Анализ бактерицидной активности плёнок диоксида титана

Голубева, Ирина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ бактерицидной активности плёнок диоксида титана
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ бактерицидной активности плёнок диоксида титана"

На правах рукописи

*<Г

Голубева Ирина Сергеевна

АНАЛИЗ БАКТЕРИЦИДНОИ АКТИВНОСТИ ПЛЁНОК ДИОКСИДА ТИТАНА

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 НОЯ 2013

Саратов - 2013

005537192

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородский государственный технический университет им. Р. Е. Алексеева»

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Плескова Светлана Николаевна

Официальные оппоненты: Тихомирова Елена Ивановна

доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.», заведующая кафедрой «Экология».

Ерошенко Галина Александровна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, главный научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии отдела микробиологии

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный

университет имени Н.Г. Чернышевского»

иср

Защита состоится «28 » ноября 2013 г. в 7<* часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 на базе ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335

Автореферат диссертации разослан «¿13» октября 2013 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор а, Карпунина Лидия Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из центральных задач микробиологии является исследование пределов толерантности бактерий к изменяющимся условиям внешней среды. Эта задача имеет очевидную практическую значимость, поскольку позволяет решать целый ряд проблем прикладной микробиологии, подбирая условия для создания бактерицидных материалов и поверхностей. Необходимость в принципиально новых подходах к решению практических задач обусловлена выраженной экологической пластичностью бактериальных сообществ. В частности, резистентность к лекарственным препаратам (в том числе к антибиотикам) и дезинфектантам объясняется феноменом «горизонтальной эволюции». Важным резервуаром для патогенных и условно-патогенных бактерий в ветеринарной и медицинской практике являются поверхности пола, мебели, выступов, подоконников, всех классов ветеринарного и медицинского оборудования и т.д. (Dancer, 2008). Поэтому необходимо создавать самоочищающиеся и бактерицидные поверхности и исследовать условия, при которых самостерилизация реализуется наиболее эффективно.

В настоящее время создаются и изучаются новые классы тонкослойных покрытий с заданными свойствами. Одним из таких материалов является диоксид титана. Тонкие плёнки диоксида титана обладают целым рядом ценных свойств. Они применяются в фотогальванике, для деградации органических соединений, в качестве самоочищающихся покрытий и в сенсорных устройствах (Prüden и соавт., 1983; Matthews, 1988; Matthews, 1992; Sabin и соавт., 1992). Несмотря на широкую область применения, наиболее перспективным представляется внедрение тонких плёнок диоксида титана для решения задач прикладной микробиологии и биотехнологии, в частности их используют в качестве антибактериальных покрытий, а также для очищения сточных вод и воздуха (Ни и соавт., 2007; Rengifo-Herrera и соавт., 2010).

Несмотря на то, что факт бактерицидности УФ-индуцированных тонких плёнок был установлен 28 лет назад (Matsunaga и соавт., 1985) и к настоящему времени выявлена стерилизующая активность в отношении целого ряда бактерий и вирусов, многие аспекты реализации биоцидности остались не установленными. С практической точки зрения важно подобрать и обосновать условия, при которых бактерицидная активность тонких плёнок реализуется максимально.

рассматриваются механизмы формирования активных форм кислорода (АФК) под влиянием ультрафиолета на поверхности полупроводников, но не делается акцент на микробиологической составляющей и не приводится доказательств морфологических видоизменений бактериальных клеток. В статье L. Armelao и соавт. (2007) даются доказательства гибели бактерий на поверхности фотоиндуцированных плёнок диоксида титана. Однако в представленной работе проводились исследования только одного штамма бактерий. В тоже время для оценки резерва бактерицидной активности Г(02-пленок и возможности их практического использования необходимо проведение исследований бактерицидности как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных микроорганизмов. Тот же недостаток отмечается и для большинства работ, в которых исследуется бактерицидность 7г'02-пленок (Saito и соавт., 1992; Manness и соавт., 1999; Sunada и соавт., 2003; Cheng и соавт., 2007). Еще одной важной проблемой является отсутствие данных о воспроизводимости бактерицидного эффекта при многократном использовании пленок. Поэтому расширение спектра тестируемых микроорганизмов и получение данных о воспроизводимости бактерицидного эффекта являются важной задачей.

Цель работы - изучение бактерицидных свойств УФ-индуцированных плёнок диоксида титана в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и модуляция условий для эффективности и воспроизводимости бактерицидного эффекта. Задачи исследования:

1. Показать возможность образования активных форм кислорода на поверхности тонких плёнок диоксида титана в процессе окисления адреналина и метиленового синего;

2. Исследовать эффективность и воспроизводимость УФ-индуцированной бактерицидности тонких плёнок диоксида титана в отношении музейных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий;

3. Подобрать физико-химические условия обработки ТЮг-плёнок для достижения максимального бактерицидного эффекта;

4. Оценить динамику бактерицидной активности УФ-индуцированных тонких плёнок диоксида титана в промежутках времени от 15 до 60 минут;

5. Проанализировать изменения бактерицидной активности в условиях модуляции микробиологической составляющей в комплексной системе «7702-плёнки - УФ - бактерии».

Научная новизна. Впервые проанализирована бактерицидная активность УФ-индуцированных плёнок диоксида титана в отношении широкого спектра музейных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий. Впервые выявлены, что после однократной инкубации бактериальной суспензии под УФ-светом происходят изменения свойств поверхности с гидрофобных на гидрофильные. Кроме того, предложено два способа (термический отжиг и химическая обработка бензолом) для восстановления бактерицидного эффекта тонких плёнок. Впервые показано, что структурная модуляция бактериальных клеток (лиофилизированные клетки и сферопласты) приводит к повышению бактерицидной активности 7702-плёнок. Впервые установлена решающая роль

воды, как центрального кондиционирующего фактора в системе «ТЮ2-плёнки -бактерии».

Практическая значимость работы. Полученные методом золь-гель технологии плёнки диоксида титана в перспективе можно использовать в качестве эффективных антибактериальных и самоочищающихся поверхностей в различных областях народного хозяйства. В прикладной микробиологии, ветеринарии и медицине - для покрытия хирургического (в том числе эндоскопического) инструментария и поверхностей для предотвращения контаминации антибиотикорезистентными штаммами бактерий. В области экологического природопользования - для дезинфекции и доочистки воды и создания специализированных устройств безопасного разложения органических отходов, а также для производства самоочищающихся стекол. Предложенные методы обработки поверхностей (термический и химический) возвращают покрытиям исходные бактерицидные свойства.

Результаты диссертационной работы использованы в учебном процессе, лекциях и практических занятиях по курсу «Основы микробиологии», а также были использованы при написании дипломных работ и магистерских диссертаций в Нижегородском государственном техническом университете им. P.E. Алексеева.

Методология и методы исследования. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы. При проведении исследований и изложении материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описание, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа.

Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов. Положения, выносимые на защиту:

1. Бактерицидная активность тонких плёнок в отношении разных штаммов бактерий выражена не одинаково. В наибольшей степени к сочетанному воздействию ультрафиолета и активных форм кислорода, генерируемых на '/¿'CV поверхностях чувствительны грамположительные бактерии.

2. Свойства поверхности 770гплёнок изменяются после инкубации на ней суспензии бактериальных клеток. Однако гидрофобность можно восстановить путем термической (отжиг) или химической (бензол) обработки.

3. Вода является принципиальным фактором модулирующим взаимодействие в системе «Г/Ог-плёнки - бактерии».

4. Атака активными формами кислорода, генерируемыми на 7702-поверхности ультрафиолетом (Хтах=365 нм) приводит к полному уничтожению бактериальной клетки и морфологическим доказательством разрушения бактерий являются результаты, полученные с помощью метода атомно-силовой микроскопии.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на: II Международной научно-практической конференции

«Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г. Казань, 2008), XII Международной Путинской школе-конференции молодых ученых (г. Пущино, 2008), VIII и X Международной молодёжной научно-технической конференции «Будущее технической науки» (г. Нижний Новгород, 2009, 2011), Всероссийской школе-семинаре по тематическому направлению деятельности национальной нанотехнологической сети «Конструкционные наноматериалы» (г. Москва, 2010); III Межвузовской научной конференции «Наука молодых» (г. Арзамас, 2010); III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (г. Нижний Новгород, 2010); 1-ой и 2-ой интернациональной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (г. Москва, 2009, 2011); XVI «Нижегородской сессии молодых учёных - естественные науки» (г. Нижний Новгород, 2011); III Международной конференции «Высокоинтенсивные физические факторы в медицине, биологии, сельском хозяйстве и экологии» (г. Саров, 2011).

