Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование экзоцитоза в нейтрофилах человека при миелопролиферативных заболеваниях

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование экзоцитоза в нейтрофилах человека при миелопролиферативных заболеваниях"

г

На правах рукописи

Нуянзина Валентина Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКЗОЦИТОЗА В НЕЙТРОФИЛАХ ЧЕЛОВЕКА ПРИ МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Специальность: 03.00.25 - цитология, гистология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саранск - 2004

Работа выполнена на кафедре генетики биологического факультета и на кафедре цитологии, гистологии и эмбриологии медицинского факультета ГОУВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева».

Научные руководители: доктор биологических наук,

доцент Набокина Светлана Михайловна, доктор биологических наук, профессор Кругляков Павел Павлович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Ямщиков Николай Васильевич доктор биологических наук, профессор Шубина Ольга Сергеевна Ведущая организация: Саратовский государственный

медицинский университет

Защита диссертации состоится «_»_2004 г. в «_» часов на заседании диссертационного совета Д 212.117.01 при ГОУВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва» (430000, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва».

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Кругляков П.П.

¿005-4

диоМ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Известно, что реализация ключевых функций нейтрофилов, главным образом защитной и воспалительной, в значительной мере обусловлена мобилизацией внутриклеточных гранул. Экзоцитоз гранул необходим для адгезии, тран-сэндотелиальной миграции и выхода клеток из кровеносных сосудов в ткани, образования реактивных метаболитов кислорода, секреции литических ферментов (Borregaard N., 1996; Lageti Е., Mocsai A., 1999).

В настоящее время установлено, что осуществление экзоцитоза в нейтро-филах периферической крови человека происходит через универсальный механизм слипания/слияния мембран, получивший название SNARE гипотеза. Механизм основан на взаимодействии белка везикулярной мембраны VAMP (мембранный белок, ассоциированный с везикулами, v- SNARE) с белками плазматической мембраны, t-SNARE, - синтаксином и SNAP-25 (белок ассоциированный с синаптосомами, молекулярная масса 25 кД), образовании комплекса этих белков - SNARE комплекса - и связывании с комплексом цитозольных белков, в конечном итоге приводящем к слиянию мембран (Gerst J., 1999). В нейтрофи-лах периферической крови человека вывлены множественные изоформы белков группы SNARE, которые, по-видимому, опосредуют экзоцитоз разных типов гранул, а также исследована способность этих SNARE к белок белковым взаимодействиям (Mollinedo F., Lazo P., 1997; Nabokina S.M. et al. 1997; MartinMartin В et al., 1999; Mollinedo F. et al., 2003). В то время как представления о молекулярных механизмах, управляющих ходом экзоцитоза в нейтрофилах в норме постоянно расширяются и уточняются, данные по изучению экзоцитоза в нейтрофилах человека при различных формах миелоидных заболеваний, в частности при миелопролиферативных заболеваниях, практически отсутствуют в литературе. Миелопролиферативные заболевания представляют собой группу опухолей кроветворной ткани, возникающих в результате злокачественной трансформации стволовой кроветворной клетки, и характеризующиеся способностью клеточных элементов к дифференцировке и созреванию (Raskind W.H., Steinmann L., Najfeld V., 1998; Tefferi A., 2001). Ранее в нейтрофилах периферической крови больных миелопролиферативными заболеваниями были выявлены как морфологические, так и функциональные дефекты, в том числе было отмечено снижение хемотаксиса, адгезии, бактерицидной активности, активности ряда ферментов внутриклеточных гранул (Гусева СЛ., 1990; Borregaard N., 1993; Мацнер Я., 1993; Wolach В. et al., 1998). Вполне вероятно, что отмеченные выше морфологические и функциональные изменения циркулирующих нейтрофилов появляются вследствие нарушений механизмов, управляющих эк-зоцитозом лейкемических нейтрофилов.

Таким образом, исследования, нацеленные на изучение механизмов экзо-цитоза, в том числе белкового аппарата, вовлеченного в экзоцитоз нейтрофилов больных миелопролиферативными заболеваниями, представляются весьма

3

Цель и задачи исследования.

Основной целью данной работы явилось исследование молекулярных механизмов экзоцитоза внутриклеточных гранул нейтрофилов периферической крови человека при различных миелопролиферативных заболеваниях.

Для достижения этой цели были определены следующие задачи:

- оценка уровня экзоцитоза нейтрофилов периферической крови при миелопролиферативных заболеваниях;

- поиск и идентификация белков-медиаторов экзоцитоза (белков группы SNARE) в нейтрофилах пациентов с миелопролиферативными заболеваниями;

- исследование способности к белок-белковым взаимодействиям между отдельными представителями группы SNARE в нейтрофилах у больных миелопролиферативными заболеваниями.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Нейтрофилы периферической крови больных миелопролифератив-ными заболеваниями являются дефектными по системе регулируемого экзоци-тоза внутриклеточных гранул.

2. Нейтрофилы пациентов с миелопролиферативными заболеваниями экспрессируют множественные изоформы белков группы SNARE. Белок VAMP-1, играющий ключевую роль в экзоцитозе азурофильных гранул, отсутствует в нейтрофилах больных хроническим миелолейкозом.

3. Способность к образованию VAMP-2 - содержащих SNARE комплексов, определяющих состыковку и слипание/слияние мембран в нейтрофи-лах пациентов с хроническим миелолейкозом и миелофиброзом, снижена.

Научная новизна работы.

В настоящей работе впервые проведено систематическое исследование эк-зоцитоза нейтрофилов больных миелопролиферативными заболеваниями. Впервые изучена экспрессия белков медиаторов экзоцитоза в нейтрофилах при миелопролиферативных заболеваниях, в частности нами было показано, что в нейтрофилах пациентов с хроническим миелолейкозом отсутствует белок VAMP-1, играющий ключевую роль в процессе экзоцитоза внутриклеточных гранул нейтрофилов в норме. Также впервые установлена внутриклеточная локализация синтаксина 4 и VAMP-2 в покое и в клетках, подвергнутых стимуляции. Впервые изучена способность VAMP-2 к взаимодействию с SNARE-белками: синтаксином 4, SNAP-23 и SNAP-25. Причем впервые продемонстрировано, что способность VAMP-2 к белок-белковым взаимодействиям с указанными выше SNARE белками в нейтрофилах пациентов с миелофиброзом и хроническим миелолейкозом значительно снижена, по сравнению с нормой.

Научно-практическая ценность работы.

Результаты могут быть использованы в фундаментальных исследованиях при изучении механизмов слипания/слияния мембран в норме и при патологии.

Результаты могут быть использованы в прикладных исследованиях, посвященных установлению роли SNARE в индукции и развитии защитных и воспалительных функций нейтрофилов пациентов с хроническим миелолейко-зом и миелофиброзом.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на конференциях молодых ученых Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2000-2004 гг.), на научных конференциях «Огаревские чтения» (Саранск, 2000-2004), на всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Кипр, 2004). Работа прошла апробацию на объединенном заседании кафедр генетики биологического факультета и цитологии, гистологии и эмбриологии медицинского факультета Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 200 источников. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 6 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Основными объектами исследований являлись нейтрофилы периферической крови 33 больных миелоролиферативными заболеваниями. У 12 из них диагностирован хронический миелолейкоз (7 больных с развернутой (2-й) стадией заболевания и 4 пациента с терминальной (3-й) стадией), у 13 эритремия (8 больных со 2-й стадией заболевания и 5 пациентов с 3-й стадией) и у 9 мие-лофиброз (5 больных со 2-й стадией заболевания и 4 пациентов с 3-й стадией). Для сравнения в качестве контроля использовали нейтрофилы периферической крови 27 здоровых доноров.

В работе были использованы моноклональное антитело SMI 81, узнающее SNAP-25 (Sternberger Monoclonals Inc., США); поликлональное антитело против SNAP-23 (Вальядолидский Университет, Испания); моноклональное антитело 3D 10, узнающее синтаксин 6 , было любезно предоставлено доктором Х.Б. Боком (Стэнфордский Университет, США); моноклональное мышиное антитело против синтаксина 4 (Transduction Laboratories, США); поликлональные антитела кролика 18.1, полученные против рекомбинантных VAMP-1, были любезно предоставлены доктором X. Блази (Стэнфордский Университет, США); мо-ноклональные мышиные антитела против VAMP-2 (Synaptic Systems, Германия); биотинилированные антимышиные и антикроличьи IgG (Amersham, Англия); Кроличьи IgG против IgG мыши, конъюгированные с флуоресцеинизо-

тиоцианатом, (DAKO A/S, Дания), коньюгат стрептавидин-пероксидаза хрена (Amersham, Англия).

Выделение нейтрофилов человека проводили из свежей периферической крови человека (Mollinedo F. et al., 1989) путем седиментации эритроцитов, центрифугировании на фикол-гипаге и последующем гипотоническом лизисе примесных эритроциов.

Активность миелопероксидазы определяли по методу Моллинедо (Mollinedo F. et al., 1989)

Активность лизоцима определяли по методу Моллинедо (Mollinedo F. et al., 1989)

Активность щелочной фосфатазы определяли по методу Бодански (Камышников B.C. 2000).

Электрофорез белков проводили по Лэмли (Laemmli U.K., 1970), а имму-ноблоттинг по методу Тоубина (Towbin H. et al., 1979).

Для определения внутриклеточной локализации антигенов нейтрофилы подвергали фиксации параформальдегидом, пермеабилизации ацетоном и инкубации с соответствующими первичными и вторичными антителами.

Ультраструктурную локализацию VAMP-2 исследовали методом иммуно-электронной микроскопии с применением моноклинальных антител против VAMP-2.

Результаты статистически обработаны с использованием критерия Стью-дента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка экзоцитоза внутриклеточных гранул нейтрофилов больных миелопролиферативными заболеваниями.

