Рибосом-инактивирующие белки II типа из омелы: клонирование, экспрессия и структурно-функциональные свойства

Певзнер, Ирина Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Рибосом-инактивирующие белки II типа из омелы: клонирование, экспрессия и структурно-функциональные свойства
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Рибосом-инактивирующие белки II типа из омелы: клонирование, экспрессия и структурно-функциональные свойства"

На правахрукописи

Певзнер Ирина Борисовна

РИБОСОМ-ИНАКТИВИРУЮЩИЕ БЕЛКИ II ТИПА ИЗ ОМЕЛЫ: КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2004

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии ФГУП «Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных организмов» («ГосНИИгенетика») и селекции промышленных микроорганизмов и в лаборатории ксенотрансплантации НИИ трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО) МЗ РФ.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Доктор биологических наук, профессор И.И. Агапов

Доктор биологических наук, профессор СВ. Машко

Кандидат биологических наук С П. Домогацкий Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «14» декабря 2004 г. в 14 ч 00 мин на заседании диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных организмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных организмов».

Автореферат разослан «12» ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

В.И. Щербакова

Актуальность темы. Из зеленых частей растения омела белая (Viscum album L.) выделяют три изоформы токсических лектинов — МЫ (вискумин), MLII и MLIII (ML — "mistletoe lectins"), которые по своему строению принадлежат к семейству рибосом-инактивирующих белков II типа (РИБП) [Giibes et al., 2004]. А-Субъединица токсина является высокоспецифичным ферментом N-гликозидазой (ЕС 3.2.2.22) и выщепляет остаток аденина в положении 4324 28S рРНК 608-субъединицы эукариотической рибосомы [Stirpe et al., 2004], что приводит к остановке синтеза белка в клетке. В-Субъединица является лектином, который связывается с гликозилированными рецепторами на поверхности клетки и способствует интернализации токсина путем эндоцитоза [Sandvig and van Deurs, 2002]. Между собой ML-токсины различаются по молекулярной массе А- и В-субъединиц, а также по специфичности к углеводам. До недавнего времени только для вискумина была известна аминокислотная последовательность и был сделан рентгено-структурный анализ кристалла белка.

В настоящее время водные экстракты из листьев омелы белой, содержащие токсические лектины омелы, используются в странах Европы, Америки и Азии в качестве иммуномодулирующих и противоопухолевых препаратов в клинической практике. Успех терапии может быть связан с процентным содержанием МЫ, MLII и MLIII в различных экстрактах. Токсины обладают разной биологической активностью в отношении клеток млекопитающих вследствие различий в содержании гликозилированных рецепторов на поверхности клетки-мишени, что определяет ее чувствительность к цитотоксическому действию лектинов омелы. Было показано, что MLIII селективно действует на CD8+ Т-лимфоциты, но не взаимодействует с CD 19+ В-клетками, селективность к которым проявляет MLI [Bussing et al., 1999]. Также нашли, что MLIII наиболее активен в индукции апоптотической гибели культивируемых лимфоцитов человека и является также наиболее сильным (за ним следовали MLII и MLI) ингибитором роста клеток Molt4 (Т-клеточная лейкемия) [Dietrich et al., 1992; Корр et al., 1993]. Для токсинов омелы показана способность стимулировать выработку цитокинов иммунными клетками как in vitro, так и in vivo [Huber et al., 2002]. В последнее время в Германии проходит клинические испытания рекомбинантный вискумин [Adler et al., 2003].

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

Каталитические субъединицы растительных токсинов используются для конъюгирования с адресными молекулами (например, специфическими моноклональными антителами) при создании препаратов направленного действия -иммунотоксинов, — способных избирательно элиминировать опухолевые клетки [Stirpe, 2004]. РИБ II используются в качестве удобной модели для исследования внутриклеточного транспорта белков [Moisenovich et al., 2002]. Способность токсинов к трансмембранному переходу дает возможность использовать их при создании генно-инженерных вакцин нового поколения как вектор для доставки в цитоплазму клеток различных вирусных пептидов или опухолевых антигенов для стимуляции иммунного ответа организма против вирусов и других внутриклеточных патогенов или измененных раковых клеток [Ghetie et al., 2001]. При этом для снижения цитотоксичности белков по отношению к эукариотическим клеткам предлагается использовать ферментативно неактивные формы РИБ II [Smith et al., 2002].

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было клонирование нового гена токсического лектина омелы MLIII и сравнительное исследование структурно-функциональных свойств рекомбинантных токсинов МЫ и MLIII.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Клонировать ген токсического лектина омелы MLIII и экспрессировать его А- и В-субъединицы в клетках Escherichia coli. Провести сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей рекомбинантного токсического лектина омелы MLIII и вискумина (MLI).

2. Изучить иммунохимические свойства ренатурированных рекомбинантных А- и В-субъединиц MLI и MLIII с помощью панели моноклональных антител (моноАТ) против токсических лектинов омелы MLI, MLII и MLIII.

3. Исследовать ферментативную активность рекомбинантных А-субъединиц MLI и ML1II в бесклеточной системе синтеза белка. Исследовать углевод-связывающую способность рекомбинантной В-субъединицы MLIII в иммуноферментном анализе (ИФА) с модельным рецептором.

4. Получить мутантные формы рекомбинантных А-субъединиц токсических лектинов омелы MLI и MLIII с заменой ключевых аминокислотных остатков (а.о.) в активном центре ферментов, изучить вклад в каталитическую активность токсинов каждого из измененных остатков.

Научная новизна и практическая ценность работы. Клонирован новый ген токсического лектина омелы MLШ, первичная аминокислотная последовательность которого к началу работы не была известна. С помощью ИФА с панелью моноАТ против токсинов омелы было доказано, что экспрессированные субъединицы рекомбинантного белка несут антигенные детерминанты токсина MLШ. Показано, что рекомбинантные А-субъединицы токсинов омелы МЫ и MLШ проявляют рибосом-инактивируюшую каталитическую активность в эукариотической системе синтеза белка, а рекомбинантная В-субъединица эффективно взаимодействует с гликозилированным модельным рецептором. Обе рекомбинантные субъединицы MLШ образуют в процессе совместной ренатурации гетеродимер, обладающий иммунохимическими и лектиновыми свойствами нативного растительного токсина. Получены мутантные формы А-субъединиц токсинов омелы MLI и MLШ со сниженной каталитической активностью.

Получение рекомбинантных токсических лектинов омелы и исследование их свойств приведет к пониманию процессов ренатурации белков и субъединичной гетеродимеризации. Создание трансгенных растений, продуцирующих рекомбинантные токсические лектины омелы, поможет оценить роль рибосом-инактивирующих белков II типа в жизни растений.

Токсические лектины как рибосом-инактивирующие белки II типа используют для изучения транспорта белков в эукариотических клетках при конъюгировании токсинов с флуоресцентными метками, а также при создании генно-инженерных химерных молекул на основе генов токсинов и цветных флуоресцирующих белков. Создание на основе рекомбинантных токсических лектинов каталитически неактивных форм дает возможность изучать детальные механизмы транспорта РИБ II в эукариотических клетках без инактивации синтеза белка в них, приводящей к гибели клеток. Введение в состав рекомбинантных токсических лектинов последовательностей сигнальных пептидов позволяет менять транспорт белков и изучать влияние различных сигнальных последовательностей на его направленность.

Полученные рекомбинантные А-субъединицы токсических лектинов могут использоваться для создания цитотоксических агентов направленного действия путем конъюгирования с адресными молекулами против клеток-мишеней. Гетеродимерные рекомбинантные токсические лектины предложены для применения в

антиопухолевой и иммуномодулирующей терапии в ряде стран Европы. На основе каталитически неактивных рекомбинантных токсинов путем введения в состав белка антигенных пептидов можно создавать вакцины против вирусных и других внутриклеточных инфекций. За счет специфического транспорта РИБ II такие пептиды доставляются внутрь эукариотической клетки и презентируются в составе комплекса с молекулой МНИ, что приводит к стимуляции иммунитета организма.

Апробация результатов и публикации. Результаты работы были доложены на международном симпозиуме по применению лектинов омелы (Германия, 2003), на межлабораторных семинарах ФГУП «ГосНИИгенетика», на межлабораторных семинарах НИИ трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО), на межлабораторных семинарах кафедры биоинженерии Биологического факультета МГУ. Апробация диссертации проведена на заседании секции молекулярной биологии ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика». По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 124 страницах, иллюстрирована 28 рисунками и 9 таблицами. Список литературы содержит 194 источника.

Материалы и методы

Штаммы бактерий, плазмиды и ДНК-модифицирующие ферменты. Для

клонирования рекомбинантного гена предшественника токсического лектина омелы MLIII использовали вектор pUC19 ("Fermentas", Литва) и клетки Escherichia coli штамм LE392 ("Promega", США). Для экспрессии рекомбинантных фрагментов ДНК, кодирующих А- и В-субъединицы MLIII использовали вектор pETllc joe и клетки Е. coli штамм BL21 (DE3) ("Novagen", США). Олигонуклеотидные праймеры для амплификации были синтезированы компаниями "Синтол" (Россия) и "QIAGEN GmbH" (Германия). ДНК-Модифицирующие ферменты были приобретены в фирме "Fermentas" (Литва).

Выделение геномной ДНК из растения Viscum album L. и амплификация ДНК-

фрагментов гена MLIII. Геномную ДНК выделяли из листьев омелы белой по

методике, описанной в "Current Protocols in Molecular Biology" (1991), и

дополнительно очищали фенолом. Нуклеотидную последовательность гена токсического лектина омелы амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием Taq-ДНК-полимеразы с геномной ДНК омелы. Полученный ПЦР-продукт очищали из агарозного геля и клонировали в вектор pUC19 по сайтам рестрикции EcoRI и ВатШ. Аналогичным образом проводили амплификацию фрагментов гена предшественника токсина, кодирующих его А- и В-субъединицы. Данные ПЦР-продукты клонировали в экспрессионный вектор рЕТНс joe по сайтам рестрикции Ndel и ВатШ. Секвенирование нуклеотидной последовательности полученных рекомбинантных продуктов проводила компания "MWG-BiotechAG" (Германия).

Создание мутантных форм рекомбинантных А-субъединиц МЫ и MLIII с помощью сайт-направленного мутагенеза. Сайт-направленный мутагенез проводили с помощью последовательных этапов ПЦР, как описано в "Current Protocols in Molecular Biology" (1991) на основе гена предшественника лектина омелы MLIII и клонированного ранее гена А-субъединицы МЫ [Тоневицкий и др., 2002]. С помощью мутагенных праймеров в активный каталитический центр белка вносили изменения следующих а.о.:

Glul96—»Asp и Trpl99->Leu. Наличие мутаций в ДНК-фрагментах подтверждали с помощью секвенирования созданных плазмид, проведенного фирмой "MWG Biotech AG" (Германия).

Анализ последовательностей клонированного гена и его фрагментов, предсказание антигенных эпитопов в белках. Нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности клонированного гена и его фрагментов сравнивались с известными сиквенсами токсических лектинов омелы и других РИБ II с помощью компьютерной программы "ClustalX" (v. 1.81). Для оценки антигенности была использована трехмерная модель вискумина (1OQL (PDB NCBI), [Niwa et al., 2003]), которую просматривали и анализировали с помощью программы "Cn3D" (v. 4.1). Подвижность аминокислот в белках оценивали с помощью алгоритма Джеймсона-Вульфа [Jameson and Wolf, 1988], а их гидрофильность - по алгоритму Хоппа-Вудса [Норр and Woods, 1981] в программе "Gene Runner" (v. 3.05). Экспрессия, очистка и ренатурация рекомбинантных белков. Экспрессию рекомбинантных белков в бактериальных клетках Е. coli проводили при добавлении

индуктора изопропил THO-ß-D-гапактозида (ИПТГ) в концентрации 1 мМ в течение 4 часов при 37°С для А-субъединиц токсинов и 28°С для В-субъединицы. Наличие экспрессируемых белков подтверждали с помощью электрофореза в полиактиламидном геле (ПААГ) и иммуноблоттинга. Рекомбинантные белки выделяли в тельцах включения с помощью последовательного лизиса клеток детергентами. Очищенный белок растворяли в Трис-буфере, рН 8,0, содержащем 7М Gnd-HCl и 2% 2-меркаптоэтанола, и затем ренатурировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,4, при конечной концентрации 15 мкг/мл. Затем белок концентрировали ультрафильтрацией и исследовали его иммунохимические свойства и активность. Были получены препараты rMLIA, rMLIIIA, rMLIIIB и гетеродимер rMLIII A+rMLIIIB.

