Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Токсические лектины омелы (Viscum album L.): клонирование и характеристика
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Токсические лектины омелы (Viscum album L.): клонирование и характеристика"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА
На правах рукописи
Сударкина Ольга Юрьевна
ТОКСИЧЕСКИЕ ЛЕКТИНЫ ОМЕЛЫ (VISCUMALBUM L.): КЛОНИРОВАНИЕ И
ХАРАКТЕРИСТИКА
специальность 03.00.03 - молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2007
003066221
Работа выполнена в лаборатории белковых ингибиторов клеточных процессов Института молекулярной биологии имени В А Энгельгардга РАН
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Козлов Ю.В.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
профессор
Рубцов П.М.
Институт молекулярной биологии имени В А Энгельгардта РАН
кандидат биологических наук
Эльдаров М.А.
Центр " Биоинженерия " РАН
Ведущая организация:
Институт биологии гена РАН
Защита диссертации состоится
« » ОкУлГ^Х. 2007г в ¿7
на заседании Диссертационного совета Д 002 235 01
при Институте молекулярной биологии имени В А Энгельгардта РАН
по адресу 119991, ГСП-1, г Москва, ул.Вавилова д 32
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В А Энгельгардта РАН
Автореферат разослан «_
2007 г
Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат химических наук
Актуальность темы. Токсические лектиы омелы (Viscum album L) относятся к семейству инактивирующих рибосомы белков 2 типа (РИБ 2), в которых энзиматическая А-цепь соединена дисульфидной связью с лектиновой В-цепью [Hartley MR et al, 2004] А-цепь - специфическая РНК N-гликозидаза, которая гидролитически выщепляет остаток аденина из высоко консервативной области 28 S рРНК Модифицированная таким образом рибосома не способна связывать факторы элонгации, что ведет к остановке трансляции и, в конечном счете, гибели клетки В-цепь связывается с олигосахаридами гликопротеинов и гликолипидов клеточной поверхности, содержащих концевые остатки галактозы, обеспечивая эндоцитоз токсина К этому семейству относятся также рицин клещевины {Ricinus communis L ) И шига токсин, продуцируемый бактерией Shigella dysenteriae
Изучение цитотоксического действия РИБ 2 связано с исследованиями клеточных механизмов ретроградного транспорта белков и липидов от плазматической мембраны в эндоплазматический ретикулум, механизмов риботоксического стресса и апоптоза В этих исследованиях РИБ 2 оказываются удобным инструментом Исключительная токсичность для клеток человека обусловливает применение РИБ 2 для создания цитотоксических препаратов направленного действия, таких как иммунотоксины Было показано, что токсины этого способны доставлять сшитые с ними чужеродные белки и пептиды в цитоплазму клеток, что делает возможным использование их для доставки различных антигенов в клетки для процессинга и презентации, связанной с молекулами I класса главного комплекса гастосовместимости и индукции протективного клеточного иммунитета при вирусных инфекциях и онкологических заболеваниях [Smith DC et al, 2002]
В настоящее время экстракты омелы белой (Viscum album) широко используются в Европе для общей иммуностимуляции при онкологических заболеваниях [Bocci V et al, 1993] Три токсических лектина MLI, MLII и MLIII, различающиеся по углеводной специфичности и цитотоксичности [Franz Н et al, 1981], являющиеся действующим началом этих экстрактов, в малых дозах стимулируют иммунную систему к продукции цитокинов, таких как интерлейкины-1 и 6, интерферон-у и фактор некроза опухоли а, индуцируют цитотоксическую активность Т-лимфоцитов и естественных киллеров, усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов При этом ряд эффектов, оказываемых лектинами омелы на иммунную систему, могут вызывать их изолированные B-цепи Иммуностимулирующее действие может увеличивать эффективность цитотоксических и вакцинных
препаратов на основе лектинов омелы Получение рекомбинантных лектинов может быть полезно как для их практического применения, так и для структурно-функциональных исследований внутриклеточного транспорта белков До недавнего времени была известна только первичная структура количественно преобладающего в растении лекгина MLI
Целью данной работы было клонирование генов токсичеких лектинов омелы и характеристика функциональных свойств их каталитических и лектиновых субъединиц В ходе работы были поставлены следующие задачи
1) определить структуру концевых областей мРНК токсических лектинов омелы путем амплификации концов кДНК,
2) методом ПЦР с праймерами, комплементарными к нетранслируемым областям мРНК получить фрагменты геномной ДНК, кодирующие токсичекие лектины омелы и определить их структуру,
3) экспрессировать в клетках Е coli A-цепи токсических лектинов омелы и определить их каталитическую активность в бесклеточной системе трансляции белка,
4) экспрессировать в клетках Е coli B-цепи токсических лектинов омелы и определить их углеводсвязывающие свойства
Научная новизна и практическая ценность работы. Клонированы три варианта генов токсических лектинов омелы, один из которых кодурует MLI Структура гена MLI к началу работы не была известна Второй вариант генов кодирует MLIII, аминокислотная последовательность которого была недавно определена, и третий вариант, предположительно, соответствует MLII, данных о структуре которого в литературе пока нет Впервые получены оценки размера семейства генов токсических лектинов и генома омелы Получены энзиматически активные рекомбинантные А-цепи, которые могут быть использованы для разработки цитотоксических препаратов направленного действия Полученные рекомбинантные В-цепи, кодируемые тремя вариантами генов, обладают сниженным сродством к моносахарам галактозе и N-ацетилгалакгозамину, но связываются со сложными олигосахридами асиалофетуина и могут обладать той же биологической активностью, что и природные В-цепи
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, Россия, 2000), на международной конференции "Current Problems of Molecular Genetics and Cell
Biology" (Москва, Россия, 2000), на международной европейской конференции "ЕТОХ 11" (Прага, Чехия, 2003) и в трех печатных работах
Объем диссертации. Материал диссертации изложен на страницах
машинописного текста и содержит 14 рисунков и 2 таблицы Список цитированной литературы включает 210 источников
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение геномной ДНК и мРНК из растения Viscum album L., синтез кДНК.
Геномную ДНК выделяли из листьев омелы белой согласно Murray M G и Thompson WF (1980) Тотальную РНК выделяли из молодых листьев с помощью метода экстракции гуанидингидрохлоридом [Logemann J et al, 1987], полиаденилированную РНК выделяли с помощью парамагнитных олиго-((1Т)-частиц фирмы "Promega". кДНК синтезировали с помощью набора "Universal Riboclone cDNA Synthesis Kit" (Promega), олиго-(сГГ) использовали для затравки первой цепи
Клонирование кодирующих участков генов токсических лектинов омелы и концов кДНК. С парой вырожденных праймеров, составленных на основе аминокислотной последовательности A-цепи MLI [Soler M H et al, 1996] на матрице геномной ДНК омелы был амплифицирован фрагмент, кодирующий часть A-цепи. Со специфическим праймером, комплементарным к полученному фрагменту А-цели и третьим вырожденным праймером, составленным на основе аминокислотной последовательности В-цепи [Soler M H et al, 1998], был амплифицирован перекрывающийся фрагмент, кодирующий линкер и большую часть В-цепи С помощью односайтовой ПЦР [Lin Z et al, 1995] был амплифицирован сильно перекрывающийся, но отличающийся по последовательности, фрагмент гена токсического лекгина омелы длиной 1066 пар оснований (по) Лектины, кодируемые полученными фрагментами отличались от MLI На основе последовательностей фрагментов были составлены праймеры для амплификации концов кДНК [Frohman MA et al, 1988] Были получены несколько вариантов последовательностей 5' и 3'-концевых областей кДНК и составлены соответственно несколько вариантов праймеров, комплементарных к нетранслируемым областям мРНК На матрице геномной ДНК и кДНК были амплифицированы полные кодирующие участки трех вариантов генов токсических лектинов омелы, один из которых кодировал MLI Дчя
клонирования фрагментов геномной ДНК и кДНК использовали векторы pGEM7zf(+) и pGEM3zf(+) фирмы "Promega" и клетки Е coli DH10 фирмы "Gibco BRL"
Оценка размера семейства генов токсических лектинов омелы и генома омелы. С парой праймеров, универсальных для всех полученных вариантов генов токсических лектинов омелы был амплифицирован фрагмент геномной ДНК длиной около 400 по и определено количественное соотношение специфичных для трех вариантов генов продуктов расщепления полученного фрагмента рестриктазами Sal I и Pst I С этой же парой универсальных праймеров с помощью количественной ПЦР [Diviacco S. et al, 1992] было определено количество геномной ДНК, содержащее одну копию гена токсического лектина омелы На основе количественного соотношения трех вариантов генов в геномной ДНК, а также числа гибридизующихся фрагментов при Саузерн-блот анализе продуктов расщепления геномной ДНК различными рестриктазами была получена оценка размера семейства генов токсических лектинов омелы
Получение рекомбинантных субьединиц токсических лектинов омелы и оценка их функциональной активности. Участки генов, кодирующие A-цепи, были клонированы в экспрессионный вектор рЕТ28Ь(+) фирмы "Novagen" и экспрессированы в клетках Е coli BL21(DE3)pLysS (Novagen) Для периплазматической экспрессии B-цепей были использованы вектор рЕТ22Ь(+) и клетки Tuner(DE3) той же фирмы Рекомбинантные белки содержали поли-His последовательности на N-конце (A-цепи) или на С-конце (B-цепи) и были очищены с помощью металл-аффинной хроматографии с использованием набора HisTrap Kit фирмы "Amersham Biosciences"
Каталитическую активность A-цепей оценивали по способности ингибировать биосинтез белка в бесклеточной системе кроличьего ретикулоцитарного лизата (Promega) Количество синтезированного в системе белка определяли по включению [3Н]-лейцина во фракцию, преципитируемую трихлоруксусной кислотой
Лектиновую активность рекомбинантных B-цепей оценивали по связыванию с иммобилгоированным асиалофетуином, ингибируемому в присутствии простых Сахаров галактозы (gal) и N-ацетилгалактозамина (galNAc)
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Клонирование генов и анализ аминокислотной последовательности токсических лектинов омелы. С праймерами, комплементарными к
нетранслируемым областям мРНК, на матрице геномной ДНК и кДНК были амгогафицированы и затем клонированы фрагменты длиной около 2 тпн Частичное секвенирование более 40 клонов позволило выделить три варианта последовательностей генов и, соответственно, три группы клонов Один геномный и один кДНК клон из каждой группы был взят для полного секвенирования Структура еще одного геномного клона (ш131р), содержащего замену консервативного аминокислотного остатка в области активного центра А-цепи, также была определена Так как белки, кодируемые геномными (mllp, ml2p, ml3p и ml3 1р) и кДНК клонами (cmllp, cm!2p и cml3p) были идентичны на 96-97 % и имели общие структурные особенности, то для дальнейшего анализа функциональных свойств кодируемых белков были взяты только геномные клоны Различия в последовательности лектанов, кодируемых геномными клонами воспроизводились в клонах, полученных на кДНК и содержащих часть кодируемых последовательностей генов, в частности полученных при амплификации фрагментов, кодирующих В-цепи с использованием праймеров комплементарных З'-нетранслируемым областям кДНК и последовательности, кодирующей А-цепь Таким образом, эти различия не мо1ут быть обусловлены ошибками ПЦР
Как и в случае других растительных РИБ 2 типа, гены токсических лектинов омелы, обозначенные mllp, т12р, т!3р и ml3 1р, не содержат интронов и кодируют единый полипептидный предшественник (рис 1) Предшественники MLlp, ML2p и ML3p состоят из 564, 569 и 567 аминокислотных остатков (ао), соответственно Границы А-и В-цепей в последовательности предшественников определяли по гомологии с А- и В-цепью MLI В состав предшественников начиная с N-конца входят сигнальный пептид транспорта в эндоллазматический ретикулум из 33 ао, А-цепь из 254 ао, соединенная линкером из 14 ао (MLlp и ML3p) или 19 ао (ML2p) с В-цепью, включающей 263 (MLlp и ML2p) или 266 (ML3p) ао Параллельно с нашей работой, кодирующая последовательность гена MLI была клонирована, соответствующий ген и кодируемый белок были обозначены rML [Eck J et al, 1999] Предшественник MLlp отличается от предшественника rML по 16 ао, 8 из которых находятся в сигнальном пептиде и линкере
MLI, в отличие от MLII и MLIII, в растворе обратимо димеризуется Рентгеноструктурный анализ кристаллов MLI показал, что N-концевой домен В-цепи образует нековалентные связи в димере MLI [Sweeney ЕС et al, 1998] Gin 34 и Serlll, формирующие водородные связи в димере, Ilel 14, образующий гидрофобное
взаимодействие, и отсутствие дисульфидной связи в 1а субдомене В-цепи, необходимое для образования связей в димсрс, характерны только для \iLlp, Таким образом, МЕЛр соответствует МЫ. Если предшественник МИр идентичен
ситатиив а-цепь линкер домен I В-нет. домен 2
НСПТИД ,____- 'Ч—- . - -_
т -- .v .... jg ^Mgg -1-- гв-"1--ау Л
ВСНННК -J,— _ ——
РИБ 2 гташозо-связывающий голвктоэо-связываюирл й
сайт / сайт 2
MLlp
|sxs! Fjifei 'Kfcfi
U 2 62 96 Г36
М12р НШ^^Шт^
Шп wm jyvsj
96 136 240
ML3p и ___г*-*г r*-^ r*~si_
Mu.jp 'Zi: — --.- — L. . r —il. " , i
Ш iNs^ jjffetj ¡Sagg
112 62 139 243
m - пегггидные фрагменты, - внутри- н межцелочечные
вырезаемые во время созревания дисулъфидтп+ге связи
предшеетветенка г^-дисульфид®*^
LL==J - ПС1Г1 ядные ц&ш в .VI : : р
Ш), - [lurCHifiiiini.MuKL-aiit 35s - потенциальные сайты
М-кцикошпиртвания, N-тлнииилировашш (NXS/T).