Личный вклад автора. Лично автором диссертации проведен обзор современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, экспериментальные исследования по изучению бактерицидных свойств УФ-индуцированных плёнок диоксида титана в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и модуляции условий для эффективности и воспроизводимости бактерицидного эффекта, а также была самостоятельно проведена систематизация и анализ полученных результатов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах и состоит из введения; обзора литературы; объектов, материалов и методов исследования; результатов исследований и их обсуждения; заключения; выводов и списка использованной литературы. Работа содержит 45 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 198 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект, материалы и методы исследования

Объектом исследований являлись культуры грамотрицательных бактерий: Escherichia coli 321-5; Klebsiella oxytoca 525; Klebsiella pneumoniae 527; Pseudomonas aeruginosa 9691; Proteus vulgaris 1212 и грамположительных бактерий: Staphylococcus aureus 455; Staphylococcus aureus 956; Staphylococcus epidermidis 1061; Enterococcus faecalis 971; Enterococcus faecium 2381; Micrococcus species 5028. Бактериальные культуры являются музейными штаммами ННГУ им. Н.И. Лобачевского.

770гплёнки синтезированы на базе ИПФ РАН (Н. Новгород) методом золь-гель технологии и проанализированы с помощью рентгеноструктурного анализа в Лаборатории междисциплинарных исследований университета Бургундии (Дижон, Франция).

Источник энергии активации поверхности - УФ-лампа ВИО-2 (Украина). Плотность мощности светопотока - 4,5 мВт/см2. Короткий УФ отсекали светофильтром УФС-6.

Для доказательства формирования АФК на поверхности фотоиндурованных 7702-плёнок использовали растворы адреналина и метиленового синего. Окисление органических соединений оценивали спектрофотометрически.

Для исследования бактерицидной активности 7702-нлёнок суспензию бактерий (для разных штаммов концентрация находилась в пределах от 5,3x107 до 1,3х 108 м.о/мл) наносили на поверхность плёнки диоксида титана (опыт), и на поверхность стерильного стекла (контроль). Образцы облучали УФ (15 минут). Затем 0,05 мл суспензии высевали на МПА/среду Плоскирева и после экспозиции (20-24 ч, 37 °С) оценивали КОЕ в контроле и опыте (Armealo и соавт., 2007). Для определения динамики бактерицидной активности суспензию микроорганизмов облучали в течение 15, 30, 45 и 60 минут.

Бактерицидная активность УФ-индуцированных 7702-плёнок оценивалась в отношении лиофилизированных штаммов бактерий и сферопластов. Лиофилизацию бактерий проводили в ООО «НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород). Лиофилизированные штаммы инкубировали на поверхности 7702-плёнок (опыт) и на поверхности стекла (контроль) под УФ, затем переносили в пробирки, заливали МПБ и инкубировали (37° С, 72 ч). Бактерицидность оценивалась спектрофотометрически (^.=670 нм), в результате измерения коэффициента экстинкции по формуле:

Бактерицидность = 100% - 100 * , где

О 670 ~ коэффициент экстинкции опытной пробы,

К 670 _ коэффициент экстинкции контрольной пробы.

Сферопласты получали по методике К. Sunada и соавт. (2003). Подтверждение образования сферопластов проводили на кафедре зоологии биологического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского (Н. Новгород) с использованием микроскопа MEIJ1 TECHNO МТ4000 (Япония).

Исследование морфологии бактерий проводили на базе НОЦ ФТНС ННГУ им. Н.И. Лобачевского на установке

SOLVER ВЮ™ (NT-MDT, Зеленоград). Суспензию бактерий в дистиллированной воде (0,05 мл) инкубировали под УФ на поверхности 7702-плёнок (опыт) и стекла (контроль) в течение 60 минут, затем проводили сканирование поверхности клеток с использованием зондов DNP-10 (Bruker, США). Для обработки и визуализации сканируемых объектов использовали программу Nova NT-MDT SPM Software (NT-MDT, Зеленоград).

Для статистической обработки экспериментального материала использовали Microsoft Excel 2007, Origin 7,0 Server, Origin 8,0 Server (OriginLab Corparation, США), Биостатистика для Windows и DOS 1BM-PC, Version 4.03 (MCGraw Hill). Оценку соответствия экспериментальных данных нормальному распределению проводили с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для нормальных распределений рассчитывали среднее арифметическое значение, стандартные отклонения и их доверительных интервалы. Для сравнения трёх подгрупп использовали однофакторный дисперсионный анализ. Если параметры выборок не соответствовали критерию нормального распределения, то оценку

статистической значимости различий в группах наблюдения проводили с использованием критерия Вилкоксона.

Результаты исследований и их обсуждение

Рентгеноструктурный анализ плёнок диоксида отцота;;аБактерицидные свойства диоксида титана проявляются в том случае, если плёнка облучается светом с энергией выше ширины запрещенной зоны. Наиболее эффективна для генерации АФК анатазная кристаллическая структура (Тапака и соавт., 1991). Исследование кристаллической структуры ТЮ2-плёнок проводили при помощи рентгеноструктурного анализа, позволяющего на основании определения углов Х-лучевой дифракции и дисперсии и последующего сравнения полученных величин с образцами, делать заключения о принадлежности диоксида титана к кристаллической структуре анатаза, рутила либо брукита. Результаты исследования показаны на рисунке 1. Они свидетельствуют о том, что ТЮ2-плёнки полученные методом золь-гель технологии и оттожженные при 450°С имеют кристаллическую структуру анатаза.

Длфраылюнный угол, 20

Ргтптеттограмма диоксида титана на стеклтовтон псдложхе шаг O.OÏO*. время шага I с; Г=25*С Рентгенограмма диоксида плана на гтгкляитон поплошее шаг 0,030*. время шага 1 с;Т=2>*С

Ремпеногрэмиэ пленок диоксида пиана полненных методом золь-гель технологии грани кристаллнчесхой решетки a-tF3,7î2 А. с-9,502 А . vtjtij е крисга^ветеской решетке 'гЬ'1- 90*. пик ызкеиматв-кой дифракции - 25.5 "в.

Рисунок I - Рентгеноструктурный анализ ГЮг-плёнки, синтезированной методом золь-гель технологии. Пики соответствуют параметрам решетки анатаза (a=b=3,782 À, с=9,502 А). Пик максимальной дифракции - 25,5 °0 также соответствует анатазу

Окисление органических веществ на поверхности плёнок диоксида титана

Доказательством формирования АФК на поверхности плёнок диоксида титана является окисление органических веществ. Оценку степени окисления проводили спектрофотометрически, измеряя изменение коэффициента экстинкции растворов адреналина (CgH/iNOt) и метиленового синего (Ci6H ixCINjS-HiO), поскольку существует большое количество работ, демонстрирующих изменение светопропускания этих веществ при окислении (Сирота, 1999; Shimizu и соавт., 2007; Yao и Wang, 2010). Результаты представлены на рисунке 2 и 3.

го раствор м

ГО HD rv ri'.í 'H V r* ТЮ2 'г......и ПОД уф.с

900 1000 1100 длина волны, км

Рисунок 2 - Спектры светопропускания раствора адреналина, измеренные в диапазоне длин волн 200 - 1200 нм. На характерном для адреналина пике (280 нм) отмечается снижение максимума светопропускания на 12% после обработки УФ и на 20% после обработки УФ на поверхности 7702-плёнок. Адренохром, пик светопропускания которого отмечается па 480 нм, появляется при УФ-облучении раствора адреналина па поверхности TiOi-nnëuок

200 Ш

Рисунок 3 - Спектры светопропускания раствора метиленового синего, измеренные в диапазоне длин волн 300 - 1050 нм. На характерных для метиленового синего пиках па 377 и 417 нм отмечается снижение максимума светопропускания на 10% после обработки УФ и на 15% после обработки УФ на поверхности 7702-плёиок

Помимо снижения интенсивности светопропускания исследуемых растворов, свидетельствующем об их окислении, наблюдается изменение рН. В частности, рН раствора адреналина изменился с 3,2 в начале эксперимента на 5,2 после 3-х часовой инкубации, а для рН метиленового синего регистрировалось изменение с первоначального 6,9 до 4,8.