Иммуноблоттинг и иммуноферментный анализ. В иммуноблоттинге мы использовали поликлональную анти-MLIII сыворотку мыши и моноАТ ТА7, специфичные к денатурированным А-субъединицам всех трех токсинов [Agapov et al., 1999]. Изучение иммунохимических свойств ренатурированных рекомбинантных белков проводили с помощью сэндвич-ИФА. Для А-субъединиц токсинов омелы использовали ранее полученные и охарактеризованные моноАТ MNA9, MNA4, Н8 и НИ [Темяков и др., 1997; Agapov et al., 1999; Фаттахова и др., 2001], в системах сэндвич-ИФА MNA9-MNA4-БИOTИH (анти-MLIA), MNA4-H11-БИOTИH (анти-MLIIA) и Н8-Н11-биотин (анти-MLША). Для В-субъединицы MLIII и гетеродимера гМLША+гМLШВ в сэндвич-ИФА использовали моноАТ Е12 и МТС 12 [Темяков и др., 1997; Moisenovich et al., 2000] и моноАТ НИ в системах сэндвич-ИФА Е12-МТС12-биотин (анти-MLIIIB) и Е12-Н11-биотин (анти-МЫИВ-анти-МЬША). Взаимодействие оценивали с помощью анти-мышиных антител козы, меченных пероксидазой, либо конъюгата стрептавидин-пероксидаза ("IMTEK", Россия), хромогенным субстратом служил о-фенилендиамин (Sigma, США). Реакцию детектировали на вертикальном спектрофотометре "Multiscan" («Labsystems», Финляндия) при 492 нм.

Изучение активности рекомбинантных субъединиц токсических лектинов омелы. Каталитическую активность рекомбинантных А-субъединиц токсинов омелы и их мутантных форм исследовали в бесклеточной системе синтеза белка на основе лизатов ретикулоцитов кролика ("ЛтЫоп", США). Активность оценивалась по

снижению включения [3Н]-лейцина в состав эндогенно синтезируемого белка глобина. Синтез белка проводился в течение 60 мин. при 30°С, после чего белок преципитировали с помощью трихлоруксусной кислоты и осаждали на стеклянные фильтры. Обсчет включенной в белок метки проводили на сцинтилляционном Р-счетчике "Liquid Scintillation System 6891 DELTA 300" ("Tracor Analytic", США). За 100% включения метки принимали образец, в который не добавляли токсин (только ФСБ), за 0% включения метки принимали образец, в который добавляли 10 мкг/мл А-субъединицы рицина в ФСБ.

Углевод-связываюшую способность рекомбинантных белков rMLIIIB и гетеродимера rMLIIIA+rMLIIIB оценивали в ИФА с сорбированным на плашку модельным рецептором 3F12, несущим специфические углеводы для взаимодействия с ML-токсинами. Реакцию проявляли биотинилированными моноАТ МТС 12 (анти-MLIIIB) и HI 1 (анти-MLIIIA) и конъюгатом стрептавидин-пероксидаза ("IMTEK", Россия).

Результаты и обсуждение

Клонирование гена и анализ последовательности предшественника токсического лектина омелы. В данной работе был клонирован новый ген предшественника токсического лектина из Европейской омелы Viscum album L., собранной в Германии. Новый ген, обозначенный rMLg, заметно отличался по нуклеотидной последовательности от гена препробелка MLI [Eck et al., 1999]: на всей протяженности отмечены множественные замены нуклеотидов, гомология в сиквенсах составляла 89,6%. Наибольшие различия отмечены в области, кодирующей линкерный пептид между А- и В-цепями белков, где в новом рекомбинантном гене располагаются два участка из семи и восьми нуклеотидов, отсутствующие в гене препробелка MLI. Идентичность выведенных аминокислотных последовательностей белков-предшественников rMLg и MLI составляет 87,0%, сходство 90,5%.

Рекомбинантная А-субъединица лектина омелы по выведенной

аминокислотной последовательности гена имеет 89,4% одинаковых консервативных и 93,7% сходных а.о. с А-субъединицей MLI, отличаясь по 26 аминокислотам. В то же время последовательность rMLgA практически совпадает (идентичность 96,1%, сходство 98,4%) с сиквенсом белка MLIIIA, определенным с помощью деградации по Эдману [Wacker et al., 2003; Gen Bank Асс. No. P82683], отличаясь всего по 7

аминокислотам. Все а.о., которые участвуют в ферментативной активности А-субъединиц РИБ II типа (отмечены прямоугольниками на рис. 1), а также общие консервативные для РИБ аминокислоты присутствуют в нашем белке.

MLIA MLIIIA rMLgA

(1) (1) (1)

(66) (66) (66)

(131) (131) (131)

(196) (196) (196)

1 65

YERLRLRVTHQTTGDEYFRFITLLRDYVSSGSFSNEIPLLRQSTIPVSDAQRFVLVELTNQGGDS YERLRLRVTHQTTGDEYFRFITLLRDYVSSGSFSNEIPLLRQSTIPVSDAQRFVLVELTNQGGDS YERLRLRVTHQTTGDEYFRFITLLRDYVSSGSFSNEIPLLRQSTIPVSDAQRFVLVELTNQGGDS 66 130

ITAAIlOTNlgyVAYOAGDQSYFLRDAPRGAETHLFTGTTRSSLPraGsgPDLERYAGHRDOIPL ITAAIDVTNI l WAYQAGDQSYFLRDAPNGAERHLFTGTARSSLPFTGS ^TDLERYAGHRDQIPL ITAAIDVTMlßWAYQAGDQSYFLRDAPPGAERHLFTGTTRSSLPFTGS@IDLERYAGHRDQIPL 131 195

GIDQLIQSVTALRFPGGSIRTQARSILILICMISE GIEELIQSVSALRYPGGSTRAQARSILILIQMIS§ GIEELIQSVSALRYPGGSTRAQARSIIVLIQMIS 196

WFNPILWRARQYINSGAS FLPDVYMLEL SFKPIFWRVRODINSGESFLPDMYMLEL §FNPIFWRVRQDINSGESFLPDMYMLEL 254

ETSMGQQSTQVQHSTDGVFNNPIRLAIPPGNFVTLTMVRDVIASLAIMLFVCGERPSSS ETSMGQQSTQVQQSTDGVFNNPFRLAISTGNFVTLSNVRDVIASIAIMLFVCGERPSSS ETSMGQQSTQVQQSTEDVFiOIPFRLAISTGNFVTLSNVRDVIASIAIMLFVCRIIRPSSS

Рис. 1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей А-субъединиц нативных (МЫА, А58957: МЫПА, Р826831 и рекомбинантного (rMLgA) токсических лектинов омелы. Отличающиеся аминокислоты заштрихованы. Сайты гликозилирования (Ы-х-5/Т) подчеркнуты двойной линией, инвариантные аминокислотные остатки в активном центре ферментов выделены прямоугольниками.

Наиболее существенным отличием между А-субъединицами МЫ и rMLg является отсутствие в rMLgA (и MLIIIA) сайта гликозилирования в позиции N112 вследствие замены остатка аспарагина на треонин. Это согласуется с результатами окраски нативных токсинов омелы после электрофоретического разделения реактивом Шиффа [Темяков и др., 1997] и определения их гликозилированности [Zimmermann and Pfuller, 1998], показавшими, что А-субъединица MLIII не содержит углеводов. Также белки MLIA и rMLgA различаются по количеству положительно и отрицательно заряженных аминокислот, в результате чего наблюдается разница в изоэлектрической точке белков: pl = 6,11 у MLIA и 5,26 у rMLgA, и общем заряде белка при нейтральном рН: —1,87 у MLIA и —5,86 у rMLgA.

Рекомбинантная В-субъединица лектина омелы rMLgB по выведенной аминокислотной последовательности гена имеет 86,3% одинаковых консервативных и 89,7% сходных а.о. с В-субъединицей MLI, отличаясь по 36 аминокислотам. В то же время последовательность rMLgB практически совпадает (идентичность и сходство 98,5%) с сиквенсом белка MLIIIB, определенным с помощью деградации по Эдману

[ОепБапк Лее. N0. Р87800], отличаясь всего по 3 аминокислотам (рис. 2). Различия между МЫВ и гМ^В в количестве положительно и отрицательно заряженных аминокислот приводят к разнице в изоэлектрической точке белков: р1 = 5,43 у МЫВ и 7,63 у гМ^В, и общем заряде при нейтральном рН: 0,69 у МЫВ и -2,23 у гMLgB.

М1ЛВ

мы ив

гМЬдВ

мыв ни ив

гМЪдВ

мыв мыив

гмьдв МЫВ

мы ив гмьдв

(1) ОРУТСЗАЗЕРТУМУСШЭ (1) -РУТСТАЗЕРГУЮТОЮХЗЬС (1) РРУТСТАЗЕРТта1УИиХ;1,С 67

1ШГОПШСК01С>1^РВ| КРСКгаЮЫРЮЬЗРЯ

ирокгишырюьзрс!

кмдар! вотре]

КНТРИ

зштижрстшзшзсц омгдаихзтхкзгкжси щлгг1ыфст1кзысксьт 132

( 67) ТУСУТАСТУУМГГРГЫТАУЯЕАТШОТИОтТ!™РК.ЧНЪУ1ДА5ЯС,1ГКЙТТЪТУ0Т1.РУТЬС<у;И

(66) TYGYTAGVYУMIГPCNTAVREATLWQIWG^^iдXIINPR5NLVLGAASGSSGTTLTVQTQVYSLGQGW

(67) ТУСУТАСУУУМ1Г1Х:ОТАУ1^ТЬНЩ2СИа111КРКБ11ЬУЬСААЗСЗЗСТТЬТУ0Т0УУЗЬС2СН 133 198

(133) LAGШ1APREVTIYGFRDLCMESNGGSVWVE1CVSSQKNÍ2RWALYGDGSIRPKQNQD^CLTCGRDS

(132) LAG^1DTAPREVTIYGFRD1CMEANGASVWVETCGSSKEH0DWA1YGEGSIRPK01^0D0CLTC0GDS

(133) иУеЫРТАРНЕУПУСГКРЬСМЕАИбАЗУИУЕТСбЗБКЕКОШАЬУСШЗТКРКОМОРОСЪТСОСРЗ 199 263

(199) УЗТУ1М1УЗСЗА633СЩ?УГОгеСА1ШЬКтеШДОА0гШРКЬШ1111

(198) УЗТУ1Ы1УЗСЗАСБЗСШНУГТШ;СТ11КЬШ01.УШУАОЗЫЕ5ЬКЯ1 II

(199) У5А'/1М1У5С5АС353ОЕИУГТЫЕ5ТГЬНЬНМСЬУВД'/Л03Ы£5^ВК111

РАТСКНШШЬРУР

ратсирИ5ШЬРУР рлтйкзЯадаьрур

Рис. 2. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей В-субьединиц нативных (МЫВ, А58957: МЬШВ, Р81830) и рекомбинантного (гМЬ§В) лектннов омелы. Отличающиеся аминокислоты заштрихованы. Сайты гликозилирования (Ы-х-5Я) выделены двойным подчеркиванием, повторы подчеркнуты одной линией, важные

аминокислотные остатки в углевод-связвющих центрах лектинов выделены прямоугольниками.