Степень экзоцитозной активности внутриклеточных гранул нейтрофилов выражали в виде процентного отношения количества маркерного фермента гранул выделенного из клетки к его общему содержанию в клетке. Маркером азурофильных гранул выбрали миелопероксидазу, маркером специфических и желатиназных гранул - лизоцим, маркером секреторных везикул - щелочную фосфатазу. Оценку уровня экзоцитоза мы решили проводить на фоне активаци-онных воздействий, т.к. из литературных источников известно, что потенциальные возможности нейтрофилов (способность к хемотаксису, адгезии, фагоцитозу, микробицидному обезвреживанию, а также к экзоцитозу внутриклеточных гранул) можно выявить только на фоне активационных воздействий (Белова Л.А., 1992). В качестве активационных агентов использовали один из следующих активаторов: FMLF -10-7М, РМА- 40 нг/мл и А23187-10-9М.

Уровень экзоцитоза внутриклеточных гранул нейтрофилов больных хроническим миелолейкозом представлен на рис.1. Из рисунка 1 видно, что в ней-трофилах пациентов с хроническим миелолейкозом уровень экзоцитоза азуро-фильных, специфических и желатиназных гранул значительно снижен. Так, в частности, снижение экзоцитоза пероксидазо-содержащих гранул нейтрофилов

Рисунок I Уровень экзоцитоза щтриккточных гранул нейтрофилов бальных хроническим миелалейказан при воздействии рстшчных активирующих агентов ЕМЦ" (А), РМА (Б), А23187 (В) Контроль - нейтрофилы здоровых доноров, 2-я стадия - нейтрофилы пациентов во второй стадш/заболевания, 3-я стадия - нейтрофилы пациентов в третьей стадии заболевания АГ-азурофильные гранулы, С/ЖГ- спарфпесхие'желатиназные гранулы, СБ -секреторные везикулы. Е секр/Е общ - отношение количества маркерного фермента жю-цитаза, выделенного из клетки, к его общему содержанию в клетке, в % *р<Р,05

при активации FMLF составляет 21% и 24%, при активации РМА - 5% и 6%, а при активации А23187 -15% и 21% во 2-ой и 3-ей стадии заболевания, соответственно. Снижение уровня экзоцитоза популяции специфиче-ских/желатиназных гранул составляет при активации нейтрофилов по сравнению с контролем FMLF 27% и 38%, при обработке РМА - 14% и 21%, а при воздействии А23187 - 22% и 28% в развернутой и терминальной стадии заболевания, соответственно. Интересно также отметить, что наиболее высокий уровень экзоцитоза обнаруживает популяция секреторных везикул; причем мы не смогли зарегистрировать какие-либо отличия в экзоцитозе секреторных везикул между контрольными нейтрофилами и нейтрофилами, выделенными из периферической крови больных ХМЛ.

Таким образом, результаты наших исследований показывают, что в ней-трофилах периферической крови больных ХМЛ уровень экзоцитоза азурофиль-ных, специфических и желатиназных гранул снижен. Интересно, что наиболее выраженное снижение экзоцитоза внутриклеточных гранул демонстрируется при активации клеток FMLF. Это наше наблюдение хорошо согласуется с литературными данными о снижении количества FMLF рецепторов при хроническом миелолейкозе (Kazimir-Bauer S. et а1., 1994; Ка1рап S. et а1., 1992).

А)

3 100 «о

о 95 ш

л «> г вз

и

ш ВО

П И ■

Б)

О контроль

■ 2-я

■ 3-я

В)

3 100

ш 85

Гвконтроль I

Рисунок 2. Уровень жюцшкт внутрикчетснных гранул нейтрофшюв периферической крови бальных эритремией при воздействии рашчных активирующих агентов: РМ1~(А), РМА (Б), А23187(В). Контроль - нейтрофты здоровых доноров, 2-я стадия-нейтрофим пациентов во второй стадии заболевания, 3-я стадия-нейтрофилы пациентов в третьей стадии заболевания АГ - аурофильные гранулы; СШГ - специфические/желатиназные фанулы; СВ -секретарше везикулы Е секр/Е общ - отношение количества.маркерного фермента экзоцитоза, выделенного из клепки, к его общему содержанию в клетке, в% *р<0,05.

Уровень экзоцитоза отдельных популяций внутриклеточных гранул ней-трофилов пациентов с эритремией при воздействии различных активаторов секреции представлен на рисунке 2. Сравнение уровня экзоцитоза эритремиче-ских и контрольных нейтрофилов показывает отсутствие достоверных отличий. Таким образом, результаты наших исследований показали, что нейтрофилы, выделенные из периферической крови пациентов, страдающих эритремией,

Рисунок 3 Уровень экзоцитоза внутриклеточных гранул нейтрофшюв бальных миело фифозам при воздействиираничныхаюгшвируюира агентов FMLF(Â), РМА (Ц),А23187(В) Контроль - нейтрофилы здоровых доноров, 2-я стадия - нейтрофилы пациентов во второй стадии заболевания, 3-я стадия - нейтрофилы пациентов в третьей стадии заболевания АГ-азурофильные гранулы, С/ЖГ - специфиче-ские/желатиназные гранулы, СВ - секреторные везикулы Е секр/Е общ - отношение количества маркерного фермента экзоцитоза, выделенного из клетки, к его общему содержанию в клетке, в%, * р<0,05

Рисунок 3 Уровень экюфтж внущшлепючньа гранул нящюфшов ботньа фифоэсмг^всэдейапвшрстмлссс^пшвирунмл FMLF(A), РМА(Б),Л23187(В) Контроль - нейтрофилы здоровых доноров, 2-я стадия - нейтрофилы пациентов во второй стадии заболевания, 3-я стадия - нейтрофилы пациентов в третьей стадии заболевания АГ-азурофильные гранулы, С/ЖГ - специфиче-ские/желатиназные гранулы, СВ - секреторные везикулы Е секр/Е общ - отношение количества маркерного фермента экзоцитоза, выделенного из клетки, к его общему содержанию в клетке, в%, * р<Р,05

не содержат каких-либо дефектов в системе экзоцитоза внутриклеточных гранул. Полученные нами данные хорошо согласуются с работами других исследователей, в которых продемонстрирован нормальный функциональный ответ эритремических нейтрофилов при их активации FMLF и РМА (Samuelsson J. et al., 1993; Falanga A. et. al., 2000).

Данные по измерению содержания ферментов - маркеров экзоцитоза - во внеклеточной среде при индукции клеток к экзоцитозу больных миелофибро-зом представлены на рисунке 3. Сравнительный анализ показывает, что уровень

нению с контролем на 11% и 19% (при активации FMLF - на 11% и 17% (при активации РМА) и на 13% и 18% (при активации А23187) на второй и третьей стадии заболевания, соответственно. Экзоцитоз секреторных везикул не отличался от нормы.

Таким образом, совокупность полученных нами экспериментальных данных свидетельствуют о том, что нейтрофилы периферической крови больных хроническим миелолейкозом и миелофиброзом имеют значительные дефекты в системе экзоцитоза. При этом наиболее выраженные изменения в экзоцитозной активности демонстрируют лейкемические нейтрофилы пациентов с хроническим миелолейкозом. В нейтрофилах больных эритремией дефекты экзоцитоза нами не были зарегистрированы Следует отметить, что наши экспериментальные данные показывают отсутствие знэнигепьных вариаций в уровне экзоцитоза разных типов гранул при воздействии на клетей различных акгаваторов. Это наблюдите, по-видимому, свидетельствует о том, что снижение уровня экзоцитоза при хроническом миелолейкоэе и миелофиброэе не связано с нарушениями в системе трансакции сигнала в нейтрофилах больных указанными заболеваниями. Полученные нами экспериментальные данные хорошо согласуются с литературными данными, описывающими более глубокое угнетение функций нейтрофилов у больных ХМД незначительное - у больных миелофиброэом и практически нормальное функционирование нейгрофилов бошых эршремией (Мацнер Я, 1993; Гусева СА, 1990, Wolach В.

Идентификация белков, медиаторов экзоцитоза, в нейтрофилах больных миелопролиферативными заболеваниями.

Ранее было продемонстрировано, что нейтрофилы человека экспрессируют набор белков семейства синтаксинов, а именно синтаксины 1а, За, 3b, 4,5,6, 7, 9, 11 и 16. Наиболее изученными из них являются синтаксины 4 и 6. (MartinMartin В. et al., 2000). Результаты иммуноблоттинга представлены на рисунке 4. В экстракте нейтрофилов периферической крови больных миелопролифератив-ными заболеваниями моноклональное антитело против синтаксина 4 узнает единственную полосу, соответствующую белку с молекулярной массой « 32 кДа. Этот иммунореактивный белок имеет одинаковую электрофоретическую подвижность с синтаксином 4, детектируемым в экстракте нейтрофилов, выделенных из периферической крови здоровых доноров. Результаты иммуноблот-тинга с использованием моноклонального антитела, направленного против синтаксина 6, показывают, что другой представитель семейства синтаксинов -синтаксин 6 (белок с молекулярной массой ~ 31 кДа) также присутствует в экстрактах нейтрофилов пациентов с миелопролиферативными заболеваниями.

Ранее было установлено, что нейтрофилы человека экспрессируют два белка семейства синаптобревинов - VAMP-1 и VAMP-2 (Набокина СМ., 2001; Brumell J.H. et al., 1995). Иммунодетекция с применением VAMP-2-специфических антител демонстрирует присутствие иммунореактивной полосы, соответствующей белку с молекулярной массой и 18 кДа как в контроле, так и при всех формах миелопролиферативных заболеваний. Другой представитель семейства VAMP, белок VAMP-1, выявляется в экстрактах нейтрофилов

К ЭР ХМЛ МФ к ЭР ХМЛ МФ

А) Б)

Рисунок 4. Иммунодетекция белков семейства синтаксинов в нейтрофи-лах человека примиелопролиферативныхзаболеваниях. Равные количества покоящихся экстрактовнейтрофилов человека (~10клеток) были подвергнуты раз-делению в 12% ПААГи иммуноблоттингу с применением моноклинальных ан-тител против синтаксина 4 и синтаксина 6. Слева указаны молекулярные массы белков маркеров. Контроль (К) - экстракт нейтрофилов здоровых доноров, ЭР - экстракт нейтрофилов пациентов с эритремией, ХМЛ- экстракт нейтрофилов пациентов с хроническим миелолейкозом, МФ • экстракт нейтрофилов пациен-тов с миелофиброзом.

