Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование деградации рибосом у бактерий при минимальных бактерицидных воздействиях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование деградации рибосом у бактерий при минимальных бактерицидных воздействиях"

РГБ ОД 1 8 ОКТ 1996

На правах рукописи

ЛИЩЕНКО Николай Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕГРАДАЦИИ РИБОСОМ У БАКТЕРИЙ ПРИ МИНИМАЛЬНЫХ БАКТЕРИЦИДНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Кубанской государственной медицинской академии и в Московском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского.

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор И.А.Баснакьян;

заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор А.И.Коротяев;

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор П.А.Галенко-Ярошевский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. А. Мельникова;

доктор биологических наук М. А. Панов;

доктор медицинских наук, профессор Б. А. Шендеров

Ведущая организация - Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии.

Защита состоится " сентября 1996 г. в 14 часов на заседании специализированного совета Д 001.38.01 при Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Академии медицинских наук РФ по адресу: 103064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

Автореферат разослан 47" августа 1996 г.

Ученый секретарь специализированного ученого совета кандидат медицинских наук

Н.Г.Кудрявцева

1.0БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Среди разнообразных взаимоотношений человека и представителей царства прокариотов на одном из первых мест стоит необходимость уничтожения патогенных бактерий как внутри макроорганизма, так и во внешней среде. В современных условиях для этого используется все большее число антимикробных средств [Машковский М.Д., 1993; Красильников А.П., 1995]. Соответственно, все острее ощущается необходимость в каждом случае определить молекулярные и субклеточные причины гибели микробов при бактерицидных воздействиях. Глубокое знание тонких механизмов инактивации бактерий необходимо в производстве субклеточных и иных вакцин [Лихолетов С.М., 1988; Воробьев A.A., Ляшенко В.А., 1995]. В практической дезинфекционной работе, а также в таких производственных сферах, как нефтедобыча [Карасева Э.В. и др., 1987], недостаточное понимание механизмов бактерицидного действия антимикробных веществ порождает их неоправданный перерасход со всеми неблагоприятными экономическими и, главное, экологическими последствиями.

Изучение разных структурных уровней действия антимикробных факторов имеет не только прикладное медицинское, но и общебиологическое научное значение. Среди важнейших клеточных систем, повреждение которых может приводить к гибели бактерий, наиболее полно и на достаточно глубоком уровне изучен аппарат биосинтеза белка, в особенности рибосомы [Спирин A.C., 1986]. Эти органеллы осуществляют чрезвычайно важные функции, главная из которых - трансляция генетической информации. Вместе с тем рибосомы являются одним из основных сенсоров условий существования клетки и в ответ на их изменение синтезируют особые регуляторные молекулы, перестраивающие в оптимальном направлении весь метаболизм бактерии [Лишневская Е.Б., 1984; VanBogelen R.A., Neidhardt F.C., 1990].

Учитывая эти обстоятельства, повреждение именно этих субклеточных компонентов целесообразно в первую очередь исследовать в качестве возможной главной причины гибели бактерий при бактерицидных воздействиях. Вопрос о деградации рибосом у бактерий, помимо прочего, приобретает и непосредственное прикладное значение. Понимание ее закономерностей

становится необходимым для выбора наиболее эффективных и экономичных способов получения препаративных количеств ри-босомного материала. В настоящее время это требуется для изготовления рибосомных вакцин [Белкин З.П., 1989], для бесклеточного синтеза биологически активных веществ (биотехнология in vitro) [Baranov V.l. и др., 1989], а также для риботипирования бактерий [Гагкка Е. и др., 1994]. Вероятно, будут разработаны и другие способы использования бактериальных рибосом.

Не исключено, что именно незнание закономерностей и недооценка внутриклеточной деградации рибосом являются причиной относительного отставания в разработке рибосомных вакцин. Поскольку эти препараты предполагается получать из патогенных бактерий, перед выделением рибосом необходимо убить клетки. Однако надо быть уверенным, что фактор, вызывающий их гибель, не разрушит сами рибосомы. На момент начала нашей работы были известны лишь единичные попытки увязать механизм бактерицидного действия нагревания культуры с повреждением рибосом [Allwood М.С., Russell A.D., 1968; Rosenthal L.J., Iandolo J.J., 1970; Tomlins R.I., Ordal Z.J., 1971], причем было исследовано всего два вида бактерий. А у таких основных компонентов нормальной микрофлоры человека, как бифидобактери, рибосомы не только не изучались, но даже и не были выделены из клеток. Помимо повышенной температуры никакие другие антимикробные средства, в первую очередь антисептические вещества, подобному анализу не подвергались. Разработка перечисленных теоретических и практических проблем требует углубления представлений о субклеточных и молекулярных механизмах бактерицидного действия антимикробных агентов.

Поэтому изучение процесса деградации рибосом у бактерий при действии на них широкого круга бактерицидных факторов является актуальным и важным для практики.

Цель исследования:

Изучить закономерности, особенности и биологическую роль деградации рибосом у бактерий при минимальных бактерицидных воздействиях антимикробных факторов.

Задачи исследования:

1. Разработать методологию изучения влияния бактерицидных факторов на состояние рибосомного аппарата бактерий. 4

2. Определить минимальные бактерицидные дозы (Bactericidal Dose - BD99) физических (повышенная температура), химических (основные антисептические вещества) и физико-химических (изменение рН среды) факторов для представителей семейств грамотрицательных (энтеробактерии, псевдомонады, вибрионы) и грамположительных (бациллы, бифидобактерии) бактерий.

3. Разработать способ получения рибосом из клеток бифи-добактерий и охарактеризовать некоторые физико-химические и биологические свойства этих частиц.

4. Выявить наличие и закономерности повреждений рибосом у представителей пяти семейств микроорганизмов при различных минимальных бактерицидных воздействиях и на этой основе определить средства и способы инактивации бактерий, обеспечивающие в одних случаях сохранение в клетках интакт-ных рибосом, а в других - их максимальное разрушение.

5. Изучить особенности изменений состава рибосомного материала разных бактерий в зависимости от типа примененного бактерицидного агента (нагревание, антисептические вещества, изменения рН).

6. Оценить роль деградации рибосом в утрате жизнеспособности бактерий при минимальных бактерицидных воздействиях.

Научная новизна

Разработана методология изучения механизмов бактерицидного действия различных антимикробных факторов, нацеленная на получение сопоставимых результатов. В ее основу положено: 1) изучение этих механизмов в максимально стандартизованных условиях в отношении как физиологического состояния бактерий, так и интенсивности бактерицидных воздействий; 2) сведение к минимуму защитного действия на клеточные структуры шаперонинов и им подобных белков; 3) использование минимальных доз бактерицидных воздействий с применением для оценки их интенсивности нового, более точного показателя -BD99.

Установлено, что бактерицидное действие на грамотрица-тельные бактерии повышенной температуры, некоторых антисептических веществ, а также изменений рН среды сопровождается интенсивным повреждением в клетках рибосом, заключающемся в деполимеризации рибосомных РНК.Угрампо-

5

ложитеяьных - эти процессы выражены значительно слабее.

Получены данные о том, что разрушение рибосом у грамот-рицательных бактерий осуществляется специфической клеточной системой, активирующейся при некоторых воздействиях. Общим признаком для них, по-видимому, является способность строго определенным образом нарушать структуру и, как следствие, проницаемость клеточных мембран. Показано, что такие повреждения мембран возникают только под действием некой "оптимальной" дозы антибактериального фактора. Составлена вероятная схема внутриклеточных процессов, приводящих к разрушению рибосом у грамотрицательных бактерий.

Впервые предложена классификация результатов деградации рибосомных РНК. Несмотря на многообразие возможных индукторов, деполимеризация рРНК и, соответственно, распад бе-локсинтезирующих частиц происходят по двум основным путям, обозначенным нами как симметричная в отношении субъединиц (СДР) и асимметричная (АДР) деградация рибосом. Последняя у большинства исследованных бактерий представлена типом АДР1, когда преобладает разрушение 30S субъединиц. Особенности деградации рибосом определяются в первую очередь свойствами бактерий и в меньшей мере зависят от характера антимикробного агента. Повреждение рибосом по типу АДРИ (разрушение 50S-4acrau) обнаружено только у Bacillus subtilis.

Выявлены ранее неизвестные особенности механизмов действия антисептических веществ на состояние рибосомного аппарата бактерий. По наличию или отсутствию способности вызывать деградацию рибосом у грамотрицательных бактерий антисептики разделены на две категории.

Обнаружена способность хлоргексидина стимулировать лизис бацилл и освобождение рРНК под действием детергентов.

С помощью вновь разработанной питательной среды для бифидобактерий (неагаризованной дрожже-молочно-солевой, ДМС) реализован новый метод их выращивания, динамическое анаэробное культивирование, обеспечивающий получение биомассы, свободной от примесей питательного субстрата. Это открыло возможность широкого изучения биохимических процессов у бифидобактерий.

Из клеток бифидобактерий впервые выделены рибосомы, основные физико-химические свойства которых сходны с таковыми у Е. coli. Рибосомы бифидобактерий способны индуцировать у млекопитающих состояние тахифилаксии кгетероло-6

гичной бактериальной инфекции. Впервые изучено влияние минимальных бактерицидных доз нагревания и некоторых антисептиков на состав рибосомного материала бифидобактерий. Установлено, что у них, в отличие от псевдомонад, кишечной и сенной палочек, рибосомы при этих воздействиях практически не повреждаются.