В аминокислотной последовательности гMLgB было найдено десять остатков цистеина, тогда как в MLIB их девять. Дополнительный цистеин является результатом мутации 8ег40—»Сув, поэтому гMLgB (и MLIIIB) может формировать еще одну дисульфидную связь с Сув21 в N-терминальном домене белка, что характерно для В-субъединиц других РИБ II. А.о. 01п34, 8ег111 и Не 114 участвуют в гидрофобном взаимодействии между В-субъединицами двух молекул MLI при образовании ими гетеротетрамера [№ша е1 а1., 2003], и вследствие замен этих аминокислот на пролин, аланин и серии, соответственно, MLIII не способен к формированию подобного тетрамера.

Сравнивая а.о., составляющие углевод-связывающие сайты В-субъединиц MLI

и MLIII, мы нашли важные замены, которые могут определять углеводную

специфичность лектинов: MLI - к галактозе, а MLIII - к ^ацетилгалактозамину

(Оа1№Ае). N-концевой углевод-связывающий сайт MLIB не проявляет специфичности

к GalNAc из-за стерического препятствия Asp27 для размещения N-ацетильной группы сахарида [Niwa et al., 2003], тогда как у MLIIIB в этом положении находится остаток глицина. С другой стороны, также мешает связыванию GalNAc остаток Asp45, который у RTB соответствует Asp44, из-за чего RTB взаимодействует с N-ацетилгалактозамином только в С-концевом углевод-связывающем сайте [Rutenber and Robertus, 1991]. Замена W38-»S у MLIIIB должна снижать аффинность связывания углеводов в N-концевом сайте, так как наличие в этом положении ароматического а.о. консервативно у всех РИБ II, так как данный остаток вступает в стэкинг-взаимодействие с плоскостью пиранозного кольца сахара. Для MLIII отмечено, что его агглютинирующая способность гораздо ниже, чем у МLI [Franz et al., 1981], возможно вследствие утраты аффинности к углеводам у одного сайта.

В С-терминальном углевод-связывающем сайте МЫВ боковая цепь аминокислоты Lys254 стерически препятствует размещению N-ацетильной группы GalNAc [Lee et al., 1994]. У MLIIIB в положении 254 находится а.о. Asn, также как у В-субъединицы нигрина Ь, специфичного к GalNAc [Van Damme et al., 1996]. У RTB в соответствующем положении находится Asp. Можно предположить, что более короткая боковая цепь аминокислот (Asn, Asp) не вызывает пространственных препятствий для ацетамидной группы при связывании GalNAc. У RTB в С-терминальном углевод-связывающем центре располагается Ser238, чья боковая цепь образует водородную связь с N-ацетильной группой GalNAc [Rutenber and Robertus, 1991]. В этом положении у MLIB находится А1а239, который не может формировать аналогичную водородную связь. У MLIIIB здесь находится Ser239, также как у нигрина b.

Замена остатка Lys242 в MLIB на Ser в MLIIIB превращает Asn240 в возможный сайт гликозилирования в составе последовательности N-x-T/S. Но при этом сайт гликозилирования располагается очень близко к С-концевому углевод-связывающему центру. Нигрин b также имеет сайт гликозилирования в этом положении, но при этом сохраняет лектиновую активность. Поэтому мы можем считать, что близость сайта гликозилирования не влияет на способность связывания Сахаров. В MLIB сайт гликозилирования находится в положении Asn61. Замена Ser63 в MLIB на Arg в MLIIIB отменяет гликозилирование в этом сайте. Тем не менее, общее число возможных сайтов гликозилирования в MLIB и MLIIIB остается равно

трем, но было показано, что В-субъединицы нативных токсических лектинов МЫ и MLIII имеют только по два гликановых компонента [Zimmermann and Pfuller, 1998]

Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантных А-субъединиц токсических лектинов омелы. Продукцию рекомбинантных белков rMLgA и rMLIA в клетках Е coh контролировали с помощью электрофореза в 12,5% ДСН-ПААГ. Клоны, экспрессирующие белок с молекулярной массой около 25—30 кДа, отбирали для дальнейшего исследования.

Рис 3 12,5% ПААГ-алектрофорез (а) и иммуноблоттинг нативных токсических лектинов омелы и рекомбинантных белков гМ1&А и гМЫА, экспрессированных в клетках Е сок, с моноклональными антителами ТА7 (б) I - МЫ, 2 - МШ, 3 - МЬШ, 4 - экспрессия гMLgA, клеточный лизат, 5 - лизат клеток Е сок БЕ21 (БЕЗ) без индукции ИПТГ, 6 - экспрессия гMLIA, клеточный лизат Указана молекулярная масса маркерных белков в кДа.

Рекомбинантные А-субъединицы синтезировались бактериальными клетками в тельцах включения, их продукция от общего количества белка составляла приблизительно 10-15% (рис. 3, а) Специфичность полученных белков подтверждали с помощью иммуноблоттинга с моноАТ ТА7, направленных к денатурированной форме А-цепей трех токсических лектинов из Европейской омелы. Оба рекомбинантных белка окрашивались одинаково (рис. 3, б).

Очищенные рекомбинантные А-субъединицы токсинов омелы ренатурировали в ФСБ, концентрацию ренатурированных белков выравнивали с помощью ИФА с моноАТ ТА7 для исследования в других сэндвич-ИФА и изучения их каталитической

активности. После ренатурации выход обоих рекомбинантных белков составлял около 10%.

Для изучения иммунохимических свойств рекомбинантных А-субъединиц были использованы три системы сэндвич-ИФА: ММЛ9-ММЛ4-ВИОТИЫ (анти-МЬ1А), МКЛ4-Ы11-биотин (анти-МЬНЛ) и Н8-Н11-биотин (анти-МЬП, анти-МЬШЛ).

а б

ми

МЛ мин гмид гМ_дА

0,8

0,4 02 0

ми

П.г,----

мл мип гмид гМЬдА

ми

Ми! МШ гМШ гМЬдА

Рис. 4. Взаимодействие ренатурированных рекомбинантных белков гМЬ1А и гМЬ^Л в сэндвич-ИФА в системах ММЛ9-ММЛ4-биотин (анти-МЬ1) (а), ММЛ4-Ы11-биотин (аши-МЬП) (б), Н8-Н11-биотин (анти-МЬН, МЬШ) (в). Концентрация белков 100 нг/мл. Представлены результаты одного из трех типичных экспериментов.

Рекомбинантный белок гМЬ1А узнавался, а белок гMLgЛ практически не определялся в системе МКЛ9-МКЛ4-ВИОТИЫ (рис. 4, а), тем самым мы подтвердили, что новый экспрессированный белок не является производным вискумина. В системе сэндвич-ИФА МКЛ4-Ы11-биотин, было доказано, что рекомбинантные продукты гМЬ1Л и гMLgЛ не являются производными токсического лектина омелы МЬ11 (рис. 4, б). Рекомбинантный белок гMLgЛ детектировался только в системе Н8-Н11-биотин (рис. 4, в), это позволяет говорить о том, что А-субъединица клонированного гена несет антигенные детерминанты токсического лектина МЬ111.

Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантной В-субъединиц токсического лектина омелы. Продукцию рекомбинантного белка rMLgB в клетках Е coli контролировали с помощью электрофореза в 12,5% ДСН-ПААГ. Клоны, экспрессирующие белок с молекулярной массой около 30 кДа, отбирали для дальнейшего исследования Рекомбинантная В-субъединица накапливалась бактериальными клетками в тельцах включения, ее продукция от общего количества белка составляла приблизительно 3% (рис 5, а)

Так как пока не существует моноклональных антител, узнающих денатурированную В-субъединицу MLIII в иммуноблоте, для подтверждения специфичности рекомбинантного белка rMLgB мы применили двухстадийный иммунологический анализ на первом этапе с поликлональной анти-MLIII сывороткой

против денатурированного токсина было подтверждено, что rMLgB является производным ML-токсинов (рис 5, б), а на втором этапе с моноАТ ТА7 было показано, что полученный белок не является А-субъединицей (рис 5, в)

Рис 5 12,5% ПААГ-электрофорез (а) и иммуноблотгинг нативных токсических лектинов омелы и рекомбинантных белков rMLgA и rMLgB, экспрессированных в клетках Е coli, с анти-MLIII сывороткой (б) и моноАТ ТА7 (в) 1 - MLI, 2 -MLII, 3 - MLIII, 4 - лизат клеток Е coli BL21 (DE3) без индукции ИПТГ, 5 - экспрессия rMLgB, клеточный лизат, б - очищенный белок rMLgB, 8 - экспрессия rMLgA, клеточный лизат Указана молекулярная масса маркерных белков в кДа

Были проведены опыты по ренатурации отдельно очищенной рекомбинантной В-субъединицы (гMLgB) и совместно двух рекомбинантных субъединиц токсина (гMLgA+гMLgB) с образованием гетеродимерного белка. Для контролирования процесса сворачивания нативный токсин MLШ тоже денатурировали в буфере с Gnd-НС1 и затем ренатурировали в тех же условиях, что и рекомбинантные белки. Ренатурированные белки выравнивали по концентрации с помощью ИФА с поликлональной анти-MLШ сывороткой для для исследования в других сэндвич-ИФА и изучения лектиновой активности. Выход ренатурированных рекомбинантных белков составлял около 10%.

Для изучения иммунохимических свойств рекомбинантных В-субъединиц были использованы две системы сэндвич-ИФА: Е12-МТС12-биотин (анти-MLШB) и Е12-Ш1-биотин (анти-МЫИВ-анти-МLША). Было обнаружено, что антигенная активность рекомбинантного белка гMLgB составила 24% от активности свернутого денатурированного MLШ, взятой за 100% (рис. 6, а), а активность рекомбинантного гетеродимера (гMLgA+гMLgB) - 27% (Рис. 6, б). Исходя из свойств используемых в анализе анти-MLШB моноАТ Е12 и МТС 12, которые не узнают денатурированный

Рис. б. Исследование иммунохимической активности рекомбинантных белков гMLgB, гетеродимера гMLgA+гMLgB и денатурированного токсического лектина MLШ (dMLШ ге^) после ренатурации в сэндвич-ИФА. Взаимодействие белков в системе Е12-МТС12-биотин (а) и в системе Е12-Н11-биотин (б). Активность свернутого денатурированного белка MLШ принята за 100%. Концентрация белков 1 мкг/мл. Представлены результаты одного из трех типичных экспериментов.

белок МЬ111, можно утверждать, что формирование антигенных эпитопов в гМ1^В и в гетеродимерном рекомбинантном токсине (гMLgA+гMLgB) проходит успешно в данных условиях ренатурации.