Проведенные эксперименты, с одной стороны доказывают образование АФК на поверхности 7702-плёнок, а с другой демонстрируют перспективность применения диоксида титана в решении экологических задач, в частности для решения проблем загрязнения поверхностей органическими веществами.

Бактерицидная активность ТЮ?-плёнок

АФК, генерируются на поверхности Г/02-плёнок под действием УФ (>-тах=365 нм) в ходе каскада реакций, суммированных в работе К. Hashimoto и соавт. (2005):

Ti02 + hv ^ Ti02(e + h+) (l)

Ti02(h+) + Н20ads -» ТЮ2 + 0Hads + Н+ (2)

Ti02(h+) + 0H~ads -> ТЮ2 + 0Hads (3)

ТЮ2(ё) + 02 -> Ti02 + Of (4)

Выживаемость бактерий под действием атаки АФК оценивают по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) на поверхности агара (рисунок 4).

Рисунок 4 - Снижение числа КОЕ после инкубации бактериальной суспензии 5. ерМегт'иИй 1061 в течение 15 минут: а - бактерии под УФ-светом на поверхности стекла, б - бактерии под УФ-светом на поверхности 7/'02-плёнок

Результаты, представленные на рисунке 5 демонстрируют, что для большинства бактериальных сообществ уже 15 минут инкубации под воздействием двух абиотических факторов (АФК, генерируемых 7/02-плснками и УФ) достаточно для существенного снижения жизнеспособности.

* уровень значимости р * о,001 " Уровень значимости р <■ 0,01 *** Уровень значимости р 0,05

Рисунок 5 - Снижение числа КОЕ после воздействия УФ на бактериальную суспензию, на поверхности стекла и поверхности плёнок диоксида титана. Время инкубации 15 минут

Наибольшая чувствительность к бактерицидному действию как УФ, так и сочетанного воздействия УФ+АФК зафиксирована для грамположительных штаммов S. aureus 956 (снижение жизнеспособности на 42,8% и 70,8% соответственно) и Micrococcus species 5028 (снижение жизнеспособности на 52,4% и 68,1% соответственно). В тоже время для двух грамотрицательных штаммов К. pneumoniae 527 и P. vulgaris 1212 не выявлено статистически значимого снижения жизнеспособности (р>0,05). Отсутствие бактерицидного эффекта в отношении этих двух штаммов мы связываем с особенностями экстрацеллюлярных структур бактериальных клеток. В частности, окраска по Бурри-Гинсу выявила наличие развитой капсулы у клебсиелл, а атомно-силовая микроскопия (АСМ) показала, что у строгих швермеров - протеев имеется выраженное перитрихиальное жгутикование. В этом случае поверхностные структуры бактериальных клеток выступают в качестве своеобразных «ловушек» для АФК. Гашение АФК экстрацеллюлярными структурами препятствует атаке клеточной стенки, благодаря чему бактерии выживают. В целом можно отметить, что грамположительные микроорганизмы оказались более чувствительными к атаке АФК, генерируемым на поверхности плёнок диоксида титана, чем грамотрицательные.

Высокая бактерицидная активность двух абиотических факторов (УФ и АФК) позволяют рекомендовать плёнки диоксида титана в качестве высокоэффективных антибактериальных покрытий в тех областях, где поддержание стерильности является принципиальным требованием (операционные блоки, палаты реанимации и т.д.). Однако для их внедрения в практику необходимо оценить не только эффективность, но и воспроизводимость системы.

Исследование воспроизводилюсти бактерицидного эффекта па поверхности тонких плёнок диоксида титана

Воспроизводимость бактерицидных свойств 7"/02-плёнок тестировалась на штаммах с высокой и средней чувствительностью к АФК, генерируемых TiOj-поверхностями. Перед повторным использованием тонких плёнок их подвергали стерилизации физическим методом: экспозиция в сухожаровом шкафу (180° С, 60 минут). Затем вновь проводили тестирование выживаемости бактериальных суспензий на поверхности стекла под УФ и на поверхности 7702-плёнок, индуцированных УФ. Как свидетельствуют результаты, представленные на рисунке 6, бактерицидная активность плёнок в отношении большинства штаммов сохранилась, но существенно снизилась. При повторном использовании TiOj-поверхностей обнаружено, что для двух штаммов Е. coli 321-5 и Е. faecium 2381 чувствительность к АФК полностью утрачена

Согласно работам К. Hashimoto и соавт. (2005) явление утраты биоцидности могло быть связано с изменением физико-химических свойств Т1О2-плёнки (утратой фотокаталитической активности в связи с появлением супергидрофильности). Для подтверждения этой идеи была поставлена серия экспериментов по измерению краевого угла дистиллированной воды на поверхности УФ-индуцированных 77(?2-плёнок (рисунок 7).

' урове нь значимости р ' 0,001 *' уровень значимости р ^ 0,01 *" уровень значимости р.- 0,05

Рисунок 6 - Снижение числа КОЕ после воздействия УФ на бактериальную суспензию, находящуюся на поверхности стерилизованного стекла и поверхности стерилизованных, повторно используемых плёнок диоксида титана. Время инкубации - 15 минут

Рисунок 7 - Изменение краевого угла дистиллированной воды на поверхности ТЮ2-плёнки: а - поверхность гидрофобна, если капля воды инкубирована на поверхности ТЮ2-плёнок без УФ (5 минут) - краевой угол 134°, б - после 5 минут облучения УФ капли воды на 77<9Гплёнке поверхность становится гидрофильной -краевой угол 42°

Таким образом, на поверхности Т702-плёнок протекает параллельно два фотохимических процесса: образование активных форм кислорода и гидрофилизация поверхности. По нашему мнению, дырка, образуемая на поверхности из-за отрыва электрона вступает в немедленную реакцию с водой, вследствие чего 7702-плёнка гидрофилизируется и больше не может быть донором электронов для образования АФК. При повторном использовании плёнок поверхность, приобретающая свойство гидрофильности в значительной степени утрачивает бактерицидную активность.

Кондиционирование ТЮ?-пяёнок для воспроизводимости и эффективности бактерицидной активности

Было предложено два метода устранения эффекта гидрофилизации и реверсии бактерицидных свойств 7702-поверхностей: физический (отжиг) и химический (обработка бензолом). Для повышения эффективности бактерицидных свойств 7702-плёнок после первой инкубации под УФ светом их повторно отжигали в муфельной печи (450°С, 3 ч) и тестировали в системе с бактериями. Результаты представлены на рисунке 8.

Представленные результаты демонстрируют, что повторный отжиг поверхности вызывает восстановление бактерицидности в отношении нескольких штаммов (в том числе Е. ¡аес'шт 2381), тогда как для других штаммов нет

статистически значимых различий между контролем и опытом (например, для Е. coli 321-5 р>0,05). По всей вероятности, при повторном отжиге не происходит полного удаления гидроксильных групп, адсорбированных поверхностью.

в суспензия баткрий на воздействия УФ-светз

■ суспензия бактерий на поверхности стекла пол

V- ^ ¿г - у

* Уровень значимости р < 0,001 ** Уровень значимости р < 0,01 ""* Уровень значимости р< 0,05

Рисунок 8 - Снижение числа КОЕ под УФ воздействием на бактериальную суспензию, находящуюся на поверхности стекла и поверхности повторно отожжённых плёнок диоксида титана. Время инкубации составляет 15 минут

Был апробирован химический метод обработки гидрофилизованных поверхностей. Для этого использованные 7702-плёнки инкубировали с бензолом: в чашки Петри (0 40 мм) (контроль) и чашки Петри с нанесенными на них 77 О 2-плёнками заливали 1 мл бензола и экспонировали в вытяжном шкафу в течение 24 часов. За время экспозиции бензол полностью испарялся, после чего на обработанных поверхностях исследовали динамику бактерицидной активности в отношении Б.ерМегпй/Иьг 1061. Результаты суммированы в таблице 1.