Вся совокупность полученных данных позволяет заключить, что обнаруженная нами избирательная деградация рибосом при бактерицидных воздействиях, по-видимому, не является главной, то есть первичной, причиной гибели микробных клеток, хотя, безусловно, вносит в нее очень важный вклад.

Практическая значимость

Определены величины минимальных бактерицидных доз (BD99) повышенной температуры, антисептических веществ, за-кисления и защелачивания среды для представителей трех семейств грамотрицательных и двух семейств грамположительных бактерий, включая бифидобактерии. Для последних эти величины при кратковременном (15 минут) воздействии определены впервые.

Показано, что "аномально высокая устойчивость к нагреванию" так называемых "термостойких" шигелл, скорее всего, является артефактом. Реально она не превышает таковой у лабораторных штаммов Е. coli (MRE600). Поэтому нет оснований пересматривать в масштабе страны режим пастеризации молока на пищевых предприятиях.

Разработана новая, относящаяся к типу неагаризованных дрожже-молочно-солевая (ДМС) среда для бифидобактерий. Она имеет более низкую стоимость, чем прототипные среды, и не содержит дефицитных компонентов. На ДМС-среду получено положительное решение по заявке о выдаче патента на изобретение.

Определены условия инактивации культур бактерий, обеспечивающие как получение недеградированных рибосом, так и их разрушение. Высокая избирательность разрушения 30S субъединиц рибосом некоторыми бактерицидными факторами позволяет использовать их для препаративного получения 50S частиц вместо трудоемкого ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы. У рибосом бифидобактерий выявлены им-мунопротективные свойства.

Часть материалов диссертации обобщена в монографии (Молекулярная биология и медицина. - М.: Медицина, 1987. - 287 е.). Некоторые фактические данные включены в учебник для студентов фармацевтических и медицинских вузов "Фармакотерапия с основами клинической фармакологии" под редакцией В.И.Петрова (Волгоград, 1996, - 451 стр). Результаты работы используются в лекционном курсе для студентов Кубанской медицинской академии на кафедрах микробиологии и фармакологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Методология изучения деградации рибосом у бактерий при бактерицидных воздействиях, включающая: а) соблюдение максимально стандартизованных условий эксперимента и постоянства физиологического состояния подвергаемой воздействию популяции микроорганизмов; б) сведение к минимуму проявлений самозащиты клеток в виде синтеза шоковых белков; в) использование минимальных бактерицидных доз повреждающих воздействий с применением нового показателя оценки их интенсивности - BÜ99.

2. Обнаружение двух основных типов деградации рибосом у бактерий при минимальных бактерицидных воздействиях, обозначенных как симметричная и асимметричная деградация.

3. Совокупность данных, подтверждающих, что деградация рибосом при минимальных бактерицидных воздействиях не является главной причиной утраты жизнеспособности бактерий.

4. Способ динамического анаэробного культивирования би-фидобактерий, позволивший получить их очищенную биомассу, пригодную для препаративного выделения рибосом.

Апробация работы

Результаты проведенных исследований доложены на 3-м Всесоюзном совещании по управляемому биосинтезу и биофизике популяций (Красноярск, 1973); 5-м и 7-м съездах Всесоюзного микробиологического общества (Ереван, 1975; Алма-Ата, 1985); на симпозиуме "Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов" (Пущино-на-Оке, 1979); на Всесоюзном семинаре "Современные проблемы антибиотикорезистентности" (Москва, 1988); на I Международном конгрессе по иммунореабилитации (Дагомыс, 1994); на II и III Международных симпозиумах врачей (Анапа, 1994; Геленджик, 1995); на заседаниях Краснодарских краевых обществ микробиологов. 8

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 34 печатные работы, в том числе одна монография. По заявке N. 94023024/13 (021772) о выдаче патента на изобретение "Дрожже-молочно-солевая питательная среда для накопления биомассы бифидо-бактерий" с приоритетом от 13.06.94 г. получено положительное решение (30.5.96 г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 332 страницах машинописного текста, состоит из введения; обзора литературы; раздела предварительных исследований (три главы); двух основных разделов, где в пяти главах приведены результаты экспериментов; заключения; выводов; списка цитированной литературы, включающего 326 отечественных и зарубежных источника. Работа иллюстрирована 57 рисунками и 20 таблицами.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВОПРОСЫ МЕТОДОЛОГИИ

В связи с тем, что процессы, происходящие в клетке, зависят от множества внутренних и внешних условий, попытки выявить взаимообусловленность деградации рибосом и утраты жизнеспособности бактерий требуют тщательной методологической подготовки и анализа возможных ошибок. В частности, нельзя признать удовлетворительным само понятие минимальной бактерицидной концентрации (МБК), чаще других применяемое для характеристики антимикробного воздействия, поскольку оно не учитывает продолжительность последнего. Кроме того, чрезвычайно важно определить оптимальную для решения поставленных задач интенсивность воздействия, так как число мишеней, поражаемых классическими антисептиками и нагреванием, резко возрастает при увеличении их дозы сверх минимально бактерицидной [Красильников А.П., 1995]. Все это сильно затрудняет выявление среди повреждаемых внутриклеточных структур тех, без функционирования которых бактерия погибает.

В результате теоретического и экспериментального анализа набора исследуемых бактерий, способов их культивирования и стадии роста, видов и интенсивности воздействий, а также спо-

9

собов оценки состояния рибосом после действия антимикробных факторов мы пришли к следующему заключению. С целью получения более воспроизводимых результатов в процессе изучения закономерностей, особенностей и биологической роли деградации рибосом при бактерицидных воздействиях необходимо:

1) для максимальной стандартизации физиологического состояния исследуемых бактерий - выращивать их на жидких питательных средах постоянного состава, до одной и той же стадии роста культуры, желательно до постоянной величины ее оптической плотности;

2) для сведения к минимуму синтеза "стрессовых" белков (шаперонинов и им подобных) и устранения их защитного действия на клеточные структуры - выращивать бактерии на обогащенной среде, по возможности с аэрацией, до экспоненциальной фазы роста. Воздействие бактерицидными агентами проводить непосредственно на культуру, не выделяя клетки из питательной среды, поскольку это упрощает экспериментальную модель, устраняя смену суспендирующего раствора, связанное с этим голодание клеток, холодовой шок и т.п.;

3) для достижения в разных экспериментах и лабораториях одинаковой степени повреждений клеточных структур - использовать воздействия постоянной интенсивности в минимальных бактерицидных дозах, так как они сопровождаются наименьшим числом повреждений, возникающих уже после гибели клетки и не имеющих поэтому к ней отношения.

В данной работе применяли изохронный вариант воздействий, при котором их продолжительность остается постоянной, а "концентрация" повреждающего агента меняется. Выбрали время, равное 15 минутам. Оно близко к реально затрачиваемому на дезинфекцию в практике; сопоставимо со временем генерации изучаемых бактерий; обеспечивает, на наш взгляд, оптимальное для изучения механизмов бактерицидного действия соотношение между процессами повреждения и восстановления (наименьшую достаточную для гибели клетки степень повреждений и невозможность их компенсации и репарации).

Для реализации постоянства интенсивности воздействия нами разработан и постоянно применялся в работе новый его показатель - ВВ99,. Термином ВБм обозначали ту "концентрацию" бактерицидного фактора (конечную концентрацию антисептика, температуру прогревания, величину рН), которая при действии 10

на культуру бактерий в экспоненциальной фазе роста в течение 15 минут снижает на 2 порядка число клеток, способных образовывать колонии на богатой питательной среде.

Сравнение результатов, полученных нами разными методами, показало, что наименее трудоемким и вместе с тем достаточно объективным способом определения состояния рибосом является электрофоретический анализ рибосомных РНК. Это обусловлено тем, что, по данным литературы, рРНК выполняет роль каркаса рибосомы; рибосомные белки сами по себе вместе удерживаться не могут [Шакулов P.C. и др., 1963; Dohme F., Nierhaus К.Н., 1976]. Поэтому деградация рРНК, на наш взгляд, однозначно указывает на распад рибосомной частицы.

Исходя из приведенных результатов методологического анализа были выбраны методы исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы 12 штаммов Escherichia coli (Е. coli АВ301, АВ301/105, СР78, СР79, J53, К12-802, М, MRE600, N7060, PR 13, PR 100, Q13), 8 штаммов Shigella sonnei (S. sonnei MT/3-218, MT/3-321, MT/3-564, MT/3-587, 792, 1218, 1321, 1364), Pseudomonas aeruginosa 47, Vibrio metschnikovii 115 (не Ol-серогруппы), Vibrio albensis 10188, 3 штамма Bacillus subtilis (В. subtilis Kl, K2, 720), Bifidobacterium bijidum 791, Staphylococcus epidermidis 12228.

Ниже приведено сокращенное описание некоторых наиболее часто используемых в настоящей работе методик.

Культивирование бактерий. Аэробные и факультативно анаэробные бактерии выращивали с интенсивной аэрацией до экспоненциальной фазы роста на жидкой дрожжевой богатой (ДБ) питательной среде, содержащей минеральные соли (рН 7,3), глюкозу, гидролизат казеина и дрожжевой автолизат.