Предсказание антигенных эпитопов в субъединицах токсических лектинов омелы МЫ и MLШ. Ранее было показано, что клетки гибридом, продуцирующие моноАТ против токсических лектинов омелы, устойчивы к ним [Егорова и др., 1997]. Это предполагает, что области, образующие антигенные эпитопы токсина, задействованы в его внутриклеточном транспорте. Исходя из различий в первичной структуре А-субъединиц МЫ и МОП, а также особенностей взаимодействия с ними специфических моноклональных антител мы сделали предсказание расположения антигенных эпитопов для моноАТ на поверхности белка. Взяв за основу трехмерную модель вискумина и предполагая, что

токсические лектины омелы МЫ и МОП имеют сходную пространственную структуру, мы рассматривали расположение а.о., различающихся в этих двух белках. Так как моноАТ МКЛ9 и МКЛ4, специфичные к МЫЛ, и моноАТ Н8 и НИ, специфичные к МЫИЛ, узнают токсины как в нативном, так и в денатурированном состоянии, мы сделали предположение, что антигенные эпитопы для них расположены на поверхности и линейны. Определив поверхностные а.о., мы проанализировали подвижность и гидрофильность участков, в которых они находятся, и образуемые этими областями вторичные структуры. В таблице 1 представлены предсказанные поверхностные антигенные эпитопы для МЫЛ и МЫНЛ. Расположение этих участков на противоположных сторонах молекулы объясняет использование пары специфических антител в сэндвич-ИФА. Антигенный эпитоп для моноАТ МКЛ5 предсказан в области контакта А- и В-субъединиц МЫ на основании того, что антитела взаимодействуют только с изолированной А-цепью вискумина, но не МОП, и на этом участке существуют отличия в аминокислотных последовательностях токсинов омелы.

Аналогичным образом оценивали расположение антигенных эпитопов в В-субъединицах МЫ и МОП. Так как моноАТ ТВ 12, специфичные к МЫВ, узнают белок в нативном и денатурированном состоянии, мы сделали предположение, что антигенный эпитоп для них расположен на поверхности молекулы и является линейным. При этом было показано, что взаимодействие МЫВ с моноАТ ТВ 12

отменяется при связывании лектина с остатками галактозы на гликозилированном белке асиалофетуине, из чего сделан вывод, что антигенный эпитоп находится рядом с одним из углевод-связывающих сайтов В-субъединицы [Tonevitsky й 1995]. МоноАТ МТС 12 взаимодействуют только с нативным белком MLШ, и вероятно эпитоп для них располагается также на поверхности молекулы. В таблице 2 представлены предсказанные поверхностные антигенные эпитопы для МЫВ и MLIIIB.

Таблица 1. Специфические моноклональные антитела к А-субъединицам токсических лектинов омелы МП и MLШ и их возможные эпитопы.

МоноАТ Эпитопы

Анти-МЫА MNA4 91-99

MNA9 223-224

MNA5 208-212

Анти-MLПIA Н8 91-99

Н11 177-184

Таблица 2. Специфические моноклональные антитела к В-субъединицам токсических лектинов омелы МЫ и MLШ и их возможные эпитопы.

МоноАТ Эпитопы

Анти-МLIВ ТВ12 27-34 или 254-256

Анти-МLШВ МТС12 166-170

Исследование каталитической активности рекомбинантных А-субъединиц токсических лектинов омелы. В работе были исследованы ферментативные свойства рекомбинантных А-субъединиц токсинов омелы МЫ (гМЫА) и MLШ (гMLgA) и нативной А-субъединицы MLI (MLIA) как специфических ^гликозидаз, действующих на эукариотические рибосомы и приводящих к ингибированию эндогенного синтеза глобина в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика. Показано, что рекомбинантный белок гMLgA вызывает снижение включения [ Н]-лейцина в состав синтезируемого глобина на 60%, то есть проявляет рибосом-инактивирующую активность. Однако нативная и рекомбинантная А-субъединицы вискумина в той же концентрации (800 нг/мл) были более активны (снижение включения метки на 89 и 81%, соответственно) (рис. 7).

Рис. 7. Каталитическая рибосом-инактивирующая активность А-субъеди-ниц нативного вискумина (MLIA) и рекомбинантных белков гMLIA и rMLШA, определяемая по ингибированию вклю-чения в состав глобина, синтезируемого в бесклеточной системе лизата- ретикулоцитов кролика. За 100% принято включение в

отсутствии токсина (ФСБ), за 0% - при добавлении в систему 10 мкг/мл А-цепи рицина. Представлены результаты одного из трех типичных экспериментов.

Подобные различия в активности между А-субъединицами токсинов могут объясняться тем, что препарат рекомбинантного белка гMLgA содержит некоторое количество неправильно свернутых в области активного центра молекул, которые детектируются в ИФА, но не проявляют активность в бесклеточной системе синтеза белка. Отмеченные выше отличия у А-субъединиц токсических лектинов МЫ и MLШ в числе заряженных аминокислот и общем заряде белка при близком к нейтральному значении рН в буфере ренатурации могут влиять на процесс сворачивания рекомбинантных белков из денатурированного состояния.

Исследование углевод-связывающей способности рекомбинантной В-субъединицы токсического лектина омелы. Для анализа углевод-связывающей активности ренатурированных белков rMLgB и гетеродимерного рекомбинантного токсина гMLgA+гMLgB использовали сорбированный на планшет модельный рецептор 3F12, являющийся гликозилированным иммуноглобулином. МоноАТ МТС12 (анти-MLШB) и НИ (анти-MLШA) использовались для детекции взаимодействия лектина с рецептором. Лектиновая активность ренатурированного белка rMLgB в системе 3F12 - MTC12 - БИOTИH составила54% отактивности свернутого денатурированного MLШ, взятой за 100% (рис. 8, а), тогда как активность гетеродимера гMLgA+гMLgB - 95% от контрольной (рис. 8, б).

Рис. 8. Исследование угевод-связывающей способности рекомбинантных белков гMLgB, гетеродимера гMLgA+гMLgB и денатурированного токсического лектина MLШ (dMLШ гen.) после ренатурации в сэндвич-ИФА с модельным рецептором 3F12. Взаимодействие белков в системе 3F12-MTC12-БИOTИH (а) и в системе 3F12-H11-БИOTИH (б). Активность свернутого денатурированного белка MLШ взята за 100%. Концентрация белков 1 мкг/мл. Представлены результаты одного из трех типичных экспериментов.

В качестве возможного объяснения различия в лектиновой активности ренатурированных рекомбинантных белков можно предположить, что антигенный эпитоп для моноАТ МТС 12 в В-субъединице MLIII располагается таким образом, что при взаимодействии углевод-связывающих центров лектина со специфическими сахарами на гликопротеине 3F12 этот эпитоп частично перекрывается молекулой иммуноглобулина, тогда как моноАТ НИ легко связываются с А-субъединицей в составе рекомбинантного гетеродимера. Помимо этого, мы обнаружили, что нативный токсин MLIII не проявлял активности в системе сэндвич-ИФА 3F12^12-биотин (данные не приведены), что может свидетельствовать о блокировании гликозилированным белком взаимодействия В-субъединицы с моноАТ Е12.

Создание мутантных форм рекомбинантных А-субъединиц МЫ и MLIII и

анализ их каталитической активности. По данным рентгено-структурного анализа

различных РИБ II — рицина [Katzin et al., 1991], абрина [Tahirov et al., 1995] и

вискумина [Krauspenhaar et al., 1999] - были определены а.о., образующие активный

центр каталитических субъединиц токсинов. Это аминокислоты Туг76, Туг115,

Glul65, Argl68 и Тгр199 (нумерация по номенклатуре ML-токсинов), которые

являются инвариантными у всех РИБ [Funatsu et al., 1991]. Также были найдены

важные а.о. Asn74, Argl25, Glnl61 и Glul96, формирующие окружение активного центра и участвующие в поддержании его структуры [Katzin et al., 1991].

Нативная А-субъединица Y76

Y115

E165R168 E196W199

■ I ZW

E165A-R168L

■ I

А L

Y76S*E165A*R168L

А L

Y115S*E165A*R168L

■ I

А L

Eie5A*R168L*E196D*W199L

■I—ZW

AL DL

Рис. 9. Схема произведенных замен аминокислотных остатков в А-субъединицах ML-токсинов. Инвариантные аминокислотные остатки, составляющие активный центр фермента, выделены черным цветом, важная аминокислота Е196 из окружения активного центра выделена серым цветом.

Для создания неактивных форм каталитических субъединиц токсинов омелы МЫ и MLIII в активном центре белков были сделаны замены следующих аминокислот:

в различных сочетаниях (рис. 9). Сайт-специфический мутагенез проводили с помощью последовательных этапов ПЦР на основе плазмид, несущих рекомбинантные фрагменты генов токсинов омелы, кодирующих А-субъединицы.

В результате были получены по четыре варианта рекомбинантных мутантных белков MLIA и MLIIIA: E165A*R168L, Y76S*E165A*R168L,

с высоким уровнем экспрессии (до 15-20% от общего белка) в клетках Е. coli. Рекомбинантные белки выделяли из телец включения, ренатурировали в ФСБ и определяли конечную концентрацию белка в растворе при помощи ИФА против А-субьединиц ML-токсинов.

Ферментативная рибосом-инактивирующая активность мутантных белков определялась с помощью системы бесклеточного синтеза белка на основе лизата ретикулоцитов кролика. В качестве контрольных белков использовались нативная А-

100 • 90-

so-7060. so-

40302010-о-

¿1 » 5 S li

(0 tu

100-1 9080706060403020100-

кй ю —¡

«i У Ji

2 S

Ul 2

Ьй

1л á

00 s

? S3 SIS

Рис. 10. Каталитическая рибосом-инактивирующая активность нативной растительной А-субъединицы МЫ, рекомбинантной и мутантных форм А-субъединиц МЫ (а) и MLШ (б), определяемая по ингибированию включения [3Н]-лейцина в состав глобина, синтезируемого в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика. За 100% принято включение [3Н]-лейцина в отсутствии токсина (ФСБ); за 0% - при добавлении в систему 10 мкг/мл А-цепи рицина. Концентрация токсинов 800 нг/мл. Представлены результаты одного из трех типичных экспериментов.

субъединица вискумина (MLIA) и рекомбинантные А-субъединицы МЫ (гMLIЛ) и MLIII О^ША).

Двойная мутация E165Л*R168L ненамного снижает активность белка, что отражается в увеличении количества включенного [3Н]-лейцина на 10% по сравнению с действием рекомбинантных белков гMLIA и гMLIIIA. Добавление к этим двум мутациям замены одного из тирозинов в активном центре - У768 или У1158 - еще более снижает активность каталитической субъединицы, причем в случае мутантного белка Y76S*E165A*R168L в два раза сильнее (активность мутантного варианта МLIА отличается на 34,8% от действия гMLIA, активность мутантного варианта MLIIIA отличается на 28,7% от гMLIIIA), чем для мутантной формы У115S*E165Л*R168L (разница в активности 18,5% и 14,6% с гMLIA и гMLIIIA, соответственно). Для мутантного белка с наибольшим числом замененных а.о. E165A*R168L*E196D*W199S отмечено максимальное снижение активности: разница с действием исходных рекомбинантных белков гMLIA и гMLIIIA - 40,83% и 32,8%, соответственно (рис. 10).

Наши результаты согласуются с данными разных авторов по влиянию мутаций на активность каталитических субъединиц РИБ - рицина, абрина, вискумина и Шига-подобного токсина I. Катализ №гликозидной связи между субстратным аденином и рибозой в 28S рРНК происходит при протонировании атома N-7 аденина аргинином Лгg168, и переходное состояние комплекса (оксикарбониевый ион) стабилизируется остатком 01и165. Поэтому замена этих двух а.о. должна приводить к практически полной отмене активности белка, что на самом деле не наблюдается. При замене E165A*R168L не происходит сильного снижения активности фермента, вероятно за счет замещения этого остатка расположенной рядом глутаминовой кислотой в положении 196. При дополнительной замене E196D активность существенно снижается, так как более короткая боковая цепь аспарагиновой кислот не может замещать мутированный остаток Е165А. Ароматические а.о. Туг76 и Туг1 16 участвуют в стэкинговом взаимодействии с пуриновым кольцом аденина. Для каталитической активности фермента остаток У76 является более важным. Триптофан в положении 199 стабилизирует структуру активного центра РИБ II за счет формирования водородных связей и гидрофобных взаимодействий с прилегающими а.о., в частности с Лщ168. Делеция этого остатка в А-цепи рицина

полностью отменяла активность белка, а замена триптофана на другие аминокислоты снижала активность очень незначительно. Наибольшая потеря каталитической активности отмечена нами у рекомбинантных мутантных форм А-субъединиц МЫ и MLIII, несущих одновременную замену трех а.о. Y76S*E165A*R168L и четырех а.о. E165A*R168L*E196D*W199L. В последнем случае можно предполагать, что мутация W199L минимально влияет на снижение активности белка.

