Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние векторной составляющей на цитотоксическую активность и внутриклеточный транспорт конъюгатов, содержащих каталитическую субъединицу рицина

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Венедиктова, Ольга Алексеевна

Список сокращений

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Современные представления о плазматических 9 мембранах. Многообразие внутриклеточных путей.

1.2 Внутриклеточный транспорт рицина.

1.3 Эпидермальный фактор роста и трансферрин

1.4 Рецепторы эпидермального фактора роста и 26 трансферрина.

1.5 Внутриклеточный транспорт TFR и EGFR.

1.6 Современные подходы к синтезу и использованию 39 препаратов направленного действия.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние векторной составляющей на цитотоксическую активность и внутриклеточный транспорт конъюгатов, содержащих каталитическую субъединицу рицина"

Конъюгаты, содержащие каталитическую субъединицу рибосоминактивирующего белка (РИБ) рицина и векторную молекулу, представляют собой препараты направленного действия, способные к избирательной элиминации клеточных популяций. Это одна из возможных реализаций концепции «магической пули», предложенной Паулем Эрлихом еще на рубеже 18 и 19 столетий. В настоящее время достигнуты определенные успехи в применении конъюгатов на основе РИБ при терапии лейкозов, а также в качестве специфических иммунодепрессантов в трансплантологии. Однако современный уровень реализации концепции не позволяет широко применять препараты этой группы в клинической практике. Несмотря на кажущуюся легкость создания и применения таких терапевтических агентов, пока не создано препарата, который являлся бы абсолютно эффективным при лечении онкологических заболеваний. Причина неудач кроется в недостаточном понимании механизмов взаимодействия конъюгатов, содержащих фрагменты РИБ, с клетками-мишенями. Интоксикация клеток такими молекулами - сложный многоступенчатый процесс, в ходе которого молекула токсина вступает во взаимодействие с различными клеточными структурами. Опубликовано много работ о внутриклеточном транспорте различных РИБ и рицин является одной из наиболее изученных молекул, однако существует мало данных, отражающих внутриклеточный транспорт конъюгатов, содержащих субъединицы РИБ. Связывающая субъединица рицина (RTB) не только обуславливает взаимодействие молекулы с поверхностью клетки, но и направляет ее в клеточные компартменты, откуда происходит транслокация каталитической субъединицы (RTA) в цитозоль, в результате чего RTA достигает своей клеточной мишени - рибосомы. Взаимодействие RTA с рибосомой приводит к остановке синтеза белка и гибели клетки. Замена векторной составляющей не только меняет специфичность связывания с поверхностными рецепторами, но и оказывает влияние на взаимодействие интернализуемой молекулы с клеточными структурами, что может приводить к доставке конъюгата в компартменты, из которых затруднена транслокация. Особый интерес представляют данные сравнительного анализа внутриклеточного пути и биологической активности рицина и его структурного и функционального аналога - вискумина (MLI) [Krauspenhaar et al, 1999]. Активность каталитической субъединицы вискумина (MLA) в бесклеточной системе сопоставима с активностью RTA [Barbieri et al, 1993]. Связывающая субъединица вискумина (MLB) отличается от RTB пространственной организацией галактозсвязывающих центров, что приводит к существенным различиям в цитотоксической активиости и внутриклеточном транспорте рицина и вискумина [Moisenovich et al, 2002].

Сравнительный анализ внутриклеточного транспорта пативиого рицина и различных конъюгатов на основе RTA позволит получить информацию о роли векторной части РИБ и их производных в интоксикации клетки. Эта информация необходима для создания нового поколения препаратов направленного действия, обладающих высокой специфической цитотоксической активностью и незначительными побочными действиями при клиническом применении.

Цель и задачи работы: Целью данного исследования является проведение сравнительного анализа транспорта и цитотоксической активиости конъюгатов RTA с векторными молекулами, использующими разные внутриклеточные пути

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы дополнительной очистки и контроля чистоты препаратов субъединиц рицина.

2. Синтезировать и провести очистку конъюгатов трансферрин-RTA (TF-RTA), эпидермальный фактор роста-RTA (EGF-RTA), а также химерных молекул MLB-RTA, RTB-MLA.

3. Провести сравнительный анализ внутриклеточного транспорта EGF, трапсферрина, рицина и вискумина.

4. Оценить цитотоксическую активность TF-RTA, EGF-RTA, MLB-RTA, RTB-MLA, а также нативных молекул рицина и вискумина.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведен сравнительный анализ цитотоксической активности конъюгатов RTA с векторными молекулами, определяющими ее доставку в различные клеточные компартменты. Показано, что наибольшей цитотоксической активностью обладали коныогаты, содержащие вектор, который направляет RTA в компартмент, вовлеченный в транспорт основного пула нативного рицина. Полученная информация важна для разработки дизайна иммунотоксинов нового поколения. Синтезированные коныогаты EGF-RTA и TF-RTA представляют собой потенциальные терапевтические агенты.

Нами показано, что рицин влияет на внутриклеточный транспорт EGF, снижая процент молекул, попадающих в лизосомы.

Совместно с к.б.н. Е.Н. Поповой получена серия моноклональных антител, дискриминирующих изолированную каталитическую субъединицу рицина от нативного токсина. На основе этих антител разработана тест-система, позволяющая выявлять нанограммовые количества RTA в присутствие нативного рицина.

Разработаны методы дополнительной очистки компонентов цитотоксически-активных конъюгатов, позволяющие в дальнейшем минимизировать побочные эффекты при применении их в терапии онкологических заболеваний.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Венедиктова, Ольга Алексеевна

Выводы.

1) Дополнительная аффинная очистка связывающей субъединицы рицина позволила получить препараты RTB, пригодные для сравнительного анализа транспорта RTB с другими векторными молекулами.

2) Был получен препарат RTA, не содержащий минорных примесей RTB и не обладающий цитотоксической активностью при концентрации 10"7 М.

3) Сравнительный анализ внутриклеточного распределения векторных молекул и токсинов выявил существенные различия в транспорте TF и R60; при этом наблюдался высокий уровень колокализации EGF и R60.

4) На клетках линии А431 при взаимодействии с клеточными структурами рицин и вискумин проявляют специфичность, которая выражается в их ассоциации с разными доменами плазматической мембраны и эндосомального компартмента.

5) Цитотоксическая активность RTA в составе исследованных конъюгатов и химерных молекул зависит от особенностей внутриклеточного транспорта векторной части.

6) Наибольшей цитотоксической активностью обладали конъюгаты, содержащие векторную составляющую, которая обуславливает доставку RTA в компартмент, вовлеченный в транспорт основного внутриклеточного пула R60.

Заключение.

Рицин способен проникать в клетку не только путем клатрин-зависимого эндоцитоза, но и клатрин-независимым путем (рис.5). Разнообразие способов интернализации рицина определяется разнообразием рецепторов, с которыми рицин может связываться благодаря своей лектиновой активности. После интернализации токсин обнаруживается в ранних эндосомах, куда он может направляться как из клатрин-окаймленных везикул, в случае клатрин-зависимого способа интернализации, так и из кавелосом, в случае клатрин-независимого захвата участка мембраны с иммобилизованным токсином кавеолами.

Затем рицин может либо вернуться на поверхность клетки с помощью ранних эндосом, либо быть доставлен в поздние эндосомы или в транс-Гольджи сеть. Приблизительно 5% интернализовавшегося токсина

1,2,3 - >ндоц1гто1

4 - pi НН 111*1 шлосомвльный

КТ)М111|ТТМГМГ

5 - неримуклеармый ришклинговый комлартиент

6 - поишм эндосомы

7 - .ihjocovih

8 - япсирпт Гольджи

9 - эндмиапиитический рстнкулум

10 -ялро

Рис. 5 Основные этапы внутриклеточного транспорта рицина (красные стрелки), TF (синие стрелки) и EGF (зеленые стрелки) пояснения в тексте). обнаруживается в А Г и затем ретроградным транспортом направляется в эндоплазматический ретикулум, откуда транслоцируется в цитозоль.