йтсуияиукщий в ML3.1p обозначена позиция Asn в
Л- ЙИИ iS-iytftN
Рис. I. Структура предшественника РИБ 2 типа и зрелых лекпшов, кодируемых генами mlp. Сигнальный пептид и линкер удаляются при созревании предшественника. А- и R-Цепи в зрелом лехтнне соединены дисульфидиой связью, В-цепь состоит из двух Гомологичных доменов, каждый из которых, в свою очередь, состоят из трех гомологичных субдоменов а. р и -у размером примерно 40 аминокислотных остатков я линкерного субдомена А. Субдомены а к [> (за исключением 1а к MLlp и Ip в ML3.1p) содержат дисулъфидпые связи.
предшественнику rML на 98% и сходен (с учетом гомологичных ао) да 99%, то ML2p, ML3p и ML3.1p идентичны (сходны) на 88 (91%), 78 (87%) и 77 (86%), соответственно.
Токсические лектины омелы обладают Значительной гомологией аминокислотной последовательности с рицином - наиболее изученным РИБ 2 типа. Его кристаллическая структура была определена и детально описана [Robertus J.D. et а/,, 20041. Механизм каталитического действия рицина, лектиновые свойства, взаимодействие с клетками млекопитающих и биосинтез а растении в значительной степени изучены [Roberts L.M. et а!.. 2004].
А-цени токсических лектинов омелы идентичны (сходны) с А-цспью рицина па 40 (54-57%). Инвариантные для растительных РИБ ао, формирующие активный пентр А-цепн, сохраняются в А-цепях MLp: Туг 17. Arg25, Туг76, Тут 1!5, Glul65, Argi68.
Тгр199 соответствуют Tyr21, Arg29, Туг80, Туг 123, Glul77, Argl80, Trp211 A-цепи рицина (рис 2) Еще один высококонсервативный ао А1а166, гомологичный А1а178 A-цепи рицина, заменен на Val в A-цепи ML3 1р, что позволило предположить, что ее каталитическая активность может отличаться от других вариантов A-цепей Как и в A-цепи рицина, в С-концевой области A-цепей токсических лектинов омелы расположена гидрофобная последовательность (236 - 246 ао), участвующая в процессе транслокации A-цепи из эндоплазматического ретикулума в цитозоль [Simpson J С et al, 1995] Как и для A-цепи рицина для A-цепей MLp характерно очень низкое содержание Lys (ML3p содержит один остаток Lysll, остальные варианты A-цепей не содержат Lys), что позволяет A-цепи избегать протеолитической деградации на протеосомах клеток, используя механизмы контроля качества новосинтезированных белков в эндоплазматическом ретикулуме для транслокации в цитоплазму [Deeks ED et al, 2001]
В-цепь рицина содержит два гомологичных глобулярных домена Каждый домен состоит в свою очередь из трех гомологичных субдоменов а, (3 и у, размером примерно по 40 ао, и линкерного субдомена X (рис 1) Линкерный субдомен N-концевого домена IX образует дисульфидную связь с A-цепью, гомологичный ему субдомен 2Х связывает второй домен с первым Такая повторяющаяся структура В-цепи возникла, предположительно, в результате серии дупликаций гена древнего галактозосвязывающего пептида длиной около 40 аминокислотных остатков, содержащего дисульфидную связь, сохранившуюся в субдоменах а и р В связывании галактозы участвуют только субдомены 1а и 2у
В-цепи MLlp, ML2p и ML3p идентичны (сходны) с В-цепью рицина на 64 (75%), 65 (77%) и 55 (70%), соответственно Аминокислотные остатки, формирующие галактозосвязывающие сайты В-цепи рицина - Asp22, Gln35, Trp37, Asn46 и Gln47 в la субдомене и Asp234, Ile246, Tyr248, Asn255 и Gln256 в 2у субдомене - в основном сохраняются в В-цепях токсических лектинов омелы Исключение составляют замена Тгр38 (Тгр37 в В-цепи рицина) на Ser в В-цепи ML2p и замена Туг252 (Туг248 в В-цепи рицина) на Phe в В-цепи ML3p, которые могут быть связаны с известными различиями в углеводной специфичности MLI, MLII и MLIII Высококонсервативные ао, формирующие гидрофобное ядро доменов В-цепи рицина сохраняются в В-цепях токсических лектинов омелы, что отражает сходство третичной структуры РИБ 2 типа
г1сП гМ, МЫр
иъгр
МЬЗр МЬЗ.1р
ri.cc> г№
НЪ1р МЛр
мьзр ми. 1р
гКЬ
мыр мьгр мьзр мьз.1р
г!сЕ гИЬ МЫр КЬ2р
мьзр иьз.1р
г1с£> гМЬ МЫр МЬ2р
мьзр ХЬЗЛр
г!сВ гмь
МЫр
ньгр МЬЗр мьз,1р
г 1с и гМЬ
Кйр
МЬЗр
мьзр мьз.1р
ri.cE> гМЬ
мыр к,2р мьзр мх,з.1р
Г"1СГ
гго, МЫр МЬ2р мьЗр МЬЗ.
сигнальный пдггтид пр<?пет"ид 1 А-цсрт. г1 зэ
МК Р55И ТIV ГИМУАУА?Н1СГБ ГГЬЕОИДЙгРКОУ Р ' 1|М7Т|ТАЗ АТЧфЗЕТ НИ ЯАУВЗ1
миаумозкиш. . .дзсгшьеьурштукйкткгжЕкьньк'УТнщттй.. .ОЕЙГКПТЫЖУ МНАйЬА-зиак,. .-.МУЕЬ-МЬСЬУРЗ АТУКАВ ТКРЗКЕИ.Р:Г_ВУТногтя,. .ЕЗ^еегтььйэу
юшиавэйди ... шсремувьусс м-АИдрзк I иузжг зькутштк»,... ёгигаи т I Шсгсг ШАЯЬАзгйЬй.. .. ОЕ^РКПТИЙот
31 27
И
п
27 27
ЬТТЙАПУТЩЕХРУЪ. Р^руеьртковетьуеьзниаеьзутьаьеутка^РА'СУКЛСНЗАУРЗНРЕ
УЕ 1в£ .г5КП1РЬЬЕаЕ 1ТАА1 ОУТМЬ§УУАУ0ААС.С!3 УУЬН.Б
УЗИБВ. РЗХЩ1РЬЬКСЗТ1РУЗОАОКгЛ'Ь'1ГЕЬ2№еСОЕ1ТАА1РУ,гаЬ^Л/АУОАА5(ЭЗ^¥ЬЯ.В 123
НСЕНАЕ ахтнг, ртйадШтрАЕ^е^ойЬЕйЬАекьие ы I бызнерьее га вма^ЛЗ^теетса р АРЗСАЕ. ,тньрт0т,ткзаьррр5Щ?вьЕМАок.мхззрьс1гаысзутА:лр...росзт»
рЕ1ЕР.УАЗН .шоIРЬС*одыОЗУГАЬЕР .. .РСБЗТК
)ЕЕ5УАан.коР1РьсяЕ?ьькзузА1,Н1:.. .рссзта пЬЕкташ. ¡шадрЬБЮРъькз^ЗАьнУ.. .розвтя 211
¡гнришанеудееАй рь РПУ^мьеьетзкознтоуснз Т ИЗУЕ™
(ГКРИЯ РАЕОУIНБСАБ ЕЬРОНУМЬЕЬЕТгйОООЗта'/рОЕТСОУГНН
1= N Е ХЕИВУК^ МЬЕЬЕ тзкзшвтцу^^тдадада
ргайьМнАдд у:: ¡ТЯБУЗ ЕЬ е СУУМЬЕ ЬЕ ТЗЙЕВДЗ ТОУЙОЗТШУЕВД ь'лтудаз у I жбузрь р к/ умьеьетзЯотйз тциооз т Ей I еш
о А-цепь Еинкер 1 0 В-депь
ртоьомйг^ЕЗ'геоУ51ы?11ймутсярррззо. .. Т^еьынруури.. .Е^АРУСМОРЕ
АРКЗАЕ . . ТЯЬРТБТ , ГВбЗЬРГЩ ШЙАЕ. .№Ъ£"ТЕТ,ТВ.331,.РЕТЗЗ!
арнсае .. (шьртйт . тйвзьреЩ ареоае.
ТГ:Акзр11С1О;1
Т0АЕ31ЫЫ0М1 ТОДНЭШАУбМ! А(ЗАКЗТТ1Ы(Ж1 АйДЗЗ 111-ЛОМТЕ АдЛЗдшут2М1з!
р I еьй I р рсиуут ьт ^ уаоут ав цц ш г уссев рэ в Эг уй ти ? ь ути? у I.....а
РIРЬА1 др енГУТЬТ1аЛ' I АЗ ЬА1М Ь ЗУ СцЕ Р Р Э 3 ЕР УКУ КР1У7 Р РУI.....я
; УВУ ярь VI и РУГ.,ЕЫЗ з А^1
иОТТСЗАЭЕ ИЗУТСЗАЗЕ ОЭУТСТАЗЕ РРУТСТТЗЕ РОУГСТТЗЕ
Р ЕЯ Ь А13 Т И] Е'УТЬЗ К УР П У1АЗЬА1ИЬЕУС ЙШРЗЕ.
Р Г К Ь 31Э ТбЫ ЕУГ ьзкта О VIР ЗЫТКУРУСЙБКЗ Э 3 ^>УЩДОЕУ1 К РУН.....V
Р1 мс I в тек рут I. зя уйру I р&ь^куруз кцкззз вруны и рт , у 1 ир уи.....у
ЗнП % . а ~
р I ур гусвиеьсунтемкрниеи а I ньврск зктеа|®ьи1|ькйомт1 намеке Ытусузроуу ртуя I Убймсмс^жоБ оЕкиека! з кзтшрНьмтцаш<5т и ^Щс I ттуеу тасту РТУЙ I УЙККЙМС уЩукосцрн тскыйшрзкзшорщьйтгтаойтт ^кЩс етт ус-У т асуу рт Ш1 ужсоьсувтеиш рн я аир I ^|?скзм т о рЩькт гнзмшуигтувггАб ту рт^е! узвдшс ьНу к □зиукЕззк:&ь|?скзызЕ I® ьии амедсь ттусутасзу
? туй гУа ки схсьйур.ой с>у н ссйр.! З^нр ск 5 к Б врй® ьм т I нк ост 1 н вк с?, гъ Т т I с тлдд у
V • ----■ » • V
ун хурсит аатодтиио! ишета 1к ркэ ЬААТБеизет ■.. т ь тур тк г у дув сеиь? ^йЩ ЧЖТЕСФ ТДУЙВАТЬМО! и^ыед; Дравньуцае ВБ ткет.,. тьтуотьрутъ6ССИЬА^Щ ум1РРСктАУРЕАТ1№:у.,^ат]ынркз1ЛУ^ААЗБ51КбТ.. .тьтустьсутьеаз«ьле|тл)
\.-М1ГЗСМТАУКЕАТТ,;№1К(^Яд11МРКЗ!Л.\С,СААЗЗЗЗОТ, . . ТЬТ'уртрУУЗЬв03ишдиэт! I МНУ ЮШАСИ сьттнотРЕкеыЕКРйзкмУХйТРзззкБтксп'гтг.стьпоЕЬйо 5ИЬА£|ЫР:! I КМУЕСЫ КАСИО ьттбйдкена 11 гериз^ку
* » »•
О? гутт гу еьу еьсьс Акзеоуи I ЕОСЙ зёкаеооиаь тасгз I ьтз ивк ГЯЕТУУК
А ?ЙЕ УТI УарйЭЬСМЕ ЕЗЗ'Л';татС УЕ ЗСККОКИАЪУ СССВ11<РК0П0С0С1ТССК05УЗТУ1М
АРЕЕУТГгеРИ)ЬСйЕВ ззоо№анАьусссззкРКско1х;с1,тсскг)зузтУ1^
АРКЕ^УТIТСЕМЗЬСНЕАК 3 АЗУЛУЕТ ССЗеТЕКдНИАЬУеОС31КРКОКЙХЗСЕТСОЗСЗУАТУ1Н АРКЕУТ! Уф^ЙЭЬСМЕ т ЭЗЗВ У№УЕ 3 С УЭ 3 КРМРРУ^АЬУйРС ЭI Е.Е К? ^ОС^ЕЪТ ЗдСОЗУКЗУГН арйеу т I у б сузз^лэкиаьуйВДз 1№< Р Уогюсьт зосвзунетлн
—} • * а г1® •
1Ь5С5РАЗЗе0РКМЕККЕ5Т1Ь«ЬУ351,У7.|УКАЗЗРЗЬК21Е1^РЕНСЕРЩ1МЬР11Е 262
IVSCSkC,SSGQRt^lШвAILNLШGlЛM§/ЛQAflPKLSJ^l^I$P^G:<M¿mLFVP Р. 63
гуйсзасззс2№У^МЕЗА1ЬНЬКНСЬАМ^УА2АН?;<1.ЗВ11;|РАТЕ?;РЖМ-1';ЬРУР 263
Iу$сзлеззаокиуртииёт Ь'/ЩУАОАДрфдк!ш:1длтбыр11м№рV? 263
ьебстаезрр.оки'л'тгшстииькыбха^ктоезнра1Д01й.|Дзу5ш^1дииьрур гчь
эй М 91
да.