Выводы

1. Клонирован новый ген предшественника токсического лектина из Европейской омелы MLIII. Сравнение аминокислотных последовательностей А- и В-субъединиц вискумина (МЫ) и MLIII выявило различные аминокислотные остатки в составе углевод-связывающих сайтов белков, определяющие их специфичность к разным сахарам, а также позволило предсказать поверхностные эпитопы для специфических анти-MLI и анти-МЫП моноклональных антител.

2. Экспрессированные в клетках Escherichia coli и ренатурированные рекомбинантные А- и В-субъединицы, кодируемые новым геном, эффективно взаимодействуют со специфическими анти-MLIII моноклональными антителами.

3. Рекомбинантные А-субъединицы токсических лектинов омелы МЫ и MLIII ингибируют синтез белка в эукариотической бесклеточной системе, что доказывает наличие у них каталитической рибосом-инактивирующей активности. Рекомбинантная В-субъединица MLIII взаимодействует с гликозилированным модельным рецептором, что говорит о ее углевод-связывающей способности.

4. Получены мутантные формы рекомбинантных А-субъединиц токсических лектинов омелы MLI и MLIII со сниженной каталитической активностью. Показано, что наиболее важными аминокислотными остатками в активном центре являются Туг76, Glul65 и Argl68.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пашков B.C., Агапов И.И., Балашова ТА., Егорова Н.С., Суровой А.Ю., Певзнер И.Б., Тоневицкий А.Г. Эпитоп каталитической субъединицы вискумина, экспонируемый при его взаимодействии с липидным бислоем. Биоорганическая химия 2003, т. 29 (6), с. 589-596.

2. A.G. Tonevitsky, I.I. Agapov, I.B. Pevzner, N.V. Malyuchenko, M.M. Moisenovich, M. Yurkova, K. PfUeller, U. PfUeller. A new gene encoding the ribosome-inactivating protein MLIII from mistletoe extracts. 3 Mistelsymposium "Die Mistel in der Tumortherapie. Grundlagenforschung und Klinik", Germany, Normweiler-Otzenhausen, 20-22 November, 2003, p. 51.

3. A.G. Tonevitsky, I.I. Agapov, I.B. Pevzner, N.V. Malyuchenko, M.M. Moisenovich, R.A. Palmer, M. Yurkova, K. Pfueller, U. Pfueller. A new gene encoding the ribosome-inactivating protein from mistletoe extracts. Drug Research 2004,54 (4), p. 242-249.

4. Тоневицкий А.Г., Агапов И.И., Певзнер И.Б., Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Пфюллер У., Кирпичников М.П. Клонирование и экспрессия каталитической субъединицы MLIII, рибосом-инактивирующего белка омелы белой. Биохимия 2004, т. 69 (6), с. 790-800.

5. Певзнер И.Б., Агапов И.И., Пфюллер У., Пфюллер К., Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Тоневицкий А.Г., Кирпичников М.П. Клонирование и экспрессия В-субъединицы токсического лектина омелы III. Биохимия 2004, т. 69 (9), с. 11591167.

6. I.B. Pevzner, I.I. Agapov, H. Niwa, N.V. Maluchenko, M.M. Moisenovich, U. Pfiiller, A.G. Tonevitsky. Differences in amino acid sequences of mistletoe lectin I and III B-subunits determining carbohydrate binding specificity. Biochimica et Biophysica Acta 2004, v. 1675, pp. 155-164.

»222 7 0 5

Подписано в печать 10 ноября 2004 г. Заказ 449. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в отделе оперативной печати ПКФСтрой. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ. Тел. 778-97-47

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Певзнер, Ирина Борисовна

Список сокращений.

Введение.

Цель и задачи исследования.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Определение и классификация РИБ.

1.2. Токсины из растения омела белая (Viscum album L.).

1.3. Строение вискумина.

1.3.1. Строение А-субъединицы вискумина.

1.3.2. Строение В-субъединицы вискумина.

1.3.3. Взаимодействие между субъединицами вискумина.

1.3.4. Димеризация вискумина.

1.4. Ферментативная активность РИБ.

1.5. Исследование структуры каталитического активного центра РИБ с помощью сайт-направленного мутагенеза.

1.6. Биосинтез РИБ в растительных клетках.

1.7. Физиологическая роль РИБ в растениях.

1.8. Транспорт РИБ II в эукариотических клетках.

1.9. Применение РИБ в медицине.

1.9.1. Биологическая активность экстрактов омелы и их компонентов.

1.9.2. Иммунотоксины и вакцины на основе РИБ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы бактерий, плазмиды, ДНК-модифицирующие ферменты и реактивы

2.2. Выделение нативных токсинов и их субъединиц из растения Viscum album L.

2.3. Выделение токсинов и их субъединиц из растения Ricinus communis.

2.4. Выделение геномной ДНК из растения Viscum album L.

2.5. Клонирование гена предшественника лектина омелы.

2.6. Клонирование фрагмента гена, кодирующего А-субъединицу токсического лектина омелы.

2.7. Клонирование фрагмента гена, кодирующего В-субъединицу токсического лектина омелы.

2.8. Анализ последовательностей клонированного гена и его фрагментов.

2.9. Предсказание антигенных детерминант в А- и В-субъединицах MLI и MLIII

2.10. Экспрессия рекомбинантных белков.

2.11. Выделение и очистка рекомбинантных белков.

2.12. Ренатурация рекомбинантных белков.

2.13. Иммуноблоттинг.

2.14. Иммуноферментный анализ (ИФА).

2.15. Бесклеточная система синтеза белка.

2.16. Оценка углевод-связывающей способности рекомбинантных белков.

2.17. Создание мутантных форм рекомбинантных А-субъединиц MLI и MLIII с помощью сайт-направленного мутагенеза.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Клонирование гена иЪшлиз последовательности предшественника токсического лектина омелы.

3.1.1. Анализ нуклеотидной последовательности гена и сигнальных пептидов предшественника токсического лектина омелы.

3.1.2. Анализ аминокислотной последовательности А-субъединицы токсического лектина омелы.

3.1.3. Анализ аминокислотной последовательности В-субъединицы токсического лектина омелы.

3.2. Получение рекомбинантных субъединиц токсического лектина омелы и исследование их активности.

3.2.1. Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантных А-субъединиц токсических лектинов омелы.

3.2.2. Предсказание антигенных эпитопов в А-субъедницах MLI и MLIII.

3.2.3. Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантной В-субъединицы токсического лектина омелы.

3.2.4. Предсказание антигенных эпитопов в В-субъедницах MLI и MLIII.

3.2.5. Исследование каталитической активности рекомбинантных А-субъединиц токсинов омелы MLI и MLIII.

3.2.6. Исследование углевод-связывающей способности рекомбинантной В-субъединицы токсина омелы MLIII.

3.3. Создание мутантных форм рекомбинантных А-субъединиц MLI и MLIII.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рибосом-инактивирующие белки II типа из омелы: клонирование, экспрессия и структурно-функциональные свойства"

Европейская омела (V. album L.) является паразитом хвойных и лиственных деревьев и кустарников и с древних времен широко используется в медицине как лекарственное растение. Из зеленых частей растения выделяют три изоформы токсических лектинов - MLI (вискумин), MLII и MLIII, которые по своему строению принадлежат к семейству рибосом-инактивирующих белков II типа (РИБ II). РИБ II являются гетеродимерными гликопротеинами, состоящими из двух субъединиц с молекулярной массой каждой около 30 кДа, связанных между собой дисульфидной связью. А-Субъединица токсина является высокоспецифичным ферментом N-гликозидазой и выщепляет остаток аденина в положении 4324 28S рРНК 60S-субъединицы эукариотической рибосомы, приводя к остановке синтеза белка в клетке. В-Субъединица является лектином, который связывается с гликозилированными рецепторами на поверхности клетки и вызывает агглютинацию клеток in vitro, а также способствует интернализации ферментативной субъединицы токсина путем эндоцитоза.

MLI, MLII и MLIII различаются между собой по молекулярной массе, а также углеводной специфичности. MLI специфичен по отношению к галактозе, MLIII - к N-ацетилгалактозамину, a MLII имеет одинаковую аффинность к обоим сахарам. Тем не менее, сравнение аминокислотных последовательностей токсических лектинов омелы говорит о высокой степени их гомологии (>90%).

Токсические лектины омелы присутствуют во всех экстрактах омелы и являются основными их составляющими наряду с вискотоксинами и другими веществами небелковой природы. В настоящее время водные экстракты из листьев омелы белой используются в ряде стран Европы, Азии и Америки в качестве иммуномодулирующих и противоопухолевых препаратов в клинической практике. Токсины омелы MLI и MLIII обладают разной биологической активностью в отношении различных клеток млекопитающих. Чувствительность клетки-мишени к цитотоксическому действию лектинов омелы определяется содержанием гликозилированных рецепторов на ее поверхности. Для изолированных токсических лектинов и полных экстрактов омелы показана способность стимулировать выработку цитокинов как in vitro, так и in vivo. Было найдено, что углевод-связывающая В-субъединица MLI стимулирует активность клеток - естественных киллеров (NK-клеток) in vivo, тогда как А-цепь была в тех же условиях полностью неактивна из-за неспособности связывания с углеводсодержащими клеточными рецепторами. Применение экстрактов омелы в качестве дополнительных препаратов при лечении рака существенно снижает побочное действие химиотерапии.

Ранее нами была получена панель моноклональных антител против трех изоформ нативных ML-токсинов (MLI, MLII и MLIII), что позволило иммунохимически детектировать содержание токсинов и их изолированных субъединиц в фармакологических экстрактах омелы, используемых для терапии онкологических заболеваний. Успех терапии может быть связан с процентным содержанием MLI, MLII и MLIII в различных экстрактах. В настоящее время в Германии проходят клинические испытания препарата рекомбинантного MLI. Рекомбинантный гетеродимерный токсин омелы MLIII предлагается для разработки нового антиопухолевого и иммуномодулирующего препарата, а также для исследования терапевтического эффекта его изолированных субъединиц.

Получение рекомбинантных токсических лектинов омелы и исследование их свойств поможет оценить влияние гликозилирования белка на его структуру и функции, приведет к пониманию процессов ренатурации белков и субъединичной гетеродимеризации. Создание трансгенных растений, продуцирующих рекомбинантные токсические лектины омелы, поможет оценить роль рибосом-инактивирующих белков II типа в жизни растений.

Каталитические субъединицы растительных токсинов применяют для конъюгирования с адресными молекулами (например, специфическими моноклональными антителами) при создании иммунотоксинов - препаратов направленного действия, способных избирательно элиминировать опухолевые клетки. Рекомбинантные токсины используют для создания генно-инженерных иммунотоксинов, которые имеют преимущества перед химически созданными белковыми конъюгатами из-за меньшей молекулярной массы, отсутствия гликозилирования, а также возможности вводить в них сигнальные последовательности, позволяющие изменить внутриклеточный транспорт и увеличить активность иммунотоксинов.

РИБ II используются в качестве удобной модели для исследования транспорта белков в эукариотических клетках. Во время своего продвижения к рибосоме РИБ II оказываются задействованными в различных механизмах транспорта: рецептор-опосредованном эндоцитозе, прохождении через эндосомальные компартменты, ретроградном переносе в аппарат Гольджи и эндоплазматическом ретикулум и, наконец, транслокации активной ферментативной части токсина из внутриклеточного компартмента в цитозоль. Обычно создают конъюгаты токсических лектинов с флуоресцентными метками с помощью химических методов, а на основе рекомбинантных белков можно создавать химерные молекулы при слиянии генов токсинов и цветных флуоресцирующих белков. Введение в состав рекомбинантных токсических лектинов последовательностей сигнальных пептидов позволяет менять транспорт белков и изучать влияние различных сигнальных последовательностей на его направленность.

Однако при использовании РИБ II в подобных прикладных целях необходимо учитывать их высокую цитотоксичность по отношению к эукариотическим клеткам. Чтобы снизить отрицательное воздействие токсинов на клетки-мишени, предлагается использовать их ферментативно неактивные формы, созданные на основе рекомбинантных генов РИБ II путем внесения точечных мутаций в активный центр А-субъединиц. Получение таких форм токсических лектинов дает возможность изучать детальные механизмы транспорта РИБ II в эукариотических клетках без инактивации синтеза белка в них, приводящей к гибели клеток.

Способность токсинов к трансмембранному переходу дает возможность использовать их при создании генно-инженерных вакцин нового поколения как вектор для доставки в цитоплазму антиген-презентирующих клеток различных вирусных пептидов или опухолевых антигенов для стимуляции иммунного ответа организма против вирусов и других внутриклеточных патогенов или раковых клеток. Такие конъюгированные с токсинами пептиды доставляются внутрь эукариотической клетки и презентируются в составе комплекса с молекулой МНС I, что приводит к стимуляции цитотоксических лимфоцитов, направленных против данного патогена.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было клонирование нового гена токсического лектина омелы MLIII и сравнительное исследование структурно-функциональных свойств рекомбинантных токсинов MLI и MLIII.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

2. Изучить иммунохимические свойства ренатурированных рекомбинантных А- и В-субъединиц MLI и MLIII с помощью панели моноклональных антител против токсических лектинов омелы MLI, MLII и MLIII.

3. Исследовать ферментативную активность рекомбинантных А-субъединиц MLI и MLIII в бесклеточной системе синтеза белка. Исследовать углевод-связывающую способность рекомбинантной В-субъединицы MLIII в иммуноферментном анализе с модельным рецептором.

4. Получить мутантные формы рекомбинантных А-субъединиц токсических лектинов омелы MLI и MLIII с заменой ключевых аминокислотных остатков в активном центре ферментов, изучить вклад в каталитическую активность токсинов каждого из измененных остатков.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Певзнер, Ирина Борисовна

Выводы

Клонирован новый ген предшественника токсического лектина из Европейской омелы MLIII. Сравнение аминокислотных последовательностей А- и В-субъединиц вискумина (MLI) и MLIII выявило различные аминокислотные остатки в составе углевод-связывающих сайтов белков, определяющие их специфичность к разным сахарам, а также позволило предсказать поверхностные эпитопы для специфических анти-MLI и анти-MLIII моноклональных антител.

Экспрессированные в клетках Escherichia coli и ренатурированные рекомбинантные А- и В-субъединицы, кодируемые новым геном, эффективно взаимодействуют со специфическими анти-MLIII моноклональными антителами.

Рекомбинантные А-субъединицы токсических лектинов омелы MLI и MLIII ингибируют синтез белка в эукариотической бесклеточной системе, что доказывает наличие у них каталитической рибосом-инактивирующей активности. Рекомбинантная В-субъединица MLIII взаимодействуют с гликозилированным модельным рецептором, что говорит о ее углевод-связывающей способности.

Получены мутантные формы рекомбинантных А-субъединиц токсических лектинов омелы MLI и MLIII со сниженной каталитической активностью. Показано, что наиболее важными аминокислотными остатками в активном центре являются Tyr76, Glul65 и Argl68.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Певзнер, Ирина Борисовна, Москва

1. Агапов И.И. Рибосом-инактивирующие белки II типа: структура, внутриклеточный транспорт, биологическая активность, использование для синтеза иммунотоксинов. Дисс. Докт. Биол. Наук. Москва, 1997.

2. Попова Е.Н. Взаимодействие рицина с клетками гибридом, секретирующих антитела против его каталитической субъединицы. Дисс. Канд. Биол. Наук. Москва, 2004.

3. Тоневицкий А.Г., Агапов И.И., Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Ведяков A.M. (2002) значение области межсубъединичного взаимодействия в А-субъединице вискумина для активности токсина. Молекулярная биология, 36 (4), 1-8.

4. Фаттахова Г.В., Агапов И.И., Солопова О.Н., Мойсенович М.М., Тоневицкий А.Г. (2001) Получение моноклональных антител против изоформ растительного токсина вискумина. Биотехнология, 3, 59-70.

5. Agapov I.I., Tonevitsky A.G., Shamshiev A.T., Pohl E., Pohl P., Palmer R.A., Kirpichnikov M.P. (1997) The role of structural domains in RIP II toxin model membrane binding. FEBS Lett., 402,91-93.

6. Agapov II, Tonevitsky AG, Maluchenko NV, Moisenovich MM, Bulah YS and Kirpichnikov MP (1999b) Mistletoe lectin A-chain unfolds during the intracellular transport. FEBS Lett., 464,63.66.

7. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. (1993) Ribosome-inactivating proteins from plants. Biochim. Biophys. Acta, 1154, 237-282.

8. Barbieri L., Lorenzoni E., Stirpe F. (1979) Inhibition of protein synthesis in vitro by a lectin from Momordica charantia and by other haemagglutinins. Biochem. J., 182, 633-635.

9. Barbieri L., Valbonesi P., Bonora E., Gorini P., Bolognesi A., Stirpe F. (1997) Polynucleotide adenosine glycosidase activity of ribosome-inactivating proteins: effect on DNA, RNA and poly(A). Nuc. Acids Res., 25, 518-522.

10. Bass H.W., Webster C., O'Brian G.R., Roberts J.K., Boston R.S. (1992) A maize ribosome-inactivating protein is controlled by the transcriptional activator Opaque-2. Plant Cell. 1992 Feb;4(2):225-34.

11. Bass H.W., Krawetz J.E., O'Brian G.R., Zinselmeier C., Habben J.E., Boston R.S. (2004) Maize ribosome-inactivating proteins (RIPs) with distinct expression patterns have similar requirements for proenzyme activation. J. Exp. Bot., 55,2219-2233.

12. Beuth J., Stoffel В., Ко H.L., Buss G., Tunggal L., Pulverer G. (1995) Immunoactive effects of various mistletoe lectin-1 dosages in mammary carcinoma patients. Arzneimittelforschung / Drug Res., 45, 505-507.

13. Bowman A. (1990) The everlasting mistletoe and the cardiovascular system. Texas Heart Institute Journal, 17,310-314.

14. Bradley J.L., McGuire P.M. (1990) Site-directed mutagenesis of ricin A chain Trp 211 to Phe. Int. J. Pept. Protein Res., 35, 365-366.

15. Braun J.M., Ко H.L., Schierholz J.M., Beuth J. (2003) Standardized mistletoe extract augments immune response and down-regulates local and metastatic tumor growth in murine models. Anticancer Res., 22(6C), 4187-4190.

16. Burger A.M., Mengs U., Schuler J.B., Fiebig H.H. (2001) Anticancer activity of an aqueous mistletoe extract (AME) in syngeneic murine tumor models. Anticancer Res., 21(3B), 19651968.

17. Bussing A., Regnery A., Schweizer K. (1995) Effects of Viscum album L. on cyclophosphamide-treated peripheral blood mononuclear cells in vitro: sister chromatid exchanges and activation/proliferation marker expression. Cancer Lett., 94, 199-205.

18. Bussing A., Schietzel M. (1999) Apoptosis-inducing properties of Viscum album L. extracts from different host trees, correlate with their content of toxic mistletoe lectins. Anticancer Res., 19, 23-28.

19. Bussing A., Suzart K., Bergmann J., Pfuller U., Schietzel M., Schweizer K. (1996) Induction of apoptosis in human lymphocytes treated with Viscum album L. is mediated by the mistletoe lectins. Cancer Lett 99, 59-72.

20. Cazacu M., Oniu Т., Lungoci C., Mihailov A., Cipak A., Klinger R., Weiss Т., Zarkovic N. (2003) The influence of Isorel on the advanced colorectal cancer. Cancer Biother. Radiopharm., 18, 27-34.

21. Chaddock J.A., Monzingo A.F., Robertus J.D., Lord J.M., Roberts L.M. (1996) Major structural differences between pokeweed antiviral protein and ricin A-chain do not account for their differing ribosome specificity. Eur. J. Biochem., 235,159-166.

22. Chan W.Y., Ng T.B. (2001) Comparison of the embryotoxic effects of saporin, agrostin (type 1 ribosome-inactivating proteins) and ricin (a type 2 ribosome-inactivating protein). Pharmacol. Toxicol., 88, 300-303.

23. Chaudhry В., MuIIer-Uri F., Cameron-Mills V., Gough S., Simpson D., Skriver K., Mundy J. (1994) The barley 60 kDa jasmonate-induced protein (JIP60) is a novel ribosome-inactivating protein. Plant J., 6, 815-824.

24. Chen J.K., Hung C.H., Liaw Y.C., Lin J.Y. (1997) Identification of amino acid residues of abrin-a A chain essential for catalysis and reassociation with abrin-a В chain by site-directed mutagenesis. Prot. Eng., 10, 827-833.

25. Current Protocols in Molecular Biology (1991) (Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. and Struhl K., eds), Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley & Sons.

26. Day P.J., Ernst S.R., Frankel A.E., Monzingo A.F., Pascal J.M., Molina-Svinth M.C., Robertus J.D. (1996) Structure and activity of an active site substitution of ricin A-chain. Biochemistry, 35,11098-11103.

27. Deresiewicz R.L., Calderwood S.B., Robertus J.D., Collier R.J. (1992) Mutations affecting the activity of the Shiga-like toxin I A-chain. Biochemistry, 31, 3272-3280.

28. Doser С., Doser M., Hulsen H., Mechelke F. (1989) Influence of carbohydrates on the cytotoxicity of an aqueous mistletoe drug and of purified mistletoe lectins tested on human T-leukemia cells. Arzneimittelforschung / Drug Res., 39, 647-651.

29. Eck J, Langer M, Mockel B, Baur A, Rothe M, Zinke H and Lentzen H (1999a) Cloning of the mistletoe lectin gene and characterization of the recombinant A-chain. Eur. J. Biochem., 264, 775-784.

30. Eck J., Langer M., Mockel В., Witthohn K., Zinke H., Lentzen H. (1999b) Characterization of recombinant and plant-derived mistletoe lectin and their B-chains. Eur. J. Biochem., 265, 788797.

31. Elsasser-Beile U., Ruhnau Т., Freudenberg N., Wetterauer U., Mengs U. (2001) Antitumoral effect of recombinant mistletoe lectin on chemically induced urinary bladder carcinogenesis in a rat model. Cancer, 91 (5), 998-1004.

32. Emini E., Hughes J.V., Perlow D.S., Boger J. (1985) Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J. Virol., 55, 836-839.

33. Endo Y., Tsurugi K. (1988) The RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. The characteristics of the enzymatic activity of ricin A-chain with ribosomes and with rRNA. J. Biol. Chem., 263, 8735-8739.

34. Endo Y., Tsurugi K., Franz H. (1988) The site of action of the A-chain of mistletoe lectin I on eukaryotic ribosimes. The RNA N-glycosydase activity of protein. FEBS Lett., 231, 378-380.

35. Eschenburg S., Krauspenhaar R., Mikhailov A., Stoeva S., Betzel C., Voelter W. (1998) Primary structure and molecular modeling of mistletoe lectin I from Viscum album. Biochem. Biophys. Res. Coramun,, 247, 367-372.