больных эритремией и миелофиброзом, а при ХМЛ не обнаруживает-ся.(рисунок 5). В связи с тем, что 1) наши эксперементальные данные показали присутствие синтаксина 4 и VAMP-2 в нейтрофилах больных миелопролифера-тивными заболеваниями и 2) сведения о внутриклеточной локализации этих белков в нейтрофилах периферической крови нормальных доноров достаточно

К ЭР ХМЛ МФ К ЭР ХМЛ МФ

Рисунок 5. Иммунодетекция белков семейства VAMP в нейтрофилах человека при миелопролиферативных заболеваниях. Равные количества покоящихся

экстрактов нейтрофилов человека (~10е клеток) были подвергнуты разделению в 12% ПААГ и иммуноблоттингу с применениеммоноклональных антител против VAMP 1 (А) и VAMP 2 (В). Слева указаны молекулярные массы белков маркеров. Контроль (К) - экстракт нейтрофилов здоровых доноров, ЭР - экстракт нейтрофилов пациентов с эритремией, ХМЛ- экстракт нейтрофилов пациентов с хроническим миелолейкозом, МФ - экстракт нейтрофилов пациентов с миелофиброзом.

Рисунок б.

Локализация синтаксиса 4в покоящихся нейтрофилах человека; А) агрегированные нейтрофилы человека. Иммунофлуоресцентный метод. Лазерная микроскопия. Увеличениех 700.

не полные, мы решили исследовать локализацию этих SNARE в нейтрофилах здоровых доноров. Локализацию синтаксина 4 и VAMP-2 изучали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Распределение синтаксина 4 в покоящихся нейтрофилах представлено на рисунке 6. В покоящихся клетках продукт иммуногистохимической реакции определяется по периферии по всему периметру плазматической мембраны клетки. Это свидетельствует о локализации этого белка преимущественно в плазмалемме. Следует отметить некоторое увеличение иммунной реакции в областях контакта клеток друг с другом, что особенно ярко проявляется в случае образования агрегатов клеток (рис 6а).

Мы также исследовали локализацию синтаксина 4 в стимулированных нейтрофилах. В качестве стимула использовали хемотактический пептид FMLF. Известно, что активация нейтрофилов хемотрактантами сопровождается хемотаксисом и изменениями формы клеток: клетки при этом становятся асимметричными, вытянутыми, приобретают отростки, а лидирующий край формирует зону, вовлеченную в дегрануляцию (Roos F.J. et al., 1987). Мы обнаружили, что в таких клетках продукт иммуногистохимической реакции определялся в плазмалемме уплощенной ламеллоподии и отсутствовал (или был резко снижен) в других участках плазмалеммы (рисунок 7). По-видимому,

Н Рисунок 7. Локализация синтаксина 4 в нейтрофилах человека, стимулированных FMLF: Продукт иммуногистохимической реакции определяется в области ламелоподий. Иммунофлуорисцентный метод. Лазерная микроскопия. Увеличениех 700.

стимуляция нейтрофилов индуцирует перемещение молекул синтаксина 4 в плазматической мембране и их предпочтительное накопление в областях интенсивной дегрануляции.

Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии с применением антител против VAMP-2 представлены на рисунке 8. Видно, что продукт иммуногисто-химической реакции локализован преимущественно в отдельных гранулопо-добных структурах, равномерно присутствующих по всему объему клетки. Четко выраженного иммунного окрашивания периферии клетки не наблюдается. Таким образом, в покоящихся нейтрофилах VAMP-2 находится в цитоплаз-матических гранулах и, по-видимому, отсутствует в плазматической мембране. Обнаруженный образец распространения VAMP-2 в нейтрофилах хорошо согласуется с литературными данными по локализации этого белка в секреторных

■ Рисунок 8. Локализация VAMP-2 в нейтрофилах человека: инкубация с моноклональным антителом против VAMP-2. Иммунофлуорисцентный метод. Лазернаямикроскопия. Увеличениех 700.

везикулах нейрональных и нейроэндокринных клеток (Trimble W.S., 1993).

Чтобы определить с каким типом внутриклеточных гранул нейтрофилов ассоциирован VAMP-2, мы исследовали субклеточное распространение белка в покоящихся нейтрофилах при помощи иммуноэлектронной микроскопии. Све-жевыделенные клетки были подвергнуты фиксации, нарезанию на тонкие срезы и инкубации вначале с моноклональными антителами, узнающими VAMP-2, a затем с белком А, связанным с коллоидным золотом. Как видно из рисунка 9, частицы коллоидного золота главным образом находятся в мембранах популяции электронноплодных гранул, которые соответствуют по морфологическим признакам пероксидазо-негативным гранулам. При условиях, использованных в эксперименте, азурофильные гранулы были подвержены частичной солюбили-зации, и в исследуемых образцах эти гранулы выявляются в виде областей с пониженной электронной плотностью. Как видно из рисунка 9, морфологически детерминированные азурофильные гранулы практически не содержат частиц золота. Таким образом, данные по ультраструктурной локализации VAMP-2 в покоящихся нейтрофилах демонстрируют предпочтительную ассоциацию этого белка с мембранами пероксидазо-негативных гранул.

Мы также исследовали локализацию VAMP-2 при индукции клеток к экзоцитозу при помощи активации с РМА (40 нг/мл). Данные иммунофлуорес-

Рисунок 9 Локализация VAMP-2 в нейтрофилах человека Иммуноэлектронная микроскопия с использованием моноклинального антитела против VAMP-2 Ядро (Я), пероксидаза-негативные гранулы (ПИ), пероксидаза-позитивные гранулы (ПП) Увеличение х 1000

■ Рисунок 10 Локализация VAMP-2 в нейтрофилах человека, стимулированных РМА Продукт им-муногистохимической реакции определяется в области плазмалеммы Ичмунофлуорисцентный метод Лазерная микроскопия Увеличение х 700

центной микроскопии, представлены на рисунке 10. В стимулированных ней-трофилах продукт иммуногистохимической реакции выявляется, главным образом, по всему периметру клетки; дополнительное иммунное окрашивание других областей клетки практически отсутвует. Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о том, что экзоцитоз внутриклеточных гранул сопровождается транслокацией VAMP-2 к плазматической мембране

Ранее было показано, что третий белковый компонент SNARE - комплекса, белок SNAP-25, содержится в двух изоформах SNAP-23 и SNAP-25 и ассоциирован с мембранами внутриклеточных гранул. Результаты иммуноблоттинга с применение антител, узнающих белки семейства представлены на рисунке 11. Рисунок демонстрирует наличие как SNAP-25 - так и SNAP-23 - иммунореак-тивных белков в нейтрофилах больных всеми исследованными формами мие-лопролиферативных заболеваний.

Таким образом, наши экспериментальные данные показывают, что ней-трофилы периферической крови больных миелопролиферативными заболеваниями экспрессируют белки плазматической мембраны - синтаксин 4 и синтак-син 6 - и мембранные белки популяции специфических/желатиназных гранул -SNAP-25, SNAP-23 и VAMP-2. В тоже время белок VAMP-1, ассоциированный в нейтрофилах здоровых доноров с мембранами как азурофильных, так и спе-цифических/желатиназных гранул присутствует при эритремии и миелофибро-зе, а при хроническом миелолейкозе отсутствует.

Рисунок 11. Иммунодетекция белков семейства 8ЫЛР-25 в нейтрофшах человека при миелоро-лиферативных заболеваниях. Равные количества покоящихся экстрактов нейтрофилов человека

(~10клеток) были подвергнуты разделению в 12% ПЛАТ и иммуноблоттингу с применением моно-клональных антител против 8МЛР-23 (Л) и ЗМЛР-25 (Б). Слева указаны молекулярные массы белков маркеров. Контроль (К) - экстракт нейтрофилов здоровых доноров, ЭР - экстракт нейтрофилов пациентов с эритремией, ХМЛ - экстракт нейтрофилов пациентов с хроническим миелолейко-зом, МФ - экстракт нейтрофилов пациентов с миелофиброзом.

Взаимодействие SNARE в нейтрофилах человека при миелопролифе-ративных заболеваниях.

Для изучения способности к белок-белковым взаимодействиям SNARE в нейтрофилах больных МПЗ мы воспользовались экспериментальным подходом, основанным на совместной иммунопреципитации SNARE белков из экстрактов полиморфноядерных лейкоцитов человека. Для выделения из клеток SNARE

комплексов активированные нейтрофилы (FMLF 10-7М; 10 мин; 37°С), лизиро-вали и осаждали на афинном сорбенте протеин А-агароза с присоединенными к ней моноклональными антителами против VAMP-2. После электрофореза и переноса на нитроцеллюлозу VAMP-2-иммунопреципитаты были исследованы на присутствие в них SNAP-25, SNAP-23 и синтаксина 4.

Результаты Вестерн-блот анализа иммунопреципитатов с применением моноклинального антитела против синтаксина 4 представлены на рисунке 12. Из рисунка 12 видно, что синтаксин 4, присутствующий в клеточных экстрактах нейтрофилов больных МПЗ, сорбируется на носителе протеин А-агароэе. Интересно отметить, что интенсивность детектируемой синтаксин 4-иммуно-реактивной полосы при ХМЛ значительно снижена по сравнению с контролем, а в случае мие-лофиброза следовые количества синтаксина 4 выявляются только при более долгой экспозиции блота.

Результаты иммуноблоттинга VAMP-2 им-мунопреципитатов с применением моноклинального антитела против SNAP-25 и поликлональных антител против SNAP-23 представлены на рис. 13. Как видно из рис. 13, VAMP-2-иммунопреципитаты содержат белки SNAP-25 и SNAP-23. Однако сравнительный анализ иммунопреципитатов из нормальных и лейкемических клеток показал, что содержание исследуемых белков в нейтрофилах пациентов с хроническим миелолейкозом и миелофиброзом значительно ниже, чем в нейтрофилах здоровых доноров. В случае нейтрофилах больных эритремией содержание SNAP-25 и SNAP-23 в иммунопреципитатах не отличалось от нормы.

Рисунок 12. Взаимодействие УАМР-2 с синтаксинам 4 в нешпрофилах человека при миело-пролиферативных заболеваниях Равные количества активированных экстрактов клеток

£107клеток) подвергали итунопрециптщии на афиннам сорбенте протеин А-агарозе с присоединенными к ней монсклональными антителами против УАМР-2 с последующим рев-делением в 12% ПААГ и шщмоблоттингам с применением моноспецифичесих антител против синтсваш 4 Контроль (К) - экстракт нейтрофипов здоровых доноров, ЭР - экстракт нейтрофилов пациентов с эритремией, ХМЛ - экстракт нейтрофилов пациентов с хроническим миеполейкоюм, МФ-экспцюш нейтрофилов пациентов с миелофиброзом.

К ЭР ХМЛ МФ К ЭР ХМЛ МФ

Рисунок 13. Взаимодействие VAMP-2 с белками семейства SNAP-25 в нейтрофипах человека при миелопролиферативных заболеваниях Разные количества активированных экстрактов

клеток (^¡О7 клеток) подвергали иммунопреципитации на афиннам сорбенте протеин А-агарсвы с присоединенными к ней моноклональныт антителами против VAMP-2 с последующим разделе-нием в 12% ПААГ и иммуноблоттингом с применением моноспецифических против SNAP-23 и SNAP-25. Контроль (К) - экстрскт нейтрофилов здоровых доноров, ЭР -жтраап нейтрофилов пацьентов с эрипремией, ХМЛ-экстракт нейтрофилов пациентов с хроническим миелолейкозам, МФ-экстракт нейпрофилов пациентов с миеяофиброяам.

На основании результатов настоящего исследования можно заключить, что в нейтрофилах больных хроническим миелолейкозом и миелофиброзом имеются нарушения в функционировании белкового аппарата, ответственного за осуществление состыковки гранулярной и плазматической мембран и их последующего слипания/слияния (SNARE аппарата). Эти нарушения, по-видимому, приводят к изменениям (снижению) в уровне экзоцитоза гранул в клетках больных МПЗ. Так, в частности, вполне вероятно, что при хроническом миело лейкозе и миелофиброзе снижение уровня экзоцитоза популяции специфических/ желатиназных гранул происходит вследствие снижения бинарных белок- белковых взаимодействий VAMP-2 с синтаксином 4, SNAP-25 и SNAP-23 .Нарушение же экзоцитоза азурофильных гранул при хроническом миело-

лейкозе вызвано, по-видимому, отсутствием в лейкемических нейтрофилах УЛМР-1, ключевого белка, в норме опосредующего экзоцитоз азурофильных гранул.

ВЫВОДЫ

1. Нейтрофилы периферической крови больных хроническим миелолейкозом и миелофиброзом дефектны по системе регулируемого экзоцитоза внутриклеточных гранул. В нейтрофилах пациентов с хроническим миелолейкозом снижен уровень экзоцитоза азурофильных, специфических и желатиназных гранул. В нейтрофилах больных миелофиброзом снижен уровень экзоцитоза популяции специфических/желатиназных гранул. При эритремии существенных изменений в уровне экзоцитоза нейтрофилов нами не выявлено.

2. Нейтрофилы больных хроническим миелолейкозом, миелофиброзом и эрит-ремией содержат следующие мембранные белки, необходимые для образования комплекса, являющегося рецептором для белков цитозоля - фактора, чувствительного к N-этилмалеимиду, и белка, связывающегося с фактором, чувствительным к N-этилмалеимиду (SNARE комлекса): две изоформы SNARE белков семейства синтаксинов - синтаксин 4 и синтаксин 6 - и две изоформы SNARE белков семейства SNAP-25 (белков, ассоциированных с синаптосомами) - SNAP-25 и SNAP-23. Установлено, что представитель семейства мембранных белков, ассоциированных с везикулами, VAMP-2, при-сутствеут в нейтрофилах больных хроническим миелолейкозом, миелофиб-розом и эритремией, в то время как другой представитель этого семейства -VAMP-1 - отсутствует в нейтрофилах пациентов с хроническим миелолейкозом.

3. Установлена внутриклеточная локализация в нейтрофилах человека белка VAMP-2: белок находится в мембранах специфических и желатиназных гранул. В нейтрофилах, индуцированных к экзоцитозу, происходит транслокация VAMP-2 к плазматической мембране.

4. В нейтрофилах человека синтаксин 4 находится в плазматической мембране. В покоящихся нейтрофилах белок равномерно распределен по всей поверхности клетки, в то время как в нейтрофилах, подвергнутых стимуляции, происходит перераспределение синтаксина 4 и аккамуляция белка в зонах интенсивной секреции.

5. В нейтрофилах, индуцированных к экзоцитозу, VAMP-2 in vivo образует комплексы с белками синтаксином 4, SNAP-23 и SNAP-25. Установлено, что способность VAMP-2 к белок-белковым взаимодействиям с синтаксином 4 SNAP-23 и SNAP-25 значительно снижена в нейтрофилах больных с хроническим миелолейкозом и миелофиброзом.

Практические рекомендации

1. Результаты могут быть использованы в практике научно-исследовательских лабораторий при изучении вопросов морфо-функционального состояния нейтрофилов при миелопролиферативных заболеваниях.

2. Полученные результаты могут быть использованы в лекционном преподавании и при проведении практических занятий со студентами медицинского факультета по разделам цитологии и клеточной биологии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Набокина СМ., Нуянзина В А, Сальникова Е.Н.. Белки группы SNARE в нейтрофилах человека. Современные аспекты теоритической и клинической медицины: проблемы диагностики, лечения и реабилитации. Межвузовский сборник научных трудов. - Саранск: Изд-во Мордов. Ун-та, 2000. С. 142.

2. Нуянзина В.А., Набокина СМ.. Дисфункции нейтрофилов при хроническом миелолейкозе. Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии. Томск: Изд-во Сибирского государственного медицинского ун-та, 2004. Т.З,№2,С301.

3. Нуянзина В А., Набокина СМ.. Идентификация белков медиаторов экзоци-тоза в нейтрофилах периферической крови больных хроническим миелолей-козом. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - Москва: Изд-во РАМН, 2004. № 6 С. 409-412.

4. Нуянзина В.А., Набокина СМ. Изучение экзоцитозной активности внутриклеточных гранул нейтрофилов больных миелопролиферативными заболеваниями. Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии. Томск: Изд-во Сибирского государственного медицинского ун-та, 2004. Т.З, №2, С 304.

5. Нуянзина ВА., Набокина СМ.. Исследование взаимодействия белков группы SNARE в нейтрофилах человека in vivo. Материалы научной конф. 30 Огаревские чтения. Вып.2. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2001. С. 49-52.

6. Нуянзина В.А., Набокина СМ., Рындов Е.А.. Изучение секреторной активности нейтрофилов периферической крови больных хроническим миелолей-козом. Материалы научной конф. 31 Огаревские чтения. Вып.2. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2003. С. 74.

7. Нуянзина ВА., Харитонова Т.Н., Набокина СМ.. Исследование секреторной активности нейтрофилов периферической крови больных миелодиспласти-ческим синдромом. Проблемы региональной генетики: Научные труды, посвященные 40-летию кафедры генетики МГУ им. Н. П. Огарева. Вып 1. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2003. С 84-86.

Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Тайм^ Печать способом ризографии. Усл. печ. л. 1,16. Уч.- изд. л. 1,58. Тираж 100 экз. Заказ №151.

Отпечатано с оригинала-макета заказчика в копи-центре «Референт». ИП Тимошкина Л .В. 430000, г. Саранск, ул. Полежаева, 49.

«22251

РНБ Русский фонд

2005-4 19548

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нуянзина, Валентина Александровна

Введение

Глава 1. Обзор литературы 1.1 .Миелопролиферативные заболевания

1.1.1. Хронический миелолейкоз

1.1.2. Эритремия

1.1.3.Сублейкемический миелоз (миелофиброз)

1.2. Гранулы нейтрофилов человека

1.2.1. Характеристика и классификация гранул нейтрофилов

1.2.1.1. Азурофильные (первичные) гранулы

1.2.1.2. Специфические (вторичные) гранулы

1.2.1.3. Желатиназные гранулы

1.2.1.4. Секреторные везикулы

1.2.2. Экзоцитоз гранул нейтрофилов

1.3. Гипотеза слипания и слияния мембран (SNARE гипотеза)

1.3.1. Характеристика основных белковых компонентов модели 1.3.1.1 .Белки семейства VAMP/синаптобревинов

1.3.1.2. Синтаксины

1.3.1.3. SNAP

1.3.1.4. NSF

1.3.1.5. SNAP

1.3.2. Механизм слипания/слияния мембран (SNARE гипотеза)

Глава 2. Материалы и методы исследований

2.1. Объекты исследования

2.2. Материалы

2.3. Методы

2.3.1 Выделение нейтрофилов человека

2.3.2. Активация нейтрофилов

2.3.3. Определение активности миелопероксидазы

2.3.4. Определение активности лизоцима

2.3.5. Определение активности щелочной фосфатазы

2.3.6. Иммунофлуоресцентная микроскопия

2.3.7. Электронная микроскопия

2.3.8. Электрофорез белков

2.3.9. Иммуноблоттинг (Вестерн-блот анализ) 49 2. 3.9.1. Перенос фракций из геля на фильтр 50 2.3.9.2. Иммунное выявление антигенов на фильтре

2.3.10. Иммунопреципитация

Глава 3. Результаты и их обсуждения

3.1. Оценка экзоцитоза внутриклеточных гранул нейтрофилов больных миелопролиферативными заболеваниями

3.2. Идентификация белков-медиаторов экзоцитоза в лейкоцитах пациентов с миелопролиферативными заболеваниями

3.3. Взаимодействие белков группы SNARE в нейтрофилах больных миелопролиферативными заболеваниями

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование экзоцитоза в нейтрофилах человека при миелопролиферативных заболеваниях"

Известно, что реализация ключевых функций нейтрофилов, главным образом защитной и воспалительной, в значительной мере обусловлена мобилизацией внутриклеточных гранул. Экзоцитоз гранул необходим для адгезии, тран-сэндотелиальной миграции и выхода клеток из кровеносных сосудов в ткани, образования реактивных метаболитов кислорода, секреции литических ферментов (Borregaard N., 1996; Lageti Е., Mocsai А., 1999).