Бифидобактерии выращивали как на агаризованных средах (среда Блаурокка, АДМС-среда) в стационарных условиях, так и на жидкой, неагаризованной ДМС-среде по предложенному нами методу динамического анаэробного культивирования (см. ниже). В состав дрожже-молочно-солевой (ДМС) среды входят: минеральные соли из среды М9, 10% осветленной молочной сыворотки, 0,5% лактозы, 0,3% дрожжевого автолизата, 0,1% Б,Ь-цистеина, рН 7,3. Агаризованный вариант (АДМС-среда) дополнительно содержал 0,075% агар-агара.

Бактерицидные воздействия. Культуру бактерий, достигшую экспоненциальной фазы роста, либо быстро (в зависимости от объема - за 10-40 секунд) нагревали до заданной температуры, либо вносили в нее рассчитанный объем маточного раствора антисептического вещества, либо ступенчато изменяли величину рН. Воздействие во всех случаях продолжали в течение 15 минут без аэрации. Температура культуры при действии антисептиков и изменений рН - 37°С. Для прекращения воздействия культуру либо охлаждали до 0°С, либо разводили забуференным (рН 7,0) физраствором. Затем анализировали изменения состава рибо-сомного материала. Параллельно определяли выживаемость бактерий.

Определение величины BD99. По окончании действия бактерицидного фактора культуру разводили забуференным физраствором таким образом, чтобы при последующем высеве на пластинки МПА контрольной порции культуры на них вырастало около 150 колоний. Подсчитывали количество выросших колоний в контроле и опыте. Полученные данные анализировали с применением системы пробитов [Ашмарин И.П., Воробьёв А.А., 1962; УрбахВ.Ю., 1975].

Выделение рибосом из бактерий. В разных сериях опытов клетки из контрольной и подвергнутой минимальному бактерицидному воздействию культур отмывали от среды и разрушали 1) повторным замораживанием и оттаиванием полученных с помощью лизоцима сферопластов; 2) обработкой кварцевым песком в планетарной мельнице; 3) обработкой низкочастотным ультразвуком. ДНК-полисомные комплексы разрушали ДНК-азой. Связанные с мембранами рибосомы отделяли от них либо Тритоном Х-100, либо смесью дезоксихолата натрия и твина-40. Рибосомы из тотального лизата или из отдельных субклеточных фракций осаждали дифференциальным ультрацентрифугированием в аппаратах УЦА-1, УПР-8, УЦП-75, Spinco L8-70.

Анализ состояния рибосом. С этой целью использовали:

1) спектр поглощения суспензии в ультрафиолетовой области;

2) аналитическое ультрацентрифугирование (аппараты УЦА-1 или МОМ-3170); 3) центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы; 4) электрофорез рибосомных РНК в полиакрила-мидном геле. В последнем случае исследовали как выделенные из клеток рибосомы, так и рибосомные РНК в лизатах клеток, полученных с помощью описанной P.Gegenheimer с соавт. (1977) литической смеси (трис, ЭДТА, ДСН, сахароза, бромфеноловый 12

синий). Для лизиса бифидобактерий требовалось их суспензию в литической смеси кратковременно (6 секунд) обработать низкочастотным (28 кГц) ультразвуком. Указанная литическая смесь оказалась непригодной для подготовки к электрофорезу РНК из клеток Bacillus subtilis. Поэтому потребовалось разработать так называемую TJIT-технологию (Трис-Лизоцим-Тритон), по которой перед действием литической смеси взвесь бактерий в трис-буфере обрабатывали лизоцимом, а затем тритоном Х-100.

Электрофорез РНК в полиакриламидном геле. Использовали 3%-й полиакриламидный гель длиной 90 мм и толщиной 1 мм, ширина одной лунки - 7 мм. Буфер геля и электродных сосудов -0.05 М трис-боратный, pH 8,3, содержал 2,5 мМ ЭДТА.

В лунку геля вносили постоянное количество биомассы, равное 0,075-0,100 ОЕб5о/слот. Для этого использовали предложенную нами формулу:

Vy = 0,2 • Vx • ODeso (мл),

где: Vy - объем физраствора (мл), необходимый для ресуспенди-рования данного осадка бактерий, чтобы конечная ODöso = 5,0; Vx - объем культуры (мл), из которого получен данный осадок; OD650 - оптическая плотность исходной анализируемой культуры перед бактерицидным воздействием.

Фракции РНК разделяли 15 мин при напряжении 100V и еще 75 мин при 200V. Гель окрашивали свежеприготовленным 0,0005% раствором бромистого этидия в воде и фотографировали при ультрафиолетовом освещении через желтый светофильтр на фотопленку 65 ед. ГОСТ. Относительные размеры фрагментов РНК, выявляемых с помощью электрофореза, определяли по предложенной нами ориентировочной формуле:

X = 16 + 7(di6-dx) : (d16-d23),

где: X - коэффициент седиментации исследуемого фрагмента РНК (единиц Сведберга, S); die, ёгз, dx - расстояния на электро-фореграмме от линии старта до центров полос 16S, 23S и исследуемой РНК; 16 - коэффициент седиментации 16S рРНК; 7 - разность коэффициентов седиментации реперных РНК, в качестве которых использовали только 23S и 16S рРНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Динамика роста бактерий и величины В099 антимикробных факторов

В ходе предварительных экспериментов была определена динамика роста культур исследуемых бактерий и продолжительность экспоненциальной фазы. В последующих опытах бактерицидным воздействиям подвергали культуры, оптическая плотность которых составляла «1/2 от таковой в стационарной фазе, что соответствовало середине экспоненциальной фазы роста.

Для всех исследуемых штаммов бактерий в этих условиях были определены величины минимальных бактерицидных доз (ВБ99) использованных в работе антимикробных факторов. Часть полученных результатов приведена в таблице 1.

Деградация рибосом у бактерий при нагревании культуры

Наиболее подробно изучали влияние на рибосомный аппарат экспоненциально растущих культур разных штаммов кишечных палочек минимального бактерицидного нагревания (ВБэ?). Оказалось, что оно вызывает разрушение около половины всей РНК (80% ее приходится на рРНК) до низкомолекулярных продуктов и выход последних из клетки. Белки при этом не разрушаются. Такая картина обнаруживается только при прогреве культуры или суспензии бактерий в забуференном физрастворе. Результаты соответствующих экспериментов приведены на рисунке 1 (фрагменты А и В). Степень деградации РНК при прогреве клеток в физрастворе примерно равна таковой в мясо-пептонном бульоне. Различие содержания нуклеотидов при этом объясняется лишь тем, что в клетках, прогретых в МПБ, определяли только внутриклеточные кислоторастворимые продукты, а у бактерий, прогретых в физрастворе, к ним прибавлены нук-леотиды, вышедшие в окружающую среду. Суммарное содержание РНК и нуклеотидов в клетках, прогретых при разных температурах, в последнем случае остается постоянным. В МПБ обна-14

Таблица 1

Величины ВИдя бактерицидных факторов для исследуемых бактерий, выращенных с аэрацией на обогащенной полусинтетической среде*

Бактерицидный фактор Величины ВБээ для

Е.соК СР78° Е.соИ МЯЕ 600° Рв.аеги-ginosa 47° У.а1Ьеп 10188° В.зиЪй-Нв 720° В.ЬШ-dum 79Г

Дегмицид 0,006 0,02 0,08 0,03 0,04 0,05

Йод 0,008 0,01 0,1 0,02 0,02 0,02

Перекись водорода 0,3 0,3 0,15 0,03 0,1 0»

Рихлокаин 0,08 0,1 0,13 0,12 0,2 >1,5

Салициловая кислота 0,6 0,6 0,7 0,6 0,2 0,8

Сулема 0,0005 0,0005 0,001 0,001 0,005 0,003

Фенол 0,5 0,5 0,4 0,5 0,5 0,5

Формальдегид 0,1 0,15 0,03 0,01 0,02 0,2

Хлорамин Б 0,02 0,02 0,2 0,05 0,04 0,03

Хлоргексидин 0,005 0,005 0,007 0,006 0,002 0,05

Хлороформ 0,3 0,3 0,4 0,3 0,3 1,0

Повышенная температура** 52°С 53,5°С 52°С 48,5°С 51°С 53,5°С

Закисление среды** 3,5 2,75 4,0 4,75 4,5 _

Защелачивание среды" 10,5 11,25 11,25 10,5 10,75 —

* - приведены концентрации (%), которые при 15-минутном действии на культуру бактерий в экспоненциальной фазе роста снижают число клеток, способных образовывать колонии на плотной среде, на 2 порядка; ** - температура прогрева культуры (°С) и величины рН, вызывающие такой

же эффект, как в (*); О - на ДБ-среде;

00 - на АДМС-среде в анаэробных условиях; ООО - нет данных.

роста, прогретых в течение 15 минут в разных условиях. А - Прогрета кздаиура в МПБ, затем клетки отмыты от среды и в них определена содержание РНК и нукпйотидов. Б - клетки отмыты от МПБ, затем прогрет их пштаый осадок. Далее в них опред елено содержание РНК и нукпеотидов. В - Клетки отмыты от МПБ, суспендированы б 0,85% растворе НаС1 (рН 7,0). Суспензия прогрета. Определено содержание РНК в клетках, а также сумма свободных нукпвотидов в клетках и вне их (в физрастворе). Контроль - не прогретая кзщьтура (0°С).

Б

Рис. 2. Седиментограммы рибосомного материала, выделенного из интактных (А) и прогретых (51°С 15 мин) в культуре на дрожжевой богатой среде (Б) клеток Е. coli СР78.

Примечание. 1. Рибосомы суспендированы в буфере №3 в концентрации 2 мг/мл и подвергнуты при 20°С аналитическому ультрацентрифугированию при 42000 об/мин в центрифуге MOM-317Ö. 2. Фотосъёмка - в шлирен-оптической системе. Движение пиков слева направо.

ружить это невозможно из-за высокого поглощения ультрафиолетовых лучей бульоном.

При нагревании плотного осадка клеток (рис. 1Б) деградация РНК при тех же температурах почти не происходит и количество свободных нуклеотидов в них увеличивается незначительно. Это наблюдение показывает, что деполимеризация РНК, вероятно, связана с выходом ее продуктов из клетки. Если такой возможности нет, распад РНК тормозится.

Деградация РНК, содержащейся в рибосомах, приводит к снижению числа последних в клетке. В наибольшей степени разрушаются частицы, связанные с нуклеоидом, в наименьшей - с мембранами. Рибосомы, уцелевшие в прогретых клетках, имеют некоторый дефицит РНК по сравнению с интактными, в них снижена доля двунитевых полинуклеотидных участков.

Минимальное бактерицидное нагревание культур Е. coli, выращенных на богатых питательных средах (МПБ и ДБ-среде), приводит к резким изменениям состава тотального (без учета деления на субклеточные фракции) рибосомного материала. Двумя независимыми методами (аналитическим ультрацентрифугированием выделенных из клеток рибосом и электрофорезом крупных рРНК из лизатов клеток) показано, что гибель кишечных палочек сопровождается практически полной деградацией малых (30S) рибосомных субъединиц за счет деполимеризации 16S рРНК до низкомолекулярных продуктов. Характерно, что этот процесс затрагивает как свободные 30S частицы, так и входящие в состав 70S моносом. В результате рибосомный материал в прогретых клетках состоит почти целиком из 47-50S частиц. Это хорошо видно на седиментограммах, приведенных на рисунке 2, где в материале из клеток Е. coli СР78, прогретых даже при температуре на 1°С ниже BD99, резко снижена высота пиков 30S и 70S частиц. При действии BD99 на соответствующих седиментограммах полностью исчезают 30S- и 70Б-пики, а на электрофо-реграммах - полоса 16S рибосомной РНК.

Состав конечных продуктов разрушения рРНК отличается у разных кишечных палочек. В таблице 2 приведено описание элек-трофореграмм рРНК в лизатах Escherichia coli и других видов бактерий, подвергнутых минимальному бактерицидному нагреванию. Исчезновение каких-то фракций РНК описывается как нулевое содержание соответствующих молекул. В отдельной графе показаны вновь возникающие фрагменты, являющиеся результатом деградации рРНК. У 11 изученных штаммов Е. coli 18

Таблица 2

Состав рибосомных РНК в клетках бактерий, подвергнутых минимальному бактерицидному нагреванию

Штамм Тип (вариант) деградации* Содержание фракций РНК в клетках (в % от контроля) Фрагменты рРНК, появляющиеся после воздействия

16Б 23Б <16Б 16-238

Грамотрицательные бактерии

Е.соИ АВ301, АВ301/105 АДР1 0 100 - -

Е.соИ СР78, СР79 АДР1 0 100 - -

Е.соИ К12-802 АДР1(1-4) 0 70 Ш -

Е.соИ МЯЕбОО СДР 0 20 - -

Е.соИ 153, N7060 СДР 10 20 - -

Е.соИ РШЗ.РШОО СДР 0 30 - -

Е.соИ <313 СДР 0 50 - -

РБ.аегидтоза 47 АДР1 20 100

У.аШе^ 10188 0 100 100

Грамположительные бактерии

В.виЫШз 720 СДР 70 70 -

В.ЬШскип 791 СДР 70 70

Примечание. 1. Действие нагревания продолжалось всегда в течение 15 минут. 2. Интенсивность полос 16Б и 238 рРНК оценивали визуально. 3."Размер" фрагментов рРНК, образующихся после воздействия, определяли по предложенной нами формуле. 4. Денсито-метрия полос продуктов деградации не производилась.

* - описание типов и вариантов деградации рибосомных РНК приведено в таблице 6.

обнаружено два главных способа повреждений рибосомного аппарата:

1) исчезновение в клетках 16S рРНК и как следствие - 30S субъединиц, тогда как 23S рРНК полностью или почти полностью сохранена. На седиментограммах при этом выявляется только один пик - 50S рибосомных субъединиц. Такие изменения мы обозначили как асимметричную в отношении субъединиц деградацию рибосом I типа (АДР1). Они выявлены у Е. coli АВ301, АВ301/105, СР78, СР79, К12-802;

2) относительно равномерное разрушение у бактерий обеих рРНК, и 16S, и 23S. Соответственно, в клетках резко снижено содержание рибосомного материала. Поэтому чтобы обнаружить РНП-частицы с помощью аналитического ультрацентрифугирования, приходится применять интенсивность нагревания ниже уровня BD99. Эти повреждения обозначены нами как симметричная деградация рибосом (СДР). Они выявлены у Е. coli MRE600, J53, N7060, PR 13, PR 100, Q13.

Показано, что продукт гена г el А, столь важный в регуляции содержания рибосом у бактерий [Шакулов P.C., Клячко Е.В., 1983], не участвует в их разрушении при бактерицидном термальном воздействии: состав рибосомного материала в прогретых stringent-клетках (Е. coli СР78) не отличается от такового в relaxed-варианте тех же бактерий (Е. coli СР79).

Несмотря на то, что разрушение рРНК, несомненно, происходит за счет активации внутриклеточных рибонуклеаз, в экспериментах с соответствующими мутантами (Е. coli MRE600, N7060, АВ301/105, PR13) выяснилось, что такие наиболее изученные ферменты, как РНК-азы I, II, III и полинуклеотид-фосфорилаза, могут не принимать участия в этом процессе. У таких мутантов и в клетках, содержащих неизмененные РНК-азы, обнаруживаются однотипные повреждения рибосом после бактерицидного нагревания. Эти данные, однако, служат лишь дополнительным подтверждением широкой взаимозаменяемости клеточных рибонуклеаз [Deutscher М.Р., 1985], а не отрицают участие вышеперечисленных ферментов в расщеплении рРНК.

Особого внимания, на наш взгляд, заслуживают результаты изучения влияния на деградацию рибосом предшествующего культивирования Е. coli в условиях, индуцирующих повышенное накопление в клетках шоковых белков (шаперонинов). В качестве примера использовали сменяемые каждые полчаса суббактерицидные закисление и защелачивание культуры (pH-шок), 20

а также выращивание бактерий на бедной питательными веществами глюкозо-минеральной среде М9. Оказалось, что в таких клетках деградация рибосом при бактерицидном нагревании не происходит. Седиментационная картина рибосомного материала из прогретой культуры была неотличима от таковой в интакт-ных клетках. Это, по-видимому, демонстрирует одну из функций шоковых белков - защищать внутриклеточные структуры, в частности рибосомы, от деградации при бактерицидных воздействиях.

Изучение других грамотрицательных бактерий показало, что обнаруженная у энтеробактерий картина деградации белок-синтезирующих частиц не является универсальной. Имеются семейства, например Vibrionaceae, у которых рибосомы в указанных условиях совсем не разрушаются. Более половины их сохранялось в клетках V. metschnikovii 115 и V. albensis 10188 даже после 15-минутного прогрева культур при температуре, на 3-5°С превышающей минимальную бактерицидную, а при действии BD99 нагревания все рибосомы сохранялись (см. таблицу 2).

В то же время судьба рибосом в прогретых культурах Pseudomonas aeruginosa 47 (BD99) была очень близка к некоторым штаммам кишечных палочек (см. таблицу 2): в них разрушалось 70-90% 16S рРНК, тогда как 23S РНК полностью сохранялась. Следовательно, у Ps. aeruginosa 47 происходит асимметричная деградация рибосом I типа (АДР1).

Повреждение рибосомного аппарата под действием нагревания имеет место и у грамположительных бактерий (таблица 2). В клетках В. subtilis 720 минимальное бактерицидное термальное воздействие индуцирует разрушение только около 1/3 и 30S, и 50S рибосомных субъединиц за счет симметричной деградации соответствующих рРНК (СДР). Так же как и у кишечных палочек, основная масса продуктов деполимеризации РНК имеет слишком малые размеры, чтобы их можно было обнаружить в 3%-м полиакриламидном геле, т.е. деградация идет в основном по типу "всё или ничего".

Таким образом, у большинства исследованных бактерий минимальное бактерицидное нагревание их культур в богатой питательной среде одновременно с гибелью клеток вызывает деградацию той или иной части рибосом. У представителей разных семейств обнаружено два основных типа таких повреждений: АДР1 и СДР. Распад рибосом происходит за счет деполимеризации крупных рРНК, продукты которой покидают клетку вслед-

21

ствие одновременного нарушения барьерной функции клеточных мембран. Деградация рибосом более выражена у грамотрица-тельных бактерий.

Деградация рибосом при минимальном бактерицидном действии антисептических веществ

При использовании минимальных бактерицидных доз антисептиков нами показано, что вызываемая этими веществами гибель кишечных палочек не всегда сопровождается разрушением рибосом. По этому признаку химические агенты подразделены на две категории. К первой, не вызывающей распад рибосом, относятся соли тяжелых металлов (ртути, кадмия, цинка, меди), селенитовые и теллуритовые соли, а также хлороформ, перекись водорода, фурацилин, этанол, ацетон и высокие концентрации хлорида натрия. Представители второй категории веществ, наоборот, индуцируют разрушение рибосом. К ним относятся йод, фенол, формальдегид, хлорамин Б, хлоргексидин, бриллиантовый зеленый, дегмицид и салициловая кислота. Рихлокаин приводит к деградации рибосом только у тех Е. coli, у которых нагревание разрушает обе рибосомные субъединицы (СДР). Полученные данные позволяют осознанно выбирать способ инактивации бактерий перед препаративным получением из них ри-босомного материала. Для грамотрицательных бактерий, в частности, могут быть рекомендованы перекись водорода и хлороформ.

Несколько веществ, способных вызывать деградацию рибосом (йод, рихлокаин, фенол, формальдегид, хлорамин Б, хлоргексидин), исследовали более подробно, действуя ими на культуры 11 штаммов Е. coli. Результаты части экспериментов, полученных с использованием E.coli СР78 и MRE600 (у них деградация рибосом при нагревании относится к разным типам, см. выше), приведены в таблице 3. Обнаружены те же два основных типа повреждений, что и при нагревании бактерий - асимметричная (АДР1) и симметричная (СДР) деградация рибосом; на их фоне в пораженных клетках могут появляться относительно стабильные крупные фрагменты рРНК. В противоположность нагреванию, при действии антисептиков отличия деградации 22

Таблица 3

Состав рибосомных РНК в клетках бактерий, подвергну_тых действию 1 ВРээ антисептических веществ_

Штамм Антисептик Тип (вариант) деградации* Содер pitr, ках (i конт жание кций } клет-% от роля) Фрагменты рРНК, появляющиеся после воздействия

16S 23S <16S 16-23S

1 2 3 4 5 6 7

Е. coli СР78 Йод, Хлорамин Б СДР(3-4) 50 50 14,7S -

Рихлокаин 0 100 100 - -

Фенол СДР 50 50 -

Формальдегид СДР 10 20 - -

Хлоргексидин АДР1(1-4) 30 100 14,7S -

Е. coli MRE600 Йод СДР(3-4) 50 50 14,7S -

Рихлокаин, Хлоргексидин АДРЦ1-4) 30 100 14.7S

Фенол СДР 10 10 - -

Формальдегид СДР 50 50 -

Хлорамин Б СДР 0 20 - -

Ps. aeruginosa 47 Н2О2, Дегмицид, Хлороформ, Сулема 0 100 100 - -

Хлоргексидин АДР1 30 100 - -

Йод, Формальдегид СДР 30 30 - -

Vibrio al-bensis 10188 Н2О2, Дегмицид, Хлороформ, Сулема, Фенол, Формальдегид, Хлорамин Б 0 100 100 - -

Хлороформ СДР(3-5) 50 50 - 20S

Хлоргексидин АДРЩ5) 100 100 - 20S

Таблица 3 (окончание)

1 2 3 4 5 6 7

Bacillus subtilis 720 Рихлокаин, Фенол, Хлоргексидин 0 100 100 - -

Н2О2 АДРН 100 30 -

Дегмицид АДРИ (2-5) 150 70 16S, 20S

Хлороформ АДРЩ5) 100 100 - 20S

Йод, Формальдегид СДР 50 50 - -

Сулема СДР(3-4) 0 0 <10S -

В. bffidum 791 Йод,Рихлокаин, Формальдегид, Хлоргексидин, Хлороформ 0 100 100 - -

Примечание. 1. На культуру во всех экспериментах действовали только одним антисептиком. 2. Воздействие бактерицидных агентов продолжалось всегда в течение 15 минут. 3. Интенсивность полос 16S и 23S рРНК оценивали визуально. 4. "Размер" фрагментов рРНК, образующихся после воздействия, определяли по предложенной нами формуле. Денситометрия полос продуктов деградации не производилась.

* - Описание типов и вариантов деградации рибосомных РНК приведено в таблице 6.

рРНК между E.coli СР78 и MRE600 выражены значительно слабее. Однако, если рассматривать результаты по всем 11 штаммам, можно заключить, что состав продуктов деградации рРНК (рибосом) у Е. coli зависит от двух основных факторов: в первую очередь - от особенностей штамма и только во вторую - от химических свойств повреждающего агента. Поэтому, несмотря на то, что суммарная картина получается довольно пестрой, существует возможность разделить исследуемые штаммы на две группы. Одна - с тенденцией к симметричной деградации рибосом, другая - к асимметричной. Примечательно, что это деление частично совпадает с таковым при действии на кишечную палочку повышенной температуры. 24

Связь деградации рибосом при действии 1 BD99 антисептиков с биологическими особенностями микроорганизмов имеется и у других грамотрицательных бактерий. В частности, в клетках вибрионов практически никакие из этих соединений, так же как и нагревание, не вызывают разрушения рибосом (таблица 3). Наоборот, у псевдомонад эти агенты вызывают сходные с Е. coli повреждения белоксинтезирующих частиц.

У некоторых антисептиков при их действии на грамотрица-тельные микробы обнаружена парадоксальная зависимость деградации рибосом от концентрации препарата. Наиболее сильно она выражена у хлоргексидина. Максимальное повреждение рРНК происходит при суббактерицидных его дозах и снижается или совсем отсутствует при суперлетальных. В частности, 0,5-1 BD99 этого антисептика индуцируют у разных Е. coli деградацию 50-80% 16S рРНК, не затрагивая 23S рРНК, тогда как 2 BD99 вообще не вызывают разрушения рРНК. Характерной особенностью такой асимметричной деградации является накопление в клетках относительно стабильных 14,7S фрагментов РНК.

Иная картина наблюдается у грамположительных бацилл. Суббактерицидные дозы (около 0,5 BD99) хлоргексидина, а также рихлокаина, фенола и в меньшей мере хлороформа в экспоненциально растущих клетках Bacillus subtilis вызывают частичную деградацию 23S рРНК с образованием относительно стабильных 208-фрагментов. Повреждений 16S рРНК обнаружить не удается. Такие изменения мы назвали асимметричной деградацией рРНК (рибосом) II типа (АДРИ). Более высокие дозы хлоргексидина (>1 BD99) никаких повреждений рибосом не производят (см. табл. 3). Характерно, что и другие антисептики, такие как перекись водорода и дегмицид, сильно отличающиеся от вышеперечисленных по химическим свойствам и структуре молекул, также приводят к ранее в литературе не описанной и встречающейся только у бацилл асимметричной деградации рибосом II типа. В "чистом" виде эта особенность бацилл обнаружена при действии на них перекиси водорода. Обращает на себя внимание отсутствие у бацилл АДР1. Эти данные еще раз подчеркивают ведущую роль вида микроба в способе деградации рибосом.

Учитывая наши наблюдения, а также сообщения о повреждающем действии хлоргексидина на функции бактериальных мембран [Fitzgerald К.А. и др., 1992; Kuyyakanond T., Quesnel

Ь.В., 1992], считаем целесообразным в классификации антисептических препаратов [Машковский М.Д., 1993] перенести хлор-гексидин в группу детергентов.

Вторая, пока не расшифрованная особенность строения В. тЫйЬ приводит к тому, что столь мощный анионный детергент, как додецилсульфат натрия, действующий на суспензию бактерий вместе с ЭДТА, не может освободить рРНК из какого-то прочного комплекса. В итоге на электрофореграммах лизатов интактных клеток не удается обнаружить полос рРНК. Поэтому для проведения электрофоретического анализа состава рРНК у этих бактерий нам потребовалось разработать так называемую ТЛТ-технологию (Трис-Лизоцим-Тритон) предлизисной подготовки бацилл, заключающуюся в наличии двух дополнительных стадий: суспендированные в трис-буфере клетки обрабатывали лизоцимом, а затем тритоном Х-100.

Третья не объясненная особенность В-мЫйк заключается в способности хлоргексидина, рихлокаина, хлороформа и фенола своим присутствием заменять ТЛТ-методику. После внесения этих веществ в культуры интактных бацилл (37°С, 1 мин) без последующего применения ТЛТ-технологии линии рРНК на электрофореграммах хорошо видны. Можно предположить, что в основе такой "способности" перечисленных антисептиков лежит их специфическое, возможно детергентоподобное, действие на клеточную стенку бацилл.

Деградация рибосом при изменениях рН культуры

В отличие от нагревания и антисептиков, результаты действия изменений рН на рибосомный аппарат исследованных бактерий были очень сходными (см. таблицу 4). У всех них при минимальном бактерицидном и закислении, и защелачивании среды происходила симметричная деградация рибосом (СДР). Степень разрушения рибосом везде была очень высокой, вплоть до практически полного исчезновения соответствующих фракций рРНК из клеток. Необходимо подчеркнуть, что деградация большей части клеточных рибосом происходила у всех бактерий еще при суббактерицидных уровнях изменения рН.

У вибрионов и псевдомонад в кислой и в щелочной среде на фоне практически полной деградации 235 и 168 рРНК даже по 26

Таблица 4

Изменения состава рибосомных РНК в клетках бактерий, культуры которых подвергнуты минимальному бактерицидному закислению или защелачиванию среды

Штамм Изменение кислотности среды на 15 минут до... Тип (вариант) деградации* Содержание фракций РНК в клетках (в % от контроля) Фрагменты рРНК, появляющиеся после воздействия

16S 23S <16S 16-23S

Е. coli СР78 pH 3,25 СДР 20 20 - -

pH 10,25 СДР(3-5) 0 0 - 19S

Е. coli MRE600 pH 2,75 СДР 10 10 - -

pH 11,25 СДР(3-5) 0 0 - 19S

Ps. aeruginosa 47 pH 4,0 СДР(3-5) 10 10 - 17S

pH 11,25 СДР(3-5) 10 10 - 17S

Vibrio albensis 10188 pH 4,75 СДР(3-5) 0 30 - 17S

pH 10,5 СДР(3-5) 0 30 - 17S

Bacillus subtilis 720 pH 4,5 СДР 0 0 - -

pH 10,75 СДР 0 0 - -

Примечание. 1 .Интенсивность полос 16Б и 238 рРНК оценивали визуально. 2. "Размер" фрагментов рРНК, образующихся после воздействия, определяли по предложенной нами формуле. 3. Денситомег-рия полос продуктов деградации не производилась.

* - Описание типов и вариантов деградации рибосомных РНК приведено в таблице 6.

еле супербактерицидных изменений pH сохранялись 17S-фрагменты РНК. Сходный тип деградации рРНК отмечен и при защеяачивании (но не закислении) культур Е. coli СР78 и MRE600. Однако у них появляющийся фрагмент РНК был более крупным - 19S. Эти факты не позволяют считать наблюдаемое разрушение рРНК непосредственным результатом действия кислоты или щелочи.

Выделение и характеристика рибосом бифидобактерий.

Влияние бактерицидных воздействий на рибосомы

Изучение большинства свойств рибосом связано с выделением этих частиц из клетки. Однако если извлечение этих органелл из остальных взятых в работу бактерий не встречает серьезных препятствий, получение их из бифидобактерий общепринятыми методами оказалось невозможным. Трудность заключалась не столько в лизисе клеток или собственно выделении рибосом, как случалось с другими бактериями, сколько в биологических особенностях микроба, осложняющих получение и очистку биомассы.

Традиционные способы культивирования бифидобактерий предусматривают использование слабоагаризованных (жидких) сред. Агар-агар применяют с двоякой целью: оградить бактерии от кислорода и предоставить клеткам опору, препятствующую их ярко выраженной склонности к спонтанной агглютинации. Однако бактерии прочно прикрепляются к агарозным волокнам, и биомассу потом трудно очистить от остатков питательного субстрата (образуется рыхлый осадок, составляющий до 10-15% от исходного объема). Вероятно, по этой причине до сих пор никто не выделял рибосомы из бифидобактерий. Это же обстоятельство, по-видимому, тормозит изучение у них внутриклеточных биохимических процессов. Поэтому для получения рибосом потребовалось разрабатывать и новую среду, и новый метод их культивирования.

Вновь созданная среда (дрожже-молочно-солевая, ДМС; состав см. выше) совсем не содержала агара и таких дорогих и дефицитных компонентов, как печень, панкреатин, была забуфе-ренной, прозрачной. Несмотря на уменьшенное в 3-5 раз содержание питательных веществ, выход биомассы на ДМС был лишь на 12% ниже, чем на печеночной среде Блаурокка. 28

Сущность разработанного нами метода динамического анаэробного культивирования бифидобактерий заключается в интенсивном перемешивании культуры на неагаризованной среде и устранении над ней пузырей воздуха или замене воздуха инертным газом. Схема использованного устройства для его реализации приведена на рисунке 3. В нашей работе с помощью этого метода получали плотный осадок бифидобактерий, пригодный не только для выделения рибосом, но и для различных биохи-

1

Рис. 3. Схема устройства для динамического анаэробного культивирования бифидобактерий и анаэробного отбора проб культуры*.

1 - Культура бактерий.

2 - Герметизирующая резиновая пробка.

3 - Магнит.

4 - Шприц для подачи воды в резервуар.

5 - Тонкостенный резиновый резервуар.

6 - Магнитная мешалка.

* - Флакон с культурой и мешалку необходимо помещать в воздушный термостат (37°С).

w Таблица 5

° Типы повреждений рРНК, возникающих в экспоненциально растущей культуре Bifidobacterium bifidum 791 при бактерицидном действии различных факторов*

(по данным электрофореза в 3%-м ПААГ)

Тип Бактерицидный фактор 0,5 ВВ99 1 ВВ99 2 - 5 ВВ99

0 (нет разру- Йод, Рихлокаин, Хлоргексидин, Хлороформ Нет разрушения рРНК Нет разрушения рРНК Нет разрушения рРНК

шения РНК) Формальдегид Нет разрушения рРНК Нет разрушения рРНК Основная масса РНК остается на старте геля (кажущаяся деградация и 16Э, и 238рРНК)

СДР Повышенная температура Нет разрушения рРНК (50°С) Разрушение 30% и 168, и 238 рРНК (53,5°С) Разрушение 90% и 168, и 238рРНК (56°С)

Длительная инкубация культуры на АДМС при 37°С** Разрушение 40% и 16Б, и 238 рРНК (1 сутки при 37°С) Разрушение 90% и 168, и 238 рРНК (2 суток при 37°С) Полная деградация всех рРНК (4 суток при 37°С)

* - Длительность воздействия, если не указано иначе, - 15 минут.

** - Контролем служила 18-часовая культура.

мических исследований. Из нескольких испытанных методов разрушения клеток для бифидобактерий оптимальной была баллистическая дезинтеграция в планетарной мельнице. В остальном процедура выделения рибосом практически не отличалась от других бактерий.

Рибосомы бифидобактерий по исследованным физико-химическим свойствам (спектру УФ-поглощения и электрофоре-тическому профилю рРНК в полиакриламидном геле) практически не отличались от аналогичных органелл Е. соИ.

Рибосомный материал, выделенный из интактных клеток бифидобактерий, обладал способностью индуцировать у мышей неспецифическую резистентность (тахифилаксию) к гетероло-гичной бактериальной инфекции, которая развивалась через 24 часа после внутрибрюшинного введения им очень малых доз (0,1 мг) рибосом. Заражение тех же животных пятью ОЬзо вирулентных шигелл Зонне через 24 часа после первой инъекции не вызывало их гибели, тогда как все контрольные мыши, не получившие рибосом, погибали. Протективная активность рибосом бифидобактерий оказалась примерно в 10 раз ниже, чем у рибосом, выделенных из синегнойной палочки.

Результаты влияния бактерицидных факторов на состояние рибосомного аппарата бифидобактерий сильно отличались от других исследованных микробов. Прежде всего, для них величины минимальных бактерицидных доз некоторых антисептических веществ (хлоргексидина, хлороформа, рихлокаина -веществ, которые при действии на грамотрицательные бактерии проявляли парадоксальную концентрационную зависимость и были "способными" облегчать БОБ-лизис бацилл) оказались значительно выше, чем для остальных бактерий. ВВээ хлороформа для бифидобактерий превышала их в 3 раза, хлоргексидина - в 10 раз, рихлокаина - примерно в 15 раз. Столь резкие отличия, на наш взгляд, указывают на то, что молекулярные механизмы бактерицидного действия этих соединений на бифи-добактерии сильно отличаются от других микробов. В свою очередь, это может быть еще одним элементом объяснения, почему именно бифидобактерии служат основным компонентом нормальной микрофлоры кишечника человека.

Чувствительность рибосомного аппарата бифидобактерий к деградации при нагревании и химических бактерицидных воздействиях также сильно отличается от представителей других семейств (см. таблицу 5). Общей закономерностью для бифидо-

31

бактерий является отсутствие разрушения рибосом под действием хлоргексидина, хлороформа, рихлокаина, йода и формальдегида. Даже такой фактор, как повышенная температура (ЕЮэя), разрушает не более 1/3 рибосомного материала (СДР). Все это приводит к выводу, что, во-первых, гибель по крайней мере би-фидобактерий при минимальных бактерицидных воздействиях не связана с деградацией в клетках рибосом, во-вторых, устойчивость их рибосом к повреждающему действию антимикробных средств должна рассматриваться как один из положительных моментов взаимоотношений человека и его бифидомик-рофлоры.

Возможные механизмы деградации рибосом

Анализ собственных и литературных данных позволил нам составить представление о типах и вариантах возможных повреждений рРНК при бактерицидных воздействиях (см. таблицу 6). Мы различаем симметричную деградацию рибосом (СДР), при которой в клетке равномерно снижается содержание обеих рибо-сомных субъединиц, и асимметричную (АДР), когда преобладает разрушение одной из них. Имеется три основных (АДР1, АДРН, СДР) и несколько смешанных типов; отдельные варианты деградации отличаются друг от друга тем, какие молекулы рРНК разрушаются и какие продукты в результате этого появляются в клетке. Все основные и многие из смешанных типов деградации нами обнаружены.

Для понимания механизмов деградации рибосом у бактерий важно учесть результаты наших экспериментов, в которых in vitro изучали влияние на выделенные из клеток рибосомы бактерицидных доз исследуемых антимикробных средств. Не только минимальные бактерицидные, но и увеличение по сравнению с ними в 2 - 4 раза дозы антисептиков никак не влияют на целостность рРНК как наиболее лабильного компонента рибосом. Не изменяет свойств рРНК и нагревание суспензии рибосом в буфере при температуре, превышающей бактерицидную на 2-3°С. Все это доказывает, что обнаруженное нами разрушение рибосом in vivo не является непосредственным результатом действия антимикробных факторов. Остается предположить, что оно осуществляется клеточными механизмами, которые мы обозначили как систему специфической деградации рибосом. В наиболее пол-32

Таблица 6

Типы и варианты возможных повреждений рРНК при минимальных бактерицидных воздействиях

Тип Описание повреждений Вариант*

0 Нет повреждений рРНК после гибели 0

АДР1 Асимметричная деградация рибосом I типа: полное или частичное разрушение 16Б рРНК. 23Э рРНК сохранена 1

АДРИ Асимметричная деградация рибосом II типа: полное или частичное разрушение 238рРНК. ШрРНК сохранена 2

СДР Симметричная деградация рибосом: полное или частичное разрушение и ^Б.игЗБрРНК 3

- Появление в клетке фрагментов РНК "размером" <16Б 4

- Появление в клетке фрагментов РНК "размером" 16 - 23Б 5

Смешанные типы Различные сочетания вариантов повреждений рРНК** -

* - Для конкретизации варианта повреждений рРНК перед цифрами указывается заглавная латинская буква родового названия соответствующего микроорганизма. Например, "вариант V3" -симметричная деградация рибосом у представителя рода Vibrio.