36. Ferrini J.B., Martin M., Taupiac M.P., Beaumelle B. (1995) Expression of functional ricin В chain using the baculovirus system. Eur. J. Biochem., 233, 772-777.

37. Frankel A., Welsh P., Richardson J., Robertus J.D. (1990) Role of arginine 180 and glutamic acid 177 of ricin toxin A-chain in enzymatic inactivation of ribosomes. Mol. Cell Biol., 10, 62576263.

38. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman R.J., Leppla S.H. (2003) Immunotoxin therapy of hematologic malignancies. Semin. Oncol., 30, 545-557.

39. Franz H. (1986) Mistletoe lectins and their A and В chains. Oncology, 43 (Suppl 1), 23-34.

40. Franz H. (1989) Viscaceae lectins. In: Advances in lectin research (Franz H., ed.), Berlin, VEB, Verlag volk und Gesundheit, 2, 28-59.

41. Franz H., Ziska P., Kindt A. (1981) Isolation and properties of three lectins from mistletoe (Viscum album L.). Biochem. J., 195, 481-484.

42. Frigerio L., Roberts L.M. (1998) The enemy within: ricin and plant cells. J. Exp. Bot., 49, 14731480.

43. Funatsu G., Islam M.R., Minami Y., Sung-Sil K., Kimura M. (1991) Conserved amino acid residues in ribosome-inactivating proteins from plants. Biochimie, 73, 1157-1161.

44. Gamier J., Osguthorpe D.J., Robson B. (1978) Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins. J. Mol. Biol., 120, 97-120.

45. Girbes Т., Ferreras J.M., Arias F.J., Stirpe F. (2004) Description, distribution, activity and phylogenetic relationship of ribosome-inactivating proteins in plants, fungi and bacteria. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 4,467-482.

46. Gray A.M., Flatt P.R. (1999) Insulin-secreting activity of the traditional antidiabetic plant Viscum album (mistletoe). J. Endocrinol., 160,409-414.

47. Hajto Т., Hostanska K., Fischer J., Sailer R. (1997) Immunomodulatory effects of Viscum album agglutinin-I on natural immunity. Anticancer Drugs, 8, S43-S46.

48. Hajto Т., Hostanska K., Gabius H.J. (1989) Modulatory potency of the beta-galactoside-specificlectin from mistletoe extract (Iscador) on the host defense system in vivo in rabbits and patients. Cancer Res., 49, 4803-4808.

49. Harley S.M. and Beevers H. (1982) Ricin inhibition of in vitro protein synthesis by plant ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5935-5938.

50. Hartley M.R., Lord J.M. (2004) Cytotoxic ribosome-inactivating lectins from plants. Biochim. Biophys. Acta, 1701,1-14.

51. Hatakeyama Т., Yamasaki N., Funatsu G. (1986) Identification of the tryptophan residue located at the low-affinity saccharide binding site of ricin D. J. Biochem. (Tokyo), 100, 781-788.

52. Hazes В., Read R.J. (1997) Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells. Biochemistry, 36, 11051-11054.

53. Heiny B.M., Albrecht V., Beuth J. (1998) Correlation of immune cell activities and beta-endorphin release in breast carcinoma patients treated with galactose-specific lectin standardized mistletoe extract. Anticancer Res., 18, 583-586.

54. Hincha D.K., Bakaltcheva I., Schmitt J.M. (1993) Calactose-specific lectins protect isolated thylakoids against freeze-thaw damage. Plant Physiol., 103, 59-65.

55. Hincha D.K., Pfuller U., Schmitt J.M., (1997) The concentration of cryoprotective lectins in mistletoe (Viscum album L.) leaves is correlated with leaf frost hardiness. Planta, 203, 140144.

56. Hopp T.P. and Woods K.R. (1981) Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78 (6), 3824-3828.

57. Hovde C.J., Calderwood S.B., Mekalanos J.J., Collier R.J. (1988) Evidence that glutamic acid 167 is an active-site residue of Shiga-like toxin I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,2568-2572.

58. Hudak K.A., Dinman J.D., Turner N.E. (1999) Pokeweed antiviral protein accesses ribosomes by binding to L3. J. Biol. Chem., 274, 3859-3864.

59. Hung C.H., Lee M.C., Chen J.K., Lin J.Y. (1994) Cloning and expression of three abrin A-chains and their mutants derived by site-specific mutagenesis in Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 219, 83-87.

60. Hutt N., Kopferschmitt-Kubler M.C., Cabalion J., Purohit A., Alt M., Pauli G. (2001) Anaphylactic reactions after therapeutic injection of mistletoe (Viscum album L.). Allergol. Immunopathol. (Madr.), 29 (5), 201-203.

61. Jameson B.A., Wolf H. (1988) The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput. Appl. Biosci., 4, 181-186.

62. Janssen O., Scheffler A., Kabelitz D. In vitro effects of mistletoe extracts and mistletoe lectins. Cytotoxicity towards tumor cells due to the induction of programmed cell death (apoptosis). Arzneimittelforschung / Drug Res., 43, 1221-1227.

63. Katzin B.J., Collins E.J., Robertus J.D. (1991) Structure of ricin A-chain at 2.5 A. Proteins, 10, 251-259.

64. Kim Y., Mlsna D., Monzingo A.F., Ready M.P., Frankel A., Robertus J.D. (1992) Structure of a ricin mutant showing rescue of activity by a noncatalytic residue. Biochemistry, 31, 32943296.

65. Kim Y., Robertus J.D. (1992) Analysis of several key active site residues of ricin A chain by mutagenesis and X-ray crystallography. Protein Eng., 5, 775-779.

66. Kourmanova A.G., Soudarkina O.J., Olsnes S., Kozlov J.V. (2004) Cloning and characterization of the genes encoding toxic lectins in mistletoe (Viscum album L.). Eur. J. Biochem., 271, 2350-2360.

67. Kovacs E., Hajto Т., Hostanska K. (1991) Improvement of DNA repair in lymphocytes of breast cancer patients treated with Viscum album extract (Iscador). Eur. J. Cancer, 27, 1672-1676.

68. Kumar M.A., Timm D.E., Neet K.E., Owen W.G., Peumans W.J., Rao A.G. (1993) Characterization of the lectin from the bulbs of Eranthis hyemalis (winter aconite) as an inhibitor of protein synthesis. J. Biol. Chem., 268, 25176-25183.

69. Marsden C.J., Fulop V., Day P.J., Lord J.M. (2004) The effect of mutations surrounding and within the active site on the catalytic activity of ricin A chain. Eur. J. Biochem., 271, 153-162.

70. McGaughy J., Everitt B.J., Robbins T.W., Sarter M. (2000) The role of cortical cholinergic afferent projections in cognition, impact of new selective immunotoxins. Behav. Brain. Res., 115,251-263.

71. Mengs U., Gothel D., Leng-Peschlow E. (2002) Mistletoe extracts standardized to mistletoe lectins in oncology, review on current status of preclinical research. Anticancer Res., 22, 1399-1407.

72. Moisenovich M., Tonevitsky A., Agapov I., Niwa H., Schewe H., Bereiter-Hahn J. (2002) Differences in endocytosis and intracellular sorting of ricin and viscumin in 3T3 cells. Eur. J. Cell Biol., 81,529-538.

73. Montfort W., Villafranca J.E., Monzingo A.F., Ernst S.R., Katzin В., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R., Robertus J.D. (1987) The three-dimensional structure of ricin at 2.8 A. J. Biol. Chem., 262, 5398-5403.

74. Monzingo A.F., Collins E.J., Ernst S.R., Irvin J.D., Robertus J.D. (1993) The 2.5 A structure of pokeweed antiviral protein. J. Mol. Biol., 233, 705-715.

75. Monzingo A.F., Robertus J.D. (1992) X-ray analysis of substrate analogs in the ricin A-chain active site. J. Mol. Biol., 227, 1136-1145.

76. Moon Y.H., Song S.K., Choi K.W., Lee J.S. (1997) Expression of a cDNA encoding Phytolacca insularis antiviral protein confers virus resistance on transgenic potato plants. Mol. Cells, 7, 807-815.

77. Munishkin A., Wool I.G. (1995) Systematic deletion analysis of ricin A-chain function. Single amino acid deletions. J. Biol. Chem., 270, 30581-30587.

78. Niwa H., Tonevitsky A.G., Agapov I.I., Saward S., Pfuller U., Palmer R.A. (2003) Crystal structure at 3 A of mistletoe lectin I, a dimeric type-II ribosome-inactivating protein, complexed with galactose. Eur. J. Biochem., 270, 2739-2749.

79. Noakes K.L., Teisserenc H.T., Lord J.M., Dunbar P.R., Cerundolo V., Roberts L.M. (1999) Exploiting retrograde transport of Shiga-like toxin 1 for the delivery of exogenous antigens into the MHC class I presentation pathway. FEBS Lett., 453, 95-99.

80. Ochoska J.R., Piotrowski A. (2002) Biologically active compounds from European mistletoe (Viscum album L.). Can. J. Plant Pathol., 24, 21-28.

81. O'Hare M., Roberts L.M., Thorpe P.E., Watson G.J., Prior В., Lord J.M. (1987) Expression of ricin A-chain in Escherichia coli. FEBS Lett., 216, 73-78.

82. Olsnes S., Refsnes K., Pihl A. (1974) Mechanism of action of the toxic lectins abrin and ricin. Nature, 249, 627-631.

83. Olsnes S., Sandvig K. (1988) How protein toxins enter and kill cells. Cancer Treat. Res., 37, 3973.

84. Olsnes S., Sandvig K., Eiklid K., Pihl A. (1978) Properties and action mechanism of the toxic lectin modeccin, interaction with cell lines resistant to modeccin, abrin, and ricin. J. Supramol. Struct., 9, 15-25.

85. Park C.H., Lee D.W., Kang K.H., Yoon T.J., Kim J.B., Do M.S., Song S.K. (2001) cDNA cloning and sequence analysis of the lectin genes of the Korean mistletoe (Viscum album coloratum). Mol. Cells, 12, 215-220.

86. Peumans W.J., Hao. Q., Van Damme E.J.M. (2001) Ribosome-inactivating proteins from plants: more than RNA N-glycosidases? FASEB J., 15,1493-1506.

87. Peumans W.J., Van Damme E.J.M. (1995) Lectins as Plant Defense Proteins. Plant Physiol., 109, 347-352.

88. Piatak M., Lane J. A., Laird W., Bjorn M.J., Wang A., Williams M. (1988) Expression of soluble and fully functional ricin A-chain in Escherichia coli is temperature-sensitive. J. Biol. Chem., 263, 4837-4843.

89. Pilon M., Schekman R., Romisch K. (1997) Sec61p mediates export of a misfolded secretory protein from the endoplasmic reticulum to the cytosol for degradation. EMBO J., 16, 45404548.

90. Pohl P., Antonenko Y.N., Evtodienko V.Y., Pohl E.E., Saparov S.M., Agapov 1.1., Tonevitsky A.G. (1998) Membrane fusion mediated by ricin and viscumin. Biochim. Biophys. Acta, 1371, 11-16.

91. Prestle J., Schonfelder M., Adam G., Mundry K.-W. (1992) Type 1 ribosome-inactivating proteins depurinate plant 25S rRNA without species specificity. Nuc. Acids Res., 20, 3179> 3182.

92. Ramalingam T.S., Das P.K., Podder S.K. (1994) Ricin-membrane interaction, membrane penetration depth by fluorescence quenching and resonance energy transfer. Biochemistry, 33, 12247-12254.

93. Rapak A., Falnes P.O., Olsnes S. (1997) Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 37833788.

94. Reiter Y. (2001) Recombinant immunotoxins in targeted cancer cell therapy. Adv. Cancer Res., 81,93-124.

95. Ribereau-Gayon G., Dumont S., Muller C., Jung M.L., Poindron P., Anton R. (1996) Mistletoe lectins I, II and III induce the production of cytokines by cultured human monocytes. Cancer Lett., 109,33-38.