31 91
16: 151 15< 151 15' 15'
22: 21' 211 21' 21' 21'
8 3 9 9 9 9
14 75 75 75
73 75
13' 13! 131
131 14 14
20:
20' го-го-
2С" 30'
Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей предшественников рицина (Р02879), rML (САА03513), MLlp (AY377890), ML2p (AAR25547), ML3p (AAR25550) и ML3 1p (AAR25549) Последовательности А- и B-цепи, сигнального пептида, N-концевого пропептида и линкера отмечены Последовательность N-концевого пропептида токсических лектинов омелы отмечена пунктиром соответственно двум наиболее вероятным сайтам отщепления сигнального пептида Консервативные аминокислотные остатки, формирующие активный центр А-цепи отмечены звездочками Консервативные аминокислотные остатки, формирующие галактозосвязывающие сайты в субдоменах 1а и 2у отмечены А Консервативные гидрофобные аминокислотные остатки, входящие в состав гидрофобного ядра доменов B-цепи отмечены • Замены консервативных аминокислотных остатков, формирующих активный центр А-цепи и галактозосвязывающие сайты, выделены жирным шрифтом Остатки Cys, образующие дисульфидную связь А- и B-цепи, отмечены о Граница между доменами B-цепи отмечена V Потенциальные сайты N-гликозилирования заключены в рамку Позиции некоторых аминокислотных остатков А- и B-цепи рицина, обсуждаемые в тексте, отмечены над последовательностью
Последовательности линкеров, соединяющих А- и B-цепь токсических лектинов омелы и рицина в целом заметно отличаются, но в области последовательности LeuVallleArgPro наблюдается значительная гомология, очевидно, связанная с функциональной ролью этой последовательности как сигнала транспорта предшественника в вакуоли [Fngeno L et al, 2001]
N-концевая лидерная последовательность предшественника рицина включает 35 ао, из которых 26 ао составляют сигнальный пептвд транспорта в ЭР и 9 ао - это N-концевой пропептид, вырезаемый в вакуолях и необходимый для эффективной транслокации предшественника в ЭР [Jolhffe NA et al, 2006] Анализ N-концевых последовательностей предшественников лектинов омелы с помощью программы SignalP 3 0 показал два наиболее вероятных сайта отщепления сигнального пептида, соответствующих длине пептида 23 или 28 ао, при этом вероятность отщепления по N-концу зрелой А-цепи очень мала Таким образом, можно полагать, что лектины омелы также содержат N-концевой пропептид из 5 или 10 ао (рис 2)
Количественное соотношение трех вариантов генов токсических лектинов омелы в геномной ДНК и их транскриптов в мРНК Оценка количественного соотношения трех вариантов генов в геномной ДНК и их транскриптов в мРНК (и, соответственно, в кДНК) была основана на принципе конкурентной количественной ПЦР [Diviacco S et al, 1992] Если праймеры Ml и М2 универсальны для всех вариантов mlp генов и последовательности, фланкируемые праймерами сходны и мало отличаются по длине, то все варианты генов будут амплифицироваться в равной степени и количественное соотношение продуктов амплификации разных вариантов генов будет равно их соотношению в исходной Д НК-матрице Различие рестриктных карт Sali и Pstl трех вариантов генов mlp позволило разделить продукты их
амплификации (рис. ЗА) Фрагмент геномной ДНК или кДНК, амплифицированный с Ml и М2 праймерами размером около 400 по (415 по для mllp и т13р и 430 по для т12р) был очищен из агарозного геля и фосфорилирован с помощью Равные количества фрагмента были расщеплены Sail или Pstl рестриктазами и разделены на агарозном геле. Pstl фрагмент (246 по), специфичный для гена mllp, и Sali фрагменты длиной 243 по и 365 по, специфичные для генов т12р и т13р, соответственно, содержащие радиоактивную метку на одном из концов, были вырезаны из геля и их радиоактивность была измерена (рис ЗБ) Количественное соотношение трех вариантов генов в геномной ДНК или их транскриптов в мРНК определяли по соотношению радиоактивности специфичных рестриктных фрагментов. Картина рестриктных фрагментов, полученных при разрезании М1-М2 продукта амплификации геномной ДНК и кДНК была сходна, однако относительные количества рестриктных фрагментов, соответствующих трем вариантам mlp генов заметно отличались В геномной ДНК гены mllp, т12р и т13р присутствуют в количественном соотношении 1514, соответственно В кДНК количественное соотношение продуктов транскрипции генов mllp, т12р и т13р составляет 50:10.1, соответственно, что согласуется с известным количественным преобладанием MLI в растении, которое отчасти может быть обусловлено более интенсивной траснкрилцией.
Никаких дополнительных фрагментов, не соответствующих трем вариантам генов mlp не наблюдалось при одновременном разрезании Sail и Pstl продукта амплификации кДНК При разрезании продукта амплификации геномной ДНК Sali, или Sali и Pstl одновременно, появляется дополнительный рестриктный фрагмент длиной примерно 380 по Рестриктный анализ этого фрагмента с использованием рестриктаз Nrul, Aatll, Agel, Narl и Vnel не выявил сходства с mlp генами. Таким образом, этот фрагмент может быть продуктом неспецифической амплификации или может представлять неэкспрессирующийся сильно измененный псевдогенный материал.
Если предположить, что одна копия mllp гена содержится в гаплоидном геноме омелы, то, исходя из количественного соотношения трех вариантов генов mlp в геномной ДНК, размер семейства генов токсических пектинов омелы может составлять 6-7 генов (1.5 1:4 1/2 + 1 + 4 = 6/7). Попытка оценить размер семейства mlp генов путем Саузерн-блот анализа геномной ДНК не дала однозначной оценки. Фрагмент т!2р гена длиной около 1000 по, радиоактивно меченый с
100 по i_í
mllp
ml 2p
üí /¡-Ifens
Hindi
J.
В-цепь V? AatlI PvuII
mi íp я mi i ,ip
Peí 1 Nml А-цеп Agel 1 Pstl В-ц em- Aatl! Sp!l
NruJ A J^ Мепь Vnel в-цепь 1 n/r o[
/ V Nntf A^elMwiI
продукт амгслнфикаинн геномной ДНК M 1 2 3 4
Гфодук? аыплмфихйцнн кДИК
1 2 3 4 5
Рнс, 3. Опечка количественного соотношения грех генов mlp в геномной ДНК омелы и их транскриптов в мРКК. (А) Рестрнктная карта гепов mlp в области, фланкируемой прайм ерами Ml и М2. Положение праймеров отмечено стрелками, Продукт амплификации геномной ДНК и кДНК с пранмерами Ml и М2 расщепляли Sal I и Pst I рестриктазами. Pst I расщепляет только продукт амплификации гена mllp, с образованием фрагментов длиной 169 и 246 по. Sal I расщепляет продукт амплификации гена ml2p с образованием фра!'ментов длиной 66, 121 и 243 по и продукт амплификации генов mllp (и m¡3 1р) с образованием фрагментов длиной 50 и 365 по. Pst I-рестриктный фрагмент длиной 246 по и Sail-petтриктные фрагменты длиной 243 и 365 по использовали для определения количественного соотношения, (Б) Электрофоретическое разделение на 2 % атарозном ¡еле равных количеств продукта амплификации геномной ДНК и кДНК необработанного ре стриптизами (дорожки 1) и расщепленного Pst I (дорожки 2), (дорожки 3) или Pst 1 и Sal I одновременно (дорожки 4). Дорожки М - маркеры длины фрагментов ДНК (отмечена слева в по), дорожка 5 - в три раза большее количество продукта амплификации кДНК, расщепленного Sai I, чтобы можно было видеп фрагмент длиной 365 по (отмечен черной стрелкой снрана). Sal I-рсстриктный фрагмент длиной около 380 по, образующийся при расщеплении продукта амплификации геномной ДНК отмечен белой стрелкой справа. Рестриктные фрагмнты продуктов аллификагош генов mllp, ml2p и ml3p вырезали из геля и измеряли их радиоактивность. Для определения фона радиоактивности был вырезан кусочек годя между полосами, соответствующими 400 и 240 по, на дорожках 2 или 3. ■
помощью ник-трансляции был использован в качестве зонда при мягких условиях отмывки Геномную ДНК расщепляли только теми рестриктазами, которые не разрезают ни один из полученных вариантов т1р генов в области, гомологичной зонду, так что число гибридизующихся фрагментов может примерно соответствовать или не превышать размера семейства генов (рис 4) Продукты расщепления геномной ДНК рестриктазами BglII и ЕсоШ (а также ХЬа1 и N001, данные не показаны) давали
два гибридизующихся фрагмента, один
Nsil
AflH BglU
EcoRT
212-^ чт
21 2-
2 O-HäS»
Рис. 4. Оценка размера семейства генов токсических лектинов омелы с помощью Саузерн-блот анализа Равные количества высокомолекулярной геномной ДНК омелы (10 мкг) расщепляли рестриктазами Bgl II, Nsi I, Afl II или EcoR I, электрофоретически разделяли на 0 7 % агарозном геле, переносили по Саузерну на нейлоновую мембрану, гибрвдизовали с радиоактивно меченным Sma I - Pst I фрагментом клона т12р и отмывали в мягких условиях Стрелками слева отмечена длина фрагментов ДНК маркеров (по)
из которых был представлен более интенсивной полосой Продукты расщепления АЙН и Nsil (и Bell, данные не показаны) давали сходную картину из пяти гибридизующихся фрагментов, одному из которых соответствовала более интенсивная полоса Очевидно, что различное число копий генов в полосе может обусловливать различную
интенсивность полос Соответственно, семейство генов могут составлять больше пяти генов, что подтверждает результат полученный, исходя из соотношения трех вариантов генов в геномной ДНК
С помощью конкурентной количественной ПЦР и универсальных М1 и М2 праймеров было определено количество геномной ДНК, содержащее одну копию гена Конкурирующая ДНК была сконструирована путем субклонирования Hindlll - Sali фрагмента клона ml3 1р в клон т12р по сайгам Hmdlll и Agel Амплификация полученной плазмидной ДНК (в линейной форме) с М1 и М2 праймерами дает фрагмент длиной 388 по легко отличимый на 2 % агарозном геле от продукта амплификации геномной ДНК (415 / 430 по) Определенное количество геномной ДНК омелы (200 нг), смешанное с возрастающими количествами конкурентной ДНК (500 - 10000 молекул) был амгогафицирован с М1 и М2 праймерами. Полученные фрагменты были радиоактивно мечены по одному из концов, так как часть М2 праймера была фосфорилирована по 5'
-концу 33Р В образце, содержащем примерно равное количество продуктов амплификации геномной ДНК и конкурентной ДНК, соответствующие полосы были вырезаны из геля и измерена их радиоактивность. По соотношению радиоактивности, представляющему количественное соотношение в образце молекул конкурентной матрицы и копий т1р генов было определено содержание т1р генов в геномной ДНК Одна копия гена содержится в 50 пг (5><1010 по) геномной ДНК Если семейство включает 6-7 генов, размер генома омелы составляет около 3 - 3 5 х 1011 по, то есть является одним из наиболее крупных эукариотических геномов, что характерно для растений [Меввшд 1 etal, 2001]
Получение и определение функциональной активности рекомбинантных А-цепей токсических лектинов омелы. Фрагменты генов т1р, кодирующие А-цепи были клонированы в рЕТ28Ь(+) вектор и экспрессированы в цитоплазме клеток ВЬ21(1ЖЗ)рЬуз8 Экспрессионные конструкции кодируют А-цепи сшитые на конце с полигистидиновой последовательностью Экспрессионную культуру растили при 30°С до оптической плотности при 600 нм (А600) равной 0 6-07, затем синтез рекомбинантного белка индуцировали добавлением 1 мМ изопропил-1 -тио-Р-Б-галактопиранозида (ИПТГ) в течение 2 5 - 3 ч Большая часть рекомбинантных А-цепей оказывалась в нерастворимой цитоплазматической фракции (тельца включения), но значительная часть была растворима Растворимые рекомбинашные А-цепи были очищены до гомогенного состояния с помощью металл-аффинной хроматографии При разделении на денатурирующем полиакриламидном геле с последующим окрашиванием Кумасси К.-350 (АтегеИат Вювмепсез) А-цепи МЬ1р и МЬ2р были представлены одной полосой размером около 30 кДа Рекомбинантные А-цепи МЬЗр и МЬЗ 1р были представлены двумя полосами, размером около 30 и 60 кДа Идентичность полос была подтверждена Вестерн-блот анализом с моноклональным антителом ТА7 [Темяков ДЕ е( а! 1997], узнающим А-цепи трех лектинов омелы (рис 5) Выход рекомбинантных А-цепей МЫр, МЬ2р, МЬЗр и МЬЗ 1р составил 6,4 4,0 35 и 0 3 мг на 1 литр культуры, соответственно
Биологическую активность рекомбинантных А-цепей оценивали по их способности ингибировать биосинтез белка в бесклеточной системе кроличьего регакулоцитарного лизата Образцы, содержащие возрастающие концентрации А-цепи (0 1 - 60 нг/мл) инкубировали при 37°С в течение 20 минут и охлаждали во льду Затем в образцы добавляли матричную РНК и проводили реакцию в течение 20 минут при 30°С Количество синтезированного белка определяли по включению [3Н]-
лейцина (рис 6) Каталитическую активность рекомбинантных A-цепей сравнивали
A-цепь MLlp А-депь ML2p А-депьМЬЗр MLI MUI MLII1
1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 И 12 13 14 15
кДа
^ft ' i -30
Рис. 5 Иммуноблоттинг рекомбинантных A-цепей MLp с моноклональным антителом ТА7 Рекомбинантные A-цепи MLlp (дорожки 1-3), ML2p (дорожки 4-6), ML3p (дорожки 7-9) и обработанные дитиотреитолом для восстановления межцепочечной дисульфидной связи природные MLI (дорожки 10-11), MLII (дорожки 12-13) и MLIII (дорожки 14-15) были разделены на денатурирующем 15 % полиакриламидном геле Рекомбинантные или природные белки были нанесены на гель в количестве 1 мкг (дорожки 1, 4, 7), 0 7 мкг (дорожки 2, 5, 8, 10, 12, 14) или 0 35 мкг (дорожки 3, 6, 9, 11, 13, 15) Разделенные белки переносили на Hybond-P мембрану (Amersham Biosciences) и определяли связывание с моноклональным антителом ТА7
по концентрации, обусловливающей 50 % ингибирование включения [3Н]-лейцина в белок (1С5о) Значения 1С50 для рекомбинантных A-цепей составили 1 нг/мл (MLlp), 4 нг/мл (ML2p), 0 35 нг/мл (ML3p) и 50 нг/мл (ML31р) Значение IC5D для рекомбинантной A-цепи MLlp в данном эксперименте совпадает с таковым рекомбинантной и нативной A-цепи рицина [O'Hare М et al, 1987] Каталитическая активность A-цепи ML3 1р значительно снижена по сравнению с остальными А-цепями, что, возможно, связано с заменой консервативного Alai 66 на Val Данные по кристаллической структуре рицина показывают, что соответствующий Alai 78 рицина расположен в области активного центра A-цепи и любой ао, больший чем Ala будет нарушать одну из связей инвариантного Туг21 (Туг 17 в A-цепях MLp), стабилизирующего структуру активного центра [Katzm В J et al, 1991]
Получение и определение функциональной активности рекомбинантных В-цепей токсических лектинов омелы. Фрагменты генов mllp, ml2p, ml3p и ml3 lp, кодирующие B-цепи, были клонированы в экспрессионный вектор рЕТ-22Ь(+) и экспрессированы в клетках Е coli Tuner(DE3) При клонировании в N-концевую область B-цепи MLlp была введена замена Ser5 на Thr и в С-концевую область В-цепи ML3 1р - замена Met265 на Val Введенные замены, предположительно, не влияют на лектиновую активность соответствующих B-цепей, так как первая замена находится в области линкерного субдомена, соединяющего А- и B-цепи, не входящего в состав глобулярных доменов, содержащих углеводсвязывающие сайты,
вторая гомологичная замена соответствует структуре очень сходного МЪЗр и остальных вариантов лектинов Экспрессионные плазмиды кодируют В-цепи, сшитые на И-конце с вектор-кодируемым сигнальным пептидом, направляющим белок в
100-
90-
80-
g. то-
1 60-
f 50-
F
1 40-
fí 30-
(O 20-
10-
0-
—— A-nensMUp —*— А-деиь М1,2р —о— A-nem>ML3p —л— A-цепь ML3 1р
10 20 30 40 А-цепъ MLp (щ/мл)
50 60
Рис. 6. Биологическая активность рекомбинантных А-цепей МЬр Представлены кривые ингибирования биосинтеза белка в бесклеточной системе кроличьего ретикулоцитарного лизата, онреденленного по включению [3Н]-лейцина, в присутствии рекомбинантных А-цепей МЬр, в возрастающих концентрациях
периплазматическое пространство, что может способствовать правильному сворачиванию В-цепей,
содержащих 3 (МЫр и МЬЗ 1р) или 4 (МЬ2р и МЪЗр) внутрицепочечных дисульфидных связи Выделение рекомбинантных В-цепей с помощью металл-аффинной хроматографии на №-содержащей сефарозе позволило получить относительно чистый белок (рис 7, препараты рекомбинантных В-цепей МЫр, МЬ2р, МЪЗр и МЬЗЛр давали аналогичную картину
электрофоретического разделения) Выход рекомбинангного бежа составлял около О 25 мг на 1 л культуры
Пектиновая активность природных лектинов и рекомбинантных В-цепей была определена по связыванию с иммобилизированным асиалофетуином (así), содержащим О- и N-связанные олигосахариды с концевыми остатками gal Связывание с моносахарами определяли по ингибированию связывания лектина с иммобилизированным asf в присутствии возрастающих концентраций gal или galNAc Специфичность к gal или galNAc оценивали по концентрации сахара, обусловливающей 50 % ингибирование связывания с asf (1С50)
Связывание MLI, MLII и МЫП с иммобилизированным asf эффективно ингибировалось простыми сахарами (рис 8А) Gal более эффективно ингибировала связывание MLI, чем galNAc (IC50(gal) = 1 1 мМ, IC5o(galNAc) = 74 мМ), что соответствует известной специфичности MLI к gal GalNAc предпочтительно
ингибировал связывание MUI и MLIIL Gal в наименьшей степени ингибировала связывание MLIII с así* (ICJ0 = 47 мМ).
Рекомбинантныс В-цепи MI,]p, ML2p и ML3p связывались с ямм обил из иров энным asf, при условии, что хранились в высоко-солевом PN буфере, при переводе в PBS и
хранении в течение ночи связывания с asf уже не наблюдалось.
Простые сахара gai и galNAc ингибировали связывание
рекомбинантных В-непей с asf, но в меньшей степени, чем связывание природных лектинов. Хранение В-цепей в PN-буфере в присутствии небольших ¡концентраций gal (0.04 мМ на 1 мкг/мл) не изменяло связывания с asf по сравнению с образцом, хранившимся без gal, но приводило к более выраженному ингибированию связывания в присутствии возрастающих
Концентраций gal и galNAc (рис. 8Ь). Значения 1СИ gal и galNAc для трех рекомбинангных В-цепей MLp были выше, чем для природных лекшнов, однако предпочтение к gai у В-цепи MLIp и к galNAc у В-цепей ML2p и MLЗр сохраняется.
Простые сахара наиболее эффективно ингибировали связывание с asf В-цепи ML3,lp и хранение бедка в течение ночи в PBS ослабляло (примерно на 30%), но не отменяло связывания (рис. 8Б),
.Пектиновые свойства изолированных В-цепей природных РИБ 2 практически не отличаются или незначительно уступают свойствам целого белка [Richardson Р.Т. et al., 1991], Так, ICjo для лактозы, определенное при ингибировании связывания с иммобилизировапным asf природного ML! и его изолированной В-цепи. составили 1.8 и 4.9 мМ, соответственно, и для galNAc соответствующие значения составили 21 и 26 мМ [Eûk.I.eiaî„ 19991.
кДа 1
976655 — ■ 43-,
40"
31--* ■-- —В-цепь
" ML 1 р
21-- ШШ* $
14-
Ркс. 7. Очистка рёййибии&шной В-цепи МЫр. Электрофорез в денатурирующем 12% иолиакри лам идиом геле в восстанавливающих условиях с окрашиванием кумасси синим G-350 (Amersham Biosciences). 5 - Маркеры молекулярной массы; 2 - лизат клеток Е. coli Tuner(DE3), в которых синтезирована 13-цепь MLIp, использованный для нанесения на колонку HisTrap HF; 3 - очищенная В-иень MLlc.
Ранее было показано, что рекомбинантная B-цепь MLI, экспрессированная в Е coli в виде телец включения с последующей ренатурацией, связывается с asf, но простые
MLI1
001 oí i lo löo gal/galNAc, мМ
MLI
1С* (gal) = 1 1 мМ 1С,s (gaiNAc) = 74 мМ
toö-
80604020-
0 01 Ol 1 10 100 »mM
MUI
IC„ (gal) = 7 мМ ICM (gaiNAc) = 04 мМ
B-uem, ML2p
001 01 1 10 100 gal / gaiNAc, мМ
MLID
IC<>(gal) = 47MM ICM (gaiNAc) = 05 мМ
100-1
В-пеш. MUp
4V
w
v:
01 I 10 100 gäl / gaiNAc, мМ
В-цепь MLlp 1С„ (gai)* = 114 мМ IC„ (gal) = 27 мМ ¡CM (gaiNAc) = 44 мМ
В-цепь ML3 lp
01 1 10 100 gal/galNAc,MM
В-цепь ML2p 1СИ Qj^l)* =147 мМ 1С,» (gal) = 100 мМ 1С» (gaiNAc) = 50 мМ
10 100 мМ
Ol
В-цепь ML3p 1С« (gal)* = 81 мМ ICM (gal) = 67 мМ ICjj (gaiNAc) = 21 мМ
01 1 10 100 gaI/gaINAc,MM
В-цепь ML3 lp IC5i (gal)* = 48 мМ ICM(gal) = 22MM 1CM (gaiNAc) = 42 MM
Рис. 8. Ингибирование связывания с асиалофетуином (asf) природных лектинов MLI, MLII и MLIII (А) и рекомбивантных В-иепей MLlp, ML2p, ML3p и ML3 lp (Б) в присутствии простых Сахаров gal(,) и gaiNAc (4) Природные лекгины или рекомбинантные В-це1ш инкубировали с иммобилизованным asf в присутствии gal или gaiNAc в возрастающих концентрациях и определяли относительное количество связанного лектина по сравнению с образцом, не содержащим конкурирующего сахара Приведены кривые ингибирования связывания с asf рекомбинантных В-цепей, хранившихся в присутствии gal в низкой концентрации, а также кривая ингибирования связывания с asf в присутствии gal В-цепей хранившихся без gal (-) Указаны значения IC50 для gal и gaiNAc, звездочкой отмечены значения ICsoígal) для препаратов В-цепей, хранившихся без gal
сахара лактоза и galNAc значительно слабее конкурируют за связывание, чем в случае В-цепи природного MLI[Eck J etal, 1999]
Как и в случае ренатурированной рекомбинантной В-цепи MLI полученные В-цепи MLlp, ML2p и ML3p обладали функциональной активностью, связываясь с олигосахаридами asf, однако, простые сахара также в меньшей степени ингибировали связывание с asf, чем в случае природных лектинов Сильное влияние концентрации соли и присутствия gal в буфере для хранения на углеводсвязывающие свойства В-цепей, очевидно, свидетельствует о нестабильной конформации Хранение в высокосолевом буфере, по-видимому, стабилизирует глобулярную структуру рекомбинантных В-цепей, необходимую для связывания с asf
Усиление связывания с простыми сахарами при хранении В-цепей с небольшими концентрациями gal может свидетельствовать о том, что gal, связываясь с рекомбинантными В-цепями, вызывает изменение конформации белка, сопровождающееся увеличением сродства к моносахарам, хотя рекомбинантные В-цепи и в этом случае уступают природным лектинам
Изменение углеводсвязывающих свойств негликозилированных рекомбинантных В-цепей, по-видимому, являются общей особенностью растительных РИБ 2 типа Подобная ситуация, когда растворимая рекомбинантная В-цепь, экспрессированная в Е coli, связывается с asf, но слабо взаимодействует с галактозой и лактозой, наблюдалась с рицином Показано, что такие свойства рекомбинантной В-цепн, связаны с отсутствием N-гликозилирования [Richardson Р Т etal, 1991]
Природа структурных изменений негликозилированных В-цепей не известна Домены В-цепей растительных РИБ 2 характеризуются особым типом третичной структуры, называемой структурой (3-трилистника [Murzin AG et al, 1992], при этом протяженных элементов регулярной вторичной структуры в В-цепях нет и первоначально структура доменов была описана как структура, состоящая из больших ii-петлей [Rutenber Е et al, 1991] Возможно, что такая структура, стабилизированная в природных пектинах обычно двумя N-гликанами, в отличие от А-цепей, содержащих выраженные элементы вторичной структуры а-спирали и р-слои, оказывается в какой-то мере подвижной в рекомбинантном белке На основе кристаллической структуры связанного с лактозой рицина сайты связывания с gal были описаны как полые карманы на поверхности доменов В-цепи [Rutenber Е et al, 1991] Данные по связыванию рицина с различными олигосахаридами предполагают, что углеводсвязывающие сайты представляют собой бороздки, вмещающие ди-, три-
и тетрасахариды, что объясняет гораздо более высокое (примерно в 1000 раз) сродство рицина к сложным N-связанным олигосахаридам asf по сравнению с моносахарами [Wu J Н et al, 2005] Возможно, что изменение углеводсвязывающих свойств, связано с конформационной подвижностью в структуре В-цепи, формирующей протяженные углеводсвязывающие сайты
B-цепь MLI кроме двух сайтов, гомологичных таковым рицина, имеет третий сайт N-гликозилирования N61, который отсутствует в MLIII [Wacker R et al, 2005] В-цепь ML3 1р имеет только один потенциальный сайт N-гликозилирования N243, который присутствует также в MLIII, но не несет гликана Таким образом, возможно, что природная B-цепь ML3 1р (по-видимому, единственная из известных РИБ 2 типа) негликозилирована, что объясняет наиболее высокое сродство рекомбинантной В-цепи к моносахарам и устойчивость в условиях низкосолевого буфера по сравнению с B-цепями MLlp, ML2p и ML3p Лектиновая активность B-цепи ML3 1р может быть близка к природной B-цепи, хотя хранение в присутствии gal усиливает сродство к простым сахарам
Получение рекомбинантных B-цепей лектинов омелы, обладающих эквивалентной природным белкам лектиновой активностью в отношении как сложных олигосахаридов так и простых Сахаров, таким образом, по-видимому, предполагает использование эукариотической экспрессионной системы С другой стороны, негликозилированные рекомбинантные B-цепи, по-видимому, могут связываться с содержащими сложные олигосахариды рецепторами клеток-мишеней и оказывать те же биологические эффекты, что и природные B-цепи Кроме того, свойства В-цепи ML3 1р, приближающиеся к природному белку, позволяют думать, что путем изменения структуры белка можно компенсировать отсутствие N-гликозилирования
Выводы:
1) Клонированы гены трех токсических лектинов омелы
2) Определено количественное соотношение трех генов mllp, т12р и ml3p в геномной ДНК, которое составляет 15 14, соответственно Количественное соотношение транскриптов mllp, ml2p и ml3p в мРНК составляет 50 10 1, соответственно Семейство генов токсических лектинов омелы включает 6-7 генов
3) Количественное содержание генов токсических пектинов омелы в геномной ДНК составляет 1 ген на 50 пг ДНК Получена приблизительная оценка размера генома омелы 3-35х Ю11 по
4) Получены каталитически активные рекомбинантные А-цепи токсических лектинов омелы
5) Получены рекомбинантные В-цепи трех токсических лектинов омелы, обладающие сниженным сродством к простым сахарам Рекомбинантная В-цепь изоформы одного из токсических лектинов омелы обладает наиболее высоким сродством к простым сахарам, близким к природному лектину
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1) Soudarkina О, Kourmanova А, Olsnes S and Kozlov Yu The mistletoe lectme gene family cloning of three variants of the genes In Advances in Molecular Cell Biology, Moscow Max Press, 173-189,2004
2) Kourmanova A G, Soudarkina О J, Olsnes S and Kozlov J V (2004) Cloning and characterization of the genes encoding toxic lectins m mistletoe (Viscum album L) Eur J Biochem 271,2350-2360
3) Козлов Ю В, Сударкина О Ю, Курманова А Г (2006) Рибосом-инактивирующие лекттщ растений Молекуляр биология 40,711-723
4) Сударкина О Ю, Курманова А Г, Козлов Ю В (2007) Получение и характеристика В-цепей токсических лектинов омелы Молекуляр биология 41, 666-673
Напечатано о готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01 12 99г Подписано к печати 07 09 2007 г Формат60x90 1/16 Услпечл 1,25 Тираж 100 экз Заказ418 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им MB Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сударкина, Ольга Юрьевна
список сокращений введение обзор литературы
1. Белки, инактивирующие рибосомы
2. Структура RIP
3. Действие RIP на рибосомы
4. Биосинтез рицина
5. Взаимодействие RIP 2 с клетками млекопитающих
5.1 Поступление RIP 2 в цитоплазму клеток
5.2 Ответ клетки на воздействие RIP
6. Биологическая роль и практическое применение RIP
7. Токсические лектины омелы 29 материалы и методы
1. Растительный материал
2. Выделение мРНК из растения и синтез кДНК
3. Амплификация фрагментов геномной ДНК, кодирующих токсические лектины омелы с помощью вырожденных праймеров
4. Амплификация концов кДНК
5. Клонирование полных кодирующих последовательностей генов токсических лектинов омелы
6. Выделение геномной ДНК омелы и Саузерн-блот анализ
7. Оценка количественного соотношения трех генов токсических лектинов омелы в геномной ДНК и их транскриптов в мРНК
8. Количественная ПЦР
9. Секвенирование ДНК
10. Конструкция экспрессионных плазмид, кодирующих рекомбинантные А- и В-цепи лектинов омелы
11. Синтез А- и В-цепей токсических лектинов омелы в Е. coli.
12. Выделение рекомбинантных А- и В-цепей токсических лектинов омелы
13. Вестерн-блот анализ рекомбинантных А-цепей
14. Каталитическая активность рекомбинантных А-цепей
15. Приготовление поликлональной антисыворотки к В-цепи ML2p
16. Лектиновые свойства рекомбинантных В-цепей 39 результаты
1. Клонирование полных кодирующих участков генов токсических лектинов омелы и анализ структуры кодируемых белков
2. Количественное соотношение трех вариантов генов токсических лектинов омелы в геномной ДНК и их транскриптов в мРНК
3. Количественное содержание генов токсических лектинов омелы в геномной ДНК
4. Получение рекомбинантных А-цепей токсических лектинов омелы и определение их функциональной активности
5. Получение рекомбинантных В-цепей токсических лектинов омелы и определение их функциональной активности обсуждение
Введение Диссертация по биологии, на тему "Токсические лектины омелы (Viscum album L.): клонирование и характеристика"
Токсические лектиы омелы (Viscum album L.) относятся к семейству белков, инактивирующих рибосомы, в которых энзиматическая А-цепь соединена дисульфидной связью с лектиновой В-цепью. А-цепь - специфическая РНК N-гликозидаза, которая гидролитически выщепляет остаток аденина из высоко консервативной области 28S рРНК. Модифицированная таким образом рибосома неспособна связывать факторы элонгации, что ведет к остановке трансляции и, в конечном счете, гибели клетки. В-цепь связывается с олигосахаридами гликопротеинов и гликолипидов клеточной поверхности, содержащих концевые остатки галактозы, обеспечивая эндоцитоз токсина. К этому семейству относятся также рицин клещевины (Ricinus communis L.) и шига токсин, продуцируемый бактерией Shigella dysenteriae.
Изучение цитотоксического действия белков этого семейства связано с исследованиями клеточных механизмов ретроградного транспорта белков и липидов от плазматической мембраны в эндоплазматический ретикулум, механизмов риботоксического стресса и апоптоза. В этих исследованиях белки, инактивирующие рибосомы, оказываются удобным инструментом. Исключительная токсичность для клеток человека обусловливает применение их для создания цитотоксических препаратов направленного действия, таких как иммунотоксины. Было показано, что токсины этого типа способны доставлять сшитые с ними чужеродные белки и пептиды в цитоплазму клеток, что делает возможным использование их для доставки различных антигенов в клетки для презентации, связанной с молекулами I класса главного комплекса гистосовместимости и индукции протективного клеточного иммунитета при вирусных инфекциях и онкологических заболеваниях.
В настоящее время экстракты омелы белой (Viscum album) широко используются в Европе для общей иммуностимуляции при онкологических заболеваниях. Три токсических лектина MLI, MLII и MLIII, различающиеся по углеводной специфичности и цитотоксичности, являющиеся действующим началом этих экстрактов, в малых дозах стимулируют иммунную систему к продукции цитокинов, таких как интерлейкин-1 и 6, интерферон-у и фактор некроза опухоли а, индуцируют цитотоксическую активность Т-лимфоцитов и естественных киллеров, усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов. При этом ряд эффектов, оказываемых лектинами омелы на иммунную систему могут вызывать их изолированные В-цепи. Иммуностимулирующее действие может увеличивать эффективность цитотоксических и вакцинных препаратов на основе лектинов омелы. Получение рекомбинантных лектинов необходимо для их практического применения и структурно-функциональных исследований. До недавнего времени была известна только первичная структура количественно преобладающего в растении лектина MLI. Целью данной работы было клонирование генов токсичеких лектинов омелы и характеристика функциональных свойств их каталитических и лектиновых субъединиц. В работе представлены следующие результаты. Клонированы три варианта генов токсических лектинов омелы, два из которых кодируют MLI, структура гена которого к началу работы не была известна, и MLIII, аминокислотная последовательность которого была недавно определена. Третий вариант, предположительно, соответствует MLII, данных о структуре которого в литературе пока нет. Впервые получены оценки размера семейства генов токсических лектинов и генома омелы. Получены энзиматически активные рекомбинантные А-цепи, которые могут быть использованы для разработки цитотоксических препаратов направленного действия. Полученные рекомбинантные В-цепи, кодируемые тремя вариантами генов, обладают сниженным сродством к моносахарам галактозе и N-ацетилгалактозамину, но связываются со сложными олигосахридами асиалофетуина и могут обладать той же биологической активностью, что и природные В-цепи. обзор литературы
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сударкина, Ольга Юрьевна
выводы
1) Клонированы гены трех токсических лектинов омелы.
2) Определено количественное соотношение трех генов mllp, т12р и т13р в геномной ДНК, которое составляет 1.5:1:4 соответственно. Количественное соотношение транскриптов mllp, т12р и т13р в мРНК составляет 50:10:1 соответственно. Семейство генов токсических лектинов омелы включает по меньшей мере 6-7 генов.
3) Количественное содержание генов токсических лектинов омелы в геномной ДНК составляет 1 ген на 50 пг ДНК. Получена приблизительная оценка размера генома омелы: 3 - 3.5 х 1011 по.
4) Получены каталитически активные рекомбинантные А-цепи токсических лектинов омелы.
5) Получены рекомбинантные В-цепи трех токсических лектинов омелы, обладающие сниженным сродством к простым сахарам. Рекомбинантная В-цепь изоформы одного из токсических лектинов омелы обладает наиболее высоким сродством к простым сахарам, близким к природному лектину.
БЛАГОДАРНОСТИ
Я выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю профессору Юрию Васильевичу Козлову за чуткое руководство и интеллектуальную поддержку и Алме Габиденовне Курмановой за неоценимую помощь и участие в проведении экспериментальной работы и плодотворное обсуждение полученных результатов.
Я благодарю московский Центр медицинских исследований Университета Осло за поддержку данной работы. Я выражаю искреннюю благодарность профессору А.Г. Тоневицкому за предоставленные препараты природных лектинов омелы MLI, MLII и MLIII и антитела к ним.
Я благодарю всех сотрудников нашей лаборатории, помогавших проведению работы: Юдкину Ольгу Владимировну, Лукьянова Евгения Владимировича, Ермакову Нину Викторовну, а также Сарафанова Андрея Гаруновича и Пенькова Дмитрия Николаевича.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Клонированы гены трех токсических лектинов омелы, два из которых кодируют MLI и MLIII, и третий, предположительно, кодирует MLII. Данные о структуре генов лектинов омелы, кроме MLI, получены впервые. Впервые получена оценка размера семейства генов токсических лектинов омелы и приблизительная оценка размера генома омелы. Получены функционально активные рекомбинантные А- и В-цепи токсических лектинов омелы. Впервые получены данные, указывающие на возможность путем изменения структуры белка компенсировать отсутствие N-гликозилирования, необходимого для поддержания функционально активной конформации В-цепей RIP 2.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сударкина, Ольга Юрьевна, Москва
1. Olsnes S. 2004. The history of ricin, abrin and related toxins. Toxicon. 44(4), 361370.
2. Lin J.-Y., Kao W.-Y., Tserng, K.-Y., Chen C.-C., Tung T.-C. 1970. Effect of crystalline abrin on the biosynthesis of protein, RNA and DNA in experimental tumors. Cancer Res. 30,2431-2433.
3. Lin J.-Y., Liu K., Chen C.-C., Tung T.-C. 1971. Effect of crystalline ricin on the biosynthesis of protein, RNA and DNA in experimental tumors. Cancer Res. 31, 921-924.
4. Girbes Т., Ferreras J.M., Arias F.J., Stirpe F. 2004. Description, distribution, activity and phylogenetic relationship of ribosome-inactivating proteins in plants, fungi and bacteria. Mini Rev. Med. Chem. 4(5), 461-476.
5. Stirpe F., Williams D.G., Onyon L.J., Legg R.F., Stevens W.A.1981. Dianthins, ribosome-damaging proteins with anti-viral properties from Dianthus caryophyllus I.(carnation). Biochem J. 195(2), 399-405.
6. Stirpe F., Olsnes S., Pihl A. 1980. Gelonin, a new inhibitor of protein synthesis, nontoxic to intact cells. Isolation, characterization, and preparation of cytotoxic complexes with concanavalin A. J. Biol. Chem. 255(14), 6947-6953.
7. Irvin J.D. 1975. Purification and partial characterization of the antiviral protein from Phytolacca americana which inhibits eukaryotic protein synthesis. Arch. Biochem. Biophys. 169(2), 522-528.
8. Irvin J.D., Kelly Т., Robertus J.D. 1980. Purification and properties of a second antiviral protein from Phytolacca americana which inactivates eukaryotic ribosomes. Arch. Biochem. Biophys. 200(2), 418-425.
9. Barbieri L., Bolognesi A., Cenini P., Falasca A.I., Minghetti A., Garofano L., Guicciardi A., Lappi D., Miller S.P., Stirpe F. 1989. Ribosome-inactivating proteins from plant cells in culture. Biochem. J. 257(3), 801-807.
10. Miyano M., Appelt K., Arita M., Habuka N., Kataoka J., Ago H., Tsuge H., Noma M., Ashford V., Xuong N. 1992. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of Mirabilis antiviral protein. J. Mo I Biol. 226(1), 281283.
11. Coleman W.H., Roberts W.K. 1982. Inhibitors of animal cell-free protein synthesis from grains. Biochim. Biophys. Acta. 696(3), 239-244.
12. Olsnes S., Pihl A. 1973. Different biological properties of the two constituent peptide chains of ricin, a toxic protein inhibiting protein synthesis. Biochemistry. 12(16), 3121-3126.
13. Olsnes S. 1978. Ricin and ricinus agglutinin, toxic lectins from castor bean. Methods Enzymol. 50,30-35.
14. Wei C.H., Hartman F.C., Pfuderer P., Yang W.K. 1974. Purification and characterization of two major toxic proteins from seeds of Abrus precatorius. J. Biol. Chem. 249(10), 3061-3067.
15. Olsnes S., Pihl A.1973. Isolation and properties of abrin: a toxic protein inhibiting protein synthesis. Evidence for different biological functions of its two constituent-peptide chains. Eur. J. Biochem. 35(1), 179-185.
16. Franz H., Ziska P., Kindt A. 1981. Isolation and properties of three lectins from mistletoe (Viscum album L.). Biochem. J. 195(2), 481-484.
17. Olsnes S., Haylett Т., Refsnes K. 1978. Purification and characterization of the highly toxic lectin modeccin./. Biol. Chem. 253(14), 5069-5073.
18. Barbieri L., Zamboni M., Montanaro L., Sperti S., Stirpe F. 1980. Purification and properties of different forms of modeccin, the toxin of Adenia digitata. Separation of subunits with inhibitory and lectin activity. Biochem. J. 185(1), 203-210.
19. Stirpe F., Barbieri L., Abbondanza A., Falasca A.I., Brown A.N., Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. 1985. Properties of volkensin, a toxic lectin from Adenia volkensii.J. Biol. Chem. 260(27), 14589-14595.
20. Fraser M.E., Chernaia M.M., Kozlov Y.V., James M.N. 1994. Crystal structure of the holotoxin from Shigella dysenteriae at 2.5 A resolution. Nature Struct. Biol. 1(1), 59-64.
21. Lindberg A.A., Brown J.E., Stromberg N., Westling-Ryd M., Schultz J.E., Karlsson K.A. 1987. Identification of the carbohydrate receptor for Shiga toxin produced by Shigella dysenteriae type I. J. Biol. Chem. 262(4), 1779-1785.
22. Ling H., Boodhoo A., Hazes В., Cummings M.D., Armstrong G.D., Brunton J.L., Read R.J. 1998. Structure of the shiga-like toxin I B-pentamer complexed with an analogue of its receptor Gb3. Biochemistry. 37(7), 1777-1788
23. Roberts L.M., Lamb F.I., Pappin D.J., Lord JM. 1985. The primary sequence of Ricinus communis agglutinin. Comparison with ricin. J. Biol. Chem. 260(29), 15682-15686.
24. Kourmanova A.G., Soudarkina O.J., Olsnes S., Kozlov J.V. 2004. Cloning and characterization of the genes encoding toxic lectins in mistletoe (Viscum album L.). Eur. J. Biochem. 271(12), 2350-2360.
25. Lin Q., Chen Z.C., Antoniw J.F., White R.F. 1991. Isolation and characterization of a cDNA clone encoding the anti-viral protein from Phytolacca americana. Plant Mol. Biol 17(4), 609-614.
26. Poyet J.L., Radom J., Hoeveler A. 1994. Isolation and characterization of a cDNA clone encoding the pokeweed antiviral protein II from Phytolacca americana and its expression in E. coli. FEBS Lett. 347(2-3), 268-272.
27. Kataoka J., Habuka N., Masuta C., Miyano M., Koiwai A. 1992. Isolation and analysis of a genomic clone encoding a pokeweed antiviral protein. Plant Mol. Biol 20(5), 879-886.
28. Poyet J.L., Hoeveler A. 1997. cDNA cloning and expression of pokeweed antiviral protein from seeds in Escherichia coli and its inhibition of protein synthesis in vitro. FEBS Lett. 406(1-2), 97-100.
29. Montfort W., Villafranca J.E., Monzingo A.F., Ernst S.R., Katzin В., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R., Robertus J.D. 1987. The three-dimensional structure of ricin at 2.8 A. J. Biol Chem. 262(11), 5398-5403.
30. Katzin B.J., Collins E.J., Robertus J.D. 1991. Structure of ricin A-chain at 2.5 A. Proteins. 10(3), 251-259.
31. Rutenber E., Robertus J.D. 1991. Structure of ricin B-chain at 2.5 A resolution. Proteins. 10(3), 260-269.
32. Robertus J.D., Monzingo A.F. 2004. The structure of ribosome inactivating proteins. Mini Rev. Med. Chem. 4(5), 477-486.
33. Hailing K.C., Hailing A.C., Murray E.E., Ladin B.F., Houston L.L., Weaver R.F. 1985. Genomic cloning and characterization of a ricin gene from Ricinus communis. Nucleic Acids Res. 13(22), 8019-8033.
34. Wood K.A., Lord J.M., Wawrzynczak E.J., Piatak M. 1991. Preproabrin: genomic cloning, characterisation and the expression of the A-chain in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 198(3), 723-732.
35. Kozlov Yu.V., Kabishev A.A., Lukyanov E.V., Bayev A.A. 1988. The primary structure of the operons coding for Shigella dysenteriae toxin and temperature phage H30 shiga-like toxin. Gene. 67(2), 213-221.
36. Corpet F. 1988. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res. 16(22), 10881-10890.
37. Murzin A.G., Lesk A.M., Chothia C. 1992. p-Trefoil fold. Patterns of structure and sequence in the Kunitz inhibitors interleukins-ip and la and fibroblast growth factors. J. Mol. Biol. 223(2), 531-543.
38. Wales R., Richardson P.T., Roberts L.M., Woodland H.R., Lord J.M. 1991. Mutational analysis of the galactose binding ability of recombinant ricin В chain. J. Biol. Chem. 266(29), 19172-19179.
39. Van Damme E.J.M., Peumans W.J., Barre A., Rouge P. 1998. Plant Lectins: a composite of several distinct families of structurally and evolutionary related proteins with diverse biological roles. Crit. Rev. Plant Sci. 17, 576- 692.
40. Pascal J.M., Day P.J., Monzingo A.F., Ernst S.R., Robertus J.D., Iglesias R., Perez Y., Ferreras J.M., Citores L., Girbes T. 2001. 2.8-A crystal structure of a nontoxic type-II ribosome-inactivating protein, ebulin 1. Proteins. 43(3), 319-326.
41. Endo Y., Tsurugi K. 1987. RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. Mechanism of action of the toxic lectin ricin on eukaryotic ribosomes. J. Biol. Chem. 262(17), 8128-8130.
42. Hartley M.R., Legname G., Osborn R., Chen Z., Lord J.M. 1991. Single-chain ribosome inactivating proteins from plants depurinate Escherichia coli 23S ribosomal RNA. FEBSLett. 290(1-2), 65-68.
43. Moazed D., Robertson J.M., Noller H.F. 1988. Interaction of elongation factors EF-G and EF-Tu with a conserved loop in 23S RNA. Nature. 334(6180), 362-364.
44. Larsson S.L., Sloma M.S., Nygard 0.2002. Conformational changes in the structure of domains II and V of 28S rRNA in ribosomes treated with the translational inhibitors ricin or alpha-sarcin. Biochim. Biophys. Acta. 1577(1), 5362.
45. Osborn R.W., Hartley M.R. 1990. Dual effects of ricin A chain on protein synthesis in rabbit reticulocyte lysate. Inhibition of initiation and translocation. Eur. J.Biochem. 193(2), 401-407.
46. Correll C.C., Munishkin A., Chan Y.L., Ren Z. Wool I.G., Steitz T.A. 1998. Crystal structure of the ribosomal RNA domain essential for binding elongation factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95(23), 13436-13441.
47. Correll C.C., Wool I.G., Munishkin A. 1999. The two faces of the Escherichia coli 23 S rRNA sarcin/ricin domain: the structure at 1.11 A resolution. J. Mol. Biol. 292(2), 275-287.
48. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P.B., Steitz T.A. 2000.The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science. 289(5481), 905-920.
49. Gluck A., Endo Y., Wool I.G. 1992. Ribosomal RNA identity elements for ricin A-chain recognition and catalysis. Analysis with tetraloop mutants. J. Mol. Biol. 226(2), 411-424.
50. Allerson C.R., Verdine G.L. 1995. Synthesis and biochemical evaluation of RNA containing an intrahelical disulfide crosslink. Chem. Biol. 2(10), 667-675.
51. Marchant A., Hartley M.R. 1995. The action of pokeweed antiviral protein and ricin A-chain on mutants in the alpha-sarcin loop of Escherichia coli 23 S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 254(5), 848-855.
52. Hudak K.A., Wang P., Turner N.E. 2000. A novel mechanism for inhibition of translation by pokeweed antiviral protein: depurination of the capped RNA template. RNA. 6(3), 369-380.
53. Endo Y., Tsurugi K. 1988. The RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. The characteristics of the enzymatic activity of ricin A-chain with ribosomes and with rRNA. J. Biol. Chem. 263(18), 8735-8739.
54. Chaddock J.A., Monzingo A.F., Robertus J.D., Lord J.M., Roberts L.M. 1996. Major structural differences between pokeweed antiviral protein and ricin A-chain do not account for their differing ribosome specificity. Eur. J. Biochem. 235(1-2), 159-166.
55. Peumans W.J., Hao Q., Van Damme E.J. 2001. Ribosome-inactivating proteins from plants: more than RNA N-glycosidases? FASEBJ. 15(9), 1493-506.
56. Hudak K.A., Dinman J.D., Turner N.E. 1999. Pokeweed antiviral protein accesses ribosomes by binding to L3. J. Biol. Chem. 274(6), 3859-3864.
57. Vater C.A., Bartle L.M., Leszyk J.D., Lambert J.M., Goldmacher V.S. 1995. Ricin A chain can be chemically cross-linked to the mammalian ribosomal proteins L9 andLlOe.y. Biol. Chem. 270(21), 12933-12940.
58. Rajamohan F., Venkatachalam Т.К., Irvin J.D., Uckun F.M. 1999. Pokeweed antiviral protein isoforms PAP-I, PAP-II, and PAP-III depurinate RNA of human immunodeficiency virus (HIV)-l. Biochem. Biophys. Res. Commun. 260(2), 453458.
59. Barbieri L., Valbonesi P., Bonora E., Gorini P., Bolognesi A., Stirpe F. 1997. Polynucleotide:adenosine glycosidase activity of ribosome-inactivating proteins: effect on DNA, RNA and poly(A). Nucleic Acids Res. 25(3), 518-522.
60. Chen X.Y., Link T.M., Schramm V.L. 1998. Ricin A-chain: kinetics, mechanism, and RNA stem-loop inhibitors. Biochemistry. 37(33), 11605-11613.
61. Tregear J.W., Roberts L.M. 1992. The lectin gene family of Ricinus communis: cloning of a functional ricin gene and three lectin pseudogenes. Plant Mol. Biol. 18(3), 515-525.
62. Lord J.M., Roberts L.M., Robertus J.D. 1994. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. FASEB J. 8(2), 201-208.
63. Youle R.J., Huang A.H.C. 1976. Protein bodies from the endosperm of castor bean. Subfractionation, protein components, lectins, and changes during germination. Plant Physiol. 58, 703-709.
64. Lamb F.I., Roberts L.M., Lord J.M. 1985. Nucleotide sequence of cloned cDNA coding for preproricin. Eur. J. Biochem. 148(2), 265-270.
65. Ferrini J.B., Martin M., Taupiac M.P., Beaumelle B. 1995. Expression of functional ricin В chain using the baculovirus system. Eur. J. Biochem. 233(3), 772-777.
66. Lord J.M. 1985. Synthesis and intracellular transport of lectin and storage protein precursors in endosperm from castor bean. Eur. J. Biochem. 146(2), 403-409.
67. Lord JM. 1985. Precursors of ricin and Ricinus communis agglutinin. Glycosylation and processing during synthesis and intracellular transport. Eur. J. Biochem. 146(2), 411-416.
68. Kimura Y., Hase S., Kobayashi Y., Kyogoku Y., Ikenaka Т., Funatsu G. 1988. Structures of sugar chains of ricin D. J. Biochem. (Tokyo). 103(6), 944-949.
69. Harley S.M., Lord J.M. 1985. In vitro endoproteolytic cleavage of castor bean lectin precursors. Plant Sci. 41, 111 116.
70. Harley S.M., Beevers H. 1982. Ricin inhibition of in vitro protein synthesis by plant ribosomes, Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 79, 5935- 5938.
71. Richardson P.T., Westby M., Roberts L.M., Gould J.H., Colman A., Lord J.M. 1989. Recombinant proricin binds galactose but does not depurinate 28 S ribosomal RNA. FEBS Lett. 255(1), 15-20.
72. Frigerio L., Vitale A., Lord J.M., Ceriotti A., Roberts L.M. 1998. Free ricin A chain, proricin, and native toxin have different cellular fates when expressed in tobacco protoplasts. J. Biol. Chem. 273(23), 14194-14199.
73. Hegde R., Podder S.K. 1997. A- and B-subunit variant distribution in the holoprotein variants of protein toxin abrin: variants of abrins I and III have constant toxic A subunits and variant lectin В subunits. Arch. Biochem. Biophys. 344(1), 75-84.
74. Yang Q., Liu R.S., Gong Z.Z., Liu W.Y. 2002. Studies of three genes encoding Cinnamomin (a type II RIP) isolated from the seeds of camphor tree and their expression patterns. Gene. 284(1-2), 215-223.
75. Chambery A., Di Maro A., Monti M.M., Stirpe F, Parente A. 2004. Volkensin from Adenia volkensii Harms (kilyambiti plant), a type 2 ribosome-inactivating protein. Eur. J. Biochem. 271(1), 108-117.
76. Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. 1976. Kinetics of binding of the toxic lectins abrin and ricin to surface receptors of human cells. J. Biol. Chem. 251(13), 3977-3984.
77. Moya M., Dautry-Varsat A., Goud В., Louvard D., Boquet P. 1985. Inhibition of coated pit formation in Hep2 cells blocks the cytotoxicity of diphtheria toxin but not that of ricin toxin. J. Cell Biol. 101(2), 548-559.
78. Simpson J.C., Smith D.C., Roberts L.M., Lord J.M. 1998. Expression of mutant dynamin protects cells against diphtheria toxin but not against ricin. Exp. Cell Res. 239(2), 293-300.
79. Sandvig K., van Deurs B. 1999. Endocytosis and intracellular transport of ricin: recent discoveries. FEBSLett. 452(1-2), 67-70.
80. Ghosh R.N., Mallet W.G., Soe T.T., McGraw Т.Е., Maxfield F.R. 1998. An endocytosed TGN38 chimeric protein is delivered to the TGN after trafficking through the endocytic recycling compartment in CHO cells. J. Cell Biol. 142(4), 923-936.
81. Wilcke M., Johannes L., Galli Т., Mayau V., Goud В., Salamero J. 2000. Rabl 1 regulates the compartmentalization of early endosomes required for efficient transport from early endosomes to the trans-Golgi network. J. Cell Biol 151(6), 1207-1220.
82. Stirpe F., Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. 1982. Action of viscumin, a toxic lectin from mistletoe, on cells in culture. J. Biol. Chem. 257(22), 13271-13277.
83. Riederer M.A., Soldati Т., Shapiro A.D., Lin J., Pfeffer S.R. 1994. Lysosome biogenesis requires Rab9 function and receptor recycling from endosomes to the trans-Golgi network. J. Cell Biol. 125(3), 573-582.
84. Mallard F., Antony C., Tenza D., Salamero J., Goud В., Johannes L. 1998. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. J. Cell Biol. 143(4), 973-990.
85. Mallard F., Tang B.L., Galli Т., Tenza D., Saint-Pol A., Yue X., Antony C., Hong W., Goud В., Johannes L. 2002. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. J. Cell Biol. 156(4), 653-664.
86. Sandvig K., Garred O., Prydz K., Kozlov J.V., Hansen S.H., van Deurs B. 1992. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358(6386), 510-512.
87. Majoul I.V., Bastiaens P.I., Soling H.D. 1996. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J. Cell Biol. 133(4), 777-789.
88. Cosson P., Letourneur F. 1997. Coatomer (COPI)-coated vesicles: role in intracellular transport and protein sorting. Curr. Opin. Cell Biol. 9(4), 484-487.
89. Munro S., Pelham H.R. 1987. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48(5), 899-907.
90. Girod A., Storrie В., Simpson J.C., Johannes L., Goud В., Roberts L.M., Lord J.M., Nilsson Т., Pepperkok R. 1999. Evidence for a COP-I-independent transport route from the Golgi complex to the endoplasmic reticulum. Nat. Cell Biol. 1(7), 423-430.
91. Simpson J.C., Dascher C., Roberts L.M., Lord J.M., Balch W.E. 1995. Ricin cytotoxicity is sensitive to recycling between the endoplasmic reticulum and the Golgi complex. J. Biol. Chem. 270(34), 20078-20083.
92. White J., Johannes L., Mallard F., Girod A., Grill S„ Reinsch S., Keller P., Tzschaschel В., Echard A., Goud В., Stelzer E.H. 1999. Rab6 coordinates a novel Golgi to ER retrograde transport pathway in live cells. J. Cell Biol. 147(4), 743760.
93. Johnson A.E., van Waes M.A. 1999. The translocon: a dynamic gateway at the ER membrane. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 799-842.
94. Tsai В., Rapoport T.A. 2002. Unfolded cholera toxin is transferred to the ER membrane and released from protein disulfide isomerase upon oxidation by Erol. J. Cell Biol. 159(2), 207-216.
95. H.Ellgaard L., Molinari M., Helenius A. 1999. Setting the standards: quality control in the secretory pathway. Science. 286(5446), 1882-1888.
96. Simpson J.C., Roberts L.M., Romisch K., Davey .J, Wolf D.H., Lord J.M. 1999. Ricin A chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. FEBS Lett. 459(1), 80-84.
97. Spooner R.A., Watson P.D., Marsden C.J., Smith D.C., Moore K.A., Cook J.P., Lord J.M. 2004. Protein disulphide-isomerase reduces ricin to its A and В chains in the endoplasmic reticulum. Biochem. J. 383(Pt 2), 285-293.
98. Day P.J., Pinheiro T.J., Roberts L.M., Lord J.M. 2002. Binding of ricin A-chain to negatively charged phospholipid vesicles leads to protein structural changes and destabilizes the lipid bilayer. Biochemistry. 41(8), 2836-2843.
99. Argent R.H., Parrott A.M., Day P.J., Roberts L.M., Stockley P.G., Lord J.M., Radford S.E. 2000. Ribosome-mediated folding of partially unfolded ricin A-chain. J. Biol. Chem. 275(13), 9263-9269.
100. Griffiths G.D., Leek M.D., Gee D.J. 1987. The toxic plant proteins ricin and abrin induce apoptotic changes in mammalian lymphoid tissues and intestine. J. Pathol 151,221-229.
101. Hughes J.N., Lindsay C.D., Griffiths G.D. 1996. Morphology of ricin and abrin exposed endothelial cells is consistent with apoptotic cell death. Hum. Exp. Toxicol 15 (5), 443-451.
102. Fujii J., Matsui. Т., Heatherly D.P., Schlegel K.H., Lobo P. L., Yutsudo Т., Ciraolo G.M., Morris R.E., Obrig T. 2003. Rapid apoptosis induced by Shiga toxin in HeLa cells. Infect. Immun. 71 (5), 2724-2735.
103. Williams J.M., Lea N., Lord J.M., Roberts L.M., Milford D.V., Taylor C.M. 1997. Comparison of ribosome-inactivating proteins in the induction of apoptosis. Toxicol Lett. 91(2), 121-127.
104. Rao P.V., Jayaraj R., Bhaskar A.S., Kumar O., Bhattacharya R., Saxena P., Dash P.K., Vijayaraghavan R. 2005. Mechanism of ricin-induced apoptosis in human cervical cancer cells. Biochem. Pharmacol. 69(5), 855-865.
105. Korcheva V., Wong J., Corless C., Iordanov M., Magun B. 2005. Administration of ricin induces a severe inflammatory response via nonredundant stimulation of
106. ERK, JNK, and P38 МАРК and provides a mouse model of hemolytic uremic syndrome. Am. J. Pathol. 166(1), 323-339.
107. Derijard В., Hibi M., Wu I.H., Barrett Т., Su В., Deng Т., Karin M., Davis R.J. 1994. JNK1: a protein kinase stimulated by UV light and Ha-Ras that binds and phosphorylates the c-Jun activation domain. Cell. 76(6), 1025-1037.
108. Liu Z.G., Baskaran R., Lea-Chou E.T., Wood L.D., Chen Y., Karin M., Wang J.Y. 1996. Three distinct signalling responses by murine fibroblasts to genotoxic stress. Nature. 384(6606), 273-276.
109. CavigelIi M., Li W.W., Lin A., Su В., Yoshioka K., Karin M. 1996. The tumor promoter arsenite stimulates AP-1 activity by inhibiting a JNK phosphatase. EMBOJ. 15(22), 6269-6279.
110. Galcheva-Gargova Z., Derijard В., Wu I.H., Davis R.J. 1994. An osmosensing signal transduction pathway in mammalian cells. Science. 265(5173), 806-808.
111. Kyriakis J.M., Banerjee P., Nikolakaki E., Dai Т., Rubie E.A., Ahmad M.F., Avruch J., Woodgett J.R. 1994. The stress-activated protein kinase subfamily of c-Jun kinases. Nature. 369(6476), 156-160.
112. Xia Z., Dickens M., Raingeaud J., Davis R.J, Greenberg M.E. 1995. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. Science. 270(5240), 1326-1331.
113. Karin M., Liu Z., Zandi E. 1997. AP-1 function and regulation. Curr. Opin. Cell Biol 9(2), 240-246.
114. Thomson S., Mahadevan L.C., Clayton A.L. 1999. MAP kinase-mediated signalling to nucleosomes and immediate-early gene induction. Semin. Cell Dev. Biol. 10(2), 205-214.
115. Haas S., Kaina B. 1995. c-Fos is involved in the cellular defence against the genotoxic effect of UV radiation. Carcinogenesis. 16(5), 985-991.
116. Schreiber M., Baumann В., Cotten M., Angel P., Wagner E.F. 1995. Fos is an essential component of the mammalian UV response. EMBOJ. 14(21), 53385349.
117. MO.Tournier C., Hess P., Yang D.D., Xu J., Turner Т.К., Nimnual A., Bar-Sagi D., Jones S.N., Flavell R.A., Davis R.J. 2000. Requirement of JNK for stress-induced activation of the cytochrome c-mediated death pathway. Science. 288(5467), 870874.
118. Kuida K., Haydar T.F., Kuan C.Y., Gu Y., Taya C., Karasuyama H., Su M.S., Rakic P., Flavell R.A. 1998. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94(3), 325-337.
119. Narayanan S., Surolia A., Karande A.A. 2004. Ribosome-inactivating protein and apoptosis: abrin causes cell death via mitochondrial pathway in Jurkat cells. Biochem. J. 377(Pt 1), 233-240.
120. Bras M., Queenan В., Susin S.A. 2005. Programmed cell death via mitochondria: different modes of dying. Biochemistry (Mosc). 70(2), 231-239.
121. Smith W.E., Kane A.V., Campbell S.T., Acheson D.W., Cochran B.H., Thorpe C.M. 2003. Shiga toxin 1 triggers a ribotoxic stress response leading to p38 and
122. Colpoys W.E., Cochran B.H., Carducci T.M., Thorpe C.M. 2005. Shiga toxins activate translational regulation pathways in intestinal epithelial cells. Cell Signal. 17(7), 891-899.
123. Kyriakis J.M., Avruch J. 2001. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation. Physiol. Rev. 81(2), 807-869.
124. Johnson G.L., Lapadat R. 2002. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science. 298(5600), 1911-1912.
125. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. 1993. Ribosome-inactivating proteins from plants. Biochim. Biophys. Acta. 1154(3-4), 237-282.
126. Peumans W.J., Van Damme E.J. 1995. Lectins as plant defense proteins. Plant Physiol. 109(2), 347-352.
127. Kumar M.A., Timm D.E., Neet K.E., Owen W.G, Peumans W.J., Rao A.G. 1993. Characterization of the lectin from the bulbs of Eranthis hyemalis (winter aconite) as an inhibitor of protein synthesis. J. Biol. Chem. 268(33), 25176-25183.
128. Kreitman R.J. 1999. Immunotoxins in cancer therapy. Curr. Opin. Immunol. 11(5), 570-578.
129. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman R.J., Leppla S.H. 2003. Immunotoxin therapy of hematologic malignancies. Semin. Oncol. 30(4), 545-557.
130. Frankel A.E., Kreitman R.J. 2005. CLL immunotoxins. Leuk. Res. 29(9), 985986.
131. Jain R.K. 1996. Delivery of molecular medicine to solid tumors. Science. 271(5252), 1079-1080.
132. Beaumelle В., Taupiac M.P., Lord J.M., Roberts L.M. 1997. Ricin A chain can transport unfolded dihydrofolate reductase into the cytosol. J. Biol. Chem. 272(35), 22097-220102.
133. Smith D.C., Lord J.M., Roberts L.M., Tartour E., Johannes L. 2002.1st class ticket to class I: protein toxins as pathfinders for antigen presentation. Traffic. 3(10), 697-704.
134. Tartour E„ Ciree A., Haicheur N. Benchetrit F„ Fridman W.H. 2000. Development of non-live vectors and procedures (liposomes, pseudo-viral particles, toxin, beads, adjuvantsellipsis) as tools for cancer vaccines. Immunol Lett. 74(1), 45-50.
135. Bocci V. Mistletoe (Viscum album) lectins as cytokine inducers and immunoadjuvant in tumor therapy. A review. 1993. J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 7(1), 1-6.
136. Hajto Т., Hostanska K., Gabius H.J. 1989. Modulatory potency of the beta-galactoside-specific lectin from mistletoe extract (Iscador) on the host defense system in vivo in rabbits and patients. Cancer Res. 49(17), 4803-4808.
137. Schumacher U., Feldhaus S., Mengs U. 2000. Recombinant mistletoe lectin (rML) is successful in treating human ovarian cancer cells transplanted into severe combined immunodeficient (SCID) mice. Cancer Lett. 150(2), 171-175.
138. Weber K., Mengs U., Schwarz Т., Hajto Т., Hostanska K., Allen T.R., Weyhenmeyer R., Lentzen H. 1998. Effects of a standardized mistletoepreparation on metastatic В16 melanoma colonization in murine lungs. Arzneimittelforschung. 48(5), 497-502.
139. Franz H. Mistletoe lectins and their A and В chains. 1986. Oncology.43 Suppl. 1, 23-34.
140. Fritz P., Dippon J., Kierschke Т., Siegle I., Mohring A, Moisa A., Murdter Т.Е. 2004. Impact of mistletoe lectin binding in breast cancer. Anticancer Res. 24(2C), 1187-1192.
141. Stirpe F., Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. 1982. Action of viscumin, a toxic lectin from mistletoe, on cells in culture. J. Biol. Chem. 257(22), 13271-13277.
142. Ribereau-Gayon G., Jung M.L., Frantz M, Anton R. 1997. Modulation of cytotoxicity and enhancement of cytokine release induced by Viscum album L. extracts or mistletoe lectins. Anticancer Drugs. 8 Suppl. 1, S3-8.
143. Barbieri L., Ciani M., Girbes Т., Liu W.Y., Van Damme E.J., Peumans W.J., Stirpe F. 2004. Enzymatic activity of toxic and non-toxic type 2 ribosome-inactivating proteins. FEBS Lett. 563(1-3), 219-222.
144. GIeeson P. A., Hughes R.C. 1985. Binding and uptake of the toxic lectin modeccin by baby hamster kidney (BHK) cells. Isolation of mutants defective in the internalization of modeccin. J. Cell Sci. 76,283-301.
145. Olsnes S, Sandvig K, Eiklid K, Pihl A. 1978. Properties and action mechanism of the toxic lectin modeccin: interaction with cell lines resistant to modeccin, abrin, and ricin. J. Supramol. Struct. 9(1), 15-25.
146. Wang B.Z., Zou W.G., Liu W.Y., Liu X.Y. 2006. The lower cytotoxicity of cinnamomin (a type II RIP) is due to its B-chain. Arch. Biochem. Biophys. 451(1), 91-96.
147. Logemann J., Schell J., Willmitzer L. 1987. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163(1), 16-20.
148. Huguet Soler M., Stoeva S., Schwamborn C., Wilhelm S„ Stiefel Т., Voelter W. 1996. Complete amino acid sequence of the A chain of mistletoe lectin I. FEBS Lett. 399(1-2), 153-157.
149. Soler M.H., Stoeva S., Voelter W. 1998. Complete amino acid sequence of the В chain of mistletoe lectin I. Biochem. Biophys. Res. Commun. 246(3), 596-601.
150. Lin Z., Zhu Y., Cui X., Li H. 1995. Single-site polymerase chain reaction through single oligonucleotide ligation. Anal. Biochem. 231(2), 449-452.
151. Frohman M.A., Dush M.K., Martin G.R. 1988. Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85(23), 8998-9002.
152. Dellaporta S.L., Wood J. and Hicks J.B. 1983. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1,19-21.
153. Diviacco S., Norio P., Zentilin L., Menzo S., Clementi M., Biamonti G., Riva S., Falaschi A., Giacca M. 1992. A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by coamplification of competitive templates. Gene. 122(2), 313-320.
154. Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Егорова С.Г., Колесанова Е.Ф., Агапов И.И., Солопова О.С., Зайцев И.З., Тоневицкий А.Г. 2000. Разворачивание А-субъединицы вискумина в ходе внутриклеточного транспорта токсина. Молекуляр. биология 34(1), 152-159.
155. Eck J., Langer М., Mockel В., Baur A., Rothe М., Zinke Н., Lentzen Н. 1999. Cloning of mistletoe lectin gene and characterization of the recombinant A-chain. Eur. J. Biochem. 264,775-784.
156. Sweeney E.C., Tonevitsky A.G., Palmer R.A., Niwa H., Pflueller U., Eck J., Lentzen H., Agapov I.I., Kirpichnikov M.P. 1998. Mistletoe lectin I forms a double trefoil structure. FEBSLett. 432, 367-370.
157. Niwa H., Tonevitsky A.G., Agapov I.I., Saward S., Pftiller U., Palmer R.A. 2003. Crystal structure at 3 A of mistletoe lectin I, a dimeric type-II ribosome-inactivating protein, complexed with galactose. Eur. J. Biochem. 270(13), 27392749.
158. Roberts L.M., Lord J.M. 2004. Ribosome-inactivating proteins: entry into mammalian cells and intracellular routing. Mini Rev. Med. Chem. 4(5), 505-512.
159. Simpson J.C., Lord J.M., Roberts L.M. 1995. Point mutation in hydrophobic C-terminal region of ricin A chain indicate that P250 plays a key role in membrane translocation. Eur. J. Biochem. 232,458-463.
160. Jolliffe N.A., Di Cola A., Marsden C.J., Lord J.M., Ceriotti A., Frigerio L., Roberts L.M. 2006. The N-terminal ricin propeptide influences the fate of ricin A-chain in tobacco protoplasts. J. Biol. Chem. 281(33), 23377-23385.
161. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol. 340(4),783-795.
162. Messing J. 2001. Do plants have more genes than humans? Trends Plant Sci. 6(5), 195-196.195.0'Hare M., Roberts L.M., Thorpe P.E., Watson G.J., Prior В., Lord J.M. 1987. Expression of ricin A chain in Escherichia coli. FEBS Lett. 216(1), 73-78.
163. Hegde R., Podder S.K. 1992. Studies on the variants of the protein toxins ricin and abrin. Eur. J. Biochem. 204(1), 155-164.
164. Evensen G., Mathiesen A., Sundan A. 1991. Direct molecular cloning and expression of two distinct abrin A-chains. J. Biol. Chem. 266(11), 6848-6852.
165. Yang Q., Liu R.S., Gong Z.Z., Liu W.Y. 2002. Studies of three genes encoding Cinnamomin (a type II RIP) isolated from the seeds of camphor tree and their expression patterns. Gem. 284(1-2), 215-223.
166. Wacker R., Stoeva S., Pfuller K., Pfuller U., Voelter W. 2004. Complete structure determination of the A chain of mistletoe lectin III from Viscum album L. ssp. album. J. Pept. Sci. 10,138-148.
167. Wacker R., Stoeva S., Betzel C., Voelter W. 2005. Complete structure determination of N-acetyl-D-galactosamine-binding mistletoe lectin-3 from Viscum album L. album. J. Pept. Sci. 11,289-302.
168. Hegde R., Podder S.K. 1997. A- and B-subunit variant distribution in the holoprotein variants of protein toxin abrin: variants of abrins I and III have constant toxic A subunits and variant lectin В subunits. Arch. Biochem. Biophys. 344(1), 75-84.
169. Lin Q., Chen Z.C., Antoniw J.F., White R.F. 1991. Isolation and characterization of a cDNA clone encoding the anti-viral protein from Phytolacca americana. Plant. Mol. Biol. 17(4), 609-614.
170. Richardson P.T., Hussain K„ Woodland H.R., Lord J.M., Roberts L.M. 1991. The effects of N-glycosylation on the lectin activity of recombinant ricin В chain. Carbohydr Res. 213,19-25.
171. Eck J., Langer M., Mockel В., Witthohn K., Zinke H., Lentzen H. 1999. Characterization of recombinant and plant-derived mistletoe lectin and their B-chains. Eur. J. Biochem. 265, 788-797.
172. Певзнер И.Б., Агапов И.И., Пфюллер У., Пфюллер К., Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Тоневицкий А.Г., Кирпичников М.П. 2005. Клонирование и экспрессия В-субъединицы токсического лектина омелы III. Биохимия. 70, 378-389.
173. Hussain K., Bowler C., Roberts L.M., Lord J.M. 1989. Expression of ricin В chain in Escherichia coli. FEBSLett. 244, 383-387.
174. Wu J.H., Singh Т., Неф A., Wu A.M. 2005. Carbohydrate recognition factors of the lectin domains present in the Ricinus communis toxic protein (ricin). Biochimie. 88, 201-217.
175. Tahirov Т.Н., Lu Т.Н., Liaw Y.C., Chen Y.L., Lin J.Y. 1995. Crystal structure of abrin-a at 2.14 A. J. Mol. Biol. 250,354-367.
176. Chambery A., Di Maro A., Monti M.M., Stirpe F., Parente A. 2004. Volkensin from Adenia volkensii Harms (kilyambiti plant), a type 2 ribosome-inactivating protein. Eur. J. Biochem. 271,108-117.
-
Сударкина, Ольга Юрьевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2007
-
ВАК 03.00.03
- Гуморальный иммунный ответ на токсины из омелы белой (Viscum album)
- Рибосом-инактивирующие белки II типа из омелы: клонирование, экспрессия и структурно-функциональные свойства
- Активация сигнальных процессов в клетках под действием лектинов
- Особенности внутриклеточного транспорта растительных токсинов, используемых в составе иммунотоксинов
- Свойства моноклональных антител к меланоме кожи человека и иммунотоксинов на их основе