Таблица 1 -Динамика снижения жизнеспособности 5.ер^епг^1в 1061 (КОЕ) на

поверхности химически обработанных 7/0;-плёпок (бензол, 24 часа)

Штамм Время инкубации 15 минут 30 минут 60 минут

S.epidermidis Контроль 100,7±24,7 87,4±15,2 83,5±14,1

1061 УФ 81,4 ± 26,2 82,4 ± 29,4 38,8 ± 19,1

УФ+АФК 17,6± 15,9* 2 ±2* 0±0**

(1=20,0; df=7; (t=20; df=7; (t=17; df=5;

р=0,00002) р=0,00002) р=0,00417)

Примечание - * Уровень значимости р < 0,001, ** Уровень значимости р < 0,01.

Они доказывают, что обработка бензолом вызывают полную реверсию бактерицидных свойств 7702-плёнок.

Однако, для сохранения гидрофобности поверхностей, после обработки бензолом не проводилась отмывка, т.к. внесение воды вновь могло вызвать гидрофилизацию. Для исключения предположения о бактерицидной активности остаточного бензола, было проведено сравнительное исследование жизнеспособности штамма на поверхности не обработанного стерильного стекла (контроль) и стерильного стекла, обработанного бензолом в том же режиме, в котором ранее обрабатывались ТЮ2-плёнки (опыт). Результаты, представленные в таблице 2, демонстрируют полное отсутствие влияния на жизнеспособность штамма Б.ер'^егт'иНз 1061 предварительной обработки поверхностей бензолом.

Таблица 2 - Жизнеспособность З.ер111еггтс118 1061 (КОЕ) на поверхности стекла

(контроль) и стекла, обработанного бензолом (опыт)

Штамм Время инкубации 15 минут 30 минут 60 минут

S.epidermidis 1061 ' контроль 114,7 ± 13,3 97,8 ± 24,2 92,1 ± 14,2

УФ 107,3 ±22,7 (t=l,0; df=I 1; Р=0,3) 106,0 ±24,6 (t=-l,l;df=12; р=0,3) 96,7 ±21,6 (t=-0,5; df=9; Р=0,6)

Таким образом, химический метод обработки оказался эффективным для восстановления бактерицидной активности 7702-поверхностей.

Динамика бактерицидной активности ТЮгплёнок

Поскольку все фотохимические реакции реализуются во времени, важно не только подобрать оптимальные экологические составляющие (определенная длина волны, мощность излучения, состав плёнок, генерирующих АФК, плотность суспензии, размер капли и т.д.) но и определить динамику активности бактерицидных поверхностей. Для этого проводили анализ бактерицидности УФ-индуцированных 77(92-плёнок (первичных, использованных и отожженных при 450°С) в течение 60 минут. Результаты исследования суммированы в таблице 3 и 4.

Очевидно, что штаммы наиболее чувствительные к УФ оказываются и максимально чувствительными к комплексному воздействию УФ и АФК, генерируемым 77С>2-плёнками. В частности, для двух штаммов S. aureus 956 и Е. faecium 2381 60 минут экспозиции на УФ-активированных поверхностях достаточно для практически полного подавления жизнеспособности.

В целом можно отметить два варианта динамики для штаммов, подвергающихся сочетанному воздействию УФ и АФК, генерируемых ТЮ2-плёнками. Для трех штаммов (S. epidermidis 1061, S. aureus 455 и E.coli 321-5) максимальное снижение жизнеспособности отмечено уже в первые 15 минут инкубации на бактерицидных поверхностях, и дальнейшее увеличение времени экспозиции мало влияет на количество КОЕ. Но для большинства штаммов наблюдается снижение выживаемости на 7702-повеРхностях при увеличении времени воздействия УФ и АФК.

Таблица 3 -Динамика бактерицидной активности УФ и сочетанного воздействия УФ+АФК на поверхности первично используемых 7702-плёнок

Штамм Время инкубации 15 минут 30 минут 60 минут

S. Контроль 120,2 ±25,6 120,2 ±23,9 120,2 ±25,6

epidermidi УФ 125,6 ± 11,4 100,1 ± 18,7 125,6 ± 11,4

s 1061 УФ+АФК 57,9 ±25,4 * 57,9 ±25,4 * 57,9 ±25,4 ***

(df=23; F= 23,8; (df=26; F= 39,7; (df=20; F= 41,6;

N=8) N=9) N=7)

S. aureus контроль 265,7 ±31,1 231,4 ±36,7 231,7 ±44,5

956 УФ 107,7 ± 12,5 66,8 ± 13,2 25,0 ± 11,2

УФ+АФК 73,6 ± 12,2 * 40,6 ± 16,6 *** 12,0 ± 13,9 *

(df=32; F= 272,9; (df=23; F= 142,8; (df=26; F= 178,2;

N=I 1) N=8) N=9)

S. aureus Контроль 155,3 ±27,7 152,8 ±29,2 147 ± 18,5

455 УФ 132,2 ± 19,0 119,4± 17,17 92,4 ± 10,1

УФ+АФК 99,8 ± 13,2 * 99,5 ±22,4 *** 61,4 ± 11,1 *

(df=17; F= 10,7; (df=29; F= 13,2; (df=20; F= 69,5;

N=6) N=10) N=7)

E. faecal is Контроль 105,0 ±8,6 101,8 ± 9,5 98,8 ± 8,2

971 УФ 90,9 ± 2,0 88,5 ±4,7 70,3 ± 6,6

УФ+АФК 71,6 ± 11,2 ** 64,0 ± 4,6 * 41,5 ± 11,9 *

(df=23; F= 32,9; (df=23; F= 66,6; (df=23; F= 78,3;

N=8) N=8) N=8)

E. faecium Контроль 127,1 ± 16,3 113,1 ± 11,1 101,6± 11,6

2381 УФ 109,9 ± 19,4 98,5 ±6,5 27,1 ±4,6

УФ+АФК 76,1 ± 7,0 ** 62,5 ±6,8 * 14,4 ±6,3 *

(df=23; F= 23,5; (df=23; F= 77,3; (df=23; F= 271,8;

N=8) N=8) N=8)

E.coli 321- Контроль 112,8 ±24,8 110,4 ± 17,2 97,9 ± 25,4

5 УФ 102,7 ± 13,2 102,5 ± 17,8 96,2 ± 29,7

УФ+АФК 85,1 ± 15,3 ** 77,5 ± 18,5 *** 44,4 ± 19,6**

(df=47; F= 9,3; (df=38; F= 12,1; (df=26; F= 13,1;

N=16) N=13) N=9)

K. oxytoca Контроль 126,5 ± 11,7 125,6 ± 18,4 124,2 ± 12,8

525 УФ 112,5 ±7,5 100,4 ±5,1 81,3 ±9,6

УФ+АФК 90,1 ± 10,2 ** 75,6 ± 12,6 * 48,5 ±6,7 **

(df=29; F= 34,1; (df=26; F= 32,4; (df=29; F=

N=10) N=9) 143,995; N=10)

P. Контроль 136,8 ±9,2 133,6 ± 10,8 134,8 ± 10,7

aeruginosa УФ 109,3 ± 17,1 98,8 ± 15,1 78,4 ±4,9

969, УФ+АФК 62,3 ± 14,9 * 41,8 ± 13,9 * 24,1 ±3,0**

(df=26; F= 63,9; (df=26; F= 108,4; (df=23; F= 499,9;

N=9) N=9;) N=8)

Примечание - * Уровень значимости р < 0,001, ** Уровень значимости р < 0,01, *** Уровень значимости р < 0,05.