96. Richardson P.T., Westby M., Roberts L.M., Gould J.H., Colman A., Lord J.M. (1989) Recombinant proricin binds galactose but does not depurinate 28 S ribosomal RNA. FEBS Lett., 255, 15-20.

97. Roberts L., Smith D. (2002) Targeted toxins. Drug delivery with poisons. The Biochemist, 2, 1820.

98. Roberts L.M., Lamb F.I., Pappin D.J., Lord J.M. (1985) The primary sequence of Ricinus v communis agglutinin. Comparison with ricin. J. Biol. Chem., 260, 15682-15686.

99. Roberts L.M., Tregear J.W., Lord J.M. (1988) Cytotoxic proteins in plants. In: Immunotoxins (Frankel A.E., ed.), Kluwer Academic Publishers, Boston-Dordrecht etc., 81-98.

100. Rutenber E., Robertus J.D. (1991) Structure of ricin B-chain at 2.5 A resolution. Proteins, 10, 260-269.

101. Sandvig K., Olsnes S. (1982) Entry of the toxic proteins abrin, modeccin, ricin, and diphtheria toxin into cells. I. Requirement for calcium. J. Biol. Chem., 257, 7495-7503.

102. Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. (1976) Kinetics of binding of the toxic lectins abrin and ricin to » surface receptors of human cells. J. Biol. Chem., 251, 3977-3984.

103. Sandvig K., van Deurs B. (2000) Entry of ricin and Shiga toxin into cells, molecular mechanisms and medical perspectives. EMBO J., 19, 5943-5950.

104. Sandvig K., van Deurs B. (2002) Transport of protein toxins into cells, pathways used by ricin, cholera toxin and Shiga toxin. FEBS Lett., 529, 49-54.

105. Sargiacomo M., Hughes R.C. (1982) Interaction of ricin-sensitive and ricin-resistant cell lines with other carbohydrate-binding toxins. FEBS Lett., 141, 14-18.

106. Schaller G., Urech K., Giannattasio M. (1996) Cytotoxicity of different viscotoxins and extracts k from the European subspecies of Viscum album L. Phytother. Res., 10, 473-477.

107. Schlossman D., Withers D., Welsh P., Alexander A., Robertus J., Frankel A. (1989) Role of glutamic acid 177 of the ricin toxin A chain in enzymatic inactivation of ribosomes. Mol. Cell Biol., 9, 5012-5021.

108. Schumacher U., Feldhaus S., Mengs U. (2000) Recombinant mistletoe lectin (rML) is successful in treating human ovarian cancer cells transplanted into severe combined immunodeficient (SCID) mice. Cancer Lett., 150 (2), 171-175.

109. Shaw P.C., Wong K.B., Chan D.S., Williams R.L. (2003) Structural basis for the interaction of E160A-E189A.-trichosanthin with adenine. Toxicon, 41, 575-581.

110. Simpson J.C., Roberts L.M., Romisch K., Davey J., Wolf D.H., Lord J.M. (1999) Ricin A-chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. FEBS Lett., 459, 80-84.

111. Soler H.M., Stoeva S., Schwamborn C., Wilhelm S., Stiefel Т., Voelter W. (1996) Complete amino acid sequence of the A-chain of mistletoe lectin I. FEBS Lett., 399, 153-157.

112. Sperti S., Montanaro L., Mattioli A., Testoni G. (1975) Relationship between elongation factor I* and elongation factor II- dependent guanosine triphosphatase activities of ribosomes. Inhibition of both activities by ricin. Biochem. J., 148, 447-451.

113. Stauder H., Kreuser E.D. (2002) Mistletoe Extracts Standardised in terms of Mistletoe Lectins (MLI) in Oncology, Current State of Clinical Research. Onkologie, 25, 374-380.

114. Stein G.M., Pfuller U., Berg P.A. (1999) Recognition of different antigens of mistletoe extracts by anti- mistletoe lectin antibodies. Cancer Lett., 135, 165-170.

115. Stirpe F. (2004) Ribosome-inactivating proteins. Toxicon, 44, 371-383.

116. Stirpe F., Barbieri L., Abbondanza A., Falasca A.I., Brown A.N., Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. (1985) Properties of volkensin, a toxic lectin from Adenia volkensii. J. Biol. Chem., 260, 14589-14595.

117. Stirpe F., Barbieri L., Battelli M.G., SoriaM., Lappi D.A. (1992) Ribosome-inactivating proteins from plants, present status and future prospects. Biotechnology (NY), 10,405-412.

118. Stirpe F., Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. (1982) Action of viscumin, a toxic lectin from mistletoe, on cells in culture. J. Biol. Chem., 257,13271-13277.

119. Sweeney E.C., Palmer R.A., Pfuller U. (1993) Crystallization of the ribosome inactivating protein MLI from Viscum album (mistletoe) complexed with beta-D-galactose. J. Mol. Biol., 234, 1279-1281.

120. Sweeney E.C., Tonevitsky A.G., Palmer R.A., Niwa H., Pfueller U., Eck J., Lentzen H., Agapovr11., Kirpichnikov M.P. (1998) Mistletoe lectin I forms a double trefoil structure. FEBS Lett., v 431,367-370.

121. Tahirov Т.Н., Lu Т.Н., Liaw Y.C., Chen Y.L., Lin J.Y. (1995) Crystal structure of abrin-a at 2.14 A. J. Mol. Biol., 250, 354-367.

122. Taylor В.E., Irvin J.D. (1990) Depurination of plant ribosomes by poke weed antiviral protein. FEBS Lett., 273, 144-146.

123. Thepen Т., van Vuuren A.J., Kiekens R.C., Damen C.A., Vooijs W.C., van De Winkel J.G. (2000) Resolution of cutaneous inflammation after local elimination of macrophages. Nat. Biotechnol., 18, 48-51.

124. Tonevitsky A, Agapov I, Chelnokova O, Moisenovich M and Marx U (2002) Comparison between the mechanisms of action of plant toxins ricin and viscumin on the stage of intracellular dissociation. Arzneimittelforschung / Drug Res., 52, 500-505.

125. Tonevitsky A.G., Agapov I.I., Shamshiev A.T., Temyakov D.E., Pohl P., Kirpichnikov M.P. (1996) Imimmotoxins containing A-chain of mistletoe lectin I are more active than immunotoxins with ricin A-chain, FEBS Lett., 392 (2), 166-168.

126. Tregear J.W., Roberts L.M. (1992) The lectin gene family of Ricinus communis, cloning of a functional ricin gene and three lectin pseudogenes. Plant Mol. Biol., 18, 515-525.

127. Turner N.E., Hwang D.J., Bonness M. (1997) C-terminal deletion mutant of poke weed antiviral protein inhibits viral infection but does not depurinate host ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 3866-3871.

128. Valentiner U., Pfuller U., Baum C., Schumacher U. (2002) The cytotoxic effect of mistletoe lectins I, II and III on sensitive and multidrug resistant human colon cancer cell lines in vitro. Toxicology, 171, 187-199.

129. Van Damme E.J., Roy S., Barre A., Rouge P., Van Leuven F., Peumans W.J. (1997) The major f elderberry (Sambucus nigra) fruit protein is a lectin derived from a truncated type 2 ribosomeinactivating protein. Plant J., 12, 1251-1260.

130. Van Deurs В., Sandvig K., Petersen O.W., Olsnes S., Simons K., Griffiths G. (1988) Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-Golgi network. J. Cell. Biol., 106, 253-267.

131. Analysis of the in planta antiviral activity of elderberry ribosome-inactivating proteins. Eur. J. 4 Biochem., 271, 1508-1515.

132. Vater C.A., Bartle L.M., Leszyk J.D., Lambert J.M., Goldmacher V.S. (1995) Ricin A-chain can be chemically cross-linked to the mammalian ribosomal proteins L9 and LlOe. J. Biol. Chem., 270, 12933-12940.

133. Villafranca J.E., Robertus J.D. (1981) Ricin B-chain is a product of gene duplication. J. Biol. Chem., 256, 554-556.

134. Wacker R., Stoeva S., Pfueller K., Pfueller U., Voelter W. (2004) Complete determination of the A-chain of mistletoe lectin III from Viscum album L. ssp. album. J. Peptide Sci., 10, 138-148.

135. Wang P., Zoubenko O., Turner N.E. (1998) Reduced toxicity and broad spectrum resistance torviral and fungal infection in transgenic plants expressing pokeweed antiviral protein II. Plant, i Mol. Biol., 38, 957-964.

136. Wright H.T., Robertus J.D. (1987) The intersubunit disulfide bridge of ricin is essential for cytotoxicity. Arch. Biochem. Biophys., 256, 280-284.

137. Wu A.M., Chin L.K., Franz H., Pfueller U., Herp A. (1992) Carbohydrate specificity of the receptor sites of mistletoe toxic lectin-I. Biochim. Biophys. Acta, 1117, 232-234.

138. Wu A.M., Wu J.H., Herp A., Chow L.P., Lin J.Y. (2001) Carbohydrate specificity of a toxic lectin, abrin A, from the seeds of Abrus precatorius (jequirity bean). Life Sci., 69(17), 20272038.

139. Xiong J.P., Xia Z.X., Wang Y. (1994) Crystal structure of trichosanthin-NADPH complex at 1.7

140. A resolution reveals active-site architecture. Nat. Struct. Biol., 1, 695-700.

141. Yamasaki C., Nishikawa K., Zeng X.T., Katayama Y., Natori Y., Komatsu N., Oda Т., Natori Y. (2004) Induction of cytokines by toxins that have an identical RNA N-glycosidase activity: Shiga toxin, ricin, andmodeccin. Biochim. Biophys. Acta, 1671, 44-50.

142. Yamasaki S., Furutani M., Ito K., Igarashi K., Nishibuchi M., Takeda Y. (1991) Importance of arginine at position 170 of the A-subunit of Vero toxin 1 produced by enterohemorrhagic Escherichia coli for toxin activity. Microb. Pathog., 11, 1-9.

143. Zarkovic N., Vukovic Т., Loncaric I., Miletic M., Zarkovic K., Borovic S., Cipak A., Sabolovicf S., Konitzer M., Mang S. (2001) An overview on anticancer activities of the Viscum albumextract Isorel. Cancer Biother. Radiopharm., 16(1), 55-62.

144. Zimmermann R., Pfueller U. (1998) Glycosylation pattern of mistletoe lectins. In: COST 98

145. Effect of antinutrients on the nutritional value of legume diets" (Bardocz S., Pfueller U. and Pustzai A., eds), European communities, Brussels, 5, 55-62.

146. Ziska P., Franz H. (1981) Studies on the interaction of the mistletoe lectin I with carbohydrates. Experienta, 37, 219.

147. Zoubenko O., Hudak K., Turner N.E. (2000) A non-toxic pokeweed antiviral protein mutant inhibits pathogen infection via a novel salicylic acid-independent pathway. Plant Mol. Biol., 44, 219-229.

148. Zoubenko O., Uckun F., Hur Y., Chet I., Turner N. (1997) Plant resistance to fungal infection induced by nontoxic pokeweed antiviral protein mutants. Nat. Biotechnol., 15,992-996.r1. Благодарности

149. Автор признателен сотрудникам ФГУП «ГосНИИгенетика» к.б.н. Лобанову Андрею Олеговичу и к.б.н. Сидоруку Константину Васильевичу за дельные советы в вопросах амплификации ПЦР-фрагментов ДНК и молекулярного клонирования.

Информация о работе

Певзнер, Ирина Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Рибосом-инактивирующие белки II типа из омелы: клонирование, экспрессия и структурно-функциональные свойства - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы