Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение и анализ структур агглютинина из Ricinus communis и вискумина (ML-1) из viscum album-белков, инактивирующих рибосому

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Определение и анализ структур агглютинина из Ricinus communis и вискумина (ML-1) из viscum album-белков, инактивирующих рибосому"

На правах рукописи

ГАБДУЛХАКОВ Азат Габдрахманович

ОПРЕДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ СТРУКТУР АГГЛЮТИНИНА ИЗ RICINUS COMMUNIS И ВИСКУМИНА (ML-I) ИЗ VISCUM ALBUM -БЕЛКОВ, ИНАКТИВИРУЮЩИХ РИБОСОМУ

03.00.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Пухцино - 2005

Работа выполнена в Институте белка РАН Институте кристаллографии им. А. В. Шубникова РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Никонов Станислав Владимирович кандидат физико-математических наук, доцент Михайлов Альберт Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Погорелов Александр Григорьевич доктор физико-математических наук, профессор Олейников Владимир Александрович

Ведущая организация:

Государственный Научно Исследовательский Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов РАН

Защита состоится ¿У сл^гГ-^р* 2005 г. в /З3 часов на заседании диссертационного совета Д002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, Институтская ул., 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского НЦБИ РАН.

Автореферат разослан «/ » 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Одним из наиболее важных направлений развития новых биотехнологий является создание фармакологических препаратов, обладающих высокой специфичностью действия на клетки или молекулы-мишени в организме. В настоящее время именно белки или их конъюгаты привлекают особый интерес исследователей при конструировании высокоселективных лекарств. Активно изучаются с этой точки зрения растительные токсины, которые полностью останавливают синтез белка в клетке, переводя рибосомы в неактивное состояние. Эти токсины носят общее название рибосом-инактивирующих белков (РИБ).

Рибосом-инактивирующие белки разделяются на два класса: РИБ-1, состоящие из одной каталитической субъединицы (active, А), и РИБ-П, имеющие как каталитическую (А), так и связывающую (binding, В) субъединицы. А-субъединица обеспечивает инактивацию рибосомы, связываясь со специфическим участком, высокозащищенной сарцин-рициновой петлей, 28S рибосомной РНК эукариот и выщепляя аденин. Поскольку модифицированная таким образом рибосома теряет сродство к фактору элонгации транскрипции, это приводит к остановке синтеза белка клеткой и к гибели клетки. В-субъединица, являясь лектином, связывается с гликозилированными рецепторами поверхности клетки и обеспечивает проникновение токсина в клетку. Наличие двух специализированных субъединиц в РИБ-П приводит к значительному возрастанию их цитотоксической активности по сравнению с РИБ-1 и является основной причиной использования этих белков для создания иммуннотоксинов - лекарств нового поколения, главным образом противоопухолевого действия.

Определение структурной организации таких белков и их комплексов с возможными лигандами и субстратом позволяет детально охарактеризовать участки, ответственные за реализацию биологических функций белков и получить необходимую информацию для конструирования лекарств на их основе.

Цель работы. Цель настоящей работы - определение пространственных структур агглютинина из Ricinus communis и вискумина из Viscum album и их комплексов с галактозой.

Научная новизна. Впервые определены и уточнены с атомным разрешением пространственные структуры агглютинина из Ricinus communis и вискумнна из Viscum album и выявлены принципы их организации в гетеротетрамеры. Для РИБ-П установлено положение на поверхностях молекул и проведен детальный анализ структур ферментативных центров и центров связывания с рецепторами на поверхности клетки.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на III национальной конференции по применению рентгеновского и синхротронного излучений нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва, 2001); на 5-ой международной школе конференции молодых ученых (Пущино, 2001); на III съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002); 7 международной школе «Кристаллография биологических макромолекул» (Комо, 2003); на 37 международной школе «Эволюционных методов в макромолекулярной кристаллографии» (Эрица, 2005). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 статьи. Координаты атомов окончательных моделей агглютинина и бискумина, а так же комплексов вискумина с галактозой и лактозой депонированы в Protein Data Bank (код 1RZO, 1SZ6, 1PUM и 1PUU соответственно).

Структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов и обсуждения, Выводов и Списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и очистка агглютинина. Агглютинин экстрагировали из семян клещевины Ricinus communis по методике, описанной ранее. Очистку лектинов проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с активированной сефарозой-4В, уравновешенной фосфатно-солевым буфером, pH 7.4. Лекганы элюировали с колонки 100 мМ раствором лактозы в фосфатно-солевом буфере. Разделение рицина и агглютинина проводили с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-150. Чистоту препаратов контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS (додецилсульфат натрия).

Кристаллизация агглютинина в комплексе с /J-D-галактозой.

Кристаллы агглютинина были выращены при комнатной температуре методом диффузии паров в висящей капле. Противораствор содержал 0.1 М фосфат буфер, рН 6.7 и 50% сульфат аммония. Раствор кристаллизационной капли состоял из 5 мкл противораствора и 5 мкл белка с концентрацией 12 мг/мл. Белок находился в 0.1 М фосфатном буфере, рН 6.7, содержащем 0.5 мМ P-D-галактозы. Сбор дифракционных данных кристаллов агглютинина. Набор дифракционных данных был получен с одного кристалла на синхротроне DESY (Hamburg, Germany). Статистические данные полученного набора представлены в таблице 1.

Таблица 1. Характеристики набора дифракциа ша данных от кристалла агглютинина

Группа симметрии Р32

Параметры ячейки, (А,0) a=b=97.630 с=207.827 СНЗ=90.00 -Г 120.00

Источник излучения XI3, DESY, Hamburg

Длина волны, (А) 0.801

Разрешение, (А)* 26.00-2.60 (2.80-2.60)

Общее число отражений 263880

Число уникальных отражений 67715

Полнота набора (%)* 99.10% (97.20%)

1/о,(1)* 16.69 (4.31)

ЯБута) **(%)* 5.30% (33.40%)

' В скобках приведены значения в слое высокого разрешения

•1W. - IZ К (Ш) - /II (М/).

Ш I / Ш I

Выделение вискумииа из Viscum album. Образцы омелы (Viscum album) собирали с одного дерева и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Затем высушенный и измельченный материал гомогенизировали в растворе уксусной кислоты до получения однородной массы. Полученную массу фильтровали через бумажный фильтр. Фильтрат подвергали колоночной хроматографии на носителях SP-сефадекс и IgG-сефароза. Фракции, содержащие смесь лектинов (MLI, MLII, МЬШ), осаждали сульфатом аммония до 50% насыщения. Для разделения токсических лектинов использовали колонку с лактозил-сефарозой 4В. В итоге был получен препарат вискумина (MLI), пригодный для экспериментов по кристаллизации. Чистоту препаратов

контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS.

Кристаллизация вискумина Кристаллизацию токсина и его комплексов с лактозой и галактозой проводили методом диффузии паров в висящей капле. Раствор белка с концентрацией 18 мг/мл содержал 0.01 М Na-ацетат, рН 4.0. Кристаллизационная капля содержала 1 мкл раствора белка и 1 мкл противораствора. Для кристаллизации вискумина в свободной форме противораствор содержал 0.1 М Glycin/HCL буфер, рН 3.4 и 20-25% сульфата аммония. Гексогональные кристаллы вискумина вырастали при комнатной температуре в течение нескольких недель до размеров 200x150x100 мкм. При съемке набора дифракционных данных в струе жидкого азота, при 100° К, применяли раствор криопротектанта, содержащий 0.1 М Glycin/HCL буфер, рН 3.4, 25-30% глицерин, 25% сульфат аммония. В случае комплексов вискумина с лигандами противораствор содержал 0.1 М Glycin/HCL буфер, рН 2.5, 30-40% сульфата аммония и 0.1 М лактозу или 0.2 М галактозу, соответственно. При кристаллизации в противораствор добавляли 40 мкл 10% диоксана на 400 мкл раствора. Гексогональные кристаллы обоих комплексов вискумина рассеивали рентгеновские лучи с разрешением 2.3 А, они вырастали в течение трех недель при комнатной температуре до 150x100x100 мкм. При съемке наборов дифракционных данных применяли раствор криопротектанта содержащий 0.1 М Glycin/HCL буфер, рН 2.5, 30-35% глицерин, 40% сульфат аммония и 0.1 М лактозу/галактозу.

Сбор дифракционных данных с кристаллов вискумина и его комплексов. Наборы дифракционных данных получены с замороженных кристаллов при температуре 100°К с использованием синхротронного излучения различных станций DESY (Hamburg, Germany). Статистические данные полученных наборов представлены в таблице 2. Группа симметрии и параметры ячейки кристаллов свободного вискумина и его комплексов практически идентичны.

Таблица 2 (Ужжьк характеристики набора дифракционных данных вшщитна и его

комплексов.

Кристаллы Вискумин в свободной форме Вискумин в комплексе с галактозой Вискумин в комплексе с лактозой

Группа симметрии Р6522 Р6522 Р6522

Параметры ячейки, (А,°) а=Ь=106.88 с=310.74 «=/»=90.00 7=120.00 а=Ь=106.83 с=310.95 0=0=90.00 ->=120.00 а=Ь=106.28 с=312.33 Of=|S=90.00 7=120.00

Источник излучения BW7B, DESY, Hamburg XI3, DESY, Hamburg Х13, DESY, Hamburg

Длина волны (А) 0.8453 0.9073 0.9073

Разрешение (А) 29.00-2.05 (2.18-2.05) 30.00-2.30 (2.38-2.30) 2.60-2.30 (2.40-2.30)

Общее число рефлексов 341674 525723 701222

Число уникальных рефлексов 65558 47779 47510

Полнота набора (%)* 98.2 (96.1) 96.3 (94.0) 99,6 (99.3)

1/<я(1)* 19.20 (3.82) 21.20(2.58) 26.30(3.93)

КвутО)" (%)' 4.4 (29.9) 4.8 (39.3) 4.9 (32.2)

В скобках приведены значения в слое высокого разрешения

I7- (ш) - /X11 ■

hid i / Ш i

Результаты и их обсуждение Определение и уточнение структуры агглютинина. Фазы отражений кристалла агглютинина были найдены методом молекулярного замещения с помощью комплекса программ «AmoRe». В качестве исходной модели использовали структуру молекулы рицина при разрешении 2.5 А из Protein Data Bank (код 2AAI), поскольку аминокислотные последовательности рицина и агглютинина имеют очень высокую степень гомологии. При использовании оптимальных параметров поиска перекрестная функция вращения, а затем функция трансляции в программе «AmoRe» выявили два контрастных пика, соответствовавших правильным ориенгациям модели в независимой части элементарной ячейки кристалла. Уточненные правильные решения имели коэффициент линейной корреляции 42.5% и R-фактор 42.4%

Полученные в результате вышеописанной процедуры фазы, приписанные к экспериментальным структурным амплитудам,

позволили рассчитать карты электронной плотности хорошего качества и построить полную модель бежа, за исключением 4-х N-концевых и 2-х С-концевых остатков (262-266) в А-субъединице и 2-х N-концевых остатков в В-субъединице. Первоначальная модель была построена с помощью программы «О». Затем были проведены несколько циклов автоматического (программой «CNS») и ручного (программой «О») кристаллографического уточнения.

Окончательная модель (Таблица 3) включает 1040 аминокислотных остатков, 406 молекул воды, 11 молекул (J-D-галактозы и 10 молекул сульфата аммония. Модель обладает хорошими стереохимическими параметрами, которые оценивались с помощью программы «PROCHECK» (ССР4), и не содержит остатков, расположенных в запрещенных областях карты Рамачандрана. Координаты атомов окончательной модели занесены в Protein Data Bank (код 1RZO).

Таблица 3. Статистические данные уточненной модели агглютинина.

Параметр Численные

значения

Диапазон разрешения, (А) 26.11-2.63

(2.79-2.63)

Число отражений, используемых при уточнении 65481

R-factor .(Rfactor) > (%) 22.5 (42.0)

Rfree2(Rfree)',(%) 27.6 (46.5)

Среднеквадратичное отклонение от стандартных

значений:

а) длин связей, (А) 0.008

б) углов, (°) 1.5

Средние значения В-фактора, (А2):

а) атомов белков 50.3

б) атомов кислорода воды 44.5

Статистика по углам ср, у*, (%)

а) разрешенные 79.3

б) дополнительно разрешенные 18.8

в) доля остатков, в как правило, разрешенных 1.9

областях

■ 1

В скобках приведены значения в слое высокого разрешения. 2 Для расчета R^ использовалось 10% рефлексов.

* статистика приведения по областям карты Рамачандрана для всех остатков, кроме Gly, Pro.

Определение и уточнение структуры вискумина. Фазы отражений кристалла вискумина были найдены методом молекулярного замещения с помощью программного комплекса «Molrep». В качестве исходной модели использовали структуру молекулы вискумина с разрешением 2.7 А из Protein Data Bank (код 2MLL).

Во всех наборах было получено по одному контрастному пику, соответствующему правильной ориентации модели в независимой части элементарной ячейки кристалла. В случае данных вискумина в свободной форме решение имело коэффициент линейной корреляции 74.2% и R-фактор 34.4%, при этом у максимального го неправильных решений коэффициент линейной корреляции составлял 21.1%, а R-факгор 59.2%. В случае комплекса с галактозой и лактозой решение так же было явным. Полученные в результате вышеописанной процедуры фазы, приписанные к экспериментальным структурным амплитудам, позволили рассчитать карты электронной плотности хорошего качества и построить полные модели белка, за исключением пята С-концевых остатков в А-субъединице, во всех трех случаях.

Таблица 4. Статистические данные уточненных моделей вискумина и его

комплексов.

Параметр вискумин в вискумин с вискумин с

свободной форме галактозой лактозой

Диапазон разрешения (А) 29.00-2.05 10.00-2.30 10.00-2.30

(2.18-2.05) (2.38-2.30) (2.40-2.30)

Число отражений, используемых

при уточнении 64820 45303 46562

Ктасюг (К-Гасюг) > (%) 21.1 (35.7) 20.9 (35.0) 20.7 (30.2)

К&ес2(К,гее)',(%) 25.3 (36.2) 24.6 (37.9) 23.2 (30.6)

Среднеквадратичное отклонение от

стандартных значений:

а) длин связей, (А) 0.007 0.009 0.010

б) углов, (°) 1.50 1.57 1.56

Средние значения В-фактора, (А2):

а) атомов белков 48.3 38.1 36.3

б) атомов кислорода воды 43.5 54.2 49.8

Статистика по углам ф (%) 88.0 88.7

а) разрешенные 87.6

б) дополнительно разрешенные 12.4 0.0 12.0 0.0 11.3 0.0

в) доля остатков, в как правило,

разрешенных областях

1В скобках приведены значения в слое высокого разрешения. 2 Для расчета Rue использовалось 5% рефлексов.

* статистика приведения по областям карты Рамачандрана для всех остатков, кроме Gly, Pro.

Окончательные модели включают в себя по 502 аминокислотных остатка, более четырехсот молекул воды, по 6 молекул N-aueran-d-гликозамина, по 2 молекулы хлора, по 2 молекулы сульфата аммония и по 16 молекул глицерина, кроме этого в структуре вискумина с галактозой содержится 2 молекулы ß-D-галактозы, а в структуре комплекса с лактозой 2 молекулы лактозы. Модели (Таблица 4) обладают хорошими стереохимическими параметрами, которые оценивались с помощью программы «PROCHECK» (ССР4). Координаты атомов окончательных моделей занесены в Protein Data Bank (коды 1SZ6, 1PUM, 1РШ).

Укладка полипептидных цепей агглютинина и вискумина. Первая кристаллическая структура рибосом-инактивирующего белка была определена в 1993 году для рицина из Ricinus communis с разрешением 2.5 Ä. Этот белок обладает наибольшей активностью из всех белков инактивируюших рибосому. Поэтому рицин является эталоном, с которым сравниваются все остальные РИБ. Вискумин и агглютинин, как и рицин, состоят из каталитической (А) (рис. 1а) и лектиновой (В) (рис.2а) субъединиц, связанных дисульфидным мостиком, причем соответствующие субъединицы топологически эквивалентны в обоих белках.

Рис. 1. а) А-субъединица агглютинина Ь) первый домен А-субъединицы агглютинина с) второй домен А-субъединницы агглютинина, ф третий домен А-субъединщы агглютинина.

262

)

)

А-субъедишщы в соответствии с номенклатурой, принятой для рицина, могут быть разделены на три домена (рис. 1 Ь, с и d). Домен I состоит из 6 параллельных ß-тяжей, а-спирали и дополнительного маленького антипараллельный ß-тяжа. Домен II сформирован из 5 а-спиралей. Последний III домен состоит из одной а-спирали и одного антипараллельного ß-листа. В вискумине на карте электронной плотности не видны последние пять аминокислот; в агглютинине не видны два N-концевых и четыре С-концевых остатка, которые, по-видимому, обладают повышенной конформационной подвижностью. Полипептидная цепь В-субъединицы является продуктом дупликации гена из более древнего галактозо-связывающего полипептида, состоящего из 40 аминокислот. Эта цепь состоит из двух главных доменов, каждый из которых делится на 4 субдомена, причем три из них являются гомологами друг друга. Участок В-субъединицы, в котором часть ß-тяжей в субдоменах уложена относительно друг друга вокруг псевдо оси третьего порядка называется - ß-трилистник. (рис. 2Ь)

Рис. 2. а) В-субъединица агглютинина Ь) укладка трех гомологичных субдоменов в доменах В-субъединницы агглютинина. Активный центр. В формировании каталитического центра участвуют все три домена А-субъединицы. Активный центр представляет собой значительное углубление на ее поверхности и сформирован идентичными для всех РИБ аминокислотными остатками: двумя тирозинами, глутаминовой кислотой, аргинином и триптофаном. На данный момент известно две конформации активного центра в свободном состоянии: «закрытая», найденная ранее у рицина и обнаруженная нами у агглютинина, и «открытая», найденная ранее у некоторых других РИБ и обнаруженная нами у вискумина. Отличие этих конформаций в положении Туг80 (по номенклатуре рицина). (Рис.3 а). Это, по видимому, никак не сказывается на связывании с мишенью:

связывание с аденином во всех известных структурах комплексов рибосом-инактивирующих белков с аденином идентично. (Рис. ЗЬ)

Рис. 3 а) Наложение активных центров вискумина (темный) и агглютинина (светлый) в свободной форме, Ь) наложение активных центров комплексов вискумина (темный) и рицина с аденином (светлый). Курсивом выделены аминокислотные остатки вискумина. Взаимодействие рибосом-инактивирующих белков с сарцин-рициновой петлей рибосомы. Поскольку сравнительный анализ активных центров различных РИБ не позволил объяснить разницу токсической активности каталитических субъединиц, было решено провести компьютерное моделирование комплекса РИБ с рибосомой. Из биохимических данных было известно, что РИБ взаимодействуют с сарцин-рициновой петлей рибосомы, а именно с высоко консервативным участком GAGA 28S рРНК.

Для первоначального моделирования были использованы: структура комплекса А-субъединицы рицина с аденил (3'-5') гуанозином (код 1APG) с разрешением ЗА и структура сарцин-рициной петли рибосомы крысы, состоящей из 29 нуклеотидов (код 430D) с разрешением 2.1Á. Начальная модель комплекса была получена вручную с помощью программы молекулярной графики «О». Затем было произведено наложение аденинового кольца (А15, таблица 5), что соответствует А4324 в эукариотических рРНК, сарцин-рициновой петли и аденинового кольца аденина комплекса A-цепи рицина с аденил (3'-5') гуанозином. Модель была поправлена вручную и уточнена процедурой молекулярной динамики «modelanneal» из комплекса программ «CNS». Сравнение моделей комплексов показало полную идентичность области взаимодействия рицина и агглютинина с сарцин-рициновой петлей, что подтверждается одинаковой токсической активностью А-субъединиц этих белков в бесклеточной системе. Построенная аналогичным образом

модель комплекса вискумина выявила существенную разницу в областях взаимодействия рицина и вискумина с сарцин-рициновой петлей рибосомы.

Таблица 5 Возможные водородные связи моделей комплексов рицина

и вискумина с сарцин-рициновой петлей рРНК крысы

Рицин, остаток, номер остатка, атом Расстояние, (Â) рРНК остаток, номер остатка, атом Расстояние (А) Вискумин, остаток, номер остатка, атом

ARG48NH2 3.39 ■няк SER43

ARG 48 NH2 2 69 ЯВншёк SER43

ASN78ND2 2.83 GUA16 02' 2.86 ASN 74 ND2

TYR 80 ОН 3.20 ADE 15 N9 2.68 TYR76 0H

TYR80 ОН 3.33 ADE 15 02' 3.36 TYR 76 ОН

TYR 80 ОН 2 81 GUA 16 04' 3 37 TYR76 0H

TYR 80 ОН 2.77 GUA 16 N9 3 43 TYR 76 ОН

ASP 96 OD2 2.48 GUA 16 N2 2.53 ASP 91 OD2

A SN 97 ND2 2.81 чИШшИВ? Укороченная петля

GLY 121 О 2.67 ADE 15 N6 2.25 GLY113 0

GLY 121 О 2.63 ADE 15 N7 3.11 GL Y 113 0

ASN 122 OD 1 2.97 GUA 14 02' 3.28 SER 114 OG

ASN 122 OD1 2.70 GUA 16 06 2.97 SER 114 OG

ASN 122 OD 1 2.51 GUA 16 N7 SER 114

ASN 122 ND2 2.37 GUA 14 02' SER 114

ASN 122 ND2 2.50 GUA 14 03' SER 114

ASN 122 ND2 2.99 ADE 15 01P SER 114

ASN122ND2 3.10 ADE 15 05' SER 114

TYR 123 N 2.84 ADE 15 OlP 3.36 TYR 115 N

ASP 124 N 3.33 ADE 15 OlP PRO 116

ASP 124 OD 1 2.50 GUA 14 OlP PRO 116

ASP 124 OD2 3.08 GUA 14 OlP PRO 116

ASP 124 OD2 3.40 GUA 14 05' PRO 116

ARG 125 NH1 2.94 GUA 16 06 ASP 117

ARG 134 NH2 3.37 ADE 15 OlP ARG 125

GLU 177 OE2 3.75 ADE 15 N3 3 85 GLU 165 OE2

ARG 180 NH1 3.13 ADE 15 N3 2.96 ARG 168 NH1

GLU 208 О 4.14 ADE 15 04' 3.55 GLU 196 0

ASN 209 ND2 3.31 ADE 15 02P 2.86 THR 197 0G1

GLY 212 N 3 32 GUA 16 OlP 2.65 GLN201NE2

ARG 213 NH1 2.58 GUA 14 06 2.88 GLN201NE2

ARG213NH2 2.67 GUA 14 N7 GLN201

ARG258NH1 3.45 "tliF'ДЯЮВ ШШшЯМШ VAL 246

Жирным шрифтом обозначены аминокислотные остатки активного центра рибосом-инактивирующих белков. Курсивом обозначены различные в данных белках аминокислоты. Серым помечен нуклеотид, не участвующий во взаимодействии с вискумином.

В модели комплекса с рицином обнаружено 17 аминокислотных остатков, взаимодействующих с рРНК, тогда как в модели комплекса с вискумином - 11 остатков (Таблица 5). Среди них четыре остатка активного центра и три остатка (Asn78, Gly 121, Glu208 по номенклатуре рицина) идентичны во всех рибосом-инактивирующих белках. Их влияние на каталитическую активность подтверждена биохимическими данными. Как видно из таблицы 5 вискумин связывается лишь с тремя нуклеотидами из консервативной четырех нуклеотидной петли GAGA, в отличие от рицина который связывается со всеми четырьмя нуклеотидами. Причина, по нашему мнению, заключается в укорочении петли 95-98 (по номенклатуре рицина), а так же в замене двух аргининов 48 и 258 в рицине на Ser и Val в вискумине, соответственно. Что подтверждает биохимические данные о более низкой каталитической активности А-субъединицы вискумина по сравнению с А-субъединицей рицина в бесклеточной системе.

Полученные структуры комплексов были встроены в 5 0S рибосомную субчастицу из археи Haloarcula marismortui (код 1FFK) путем наложения сарцин-рициновой петли рибосомы крысы на сарцин-рициновую петлю рибосомы Н. marismortui (Рис. 4). Идентичность центральных участков петли позволила произвести наложение с высокой точность (rms 1.05 Á).

Комплексы рибосом-инактивирующих белков с рибосомой позволили определить, что помимо сарцин-рициновой петли третий домен А-субъединиц контактирует с рибосомным белком L6, что согласуется с известными биохимическими данными. По литературным данным, активность рицина с интактной 28S РНК в составе рибосомы в 105 раз выше, чем для изолированной 28S РНК. Кроме того, встраивание РИБ в рибосому косвенно подтвердило правильность полученных нами моделей комплексов А-субъединиц рицина, вискумина и агглютинина с сарцин-рициновой петлей, так как не было обнаружено пересечения белков с рибосомной субчастицей. К сожалению, данные модели не позволили решить в каком виде РИБ-П подходят к рибосоме: в виде димера AB или виде мономера из каталитической А-субъединицы, т.к в наших комплексах В-субъединицы РИБ-П не имеют контактов с рибосомой. Наиболее интересный результат был получен для агглютинина (Рис. 4Ь), поскольку второй АВ-димер оказался в области взаимодействия 50S и 30S рибосомных субчастиц. Это может означать, что для взаимодействия с рибосомой тетрамер агглютинина должен распасться по крайней мере до димеров.

1

Рис. 4 а) Встраивание вискумина в 50S рибосомную субчастицу (черным цветом обозначена А-субъединица, темно серым цветом В-субъединица)

Ъ) встраивание агглютинина в 50S рибосомную субчастицу (темно серым цветом обозначен первый димер, черным цветом второй димер, пунктирной черной линией обозначено положение ЗОБрибосомной субчастицы).

Первый галактозо-связывающий карман. Так как лектиновая активность является предпосылкой токсичности, мы можем рассмотреть архитектуру сахар-связывающих карманов, которые обеспечивают взаимодействие с галактозными рецепторами на поверхности клетки. Сравнение первого галактозо-связывающего сайта вискумина с соответствующим сайтом рицина выявило их практически полную идентичность. Сайт сформирован изогнутой петлей Asp23B-Val24B-Arg25B и остатками Gln36B и Lys41B (номенклатура вискумина). В центре связывающего кармана положение боковой цепи Asp23 стабилизировано водородной связью с Gln36. Эта ориентация Asp23 обеспечивает образование двух водородных связей с галактозой. В дополнении 4'-гидроксильная группа галактозы образует водородную связь с Gln36 и Asp26. В непосредственной близости к З'-гидроксильной и 2'-гидроксильной группам галактозы находится NZ атом Lys41, который формирует водородную связь с обеими ОН группами. Ароматическое кольцо Тгр38 формирует боковую часть кармана и обеспечивает стекинг-взаимодействие с кольцом галактозы. (Рис. 5а)

Рис. 5. Структура первого галактозо-связывающего сайта, а) комплекс вискумина с галактозой, Ь) комплекс агглютинина с галактозой. (Курсивом выделены неконсервативные остатки)

В комплексе с лактозой, галактозная часть лактозы взаимодействует с вискумином аналогичным образом, тогда как ее гликолизная часть экспонирована в растворитель, формируя водородные связи с молекулами воды. В случае структуры вискумина в свободной форме место галактозы занимает молекула глицерина, наложение данных участков структур вискумина в свободной форме и комплексов с галактозой и лактозой, выявило, что отсутствие или присутствие сахара не вызывает никаких изменений в структуре кармана. В аналогичном кармане агглютинина произошла полная замена одной из боковых стенок, однако это не повлияло на способ связывания с галактозой. Полностью сохранилась система водородных связей, т.к боковые цепи Аг{*24 и Авр25 в рицине не участвовали во взаимодействии с галактозой, и их замены соответственно на ТЬг24 и С1у25, не изменили положения основной цепи в агглютинине. (Рис. 5Ь) Второй галактозо-связывающий карман. Общая архитектура второго галактозо-связывающего кармана вискумина (Рис. 6а) практически идентична первому карману. Центр кармана формируется А5р235, положение боковой цепи которого стабилизировано водородной связью с 01п257. Изогнутая петля, состоящая из трипептида Азр235-Уа1236-

А1а237, образует нижнюю часть кармана. Боковые цепи Авр235, 01п238 и Авп256 формируют водородные связи с гидроксильными группами галактозы. Туг249 обеспечивает стекинг-взаимодействие с кольцом сахара. Во втором кармане плоскость сахарного кольца наклонена по направлению к ароматического кольцу Туг249 и образует с ним угол около 30°. По сравнению с рицином в вискумине А^236 заменен на А1а237, а А1а237 на 01п238, но во взаимодействии с галактозой участвует лишь главная цепь, и эти замены несущественны. Более важной, по-видимому, является замена №з251 на ТЬг252, что исключило дополнительную водородную связь белка с З'-гидроксильной группой сахара. Кроме того, сравнение структуры вискумина в свободной форме и в комплексах с галактозой и лактозой выявило подвижность петли С}1п238-А1а239 в зависимости от наличия связанного лиганда в кармане. В агглютинине (Рис. 6Ь) по сравнению с рицином произошла замена одного из ключевых остатков рицина, Туг248, обеспечивающего стекинг-взаимодействие с кольцом сахара, на Шз248. Это привело к снижению сродства к галактозе и замещению ее на сульфат аммония в кристалле комплекса. Отсюда можно сделать вывод, что в В-субъединице агглютинина остался лишь один карман, связывающий галактозу.

Рис. 6. Изображение второго галактозо-связываюгцего сайта, а) комплекс вискумина с галактозой, Ъ) агглютинина. (Курсивом выделены остатки отличающиеся от рицина).

Четвертичная структура агглютинина и вискумина. В отличие от остальных известных РИБ-П, активные формы агглютинина и вискумина содержат по две А и В субъединицы, но образование гетеротетрамеров в этих белках происходит по-разному. В агглютинине связывание происходит через А-субъединицы (ВААВ) с помощью дисульфидного мостика, формируемого Сув156 обеих каталитических субъединиц, а также водородных связей и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий (Рис. 7а). Площадь контакта А1-А2 1200 А2, что составляет 10% от общей площади А-субъединицы и втрое меньше площади контакта А-В субъединиц. Соответственно, А1-А2 контакт гораздо слабее, как и предсказывалось на основе биохимических данных. В вискумине (Рис. 7Ь) образование тетрамера происходит через В-субъединицы, площадь контакта составляет 1300 А2. Однако, стабильность тетрамера обеспечивается только водородными связями и Ван-дер-Ваальсовыми взаимодействиями, ковалентной 8-8 связи, стабилизирующей тетрамер агглютинина, здесь нет. Поэтому нет ничего удивительного в том, что при концентрации 1.0 мг/мл вискумин является тетрамером, при меньшей же концентрации присутствует в растворе как в форме тетрамера, так и в форме димера, а при концентрации менее 0.01 мг/мл только в форме димера.

Несмотря на то, что агглютинин является гетеротетрамером, состоящим из двух рицино-подобных димеров, связанных через А-субъединицы, в пространственном расположении участков, ответственных за предположительное взаимодействие с мембраной клетки, между этими белками имеется существенное различие. Рицин обладает двумя различными по своей аффиности к галактозе карманами, расположенными на противоположных концах В-субьединицы на расстоянии около 40А, в то время как агглютинин обладает двумя одинаковыми галактозо-связывающими карманами, расположенными на расстоянии 120 А друг от друга. Возможно, это одна из причин увеличенной в 30 раз по сравнению с рицином способности агглютинина агглютинировать эритроциты. Вискумин в димерной форме, аналогично рицину, обладает двумя различными по своей аффиности к галактозе карманами. В тетрамере их число удваивается, наиболее разнесенными (около 80 А) являются вторые галактозо-связывающие карманы, первые галактозосвязывающие карманы находятся на расстоянии приблизительно 15 А, и располагаются в непосредственной близости от области контакта В-субъединиц. Мы предполагаем, что удвоение числа

галактозо-связывающих карманов увеличивает агглютинирующие вискумина.

и их пространственное расположение способности тетрамерной формы

аУ> 120 А у, Ь)

^Ж'/у ч^ч '."¿} 80 А

В А А В Л Я Я Л

Рис. 7. Пространственные структуры и расположение галактозо связывающих карманов (обозначены пунктирной линией) на поверхности белков а) агглютинина Ь) вискумина.

выводы

1. Выделены, очищены и закристаллизованы тетрамерные рибосомо-инактивирующие белки второго типа - агглютинин из Ricinus communis и вискумин (MLI) из Viscum album.

2. Определены и уточнены кристаллические структуры агглютинина из Ricinus communis с разрешением 2.63 Л в комплексе с галактозой и вискумина из Viscum album с разрешением 2.05 Á, в свободной форме и в комплексах с галактозой с разрешением 2.3 Á и лактозой с разрешением 2.3 Á.

3. Показано, что структура активных центров рицина, агглютинина и вискумина консервативна. Высказано предположение, что значительное различие в связывании этих белков с рибосомой может быть вызвано прилегающими к активному центру неконсервативными аминокислотными остатками.

4. Построены модели комплексов рицина, агглютинина и вискумина с сарцин-рициновой петлей рибосомы. Модели встроены в структуру 50S субчастицы рибосомы из Н. marismortui. Анализ моделей позволил предположить, что значительное различие в связывании белков, инактирующих рибосому, с большой субчастицей и изолированной 28S РНК может быть вызвано контактом третьего домена каталитических субъединиц с рибосомным белком L6.

5. Показано, что замена аминокислоты Туг248 во втором галактозо-связывающем кармане рицина на His248 в агглютинине приводит к утрате углевод-связывающей активности этого кармана.

6. Прямым методом впервые показано, что агглютинин и вискумин представляют собой гетеротетрамеры. Установлено, что тетрамер агглютинина образован с использованием ковалентной связи между А-субъединицами двух гетеродимеров, а тетрамер вискумина образуется за счет нековалентных взаимодействий между В-субъединицами гетеродимеров.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ruth Mikeska, Roland Wacker, Raghuvir Ami, Tej P. Singh, Albert Mikhailov, Azat Gabdoulkhakov, Wolfgang Voelter and Christian Betzel. "Mistletoe lectin I in complex with galactose and lactose reveals distinct sugar-binding properties". Acta Crystallographica Section F. 2005, v.61, p. 17-25.

2. Н.Конарева, Р.Крауспехаар, А.Габдулхаков, K.Myp, С.Стоева, А.Корнев, В.Корнилов, С.Никонов, Л.ДеЛукас, В.Воелтер, Х.Бетзел, А.М.Михайлов. "Рентгеноструктурное исследование ферментативного механизма Mistletoe lectin I из Viscum album: кристаллизация в условиях микрогравитации, пространственная структура с атомным разрешением, механизм действия". II Российская конференция по космическому материаловедению. 03.06-06.06.2003, г. Калуга.

3. A. Gabdoulkhakov, R.Krauspenhaar, S.Stoeva, A.N.Kornev, V.Kornilov, S.Nikonov, W.Voelter, Ch.Betzel and A.M.Mikhailov. "Structure-function investigation of tetrameric ribosome-inactivating proteins type П". 7th International School on the Crystallography of Biological Macromolecules. 10.05-14.05.2003, Como, Italy.

4. Габдулхаков А.Г., Корнев A.H., Никонов C.B., Крауспенхаар P., Бетзел X., Воелтер В., Михайлов A.M. "Пространственная организация вискумина и ее роль в функциональной активности этого рибосом-инактивирующего белка II типа (РИБ II)". III Съезд биохимического общества (в России). 26.06.-01.07.2002, г. Санкт-Петербург.

5. Н.В. Конарева, А.Г. Габдулхаков, С. Ещенбург, С. Стоева, А.Н. Попов, Р. Крауспенхаар, М.Е. Андриянова, Ю. Савочкива, И.И. Агапов, А.Г.Тоневитский, А.Н. Корнев, В.В. Корнилов, В.Н. Зайцев, В. Воелтер, Х.Бетзел, С.В. Никонов, Б.К. Вайнштейн, A.M. Михайлов. "Топология полипептидной цепи комплекса агглютинина из семян клещевины с B-D-галактозой в кристаллическом состоянии". Кристаллография, т.46, №5, 2001, ст. 866-874.

6. А.Г. Габдулхаков, А.А. Аловская, А.Н. Корнев, A.M. Михайлов. "Структурно-функциональные особенности взаимодействия РИБ- II типа белков с клетками". 5-ая Международная школа-конференция молодых ученых. 16.04-20.04.2001, ст. 117. г. Пущино.

7. Alovskaya A., Gabdoulkhakov A., Kornev A., Mikhailov A. "Functional Characteristics of Ricin and Ricin-Agglutinin in the Modulation of Neutrophil Cytotoxicity". FEBS Forum of Young Scientists "Protein Structure-Function, Trafficking and Signalling". 28.06-30.06.2001, Oeiras, Portugal

г

Принято к исполнению 28/07/2005 Исполнено 29/07/2005

Заказ №962 Тираж: 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 УАУ\у.ацЮгеГега1.гц

»14302

РНБ Русский фонд

2006-4 16345

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Габдулхаков, Азат Габдрахманович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Каталитические А-субъединицы белков, инактивирующих рибосому.

1.1.1 Структура и ферментативная активность А-субъединицы рицина

1.1.2 Моделирование ингибирования каталитической активности А-субъединицы

1.1.3 Структура и ферментативная активность А-субъединицы абрина

1.1.4 Структура и ферментативная активность А-субъединицы эбулина

1.1.5 Рибосом-инактивирующие белки первого типа

1.1.5.1. Антивирусный белок лаконоса (РАР).

1.1.5.2. Трихосантин

1.1.5.3 Бриодин

1.1.5.4 Сапорин

1.2. Траспортная В-субъединица рибосом-инактивирующиех белков второго типа

1.2.1. Структура и углевод-связывающая активность В-субъединицы рицина

1.2.2. Структура и углевод-связывающая активность В-субъединицы абрина 41 1.2.3 Структура и углевод-связывающая активность В-субьединицы эбулина

1.3. Особенности внутриклеточного транспорта рибосом- инактивирующих белков второго типа. Роль структурных особенностей данных белков при транспорте внутри клетки 43 1.3.1 Интернетизация токсина

1.3.2. Транспорт в эндосомальном компартменте

1.3.3. Транспорт в аппарат Гольджи

1.3.4. Ретроградный транспорт в эндоплазматический ретикулум.

1.3.5. Транслокация токсина

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Выделение и очистка агглютинина

2.2. Кристаллизация агглютинина в комплексе с jS-D-галактозой

2.3. Сбор дифракционных данных с кристаллов агглютинина

2.4 Выделение вискумина из Viscum album

2.5 Кристаллизация вискумина и его комплексов

2.6 Сбор дифракционных данных с кристаллов вискумина и его комплексов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Решение проблемы фаз для агглютинина

3.2 Определение и уточнение структуры агглютинина

3.3. Укладка полипептидной цепи агглютинина

3.4. Структура А-субъединицы агглютинина 58 3.5 Активный центр А-субъединицы агглютинина 60 3.6. Структура В-субъединицы агглютинина

3.7 Первый галактозо-связывающий центр агглютинина

3.8 Второй галактозо-связывающий центр агглютинина 65 3.9. Межсубъединичные контакты агглютинина

3.10 Решение проблемы фаз для вискумина

3.11 Определение и уточнение структуры вискумина и его комплексов

3.12. Структура А-субъединицы вискумина

3.13. Активный центр А-субъединицы вискумина

3.14. Структура В-субъединицы вискумина

3.15. Первый галактозо - связывающий центр вискумина

3.16. Второй галактозо - связывающий центр вискумина

3.17 Взаимодействие рибосом-инактивирующих белков с сарцин-рициновой петлей рибосомы

3.18 Четвертичная структура агглютинина и вискумина. 84 ВЫВОДЫ 87 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

АО. - аминокислотный остаток

АГ - аппарат Гольджи

ЛД50 - молярная концентрация ферментативной субъединицы в составе цитотоксического агента, при которой наблюдается гибель 50% клеток

КИ50 - молярная концентрация цитотоксического агента, при которой наблюдается 50% ингибирование включения в клетки [ Н] тимидина или [,4С]лейцина «• РИБ - рибосом-инактивирующие белки

РИБ-1 - рибосом-инактивирующие-белки первого типа, содержащие одну субъединицу

РИБ-П - рибосом-инактивирующие белки второго типа, содержащие две субъединицы

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

MLI - вискумин - mistletoe lectin I токсин из омелы I

MLII - mistletoe lectin II, токсин из омелы II

MLIII - mistletoe lectin III, токсин из омелы III MLA - А-субъединица вискумина MLB - В-субъединица вискумина t RTA - А-субъединица рицина

RTB - В-субъединица рицина

S06 -сапорин

Введение Диссертация по биологии, на тему "Определение и анализ структур агглютинина из Ricinus communis и вискумина (ML-1) из viscum album-белков, инактивирующих рибосому"

Одним из наиболее важных направлений развития новых биотехнологий является создание фармакологических препаратов, обладающих высокой специфичностью действия на клетки или молекулы-мишени в организме. В настоящее время именно белки или их конъюгаты привлекают особый интерес исследователей при конструировании высокоселективных лекарств. Активно изучаются с этой точки зрения растительные токсины, которые полностью останавливают синтез белка в клетке, переводя рибосомы в неактивное состояние. Эти токсины носят общее название рибосом-инактивирующих белков (РИБ).

Рибосом-инактивирующие белки разделяются на два типа: РИБ-I, которые состоят только из одной каталитической (active, А), субъединицы и РИБ-П, которые содержат как каталитическую (А), так и связывающую (binding, В) субъединицы [Barbieri et al., 1993]. А-субъединица обеспечивает инактивацию рибосомы, связываясь со специфическим участком (сарцин-рициновой петлей) 28S рРНК рибосомы эукариот и выщепляя аденин. Поскольку модифицированная таким образом рибосома теряет сродство к фактору элонгации транскрипции, это приводит к остановке синтеза белка клеткой и в результате к гибели клетки [Lord et al., 1991]. В-субъединица, являясь лектином, связывается с гликозилированными рецепторами на поверхности клетки и обеспечивает проникновение токсина в клетку. Высокая цитотоксическая активность РИБ-П является основной причиной использования их для создания иммуннотоксинов - лекарств нового поколения, главным образом противоопухолевого действия.

Помимо цитотоксических свойств белки этой группы проявляют в различной степени способность агглютинировать клетки за счет своей лектиновой активности. Кроме того, некоторые из них обладают и иммуномодулирующими свойствами.

Аминокислотные остатки, входящие в каталитический центр А-субъединиц, являются консервативными среди данного семейства; во многом сходно и t строение углевод-связывающих центров В-субъединиц. Однако, эффективность цитотоксического действия различных белков этого класса существенно различается. Сравнительный анализ структурных и функциональных свойств родственных рибосом-инактивирующих белков - один из эффективных подходов к выяснению механизмов, определяющих различия в их биологической активности. Понимание структурных особенностей, влияющих на цитотоксическую активность данных белков, необходимо также для получения эффективных препаратов иммунотоксинов на их основе.

Целью данной работы является определение пространственных структур тетрамерных рибосом-инактивирующих белков второго типа - вискумина (ML-I) из Viscum Album и агглютинина из Ricinus communis - и выявление структурных особенностей, влияющих на биологическую активность данных белков.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Габдулхаков, Азат Габдрахманович

ВЫВОДЫ

1. Выделены, очищены и закристаллизованы тетрамерные рибосом-инактивирующие белки второго типа — агглютинин из Ricinus communis и вискумин (MLI) из Viscum album.

2. Определены и уточнены кристаллические структуры агглютинина из Ricinus communis с разрешением 2.63 А в комплексе с галактозой и вискумина из Viscum album с разрешением 2.05 А, в свободной форме и в комплексах с галактозой с разрешением 2.3 А и лактозой с разрешением 2.3 А.

3. Показано, что структура активных центров рицина, агглютинина и вискумина консервативна. Высказано предположение, что значительное различие в связывании этих белков с рибосомой может был» вызвано прилегающими к активному центру неконсервативными аминокислотными остатками.

4. Построены модели комплексов рицина, агглютинина и вискумина с сарцин-рициновой петлей рибосомы. Модели встроены в структуру 50S субчастицы рибосомы из Н. marismortui. Анализ моделей позволил предположить, что значительное различие в связывании белков, инактивирующих рибосому, с большой субчастицей и изолированной 28S РНК может был» вызвано контактом третьего домена каталитических субъединиц с рибосомным белком L6.

5. Показано, что замена аминокислоты Туг248 во втором галакгозо-связывающем кармане рицина на His248 в агглютинине приводит к утрате углевод-связывающей активности этого кармана.

6. Прямым методом впервые показано, что агглютинин и вискумин представляют собой гетеротетрамеры. Установлено, что тетрамер агглютинина образован с использованием ковалентной связи между А-субъединицами двух гетеродимеров, а тетрамер вискумина образуется за счет нековалентных взаимодействий между В-субъединицами гетеродимеров. щ

88

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Габдулхаков, Азат Габдрахманович, Пущино

1. Агапов И.И.// Диссертация «Рибосом-инакгивирующие белки II типа: структура, биологическая активность, внутриклеточный транспорт, использование для синтеза иммунотоксинов» д-ра биологических наук, М: Государственный научный центр РФ ГОСНИИГЕНЕТИКА, 1997

2. Моргунова Е.Ю., Михайлов A.M., Некрасов Ю.В. и др.// Докл. АН СССР. 1988. Т. 299. С.1129.

3. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. //Ribosome-inactivating proteins from plants// Biochim. Biophys. Acta., v.l 154, pp. 237-282.1993

4. Bilge A., Howell-Clark J., Ramakrishman S., et al // Degradation of ricin A- chain by endosomal and lysosomal enzymes: the protective role of ricin B- chain// Ther. Immunol, V. 1,PP. 197-204,1994

5. Brodsky J.L, McCracken A.A.//Er-associated and proteasome-mediated protein degradation: how two topologically restricted events came together. //Trends Cell Biol, V. 7,PP 151-156,1997

6. Byers VS, Levin AS, Waites LA, Starrett BA, Mayer RA, Clegg JA, Price MR, Robins RA, Delaney M, Baldwin RW. // A phase I/П study of trichosanthin treatment of HTV disease.//AIDS.;4(12): 1189-96, Dec 1990

7. Chaddock JA, Monzingo AF, Robertus JD, Lord JM, Roberts LM //Major structural differences between pokeweed antiviral protein and ricin A-chain do not account for their differing ribosome specificity//. Eur J Biochem. Jan 15; 235(1-2): 159-66,1996

8. Chen, Y.-L, Chow, L.-P, Tsugita, A. & Lin, J.-Y.// The complete primary structure of abrin-a В chain//. FEBS Letters, 309,115-118. 1992t

9. Collaboratiove Computational Project, Number 4., Acta Cryst., D50, 760-763 (1994)

10. Crowter, RA. & Blow, D.M. //A method of positioning a known molecule in an unknown crystal structure. Acta Cryst., 23, 544-548.1967

11. D'Cruz OJ, Waurzyniakt B, Uckun FM. A 13-week subchronic intravaginal toxicity study of pokeweed antiviral protein in mice. Phytomedicine.; 11(4):342-51. 2004

12. Van Deurs В., Sandvig K., Petersen O.W. et all // Estimation the amount of internalizated ricin that reaches the trans-Golgi network// J.Cell Biol., V. 106, PP. 253-267,1988

13. Van Deurs В., Sandvig K., Petersen O.W. et all //The ways of endocytosis III, Int. Rev. Cytol, V. 117, PP. 131-177,1989

14. Drickamer, К // Making a fitting choice: common aspects of sugar-binding sites in plant and animal lectins.// Structure. 15; 5(4): 465-8. Review. Apr 1997

15. Eiklid K., Olsnes S., Phil AJ/Entry of lethal doses of abrin, ricin and modeccin into the cytosol of HeLa cells// Exp. Cell Res., V. 126, PP. 321- 326,1980

16. Ehrlich, P., Experimentelle Untersuchungen и'Ъег Immunita't I. Ueber Ricin. Dtsch. Med. Wochenschr. 17, 976-979,1891

17. Endo Y., Mitsui K., Motizuki M., et al //The mechanism of action of Ricin and related toxic lectins on eukaryotic ribosomes. // J. Biol. Chem., V. 262, PP. 59085912,1987

18. Endo Y., Tsurugi K., Franz H. //The site of action of the A-chain of mistletoe lectin I on eukaryotiic ribosomes. The RNA N-glycosidase L activity of the protein. // FEBS Letters., V.231, PP. 378-380, 1988

19. Forrester, J. A., Mcintosh, D. P., Cumber, A. J., Parnell, G. D. & Ross, W. C. // Delivery of ricin and abrin A-chains to human carcinoma cells in culture following covalent linkage to monoclonal antibody.// Cancer Drug Delivery, 4,283-292,1984

20. Frankel A, Welsh P, Richardson J, Robertus JD. //The role of arginine 180 and glutamic acid 177 of ricin toxin A chain in the enzymatic inactivation of ribosomes.// Mol Cell Biol; 10:6257-6263. 1990

21. Fryxell DK, Gawlak SL, Dodge RW, Siegall CB //Identification of a specific tyrosine residue in Bryodin 1 distinct from the active site but required for full catalytic and cytotoxic activity//. Protein Sci. Feb;7(2):318-24. 1998

22. Garred O, van Deurs B, Sandvig K. //Furin-induced cleavage and activation of Shiga toxin.//J Biol Chem. 1995 May 5;270(18): 10817-21,1995a

23. Girbe's T, Citores L, Iglesias R, Ferreras JM, МшГ oz R, Rojo MA, Arias FJ, Garci'a JR, Me'ndez E, Calonge M. //Ebulin 1, a non-toxic novel type 2 ribosome-inactivating protein from Sambucus ebulus L. leaves//. J Biol Chem;268:18195-18199. 1993

24. Gluck A, Endo Y, Wool IG. //Ribosomal RNA identity elements for ricin A-chain recognition and catalysis—analysis with tetraloop mutants//. J Biol Chem; 226: 411-424. 1992

25. Gluck A., Endo Y., Wool I. //The ribosomal RNA identity elements for Ricin and for alpha-sarcin: mutations in the putative CG pair that close a GAGA tetraloop. //Nucleic Acids Res., v. 22, pp. 321-324.1994

26. Gu Y.-J. and Zong-Xiang Xia //Crystal Structures of the Complexes of Trichosanthin With Four Substrate Analogs and Catalytic Mechanism of RNA N-Glycosidase// PROTEINS: Structure, Function, and Genetics 39:37-46,2000

27. Hatakeyama T, Yamasaki N, Funatsu G. //Identification of the tryptophan residue located at the low-affinity saccharide binding site of ricin D.// J Biochem; 100:781788,1986

28. Hazes В., Read RJ. //Accumulating evidence suggests that several AB- toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells//Biochem., V. 36, PP 11051-11054,1997

29. Huang Q, Liu S, Tang Y, Jin S, Wang Y. //Studies on crystal structures, active-center geometry and depurinating mechanism of two ribosome-inactivating proteins//. Biochem J;309 :285-298,1995

30. Hudav, K., Dinman, J.D. and Turner, N.E. J. Biol. Chem. 274,3859-3864. 1999

31. Husain J, Tickle IJ, Wood SP. //Crystal structure of momordin, a type I ribosome inactivating protein from the seeds of Momordica charantia.// FEBS Lett. Apr 4; 342(2): 154-8. 1994

32. Ippoliti, R., Lendaro, E., Bellelli, A. and Brunori, M. FEBS Lett. 342, 154-158. 1992

33. Johannes L., Tenza D., Antony C. // Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga-toxin//J.Biol.Chem., V. 272, PP 19554-10561,1997

34. Jones,T.A., Zou.J.Y., Cowan,S.W., Kjeldgaard,M. //Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models//. Acta Ciyst., A47,110-119,1991

35. Kabsch, W. //Integration, scaling, space-group assignment and post refinement. XDS. In International Tables for Crystallography//, eds. Rossmann M.G. & Arnold E.F. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers; 2001

36. Koradi, R, Billeter, M., Wu'thrich, K., //MOLMOL: a programfor display and analysis of macromolecular structures//. J. Mol.Graphics 14, 51-55,1996

37. Katzin BJ, Collins EJ, Robertus JD //Structure of ricin A-chain at 2.5 A.// Proteins; 10(3):251-9,1991

38. Kirn Y., Robertas J.D., //Analysis of several key active site residues of Ricin A-chain by mutagenesis and X-ray crystallography. // Protein Eng., v.5, pp.775-779, 1992.

39. Kurinov IV, Rajamohan F, Venkatachalam TK, Uckun FM //X-ray crystallographic analysis of the structural basis for the interaction of pokeweed antiviral protein with guanine residues of ribosomal RNA// Protein Sci. Nov;8(l 1): 2399-405,1999b

40. Kurinov I.V, Fatih M. Uckun // High resolution X-ray structure of potent anti-HTV pokeweed antiviral protein-III// Biochemical Pharmacology Volume 65, Issue 10 , 15, Pages 1709-1717, May 2003

41. Li HG, Xu SZ, Wu S, Yan L, Li JH, Wong RN, Shi QL, Dong YC //Role of Argl63 in the N-glycosidase activity of neo-trichosanthin// Protein Eng. Nov; 12(11):999-1004. 1999

42. London E. //How bactreial protein toxins enter cells: the role of partial infolding in membrane translocation// Mol. Microbiol., V.6, PP. 3277-3282,1992

43. Lord J.M., Hartley M.R. and Roberts L.M.// Ribosome-inactivating proteins of plants. // Sem. Cell. Biol., V. 2, PP. 15-22,1991

44. Lord J.M., Roberts L.M. //Retrograde transport: going against the flow// Curr. Biol., V. 8, PPR56-R58,1998

45. Ma QJ, Li JH, Li HG, Wu S, Dong YC.// Crystal structure of beta-luffin, a ribosome-inactivating protein, at 2.0 A resolution.// Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. Aug;59(Pt 8):1366-70,2003

46. Matthews B.W. //Solvent content of protein crystals//. J. Mol. Biol., V.33, P. 491 -497, 1968

47. McGrath MS, Hwang KM, Caldwell SE, Gaston I, Luk КС, Wu P, Ng VL, Crowe S, Daniels J, Marsh J, //GLQ223: an inhibitor of human immunodeficiency virus4

48. Miller DJ, Ravikumar K, Shen H, Suh JK, Kerwin SM, Robertus JD. //Structure-based design and characterization of novel platforms for ricin and shiga toxin inhibition.// J. Med Chem 3;45(l):90-8 Jan 2002

49. Montfort, W., Villafranca, J. E., Monzingo, A. F., Ernst, S. R., Katzin, В., Rutenber, E., Xoung, N. H., Hamlin, R. & Robertus, J. D // The three-dimensional structure of ricin at 2.8 A.//J Biol Chem. Apr 15;262(11):5398-403. 1987

50. Monzingo A.F. and Robertus J.D.// X-ray analysis of substrate analogs in the ricin A-chain active site // J.Mol.biol., v.227, pp. 1136-1145,1992

51. Monzingo AF, Collins EJ, Ernst SR, Irvin JD, Robertus JD. //The 2.5 A structure of pokeweed antiviral protein.//J Mol Biol. Oct 20;233(4):705-15,1993

52. Navaza J.// AmoRe: an automated package for molecular replacement //Acta cryst, v.50, pp 157-163,1994

53. Navaza J. (1987), Acta Cryst., A43, 645

54. Navaza J. (1993), Acta Cryst., D49, 588

55. Navaza J. & Saludjian P. //AMoRe: An Automated Molecular Replacement Program Package//, in Methods in Enzymology, 276, 581-594, Academic Press, 1997

56. Parikh В A, Turner NE. //Antiviral activity of ribosome inactivating proteins in medicine// Mini Rev Med Chem. Jun;4(5):523-43. 2004

57. Rajamohan F, Venkatachalam TK, Irvin JD, Uckun FM. //Pokeweed antiviral protein isoforms PAP-I, PAP-II, and PAP-III depurinate RNA of human immunodeficiency virus (HIV)-1//. Biochem Biophys Res Commun;260:453-8, 1999

58. Rajamohan F, Matthew J. Pugmire, Igor V. Kurinov, and Fatih M. Uckun //Modeling and Alanine Scanning Mutagenesis Studies of Recombinant Pokeweed Antiviral Protein// J Biol Chem, Vol. 275, Issue 5, 3382-3390, February 4, 2000

59. Ramachandran,G.N, Ramakrishnan.C, Sasisekharan,V. J.Mol. Biol, 7, 95-99, 1963

60. Rapak A, Falnes P, Olsnes S. //Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol.//Proc.Natl.Acad.Sci.USA, V. 94, PP. 3783-3788,1997

61. Ren J, Wang Y, Dong Y, Stuart D. //The N-glycosidase mechanism of ribosome-inactivating proteins implied by crystal structure of a-momorcharin//. Structure;2:7— 16. 1994

62. Ready MP, Kim Y, Robertus JD. //Site-directed mutagenesis of ricinA chain and implications for the mechanism of action//. Proteins; 10:270-278, 199171 .Riezman H. // The ins and out of protein translocation// Science, v. 278, PP. 1728-1729, 1997

63. Rini, J. M. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24,551-577.1995

64. Robertus, J. D. & Ready, M. P // Ricin В chain and discoidin I share a common primitive protein fold//J Biol Chem. 25; 259(22): 13953-6. Nov 1984

65. Rutenber and Robertas // Structure of ricin B-chain at 2,5 A resolution // Proteins, v. 10, pp.260-269,1991

66. Schlossman, D., Withers, D., Welsh, P., Alexander, A., Robertus, J., & Frankel, A.

67. Tahirov Т., Lu Т., Liaw Y., Chen Y., Lin J. //Crystal structure of abrin-a at 2.14 A. // J.Mol.Biol., v. 250, pp. 354-367,1995.

68. Valter, C.A., Bartle, L.M., Leszyk, J.D., Lambert, .M. and Goldmacher J. Biol. Chem. 270,12933-12940,19951

69. Watanabe K, Honjo E, Tsukamoto T, Funatsu G. //Fluorescence studies on the interaction of adenine with ricin A-chain.// FEBS Lett. Jun 15;304(2-3):249-51.1992

70. Wesche J., Rapak A., Olsnes S. //Dependence of ricin toxicity on translocation of the toxin A chain from the endoplasmic reticulum to the cytosol. // J.Biol. Chem., v, 274, pp. 34443-34449,1999.

71. Weston S., Tucker A., Thatcher D., Derbishire D., Pauptit R.// X-ray structure of recombinant ricin A-chain at 1,8A resolution // J.Mol.Biol., v.244, pp. 410-422,1994

72. Wu S, Lu X, Zhu Y, Yang J, Dong Y.// N-glycosidase mechanism of trichosanthin//. Science China; 41:174-180. 1998

73. Yamasaki N, Hatakeyama T, Funatsu G. Ricin D-saccharide interaction as studied by ultraviolet difference spectroscopy. J Biochem (Tokyo). 98(6): 1555-60., Dec 1985

74. Yan L, Wu S, Li HG, Li JH, Wong RN, Shi QL, Dong YC. //Role of TYR70 in the N-glycosidase activity of neo-trichosanthin//. Toxicon. Jul;37(7):961-72,1999

75. Xinjian Yan, Thomas Hollis, Maria Svinth, Philip Day Arthur F. Monzingo, George W. A. Milne and Jon D. Robertus //Structure-based Identification of a Ricin Inhibitor// J. Mol. Biol. 266,1043±1049,1997

76. Yuan Y-R, He Y-N, Xiong J-P, Xia Z-X. //Three-dimensional structure of b-momorcharin at 2.55 A resolution//. Acta Crystallogr; D55:1144-1151.1999

77. Xiong JP, Xia ZX, Zhang L, Ye GJ, Jin SW, Wang Y. // Crystallization and preliminary crystallographic study of beta-momorcharin.// J Mol Biol. Apr 29;238(2):284-5.1994

78. Zentz C, Frenoy JP, Bourrillon R //Binding of galactose and lactose to ricin. Equilibrium studies.// Biochim Biophys Acta. 26; 536(1): 18-26., Sep 1978

79. Zhan J., Stayton P., Press O. //Modificatication of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences enhances its cytotoxicity and traslocation // Cancer Immunol., Immunother., V. 46, PP 55-60,1998

80. Zhu G., Huang Q., Qian M., Tang Y. // Crystal structure of K-momorcharin in acetonitrile water mixture// Biochimica et Biophysica Acta 1548 152-158,20011. БЛАГОДАРНОСТИ

81. Автор приносит глубокую благодарность:

82. С.В. Никонову и A.M. Михайлову за руководство работой, поддержку и помощь в анализе полученных результатов;

83. А.Д. Никулину, Н.А. Невской О.С. Никонову, за помощь и ценные советы; Всему коллективу группы структурных исследований рибосомных белков Института белка (РАН) за прекрасную атмосферу, способствовавшую выполнению данной работы;

84. Российскому Фонду Фундаментальных Исследований и Фонду Биомедицинских Исследований Ховарда Хьюза за финансовую поддержку данной работы.