Так называемые «грузовые (карго)» белки, к которым относятся EGF и TF, сортируются для дальнейшего транспорта тремя путями: быстрым рециклингом к клеточной поверхности [Sheff et al, 2002], медленным рециклингом через перинуклеарный рециклинговый компартмент и сеть транс-Гольджи, а также в лизосомы через поздние эндосомы (рис.5).

Комплекс, состоящий из трансферрина, присоединенных к нему двух атомов железа и TFR интернализуется в клетку путем клатрин-зависимого эндоцитоза и сначала вступает в клатрин-окаймленные ямки, а затем движется через ранние эндосомы. При низких значениях рН в эндосомах происходит процесс отщепления атомов железа, при этом связь TF-TFR сохраняется. Через аппарат Гольджи проходит 2025% этого комплекса. Затем TF направляется либо к поздним эндосомам, либо в (перинуклеарные рециклинговые эндосомы или аппарат Гольджи). Большая часть интернализованного трансферрина подвергается рециклингу и удаляется из клетки. Приблизительно 65-70% TF-TFR после диссоциации атомов железа напрямую возвращается на поверхность клетки.

Комплекс EGF-рецептор интернализуется как клатрин-зависимым, так и клатрин-независимыми путями (рис.5). После интернализации комплекс рецептор-лиганд доставляются в ранние эндосомы, расположенные на периферии цитоплазмы, которые участвуют в регуляции транспорта между плазматической мембраной и различными внутриклеточными компартментами. Оттуда EGF через специфический рециклинговый компартмент частично возвращается на поверхность плазматической мембраны. Однако, основная его часть гидролизуется в лизосомах.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1 Материалы.

Сухие культуральные среды RPMI-1640, ДМЕМ, (Gibco Laboratories, Германия); Bodipy-ceramide, А1еха568, LysoTraker (Molecular Probes, Leiden, Нидерланды); конъюгат кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой, конъюгат стрептавидина с пероксидазой (ИМТЕК, Россия); Sephadex G-25, протеин-А-сефароза, BrCn-активированная сефароза 4В (LKB-Pharmacia, Uppsala, Швеция (Pharmacia, Sweden), рицин и вискумин (ML1) были любезно предоставлены профессором А. Г. Тоневицким (Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО), Москва). Культуральная пластиковая посуда (Nunc, Дания и Costar, США); полистироловые 96-луночные платы для твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) (Costar, США). Мышиные моноклональные антитела серии RAK и монАт 2RBK1 были получены нами совместно с к.б.н. Е.Н. Поповой. Остальные реактивы были получены от Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Германия.

2.2 Методы.

2.2.1. Клеточные линии.

Клетки фибробластов линии NIH ЗТЗ, клетки эпидермальной карциномы человека линии А431, HeLa (эпителиоидной карциномы шейки матки человека) и CaOv (рака яичника человека) были любезно предоставлены профессором Ю. Бирайтером-Ханом (Университет им. Гете, Франкфурт-на-Майне, Германия). Клетки культивировали при 37°С в присутствии 6.1% СОг в пластиковых флаконах в среде DMEM, содержащей 10% СПК. Клетки миеломы линии sp2/0 были любезно предоставлены с.н.с. Е. Р. Полосухиной (Институт Канцерогенеза, Москва). Клетки культивировали при 37°С в присутствии 6.1% С02 в пластиковых флаконах в среде RPMI-1640, содержащей L-глутамин, 0.2% ЫаНСОз, 80 мкг/мл сульфата гентамицина, 10% СПК.

2.2.2 Получение гибридом.

Мышей линии Balb/c (НИИ биомоделей РАМН, Россия) иммунизировали RTA последующей схеме: 0 день - RTA 5мкг в полном адъюванте Фрейнда; 14 день - RTA 5 мкг в неполном адыованте Фрейнда; 22 день - RTA 5 мкг в ФСБ; 29 день - RTA 5 мкг в ФСБ; 57 день - RTA 2 мкг в ФСБ. Титр антител в сыворотках контролировали при помощи ТИФА. Слияние спленоцитов с миеломой линии sp2/0 проводили на третий день после последней иммунизации в ПЭГ [Davidson R.L. et al., 1977]. Первичные гибридомы культивировали на среде RPMI 1640 в присутствии HAT. В качестве дополнительного селективного фактора для отбора устойчивых к рицину гибридом в среду добавляли 10"11 М R60. Через две недели после слияния отбирали культуральную жидкость для выявления в ней активности антител. Супернатанты скринировали при помощи ТИФА с биотинилированными R60, RTA (R60-bi, RTA-bi). Культуры, представляющие интерес, были клонированы методом лимитирующих разведений, размножены и заморожены. Затем были отобраны гибридомы, взаимодействующие с RTA-bi, но не с R60-bi. Эти гибридомы многократно клонировали методом лимитирующих разведений. МАт накапливали в асцитной жидкости и выделяли методом аффинной хроматографии на протеин-А-сефарозе.

2.2.3 Системы ТИФА.

2.2.3.1 Твердофазный иммуноферментпый анализ для определения реакции антител с биотинилированными антигенами.

Очищенные моноклональные антитела в ФСБ иммобилизовали в лунках 96-луночной платы (по 1мкг в лунку) в течение 2-х часов при 37°С. Для иммобилизации антител из сывороток или супернатантов использовали платы, предсенсибилизированные кроличьими антителами против иммуноглобулинов мыши. В лунки, содержащие иммобилизованные антитела добавляли на 60 минут биотииилированные антигены в ФСБ/ 0.05%(V/V) Твин-20/ 25мМ a-D-лактозы. После удаления биотинилированных антигенов в лунки вносили конъюгат стрептавидин-пероксидаза в ФСБ/ 0.05%(V/V) Твин-20 и инкубировали 60 мин. Все инкубации проводили при 37°С. В качестве хромогенного маркера пероксидазной реакции использовали 0.5 мг/мл ОФД в в 0.05 М цитрат-0.1 М фосфатном буфере (рН 5.0-5.5), содержащем 0.5% Н2Ог. После 15-минутной инкубации при 37°С реакцию останавливали 10%-ной серной кислотой. Калориметрические измерения проводили на униплане «Пикон» при длине волны 492 нм.

2.2.3.2. Сэндвич-ТИФА для выявления свободной каталитической субъединицы рицина.

Очищенные моноклональные антитела иммобилизовали в лунках 96-луночной платы, оставшиеся на плате активные сайты связывания блокировали БСА. В лунки, содержащие иммобилизованные антитела добавляли на 60 минут антигены (R60, RTA) в ФСБ/ 0.05%(V/V) Твин-20/ 25мМ a-D-лактозы. После удаления антигенов в лунки вносили вторые биотииилированные монАт (1мкг/мл в ФСБ/ 0.05%(V/V) Твин-20/ 25мМ a-D-лактозы) и инкубировали 60 мин. После удаления биотинилированных антител проводили 60-минутную инкубацию с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза в ФСБ/ 0.05%(V/V) Твин-20. В качестве хромогенного маркера пероксидазной реакции использовали 0.5 мг/мл ОФД в в 0.05 М цитрат-0.1 М фосфатном буфере (рН 5.5), содержащем 0.5% Н2О2. Все инкубации проводили при 37°С. После 15-минутной инкубации при 37°С реакцию останавливали 10%-ной серной кислотой. Калориметрические измерения проводили па униплане «Пикон» при длине волны 492 нм.

2.2.4 Биотинилирование белков.

Белки (R60, RTA, мАт) копъюгировали с биотинамид-N-гидросукцинимидным эфиром в соответствии с рекомендациями производителей («Sigma»,США). Биотинамид-Ы-гидросукцинимидиый эфир растворяли в ДМСО (10мг/мл) и добавляли к белкам, находящимся в ФСБ или, в случае R60 и RTA, в ФСБ с 20мМ лактозой, и инкубировали в течение 15 часов при +4°С. Концентрация белков составляла не менее 0,3мг/мл, молярное соотношение белок/биотин -1/20. Реакцию останавливали 0,01% NaN3. Белки очищали от несвязавшегося биотинамид-М-гидросукцинимидного эфира с помощью гельфильтрации на Sephadex G25. Белок элюировали с колонки ФСБ. Качество биотинилирования оценивали с помощью ТИФА.

2.2.5 Очистка моноклональпых антител (мАт).

Очистку мАт проводили на протеин-А-сефарозе. Асцитную жидкость центрифугировали 10 мин со скоростью 10 тыс об/мин. К супернатаиту добавляли равный объем 3 М глицина (рН 9.2) и сухой хлорид натрия NaCl до 3 М, суспендировали и центрифугировали 10 мин со скоростью 10 тыс об/мин. Полученный супериатант наносили па колонку с протеин-А-сефарозой, уравновешенную связывающим буфером (рН 9.0),

48 содержащим 1.5 М глицин и 3 М NaCl, и промывали этим же буфером до 0.3 оптических единиц (о.е.). Элюцию антител с колонки проводили в два этапа: сначала элюирующим буфером I (рН 6.8), содержащим 0.03 М Трис и 0.01 М NaCl, до 0.5 о.е., а затем - элюирующим буфером II рН (3.0), содержащим 0.1 М цитрат натрия и 0.15 М NaCl, до 0.3 о.е. Нейтрализацию рН элюирующего буфера II проводили с помощью 1 М Трис (рН 8.8). После элюции колонку последовательно отмывали 10-кратным объемом ФСБ (рН 7.4), 3-кратным объемом регенерирующего буфера (рН 7.2), содержащего 2 М гуанидин-HCl и 0.1 М Трис, и уравновешивали 8-кратным объемом связывающего буфера (рН 9.0), содержащего 1.5 М глицин и 3 М NaCl. Чистоту полученных фракций контролировали с помощью электрофореза в ПААГ. Фракции мАт, не содержащие примеси, объединяли и диализовали против ФСБ.

2.2.6 Иммобилизация мАт 2RBK1 на BrCN-активироваппую сефарозу 4В.

Иммобилизация антител проводилась согласно рекомендациям фирмы-производителя аффинного сорбента (Pharmacia Biotech, USA). BrCN-активированную сефарозу 4В (1мг) замачивали в Змл 1мМ НС1 на 15мин. Набухший сорбент "отмучивали" в 1мМ НС1 3 раза по 15 мин. 700 мкл (8мг/мл) мАт 2RBK1 в 0,1М гидрокарбонатном буфере, содержащем 0,5М NaCl, рН 9,0, смешивали с подготовленным сорбентом и инкубировали в течение 16 часов при комн. температуре на «качалке». Сорбент переносили в колонку и промывали 10 объемами 0,2М глицина, рН 8,0 для блокировки свободных имидокарбонатных групп. Раствор, выходящий с колонки, собирали фракциями по 1,5мл и оценивали количество неиммобилизовавшихся мАт спектрофотометрически. Сорбент несколько раз промывали попеременно ацетатным (0,1М ацетат натрия с рН 4,0, содержащий 0,5М хлорид натрия) и карбонатным (буфер для иммобилизации антител) буферами. Далее колонку промывали 10 объемами ФСБ с ЫаЫз и хранили в таком виде при +4°С.

2.2.7Дополнительная очистка RTA.

Дополнительную очистку цепей R60 проводили методом аффинной хроматографии. RTA очищали на 2RBKl-ceфapoзe 4В. Для дополнительной очистки RTB использовали сорбент на основе монАт 1RAK3. Связывание примесных белков с сорбентом проводили в ФСБ с 20мМ лактозой, рН 7,4, элюцию - в 0.2 М глициновом буфере, содержащем 1.5М NaCl, рН2.2. Чистоту полученных препаратов контролировали с помощью электрофореза в ПААГ и ТИФА.

2.2.8 Клеточные лизаты и супернатанты.

Клетки инкубировали 2 минуты в присутствии рицина. После чего трижды отмывали от несвязавшегося токсина и инкубировали 20 часов в СОг-инкубаторе. Затем супернатанты отбирали, а к клеткам добавляли лизирующий буфер из расчета 1 мл буфера на 106 клеток. Использовали лизирующий буфер следующего состава: 0,1М NaCl, ЮмМ Na2HP04, 1% Triton Х-100 и 1мМ PMSF, рН 7,4. Лизаты центрифугировали Юмин при 5000 об/мин и хранили при -20° С. Перед экспериментром лизаты разводили в 100 раз в ФСБ. Супернатанты при необходимости концентрировали в ячейке фирмы "Amicon" с фильтром РМ-10.

2.2.9 Трансфекция клеток линий Л431.

Для трансфекции использовали плазмидный вектор pEGFP СЗ, кодирующие белки rab4a, rab 11, включающий гены TRPV4 и GFP, находящиеся под одним опероном, (конструкция была предоставлена профессором Берейтер-Ханом) и набор Effectene Transfection Kit, состоящий из буфера ТЕ (рН 7-8), ДНК-конденсирующего буфера ЕС, энхансера (усиливающего агента), трансфекционного реагента Effectene.

За день до трансфекции на пластиковую чашку Петри диаметром 60 мм перенесли от 200 до 800 тыс. клеток А431 в 5 мл среды DMEM, содержащей 10% сыворотка FBS, так, чтобы в день трансфекции на чашке было 40-80% монослоя. Для трансфекции 1 мкг ДНК, растворённой в буфере ТЕ (рН 7-8), развели в ДНК-конденсирующем буфере ЕС до общего объёма 150 мкл. К полученной смеси добавили 8 мкл энхансера, интенсивно перемешали в течении 1 сек и инкубировали 2-5 мин при комнатной температуре. Затем добавили 25 мкл трансфекционного реагента Effectene к смеси ДНК-энхансер и перемешали пипетированием 5 раз. Для образования трансфекциопных комплексов образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 5-10 мин. Во время данной инкубации из чашки Петри аккуратно отобрали среду культивирования, отмыли клетки 1 раз в 4 мл PBS (рН 7.4) и добавили к ним 4 мл свежей среды DMEM, содержащей 10% сыворотки FBS. В пробирку с трансфекционными комплексами добавили 1мл среды DMEM (10% FBS), перемешали 2 раза пипетированием и по каплям добавили полученную смесь к клеткам, находящимся в чашке Петри. Инкубировали 24 часа при 37°С в присутствии 6.1% С02.

Эффективность трансфекции клеток А431 составила 5%. Для увеличения количества гаЬ4- и rabl 1-позитивных клеток применяли культивирование на селективных средах с последующим отбором положительных клонов. После 30 дней культивирования на среде, содержащей 1 мг/мл G418 количество клеток, экспрессирующих гаЬ4 и rabl 1 составляло более 20% для обоих белков. Клетки культивировали на пластиковых флаконах в низкой плотности таким образом, что после 5 дней культивирования образовывались отдельшле клоны. Клон, дающий наиболее сильный положительный сигнал, целиком извлекли из флакона и пересадили в селективной среде DMEM (10% FBS, 1мг/мл G418) в новый флакон.Полученную клеточную линию А431 с 80% экспрессией клетками TRPV4-GFP использовали для дальнейшей работы.

2.2.10 Электрофорез в ПЛАГ.

Электрофорез проводили по методике, описанной ранее [Laemmli U.K., 1970]. 5-20 мкг белка растворяли в буфере, содержащем 0.125М Трис-НС1(рН6.8), 4% додецилсульфата Na, 20% глицерина, 10% 2-меркаптоэтанола, бромфеноловый синий, и кипятили 2 мин. Для проведения электрофореза в невосстанавливающих условиях образцы готовили в буфере, не содержащем меркаптоэтанол. Электрофорез проводили в 8 % или 12 % полиакриламидном геле (ПААГ), применяли пластины длиной 8 см и толщиной 0.75 мм. В катодный и анодный электродные резервуары заливали электродный буфер (рН 8.3), содержащий 25 мМ Трис, 192 мМ глицин и 0.1 % додецилсульфата натрия. Молекулярные массы определяли в сравнении с маркерными белками. Электрофорез проводили в режиме постоянного тока: 10 мА при вхождении образца в гель и 15 мА в режиме разделения. После окончания электрофореза гель окрашивали 0.125% (в/о) раствором Кумасси R-250 в системе этанол/уксусная кислота/вода (50/10/40) в течение 60 мин и обесцвечивали в системе этанол/уксусная кислота/вода (5/7/88).

2.2.11 Конъюгаты EGF-RTA и TF-RTA.

Коныогаты получали по методике, описанной ранее [Carlsson et al, 1978], с использованием бифункционального реагента N-сукципимидил-3(2-пиридилтио-)пропионата (СПДП). Очистку полученных конъюгатов от несвязавшихся реагентов проводили гельфильтрацией на колонке Spherogel TSK 3000SW. Степень очистки проверяли с помощью электрофореза в ПААГ.

2.2.12 Получение конъюгатов трансферрина (Тф), epidermal growth factor (EGF), рицина и его субъединиц с различными флуорохромами.

Конъюгация с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Сухой ФИТЦ разводили в ДМСО до концентрации 100 мг/мл. Белки (Тф, EGF, R60) переводили в карбонатный буфер (рН 9.0), содержащий 1 М NaHC03, 20 мМ лактозу (в случае R60 и RTA), и концентрировали до содержания 2 мг/мл. Затем смешивали растворы белка в карбонатном буфере и ФИТЦ в ДМСО так, чтобы получился 25-кратный молярный избыток ФИТЦа. Инкубировали с перемешиванием 24 ч при комнатной температуре. С помощью гель-фильтрации на колонке PD-10 с сорбентом Sephadex G-25 очищали пробы от несвязавшегося с белком ФИТЦ. Переводили белок в ФСБ (рН 7.4). Количество групп ФИТЦ, внесенных в одну молекулу белка, было оценено по следующей формуле:

Моль ФИТЦ/Моль белка = 2.87*ОП495/[ОП28о - ОП495*0.35]

Конъюгация с А1еха430, А1еха488, А1еха568. Для конъюгации использовали наборы Molecular Probes (Leiden, Нидерланды), в состав которых входят карбонатный буфер (рН 8.3), раствор гидроксиламина, колонка для гель-фильтрации, сосуд с А1еха430, А1еха488 или А1еха568, содержащий магнитную мешалку. Белок, растворенный в ФСБ (рН 7.4), концентрировали до содержания 2 мг/мл. К 0.5 мл раствора белка добавили 50 мкл карбонатного буфера (рН 8.3). Полученную смесь перенесли в сосуд с флуорохромом, содержащий магнитную мешалку. Инкубировали с перемешиванием 1 ч при комнатной температуре.

Реакцию останавливали 17 мкл раствора гидроксиламина. Инкубировали с перемешиванием 30 мин. С помощью гельфильтрации на колонке очищали пробы от несвязавшегося с белком красителя.

Количество групп А1еха568, внесенных в одну молекулу белка, было оценено по следующим формулам:

Моль А1еха568/Моль рицина = 1.85*ОП577/[ОП28о - ОП577*0.46],

Моль А1еха568/Моль вискумина = 2.22*ОП577/[ОП28о - 0п577*0.46]

В результате были получены следующие конъюгаты: Тф-ФИТЦ, EGF-ФИТЦ, ЯбО-ФИТЦ, Тф-А1еха568, EGF-Alexa568, R60-Alexa568, RTB-Alexa568, RTA-Alexa430, RTA-Alexa488.

2.2.13 Реассоциация субъединиц токсинов.

Химерный токсин получали с помощью реакции тиолдисульфидного обмена. Изолированную В-субьединицу рицина или вискумина инкубировали в присутствии 5 мМ реактива Эллмана -5,5' -дитиобис-2-нитробензойная кислота (ДТНБ,"Sigma", США) в течение 30 мин при комнатной температуре в ФСБ. Избыток реагента удаляли гель-фильтрацией на колонке PD-10 ("Pharmacia"). А-субьединицу вискумина или рицина предынкубировали в присутствии 10 мМ ДТТ в течение 30 мин при комнатной температуре, затем с помощью гель-фильтрации на колонке с Sephadex G25 удаляли избыток ДТТ. 'Модифицированные субъединицы токсинов смешивали и инкубировали в течение 16 ч. Выход гетеродимеров, состоящих из А-субьединицы вискумина и В-субьединицы рицина или А-субъединицы рицина и В-субъединицы вискумина составлял 80-90% от общего количества белка. Очистку полученного химерного димера от мономерных субъединиц токсинов проводили гель-фильтрацией на колонке Superdex-75 HR (10x300мм) в системе FPLC. Химерный токсин анализировали электрофорезом в ПААГ в присутствии ДДС-Na.

2.2.14 Цитотоксический тест.

Цитотоксическое действие токсинов определяли по выживаемости клеток в присутствии токсинов по методике, описанной ранее [Mossman et al., 1983]. Клетки гибридом, находящихся в логарифмической фазе роста, трижды отмывали от продуцируемых мАт холодной средой RPMI 1640, ресуспендировали в среде RPMI 1640 с 10% ЭТС и распределяли по лункам 96-луночного плейта из расчета 5x104 клеток в 100 мкл на лунку. Предварительно в лунки того же плейта помещали токсины в разных концентрациях в среде RPMI 1640 с 10% ЭТС по 100 мкл в лунку. Клетки с токсинами инкубировали в атмосфере, содержащей 6 % углекислого газа, при +37°С в течение 48 часов. По окончании инкубации клетки гибридом трехкратно отмывали от несвязавшегося токсина и в лунки вносили по 10 мкл раствора (2-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (МТТ) (5 мг/мл в ФСБ) и инкубировали при +37°С в течение 3 часов. После центрифугирования 96-луночного плейта (1200об/мин, ЗОмин), супериантную жидкость отбирали, осадок растворяли, добавляя в лунки по 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, « Sigma»). Колориметрические измерения проводили на униплане «Пикон» при 540 нм. Согласно методике величина оптической плотности прямо пропорциональна числу живых клеток [Mossman et al., 1983]. За контроль (100%) принимали интенсивность окрашивания клеток, которых культивировали в отсутствии цитотоксических агентов. Контрольными клетками в экспериментах по устойчивости новых гибридомных клеток к действию цитотоксических агентов служила линия sp2/0.

2.2.15 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

Для экспериментов клетки линии А431 так дикого типа, так и трансфецированные выращивали на покровных стеклах при 37°С в присутствии 6.1% СОг. Перед получением изображений клетки фиксировали 4%-параформальдегидом и заключали в Мовиол. Для наблюдения за живыми клетками и получения временных серий изображений клетки выращивали на покровных стеклах, заключали в камеры для наблюдения, наполненные средой DMEM, содержащей или не содержащей 10% СПК и забуференной HEPES. В процессе получения изображений живых клеток их содержали в инкубационной камере микроскопа при 37°С в присутствии 6.1% СОг- Цифровые изображения были получены с помощью микроскопа Axiovert 200М, оборудованного конфокальной сканирующей приставкой LSM51 ОМЕТА Zeiss, Германия. Серии оптических срезов получали либо с одного из каналов, либо синхронно с двух. Установку размеров pinhole для получения изображений с высоким разрешением проводили согласно рекомендациям производителей системы, для получения временных серий pinhole был открыт полностью для достижения максимальной глубины резкости. Для деконволюции изображений и подсчета колокализации использовали программное обеспечение Imaris 1, Imaris 3 и «Huygens» (Bitplane, Zurich, Швейцария). Дальнейшую обработку проводили с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop 7.0.

Для полуколичественного анализа на изображении выделяли объекты, размеры которых превосходили 50 пикселей. Такие объекты интерпретировались как отдельные везикулы. Эта операция осуществлялась как для канала детектирующего изображение, обусловленное флуоресцентным сигналом, детектируемым от ФИТЦ (или GFP), так из канала, детектирующего флуоресцентный сигнал от Алекса 568. Считалось, что везикула содержит оба лиганда, если количество пикселей, полученных с каждого канала превышало 30% от общего числа пикселей. Данную процедуру проводили для каждого оптического (среза) слайда в конечном результате получали процент везикул содержащих оба лиганда.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

Одной из основных причин, по которой не удается создать иммунотоксин со свойствами «магической пули», является отсутствие векторных молекул, дискриминирующих в организме опухолевые клетки от клеток нормальных тканей. Одна из основных тенденций при конструировании современных иммунотоксинов - это уменьшение их молекулярной массы, что с одной стороны позволяет проникать токсинам в солидные опухоли, через межтканевые барьеры, а с другой стороны выводит иммунотоксины из-под действия иммунной системы. Как правило, такие иммунотоксины содержат один антиген-связывающий центр, вследствие чего их специфичность определяется специфичностью моновалентного взаимодействия антиген-связывающего центра с антигенной детерминантой. При этом взаимное расположение детерминант не влияет на сродство вектор-мишень, в то время как нативные токсины за счет поливалентного связывания обладают специфичностью к супрамолекулярным структурам. Конструирование векторных молекул с учетом различий в пространственном расположении детерминант является одним из путей создания высокоэффективных иммунотоксинов нового поколения. Интоксикация клетки-мишени РИБ или химерными молекулами, содержащими фрагменты РИБ - сложный многоэтапный процесс [Di Cola et al, 2005]. Финальной стадией этого процесса является взаимодействие каталитической субъединицы токсина с внутриклеточной мишенью - рибосомой. Этому взаимодействию предшествует многоступенчатый ретроградный транспорт цитотоксического агента [Iversen et al., 2001; Sandvig et al., 2000, Liu et al, 2006]. Нами проведен сравнительный анализ внутриклеточного транспорта и цитотоксической активности конъюгатов RTA и векторных молекул, направляющих RTA в различные участки эндосомального компартмента. Основная часть экспериментов выполнена на клетках линии карциномы человека А431, которые характеризуются повышенным уровнем экспрессии EGF- и трансферрин-специфичных рецепторов [Zerial et al, 2001; Фильченков и др., 2000]. Для сравнительного анализа внутриклеточного транспорта использовали молекулы, меченные флуоресцентными красителями. Предыдущий опыт показал, что модификация молекулы флуоресцентным красителем способна влиять на внутриклеточный транспорт РИБ [Moisenovich et al., 2002]. Поэтому, предварительная часть экспериментов включала выявление влияния флуоресцентной метки на внутриклеточный транспорт и другие свойства молекулы, в том числе цитотоксическую и митогенную активности, а также способность модифицированной молекулы взаимодействовать со специфическими моноклональными антителами. Для дальнейших экспериментов отбирали только те фракции флуоресцентно меченых молекул, биологическая активность которых не отличалась от активности немеченых предшественников. Еще один фактор, который нам пришлось учитывать при проведении исследований - влияние сыворотки плода коровы на активность цитотоксических агентов. На рис. 6 представлена активность вискумина на клетках Sp2/0 при культивировании клеток в присутствии сыворотки Сс-pro (Германия) в сравнении с действием того же токсина на ту же линию клеток, но инкубированных в среде, содержащей сыворотку Gibco. Вероятно, подобная разница связана с неодинаковым соотношением ростовых факторов, определяемым технологическими особенностями приготовления сывороток. Все эксперименты по изучению цитотоксичности и транспорта проведены на сыворотке Gibco одного лота.

Сс-рго Gib go

-IgM

Рис. 6 Цитотоксическая активность вискумина на клетках Sp2/0 при использовании сывороток разных производителей.

3.1. Гибридомы, продуцирующие моноклоналыше антитела, дискриминирующие RTA от нативиого токсина.

При выращивании первичных гибридом в качестве дополнительного фактора селекции был использован рицин. В присутствии 10"ПМ рицина выживали только клетки гибридом, способные продуцировать специфические антитела. Это позволило нам облегчить процедуру скрининга. Дальнейший отбор гибридом осуществлялся с применением системы ТИФА. Наряду с другими устойчивыми к интоксикации рицином гибридомами, было получено 6 клонов, продуцирующих моноклональные антитела, взаимодействующие с А-субъединицей рицина, но не с цельным токсином. Возможность получения данных клонов обусловлена присутствием на поверхности RTA области площадью около 1600 A2 [Katzin et al, 1991], экранированной в составе

60 цельного токсина В-субъединицей. Кроме того, в этой области после диссоциации субъединиц рицина наблюдается частичное разворачивание полипептидной цепи, что способствует формированию уникальных эпитопов. Таким образом, наиболее вероятным местом локализации эпитопов, определяющих взаимодействие антител группы RAK с А-цепью рицина является область, расположенная в зоне контакта субъединиц.

Результаты цитотоксического теста показали, что клетки гибридом серии RAK являются более устойчивыми к действию рицина, чем клетки гибридом, не секретирующие антитела против этого токсина (табл. 1). Обладая устойчивостью к действию рицина, эти клетки сохраняют чувствительность к действию ML1 (табл. 1), который обладает сходным с R60 механизмом интоксикации клеток, но не связывается с антителами серии RAK. Таким образом, устойчивость гибридом серии RAK к действию R60 не связана с нарушением процессов ретроградного

Клетки ЛД50 для ML1 (нг/мл) ЛД50 для R60 (пг/мл) sp 2/0 0,8 0,2

1RAK3 0,9 120

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Венедиктова, Ольга Алексеевна, Москва

1. Agapov II, Tonevitsky AG, Moysenovich MM, Maluchenko NV, Weyhenmeyer R, Kirpichnikov MP. Mistletoe lectin dissociates into catalytic and binding subunits before translocation across the membrane to the cytoplasm. FEBS Lett, 1999, v. 452, 211-214

2. Agapov II, Tonevitsky AG, Shamshiev AT, Pohl E, Pohl P, Palmer RA, Kirpichnikov MP. The role of structural domains in RIP II toxin model membrane binding. FEBS Lett, 1997, v.402, 91-93

3. Aisen P., Listowsky I. Iron transport and storage proteins. Annu. Rev.Biochem., 1980,49, 357-93

4. Altmann SW, Davis HR Jr, Zhu LJ, Yao X, Hoos LM, Tetzloff G, Iyer SP, Maguire M, Golovko A, Zeng M. Niemann-Pick CI Like 1 protein is critical for intestinal cholesterol absorption. Science 2004, 303, 1201-1204

5. Baass PC, Di Guglielmo GM, Authier F, Posner BI, Bergeron JJ. Compartmentalized signal transduction by receptor tyrosine kinases.Trends Cell Biol. 1995,5(12),465-470

6. Baenziger JU, Fiete D. Structural determination of Ricinus Communis agglutinin and toxin specificity for oligosaccharides. J.Biol.Chem., 1979, v.254, 9795-9799

7. Barbieri L, Battelli MG, Stirpe F. Ribosome-inactivating proteins from plants Biochim. Biophys. Acta., 1993, v.l 154, 237-282

8. Barbieri MA, Fernandez-Pol S, Hunker C, Horazdovsky BH, Stahl PD. Role of rab5 in EGF receptor-mediated signal transduction. Eur J Cell Biol. 2004, 83(6), 305-14

9. Bigay J, Gounon P, Robineau S, Antonny B: Lipid packing sensed by ArfGAPl couples COPI coat disassembly to membrane bilayer curvature. Nature 2003, 426, 563-566

10. Bilge A, Warner C, Press O. Translocation of ricin A-chain into proteoliposomes reconstituted from Goli and endoplasmic reticulum J. Biol. Chem., 1995, v.270, 23720-23725

11. Bishayee S. Role of conformational alteration in the epidermal growth factor receptor (EGFR) function. Biochem Pharmacol 2000, 60(8), 1217-1223

12. Boado R J. RNA Interference and Nonviral Targeted Gene Therapy of Experimental Brain Cancer. American Soc Exp NeuroTherap, 2005, 2, 139150

13. Boonstra J, Rijken P, Humbel B, Cremers F, Verkleij A, van Bergen en Henegouwen P. The epidermal growth factor. Cell Biol Int, 1995, 19(5), 413430

14. Brown DA, London E. Functions of lipid rafts in biological membranes.

15. Annu Rev Cell Dev Biol, 1998, 14, 111-136

16. Brown DA, London E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J Biol Chem, 2000, 275, 17221-17224

17. Brugger B, Sandhoff R, Wegehingel S, Gorgas K, Malsam J, Helms JB, Lehmann WD, Nickel W, Wieland FT. Evidence for segregation of sphingomyelin and cholesterol during formation of COPI-coated vesicles. J Cell Biol, 2000, 151,507-518

18. Buske C, Weigert O, Dreyling M, Unterhalt M, Hiddemann W. Current status and perspective of antibody therapy in follicular lymphoma. Haematologica 2006, 91, 104-112

19. Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. Annu Rev Biochem, 1979,48, 193-216

20. Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. J Biol Chem, 1990, 265(14), 7709-7712

21. Carpenter G. The EGF receptor: a nexus for trafficking and signaling. Bioessays 2000, 22(8), 697-707

22. Cheng Y, Zak O, Aisen P, Harrison SC, Walz T. Structure of the human transferrin receptor-transferrin complex. Cell, 2004, 116(4), 565-76

23. Chernomordik LV, Kozlov MM: Protein-lipid interplay in fusion and fission of biological membranes. Annu Rev Biochem, 2003, 72, 175-207

24. Choong NW, Cohen EEW. Epidermal growth factor receptor directed therapy in head and neck cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology, 2006, 5725-5743

25. Conner SD, Schmid SL. Regulated portals of entry into the cell. Nature, 2003, 6, 422(6927), 37-44

26. Cosson P, Letourneur F. Coatomer interaction with di-lysine endoplasmic reticulum retention motifs. Science, 1994, v. 263, 1629-1631

27. Dautry-Varsat A, Ciechanover A, Lodish HF. pH and the recycling of transferrin during receptor-mediated endocytosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1983, 80, 2258-2262

28. Day PJ, Owens SR, Wesche J, Olsnes S, Roberts LM, Lord JM. An interaction between ricin and calreticulin that may have implications for toxin trafficking. J Biol Chem, 2001, 276, 7202-7208

29. Di Cola A, Frigerio L, Lord J. M., Roberts L.M., Ceriotti A. Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Ricin A Chain Has Unique and Plant-Specific Features Plant Physiology, 2005, v. 137, 287-296

30. Dinneen JL, Ceresa BP Continual expression of Rab5(Q79L) causes a ligand-independent EGFR internalization and diminishes EGFR activity. Traffic, 2004, 5(8), 606-615

31. Dorn GW 2nd, Mochly-Rosen D. Intracellular transport mechanisms of signal transducers. Annu Rev Physiol., 2002, 64,407-29

32. Drecktrah D, Chambers K, Racoosin EL, Cluett EB, Gucwa A, Jackson B, Brown WJ. Inhibition of a Golgi complex lysophospholipid acyltransferase induces membrane tubule formation and retrograde trafficking. Mol Biol Cell, 2003, 14, 3459-3469

33. Dubljevic V, Sali A, Goding A. A conserved RGD (Arg-Gly-Asp) motif in the transferrin receptor is required for binding to transferrin. Biochem J., 1999, 341, 11-14

34. Duchek P, Rorth P. Guidance of cell migration by EGF receptor signaling during Drosophila oogenesis. Science, 2001, 291, 131-133

35. Edidin M. Lipids on the frontier: a century of cell-membrane bilayers

36. Enns CA. The transferrin receptor. In: Templeton DM., editor. Molecular and cellular iron transport. New York: Marcel Dekker; 2002, 71-94

37. Huang F, Khvorova A, Marshall W, Sorkin A. Analysis of Clathrin-mediated Endocytosis of Epidermal Growth Factor Receptor by RNA Interference J. Biol. Chem., 2004, v. 279, 16, 16657-16661

38. Farge E, Ojcius DM, Subtil A, Dautry-Varsat A. Enhancement of endocytosis due to aminophospholipid transport across the plasma membrane of living cells. Am J Physiol, 1999, 276, 725-733

39. Fielding CJ, Fielding PE. Cholesterol and caveolae. Structural and functional relationships. Biochim Biophys Acta, 2000, 1529, 210-222

40. Fielding CJ, Fielding PE. Intracellular cholesterol transport. J Lipid Res, 1997,38, 1503-1521

41. Frankel AE, Burbage C, Fu T, Tagge E, Chandler J, Willingham MC, Ricin toxin contains at least three galactose-binding sites located in В chain subdomains la, ip, and 2y. Biochemistry, 1996, v. 35, 14749-14756

42. Fu T, Burbage C, Tagge EP, Brothers T, Willingham MC, Frankel AE. Ricin toxin contains three lectin sites which contribute to its in vivo toxicity. Int. J. Immunopharmacol., 1996, v. 18, 12, 683-692

43. Gadina M, Newton DL, Rybak SM, Wu Y-N, Yole RJ. Humanized immunotoxins. Therap Immunol, 1994, 1, 59-64

44. Gerstein M, Anderson BF, Norris GE, Baker EN, Lesk AM, et al. Domain closure in lactoferrin: Two hinges produce a see-saw motion between alternative close-packed interfaces. J Mol Biol., 1993, 234, 357-372

45. Giannetti AM, Snow PM, Zak O, Bjorkman PJ. Mechanism for Multiple Ligand Recognition by the Human Transferrin Receptor PLoS Biol., 2003, 1(3): c51

46. Godi A, Di Campli A, Konstantakopoulos A, Di Tullio G, Alessi DR, Kular GS, Daniele T, Marra P, Lucocq JM, De Matteis MA: FAPPs control Golgi-to-cell-surface membrane traffic by binding to ARF and PtdIns(4)P. Nat Cell Biol, 2004 , 6, 393-404

47. Goldstein JL, Brown MS, Anderson RG Receptor-mediated endocytosis: concepts emerging from the LDL receptor system. Annu Rev Cell Biol., 1985, v.1, 1-39

48. Grimmer S, van Deurs B, Sandvig K. Membrane ruffling and macropinocytosis in A431 cells require cholesterol. J Cell Sci, 2002, v. 115, 2953-2962

49. Gruenberg J. Lipids in endocytic membrane transport and sorting. Curr Opin in Cell Biol, 2003, 15, 382-388

50. Gullick WJ. Type I growth factor receptors: current status and future work. Biochemical society symposia, 1998, 63, 193-198

51. Hag EI., Chahine J-M, Pakdaman R. Transferrin, a mechanisms for iron release. Eur J Biochem, 1995, 230, 1102-1110

52. Hansen SH, Sandvig K, Deurs BV. Molecules internalized by clathrin-independent endocytosis are delivered to endosomes containing transferrin receptors. J.Cell Biol., 1993, v. 123, 89-97

53. Hao M, Maxfield FR. Characterization of rapid membrane internalization and recycling. J Biol Chem., 2000, 19, 275(20), 15279-86

54. Hatakeyama T, Yamasaki N, Funatsu G. Identification of the tryptophan residue located at the low-affinity sacharide binding site of ricin D. J. Biochem., 1986, v. 100, 781-788

55. Hayes GR, Williams AM, Lucas J J, Enns CA. Structure of human transferring receptor oligosaccharides: conservation of site-specific processing. Biochemistry, 1997, 36, 5276-84

56. Higashiyama S, Abraham JA, Miller J, Fiddes JC, Klagsbrun M. A heparin-binding growth factor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF. Science, 1991, 251(4996), 936-939

57. Hinners I., Moschner J., Nolte N., Hille-Rehfeld A, The orientation of membrane proteins determined in situ by immunofluorescence staining. Anal Biochem, 1999, v. 276, 1-7

58. Huang, F, Khvorova A, Marshall W, Sorkin A. Analysis of clathrin-mediated endocytosis of EGF receptor by RNA interference. J. Biol. Chem, 2004, 279, 16657-16661

59. Ikonen E. Roles of lipid rafts in membrane transport. Curr Opin Cell Biol, 2001, 13,470-477

60. Jiang X, Sorkin A. Epidermal growth factor receptor internalization through clathrin-coated pits requires Cbl RING finger and proline-rich domains but not receptor polyubiquitylation. Traffic, 2003, 4, 529-543

61. Jiang X, Huang F, Marusyk A, Sorkin A. Grb2 regulates internalization of EGF receptors through clathrin-coated pits. Mol. Biol. Cell, 2003, 14, 858870

62. Jinno H, Ueda M, Ozawa S, Ikeda T, Kitajima M, Maeda T, Seno M. The cytotoxicity of a conjugate composed of human epidermal growth factor and eosinophil cationic protein. Anticancer Res. 2002, 22(6C), 4141-4145

63. Johannes L, Decaudin D. Protein toxins: intracellular trafficking for targeted therapy.Gene Ther., 2005, 12(18), 1360-1368

64. Katzin BJ, Collins EJ, Robertus JD. Structure of ricin A-chain at 2.5 A. Proteins. 1991, 10(3), 251-259

65. Kenneth M, Yamada, Sharona E-R. Integrin regulation of growth factor receptors. Nat Cell Biol, 2002, 4, 75-76

66. Kimihiko M, Honami Y, Hirofumi K, Bunzo M, Masaaki H, Alternative structural state of transferring. J Biol Chem, 1999, 274, 10190-10194

67. Klein P, Mattoon D, Lemmon MA, Schlessinger J. A structure-based model for ligand binding and dimerization of EGF receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(4), 929-934

68. Kooijman EE, Chupin V, de Kruijff B, Burger KN: Modulation of membrane curvature by phosphatidic acid and lysophosphatidic acid. Traffic, 2003,4, 162-174

69. Kuan C-T, Wikstrand CJ, Bigner DD. EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy. Endocrin-related cancer, 2001, 8, 83-96

70. Kuhn LC, Med Wochenschr. 1989 119, 1319-1326

71. Kumar V, Bustin SA, McKay IA. Transforming growth factor alpha. Cell Biol Int 1995, 19(5), 373-388

72. Kurokawa H, Dewan JC, Mikami B, Sacchettini JC, Hirose M. Crystal structure of hen apo-ovotransferrin: Both lobes adopt an open conformation upon loss of iron. J Biol Chem., 1999, 274, 28445-28452

73. Lauvrak SU, Llorente A, Iversen TG, Sandvig K. Selective regulation of the Rab9-independent transport of ricin to the Golgi apparatus by calcium. J Cell Sci. 2002, 1,115, 3449-3456

74. Le Roy C, Wrana JL. Clathrin- and non-clathrin-mediated endocytic regulation of cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6, 2, 112-126

75. Liu Q, Zhan J, Chen X, Zheng S. Ricin A chain reaches the endoplasmic reticulum after endocytosis. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 343, 857-863

76. Lund KA, Opresko LK, Strarbuck C, Walsh BJ, Wiley HS. Quantitative analysis of the endocytic system involved in hormone-induced receptor internalization. J. Biol. Chem., 1990,265, 15713-15723

77. Matsuo H, Chevallier J, Mayran N, Le Blanc I, Ferguson C, Faure J, Blanc NS, Matile S, Dubochet J, Sadoul R et al.: Role of LBPA and Alix in multivesicular liposome formation and endosome organization. Science, 2004, 303,531-534

78. Maxfield FR, McGraw ТЕ, Endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5, 2, 121 -132

79. Mayawala K, Vlachos DG, Edwards JS. Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding. FEBS Letters, 2005, 579, 3043-3047

80. Mayawala K, Vlachos DG, Edwards JS. Computational modeling reveals molecular details of epidermal growth factor binding. BMC Cell Biology, 2005,6,41

81. McGraw ТЕ, Maxfield FR. Human transferrin receptor internalization is partially dependent upon an aromatic amino acid on the cytoplasmic domain. Cell Regul., 1990, 1(4), 369-377

82. McLaughlin S, Smith SO, Hayman MJ, Murray DJ. An Electrostatic Engine Model for Autoinhibition and Activation of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR/ErbB) Family Gen. Physiol., 2005, 126, 1,41-53

83. Miaczynska M, Pelkmans L, Zerial M. Not just a sink: endosomes in control of signal transduction. Current Opinion in Cell Biology, 2004, 16, 400-406

84. Mineo C, Gill GN, Anderson RGW. Regulated migration of epidermal growth factor receptor from caveolae. Biol Chem, 1999, v. 27(43), 3063630643

85. Miwako I, Yamamoto A, Kitamura T, Nagayama, K, Ohashi M. Cholesterol requirement for cation-independent mannose 6-phosphate receptor exit from multivesicular late endosomes to the Golgi. J.Ceel.Sci., 2001, 114, 1765-1776

86. Mizutani K, Yamashita H, Kurikawa H, Mikami B, Hirose M. Alternative structural state of transferrin. J Biol Chem, 274, 15, 10190-10194

87. Modregger J, Schmidt AA, Ritter B, Huttner WB, Plomann M: Characterization of Endophilin Bib, a brain-specific membrane-associated lysophosphatidic acid acyl transferase with properties distinct from endophilin Al. J Biol Chem, 2003,278,4160-4167

88. Moisenovich M, Tonevitsky A, Agapov I, Niwa H, Schewe H, Bereiter-Hahn J. Differences in endocytosis and intracellular sorting of ricin and viscumin in 3T3 cells. Eur J Cell Biol., 2002, v. 81(10), 529-538

89. Moisenovich M, Tonevitsky A, Maljuchenko N, Kozlovskaya N, Agapov I, Volknandt W, Bereiter-Hahn J. Endosomal ricin transport: involvement of Rab4- and Rab5-positive compartments. Histochem Cell Biol, 2004, 121,429-439

90. Montfort W, Villifranca JE, Monzingo AF, Ernst S, Katzin B, Rutenber E, Xuong NH, Hamlin R, Robertus JD. The three-dimensional structure of ricin at 2,8 A. J. Biol. Chem., 1987, v.262, 5398-5403

91. Morlon-Guyot J, Helmy M, Lombard-Frasca S, Pignol D, Pieroni G, Beaumelle B. Identification of the ricin lipase site and implication in cytotoxicity. J Biol Chem, 2003, 278, 17006-17011

92. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65, 55-63

93. Motley A, Bright NA, Seaman MN, Robinson MS. Clathrin-mediated endocytosis in АР-2-depleted cells. J Cell Biol., 2003, 1, 162(5), 909-918

94. Mroczkowski B, Reich M, Chen K, Bell GI, Cohen S. Recombinant human epidermal growth factor precursor is a glycosylated membrane protein with biological activity. Mol Cell Biol, 1989, 9(7), 2771-2778

95. Munro S: Lipid rafts: elusive or illusive? Cell, 2003, 115, 377-388

96. Ogris M, Walker G, Blessing T, Kircheis R, Wolschek M, Wagner E. Tumor-targeted gene therapy: strategies for the preparation of ligand-polyethylene glycol-polyethylenimine/DNA complexes. Control Release., 2003,91(1-2), 173-181

97. Okamoto T, Schlegel A, Scherer PE, Lisanti MP. Caveolins, a family of scaffolding proteins for organizing 'preassembled signaling complexes' at the plasma membrane. J Biol Chem, 1998, 273, 5419-5422

98. Oksvold M, Huitfeldt H, Stang E. Matshus I. Localizing the EGF receptor. Nat Cell Biol, 2002,4, 22-23

99. Owen DJ, Evans PR. A structural explanation for the recognition of tyrosine-based endocytic signals. Science, 1998, 282, 1327-1332

100. Parton RG. Caveolae — from ultrastructure to molecular mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol, 2003, 4, 162-167

101. Petiot A, Faure J, Stenmark H, Gruenberg J. PI3P signaling regulates receptor sorting but not transport in the endosomal pathway. J Cell Biol., 2003, 162(6), 971-979

102. Pfeffer S. Membrane domains in the secretory and endocytic pathways. Cell, 2003, 112, 507-517

103. Pike L, Casey L. Cholesterol levels modulate EGF receptor-mediated signaling by altering receptor function and trafficking. Biochemistry, 2002, 41, 10315-10322

104. Roberts RL, Fine RE, Sandra A. Receptor-mediated endocytosis of transferring at the blood-brain barrier. J Cell Sci, 1993, 104, 521-532

105. Rosen H, Glukhman V, Feldmann T, Fridman E, Lichtstein DCardiac Steroids Induce Changes in Recycling of the Plasma Membrane in Human NT2 Cells Mol Biol Cell., 2004 15(3), 1044-1054

106. Sandvig K, Grimmer S, Iversen TG, Rodal K, Torgersen ML, Nicoziani P, van Deurs B. Ricin transport into cells: studies of endocytosis and intracellular transport. Int J Med Microbiol., 2000, 290(4-5), 415-420

107. Sandvig K, van Deurs B. Endocytosis and intracellular transport of ricin: recent discoveries. FEBS Lett, 1999, 452, 67-70

108. Sandvig К, Bo van Deurs. Endocytosis, intracellular transport and cytotoxic action of shiga toxin and ricin. Phys. Reviews, 1996, v. 76, 949-966

109. Schimmuller F, Simon I, Pfeffer S. Rab GTPases, directors of vesicle docking. J.Biol.Chem., 1998, v. 273, 22161-22164

110. Schliwa M. Action of cytochalasin D on cytoskeletal networks. J Cell Biol, 1982, v.92, 79-91

111. Sharon N. Lectin-carbohydrate complexes of plants and animals: an atomic view. TIBS, 1993, v. 18, 221-226

112. SheffD, Pelletier L, O'Connell C.B., Warren G, Mellman I Transferrin receptor recycling in the absence of perinuclear recycling endosomes. J Cell Biol, 2002, v. 156, 5, 797-804

113. Shoyab M, Plowman GD, McDonald VL, Bradley JG, Todaro GJ. Structure and function of human amphiregulin: a member of the epidermal growth factor family. Science, 1989, 243 (4894 Pt 1), 1074-1076

114. Sibilia M, Fleischmann A, Behrens A, Stingl L, Carroll J, Watt FM, Schlessinger J, Wagner EF. Cell, 2000, 102, 211-220

115. Simmons BM, Stahl PD, Russel IH. Mannose receptor-mediated uptake of ricin toxin and ricin A chain by macrophages. Multiple intracellular pathways for A chain translocation. J. Biol. Chem., 1986, v. 261, 7912-7920

116. Simons K, Ikonen E. Functional rafts in cell membranes. Nature, 1997,387, 569-572

117. Simons K, Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol, 2000, 1,31-39

118. Simpson JC, Dascher C, Roberts LM. Ricin cytotoxicity is sensitive to recycling between the endoplasmic reticulum and the Golgi complex. J. Biol. Chem., 1995a, v. 270, 20078-20083

119. Simpson JC, Roberts LM, Lord JM. Free ricin A-chain reaches an early compartment of the secretory pathway before it enters the cytosol Exp. Cell Res., 1996 v. 229,447-451

120. Simpson, JC, Lord JM, Robers LM. Point mutations in the hydrophobic C-terminal region of ricin A chain indicate that Pro250 plays a key role in membrane translocation. Eur J Biochem., 19956, 1, 232(2), 458463

121. Slepnev VI, De Camilli P. Accessory factors in clathrin-dependent synaptic vesicle endocytosis. Nat Rev Neurosci., 2000, 1(3), 161-172

122. Sonnichsen B, De Renzis S, Nielsen E, Rietdorf J, Zerial M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rabll. J Cell Biol, 2000, v. 149, 901913

123. Sorkin A. Internalization of the epidermal growth factor receptor: role in signaling. Biochem Soc Trans, 2001, v. 29, 480-484

124. Sorkin A, Von Zastrow M. Signal transduction and endocytosis: close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2002, 3, 600-614

125. Spilsberg B, Van Meer G, Sandvig K. Role of lipids in the retrograde pathway of ricin intoxication. Traffic, 2003,4(8), 544-552

126. Sprong H, van der Sluijs P, van Meer G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001, 2, 504-513

127. Stenmark H, Olkkonen V M. The Rab GTPase family. Genome Biology, 200, 2(5), 3007.1-3007.7

128. Stuven E, Porat A, Shimron F, Fass E, Kaloyanova D, Brugger B, Wieland FT, Elazar Z, Helms JB. Intra-Golgi protein transport depends on a cholesterol balance in the lipid membrane. J Biol Chem, 2003, 278, 5311253122

129. Trischler M, Stoorvogel W, Ullrich O. Biochemical analysis of distinct Rab5- and Rabl 1 -positive endosomes along the transferrin pathway. J Cell Sci, 1999, v. 112, 4773-4783

130. Utsumi T, Ide A, Funatsu G. Ricin A-chain induces fusion of small unilamellar vesicles at neutral pH. 1998, FEBS Letters, v.242, 255-258145. van Meer G. Cell biology. The different hues of lipid rafts. Science, 2002, 296, 855-857

131. Venkatesh YP, Lambert JM. Galactose-induced dimerization of blocked ricin at acidic pH: evidence for a third galactose-binding site in ricin В chain. 1997, Glycobiology, v. 7, 3, 329-335

132. Villafranca JE, Robertus JD. Ricin В chain is a product of gene duplication. J.Biol.Chem., 1981, v. 256, 554-556

133. Wales R, Richardson PT, Roberts LM. Mutational analysis of the galactose binding ability of recombinant ricin В chain. J. Biol. Chem., 1991, 266, 19172-19179

134. Waugf MG, Hsuan JJ. EGF receptors as transcription factors. Nature Cell Biol, 2001,3,209-211

135. Wesche J, Rapak A, Olsnes S, J. Dependence of ricin toxicity on translocation of the toxin A-chain from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Biol. Chem., 1999, 274, 34443-34449

136. Wolf P, Gierschner D, Buhler P, Wetterauer U, Elsasser-Beile U. A recombinant PSMA-specific single-chain immunotoxin has potent and selective toxicity against prostate cancer cells Cancer Immunol Immunother 2006, Accepted: 10 January 2006

137. Woodburn JR. The epidermal growth factor receptor and its inhibition in cancer therapy. Pharmacol Ther, 1999, 82, 241-250

138. Xie J, Qian L, Wang Y, Rose CM, Yang T, Nakamura T, Hamm-Alvarez SF, Mircheff AK. Novel biphasic traffic of endocytosed EGF to recycling and degradative compartments in lacrimal gland acinar cells. J Cell Physiol., 2004, 199(1), 108-125

139. Yamabhai M. Anderson RG. W. Second Cysteine-rich Region of Epidermal Growth Factor Receptor Contains Targeting Information for Caveolae/Rafts J. Biol. Chem., 2002, v. 277, 28, 24843-24846

140. Yazdi PT, Wenning LA, Murphy RM. Influence of cellular trafficking on protein synthesis inhibition of immunotoxins directed against the transferring receptor. Cancer Res, 1995, 55(17), 3763-3771

141. Zerial M, McBride H. Rab proteins as membrane organizers. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001,2, 107-117

142. Zhan J, Stayton P, Press O. Modificatication of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences enhances its cytotoxicity and traslocation. Cancer Immunol., Immunother., 1998, v. 46, 55-60

143. Бенедиктова О.А., Попова Е.Н., Егорова С.Г., Демина И.А., Мойсенович М.М. Выявление свободной А-цепи рицина в супернатантах клеток, предобработанных нативным токсином. Биотехнология, 2005, 6, 83-89

144. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика, пер. с англ. B.JI. Друцы, О.Н. Королевой. М.: Мир, 544 е., 1991

145. Попова Е.Н., Егорова С.Г., Демина И.А., Бенедиктова О.А., Агапов И.И., Мойсенович М.М. Мышиные моноклональные антитела против рицина не реагируют с агглютинином рицина. Российский иммунологический журнал. 2003, 8, 235-239

146. Фильченков А.А., Слуквин И.И., Кудрявец Ю.И. Коэкспрессия функциональноактивных рецепторов ЭФР и трансферрина в человеческих опухолевых клетках эпителиального происхождения. Эксп. Онкол, 2000, 22, 130-1341. Благодарности