В настоящее время установлено, что осуществление экзоцитоза в нейтро-филах периферической крови человека происходит через универсальный механизм слипания/слияния мембран, получивший название SNARE гипотеза. Механизм основан на взаимодействии белка везикулярной мембраны VAMP (мембранный белок, ассоциированный с везикулами, v- SNARE) с белками плазматической мембраны, t-SNARE, - синтаксином и SNAP-25 (белок ассоциированный с синаптосомами, молекулярная масса 25 кД), образовании комплекса этих белков - SNARE комплекса - и связывании с комплексом цито-зольных белков, в конечном итоге приводящем к слиянию мембран (Gerst J., 1999). В нейтрофилах периферической крови человека вывлены множественные изоформы белков группы SNARE, которые, по-видимому, опосредуют экзоцитоз разных типов гранул, а также исследована способность этих SNARE к белок белковым взаимодействиям (Mollinedo F., Lazo P., 1997; Nabokina S.M. et al. 1997; Martin-Martin В et al., 1999; Mollinedo F. et al., 2003). В то время как представления о молекулярных механизмах, управляющих ходом экзоцитоза в нейтрофилах в норме постоянно расширяются и уточняются, данные по изучению экзоцитоза в нейтрофилах человека при различных формах миелоидных заболеваний, в частности при миелопролиферативных заболеваниях, практически отсутствуют в литературе.

Миелопролиферативные заболевания представляют собой группу опухолей кроветворной ткани, возникающих в результате злокачественной трансформации стволовой кроветворной клетки, и характеризующиеся способностью клеточных элементов к дифференцировке и созреванию (Raskind W.H., Steinmann L., Najfeld V., 1998; Tefferi A., 2001). Ранее в нейтрофилах периферической крови больных миелопролиферативными заболеваниями были выявлены как морфологические, так и функциональные дефекты, в том числе было отмечено снижение хемотаксиса, адгезии, бактерицидной активности, активности ряда ферментов внутриклеточных гранул (Гусева С.А., 1990; Borregaard N., 1993; Мацнер Я., 1993; Wolach В. et al., 1998). Вполне вероятно, что отмеченные выше морфологические и функциональные изменения циркулирующих нейтрофилов появляются вследствие нарушений механизмов, управляющих экзоцитозом лейкемических нейтрофилов.

Таким образом, исследования, нацеленные на изучение механизмов экзоцитоза, в том числе белкового аппарата, вовлеченного в эк-зоцитоз нейтрофилов больных миелопролиферативными заболеваниями, представляются весьма важными для понимания морфофунк-ционального состояния и патофизиологии лейкемических нейтрофилов.

Цель и задачи исследования.

Основной целью данной работы явилось исследование молекулярных механизмов экзоцитоза внутриклеточных гранул нейтрофилов периферической крови человека при различных миелопролифе-ративных заболеваниях.

Для достижения этой цели были определены следующие задачи:

- оценка уровня экзоцитоза нейтрофилов периферической крови при миелопролиферативных заболеваниях;

- поиск и идентификация белков-медиаторов экзоцитоза (белков группы SNARE) в нейтрофилах пациентов с миелопролиферативными заболеваниями;

- исследование способности к белок-белковым взаимодействиям между отдельными представителями группы SNARE в нейтрофилах у больных миелопролиферативными заболеваниями.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Нейтрофилы периферической крови больных миелопролиферативными заболеваниями являются дефектными по системе регулируемого экзоцитоза внутриклеточных гранул.

2. Нейтрофилы пациентов с миелопролиферативными заболеваниями экспрессируют множественные изоформы белков группы SNARE. Белок VAMP-1, играющий ключевую роль в экзоцитозе азу-рофильных гранул, отсутствует в нейтрофилах больных хроническим миелолейкозом.

3. Способность к образованию VAMP-2 - содержащих SNARE комплексов, определяющих состыковку и слипание/слияние мембран в нейтрофилах пациентов с хроническим миелолейкозом и миело-фиброзом, снижена.

Научная новизна работы.

В настоящей работе впервые проведено систематическое исследование экзоцитоза нейтрофилов больных миелопролиферативными заболеваниями. Впервые изучена экспрессия белков медиаторов экзоцитоза в нейтрофилах при миелопролиферативных заболеваниях, в частности нами было показано, что в нейтрофилах пациентов с хроническим миелолейкозом отсутствует белок VAMP-1, играющий ключевую роль в процессе экзоцитоза внутриклеточных гранул нейтрофилов в норме. Также впервые установлена внутриклеточная локализация синтаксина 4 и VAMP-2 в покое и в клетках, подвергнутых стимуляции. Впервые изучена способность VAMP-2 к взаимодействию с SNARE-белками: синтаксином 4, SNAP-23 и SNAP-25. Причем впервые продемонстрировано, что способность VAMP-2 к белок-белковым взаимодействиям с указанными выше SNARE белками в нейтрофилах пациентов с миелофиброзом и хроническим миелолейкозом значительно снижена, по сравнению с нормой.

Научно-практическая ценность работы.

Результаты могут быть использованы в фундаментальных исследованиях при изучении механизмов слипания/слияния мембран в норме и при патологии.Результаты могут быть использованы в прикладных исследованиях, посвященных установлению роли SNARE в индукции и развитии защитных и воспалительных функций нейтро-филов пациентов с хроническим миелолейкозом и миелофиброзом.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на конференциях молодых ученых Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2000-2004 гг.), на научных конференциях «Огаревские чтения» (Саранск, 2000-2004), на всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Кипр, 2004). Работа прошла апробацию на объединенном заседании кафедр генетики биологического факультета и цитологии, гистологии и эмбриологии медицинского факультета Мордовского госуниверситета им. Н.П.Огарева.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Нуянзина, Валентина Александровна

ВЫВОДЫ

Нейтрофилы периферической крови больных хроническим миелолейкозом и миелофиброзом дефектны по системе регулируемого экзоцитоза внутриклеточных гранул. В нейтрофилах пациентов с хроническим миелолейкозом снижен уровень экзоцитоза азурофильных, специфических и желати-назных гранул. В нейтрофилах больных миелофиброзом снижен уровень экзоцитоза популяции специфических/желатиназных гранул. При эритре-мии существенных изменений в уровне экзоцитоза нейтрофилов нами не выявлено.

Нейтрофилы больных хроническим миелолейкозом, миелофиброзом и эритремией содержат следующие мембранные белки, необходимые для образования комплекса, являющегося рецептором для белков цитозоля -фактора, чувствительного к N-этилмалеимиду, и белка, связывающегося с фактором, чувствительным к N-этилмалеимиду (SNARE комлекса): две изоформы SNARE белков семейства синтаксинов — синтаксин 4 и синтак-син 6 - и две изоформы SNARE белков семейства SNAP-25 (белков, ассоциированных с синаптосомами) - SNAP-25 и SNAP-23. Установлено, что представитель семейства мембранных белков, ассоциированных с везикулами, VAMP-2, присутствеут в нейтрофилах больных хроническим миелолейкозом, миелофиброзом и эритремией, в то время как другой представитель этого семейства - VAMP-1 - отсутствует в нейтрофилах пациентов с хроническим миелолейкозом.

Установлена внутриклеточная локализация в нейтрофилах человека белка VAMP-2: белок находится в мембранах специфических и желатиназных гранул. В нейтрофилах, индуцированных к экзоцитозу, происходит транслокация VAMP-2 к плазматической мембране.

В нейтрофилах человека синтаксин 4 находится в плазматической мембране. В покоящихся нейтрофилах белок равномерно распределен по всей поверхности клетки, в то время как в нейтрофилах, подвергнутых стимуляции, происходит перераспределение синтаксина 4 и аккамуляция белка в зонах интенсивной секреции.

В нейтрофилах, индуцированных к экзоцитозу, VAMP-2 in vivo образует комплексы с белками синтаксином 4, SNAP-23 и SNAP-25. Установлено, что способность VAMP-2 к белок-белковым взаимодействиям с синтаксином 4 SNAP-23 и SNAP-25 значительно снижена в нейтрофилах больных с хроническим миелолейкозом и миелофиброзом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нуянзина, Валентина Александровна, Саранск

1. Агеев А.К. Инфекционные осложнения лейкозов и других опухолей кроветворной системы//Архив патологии. 1983. Т.14. №7. С. 13-19.

2. Белова Л.А. Биохимия процессов воспаления и поражения сосудов. Роль нейтрофилов//Биохимия. 1997. Т. 62. С. 659-668.

3. Берлов М.Н., Лодыгин П.А., Андреева Ю.В., Кокряков В.Н. Выделение и некоторые физико-химические свойства эластазы и катепсина// Биохимия.2001. Т.66. №9. С.1238-1244.

4. Блиндарь В.Н., Зубрихина Г.Н., Михайлова И.Н. и др. Дисфункции нейтрофилов при хроническом миелолейкозе// Гематология и трансфузиология.2002. №2. С. 13-16.

5. Гаврилов O.K., Файнштейн Ф.Э., Турбина Н.С.// Депрессии кроветворения. М. Медицина. 1987. С. 142-145.

6. Глебов Р. Н. Эндоцитоз и экзоцитоз // Биохимия мембран. Книга 2. Под ред. A.A. Болдьфева. Москва: Изд-во "Высшая школа". 1987. - 95с.

7. Гусева С.А. Бактерицидная функция нейтрофилов при миелопролиферативных заболеваниях// Врачебное дело. 1990. №2. С. 27-30.

8. Катанаев внутриклеточная передача сигнала при хемотаксисе нейтрофилов// Биохимия. 2001. Т.66. №4. С. 437-456.

9. Мацнер Я. Дисфункции гранулоцитов при гематологических заболеваниях// Гематология и трансфузиология. 1993. №5. С. 41-43.

10. Ю.Морозова В.Т. Цитохимические и функциональные особенности нейтрофилов при полицетемии// Лабораторное дело. 1975. №7. С.390-394.

11. Славинский A.A. Цитоплазматическая зернистость нейтрофилов// Клиническая лабораторная диагностика. 2002. №2. С.39-43.

12. Шардаков В.И., Копанева Т.Г., Безносикова Т.П. Функциональная активность нейтрофилов у больных хроническим миелолейкозом// Гематология и

13. TpaHC(J)y3H0Ji0rHa. 1987. №8. C.16-19.

14. Arnljots K, Sorensen O, Lollike K, Borregaard N. Timing, targeting and sorting of azurophil granule proteins in human myeloid cells//Leukemia. 1998. V. 11. P. 178995.

15. Baiton D.F. Neutrophil granules // Br. J. Haemotol. 1975. V. 29. P. 17-22.

16. Baiton D.F., Farquhar M.G. Origin of granules in polymorphonuclear leukocytes. Two types derived from opposite faces of the Golgi complex in developing granulocytes//!. Cell. Biol. 1966. V. 28. P. 277-301.

17. Bainton DF. Related Articles, Distinct granule populations in human neutrophils and lysosomal organelles identified by immuno-electron microscopy// J Immunol Methods. 1999. V. 232. P. 153-68.

18. Bainton DF. Neutrophilic leukocyte granules: from structure to function// Adv Exp Med Biol. 1993. V.336. P. 17-33.

19. Baiton D.F., Ullyot J.L., Farquhar M.G. The development of neutrophilic polymorphonuclear leukocytes in human bone marrow. Origin and content of azurophil and specific granules// J. Exp. Med. 1971. V. 134. P. 907-934.

20. Borregaard N. Cowtand J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte//Blood. 1997. V. 89. P. 3503-3521.

21. Boiregaard N., Heiple J.M., Simons E.R., dark R.A. Subcellular localization of the b-cytoclirome component of the human neutrophil microbicidal oxidase: Trans-iocation during activation//J. Cell Biol. 1983. V. 97. P. 52.

22. Borregaard N, Cowland JB. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte// Blood. 1997 V.10. P. 3503-3521.

23. Borregaard N., Lollike K., Kjeldsen L., Sengelov H., Bastholm L., Nielsen M.H.,

24. Baiton D.F. Human neutrophil granules and secretory vesicles // Eur. J. Haemotol. 1993. V. 51. P. 187-198.

25. Borregaard N., Kjeldsen L., Lollike K., Sengelov H. Ca2+-dependent transloca-lion of cytosolic proteins to isolated granule subpopularions and plasma membrane from human neutrophils// FEBS Lett. 1992 V. 304. P. 195-197.

26. Borregaard N, Kjeldsen L, Lollike K, Sengelov H. Granules and vesicles of human neutrophils. The role of endomembranes as source of plasma membrane proteins// Eur J Haematol. 1993. V.51. P.318-322.

27. Borregaard N, Kjeldsen L, Lollike K, Sengelov H. Granules and secretory vesicles of the human neutrophil// Clin Exp Immunol. 1995. V.101. P.6-9.

28. Borregaard N., Kjeldsen L., Rygaard K., Bastholm L., Nielsen M.H., Sengelov H., Bjerrum O.W., Johnsen A.H. Stimulus-dependent secretion of plasma proteins Irom human neutrophils//!. Clin. Invest. 1992. V.90. P. 86.

29. Borregaard N, Kjeldsen L, Sengelov H. Mobilization of granules in neutrophils from patients with myeloproliferative disorders// Eur. J. Haematol. 1993. V.50. P. 189199.

30. Borregaard N., Sehested M., Nielsen B.S., Sengelov H., Kjeldsen L. Biosyntesis of granule proteins in normal human bone marrow cells. Gelatinase is a marker of terminal neutrophil differentiation// Blood. 1995. V. 85. P. 812-817.

31. Brennwald P., Keams B., Champion K., Keranen S., Bankaitis V., Novick P. Sec9 is a SNAP-25-hke component of a yeast SNARE complex that may be the effector ofSec4 function in exocytosis// Cell. 1994. V. 79. P. 245-258.

32. Bulow E, Bengtsson N, Calafat J, Gullberg U, Olsson I. Sorting of neutrophil-specific granule protein human cathelicidin, hCAP-18, when constitutively expressed in myeloid cells// J. Leukoc. Biol. 2002. V. 72. P. 147-153.

33. Burg ND, Pillinger MH. The neutrophil: function and regulation in innate and humoral immunity// Clin Immunol. 2001. V. 99. P. 7-17.

34. Burgoyane R., Morgan A. Secretory granules exocytosis// Physiol. 2003. V.83. P. 581-632.

35. Burri L., Varlamov O., Doege C.A. A SNARE reqared for retrograde transport to the endoplasmatic reticulum// Proc.Natl. Acad. USA. 2003. V. 100. P. 9873-9877.

36. Bjerrum OW, Nissen MH, Borregaard N. Neutrophil beta-2 microglobulin: an inflammatory mediator//Scand J Immunol. 1990. V.32. P. 233-242.

37. Calakos N. Scheller R.H. Synaptic vesicle biogenesis, docking, and fusion: a molecular description//Physiol. Rev. 1996. V. 76. P. 1-29.

38. Castell L, Vance C, Abbott R, Marquez J, Eggleton P. Granule localization of glutaminase in human neutrophils and the consequence of glutamine utilization for neutrophil activity// J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 13305-13310.

39. Calhoun B.C., Goldenring J.R. Two Rab proteins- vesicle-associated membrane protein 2 (VAMP-2) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs), are present on immunoisolated parietal cell tubiilovesicles // Biochem. J. 1997, V. 325. P. 559564.

40. Cham BP, Gerrard JM, Bainton DF. Granulophysin is located in the membrane of azurophilic granules in human neutrophils and mobilizes to the plasma membrane following cell stimulation// Am J Pathol. 1994. V.6. P. 1369-80.

41. Chapman E.R., Hanson P.I., An S., Jahn R. Ca2- regulates the interaction between synaptotagmin and syntaxin 1 //J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 23667-23671.

42. Cheatham B., Volchuk A., Kahn C.R., Wang L., Rhodes C.J. Klip A. Insulin-stimulated translocation of GLUT4 glucose transporters requires SNARE-complex proteins //Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. V. 93. P. 15169-15173.

43. Chen Y, Xu Y, Zhang F, Shin YK. Constitutive versus regulated SNARE assembly: a structural basis//EMBO J. 2004. V. 23. P. 681-689.

44. Chin A.C., Burgess R.W., Wong B.R,, Schwarz T.L„ Scheller R.H. Differential expression of transcripts from syb, a Drosophila melanogaster gene encoding VAMP (synaptobrevin) that is abundant in non-neuronal cells // Gene. 1993. V. 131. P. 175181.

45. Cintin C, Johansen JS, Skov F, Price PA, Nielsen HJ. Accumulation of the neutrophil-derived protein YKL-40 during storage of various blood components// Inflamm Res. 2001. V. 50. P. 107-111.

46. Conner S., LeafD., Wessel G. Members of the SNARE hypothesis are associated with cortical granule exocytosis in the sea urchin egg // Mol. Reprod. Dev. 1997. V.48. P. 106-118.

47. Debello W.M., Betz H., Augustine G.J. Synaptotagmin and neurotransmitter release// Cell. 1993. V. 74. P. 947-950.

48. Drummond M.W., Holyoake T.L. Tyrozine kinase inhibitors in the theatment of chronic myeloid leukemia: so far god?// Blood. 2001. V. 15. P. 85-95.

49. Durant S, Pederzoli M, Lepelletier Y, Canteloup S, Nusbaum P, Lesavre P, Witko-Sarsat V. Apoptosis-induced proteinase 3 membrane expression is independent from degranulation// J. Leukoc. Biol. 2004. V. 75. P. 87-98.

50. Elferirit L.A., Trimble W.S., Scheller R.H. Two vesicle-associated membrane protein genes are differentially expressed in the rat central nervous system// J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 11061-11064.

51. Falnga A., Marchetti M., Evangelista V. Et al. Polymorphonuclear leukocyte activation and hemostasis in patients with essential thrombocytemia and polycytemia vera//Blod. 2000. V.96. P. 4261-4266.

52. Fasshauer D. Structural insights into the SNARE mechanism// Biochem. Biophys. Acta. 2003. V. 164. P. 87-97.

53. Faurschou M, Borregaard N. Neutrophil granules and secretory vesicles in9inflammation//Microbes Infect. 2003. V. 14. P. 1317-1327.

54. Faurschou M., Sorensen O., Jonsen A. et al. Defensin-rich granules of human neutrophils: characterization of secretory properties// Biochem. Biophis. Acta.2002. V. 19. P.29-35.

55. Fernandez I. Ubach .1. Dulubova I. Zhang X., SudhofT.C. Rizo J. Thre-dimensional structure of an evokitionary conserved N-terminal domain of svntaxin 1A// Cell. 1998. V. 94. P. 841-849.

56. Femandez-Segura F. Garcia J.M. Campos A. Topographic distribution neutrophils as related to shape changes and movement induced b himotactic peptide and phorbol esters//Cell Immunol. 1996. V. 17. P. 120.

57. Freedman S J., Song H.K., Xu Y. et al. Homotetrameric structure of the SNAP-23 N-terminal coiled-coil domain// J. Biol Che. 2003. V. 278. P. 13462-13467.

58. Fukuyama N, Ichimori K, Su Z, Ishida H, Nakazawa H. Peroxynitrite formation from activated human leukocytes// Biochem Biophys Res Commun. 1996. V. 224. P. 414419.

59. Gabay JE, Almeida RP. Antibiotic peptides and serine protease homologs in human polymorphonuclear leukocytes: defensins and azurocidin// Curr. Opin. Immunol. 1993. V. 5. P. 97-102.

60. Gaisano H.Y., Chai M., Malkus P.M., Shell L., Bouquillon A., Bennet M.K., Trimble W.S. Distinct cellular locations of the syntaxin family of proteins in rat pancreatic acinar cells // Mol. Biol. Cell. 1996. V. 7. P. 2019-2027.

61. Gaisano H.Y., Shell L., Foskett J.K., Trimble W.S. Tetanus toxin light chain cleaves a vesicle-associated membrane protein (VAMP) isoform 2 in rat pancreatic zymogen granules and inhibits enzyme secretion // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 1706217066.

62. Gerst J.E. Conserved alpha-helical segments on yeast homologs of the synap-tobreyin/VAMP family ofv-SNAREs mediate exocytic function// J. Biol. Cliem. 1997. V.272. P. 16591-16598.

63. Grahan M.E., Wasbourne P., Wilson P. Molecular analysis of SNAP-25 function in exocytosis// Ann. N.Y. Acad. Sci. 2002. V.971. P. 210-221.

64. Haynes L.P., Barnard R.J., Morgan A., Burgoyne R.D. Stimulation of NSF ATPase activity during t-SNARE priming//FEBS Lett. 1998. V. 436. P. 1-5.

65. Hodel A. SNAP-25 //Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1998. V. 30. P. 1069-1073.

66. Hoffstein S.I. Intra- and extracellular secretion from polymorphonuclear leuko-, cytes// Cell Biology of Inflammation (ed. G. Weissmann). Elsevier, New York. 1980. 387 p.

67. Hohne-Zell B., Galler A., Schepp W„ Gratzl M., Prinz C. Functional importance of Synaptobrevin and SNAP-25 during exocytosis of histamine by rat gastric enterochromaffin-like cells/ZEndocrinology. 1997. V. 138. P. 5518-5526.

68. Holyoake T. Recent advances in the molecular and cellular biologi of CML// Br. J. Haematol. 2001. V.74. P.321-329.

69. Hua Y., Scheller R. Three SNARE complexes cooperate to mediate membrane fusion// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 8065-8070.

70. Jeremic A, Kelly M, Cho JA, Cho SJ, Horber JK, Jena BP. Calcium drives fusion of SNARE-apposed bilayers// Cell Biol Int. 2004. V. 1. P. 19-31.

71. Karlsson A, Dahlgren C. Assembly and activation of the neutrophil NADPH oxidase in granule membranes// Antioxid Redox Signal. 2002. V. 4. P. 49-60.

72. Karlsson A., Nixon J. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADF- oxidase activity by two separate signal transduction pathways : dependent or independent ofphosphatidylinositol 3-kinase// J. Leukoc. Biol. 2000. V. 80. P. 396-404.

73. Kjeldsen L. Gelatinase granules in human neutrophils// Eur J Haematol Suppl. 1995. V.56. P. 1-30.

74. Kjeldsen L, Sengelov H, Borregaard N. Subcellular fractionation of human neutrophils on Percoll density gradients // J Immunol Methods. 1999. V. 232. P.131-143.

75. Kjeldsen L., Sengelov H., Lollike K., Nielsen M.H., Borregaard N. Isolation and characterization ofgelatinase granules from human neutrophils// Blood. 1994. V.83. P. 1640.

76. Kosir MA, Foley-Loudon PA, Finkenauer R, Tennenberg SD. Multiple heparanases are expressed in polymorphonuclear cells// J Surg Res. 2002. V. 103. P. 100-108.

77. Kuliawat R, Kalinina E, Bock J, Fricker L, McGraw TE, Kim SR, Zhong J, Scheller R, Arvan P. Syntaxin-6 SNARE involvement in secretory and endocytic pathways of cultured pancreatic beta-cells// Mol Biol Cell. 2004. V.15. P. 1690-1701.

78. Kweon D.H., Kim C.S., Shin Y.K. Regulation of neuronal SNARE assembli by the membrane//Nat. Struct. Biol.- 2003. V. 10. P. 470-477.

79. Lane S.R., Liu Y. Characterization of the palmitoylation domain of SNAP-25// Neurochem. 1997. V. 69. P. 1864-1869.

80. Lawrence G., Dolly J. Multiple forms of SNARE complexes in exocytosis from chromaffin cells: effect of Ca2+, MgATP and botulinum toxin type A// J. Cell Science. 2002. V. 115. P. 667-673.

81. Le Cabec V, Calafat J, Borregaard N. Sorting of the specific granule protein, NGAL, during granulocytic maturation of HL-60 cells// Blood. 1997. V. 89. P. 2113-2121.

82. Lehrer R., Ganz T. Cathelicidins: a family of endogenous antimicrobial peptides//

83. Cur. Opin. Hematol.2002. V. 9. P. 18-22.

84. Legeti E., Mocsai A. Exocytosis neutrophils granulocytes// Biochem. Pharmacol. 2000. V. 57. P. 1209-1214.

85. Li C., Ullrich B., Zhang J.Z., Anderson R.G.W., Brose N. Sudhof T.C. Ca2'-dependent and -independent activities of neural and non-neural synaptotagmins// Nature. 1995. V. 375. P. 594-599.

86. Li L., Chin L.S. The molecular machinery of synaptic vesicle exocytosis// Cell Mol. Life Sci. 2003. V. 60. P. 942-960.

87. Ligeti E., Mocsai A. Exocytosis of neutrophil granulocytes// Biochem. Pharmacol. 1999. V. 57. P. 1209-1214.

88. Linial M. SNARE proteins why so many, why so fewWJ// Neurochem. 1997. V. 69. P. 1781-1792.

89. Liu Y, Merlin D, Burst SL, Pochet M, Madara JL, Parkos CA. The role of CD47 in neutrophil transmigration. Increased rate of migration correlates with increased cell surface expression of CD47// J. Biol. Chem. 2001. V.276. P. 40156-40166.

90. Logan MR, Odemuyiwa SO, Moqbel R. Understanding exocytosis in immune and inflammatory cells: the molecular basis of mediator secretion// J. Allergy Clin Immunol. 2003. V. 111. P. 32923-32933.

91. Low S.H., Li X., Miura M., Kudo N. et al. Syntaxin 2 and andobrevin are required for the terminal step of cytokinesis in mammalian cells// Dev. Cell. 2003. V. 4. P. 753-759.

92. Lollike K, Lindau M, Calafat J, Borregaard N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils// J. Leukoc. Biol. 2002. V. 6. P. 973-980.

93. Martin-Martin B, Nabokina SM, Blasi J, Lazo PA, Mollinedo F. Involvement of SNAP-23 and syntaxin 6 in human neutrophil exocytosis// Blood. 2000. V. 96. P. 2574-2583.

94. Martin-Martin B., Nabokina S.M., Lazo P. et al. Co-expression of several human syntaxin genes in neutrophils and differenting HL-60 cells: variant isoform anddetection of syntaxin 1// J Leukoc Biol. 1999. V. 65. P. 397-406.

95. Masaki R., Yamamoto JL. Akagawa K. Tashiro Y, Important roles orrBe C-lerminal portion of HPC-I syntaxm 1A in membrane anchoring and intracellular localization / J Biocliem. (Tokyo). 1998. V. 124. P 310-318.

96. Matveeva E., Whiteheart S.W. The effects of SNAP/SNARE complexes on the ATPase ofNSF 7/FEBS Lett. 1998. V.435. P. 211-214.

97. Melo J. The diversity of BCR-ABL fusion proteins and their relationship to leukemia phenotipe//Blood. 1996. V. 88. P. 2375-2384.

98. Misonou H., Ohara-Imaizumi M., Kumakura K. Regulation of the priming of exocytosis and the dissociation of SNAP-25 and VAMP-2 in adrenal chromaffin ce!ls//Neurosci. Lett. 1997. V. 232. P. 182-184.

99. Mollinedo F., Lazo P. A. Identification of two isoforms of the vesicle-membrane fusion protein SNAP-23 in human neutrophils and HL-60 cells// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V.231. P. 808-812.

100. Mollinedo F., Pulido R., Lacal P.M., Sanches-Madrid F. Mobilization of ge-latinase-rich granules as a regulatory mechanism of early functional responses in human neutrophils//Scand. J. Immunol. 1991. V. 34. P. 33-43.

101. Nabokina S., G. Egea, J. Blast, F. Mollinedo. Intracellular location of SNAP-25 in human neutrophils//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 239. P. 592-597.

102. Nabokina S. M., Lazo P.A., Mollinedo F. Homo sapiens mRNA for syntaxin 4 precursor// EMBL/GenBank /DDBJ databases. Accession AJ000541. 1997.

103. Nabokina S.M., Lazo P.A., Mollinedo F. Homo sapiens mRNA for syntaxin 3A, complete CDS. EMBL/GenBank/DDBJ databases. Accession AJ002076. 1997.

104. Nabokina S. M., Lazo P.A., Mollinedo F. Homo sapiens mRNA for syntaxin 3B, partial CDS. EMBL/GenBank/DDBJ databases. Accession AJ002077. 1997.

105. Nabokina S.M., Lazo P.A., Mollinedo F. Homo sapiens mRNA for syntaxin 6, complete CDS. EMBL/GenBank/DDBJ databases. Accession AJ002078. 1997.

106. Nabokina S.M., Lazo P.A., Mollinedo F. Homo sapiens mRNA for vesicle associated membrane protein 2 (VAMP-2). EMBL/GenBank/DDBJ databases. Accession AJ225044.1998.

107. Nagamatsu S., Sawa H., Nakamichi Y., Kondo Y., Matsushima S., Watanabe T. Non-functional role of syntaxin 2 in insulin exocytosis by pancreatic beta cells // Cell. Biochem. Funct. 1997. V. 15. P. 237-242.

108. Nemeth K., Furesz J., Adorjani E. et al. Azurophil granules are heterogeneous with respect to mobilization induced by different concentrations of FMLF// Haematologia. 2001. V. 31. P. 181-189.

109. Nichols B.J., Pelham H.R.B. SNAREs and membrane fusion in the golgi apparatus//Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1404. P. 9-31.

110. Oren A, Taylor JM. The subcellular localization of defensins andmyeloperoxidase in human neutrophils: immunocytochemical evidence for azurophil granule heterogeneity//J. Lab. Clin. Med. 1995. V. 125. P. 340-347.

111. Parlati F., Varlamov O., Paz K. et al. Distinct SNARE complexes mediating membrane fusion in Golgi transport based on combinatorial specificity// Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V. 99. P. 5424-5429.

112. Parmley RT. Heterogeneity of peroxidase positive granules in normal and pathologic human neutrophils// J Nihon Univ Sch Dent. 1997. V. 39. P. 61-66.

113. Paumet F, Rahimian V, Rothman JE. The specificity of SNARE-dependent fusion is encoded in the SNARE motif / Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V. 101. P. 3376-3380.

114. Poirier M.A„ Hao J.C„ Malkus P.N„ Chan C., Moore M.F., King D.S., Bennett M.K. Protease resistance of syntaxin. SNAP-2 5. VAMP complexes. Implications for assembly and structure// J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 11370-11377.

115. Poirier M.A., Xiao W„ Macosko J.C., Chan C., Shin Y.K., Bennett M.K. The synaptic SNARE complex is a parallel four-stranded helical bundle // Nat. Struct. Biol. 1998. V. 5. P. 765-769.

116. Pryor PR, Mullock BM, Bright NA, Lindsay MR, Gray SR, Richardson SC, Stewart A, James DE, Piper RC, Luzio JP. Combinatorial SNARE complexes with VAMP7 or VAMP8 define different late endocytic fusion events// EMBO Rep. 2004. V. 6. P. 590-5.

117. Quintanar J.L., Salinas E., Reig J.A. Immimohistocliemical demonstration of syntaxin and SNAP-25 in chromaffin cells of the frog adrenal gland // Gen. Comp. Endocrinol. 1998. V. 11 l.P. 119-122.

118. Ravichandran V., Chawla A., Roche P.A. Identification of a novel syntaxin-andsynaptobrevin/VAMP-binding protein, SNAP-23, expressed in non-neuronal tissues// Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 13300-13303.

119. Raynal P., Pollard H.B. Annexins: the problem of assessing the biological role for a gene family of multifunctional calcium- and phospholipid-binding proteins// Biochim. et Biophys. Acta. 1994. V. 1197. P. 63-93.

120. Rea S., Martin L.B., Mcintosh S., Macaulay S., Ramsdale T., Baldini G., James D.E. Syndet, an adipocyte target SNARE involved in the insulin-induced translocation ofGLUT4 to the cell surface// J. Biol. Chem. 1998. V. 273. ,P. 1878418792.

121. Rickman C., Davletov B. Mechanism of calcium-independent synaptotagmin binding to target SNAREs// J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 5501-5504.

122. Roos D, Van Bruggen R, Meischl C. Oxidative killing of microbes by neutrophils//Microbes Infect. 2003. V. 14. P. 1307-1315.

123. Rothman J.E. Mechanisms ofintracellular protein transport// Nature. 1994. V. 372. P. 55-63.

124. Rowe T., Dascher C., Bannykh S. Plutner H., Balch W.E. Role of vesicle associated syntaxm 5 in the assembly ofpre-Golgi intermediates // Science. 1998. V. 13. P. 405-14.

125. Saito N, Sato F, Asaka M, Takemori N, Kohgo Y. Morphological heterogeneity of myeloperoxidase-positive granules in normal circulating neutrophils: an ultrastructural study by cryosection// Histol Histopathol. 1998. V. 13. P. 405-14.

126. Samuelson J., Lindstrom P., Palmblad J. Stimulus-specific defect in oxidative metabolism of polymorphonuckear granulocytes in polycythemia vera// Eur. J. Haematol. 1988. V.41. P. 454-458.

127. Scott C.C. Furuya W., Trimble W.S., Grinsten S. Activation of store-operated calcium channels: assessment of the role of snare-mediated vesicular transport// J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 30534-3539.

128. Sengelov H., Kjeldsen L., Borregaard N. Control ofexocytosis in early neutrophil activation//J. Immunol. 1993. V.I 50. P. 1535-1543.

129. Sengelov H., Nielsen M.H., Borregaard N. Separation of human neutrophil plasma membrane from intracellular vesicles containing alkaline phosphatase and NADPH oxidase activity by free flow electrophoresis// J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 14912

130. Shiff G., Morel N. Association ofsyntaxin with SNAP-25 and VAMP (synap-tobrevin) during axonal transport // J. Neurosci. Res. 1997. V. 48. P. 313-323.

131. Shukla A, Berglund L, Nielsen LP, Nielsen S, Hoffmann HJ, Dahl R. Regulated exocytosis in immune function: are SNARE-proteins involved?// Respir Med. 2000. V. 94. P. 10-17.

132. Smith J. A. Neutrophils, host defense, and inflammation: a double edged sword// J. Leukocyte Biol. 1994. V. 56. V. 672-686.

133. Smolen JE, Hessler RJ, Nauseef WM, Goedken M, Joe Y. Identification and cloning of the SNARE proteins VAMP-2 and syntaxin-4 from HL-60 cells and human neutrophils// Inflammation. 2001. V. 4. P. 255-65.

134. Solner T.H. Regulted exocytosis and SNARE function// Mol. Membr. Biol. 2003. V. 20. P. 209-220.

135. Sollner T., Bennett M.K., Whiteheart S.W., Scheller R.H., Rothman J.E. A protein assembly-disassembly pathway in vitro that may correspond to sequential steps ofsynaptic vesicle docking, activation, and fusion// Cell. 1993. V. 75. P. 163172.

136. Sollner T., Whiteheart S.W., Brunner M., Erdjument-Bromage H., Geromanos B. S., Tempst P., Rothman J.E. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fasion// Nature. 1993. V. 362. P. 318-324.

137. Szue J.A., Jarvis S.E., Hibbert J.E. et al. Calcium-triggered membrane fusion proceeds independently of specific presynaptic proteins// J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 24251-24254.

138. Tamm. L.K., Crane J., Kiessling V. Membrane fusion: a structural perspective on the interplay of lipids and proteins// Curr. Opin. Struct. Boil. 2003. V. 13. P. 453466.

139. Teng F., Wang Y., Tang B. The syntaxins// Genome Biologi. 2001. V. 2. P. 30121-30127.

140. Trimble W.S. Analysis of the structure and expression of the VAMP family of synaptic vesicle proteins//Physiol. 1993. V. 87. P. 107.

141. Tsurumi H., Shimazaki M., Takanashi T. Flow cytometric determination of active oxigen produced by peripheral blood neutrophils in patients with hematological desorders// Int J. Hematol. 1994. V. 87. P. 464-470.

142. Vaissiere C, Le Cabec V, Maridonneau-Parini I. NADPH oxidase is functionally assembled in specific granules during activation of human neutrophils// J. Leukoc Biol. 1999. V. 65. P. 629-634.

143. Yan Q, Sun W, McNew JA, Vida TA, Bean AJ. Ca2+ and N-ethylmaleimide-sensitive factor differentially regulate disassembly of SNARE complexes on early endosomes// J Biol Chem. 2004. V. 279. P. 18270-18276.

144. Yang R, Stoick CL, Kinnamon JC. Synaptobrevin-2-like immunoreactivity is associated with vesicles at synapses in rat circumvallate taste buds// J. Comp. Neurol. 2004. V. 471. P. 59-71.

145. Ungar D., Hughson F.M. SNARE protein structure and function// Annu Rev. Cell Dev. Biol. 2003. V. 19. P. 493-517.

146. Xu X, Hakansson L. Degranulation of primary and secondary granules in adherent human neutrophils// Scand J Immunol. 2002. V. 55. P. 178-188.

147. Wheeler M.B., Sheu L. Ghai M., Bouqufflon A., Grondin G., Weller U., Beaudoin A., Bennett M.K., Trimble W.S., Gaisano H.Y. Characterization of

148. SNARE protein expression in p cell lines and pancreatic islets// Endocrinology. 1996. V. 137. P. 1340-1348.

149. Whiteheart S.W., Wilson D.W., Wiedmann M., Rothman J.E. Soluble N-ethyhnaleimide-sensitive fusion attachment proteins (SNAPs) bind to a multi-SNAP receptor complex in Golgi membranes// J. Biol. Chem. 1992. V. 276. P. 1223912243.

150. Whiteheart S.W., Griff I.C., Bnmner M., Clary D.O., Mayer T., Bulirow S.A„ Rothman J.E. SNAP family of NSF attachment proteins includes a brain-specific isoform//Nature. 1993. V. 362. P. 353-355.

151. Whiteheart S.W., Kubaiek E.W. SNAPs and NSF: general members of the fusion apparatus//Trends Cell Biol. 1995. V. 5. P. 64-68.

152. Wolach B., Gavrieli R., Manor Y., Lishner M. Lekocyte function in chronic myeloproliferative desorders// Blood cells? Molecules and deseases. 1998. V. 24. P. 544-551.

153. Word P., Uribe-Lune S., Connelly O. Lactoferrin and host dense// Bioche. Cell. Biol. 2002. V. 19. P. 29-35.

154. Zhang X., Kim-Miller M., Fukuda M. et al. Ca2+dependent synaptotagmin binding to SNAP-25 is essential for Ca2+-triggered exocytosis// Neuron. 2002. V. 34. P. 599-611.

155. Zhang X., Ren R. BCR-ABL efficiently induces a myeloproliferative disease and production of excess interleukin-3 and granulocyte colony-stimulating factor in mice: a novel model for chronic myelogenous leukemia// Blood. 1998. V. 92. P. 3829-3840.

156. Zhao C.M., Jacobsson G., Chen D., Hakanson R., Meister B. Exocytotic ; proteins in enterochromaffm-like (ECL) cells of the rat stomach// Cell. Tissue

157. Res. 1997. V.290. P. 539-551.