Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль модуляторов в креатинфосфат-креатинкиназной системе миокарда человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль модуляторов в креатинфосфат-креатинкиназной системе миокарда человека"

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ АКАДЕМИИ НАУК АРМЕНИИ

На правах рукописи

МЕЛИКСЕТЯН ГОАР ОГАНЕСОВНА

УДК 612.173.1.015.1:577.152.273|06:612.173.1.015.3=547.953 РОЛЬ МОДУЛЯТОРОВ В КРЕАТИНФОСФАТ-КРЕАТИНКИНАЗНОЙ СИСТЕМЕ МИОКАРДА ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1992

Работг выполнена в Институте молекулярной биологии АН РА в лаборатории молекулярной знзимологии Научные руководители: доктор химических наук

Г.А.Невинский

кандидат биологических наук З.О.Мкртчян

Научный консультант! профессор Ж.И.Акопян

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АН РА, профессор С.С.Оганесян

доктор биологических наук К.А.Маркосян

Ведущее учреждение-Ереванский Государственный медицинский институт

Защита диссертации состоится " ■/ " Риса с1 1992 г. ■ л и

в _ . часов на заседании сшциализированоого совета Д 005.15.01

при Инстмтуие биохимии АН РА (375044, Еревав-44, ул.П.Севака 5Л>.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии РА

Автореферат разослан -Л« лн^Ьуи^ 1992 г.

Ученый, секретаре специализированного совета,

профессор ^ ■ ^

¿ с с с и С- (.'Си

а.А.Оимонян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Креатинфосфат-креатинкиназная система играет важную роль в энергетическом метаболизме клетки, в обеспечении мышечного сокращения и сократительной функции миокарда. От нормального функционирования этой системы зависят многие жизненно важные функции организма. Я таасюезя» Некоторые ввды сердечной недостаточности, Так например, ишемия миокарда, сократительная функция миокарда связаны с изменением активности креатинкиназы (Толейкис А.И., и др., 1988).

Функциональная связь, наблюдаемая между энергодефицитным состоянием, шемическим повреждением сердца, структурно- функциональной целостностью мембран и активностью креатинкиназы, выдвигает на шрвый план вопросы, связанные с необходимостью исследования факторов, влияющих на каталитические свойства ММ изофермента креатинкиназы миокарда человека, который, в отличие от креатинкиназы скелетных мышц кролика и креатинкиназы митохондриальной, исследован недостаточно.

Фосфолипида биологических мембран являются не только их структурным каркасом, но также их метаболически активным компонентом, на основе которых образуется большой ряд липидных биорегуляторов. Однако до сих пор не исследовано влияние самих компонентов липидных мембран на активность щггоплазиатического ММ изофермента креатинкиназы, каталитическая активность которого может зависеть от многих факторрв. Такими факторами могут быть фосфолипиды, жирные кислоты, органические лиганда, комплексы металлов, факторы, возникающие в результате нарушения метаболизма при различных патологиях. Известно, например,что некоторое фосфолипвды и ненасыщенные жирные кислоты снижают сократительную функцию миокарда, (Булгаков В.Г., и др., 1987), что может быть следствием их влияния на активность цитоплззматического ММ изофермента креатинкиназы.

В последнее время большое вниманиэ уделяется синтезу новых комплексных соединений, содержащих различные металлы. Некоторые из них, например комплексы платины, обладающиз антиканцерогенным свойством, широко используются в химиотерапевтической практике, однако нет данных о биологической активности органических комплексов молибдена и вольфрама. Поскольку такие соединения имеют трехмерную структуру, то следовало ожидать их взаимодействия с ферментами. Кроме того, эти комплексы могут оказаться потенциальными

фармакологическим™, агентами. Благодаря многообразию пространственно-структурной организации, комплексы молибдена и вольфрама можно также использовать в целях моделирования взаимодействия компонентов липидных мембран с ферментами.

Цель работы - исследование влияния и характера взаимодействия фосфолипидов и жирных кислот на активность ММ креатинкиназы миокарда человека.

Моделирование взаимодействия компонетов липидных мембран с ферментам, используя органические комплексы молибдена и вольфрама.

Сравнительный анализ действия комплексных соединения и аффинного модификатора оаор на ММ креатинкиназы миокарда человека и скелетных мышц кролика.

Задачи исследования. I. Получение гомогенного препарата фермента из миокарда человека. Его физико-химическая и кинетическая характеристика.

2. Исследование влияния фосфолипидов и жирных кислот на каталитические свойства фермента и выяснение механизма их действия.

3. Исследование влияния комплексов молибдена и вольфрама на активность фермента и выяснение механизма их действия.

4. Синтез м-глицинового производного атр и исследование его действия на активность фермента из миокарда человека.

Ь. Синтез параодатокисленного абр <оаор> для идентификации я-ами-ногруппы остатка лизина в активном центре ММ креатинкиназы миокарда человека.

Научная новизна. Впервые показано регулирующее действие фос-фолипвдов на цитоплазм этический ММ изофер&.сшт креатинкиназы миокарда человека

Обнаружены сильные ингибиторы креатинкиназы ненукдеотидной природа, представляющие собой комплексы молибдена и вольфрама.

Показана возможность использования таких комплексов для зондирования специфических участков фермента, предназначенных, по-видимому, для взаимодействия с поверхностью мембран.

Выявлено ингибирование креатинкиназы без конкуренции ингибиторов и субстратов за фермент, указывающее на тс, что взаимодействие фосфолипидов, жирных кислот и комплексных соединении с ферментом происходит не по активному центру.

Синтезировано новое производное атр, содержащее комплекс молибдена смо (Б1у> эс14> которое приобрело свойства активатора.

л

Вблизи рибофуранозилсвязывающего участка ММ креатинкиназы миокарда человека идентифицирована ^-аминогруппа остатка лизина.

Креатинкиназа ММ миокарада человека более лабильный фермент по сравнению с аналогичным ферментом скелетных мышц кролика.

Креатинкиназа ММ миокарда человека состоит из двух субъединиц с функционально неэквивалентными нуклвотидсвязывгющими центра?ги.

Практическая ценность работы. Выявление регулирующей роли фа-сфолипвдов на активность одного из важнейших ферментов энергетического метаболизма кардиомиоцитов имеет особое значение, так как функциональная активность креатинкиназы миокарда человека может быть зависима от последствий, связанных с любыми нарушениями метаболизма фосфолипидов. Объективная оценка этих результатов будет способствовать решению ряда вопросов, связанных с профилактикой и прогнозированием сердечно-сосудистых заболеваний.

Комплексные соединения молибдена и вольфрама могут использоваться для моделирования взаимодействия ферментов со специфическими лигандами и зондирования поверхности ферментов. Биологическая активность этих комплексов,и особенно соединений типа и-глициново-го производного атр, может целенаправленно использоваться для регулирования активности креатинкиназы.

Апробация работы. Результаты работы доложены на п Республиканской конференции, посвященной проблемам физико-химиичиской биологии - Ереван, 1986; 19-оа Конференции ФЕБО - Италия, 1989; 11-ом Международном конгрессе кардиологов - Филиппины, 1990.

Работа апробирование на заседании Ученого совета Института молекулярной биологии АН РА от 7 октября 1992 года.

Публикации - г-.о теме диссертации опубликовано 8 работ.

Стр-лстура и соьем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, списка сокращения, введения, трех глав (обзор литературы, зксперикзнтальная часть, результаты и обсуждение), заключения, вы-зодоз, списка литературы. Изложена на 99 стр. машинописного текста содэретгг ■ 25 рис., 4 таблицы. Библиография включает 146 наименований.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Очистку ММ креатинкиназы из миокарда человека проводили по описанному методу, но с применением аффинной хроматографии на голубой сефарозе с иммобилизованным цибакроном. Очищенный препарат фермента имел удельную активность 468 Ед/мг. Гомогенность препара-

та проверялась методом ПААГ-электрофореза в натиэных и диссоциирующих условиях. Количество белка определяли иэтодом Лоури и спек-трофотокетриче ски.

Определение активности креатинкиназы в обратной реакции проводили колориметрическим методом Эннора и Розенберга. Реакционная смесь,объемом 0,15 мл, содержала 1,3 мМ hdp, 1,6 мМ креатинфосфат, 10 ни магниа-ацетат, 0,15 М трис-ацетатнш буфер рН 6,6, 0,2-1 мкг фермента. За единицу активности принимали количество мкмолоа крз-атина, образовавшегося за I мин.

Акт'лвнисть креатинкиназы в прямой реакции определяли потепци-ометричзским методом. Реакционная смесь, объемом 2 мл, содержала 20 мМ мп , 40 мУ креатин, 10 мМ магний-ацетат, I мМ дитиотрейтол, 0,1 мМ ЭДТл, 0,1 мМ натрий-ацетат, 2-3 мкг фермента. За единицу активности принимали количество мкэкв ** , выделенных за I кош.

Скк_:оз шрйодатокисланного лор проверили по методу (НэвиаспЗ Г.А., Газа; янц М.Г., Мкртчян З.С. ,1983). синтез n-глицинового производного проводили по методу, разработанному в МОХ СО РАН.

РЕЗУЛЬТАТЫ К ОССУйДЕНИЕ ;. ХАРАКТЕРИСТИКА ММ КРЕАТИНКИНАЗЫ МИОКАРДА ЧЕЛОВЕКА.

Методом аффинной хроматографии получен гомогенный препарат фермента с удельной активностью 468 £д/мг. По данным электрофорезе подученный препарат гомогенен в условиях сохранения нативной структуры. В диссоциирующих условиях б присутствии 0,1% sds, ферментному препарату соответствуют два близлежащих гожа <рис.1 а,б), что указывает на раздкчаз ь молекулярных массах фершнта, соответствуй ух r-„bJ-^iOCO. Серыэнт активен в широком диапазоне температур, но оптимальной является 37°С. Исследование рН-зависикости выявило широкий диапазон рН в обоих направлениях реакции. В пряной реакции - рН 8,0-9,5, с оптимальным значением рН 8,5-9,0. В обратной роаыди' - рН 5,0-8,0, с оптимальным значением 5,6-6,7.

Зависимость начальных скоростей креаташошазног реакции от концентрации креатина, атр, креатинфосфата подч!шяется гиперболическому закону Михазлиса-Мэятен, и по графику двойных обратных величин определены к™: для креатина - 16,6 мМ, atf - I мМ, креатинфосфата - 3,2 у.М. При исследовании зависимости начальных скоростей рзакпии от концентрации adp при рН 6,6 были подучены кривые с промежуточном плато (рис.2). Впорвые такие кривые были описаны для

б :

■ • ! 1 :

, 1 '

. . . . те

1 ! I

Ж

У

Рис1. Деяситограмма геля после электрофореза форконта в напевных (а)

и диссоциирующих (б) условиях, аллостерических ферментов, затем и для креатинкиназы го скелетных мыиц кролика и мктохондриальной креатинкиназы. Характер подобных кривых объясняется как результат существования взаимопревращающих-ся форм фермента, или особым характерам взаимодействия активных центров феркента, или присутствием двух форм фермента с разной четвертичной структурой (Курганов.Б.И.,1978). Мы предполагаем не то-

,-&ДР],мМ

Рис.2.Зависимость начальных скоростей реакции от концентрации аор при рН 6,8.

лько наличие различных кинетических форм фермента, связанных с динамическим процессом ассоциации-диссоциации, но и существование изначальной неэквивалентности нуклеотвдсвязывающих центров субъединиц. Подобное предположение основано на результатах, указывавших на функциональную неидентичность мим' субъединиц креатинкиназы из скелетных мышц кролика, которые отличались друг от друга по электрофоретической подвижности, по сродству к атр и арр, по оптимуму рН максимальной активности, которая для одной из субъединиц находилась в пределах рН 5,0- 5,8, а для другой - 7,6-8,2 (Невин-скш! Г.А. и др. ,1983).

Исходя из этого, зависимость активности ММ креатинкиназы миокарда человека от концентрации абр исследовали при рН 7,8 и 5,2. Как видно из рис'.З при обоих значениях рН зависимость начальных скоростей реакции от концентрации аор подчиняется гиперболическому закону. Величины Кт, вычисленные по графику двойных обратных вели-

Рис.З. Зависимость начальных скоростей реакции от концентрации

аир при различных рН. чин равны 0,4 мМ и 1,2 мМ, соответственно. Эти значения отличаются в три раза. Значения к™, вычисленные по графику двойных обратных величин на основании двух линейных участков при рН 6,6 оказались равны 10 мМ и 3,3 мМ и также отличались в три раза. Мы считаем,что такое совпадение не случайно и указывает на разное сродство нукле-отидсвязывающих центров ММ креатинкиназы миокарда человека. На это указывают и данные полученные ранее методом флуоресцентного титро-

вания, выявившие две величины к для аор, атр и их аминоалкилами-дов, которые отличались в 5-10 раз. Таким образом, на основании совокупности полученных данных можно предположить, что ММ креатин-кина миокарда человека также состоит из двух субъединиц с функционально неэквивалентными нуклеотидсвязывающими центрами.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ФОСФОЛИЩЦОВ И ЖИРНЫХ КИСЛОТ НА ММ КРЕАТИНКИКАЗУ МИОКАРДА ЧЕЛОВЕКА.

В результата исследования широкого спектра фосфолипвдов в плане их возможного действия на фермент, была выявлена группа активаторов и группа ингибиторов креатинкиназной реакции. Данные рисунка 4 свидетельствуют об активирующем действии фосфатидной кислоты, фосфатвдилсерина, кардиолилина и фосфатидилхолин(дипальмито-ла) на активность креатинкиназы ММ миокарда человека. Видно, что активность фермента в присутствии указанных фосфолипидов повышает-

липидов на креатинкияазу. ФК - 1-8 мМ, ФС - 0,6-60 мкМ,

КЛ - 1-е мМ, ФХДП - 9-900 mkfi. ся на 60 - 170% от исходной. Поскольку креатинкиназэ является диссоциирующей системой, то можно допустить, что фосфолипиды смещают динамическое равновесие дкмэр-мономэр в сторону образования более активных мономерных форм. Дяя подтверждения этого предположения

активирующее влияние фосфатидаой кислоты на ММ креатинкиназу изучали при различных концентрациях фермента. На рис.5 представлэн разностный график активирующего действия 3 мМ фосфатидной кислоты на активность фермента в зависимости от его концентрации, на кото-

100"

80

т

Й т к

Н И -я!

60

40

20 -

—I—

0,7 2,1 3,5 4,9

Рис.5. Активирующее действие 3 мМ ФК на активность креатинкиназы

в зависимости от ее концентрации, ром видао.что при малых концентрациях фермента, когда.вероятность смещения равновесия мм~—- мж в сторону мономеров достаточно велика, активирующее действие фосфатидной кислоты выражено намного сильнее. По всей вероятности, присутствие фосфолипидов ускоряет процесс образования кинетически более активных мономорных форм. Не исключено также существование аллостерического эффекта,так как,например, для мембрзносвязанных ферментов именно он является основой активирующего действия фосфолипидов. Полученные данные согласуются с многочисленными литературными данными об активирующем действии фосфолипидов на различные ферменты (цитохромоксидазу, родуктозу, глюкозо-6-фосфатазу, пируватоксидазу, протеинкиназу, АГОазу), однако механизм такого влияния еще мало изучен. Обобщая литературные данные можно отметить,что основными путями активирования ферментов являются влияние фосфолипидов на конформацию ферментов, характер

—I—

3,5

КК ,мкг/мл

укладки ферментов в мембране, создание гидрофобной среды. Ванным моментом в механизме активирующего действия является солюбилизиру-щий эффект, способствующий переходу фермента в растворимую форму и взаимодействию с субстратом. Активирующее влияние фосфолипидов осуществляется на уровне вторичной и третичной структуры отдельных субъединиц и на уровне четвертичной структуры всей молекулы фермента. Регулирующая роль фосфшипвдов проявляется также в их влиянии на переход ферментов из одной формы в другую (Грибанов Г.А.,

Механизм активирования ММ креатинкиназы миокарда человека фо-сфалипидами согласуется с вышеизложенными положениями и сводится к тому, что присутствие фосфолипидов создает условия, способствующие диссоциации фермента на каталитически более активные мономерные формы. Следующая груша фосфолипидов относится к ингибиторам креатинкиназы. На рис.6 представлены данные по ингибирующему действию фосфатидалхолина, лизофосфатэдилхолина и фосфатвдилинозиталэ на активность фермента, из которого следует, что достаточно малые концентрации этих фосфолипидов приводят к 80-100% ингибированию фермента. Для выяснения механизма тормозящего действия фосфолипидов

Р/с.8.Концентрационная зависимость ингибирующего действия фосфолипидов. ФХ - 0,7-20 мкм, ЛФХ - 8-200 MKM, ФИ - 20-100 мкМ. исследовали их влияние на начальные скорости реакции в зависимости от концентрации! субстратов. Результаты представлены в виде графиков двойных обратных величин. Как видно из рис.7 по отношению к креатинфосфату фосфатидилинозитол является ингибитором смешанного типа, а лизофосфатидилхолин - неконкурентного. Видимо оба указанных липида действуют на стадии превращения субстрата, не влияя на эффективность его связывания.

1991).

ФИ

...... -,-1/[к$],мГ1

0,2 0,4 0,6 0,8

,-т.:с.7. Зависимость начальных скоростей реакции от концентрации креатинфосфата в присутствии ФИ (20 мкМ) и ЛФХ (36 мкМ) в двойных обратных величинах.

Ингибирование ММ креатинкиназы фосфатвдилинозитолом и лизо-фосфатидилхолином по отношению к аор происходит по бесконкурентному типу (шс.8). Одновременное изменение чта* и кт указывает на то, что присоединение этих фосфолипидов происходит к фермеят-нук-леотщщому комплексу. Действительно, есть данные, указывающие на то '.о фосфолипида влияют на ^та* и ^ реакции. Некоторые фосфо-лигшды влияют не на образование е-ь комплекса, а на его диссоциацию (Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норке и патологии 1582).

Влияние фосфолипвдов на ферменты обусловлено не только их типом, но и их жирно-кислотным составом. Для митохондриальной АТФазы эффектор'1" является кардиоллгош, содержащий исключительно линоле-вую кислоту. Реактивирующее влияние лецитина на пируватоксидазу в основном определяется его жирно-кислотным составом и степень» их ненасыщенности. Но в случае протеинкиназы активирующее действие .шщлов те зависит от их жирно-кислотного состава.

^ири/сш спектр жирных кислот был апробирован нами для еу яснеть::- ¡»х рол.": в активирующем и ингибиру^щем действии фосфолипидов на кроативюшазу миокарда человека. С;:вди них эффективными оказалась липодзвая и г-линоленовая кислоты. Как видно из рис.9 ингиби-р иание фермента этим соединениями достигает 70-90%.

1/[ш] мм

Рис.8. Зависимость начальных скоростей реакции от концентрации АДР в присутствии ФИ 20 мкМ и Л5Х 36 мкМ.

Рис.9. Концентрационная зависимость ингкЗирующего действия жирных кислот на активность фермента. I - линолевая, 2 - с-лно-леновая.

Зависимость начальных скоростей реакции от концентрации аор в присутствии линолевой кислоты указывает на бесконкурентный характер ингибирования, а по отношению к креатинфосфату эта кислота является ингибитором неконкурентного типа. Поскольку кинетические параметры взаимодействия субстратов реакции с фосфолипидами и жирными кислотами совпадают, то можно предположить, что ингибирующее действие фосфолипидов может осуществляться входящими в их состав ненасыщенными жирными кислотами. Таким образом, полученные экспериментальные данные указывают на возможность ингибирования ММ кре-атанкиназы миокарда человека фосфолилвдаки и ненасыщенными жирными кислотами, что согласуется с литературными данными относительно влияния некоторых фосфолипидов и ненасыщенных жирных кислот на сократительную функцию миокарда, и токсическом эффекте лизосоедине-ний, угнетающих, в частности, активность ряда дыхательных ферментов (Грибанов Г.А., 1991) и, которые накапливаются при ишемии мио-

карда (ДиалиашвиЛ1 И.В., и созвт.,1992).

Выявление активирующего действия фосфагидноз кислоты, фосфа-тидилсерина, кардиолипина, фосфатидилхолин(дипальмитола) и ингиби-рующего действия фосфатидилхолина, лизофосфатвдилхолина, фосфати-дилинозитола указывают на то, что эти фосфолшиды проявляют регулирующее действие на активность ММ креатинкияазы миокарда человека, причем взаимодействие из с ферментом происходит не по активному центру фермента.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КРЕАТИНКИНАЗЫ ММ МИОКАРДА ЧЕЛОВЕКА С ОРГАНИЧЕСКИМИ КОМПЛЕКСАМИ МОЛИБДЕНА И ВОЛЬФРАМА.

В последнее десятилетие большое внимание уделяется синтезу новых комплексов металлов, с различными органическими и неорганическими лигандами, которые могут использоваться, как используются хорошо известные комплексы платины, обладающие антиканцерогенным действием, в химяотерапевтичесноа практике. Кроме того, такие комплексы могут использоваться для моделирования взаимодействия специфических лигандов с ферментами. В отличие от органических соединений плоского строения, такие комплексы, благодаря большому координационному числу металлов, имеют трехмерную структуру, содержат атомы различных элементов и аминокислот, которые потенциально способны взаимодействовать с аминокислотными остатками белков. Наличие большого числа различных групп, расположенных в пространстве на различном расстоянии друг от друга, увеличивает вероятность соответствия геометрических параметров, необходимых для контакта специфического лиганда с ферментом. При достижении подобного соответствия можно ожидать инпСируюцэго или активирующего действия комплексных соединения на активность ферментов. Надо полагать, что во взаимодействие с соединениями, не являющимися субстратами фермента или их аналога®!, активный центр не вовлекается и такое взаимодействие осуществляется участками фермента, удаленны»«! от активного центра по пэдустврическому механизму. Для проверки высказанных выше прэдподотаниг нага были выбраны органические когшлексные соедгаения молибдлна и вольфрама, о биологической активности которых до последнего времени никаких данных нет. Структурные формулы этих комплексов представлены на рис.10. Среди апробированных 18 соединений были выявлены 14,проявившие определенную эффективность.

/\ R /

Mo

/

л

z——г

/

ROO

V

\

S-s

Br I \/ \ Br

Mo-Mo

lAI Br

s-s

v

I <R = CH2NH3C1 )

EMo (Gly) ЗС1 - (I), К Clio С1 1 - (II), (Et N) CMoS 3 - (III),

2 4 4 '428 424

К CMoCl 3 - (IV). (Et N) EMo S Br ] -<V>, (Et N) EMd S Br 1 - (VI)

3 tí 42248 4 2 3 7 tí

(NH ) EMo S a - (VII). (NH ) CMa S 1 - (VIII).

42 212 42 313

(Et n) CrtaS J - (IX), (NH ) tW S (NH ) ] - (X),

42 P 4 2 3 1 d 3 3

(Et N) CW S Br Д - (XI), (Et N) И S Br ] - (XII),

4 2 3 7 <S 4 2 2 Л Я

(Et N) CW S (SCN) 3 - (XIII), (NH ) CWS 3 - (XIV).

45Э4 í» 424

Экспериментальные данные показали, что в присутствии комплексов (i) и (id активность креатанкиназы как в прямой, так и в обратной реакциях повышалась. Комплекс <п> активировал фермент на 20-30%, а комплекс <i> - на 80-100%, причем в очень малых концентрациях (70 мкМ). На рис.II показана концентрационная зависимость активирующего действия комплекса молибдена и>. Известно, что кре-

200 i

150 "

я

ы

S

а

я

щ

/

/

20

—Г"

40

—i—

60

60

[(Di t

.c'J

¡- Концентрационная зависимость активирующего действия комп-

лекса г,ад^;йдана

ат'икинзза диссоциирующая ферментная система и, что ягсс-цаация КМ-доюра приводит к увеличена удельной активности в 20-30 раз. Исходя из !гого ::с-ош предлог ть, что активирующий эффект является следствием дгсеоцчации ликера,стимулируемой соединениями типа

©

<г) и <и) на каталитически более активные мономеры. В отличие от вышераосмотренных, в,се остальные комплексы оказались ингибиторами фермента, подавляющими ферментативную активность на 10-100%. Концентрационная зависимость ингийирующего действия сильных ингибиторов представлена на рис.12. Важно отметить очень высокое сродство комплексов молибдена и вольфрама к ферменту, которое на 1-3 порядка выие сродства субстратов, что свидетельствует об их выраженной биологической активности. Для выяснения механизма ингийируюшрго действия исследовали влияние комплексных соединений на начальные скорости реакции в зависимости от концентрации субстратов. Полученные данные просуммирозаны в таблице I.

Таблица 1.1ипы и константы ингибирования креатинкиназы комплексами молибдена и вольфрама.

Комплексы Тип ингибирования по отношению к Тип ингибирования по отношению к

АОР К V мкМ креатинфосфату к МКУ

неконкурентный 32 неконкурентный 27

(VI) неконкурентный 520 неконкурентный 26

(VII ) бесконкурентный 0,6 неконкурентный 2,2

(VIII) неконкурентный 67 бе сконкурентный 45

(IX) .бесконкурентный 150 смешанный 90

<Х> неконкурентный 10 смешанный 1.4

(XI) бесконкурентный 42

(XII) бесконкурентный 1530 смешанный 430

Следует отметить, что подобный хара:ггер ингибирования .по от-ношонко к субстратам проявили также лизофосфатидилхолин, фосфати-дил^оаитол и линолавая кислота. Обобщая полученные данные можно сделать вывод, что, как ни один из комплексов, так и ни один из указанных кошонентов мембран не конкурируют с субстратами за активный грнтр фэрканта. Сходство характера взаимодействий комплексов молибдена и вольфрама и кошонентов липидных мембран с краа-тинкиназой указывает на возможность зондирования с помощью этих соединений участков фершнта, предназначенных по-видимому, для взаимодействия с поверхностью мембран.

Поскольку комплекс (I) обладает высоким сродством к ферменту и взаимодействие его с ферментом приводаг к 100% активации, то интересно было проверить, как будут сочетаться свойства субстрата и

ЮС-к

<о I

й

л н

о о а я

В1 Ей И

03

§

§

о о

150

250

350 4 50 550 Рис.12. [Комплексы} миМ

Концентрационная зависимость ингибирущаго действия комплексов Ыо и ^ на активность КК. I - (У11),(Ш1); 4 - (Л); 7 - (Ж1);

2 - СУ); 5 - (IX); 8 - (X).

3 - (XI); 6 - (XIII);

свойства активатора. С этой цэлыо было синтезировано N-глициновое производное атр путем образования фрсфамидной связи между у-фосфатом атр и комплексам сма2 <(31у) ^ к;^ . Исследование его влияния на фермент показало, что это производное атр теряет субстратные свойства, вероятно в результате увеличения размера молекулы и недоступности ее к активному цвнтру, и приобретает свойства активатора. Этот факт также свидетельствует в пользу расположения точек контакта активаторов с креатинкиназоя вне активного цзнтра фермента.

Поскольку наш показано,что комплексы молибдена и вольфрама обладают высокой биологической активностью и могут служить потенциальными фармакологическими агентами, то важно было проверить их действие и на креатинкиназу из скелетных мышц кролика. Результаты сравнительных иссдздовакиг показали, что ММ креаткнккназа миокарда человека более чувствитвлеьна к действию комшаксных соединений типа <1>-<х1У>, чем аналогичный фермент из скелетных ныяц кролика,

Й

о о

м S

BJ

ь

м «

ю

S

ь

«

ь

о о

100

80

60

40

20

10

—г-

15

-!—

2D

t ,шш.

Рис.13.Кинетика инактивации фермента oadp к за:цитз субстратами. I - oadp, 0,12мм/ 2 - атр, 12мМ/ 3 - креатин, 16кМ/ 4 - adp, 9мМ/ 5 - adp + креатин.

так как на него ингибирующее действие оказали лишь два наиболее сильных ингибитора (VIп> и <х>. Характер ингибирования указывает на то, что и в этом случае взаимодействие происходит не по активному центру. Различие, выявленное при изучении действия комплексов на активность двух ферментов, выдвинуло задачу- проверить действие модификатора креаткнкиназы из скелетных мышц кролика горйодатокис-ленного аор (оаор) на ММ креатинкинззу миокарда человека. Кинетика инактивации и защита различными субстрата?га (рис.13), а также конкурентный характер ингибирования аналогом по отношению к мдАОР укззывают на аффинный характер модификации и на наличие ^-амино-группы .остатка лизина вблизи рпбофуранозилсвязывающего участка активного центра фермента, как и у фермента из скелетных мышц кролика.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, выделенный нами из миокарда человека гомогенный препарат креаткнкиназы, представляет собой цигошгазматический ММ изофермент, состоящий из двух субъединкц с молекулярными массами 39000 - 41000. Оптимальными условия?™ для проявления максимальной активности является температура 37°С и рН 6,6. Константы Миха-злиса для субстратов прямой и обратной реакций равны: для креатина - 16,6 мМ, для атр - I мМ, для креатшфосфата - 3,2 мМ. Зависимость начальных скоростей от концентрации аор при рН 6,6 не подчиняется гиперболическому закону и полученные значения кт, вычисленные по линейным участкам до и после промежуточного плато, отличаются в три раза. Такое же отличие в значениях кт для аор отмечается и при рН 7,6 и 5,2. На основании совокупности полученных данных сделано предположение о функциональной неэквивалентности нуклео-тидсвязывающих центров фермента. Исследование влияния фосфолипидов и жирных кислот на активность фермента показало, что фосфатидная кислота, фосфатидилсерин, кардиолишн и фосфатидалхолин (дипальми-тол) ЯВ.Ш0ТСЯ активаторами креатинкиназы миокарда человека. Механизм активирующего действия фосфолипидов сводаггся к диссоциации димэра ММ фермента на более активные монетерные фор™. Другая группа фосфолипидов - фосфатидалхолин, лизофосфатидилхолин и фос-фатщцшшозитол являются сильными ингибиторами фермента. Из ряда исследованных жирных кислот эффективными оказались линолевая и г--липоленовая кислоты. Ингибированнэ фосфолипадами и жирными

кислотами проявляет бесконкурентный и неконкурентный характеры, что свидетельствует об их взаимодействии с формантом не по активному центру. На основании совокупности паяучскшх данных сделано заключение о регулирующем действии фосфолигп-цов на активность ММ креатинкиназы миокарда человека.

Исследование влияния комплексных соединений молибдена и вольфрама на активность креатинкиназы показало, что активирующее и ин-гибирующее действие комплексов достигает 90-1ОСЯ. Такие сильные эффекторы креатинкиназы ненуклеотидной природа, обладающие высоким сродством к ферменту, обнаружены впервые. Исследование характера ингибирования фермента сильными ингибиторами выявило бесконкурентный и неконкурентный типы ингибирования, что указывает на их взаимодействие с ферментом не по активному центру. На взаимодействие активатора фермента не по активному центру свидетельствуют данные по активирующему действию м-глицинового производного атр. Сходство в характерах взаимодействия комплексных соединений и компонентов лигшдных мембран указывет на возможность зондирования с помощью комплексов молибдена и вольфрама участков фермента, ответственных за взаимодействие с поверхностью фосфолипидных мембран. Поскольку комплексные соединения молибдена и вольфрама обладают биологической активностью, то эти соединения, особенно соединение типа м-глицинового производного йтр, могут служить потенциальными фармакологическими агентами.

Сравнительное исследование влияния комплексов молибдена и вольфрама на активность ММ креатинкиазы миокарда человека и скелетных мышц кролика показало, что миокардиальный фермент более лабилен. На это же указывают данные по модификации миокардиального фермента перйодатокисленным аналогом аор, так как полная инактивация достигается при меньших концентрациях аналога и требует меньше времени. Результаты аффиной модификации указывают на локализацию «■-аминогруппы остатка лизина вблизи рибофуранозилсвязывающего участка активного центра ММ креатинкиназы миокарда человека, как и в случае фермента из скелетных мышц кролика.

вывода

1.Креатинкиназа ММ миокарда человека состоит из субъединиц с функционально неэквивалентными нуклеотдсвязывающими центрами.

2.Впервые исследовано влияние фосфолипидов и жирных кислот на ММ

яреатинкиназу миокарда человека. Выявлено их активирующее и ие-гибирующее действие. Результаты кинетических исследований указывают на то, что взаимодействие га с ферментом происходит не по активному центру. На основании совокупности полученных данных сделано заключение о регулирующем действии компонентов липидных ме»йбран на активность фермента.

3.Впервые исследовано влияние органических комплексов молибдена и вольфрама на ММ креатинкиназу миокарда человека. Показано, что эти соединения оказывают активирующее и ингибирувщее действие на ■фермент. На основании сходства взаимодействий комплексных соединен;® и компонентов липидшх мембран с ферментом сделано заключение о возможности зондирования с-их помощью участков фермента, предназначенных для взаимодействия с поверхностью мембран.

4.Показано, что горйодатокисленный adp является аффинным реагентом Ш креатинкиназы миокарда человека. Полученные данные свидетельствуют о локализации е-амивогрупш остатка лизина вблизи рибофу-ранозилсвязывающего участка зкт:гокого центра фермента.

5.Введение по ^-фосфату атр комплекса молибдена смо<Giy> ]ci приводит к потере сродства аналога атр к ферменту и приобретению нового свойства - свойства активатора фермента.

3.Органические комплексы, молибдена и вольфрама, особенно соединение тигэ n-глицинового производного атр, могут служить потенциальными фармаколопстостс"."'. агентами.

C~yir,:i "¿cr, опубликованных по теме диссертации.

Г.;'сс:о.т-., "з :"f ;.лфзр!евта креатинкиназы из сердечной мышцы че-лс-о:г.-!. -?кси -складов и Республиканской конференции, посвяще-ннсл :тг-с."п'1. V лг.'ихо-хкнхческой биологии. Ереван, 1986, стр.65. <С--г.!ЭТ. МкрТЧЯН З.С., АКОПЯН Ж.И. >.

".о-'.'хткз и нехсторао свойства изофермента ММ креатинкиназы из се-;>дзчнся кыгци человека. Вопр.мед. химии, 1387, N2, стр.112-116. ""oa.-iT. Мкртчян З.С., Акопян Ж.И.).

3.^часпге фосфолипидов в регуляции креатинкиназы сердечной мышцы человека. ДАН Арм.ССР, 1933, lxxxvii, n2, стр.90-92. (Соавт. Ка-рагезян К.Г., Мкртчян З.С. и др.).

4.The '^qulatory ef-fect of acidic and neutral phospholipids on the nativity of эсэтэ епгуте systems. 19 Conference FEES, Italy, 1989, Ti l:;. (Boyadjyan .A. S. , Kkrtchyan Z.S., et al.J.

5.Role DP individual phospholipids on the functional activity of human heart muscle creatine kinase- 11 International congress a-f cardiologist. Philippines, 1990.(Mkrtchyan Z.S., Akopyan Zh.I., Karageuzyan K.S.).

6.Роль индивидуальных фосфолишдов в функциональной активности креатинкиназы сердечной мышцу человека. Вопр. мед. химии, 1991, N5, стр. 68-70. (Соавт. Мкртчян З.С., Зарафян VIM., и др.).

7.Взаимодействие креатинкиназы из миокарда человека с гомометалли-чвскими комплексами молибдена. Биол.ж.Армении, 1992, т.45, N3-4, стр.260. (Соавт. Мкртчян З.С., Невинский Г.А., и др.).

8.Влияние гомометаллических комплексов вольфрама на креатинкиназу ММ. Биол.ж.Армении, 1992, т.45, N3-4, стр.269. (Соавт. Мкртчян З.С., Невинский Г.А,, и др.).