** - Теоретически с помощью электрофореза в полиакриламидном геле можно обнаружить 12 смешанных типов деградации крупных рРНК (0-4; 0-5; 0-4,5; 1-4; 1-5; 1-4,5; 2-4; 2-5 и т.д.).

АДР - асимметричная деградация рибосом.

СДР - симметричная деградация рибосом.

ном виде она имеется у грамотрицательных бактерий. Ее наличие у грамположительных бактерий, равно как и механизмы деградации рибосом у них, остается малопонятным.

Предполагаемая система специфической деградации рибосом активируется только вполне определенными антибактериальными агентами. Анализ показывает, что общим свойством таких "рибосоморазрушающих" факторов является способность непосредственно влиять на структуру клеточных мембран и увеличивать их проницаемость. Поэтому пусковым элементом постулируемой нами системы являются, вероятно, поврежденные компоненты клеточной мембраны, а конечным, исполнительным звеном - внутриклеточные рибонуклеазы, которых сейчас для Е. coli известно около двух десятков [Deutscher М.Р., 1985]. Главный вопрос о природе "сигнала", связывающего эти звенья, остается нерешенным. Не исключено, что его роль выполняет потеря клетками ионов магния [Sakikawa Т. и др., 1989]. Косвенным подтверждением этого служит наблюдаемое нами отсутствие деградации рибосом при прогревании плотных осадков бактерий, когда ионы Mg2+ не могут выйти из клеток.

В оценке механизма деградации рибосом нельзя, на наш взгляд, игнорировать сходство трех состояний бактерий: 1) после наблюдаемого нами повреждения мембран при бактерицидных воздействиях и выхода в среду нуклеотидов; 2) вследствие ргдодания бактерий по источникам углерода; 3) при переходе культуры к стационарной фазе роста. Известно, что в двух последних случаях у бактерий разрушаются "излишние" рибосомы, не требующиея клетке в данных условиях [Kaplan R., Apirion D., 1975]. Образующиеся в результате такой деградации мономеры используются для сохранения жизнеспособности микроба. Если указанные состояния действительно сходны, в качестве вышеупомянутого "сигнала", достаточного для запуска деградации рибосом, может выступать само снижение концентрации мономеров в клетке, запускающее синтез так называемых алармонов [Лишневская Е.Б., 1984].

Наконец, имеется большое сходство описанной нами деградации рибосом при бактерицидных воздействиях и подобного процесса, сопровождающего "самоубийство" бактерий вследствие синтеза ими плазмидных киллерных белков ßto R. и др., 1985]. Эти белки не имеют ферментативной, в том числе и РНК-азной, активности, но, встраиваясь в липидный бислой, повреждают мембрану бактерии (резко увеличивают ее проницае-34

Схема

Возможные процессы, приводящие к деградации рибосом у грамотрицательных бактерий

Недостаток субстратов в среде

^ Бактерицидные воздействия, повреждающие мембрану

плазматическая

Увеличение ^Проницаем

Пул мономеров, катионы

Индукция киллерных белков | (ОеГ -подобных)

1

Потеря плазмиды

Протеазы

Активация аутолитических процессов

Изменение конформации

деградация рибосом

мость), и, как следствие, в клетке разрушается РНК (рибосомы). На основе анализа результатов собственных экспериментов и данных литературы мы предлагаем следующую гипотетическую схему (см. схему) процессов, приводящих к деградации рибосом у грамотрицательных бактерий при бактерицидных воздействиях [РоиЬеп Ь.К. и др., 1991; ве^ К. и др., 1992].

Бактерицидный агент, такой, как хлоргексидин или повышенная температура, взаимодействуя с мембраной, нарушает ее проницаемость. Это само по себе или, скорее, посредством снижения внутриклеточного содержания нуклеотидов и аминокислот (за счет выхода их в среду) имитирует состояние голодания клетки. Как одна из реакций на "голодание" в ней активируются аутолитические процессы, направленные на использование своих "избыточных" структурных компонентов в качестве источников энергии. Но так как выход низкомолекулярных продуктов деградации рибосом, в частности ее рРНК, продолжается и состояние "голодания" от этого не компенсируется, процесс разрушения РНК продолжается вплоть до несовместимого с жизнью уровня. Иными словами, минимальное бактерицидное воздействие становится фактором, который имитирует функцию киллерных белков (или, что менее вероятно, инициирует их синтез) и тем самым запускает процесс, делающий рРНК доступной клеточным РНК-азам. Рибосомные белки, лишившись рРНК-каркаса, первоначально пополняют их внутриклеточный пул и ; впоследствии тоже гидролизуются. У грамположительных бактерий подобный способ деградации рибосом либо отсутствует, либо индуцируется другими воздействиями.

Таким образом, механизм некоторых бактерицидных воздействий на грамотрицательные бактерии может заключаться в патологической стимуляции эволюционно закрепленных клеточных процессов, которые призваны деградировать "излишние", не жизненно важные в неблагоприятных условиях компоненты клетки ради сохранения ее жизнеспособности.

3. выводы

1. Разработана методология изучения механизмов бактерицидного действия различных факторов, включающая: соблюдение максимально стандартизованных условий эксперимента и постоянства физиологического состояния исследуемых микроорганизмов; сведение к минимуму проявлений самозащиты клеток в виде синтеза шоковых белков; использование минимальных бактерицидных доз повреждающих воздействий с применением нового показателя оценки их интенсивности - BD99 (Bactericidal Dose). Определены величины минимальных бактерицидных доз различных факторов при их 15-минутном действии на культуры представителей энтеробактерий, псевдомонад, вибрионов, бацилл и бифидобактерий.

2. Исследована деградация рибосом у Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio albensis, Bacillus subtilis и Bifidobacterium bifidum при минимальных бактерицидных воздействиях на их культуры нагревания, изменений pH и некоторых антисептиков; показано, что характер повреждений рибосом больше зависит от штамма и вида бактерий, чем от свойств бактерицидного агента.

3. Обнаружено, что деградация рибосом у бактерий заключается прежде всего в расщеплении рРНК. Отмечены два основных ее типа: а) симметричная деградация рибосом (СДР, когда равномерно разрушаются и 30S, и 50S субъединицы); б) асимметричная деградация рибосом (АДР, когда преобладает потеря одной из субъединиц: 30S - АДР1 тип, 50S - АДРН тип). У всех грамотрицательных бактерий выявлена либо СДР, либо АДР1. Преобладающее разрушение 50S субъединиц (АДРН) происходит только у бацилл.

4. Показано, что минимальное бактерицидное нагревание вызывает деградацию рибосом у всех исследованных бактерий: у псевдомонад и кишечных палочек (штаммы АВ301, АВ301/105, СР78, СР79 и К12-802) - разрушение в основном 30S субъединиц (АДР1); у вибрионов, бацилл, бифидобактерий и некоторых штаммов кишечной палочки (MRE600, J53, N7060, PR 13, PR 100 и Q13) - симметричную деградацию и 30S, и 50S частиц (СДР).

5. Установлено, что гибель бактерий при минимальном бактерицидном действии солей тяжелых металлов, селенитовых и теллуритовых солей, а также хлороформа, перекиси водорода, фурацилина, этанола, ацетона и хлорида натрия не сопровождается разрушением рибосом в клетках. В то же время йод, хлорамин Б, формальдегид, хлоргексидин, фенол, рихлокаин, бриллиантовый зеленый, дегмицид и салициловая кислота вызывают тот или иной тип деградации рибосом, особенности которой в основном соответствуют таковым при действии на те же штаммы повышенной температуры. Выявлены бактерицидные агенты (хлоргексидин, рихлокаин, фенол), под действием которых деградация рибосом максимальна при суббактерицидных дозах и совсем отсутствует при супербактерицидных.

6. Обнаружено, что минимальное бактерицидное закисление и защелачивание культуры энтеробактерий, псевдомонад, вибрионов и бацилл вызывает в них полную деградацию рибосом.

7. На E.coli MRE600 показано, что предварительное культивирование бактерий в условиях pH-шока приводит к тому, что последующее минимальное бактерицидное нагревание той же культуры не вызывает в клетках разрушения рибосом. Это указывает на возможное участие шоковых белков в защите рибосом от деградации.

8. Установлено, что поскольку минимальные бактерицидные дозы всех изученных антимикробных факторов in vitro не оказывают повреждающего действия на структуру рибосом, изолированных из интактных клеток, деградация рибосом при минимальных бактерицидных воздействиях не является первичной причиной утраты жизнеспособности исследованных микробов, хотя и вносит в нее существенный вклад.

9. Предложена гипотеза о наличии у грамотрицательных бактерий системы специфической активной деградации рибосом, состоящей из нескольких звеньев, первичным из которых являются компоненты клеточных мембран, а конечным, исполнительным звеном - рибонуклеазы. В экспериментах на соответствующих мутантах показано, что система stringent-контроля, а также РНК-азы I, II, III и полинуклеотидфосфорилаза не участ-38

твуют в деградации рибосом.

10. Разработан новый способ динамического анаэробного культивирования бифидобактерий и новая неагаризованная питательная среда, позволившие получить очищенную биомассу, впервые выделить рибосомы, исследовать некоторые их свойства и показать сходство последних со свойствами рибосом Е. coli. В отличие от других исследованных микроорганизмов минимальные бактерицидные воздействия у бифидобактерий не вызывают существенной деградации рибосом.

4. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лищенко H.H. Воздействие тепловой обработки на рибосо-мальный аппарат кишечной палочки МРЕ-600 // Материалы II научной конференции молодых ученых.- Краснодар, 1973.-С.57-59.

2. Лищенко H.H. Стабильность рибосомального аппарата как основа жизнеспособности клетки // В сб. "3-е Всесоюзное совещание по управляемому биосинтезу и биофизике популяций". -Красноярск, 1973. - С. 224-225.

3. Коротяев А.И., Наумов Г.Н., Лищенко H.H., Анохина Р.В О регуляции синтеза РНК и рибосом у бактерий // В кн."Проблемы регуляции обмена веществ у микроорганизмов". -Пущино-на-Оке, 1973. - С. 34-42.

4. Лищенко H.H. Динамика восстановления биосинтетических процессов у вибриона Мечникова после термального воздействия // Материалы 3-й научной конфер. молодых ученых. Краснодар, 1974. - С. 48-49.

5. Коротяев А.И., Наумов Г.Н., Лищенко H.H., Анохина Р.В Рибосомы и интенсивность основных биосинтетических процессов у бактерий II Биохимия. - 1974. - Т. 39, в.4. - С. 800-807.

6. Коротяев А.И., Лищенко H.H., Орлов В.Г., Журавлев Ю.Н. Внутриклеточное размещение рибосом у E.coli // В сб."Молекулярная биология и медицинская генетика". - Харьков,

39

1975.-С. 15-19.

7. Коротяев А.И., Орлов В.Г., Наумов Г.Н., Лищенко Н.Н. Рибосомальный аппарат бактерий. Активная регуляция содержания рибосом // Материалы 5-го съезда Всесоюзн. микробиологического об-ва. - Ереван, 1975. - С. 15-16.

8. Лищенко Н.Н. Восстановление активности рибосомального аппарата бактерий после сублетального термального воздействия // Материалы 5-го съезда Всесоюзного микробиологического общества. - Ереван, 1975. - С. 27-28.

9. Коротяев А.И., Лищенко Н.Н. Восстановление биосинтеза РНК и белка в культуре Escherichia coli MRE-600 после термального воздействия // В сб. "Биохимия и биофизика микроорганизмов". - Горький, 1977. - С. 68-72.

10. Коротяев А.И., Орлов В.Г., Лищенко Н.Н., Наумов Г.Н. Регуляция содержания рибосом у бактерий в зависимости от условий их культивирования // В сб. "Вопросы биохимии и физиологии микроорганизмов". - Саратов, 1977. - С. 91-102.

11. Лищенко Н.Н. Природа периода восстановления жизнедеятельности бактерий после сублетального термального воздействия // В сб. "Молекулярная биология бактерий". - Краснодар, 1978.-С. 86-93.

12. Лищенко Н.Н. Роль системы активной деградации рибосом в регуляции их содержания у бактерий // В сб. "Молекулярная биология бактерий". - Краснодар, 1978. - С. 9498.

13. Лищенко Н.Н. Закономерности деградации и ресинтеза рибосом у бактерий при экстремальных воздействиях // В сб. "Актуальные вопросы иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии". - Краснодар, 1978. - С. 209-211.

14. Коротяев А.И., Лищенко Н.Н. Влияние условий культивирования на биосинтез РНК и белка у бактерий после термального воздействия // В сб. "Биохимия и биофизика микроорганизмов". - Горький, 1978. - С. 17-21.

15. Лищенко Н.Н. Влияние условий культивирования на биосинтез РНК и белка у бактерий после сублетального нагревания // Тезисы докл. научной конференции Кубмединститута. -Краснодар, 1979. - С. 149-151.

16. Лищенко Н.Н., Коротяев А.И. Регуляция содержания рибосом у бактерий. Восстановление синтеза рибосом после сублетального воздействия // "Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов" (материалы симпозиума). - Пущино-на-Оке, 40

1979. - С. 299-300.

17. Коротяев А.И., Лищенко H.H. Оптимизация условий биосинтеза стафилококками внеклеточной нуклеазы // В сб.: Вопросы микробиологии, эпидемиологии и клиники инфекционных болезней. - Краснодар, 1979. - С. 7-9.

18. Коротяев А.И., Лищенко H.H. Система активной деградации рибосом у бактерий // В сб.: Актуальные вопросы иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии". - Краснодар, 1983. - С. 232-233.

19. Лищенко H.H. Деградация рибосом при сублетальном нагревании бактерий в зависимости от условий культивирования Н В кн.: Функции иммунной системы в инфекционном и неинфекционном процессе. Молекулярная биология бактерий. - Краснодар, 1984.-С. 138-142.

20. Кроличенко Т.П., Лищенко H.H., Орлов В.Г. Хромосомы, рибосомы и клеточный цикл у бактерий И Тез. докл.VII съезда Всесоюзн. микробиол. об-ва. - Т. 3: Генетика и генная инженерия. -Алма-Ата, 1985.-С. 40.

21. Коротяев А.И., Лищенко H.H. Молекулярная биология и медицина. - М.: Медицина, 1987. - 287 с.

22. Krilov V.P., Lischenko N.N. Autovaccinotherapy as immunorehabilitation method // International Journal of Immunorehabilitation. - 1994. - N.l. - P. 190-191.

23. Lischenko N.N., Orlov V.G. Ribosomal vaccines and the problem of ribosome vaccination in bacteria // International Journal of Immunorehabilitation.- 1994,-N.l.-P.208

24. Лищенко H.H. Чувствительность Bifidobacterium bifidum 791 к бактерицидному действию (DL99) повышенной температуры и некоторых дезинфектантов // Медицинские аспекты микробной экологии. - 1993/1994. - N. 7/8. - С. 98-101.

25. Лищенко H.H. Деградация рибосомальных РНК в клетках Bifidobacterium bifidum 791 при их старении и под влиянием нагревания и некоторых дезинфектантов // Медицинские аспекты микробной экологии. - 1993/1994. - N. 7/8. - С. 102-106.

26. Лищенко H.H., Орлов В.Г. Новые аспекты механизмов действия антисептических средств на грамотрицательные бактерии // Традиционные и нетрадиционные методы реабилитации больных. / Тезисы докл. II Междунар. симп. врачей (20-22 сентября 1994 г., Анапа). - Анапа, 1994. С. 238- 240.

27. Лищенко H.H., Крылов В.П., Орлов В.Г. Феномен высо-

кой термоустойчивости шигелл: зависимость от возраста культуры // В сб.: Актуальные эколого-гигиенические проблемы Северного Кавказа. - Краснодар, 1995. - С. 159-162.

28. Крылов В.П., Лищенко Н.Н., Орлов В.Г. Рибосомы как иммуногенный компонент стафилококковой вакцины (аутовакцины) // В сб.: Актуальные эколого-гигиенические проблемы Северного Кавказа. - Краснодар, 1995. - С. 136-137.

29. Лищенко Н.Н., Волкодав Л.В., Гальцева Г.В. Вибриоф-лора Черноморского побережья. Бактерицидные дозы антисептических агентов и характер повреждений рибосомального аппарата, сопровождающих гибель светящихся вибрионов // Адаптация организма при стрессовых ситуациях. / Тезисы докл. III Междунар. симп. врачей. (11-14 октября 1995 г., Геленджик). -Анапа, 1995.-С. 129-130.

30. Орлов В.Г., Крылов В.П., Лищенко Н.Н. Рибосомные вакцины - новая тенденция в современной вакцинологии // Кубанский научный медицинский вестник.- 1995.- N. 5-6.- С. 71-73.

31. Лищенко Н.Н., Волкодав Л.В. Особенности деградации рибосомальных РНК у грамотрицательных и грамположитель-ных бактерий под действием минимальных бактерицидных доз хлоргексидина и нагревания // Антибиотики и химиотерапия. -1995. Т. 40, N. 9. - С. 20-25.

32. Лищенко Н.Н., Баснакьян И.А. Симметричная и асимметричная деградация рибосом у бактерий при минимальных бактерицидных воздействиях // Журн. микробиол.- 1996.- N. 6.- С.

33. Лищенко Н.Н., Галенко-Ярошевский П.А., Гуменюк С.Е., Волкодав Л.В., Степанчук Ю.Б. Влияние минимальных бактерицидных доз хлоргексидина и других антисептических средств на рибосомы Bacillus subtilis 720 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-1996.- Т. 121, N. 5.- С. 551-554.

34. Lischenko N.N., Belkin Z.P., Volkodav L.V. Fractionation of Bifidobacterium subcellular components and their physical, chemical and immunological properties // Alpe Adria Microbiology Journal (Italy).- 1996, N. 1.- P. 35-40.