоибикакткого Салка в иггивкус конфорначи». Водородные овязн, которые участвует в связывании с лактозой, обеспечивает стабильность структура промежуточных

Рис.6. Связывание рииина <43-, -в-), гетеродииероя РТВ-РТА (-О-, ) и рРТВ-РГА (-1&-, -тЛ-) с асиалоФвтуинон. Окрашенные синеоли -в присутствии 20 мМ лактози. Выявляли с помощью бкотииилироввиных ноликлопальных антител против РТА.

При добавлении к рРТВ эктжо/лркэго количеств!!

прео6ря5отпичой дитплгреитолок РТ?1 . обрезугтггя геткрсг.пмчри

pPTD-PTA о мол. кассой 60. кЛа. Такие яэ гетеродимери образуются мевд7 к&тизяыни РТВ и РТА. Очиотку полученных готеродимеров проводили гельфияьтрацией. На рио. 3 показано, что по

галяитозосвяэквакаей Активности долучетшэ гетеродимери рРТВ-РТА

!

•те стгичаптся от пптнвкого рицина и готеродимеров РТВ-РТА. Таким оЯряхпч, не обкаруяяко различий в эффективности реаосоцнации рРХА п кативноЯ РТВ о РТА. Как известно, . избирательное язаимепейстгив РТ8 с РТА характеризуется высокой аффинность», которая достигается за счет гидрофобного и полярного' взаимодействий мехду определенными аминокислотными остатками [Eutenber end Robertus, 1991]. Эффективность образования готеродимероя рРТЗ-РТА, сохранение антигенных свойств и галвктозоевязываюиэй активности рРТВ и гетеродимеров р^ТВ-РТА означают, . «то структура рРТВ К9 отличается от нативной конвормации. Таким образом, К-гликозилирование не влияет па сворачивание рекокбинантноЛ В-субьедикицы рицина.

Известно, что РТВ имеет два галактозосвязывавэих участка. Нутзктнае формы, где Зиди заменены аминоксилотные остатки второго галЕКтозосвязы^агпегс участка Asp-234 иа глутамин и Аэп-255 на аланин, не удалось рекатурировать. Это свидотельстзует о важном структурном значении Asp-234 и Asn-255 в образовании нативной кокоюрмации В-субъсдилицы рицина.

3. СТАБИЛЬНОСТЬ СТРУКТУРЫ И Б5ЮЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РНХОИНИНАЯТНОЙ В-СУБЬВДИНИЦЫ РИ1ПШЙ.

Для изучения влияния гликозилирования РТЗ сравнивали кокфорнацию, стабильность структуры и биологическую активность рекомби:1в1;тксГ1 РТЗ и нативной РТВ. Структуру белксз исследовали

методом собственной флуоресценции, Спектры поглощения РТ2 и рРТВ были идентичны. В спектрах флуоресценции рРТВ наВлидаяи небольшие отличия: й^Вйг максимума спектра в длшщосолнов уо область (от 330 к J52 1ш), увярение спектра от 53 км до £В л;). Наблюдали незначительное увеличение кьантоього выхода Флуоресценции от 0,2 до 0,22. Изменение параметров фдуоресавниим , свидетельствует о незначительном изменении конзормащц! белка. Остатки триптофана в молекуле рРТВ становятся более достушш^ молекулам воды, но не полностью экспонированными в раотворитель (максимум спектра флуоресценции триптофана в воде 253 ки)..

Для оценки стабильности отруитурц р?ТВ и РТВ исслодозалн денатурацио этих белков под действиен GndHCl и температуры. Hs рис. 7, А и 0 показано, что денатураииокный переход РТВ прсиохокнх при концентрациях GdnHCl от 1 дэ 3 Н (середина перехода 1,7 К) Для рРТВ ооредика декатурациокиогс перехода одЕИтаег'СЯ в сторону меньших концентраций GndHCl. Различие в величине свободной гнергни денатурации нееду РТВ и рРТВ моано определить по!

д(Д0) = - RTln(kPTB/kpPTB), где К - (денатурированиый/ньтивный) - равновесная константе денатурации. Величина A(AG) может быть вычислена в- области концентраций GndHCl, где переходы для обйих белков перекрываютоя. Используя кривые на рио. 7,А была вычислена величина различия свободной энергии для РТВ и рРТВ 1,2 ккал/моль. По-видимому, Н-связанные олигосахариды обеспечивает стабильность структуры РТВ в процессе денатурации под действием GndHCl.

На* рис. 7,С и 0 показано влияние температуры к» параметры Флуоресценции белков. Денатурационный переход нативной РТВ пол

Н

действием температура происходит в области температур от 40 до

0 12 3

. с&тхп. [и]

330

го 40 го Температура (*С)

Рис. 7. Влияние гуанидингидрохлорида (Зп<1НС1) и температуры яа параметры флуоресценции нативной РТБ (1) и рекомбинантной ' РТВ (?.). Длина волны возбуждения 295 нм. А,С - изменение квантового выхода; В,0 - изменение положения максимума спектра.

£5°С (середина перевода 48°С). Для рРТВ область денатурации

сдвигается в сторону меньших температур (середина перехода 40-

42°С>. Это означает, что рРТВ обладает меньшей стабильностью к

действия температуры.

Па рио. 8 показана зависимость галактозосвязиваюпей активности рРТВ от времени преинкубаиии при 37°С.; ' рРТВ инкубировали при 37ЧС (3 ч и С ч) и затем наносили на иммобилизованный асиэлофетуин. Связанный с асиалафетуином рРТВ впявлчли с ломсиьн конАТ против РТВ. Наблюдали снижение

а

галиктозосвязывающей активности рРТВ после иккуйвиии при 37°С, тогда как связывание кативной РТ8 с аоиало<ретуинон be менялась

Рис. 8 Влияние преиккубации при 37°С па связывание рРТВ с аоналофетуипон: 0 - без инкубации; 3 ч инкубации; G ч инкуСацин.

Как било показано выше, рРТВ эффективно взаимодвйотвуат с

F ТА и образует готеродинеры рРТВ-ГТА с мол. кассой 60 кД»1.

Гедькч'озоевязываоапя активность гатбродииерои рРТЙ-РТА и PTU-PTÍ.

¡а. отличалась и сохранялась при инкубации гетяролимерсв npít 37°С.

На гнс. S показана цптотокцпчсская активность гегеролииегов

i ">

45 клетках 1ШТШ2. Ока-.-млоо., что ИЛ50 рицина равна ЗхЮ'1'' К.

1 ^

гитеродпмероь iistuuhux суКьединии FTB-PTA равна 3x10"М. ¡Üin¡> кик ллч пгТ1-рчдиш<рис рГТВ с иатимюй ГТА рагша ЗхШ"11 И.

1 С,

Натнвнля РТА токсична только при вмсоких концентрациях, ИДдд=

I

РвкоибннаН'гйая ртв Ив оказывает токоичесхого влияние на клетки HUT 102 С!1Дзп>ЮГ7 Н), в то гремя ИД50 яатЮТой . РТВ равЯа 30~® Н. В присутствии Лактозы цитотоксичёская активность рицинр и гетероднмеров снижалась прИкерпо в 1000 раз.* Отсутствие иитотокеической активности рРТВ при гокцентрации И

противоречит предположения, что РТВ ногет образовать нвспециеические Поры крИ высокой концентрации, и говорит а пользу сяецифичноЛ вспомогательной роли РТВ в i-рапслокации А-суСъедишшы токсина а цитозоль. г

Рис. 9. Цитотоксическое действие дативного рицина (1) .• глтородимерор РТВ-РТА (2), рРТВ-РГЛ (3), РТА (4); РТВ (5) и рРТВ С6) чз клети.t линии HUT 102 .

Таким образом, при идентичности еитигенных овойств и галактэзосвяэываюаей активности, цитотоксичность получонкого гетеродимера рРТВ-РТА была в 10 раз ииже (Зх10~И Н) по сравнению о -активностью РТВ-РТА или нативиого рицина (ЗхЮ-^ (.¡). Как известно, нативная РТВ оодераит два олигооахарида, связанные с Азп-95 и Asn-135 [Kinura et al., 1983]. Наблюдается взаимодействие между олигосахаридом, связанный с Asn-95 и аминокислотными остатками Тгр-93 и Gln-81, других контактов олигосахаридов о балком нет [Rutenber. and Robertus, 1991]. Рекомбннантная РТВ, экслрессированная ».клетках E.coli, не имеет олигосахаридов. По-видимому, олигосахариды нативной РТВ играют определенную роль в процессе интоксикации. Результаты по денатурацинному воздействию GndHCl и температуры на рРТВ и РТВ, и снижение галахтозоовязываюней активности рРТВ при инкубации при 37°С указывают на то, что негликозилированная конфорнация рРТВ менее стабильна. Иокно предположить, что олигосахариды РТВ необходимы для стабильности нативной кокфоркаии". и возножно, завдаают белок от воздействия протеолирических ферментов во внутриклеточных везикулах.

4. ГИБРИДОНН И АНТИТЕЛА ПРОТИВ В-СТБЪЕЛИИИЦЫ ВКСКТСИНА

Путей гибридизации мышиной миеломы SP2/0 и клеток селезенки мыаей, иммунизироважных дентурированным виекуминон или нативной В-субъединицей, получены гибридомы ТВ7, ТВЗЗ, Т35, ТВ35 и ТВ12, которые продуцируют монАТ против В-субьединицы вискумина. Прямым и сэндвич-методом ИФА показано, что монАТ TB7 (IgH), ТВЗЗ (IgGl) и ТВ35 (IgQl) связываются только с денатурированным токсином и выявляют вискумин, иммобилизованный на твердой фазе (на 96-

лукочкых плахвогах) «ли на икмукобдотингэ. На рис. 10 показано, что на инмуиойлоттннге монАТ ТВЗЗ реагирует о В-субъединицой зискукина.

Рис. 10. Электрофорез о ПААГ (7-22%) <а) и иммуноблоттинг (Ь) аискунина, и его субъединиц; 1 - вискумин в буфере без херкаптозтанола, 2 - В-субъедикица внскумина, 3 - А-оубъедииица вискумияа с мвркаптоэтонодон; цифры справа - мол. массы белков.

ИонАТ антитола ТВ12 (1ав1) свяэывавтоя как. о иммобилизованным

эиокупином, так и о нагквныи вискунинои а растворе. Связывание

антигод о нативныа Енокумииои оценивали радиолигвидным неполон с

помовъо гольфильтрашт на колонке ЯЗСООБН (О.ОхЗОон). ионАТ ТЗЗЗ,

ТВ35 н ТВ7 ве реагирует о н&тивхым токсином, тогда как нонАТ

. ТВ12 авиэнвается о кативкым виокуииком и константа связывания

равна , 2х107 Таким образом, нонАТ против В-оубъедихицы

. виокукила выявляют структурные различия иммобилизованного и

Дативного виокумина. Возиояно при оорбиии на твердую фазу

ниркуиин претерпевает структурные иэмокемкия .• Этот факт интересен

что подобные изменения структуры токоима могут иметь место

цри взаимодействии о клетками. Поэтому интересно исследование

цитоюксичвского действия висхумика на клепси гибридом, синтезирующих антитела против »»ого токсина. • ■■ I

Рис. 11. Цитотоксичвокое дейотвие катизиого вискунипа ка ; кяеткм гибридом ТВ12, ЗВ4 и ТВ12 в присутствии 10 мК лактозы.

На рко. 11 показано цитотоксическое дейотвие зискукнм* ня клетки контрольной гибрид 41 (ЗИ4) и гнбридоии ТВ13. гибрияоми ТВ12 расна 3.вх10~1°И, тогда как для гиСрндоиа 354 равна Зх10-1^И. Таких образом, кльтхи гибрикони ?В12, синтезирующие антитела против вискукина, » 80-100 раз устойчивое к дейг;твио вискумина, по сравнению с контрольной гибридоной. Ь присутствии 10 нК лактозы цитотоксяческая активность внпкумикэ ¿нихалась более чем в 1000 раз.

Хикернш"! токсин, состоящий но А-субъеднннци вискуиикв и Ь-

суськчинииы рииияа, обладает одинаковой цитотохсической акгийлостьг дзух гибридоиах, ЛД50 равна 3.5:с10_11И для ТВ12 м 2.7х10~и для ЗВ4 (рис. 12).

я

*■■>

о &

о

Й

125

100

То)—ПТПИ^ , I 1 Ч.щ--ГПТШ)—ттттслр-гттгтпгр

_i_jj.ii '1!_1_| i]пм | |

10-И 10-13 10-12 10-11 10-Ю

ЕлШШЗ ТОШШ, (М)

Р1:е.12. Цитотоксическоо действие химерного токсина на клетки гибридом ЗВ<; ТВ12; ТВ12 в присутствии 20 мИ лактозы.

Таким образом, резистентность гияридомы ТЭ12 обусловлена

антителами против гискумина, которые сиктезирустся клетками

гибридомк. Для проверки этого предположения с помотью

ралиолигсндкого метода количественно опредаляли связывание

пискуминп о гибридомами (табл.2)

Таблица 2. Параметры связывания вискумика с гибридомами.

гибрндона

ТВ 12

31М (контртль)

число мест связывания __на_длипй кдвхкя-

29x10* 32x10

6

ТТёхТоГн'У

1,5x10' Н"1

Как видно из таблицы, антитела против вмсхуминв, которые экопрессмруется на поверхности клеток гибридоны ТБ12, не влияет на эффективность овяэЫваЫя его с клетками. Внскуи»ш связывается о рецепторами клето.Ч, содержащими кокцсеую галактозу, что подтверждается отсу£от£й«м цитотокоичвекого эффект» в присутствии лактозы. СледоватьлУю, розйот&Мтность гнбркдоиы ТВ12 обуслоьляна вэаимодейств'лэм 1!нутрй1хяь±очких антител о вискуникок,

КОНЦЕНТРАЦИЯ БЕЛКА (ЮТ/ЫЛ)

Рис. 13. Ингибирование свяэцоания вискумика с гоиилофетуинон с помоыью нонАТ ТВ12. Платы сенсибилизировались осиалсфотуино«. Наносили по 0.4 мкг вискумика, меченного биотинол и разное количество белка: моиАТ ТВ 12; асиалофетуин: , контрольные 1еС.

На рис. 13 показано, что монАТ ТВ 12 препятствуют•связыванию вискумина с асиалофетуинои. Контрольные мышиные имиуноглабулини не влияют на связывание вискумина с асиало^етуином. Это указывает

иа то, что антигенные эпигопн для моиАТ ТВ12 расположены близко г: гада!;тозоевяьнза»иии центрам. Возможно, для 'транслокации А-субъедннтш из внутриклеточных везикул в цитозоль клеток необходимо сохранение галактоэосвязываюяей активности ■ В-субъе.шкииы.

0ЖОЛН

1. Получена рекоНбияантная биологически активная В-субьедииица рииина. Н-гликозилировахие необходимо для поддержания стабильности структуры В-субъедияицы ркцииа, но не 'играет важного значения при сворачивании ■ В-субьвдинииы рицина. Замена аминокислотных остатков галактозосвязывакщего центра (Авр-234 на г.1ут&киа, А8и-255 на алапик) приводит к необратимым нарушениям структуры В-субъединицы.

2. Впервые получен химерный токсин, состоящий из А-оувъедияицы гнекукииа и В-субъединица рицина, который оказался активнее нативното вискумина, особенно яри ингибировации вяутреклеточных протеолитических ферментов с поиошью Это /казывает на то, что В-субъедииицэ рицина является не только вэктсром, но и играет загаитную роль в транспорте юксииа во внутриклеточных везикулах.

3. Получены мококлокальные антитела ТВ7 (1йН), ТВЗЗ, ТВ35 и ТВ12 (все 1в(г1> против В-субьединицы растительного токсина вискумина. Антитела ТВ 12, связываются с нативной 3-субьединицей вискумина и препятствуют связыванию токсина с рецептором. Антитела ТВЗЗ, ТВ35 и ТВ7 узнают антигенную детерминанту поелв' денатурации белка.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕК". ДИССЦРТйЦИИ

1). Д.О. Tonevitsky, A.Vu. Toptygin, А.Т. Shanshiev, I.I. Agapov. G.Y.Evshova, U.Ffuller, and K.Pfuller. Coapariaon off properties df Misletoe Lootin A-cliain and Mcin B-chain conjugate with native toxinB. FEBS Letters, 1893. v.336, n.i, v.i00-102.

2). Дедов И.И., Коколоа И.С., Тоиевицкий А,Г., Булатов AiA.. Серлухозигцн С.Ю., Агапов И.И., Шамшиев А.'Г., Елюароэа Г.П.. ДебаСов В.Г., Влияние растительного токсина риципа ка кдвтьчтч. культуры опухолей гипофиза человака. Доклада Акадеиин Наук, liiUJ . т.333, н.4. с.526-528.

3). Д.0.Tonevitsky, I.I.Agepov, Hechetnrr В.В. О .V.Brstjota, A.Y'j.Tcptygin, T.Sarce, А .Т. Siiaashiev, U.Pfullar. Coapr.riso» oi the cytotoxic activity of the inaunitoxina vith diiiorent internalization rata. Biochen. and i'olec. Biol. Iwtcrnr.tionBl, 1893, v. 31, ri. 6, p.1059-1068.

4). А.Г.Тонзвишшй, А.З.Топтыгин, И.И.Агапов, A.T.Пал?, У.Пфсл.чер. Г.В.Ериова, С. А .Прокофьев, В. А. Рахкакова. Khhsphuh токсин А-суб'ьегикишл ьискумина и В-субьсп^чицы рчщша. Молекулярная биология, йУУ-1, т. 26, н. 3. с.

5). А.Г .Тоневицкий, А .».Топтыгин, И.И.Лгалов, В.А. Рахнаноза, А.Т .НамаиаБ, У. П-иэляер, А-Франколь. Получений биологически активной 'рокомбинантной В-субъединпиу риигши, Молекулярная биология, 1С94 (а лачати).

6). А. Г. Тоиешицкий, А.й. Топтыгин, И. И. Агапоза, Л. Т. Шамшиоя, А. Фракколь, В.Г Дебабов. Влияние гликозидирогакия и а структуру, отаОидькость, и биологическую актизксоть В^-субъелнннш4 рицина. ДАН, 1094 (в печати). >

2'1