Таблица 4 - Динамика бактерицидной активности УФ и сочетанного воздействия УФ+АФК на поверхности повторно используемых и отожженных __ при 450°С 77Ргплёнок__

Штамм Время инкубации 15 минут 30 минут 60 минут

На поверхности повторно используемых плёнок

S. aureus 956 Контроль 265,7 ±31,1 231,4 ±36,7 231,7 ±44,5

УФ 242,9 ± 34,9 223,5 ±41,9 169,3 ±23,3

УФ+АФК 137,3 ±33,2* 111,6 ±27,6** 24,9 ± 10 *

(df=32; F= 47,3; (df=23; F= (df=26; F= 115,6;

N=11) 27,9; N=8) N=9)

E.coli 321-5 Контроль 130,6 ±25,9 121,6 ± 13,4 121,5 ±7,6

УФ 121,9 ± 35,0 121,0 ±23,4 120,6 ±27,7

УФ+АФК 102,2 ±23,4 93,6 ± 10,4** 65,9 ± 22,2 *

(df=23; F= 2,1; (df=29; F= 9,2; (df=23; F= 18,5;

N=8) N=10) N=8)

На поверхности плёнок отожженных при 450°С

S. aureus 956 Контроль 266,3 ± 32,7 231,4 ±36,7 230,0± 47,3

УФ 136,4 ±40,7 127,4 ±9,2 91,1 ±9,6

УФ+АФК 98,8 ± 26,5 * 42,1 ±4,6 * 3,1 ± 1,4 *

(df=29; F= 67,6; (df=23; F= (df=23; F= 134,7;

N=10) 148,4; N=8) N=8)

E.coli 321-5 Контроль 113,3 ± 16,9 109,6 ±29,7 103,3 ±26,7

УФ 109,3 ±31,3 95,3 ± 30,6 94,8 ± 24,9

УФ+АФК 79,9 ±21,8 *** 62,9 ± 19,8 * 47,8 ±4,3 **

(df=26; F= 5,2; (df=32; F= 8,6; (df=23; F= 14,8;

N=9) N=11) N=8)

Примечание - * Уровень значимости р < 0,001, ** Уровень значимости р < 0,01, *** Уровень значимости р < 0,05

Вероятнее всего эти различия обусловлены разной чувствительностью клеточной стенки бактерий к фотооксидации. Это предположение было подтверждено методом атомно-силовой микроскопии. Если для S. aureus 956 после часовой инкубации на поверхности 7702-плёнок отмечена агрегация и полное разрушение клеток, то для Е. coli 321-5 отмечается только значительное * увеличение объема (набухание), но «теней» клеток, как в случае со стафилококком не обнаруживается.

Тем не менее, было отмечено (таблица 4), что увеличение времени инкубации на поверхности повторно используемых плёнок до 60 минут приводит к статистически значимому снижению выживаемости E.coli 321-5, хотя и для S. aureus 956 и для E.coli 321-5 бактерицидная активность неоднократно используемых 7702-плёнок оказывается значительно ниже, чем у первично используемых. Отжиг в жестких условиях (450°С), напротив, приводит к увеличению бактерицидной эффективности поверхности. По всей вероятности, под воздействием высокой температуры происходит не только восстановление гидрофобности поверхностей, но и изменение ее микроструктуры. Хотя

рентгеноструктурный анализ показывает, что кристаллическая структура анатаза сохраняется и после отжига.

Бактерицидная активность ТЮу-плёнок в отношении лиофилизироваиных бактерий

Была показана решающая роль воды в изменении физико-химических свойств поверхности. Необходимо было определить, каким образом этот фактор влияет на эффекты взаимодействия в системе « 7702-плёнки - бактерии», если кондиционировать микробную составляющую. Для реализации этой задачи бактерии подвергали лиофильной сушке, т.е. исключали воду из системы. В этом случае появляется возможность исследования бактерицидного эффекта плёнок многократно без изменения изначальных гидрофобных свойств поверхности. Однако традиционный метод оценки КОЕ в данном случае не подходил, поэтому нами была разработана спектрофотометрическая методика определения бактерицидного эффекта 7702-плёнок. Она включала следующие этапы: (1) лиофилизированные микроорганизмы (2,2х108 м.о) насыпали на поверхность стекла экспонированного в стерильных условиях без доступа УФ (контроль); на поверхность стекла, экспонированного под УФ (опыт 1) и Г/Ог-плёнок, экспонированных в потоке УФ (опыт 2); (2) через 15 минут бактерии сухо переносили в мясо-пептонный бульон (МПБ) и инкубировали 37 °С, 72 ч; (3) к моменту выхода культуры на стационарную фазу роста количество бактерий в МПБ определяется изначальной концентрацией выживших на поверхностях бактерий - поэтому проводилась спектрофотометрическая оценка коэффициента экстинкции контрольных и опытных проб против стерильного МПБ (670 нм); (4) бактерицидность оценивали в процентах по формуле:

Бактерицидность = 100% - КЮ*°'',°. Где

О 670 - коэффициент экстинкции опытной пробы (опыт 1 или опыт 2),

К 670 - коэффициент экстинкции контрольной пробы;

(5) после использования стекла и 7701-плёнки стерилизовали в стандартном режиме (180°С, 60 минут) и использовали повторно согласно вышеизложенному протоколу.

Результаты бактерицидной активности Т/Ог-плёнок в отношении лиофилизироваиных штаммов S.aureus 956 и E.coli 321-5 показаны в таблице 5. Проводилось попарно сравнение бактерицидного эффекта УФ и сочетанного эффекта УФ и АФК, генерируемых 770г-плёнками для каждого штамма отдельно.

Анализ представленных данных позволяет сделать три практически важных заключения. Во-первых, повторное использование плёнок в отсутствии воды не приводит к инактивации бактерицидной активности ТЮ2. Во-вторых, при использовании лиофилизироваиных бактерий бактерицидный эффект 77(3?-плёнок значительно выше, чем в случае воздействия на суспендированную в жидкости форму бактерий. Уже 15 минут экспозиции в потоке УФ на поверхности Г/С^-плёнок достаточно для практически полного подавления жизнеспособности S.aureus 956 и преодоления 50% барьера бактерицидное™ в отношении E.coli 321-5. В-третьих, для E.coli 321-5 получены статистически значимые различия в биоцидности монофакторного воздействия (только УФ) и сочетанного воздействия двух факторов (УФ + АФК). Можно предположить, что

АФК, образующиеся на поверхности ТЮг-плёнок в результате фотоактивации поверхности вносят больший вклад в бактерицидный эффект в отношении данного штамма, тогда как для S.aureus 956 и воздействие на лиофилизированную форму только УФ оказывается достаточно эффективным

Таблица 5 - Бактерицидный эффект (%) в отношении лиофилизированных

бактерий на первичных ТЮ2-плёнках и на многократно используемых 7702-плёнках

Штамм Бактерицидны й фактор Первичный эксперимент Эксперимент, воспроизведенный после стерилизации поверхности (180°С, 60 минут)

S.aureus 956 УФ 79,8 ± 29,3 59,2 ± 38,5

УФ + АФК 98,9 ± 1,5 (t=-l,56; df=5; р=0,2) 90,5 ± 20,0 (t=-l,8;df=5;p=0,13)

E.coli 321-5 УФ 49,7 ± 44,9 15,3 ± 13,4

УФ + АФК 77,0 ± 32,0* (t=-2,5; df=7; р=0,04) 77,6 ± 20,6* (t=-6,8; df=5; р=0,02)

Примечание - * Уровень значимости р < 0,05.

Бактерицидная активность ТЮ^-плёнок в отношении сферопластов Согласно работе К. Sunada и соавт (2003) бактерицидность 7702-плёнок обусловлена прежде всего атакой АФК клеточной стенки бактерий. Эти данные подтверждаются и АСМ-исследованиями. Необходимо было определить, какой вклад вносит клеточная стенка бактерий во взаимодействие в системе «7702-плёнки - бактерии». Для этого два штамма S. aureus 956 и Е. coli 321-5 лишали клеточной стенки, а чувствительность сферопластов к моно воздействию (УФ) и сочетанному воздействию (УФ+АФК, генерируемым 7702-плёнками) определяли согласно основному протоколу исследования. Результаты исследования представлены на рисунке 9.

Из полученных результатов можно сделать ряд выводов. Во-первых, общая тенденция более выраженной чувствительности стафилококков к сочетанному воздействию УФ и АФК сохраняется, о чем свидетельствует значительное снижение их жизнеспособности после 30 минут инкубации и полное уничтожение сферопластов после 60 минут. Во-вторых, лишение клеточной стенки вызывает снижение жизнеспособности не только под действием УФ, но и без воздействия, о чем свидетельствует регрессионный характер кривой жизнеспособности бактерий. В-третьих, клеточная стенка действительно является центральным фактором, защищающим бактерии от атаки АФК, поскольку гибель сферопластов на поверхностях происходит в два раза быстрее.

Вероятнее всего основное «гашение» АФК реализуется именно пептидогликаном или липополисахаридом, а в отсутствие клеточных стенок мембрана клеток атакуется АФК, что приводит к фотоокислению фосфолипидов и, как следствие, быстрой гибели сферопластов.

Разрушение клеток и бактерицидный эффект доказаны методом АСМ. В частности отмечено выраженная агрегация клеток S. aureus 956 с разрушением

бактерий и уменьшение морфологических параметров Е. соИ 321-5 (длины с 2,87 до 0,31 мкм; ширины с 0,82 до 0,31 мкм; высоты 1,70 до 0,37 мкм).

суслен» » с4*роппастов на noeepixocrn с г еуепенм* еферолластоа ч* поавриноетм ет суслен»»« сферолласто* на поевр«»остн rv

Время инкубации, мин va Sei воздеЛств»« УФ-свеч is под юзде<»ст»ивм УФ-см г»

го

Время инкубации. - суспеш*» сфеоол ластов па ловео«ност* стерла бе} аоздействи» УФ-ceeia eycn#Hju« сфвроялаетов на стила пол аомейсвиеи УФ-овт;

суспензии сферой ластов на поверхности ппвж

титана под воздействием УФ-сеета

Рисунок 9 - Динамика бактерицидное™ УФ и УФ +АФК в отношении сферопластов (a) S. aureus 956 и (б) Е. coli 321-5

Таким образом, в работе проанализированы бактерицидные свойства ТЮ2-плёнок активированных УФ-светом (>^тах=365 им), доказана биоцидность в отношении подавляющего большинства исследованных музейных штаммов и определены условия максимально эффективной и воспроизводимой реализации антибактериальной активности.

ВЫВОДЫ

1. Доказано образование активных форм кислорода на поверхности тонких плёнок диоксида титана под воздействием УФ (Хтах=365 нм) по реакциям фотоокисления растворов адреналина и метиленового синего. Окисление органических соединений сопровождается изменением уровня рН.

2. Установлена бактерицидная активность УФ-индуцированных ТЮ2-плёнок в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий. Продемонстрирована большая чувствительность грамположительных штаммов к воздействию АФК. Два грамотрицательных штамма - К. pneumoniae 527 и P. vulgaris 1212 продемонстрировали полное отсутствие чувствительности как к бактерицидному действию УФ, так и к сочетанному воздействию УФ и АФК, генерируемых на ЛОг-поверхностях в течение 15 минут экспозиции.

3. Показано, что при повторном использовании ТЮ2-плёнок при условии наличия жидкости на поверхности и облучения УФ происходит полная или частичная утрата ими бактерицидной активности и появление нового свойства -гидрофильности. Для реверсии бактерицидных свойств ТЮ2-плёнок подобраны два способа - температурный отжиг и обработка поверхности плёнок диоксида титана раствором бензола.

4. Продемонстрировано два варианта динамики бактерицидной активности. Для подавляющего большинства штаммов временной фактор оказывается критическим - и увеличение времени инкубации приводит к снижению жизнеспособности бактерий на УФ-активированных 7702-поверхностях. Однако

для трех из исследуемых штаммов 15 минут экспозиции достаточно для достижения максимального бактерицидного эффекта.

5. Выявлено, что бактерицидная активность 770гплёнок в отношении лиофилизированных бактерий значительно выше, чем в отношении нативных бактериальных клеток. Воспроизводимость результатов при повторном исследовании обусловлена отсутствием эффекта гидрофилизации, что доказывает ведущую роль воды для взаимодействия в системе « 7702-плёнки- бактерии».

6. Решающая роль клеточной стенки в процессе выживания бактерий под атакой АФК, генерируемых 7702-плёнками установлена благодаря методам атомно-силовой микроскопии и изучения бактерицидности в отношении сферопластов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Голубева И.С. Антибактериальная активность 7702-плёнок под действием ультрафиолетового облучения / И.С. Голубева, С.Н. Плескова // Естествознание и гуманизм: Сб. научных трудов. - Томск, 2007. - Т.4. - С. 62.

2. Антибактериальная активность ТЮ2.плёнок под действием ультрафиолетового облучения / И.С Голубева., С.Н. Плескова, Е. А. Першин // Структура и динамика молекулярных систем. - 2008 - Т. 2, № 4 - С. 399-403.

3. Голубева И.С. Исследование наноструктурного материала - 7702-плёнок в качестве антибактериального покрытия / И.С. Голубева, С.Н. Плескова // Структура и динамика молекулярных систем. Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии: Сб. тезисов 11 Международной научно-практической конференции. -Казань, 2008. - Т.2. - С. 157.

4. Голубева И.С. Стерилизующая активность 7702-плёнок к под действием УФ -лучей / И.С. Голубева С.Н. Плескова // Биология - наука XXI века: Сб. тезисов 12 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2008. -С.201.

5. Голубева И.С. Супергидрофильность 7702-плёнок индуцированных ультрафиолетовым светом / И.С. Голубева // Современный мир, природа и человек: Сб. научных трудов. - Томск, 2009. - Т. 1, № 2- С. 124.

6. Биоцидные свойства наноматериалов / С.Н. Плескова, И.В. Балалаева, Э.Р. Гиматдинова, E.H. Горшкова, И.С. Голубева [и др.] // Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах: Матер. 1-ой Международной научной школы. -Москва, 2009.-С. 312-314.

7. 7702-плёнок как источник активных форм кислорода с антибактериальной активностью / И.С. Голубева, С.Н. Плескова, Е.А. Першин [и др.].// Биология - наука XXI века: Сб. тезисов 13 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2009. - С. 160-161.

8. Першин Е.А. 7702-плёнки - перспективный наноматериал / Е.А. Першин, И.С. Голубева, С.Н. Плескова // Будущее технической науки: Сб. тезисов VIII Международной молодежной научно-технической конференции. - Нижний Новгород, 2009. - С. 301-302.

9. Голубева И.С. Антибактериальная активность 7702-плёнок индуцированная ультрафиолетом. / И.С. Голубева, С.Н. Плескова // Наука молодых: Сб. научных трудов молодых учёных. - Арзамас, 2010. - С. 350-355.

10. Апробация биоцидного эффекта УФ-индуцированных 7702-плёнок в отношении штамма Proteus vulgaris 1212 / Н.А.Чижов, Н.А Фролова., И.С. Голубева

[и др.] // Фундаментальные науки и практика: Сб. научных трудов. - Томск, 2010. -С. 98.

11. Бактерицидный эффект тонких плёнок на основе ТЮ2 / И.С. Голубева, С.Н. Плескова, H.A. Чижов [и др.] // Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии: Сб. трудов по материалам I Всероссийской интернет-конференции. - Казань, 2010 - С. 48-50.

12. Голубева И.С. Динамика фотоиндуцированной бактерицидности на поверхности ТЮГплёнок / И.С. Голубева, С.Н. Плескова // Актуальные проблемы современной науки и образования: Матер. Всероссийской научно-практической конференции с Международным участием. - Сибай, 2010. - Т.2. - С. 614-618.

13. Голубева И.С. Фотокаталитическое окисление растворов фенола на поверхности TiOj-плёнок / И.С. Голубева, С.Н. Плескова // Инновации. Интеллект. Культура: Матер. XVIII Всероссийской (с Международным участием) научно-практической конференции молодых учёных и студентов. - Тобольск-Тюмень, 2010 -С. 41-43.

14. Явления фотокатализа на поверхности 7702-плёнок / И.С. Голубева, С.Н. Плескова, H.A. Чижов [и др.] // Современные достижения науки: Матер. I Дистанционной научной конференции с Международным участием. — Азербайджан, 2010.-С. 64-68.

15. УФ-индуцированная антибактериальная активность тонких плёнок ТЮ2/ И.С. Голубева, H.A. Фролова, H.A. Чижов [и др.] // Биосовместимые материалы и покрытия: Сб. материалов Всероссийского конкурса научных работ бакалавров и магистрантов, проводимого в рамках реализации Федеральной целевой программы «научные и научно-педагогические кадры России» на 2009-2013. - Саратов, 2010. -С.164-165.

16. Голубева И.С. Синтез и исследование бактерицидных свойств тонких плёнок на основе оксида титана / И.С. Голубева // Конструкционные наноматериалы: Матер. Всероссийской школы-семинар по тематическому направлению развития национальной нанотехнологической сети. - Москва, 2010. - С. 154.

17. Чижов H.A. УФ-индуцированная антибактериальная активность тонких плёнок диоксида титана / H.A. Чижов, H.A. Фролова, И.С. Голубева // Нано 2011: Матер. IV Всероссийской конференции по наноматериалам. - Москва, 2010. - С. 304.

18. Голубева И.С. Динамика антибактериальной активности многократно-используемых 7702-плёнок / И.С. Голубева // Симбиоз Россия 2010: Матер. III Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов. - Нижний Новгород,

2010.-С. 166-167.

19. Фотоиндуцированная бактерицидная активность ТЮ2-плёнок / С.Н. Плескова, И.С. Голубева, Ю.К. Верёвкин [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. -

2011.-Т. 47, № 1.-С. 28-32.

20. Синтез ТЮ2 -плёнок с антибактериальными свойствами / И.С. Голубева, H.A. Чижов, H.A. Фролова [и др.] // Медицинские приборы и технологии: Международный сб. научных статей / под общ. ред. А.З. Гусейнова, В.В. Савельева. -Тула, 2011. -Вып.4. - С. 129-132

21. Инактивация бактериальных клеток на поверхности фотоиндуцированных 7г'Огплёнок / И.С. Голубева, С.Н. Плескова, Н.А.Чижов [и др.] // Биология - наука XXI века: Сб. тезисов 15 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пугцино, 2011 - С. 402.

22. Бактерицидная активность 7702-повсрхности в отношении грамотрицательных бактерий / H.A. Фролова, H.A. Чижов, И.С. Голубева [и др.] // Будущее технической науки: Сб. тезисов X Международной молодежной научно-технической конференции. - Нижний Новгород, 2011. - С. 291-292.

23. Антибактериальные свойства плёнок диоксида титана, индуцированные УФ-излучением / H.A. Чижов, H.A. Фролова, И.С. Голубева [и др.] // Будущее технической науки: Сб. тезисов X Международной молодежной научно-технической конференции. - Нижний Новгород, 2011. - С. 294-295.

24. Bactericidal propoties of nanofilm / I.S. Golubeva, S.N. Pleskova, N.A. Chigov [et al.] // Nanomaterials and nanotechnologies in living systems. Safety and nanomedicine: 2nd International school. - Moscow, 2011. - P. 136.

25. Антибактериальная активность тонких плёнок ТЮ2, индуцированная УФ-светом /

H.A. Чижов, H.A. Фролова, И.С. Голубева [и др.] // Матер. XVI Нижегородской сессии молодых ученых - естественные науки. - Нижний Новгород, 2011. — С 291-292.

26. Голубева И.С. Наноструктуры диоксида титана с различной морфологией / И.С. Голубева, С.Н.Плескова, А.Н. Голубев // Наноиндустрия. - 2011. - №6. - С. 2830.

27. Pleskova S.N. Dynamics of the ri'02-nanofilms bactericidal activity / S.N. Pleskova,

I.S. Golubeva, Y.K. Verevkin // Journal of Environmental and Occupational Science.-2012. -№ 1(2).-P. 71-76.

28. Голубева И.С. Оценка бактерицидной активности 7702-плёнок в отношении лиофильновысушенных S. aureus 956 / И.С. Голубева, С.Н. Плескова, А.Н. Голубев // Биология - наука XXI века: Сб. тезисов 16 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2012. - С. 16-17.

29. Голубева И.С. Антибактериальная активность ТЮ2-плёнок в отношении лиофильновысушенных бактерий / И.С. Голубева, С.Н. Плескова // Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности: Сб. тезисов Всероссийской молодёжной научной школы. - Казань, 2012. - С. 89.

30. Голубева И.С. Влияние бензола на гидрофильные свойства 7702-плёнок / И.С. Голубева, С.Н. Плескова, А.Н. Голубев // Будущее технической науки: Сб. тезисов XI Международной молодежной научно-технической конференции. - Нижний Новгород, 2012. - С. 212-215.

31. Плескова С.Н. Кондиционирование фотоиндуцированной бактерицидное™ на поверхности плёнок диоксида титана / С.Н. Плескова, И.С. Голубева, Ю.К. Веревкин // Экология человека. - 2013. - №3. - С. 21 - 27.

32. Нанотехнологическая АСМ-морфометрия бактериальных клеток / С.Н Плескова, Е.В. Дубровин, И.С. Голубева [и др.] // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. -2013. - Т. 2, №. 2. - С. 39-44.

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю д.б.н., доценту Плесковой С.Н., к.ф-м.н., в.н.с. Верёвкину Ю.К., Бурениной В.Н., Королихину В.В. сотрудникам ИПФ РАН г. Нижнего Новгорода за помощь в подготовке 7702-плёнок; за помощь получения АСМ-изображений м.н.с. Горшковой E.H., а также сотрудникам ООО «НПО «Диагностические системы», в особенности д.м.н., профессору Буркову А.Н., д.б.н. Улановой Т.И., д.б.н. Обрядиной А.П., к.б.н. Пименову В.К. за помощь в подготовке лиофилизированных образцов.

Подписано в печать 21.10.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1. Заказ № 861. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в РИУ ИНГУ им. Н.И. Лобачевского. 603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская, 37

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Голубева, Ирина Сергеевна, Нижний Новгород

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородский государственный технический университет

им. Р. Е. Алексеева»

На правах рукописи

е\1 1П4 "1 1

I ¿й-* 1 1 1

ГОЛУБЕВА ИРИНА СЕРГЕЕВНА

АНАЛИЗ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛЁНОК

ДИОКСИДА ТИТАНА

03.02.03 - микробиология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Плескова С.Н.

Нижний Новгород 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................10

1.1. Значение активных форм кислорода и механизмы их формирования.... 10

1.2. Механизмы гибели бактериальных клеток на поверхности плёнок диоксида титана. Основные факторы, влияющие на бактерицидные свойства ТЮ2- плёнок......................................................................................22

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................................................36

Глава 2. ОБЪЕКТ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ................36

2.1. Объекты исследований..............................................................................36

2.2. Золь-гель технология для формирования ТЮ2-плёнок...........................36

2.3. Рентгеноструктурный анализ плёнок диоксида титана...........................37

2.4. Подбор светофильтров для излучения заданной длины волны...............38

2.5. Окисление органических соединений на поверхности диоксида титана.................................................................................................................39

2.6. Получение бактериальной суспензии.......................................................40

2.7. Подбор питательных сред для получения КОЕ Pseudomonas aeruginosa..........................................................................................................41

2.8. Подбор питательных сред для получения КОЕ Proteus vulgaris.............42

2.9. Протокол исследования бактерицидной активности ТЮ2плёнок...........42

2.10. Динамика бактерицидной активности ТЮ2-пяёнок..............................43

2.11. Бактерицидная активность повторно используемых плёнок.................43

2.12. Бактерицидная активность отожженных плёнок...................................43

2.13. Гидрофильность и гидрофобность ТЮ2-тшёнок....................................43

2.14. Влияние бензола на гидрофильные свойства ТЮ2-плёнок...................44

2.15. Атомно-силовая микроскопия бактериальных клеток...........................44

2.16. Бактерицидная активность плёнок диоксида титана в отношении сферопластов.....................................................................................................45

2.17. Бактерицидный эффект ТЮ2-ияё нок в отношении лиофилизированных бактерий.........................................................................46

2.18. Статистическая обработка результатов..................................................47

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ............49

3.1. Рентгеноструктурный анализ плёнок диоксида титана...........................49

3.2. Окисление органических веществ на поверхности плёнок диоксида титана.................................................................................................................51

3.3. Определение бактерицидной активности ri02"njI^HOK...........................60

3.4. Исследование бактерицидной активности многократно используемых плёнок на основе диоксида титана..........................................65

3.5. Определение антибактериальной активности повторно-оттоженных плёнок на основе диоксида титана...................................................................68

3.6. Динамика бактерицидной активности Г102-плёнок................................74

3.7. Исследование бактерицидного эффекта ТЮ2-ияёиок в отношении лиофилизированных бактерий.........................................................................89

3.8. АСМ-исследования бактериальных клеток..............................................92

3.9. Исследование бактерицидного эффекта ТЮ2-плёнок в отношении сферопластов.....................................................................................................95

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................101

ВЫВОДЫ............................................................................................................106

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.......................108

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................................110

ВВЕДЕНИЕ

Степень разработанности проблемы. Технология изготовления тонких пленок диоксида титана и их исследование в качестве антибактериальных покрытий рассматриваются, в основном в западной литературе (Diegel и соавт., 1998; Zwilling и Aucouturier, 1999; Martinu и соавт., 2000; Ordine и соавт., 2000). В частности, одним из перспективных направлений является допирование диоксида титана ионами других металлов, поскольку такая модификация дает возможность активации поверхности не ультрафиолетовым, а видимым светом (Ни и соавт., 2007; Wan и соавт., 2007; Dang и соавт., 2010). В последнее десятилетие начали появляться отечественные работы, где исследуется бактерицидная активность ТЮ2-плёнок (Лыньков и соавт., 2004; Петухов и соавт., 2007). В основном, как в отечественной, так и в зарубежной литературе рассматриваются механизмы формирования активных форм кислорода под влиянием ультрафиолета на поверхности полупроводников, но не делается акцент на микробиологической составляющей и не приводится доказательств морфологических видоизменений бактериальных клеток. В статье L. Armeiao и соавт. (2007) даются доказательства гибели бактерий на поверхности фотоиндуцированных плёнок диоксида титана. Однако в представленной работе проводились исследования только одного штамма бактерий. В тоже время для оценки резерва бактерицидной активности 7702-плёнок и возможности их практического использования необходимо проведение исследований бактерицидности как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных микроорганизмов. Тот же недостаток отмечается и для

большинства работ, в которых исследуется бактерицидность ТЮ2-1и\ёпок (Saito и соавт., 1992; Manness и соавт., 1999; Sunada и соавт., 2003; Cheng и соавт., 2007). Еще одной важной проблемой является отсутствие данных о воспроизводимости бактерицидного эффекта при многократном использовании пленок. Поэтому расширение спектра тестируемых микроорганизмов и получение данных о воспроизводимости бактерицидного эффекта являются важной задачей.

Цель работы: изучение бактерицидных свойств УФ-индуцированных плёнок диоксида титана в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и модуляция условий для эффективности и воспроизводимости бактерицидного эффекта.

Задачи исследования:

1. Показать возможность образования активных форм кислорода на поверхности тонких плёнок диоксида титана в процессе окисления органических веществ;

3. Подобрать физико-химические условия обработки 77(32-плёнок для достижения максимального бактерицидного эффекта;

5. Проанализировать изменения бактерицидной активности в условиях модуляции микробиологической составляющей в комплексной системе «Г/Ог-плёнки - УФ - бактерии».

инкубации бактериальной суспензии под УФ-светом происходят изменения свойств поверхности с гидрофобных на гидрофильные. Кроме того, предложено два способа (термический отжиг и химическая обработка бензолом) для восстановления бактерицидного эффекта тонких плёнок. Впервые показано, что структурная модуляция бактериальных клеток (лиофилизированные клетки и сферопласты) приводит к повышению бактерицидной активности ТЮ2-ппёнок. Впервые установлена решающая роль воды, как центрального кондиционирующего фактора в системе «7702-плёнки - бактерии».

Практическая значимость работы. Полученные методом золь-гель технологии плёнки диоксида титана в перспективе можно использовать в качестве эффективных антибактериальных и самоочищающихся поверхностей в различных областях народного хозяйства. В в прикладной микробиологии, ветеринарии и медицине - для покрытия хирургического (в том числе эндоскопического) инструментария и поверхностей для предотвращения контаминации антибиотикорезистентными штаммами бактерий. В области экологического природопользования - для дезинфекции и доочистки воды и создания специализированных устройств безопасного разложения органических отходов, а также для производства самоочищающихся стекол. Предложенные методы обработки поверхностей (термический и химический) возвращают покрытиям исходные бактерицидные свойства.

анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описание, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа.

Применение указанных методов, а так же анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Бактерицидная активность тонких плёнок в отношении разных штаммов бактерий выражена не одинаково. В наибольшей степени к сочетанному воздействию ультрафиолета и АФК, генерируемых на ТЮ2-поверхностях чувствительны грамположительные бактерии.

2. Свойства поверхности ТЮ2-плёнок изменяются после инкубации на ней суспензии бактериальных клеток. Однако гидрофобность можно восстановить путем термической (отжиг) или химической (бензол) обработки.

3. Вода является принципиальным фактором модулирующим взаимодействие в системе «1Ю2-плёнки - бактерии».

4. Атака АФК, генерируемых на 77Ог-поверхности ультрафиолетом (^■тах^З 65 нм) приводит к полному уничтожению бактериальной клетки и морфологическим доказательством разрушения бактерий являются результаты, полученные с помощью метода атомно-силовой микроскопии.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на: II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г. Казань, 2008), XII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (г. Пущино, 2008), VIII, X Международной молодёжной научно-технической конференции «Будущее технической науки» (г. Нижний Новгород, 2009, 2011), Всероссийской школе-семинаре по тематическому направлению деятельности национальной нанотехнологической сети «Конструкционные наноматериалы» (г. Москва, 2010); III Межвузовской научной конференции «Наука молодых» (г. Арзамас, 2010); III Всероссийском с Международным

участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (г. Нижний Новгород, 2010); 1-ой и 2-ой интернациональной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (г. Москва, 2009, 2011); XVI «Нижегородской сессии молодых учёных - естественные науки» (г. Нижний Новгород, 2011); III Международной конференции «Высокоинтенсивные физические факторы в медицине, биологии, сельском хозяйстве и экологии» (г. Саров, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора. Лично автором диссертации проведен обзор современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, экспериментальные исследования по изучению бактерицидных свойств УФ-индуцированных плёнок диоксида титана в отношении грамположительных и грамотрицательных штаммов бактерий и модуляции условий для эффективности и воспроизводимости бактерицидного эффекта, а также была самостоятельно проведена систематизация и анализ полученных результатов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Значение активных форм кислорода и механизмы их формирования

Активные формы кислорода (АФК) - это молекулы и свободно-радикальные формы кислорода, обладающие следующими свойствами: короткое время жизни; высокая окислительная способность; наличие одного или нескольких неспаренных электронов на внешних атомных или молекулярных орбиталях. Отличительной особенностью АФК является возможность взаимных переходов в результате электронного возбуждения или окислительно-восстановительных реакций. К активным формам кислорода относят:

1. супероксидный анион-радикал (02)',

2. гидроксильный радикал (Olí);

3. перекись водорода (Н202);

4. синглетный кислород (102);

5. пероксидные радикалы (R0'2);

6. озон (03) (Scandalios, 2002).

Столь же высокой окислительной способностью обладают гипохлорит ОС1~ и радикалы оксида двухвалентного азота (NО), поэтому их часто относят к активным формам кислорода (Гусакова и соавт., 2011; Green и Hill, 1984; Ames и соавт., 1993; Aruoma и Halliwell, 1998; Halliwell и Gutteridge, 1999; Basaga, 1990).

Огромный спектр биохимических эффектов АФК, объясняет неослабевающий интерес к исследованию их влияния на функциональную активность клеток. Доказано, что АФК обеспечивают регуляцию ряда важных физиологических процессов, без которых невозможно существование самого организма (Дубинина, 1998; Скулачев, 1998; Войеков, 2003; McCord, 1995). В частности, супероксид анион радикал играет важную роль в реализации микробицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия

фагоцитов (Донцов, 1998; Демченко и соавт., 1999). Фагоциты активируются бактериями (или биохимическими соединениями), что сопровождается активацией ферментного комплекса плазматической мембраны — НАДФН-оксидазы с образованием 02 из 02 (Ройт и соавт., 2000). Это приводит к быстрому многократному повышению содержания супероксид анион радикала и перекиси водорода в фагоцитирующих клетках с

Информация о работе

Голубева, Ирина Сергеевна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Анализ бактерицидной активности плёнок диоксида титана - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Анализ бактерицидной активности плёнок диоксида титана ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ бактерицидной активности плёнок диоксида титана"

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Голубева, Ирина Сергеевна, Нижний Новгород

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ бактерицидной активности плёнок диоксида титана
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология