Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы прооксидантно-индуцированного повреждения миокарда на ранней стадии острой ишемии, осложненной нарушениями ритма сердечной деятельности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизмы прооксидантно-индуцированного повреждения миокарда на ранней стадии острой ишемии, осложненной нарушениями ритма сердечной деятельности"

Т г

РГ6 од

ВОЕННО-МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

2 5 АПР «о*.

На правах рукописи

КОНДРАТЬЕВ Александр Юрьевич

МЕХАНИЗМЫ ПРООКСИДАНТНО-ИНДУЦИРОВАННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ МИОКАРДА НА РАННЕЙ СТАДИИ ОСТРОЙ ИШЕМИИ, ОСЛОЖНЕННОЙ НАРУШЕНИЯМИ РИТМА СЕРДЕЧНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ

03.00.04 — БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

т

Работа выполнена в Военно-медицинской академии.

Научный руководитель — доктор медицинских наук, профессор Л. А. КОЖЕМЯКИН

Официальные оппопенты: доктор биологических наук, профессор С. Н. ЛЫЗЛОВА доктор медицинских наук, профессор А. В. СМИРНОВ

Ведущее учреждение — Научно-исследовательский институт кардиологии Минздравмедпрома РФ (г. С.-Петербург).

Защита состоится « ^^ » 1994 г. в ^^ часов на

заседании специализированного совета Д 106.03.06 при Военно-медицинской академии (194175, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан « /<5~ » г

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук В. Н. АЛЕКСАНДРОВ

I I

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Профилактика и лечение аритмических осложнений ишемической болезни сердца и, в особенности, острого инфаркта миокарда в настоящее время остается одной из актуальных проблем практической и экспериментальной кардиологии.

Важность проблемы объясняется значительным процентом смертности больных, у которых течение инфаркта миокарда осложняется нарушениями ритма сердца. По данным М.Я. Руда и А.П. Зыско (1977) предсердная экстрасистолия наблюдается у 20- 25%, а желудочковая экстрасистолия у 70- 90 % больных острым инфарктом миокарда. Среди пациентов, выживших после перенесения фибрилляций в условиях клиники, в течении года от 30% др 40% повторно доставляются в стационар (Surawicz В., 1989).

Другой аспект проблемы связан с тем, что,несмотря на обилие фармакологических средств, клиника по-прежнему нуждается в новых более сильных и универсальных препаратах. В этом плане изучение принципиальных патобиохимических закономерностей развития ишеми-ческого процесса является фундаментальной базой для развития теоретической кардиологии и экспериментальной фармакологии. На сегодня внимание исследователей привлечено к процессам перекисного окисления липидов и их роли в патогенезе ишемического повреждения миокарда (Биленко М.В.., 1989; Меерсон Ф.З., 1984).

Дискутируется участие прооксидантной системы ксантиноксидазы в инициации процессов образования свободных радикалов кислорода (Биленко М.В.., 1989; Parcks D.A., Granger P.N., 1984). Исследуется роль ионов Са2+ в ишемическом повреждении миокарда и аритмических осложнениях (Антипенко А.Е., Калинский М.И., Лызлова

- г -

С.Н., 1992; Сауля А.И., Меерсон Ф. .5., 1990) В связи с этим активно изучаются механизмы и источники поступления ионов Са2+ в ишемизированные клетки, среди которых значительное число работ посвящено структурам сарколеммы и саркоплазматического ретикулу-ма . Соответственно изучению процессов переписного окисления большой интерес представляют изменения антиоксидантных систем миокарда и, в особенности, глутатион-зависимого пула, как наиболее мобильного и подверженного изменениям при ишемическом процессе (Chambers D.E. et al., 1985; Кулинский В.И., Колесниченко Л.С.,1990).

Однако в литературе представленны немногочисленные исследования, где изучались механизмы прооксидантно-обусловленного повреждения транспорта Са2+ (Архипенко Ю.В. и соавт.,1983; Каган В.Е. и соавт., 1983) саркоплазматическим ретикулумом, в особенности, с участием системы ксантиноксидазы (Suzuki Y.J., Ford Q.P., 1991) Фактически не освещены вопросы о связи метаболизма глутатионов с динамикой внутриклеточного пула Са2+, в том числе, в условиях генерации свободных радикалов кислорода. В то же время динамика активности ксантиноксидазы, содержания глутатионов и активности систем транспорта Са2+ при ишемическом процессе ( Hearse D.J. et al., 1986; Ferrary R., Ceconi C., Curello S. et al., 1991; Фролькис P.А. и соавт., 1986). позволяет предполагать, что изменения в этих метаболических системал могут определять тяжесть течения ишемического процесса и характер нарушений ритма сердечной деятельности. Изучение этих закономерностей позволило бы приблизиться к пониманию генеза ишемического повреждения и расширить поиск средств, направленных на предупреждение развития и коррекцию патобиохимических нарушений.

С учетом сказанного, целью настоящей работы явилось изучение молекулярных механизмов прооксидантно- индуцированных изменений метаболизма глутатиона и функциональных характеристик сердечного ретикулума как биохимических детерминант тяжести поражения миокарда при ишемическом повреждении в связи с динамикой и выраженностью нарушений ритма сердечной деятельности.

Для достижения поставленной цели были сформулированы и решались следующие задачи :

1. Исследовать вызванные ишемией миокарда изменения в системах эндогенных тиолов, прооксидантноактивной формы ксантинокси-дазы и транспорте кальция саркоплазматическим ретикулумом в их взаимосвязи с возникновением и динамикой аритмогенного периода острой ишемии.

2. Экспериментально обосновать молекулярные механизмы, обусловливающие кооперативный характер изменений между исследуемой системой глутатиона, активностью прооксидантной формы ксантинок-сид азы и показателями функциональной активности Са2+-зависимой АТФазы миокардиального ретикулума.

3. При выявлении факта участия исследуемых систем в формировании метаболической основы аритмогенных свойств сердечной мышцы изучить возможности метаболической коррекции нарушений ритма сердца ишемического генеза.

Научная новизна. В настоящем исследовании впервые получены данные о взаимосвязи кооперативных изменений прооксидантной системы КСО, системы эндогенных тиолов, функциональной активности Са2+-АТФазы сердечного ретикулума с тяжестью нарушения ритма сердечной деятельности при острой ишемии миокарда.'

Показана возможность ингибировачия АТФ-гидролизующей активности ретикулума прооксидантноактивной системой КСО/ксантин. Ус-

. - 4 -

тановлены протекторные эффекты окисленного глутатиона на активность Саг+-АТФазы в условиях инактивации фермента системами генерации свободных радикалов.

Из цитозоля сердца крысы выделена цитоплазматическая фракция, оказывающая ингибирующий эффект на активность Са2+-АТФазы, который устраняется введением окисленного и восстановленного глутатионов.

Впервые описаны кардиотропный и антиаритмические эффекты окисленного глутатиона и установлена возможность предотвращения аритмических осложнений при острой ишемии миокарда профилактическим введением ингибитора КСО фолиевой кислоты и окисленного глутатиона.

Положения, выносимые на защиту

1. Формирование аритмогенных свойств миокарда при ишемичес-ком повреждении обусловливающих появление патологической аритмической активности происходит с участием образования прооксидант-ноактивной ксантиноксидазной формы КСО, значительным снижением восстановительного потенциала клетки бБН/ОЗБб и потерей функциональной активности Са2+-зависимой АТФазы сердечного ретикулума, что позволяет рассматривать установленные изменения как метаболические факторы аритмогенеза.

2. В основе нарушений активности Са2+-АТФазы ретикулума кооперативно связанных с изменением уровня эндогенных тиолов и активизацией прооксидантной формы КСО лежат молекулярные механизмы, включающие прооксидантнообусловленное ингибирование АТФазной активности в результате инактивации функциональных тиоловых групп фермента в.условиях снижения восстановительного потенциала (БН/гаЗВ.

3. Окисленный глутатион и фолиевая кислота обладают возмож-

ностыо метаболической коррекции нарушений ритма сердца при ише-мическом повреждении.

Апробация и реализация работы. Апробация работы состоялась на научных заседаниях кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ВМедА им. С.М. Кирова (1991- 1993 г.г.) и межкафедральном совещании ВМедА им. С.М. Кирова (1993 г.) Результаты исследования доложены на Всесоюзной научной конференции "Биохимия- медицине" (Ленинград, 1988), на XI научной конференции молодых ученых академии (Ленинград, 1990), на научной конференции "Актуальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний" (С.- Петербург, 1993).

Результаты работы внедрены и используются в практике учебного процесса и научно- исследовательской работы кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ВМедА им. С.М.Кирова и сердечно- сосудистой хирургии ВМедА им. С.М.Кирова.

Научно- практическая значимость работы.

Результаты исследования позволяют рассматривать степень активности 02-зависимой формы КСО, уровень восстановительного потенциала ткани бЕН/ОЗБб и функциональную активность сердечного ретикулума как метаболические факторы, участвующие в формировании аритмогенных свойств миокарда. Полученные данные подтверждают значение саркоплазматического ретикулума миокарда как источника повышения цитозольного пула свободного кальция и частично раскрывают молекулярные механизмы, ведущие к изменению функциональной активности внутриклеточного депо кальция.

Выявленные механизмы могут явиться теоретической основой для разработки фармакологических методов коррекции стационарного уровня внутриклеточного кальция во время ишемического повреждения, направленных на регуляцию и защиту функциональных характе-

- е -

ристик ретикулума. Примером таких влияний явился профилактический антиаритмический эффект фолиевой кислоты и окисленного глу-татиона.

Установление кардиотропных эффектов глутатиона и возможность тиолизации Са2+-зависимой АТФазы раскрывает пути для поиска средств регуляции функционального состояния тиол-зависимых ферментов в период развития патологического процесса. В совокупности полученные данные обосновывают новые возможности метаболической защиты миокарда.

Установление фактов ранней экскреции окисленного и восстановленного глутатиона из ишемизированной ткани позволяют рассматривать их как основу для отработки нового информативного диагностического критерия окислительного повреждения миокарда.

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 4 научных работы.

Структура и обьем работы. Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста, который содержит 25 рисунков, 16 таблиц. Работа состоит из введения и трех глав, включающих обзор литературы, описания методик исследования, результаты собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы содержит 46 отечественных и 148 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В работе использовали белых беспородных крыс-самцов массой 150-180 г, на которых отрабатывали различные модели ишемического повреждения миокарда. В ходе эксперимента сердца животных замораживали и хранили в жидком азоте не более 48 часов до начала

- 7 -

проведения биохимических исследований.

Моделирование субтотальной ишемии на изолированном перфузи-руемом сердце крысы с последующей реперфузией проводили по методу 1.1?.Кее1у е1 а1.(1967). Перфузионный аппарат представлял модификацию конструкции, предложенной Г. Морганом (Н.Е.Мог^ап еЬ а1., 1961). Использовали бикарбонатный буфер Kгebs-Henseleit, рН=7.4. оксигенированный смесью Ог:СОг в соотношении 95:5, Т=37°С. Ишемию создавали снижением скорости перфузии до 1 мл/мин, реперфузию- восстановлением скорости подачи перфузата до 15 мл/мин.

Острую ишемию миокарда у крыс вызывали высокой перевязкой левой нисходящей артерии сердца (ЛНАС) по методу Г. Селье ( Бе-1уе Н. е1 а1., 1960). Ишемию миокарда у крыс.подтверждали наличием характерных изменений на электрокардиограмме Нарушения ритма регистрировали в течение 15 минут ишемического периода, после чего животных забивали.

Лигацию левой нисходящей коронарной артерии (ЛНАС) на изолированном перфузируемом сердце крысы проводили комбинируя вышеописанные методы (Кее1у 1.1?. et а1., 1967; Зе1уе Н. е1 а1.1960).

Для проведения биохимических исследований сердца гомогенизировали в гомогенизаторе системы "РоШгоп" со скоростью вращения плавающих ножей до 15000 об/мин три раза по 15 с. В зависимости цели исследования проводилось фракционирование ткани.

Микросомальную фракцию, обогащенную саркоплазматическим ре-тикулумом (СР) выделяли поэтапным ультрацентрифугированием при 40000 к с промежуточной экстракцией актомиозина (ПЬаПа N.5. е1 а1.,1985). Удельную активность Са2+-АТФазы (скорость гидролиза АТФ), величину Са2+/АТФ и скорость транспорта Са2+ определяли по методу А.А.Болдырева с соавт. (1976), основанному на непрерывном

• - 8 -

мониторинге рН, изменяющегося при гидролизе АТФ в процессе транспорта Са2+.

Цитоплазматическую фракцию, представляющую супернатант после первого центрифугирования (40000 g) использовали для определения активности ксантиноксидазы (КСО), глутатионредуктазы (ГР), глу-татионпероксидазы (ГП) и глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы (Гл-6-ФДГ).

Для выделения ферментов КСО из ткани миокарда цитозольную фракцию пропускали через колонку "Sephadex G-25" и концентрировали (NH4)2S04, растворенным до 75-ти процентного насыщения. Активность КСО определяли спектрофотометрически по накоплению мочевой кислоты в среде инкубации при А=292 нм (Kamlnsky Z.W., Ie-zewska М.М., 1979). При исследовании Ог- зависимой формы КСО инкубационная среда не содержала НАД+.

Активность ГР оценивали спектрофотометрически по убыли NADPH при восстановлении окисленного глутатиона. При Х=340 нм фиксировалась активность фермента (Прохорова М.И., 1982). Активность Гл-6-ФДГ регистрировали по приросту зкстинции при Х=340 нм в результате восстановления НАД+ (Komberg 6. et al., 1955). Активность ГП определялась по убыли вносимого восстановленного глутатиона (6SH), идущего на восстановление гидроперекиси третбутила (ГПТБ) ферментом, содержащимся в исследуемой пробе (Гаврилова А.Н., Хмара Н.Ф., 1986).

При определении GSH использовался метод, в основу которого положена специфическая реакция DTNB (реактив Эльмана) с SH-rpyn-пами водорастворимых тиолов, дающая окрашенный комплекс желтого цвета, фотометрируемый при А=412 нм (Гаврилова А.Н., Хмара Н.Ф., 1986). Окисленный глутатион (GSSG) определяли, используя ферментативное включение вносимого в опытной пробе GSSG в циклическую

реакцию с НАДРН и DTNB, катализируемую коммерческим препаратом ГР (Sigma, USA), в результате которой образовывался GSH, определяемый по цветной реакции с DTNB (Eger Р., Podhradsky D., 1986).

Уровень ПОЛ оценивался по накоплению малонового диальдегида (ЩА), определяемому в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Uchigama M., Michera M.,1978).

При разделении цитоплазматических фракций из сердца крысы для выявления тиолизирующей активности использовали метод А. Парка и А. Томаса (Park A.M., Thomas А.6.,1989). Обессоленный после первого- центрифугирования (10000 g) супернатант повторно центрифугировался при 150000 g 60 минут, концентрировался сульфатом аммония при 75% насыщении, после чего разделялся методом гель- хроматографии на колонке "Sephadex G-75", размерами 1.6*40 см.

Концентрацию белка определяли унифицированным методом с реактивом Фолина-Чикольте, предварительно инкубируя белок с тарт-ратом-карбонатом меди (Peterson Q.L.,1977).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием параметрического критерия t-Стьюдента, коэффициента линейной корреляции г.

Результаты работы и их обсуждение.

Первым этапом работы явилось исследование метаболических изменений в сердечной мышце на различных моделях острого ишемии-ческого повреждения миокарда. В ходе операций по высокой перевязке ЛНАС была выявлена неоднородность оперированных животных по тяжести нарушений ритма, осложняющих острую ишемию миокарда, что позволило объединить их по группам в соответствии с выраженностью аритмических осложнений и провести биохимическую идентификацию метаболических нарушений в каждой группе.

К первой группе относились животные с преобладанием экстрасистол, вторая группа характеризовалась появлением фибрилляций желудочков и приступов желудочковой тахикардии, Третью группу составили животные с преобладанием тяжелых нарушений ритма, смертность в группе превышала 40 %. Изменения метаболизма миокарда исследовались в ишемической зоне левого желудочка. Нарастание тяжести нарушений ритма сопровождалось снижением активности НАД-зависимой формы КСО во второй и третьей группах, достоверно (р<0.05) различающихся с первой группой и с контролем. В зоне ишемии у животных третьей группы определялось повышение активности 02-зависимой формы фермента, что говорило о необратимой трансформации в структуре фермента и появлении в ишемической зоне источника генерации активных форм кислорода.

Выявлены сильные корреляционные связи между изменением ти-ол-дисудьфидного равновесия в зонах ишемии и тяжестью течения ишемического процесса. Содержание окисленного глутатиона повышалось с 79±8 нМоль/г ткани в контроле до 96±7 нМоль/г ткани во второй группе и более чем в 2 раза - в третьей группе, составляя 160±9 нМоль/г ткани. Содержание восстановленного глутатиона последовательно уменьшается с 4.58±0.20 мкМоль/г ткани до 3.05±0.21 мкМоль'г ткани в третьей группе. Наиболее показательным явилось изменение тканевого соотношения СЗЗН/ОЗБЭ с 57.9 в контроле до 51.0 в первой, 38.0 во второй и 19.2 в третьей группах, что соответствует взгляду на содержание данных метаболитов, ккк наиболее чувствительных маркеров окислительного стресса '(Сиге11о Э. еЬ а1., 1985). Активность ферментов Гл-б-ФДГ, ГР оставалась неизмененной, однако активность ГП достоверно повышалась в инфарктной зоне в третьей группе.

Кальций-транспортирующая активность ретикулума, связанная с

гидролизом АТФ, оказалась чувствительной к окислительному стрессу. Выявлены достоверные различия (р<0.05) между всеми группами животных как по активности Са2+-АТФазы, снижающейся до 4721±91 нМоль/мг мин во второй группе и 403Ш73 нМоль/мг мин в третьей группе, так и по сродству фермента к Са2+. В целом, установлены сильные корреляционные связи между тяжестью вызванных ишемией нарушений ритма, снижением отношения СБН/вЗБв, активацией проок-сидантной 0-формы КСО и снижением Са2+-транспортирующей способности ретикулума, выделенного из участков ишемического повреждения.

Изменения метаболизма миокарда при субтотальной ишемии и ре-перфузии на модели изолированного перфузируемого сердца.

Данная модель позволила проследить изменения исследуемых показателей в динамике ишемического процесса и в период восстановления перфузии, сопровождаемом появлением аритмий. Сердца исследовались через 15, 30, 45 минут ишемии и через 3 минуты с начала реперфузии в указанные сроки.

Субтотальная ишемия сопровождалась выраженной активизацией прооксидантных процессов, особенно через 45 минут ишемии и последующей реперфузии. Определяемое увеличение доли 0-формы в структуре общей ксантиноксидазной активности отражало последовательное снижение отношения активностей Р- и 0- форм КСО с 9.69±0.64 ДО 7.55±0.74, 6.68+0.46 И 3.95+0.58 соответственно К 30-ой, 45-ой минутам ишемии и к началу реперфузии. Высокий коэффициент линейной корреляции (г=0.8Я) между активностью 0-формы КСО и накоплением ТВК-свягнвающих продуктов, содержание которых в период реперфузми увеличивается почти в 3 раза, свидетельствовал о взаимосвязанности этих процессов.

Ишемия вызывала изменения в содержании пула окисленного и

восстановленного глутатионов, при этом суммарное содержание (ЗЗН+бБЗа падало более чем в 2 раза. Отношение 05Н/(ЗЗЗа снижалось в 4 раза к 45-ой минуте ишемии и в 5 раз в период реперфузии, что позволяло говорить о развитии выраженного окислительного стресса в сердечной мышце. Выявлены выраженные изменения функциональной активности Са2+-АТФазы СР. Наряду со снижением АТФазной активности наблюдалась значительное снижение сродства Са2+-АТФ и нарушение Са2+-транспортирующей активности ретикулума с 8326±210 нМоль/мин до 2588±174 нМоль/мин к 45ой минуте ишемии, продолжавшейся уменьшаться в период реперфузии, во время которой активность ретикулума по скорости транспорта Са2+ составляла 27.5% от исходного уровня.

Представляло интерес не только определить содержание интересующих показателей в коронарном потоке в динамике шемического процесса и при реперфузии, но и сопоставить их появление с функциональным состоянием миокарда в эти периоды.

Ишемия вызывала резкую депрессию сократительной способности и увеличение коронарного потока, что отражало феномен по-геПош. При реперфузии через 15 минут определялось транзиторное повышение содержания 6БЗй в минимальных количествах. Развиваемое давление и коронарный поток возвращались к исходным значениям. Через 30 минут ишемии реперфузия сопровождалась увеличением выхода как бЭЗЭ, так и 65Н в сравнимых концентрациях 28.4±3.1 нМоль/мл и 33.2±4.1 нМоль/мл соответственно. Реперфузионное повреждение при этом сроке вызывало появление активности креатинки-назы в следовых количествах. Функциональное состояние миокарда ухудшалось, сопровождаясь увеличением коронарного потока, перфу-зионное давление не достигало контрольных значений, оставаясь сниженным. Реперфузия через 45 минут субтотальной ишемии вызыва-

ла резкое увеличение в перфузате всех исследуемых показателей, значительную депрессию сократительной функции и повышение величины коронарного потока.

Полученные данные позволяли рассматривать содержание GSSG в растворе перфузии как наиболее чувствительный показатель, отражающий функциональное состояние миокарда. Характер динамики выхода GSSG при ишемии с транзиторным повышением при реперфузии позволял предположить активное удаление из клетки данного метаболита при развитии окислительного стресса по механизму активного транспорта ( Beutler Е., 1983) , что сопоставимо с установленной динамикой накопления 6SSG в ткани миокарда при ишемии.

Анализ проведенных исследований, выполненных на различных моделях ишемического повреждения миокарда, позволял говорить о вовлечении исследованных биохимических систем в цепочку метаболических нарушений, обусловливающих изменения функциональных свойств сердечной мышцы.

Экспер нтальное обоснование метаболических нарушений, вызываемых ишемическим повреждением.

В цепи выявленных метаболических нарушений, вызываемых ишемией, на наш взгляд, центральное место занимает факт нарушения транспорта Са2+ мембранами СР. Повышение концентрации пула свободного Са2+ в цитоплазме имеет драматические последствия для миокардиальной клетки ( Hearse D.J., 1977; Nayler W.G., 1984; Dhalla N.S. et al., 1985)

Нами установлено, что тяжесть нарушения ритма сердца и активность Са21"-АТФазы имели сильную корреляционную связь с активизацией прооксидантных процессов в ишемизированной ткани миокарда. С учетом выявленной зависимости активности Са2+-АТФазы от длительности ишемического периода представлялось логичным иссле-

довать возможность прямых инактивационных эффектов преинкубации прооксидантных систем с СР на активность АТФазы ретикулума. Снижение активности фермента при инкубации СР на воздухе в дальнейшем рассматривалось в качестве самостоятельного варианта повреждения ретикулума и обозначалось как аутоокисление. Аутоокисление и прооксидантные системы вызывали однонаправленные эффекты на АТФазу ретикулума, приводившие к потере активности фермента. Наибольший ингибирующий эффект вызывала пятнадцатиминутная преин-кубация ретикулума в системе Ге2+/аскорбат. Активность АТФазы составляла 367. от исходной. Преинкубация КСО/ксантин определяла процент ингибирования активности, равный 55% на 15-ой минуте, 43X и 33% на 10-ой и 5-ой минутах преинкубации соответственно. Максимальный эффект аутоокисления проявлялся к 15-ой минуте, вызывая снижение активности фермента на 26Х.

Срок преинкубации 15 минут был выбран для сравнения степени угнетения ферментативной активности в модельных экспериментах с данными, полученными на ретикулуме, выделенном из ткани ишемизи-рованного миокарда. Проведенные сравнения подтверждают значимость активации прооксидантной системы ксантиноксидазы в ишеми-ческом повреждении сердечной мышцы и в инактивации Са2+АТФазы СР.

Структура Са2+-стимулируемой АТФазы СР, представляющей биполярный трансмембранный протеин детерминирует возможные механизмы повреждения ферментов. Са2+-АТФаза является критическим по SH-группам ферментом, имеющим по крайней мере четыре группы в активном центре, участвующие в образовании активного комплекс Са2+-АТФ и гидролизе АТФ (Болдырев A.A., 1978) . Исходя из этого, представлялось интересным изучить влияния окисленного и восстановленного глутатионов на Са2+-АТФазу СР и вовлечение тио-

лов в прооксидантные механизмы повреждения ретикулума.

Модификация глутатионами активности Са2+-АТФазы ретикулума и инактивационного эффекта прооксидантных систем.

Внесение в инкубационную среду 6БН и К^Бй до концентраций от Ю-7 до 10~4 Моль/л не вызвало достоверных различий в активности АТФазы. Преинкубация ретикулума с микромолярными концентрациями айв вызывала значительный протекторный эффект от инактивирующе-го воздействия свободных радикалов . К 10-ой и 15-ой минутам преинкубации ретикулума с системой КСО/ксантин активность фермента снижалась до 45% и 58% от контрольных значений. Предварительное ведение в среду инкубации (ЗЗБй предотвращало снижение АТФазной активности до 67.2% к 15-ой минуте и 73.9% к 10-ой минуте преинкубации. Схожие тенденции выявлены для прооксидантной системы Ре2+/аскорбат. Протекторный эффект составлял 20% ингиби-рования активности для 15 минут преинкубации и 14% - для 10 минут. Восстановленный глутатион подобным эффектом не обладал.

Для объяснения протекторного эффекта окисленного глутатиона мы предположили, что его молекула способна к взаимодействию с ЗН-группами активного центра АТФазы, с образованием тиолизиро-ванного протеина, что предохраняет фермент от ингибирующего действия Ог и ОН' радикалов. Возможность механизма инактивации Са2+- АТФазы ретикулума по типу окисления БН-групп фермента подтверждалась реактивацией активности фермента восстановленным глутатионом при внесении его в инкубационную среду после 15 минут экспозиции с прооксидантными системами.

Активность АТФазы восстанавливалась с 20.2% до 41.3% от уровня контрольных значений после инактивации в системе Ге2+/ас-корбат и с 46% до 64.8% после ингибирования в системе КСО/ксантин. Важен факт возможности восстановления активности, что гово-

- 16 -

рит о частичной обратимости данного вида повреждения.

Для проверки возможности регуляции активности Са2+-АТФазы по механизму глутатион-зависимой тиолизации SH-групп фермента, показанной, для ряда ферментов метаболизма углеводов и липидов (Su-giyama Т., 1988), нами была предпринята попытка выделения тио-лизирующей активности из цитоплазмы сердца крысы, имеющей троп-ность к АТФазе сердечного ретикулума. С этой целью методом гель-хроматографии цитозоль сердец крыс был разделен на пять белковых фракций. Исследовалось влияние инкубации полученных фракций с ретикулумом на активность Са2+-АТФазы и способность фракций изменять активность фермента при добавлении в инкубационную среду GSH и GSSG.

Установлено, что третья фракция, включающая с 21-сй по 29-ю пробы злюции с содержанием белка приблизительной молекулярной массы 10000-40000 дальтон обладает ингибирующим действием на активность АТФазы . Одновременное добавление в среду инкубации окисленного или восстановленного глутатионов уменьшало инактиви-рующий эффект до 93% в случае GSSG и до 85% - с GSH . Как показано на рис.1 через 15 минут инкубации CP с третей фракцией активность фермента снижалась до 21% от исходных значений, что превышало инактивационные эффекты прооксидантных систем. Для данного срока добавление GSH (10~б) и GSSG (Ю-5) предотвращало снижение активности до 47% и 66% соответственно (рис.1)

Мы сочли возможным объяснить полученные результаты содержанием в третьей фракции белковой субстанции, способной к взаимодействию как с глутатионами, так и с АТФазой ретикулума. Данные результаты согласуются с данными Е.М.Parks et al. (1989), выделившими аналогичным методом глутатион- зависимую тиолизирующую активность из цитозоля бычьих сердец.

Активность Са-Н- АТФаэы ( % от контроля)

105-

D-1-1-1-1-1-г1 _

О 5 10 15 t минут

преинкуСапип

Рис.1 Влияние окисленного (GSSG) и восстановленного (GSH) глу-тотионов на активность Са2+-АТФазы саркоплаэматического ретику-луыа миокарда в условиям инкубации ретикулума с белками третей цитоплазматической фракции (фр.111)1. Примечания: 1. Третья ци-топлаэматическая фракция- порядковый номер фракции, полученной при фракционировании цитоэоля сердца крыс методом гель- хроматографии на колонке Sephadex G- 75 (Pharmacia). 2.Количество вносимой фракции- 20 мкг белка/мл среды инкубации. 3. Концентрации GSSG- 10-6 Ноль/л, GSH- 10-5 Моль/л в среде инкубации.

Кардиотропные эффекты глутатионов на модели изолированного перфузируемого сердца.

Полученные данные по выделению ишемизированным миокардом глутатионов, содержание которых в перфузионной жидкости сравнимо по величине с концентрацией тиолов в ткани сердечной мышцы; модифицирующие эффекты GSSG на активность АТФазы при проокси-дантном повреждении явились основанием для изучения прямых эффектов GSH и GSSG на функциональные показатели сокращающегося перфузируемого сердца.

Установлены прямые кардиотропные эффекты гдутатионов на функциональные показатели сокращающегося перфузируемого сердца. Окисленный глутатион оказывал концентрационно-зависимые эффекты на исследуемые показатели сокращающегося сердца. Во всех исследованиях бББб вводился однократно в перфузат непосредственно перед подачей на сердце для исключения значительного разбавления в количестве 0,5 мл.

Выраженное действие начиналось с концентрации Ю-6 Моль/л. Величина развиваемого давления повышалась на 39Х, частота сердечных сокращений - на 20%. Положительный инотропный эффект значительно увеличивался при концентрации глутатиона 10~5 Моль/л, однако хронотропный эффект был менее выражен и прёвышал контрольные значения на 13Х. Введение не физиологических миллимоляр-ных концентраций характеризовалось значительным отрицательным инотропным и хронотропным эффектами. В целом, действие 633Э расценивалось как кардиотоническое, наличие подобных эффектов у НЗН не обнаружилось.

Выявлено изменение кардиотонического действия адреналина на фоне микромолярных концентраций ЕКв. Введение равной дозы адрес последующим развитием выраженного положительного инотропного эффекта. Вторая фаза действия отсутствовала, и ЧСС достоверно не отличалось от уровня контрольных значений. Поскольку такая картина наблюдалась при введении высоких' доз адреналина, нами был сделан вывод, что окисленный глутатион повышает чувствительность миокарда к адренергической стимуляции. Данный факт может иметь важное практическое значение с позиции решения проблемы гипоад-ренергической чувствительности сердечной мышцы при ишемическом повреждении. Продемонстрировано появление адреномиметических

свойств у окисленного глутатиона, вводимого на 6-ой минуте действия 0.1% адреналина. Отмечалось развитие двухфазного эффекта, длительность промежутка между фазами превышала таковую у адреналина. Продолжительность всего эффекта составляла 65±7 с, что в 4 раза короче общей длительности действия адреналина. Характер эффектов позволял предполагать, что GSSQ вызывал диссоциацию комплекса адреналин-бета-рецептор с последующей рестимуляцией адре-нергических структур. Возможность образования подобных комплексов подтверждается фактом появления у восстановленного глутатиона (10~4) вводимого на 5-ой минуте действия адреналина кратковременного кардиотонического эффекта. Регистрируемые изменения силы и частоты сердечных сокращений соответствовали действию 6SSG в микромолярных концентрациях на интактном сердце.

Полученные результаты позволяют говорить о наличии у глута-тионов кардиотропных свойств, в основе которых может лежать способность тиолов образовывать протеин-смешанные дисульфиды (Yang Y., Wellst W.W., 1991) на наружной поверхности сарколеммы, изменяющих свойства плазматической мембраны и чувствительность ре-цепторного аппарата клетки к воздействию кардиотропных агентов.

Полученные результаты явились основой для исследования возможностей метаболической коррекции нарушений ритма сердечной деятельности. Аритмии на изолированном сердце вызывались введением наиболее распространенных аритмогенных препаратов: адреналин в дозе 1 мл 0.1% раствора, строфантин К- 1 мл 0.06% раствора, хлорид кальция при медленном введении в перфузат 5-10 мл 10% раствора. Восстановленный глутатион достоверно не изменял характер развития и особенности протекания вызываемых аритмий. В противоположность, на фоне перфузии GSSQ регистрировалось изменение

_ 623С.

Рис.2 Антиаритмические эффекты окисленного глутатиона (СЕБЕ) на модели изолированного перфузируемого сердца крысы.

Примечания: 1. Глутатион вводился однократно, в количестве 0,2 - 0,5 мл Ю-5 Моль/л р-ра, непосредственно перед подачей перфузата на сердце. 2. Показано действие вЗБв на фоне аритмий, вызванных: а) 0,1% р- ом адреналина; б) 10% р-ром СаС1г ; в) 0,06% р-ом строфантина К. 3. Скорость движения ленты 5 мм/с.

частоты возникновения и тяжести протекания аритмий при введении адреналина, строфантина К и хлорида кальция, а боллюсное введение препарата в перфузат обрывало развившиеся аритмии на "кончике иглы" (рис. 2). В целом, действие окисленного глутатиона можно охарактеризовать, как стабилизирующее ритм сердечной деятельности и повышающее толерантность миокарда к проаритмогенным воздействиям.

Проведено исследование антиаритмических свойств Ейб при острой ишемии миокарда на витальных животных с лигацией ЛНАС,-одновременно исследовался антиаритмический эффект ингибировйния КСО фолиевой кислотой в микромолярных концентрациях. Опытным животным вводились (КБб в дозе 0.5 мкМоль/г, фолиевая кислота -0.1 мкМоль/г и 6336 в сочетании с фолиевой кислотой в выше приведенных дозах. Препараты вводились внутрибрюшинно за 1 час до операции. Достоверное (р<0.05) снижение частоты возникновения и длительности протекания аритмических периодов выявлено во всех группах животных, предварительно получавших исследуемые препараты. Сочетанное введение препаратов оказалось эффективнее и уменьшало общую длительность аритмий до 205±14 с против 361±17 в контрольной группе.

В отличие от изменений, установленных на животных тельно не получавших препараты до операции не выявлено различий по содержанию ТБК-связывающих продуктов и степени трансформации Б-формы КСО между тканью миокарда в опытных группах и интактными животными. Отношение (ЗЗН/ОЗЗй и активность Са2+-АТФазы уменьшались, однако достоверно (р<0.05) отличались от значений контрольной группы.

Полученные результаты по антиаритмическому действию GSSG и ингибитора КСО подтвердили предположение о кооперативное™ изменений в системах эндогенных тиолов и прооксидантной ксанти-ноксидазы при ишемическом повреждении. Данное исследование подтверждает возможность патогенетической коррекции нарушений ритма сердечной деятельности при поражениях миокарда ишемичес-кого генеза.

ВЫВОДЫ:

1. Острая ишемия миокарда в ранние сроки сопровождается активацией прооксидантноактивной ксантиноксидазной реакции, выраженными разнонаправленными изменениями внутриклеточных пулов GSH и GSSG, ведущими к снижению восстановительного потенциала GSH/GSSG и потери функциональной активности Са2+-АТФазы CP миокарда.

2. Взаимообусловленные изменения пула восстановленного и окисленного глутатиона и образование стационарного уровня прооксидантной О-формы КСО, обусловливающее снижение АТФ-гидроли-зующей и Са2+-транспортирующей активностей миокардиального ре-тикулума являются принципиальными патобиохимическими детерминантами, определяющими тяжесть повреждения миокарда и формирование метаболической основы аритмогенных свойств сердечной мышцы при острой ишемии.

3. В основе снижения активности Са^+--АТФазы ретикулума могут лежать прямые инактивационные эффекты системы генерации свободных радикалов КСО/ксантин и Fe2+/acKopGaT.

> «

4. Глутатион взаимодействует с мембранами саркоплазматичес-кого ретикулума, модифицируя инактивационные эффекты проокси-дантных систем и факторов цитоплазматической фракции, при этом окисленный глутатион обладает протекторными свойствами, а восстановленный - способностью реактивировать фермент.

5. Окисленный глутатион обладает кардиотропными свойствами, оказывая концентрационнозависимые кардиотонические эффекты на функциональные показатели сокращающегося изолированного перфу-зируемого сердца, при этом эффект, вероятно, опосредуется через адренергическую систему миокарда.

6. Окисленный глутатион и ингибитор ксантиноксидазы- фолие-вая кислота способны оказывать антиаритмические эффекты при острой ишемии миокарда, выявляя возможности метаболической коррекции нарушений сердечного ритма при данной патологии.

НАУЧНО- ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Полученные результаты и их теоретическое содержание позволяет считать практически целесообразными следующие направления клинико- экспериментальных исследований по представленной в диссертации тематике.

1. Представленные механизмы прооксидантно- зависимого нарушения транспорта Са2+ и результаты протекторного действия ингибитора КСО- фолиевой кислоты позволяют рекомендовать клинические исследования кардиопротекторных свойств данного препарата для профилактики и лечения нарушений ритма сердца при острой ишемии и реперфузии миокарда, в том числе и в практике сердечно- сосудистой хирургии.

2. Выявление механизмов участия глутатионов в генезе ишеми-ческого повреждения миокарда, наличие собственных кардиотропных и модифицирующих кардиотонические эффекты адреналина свойств открывает перспективы разработки фармакологических агентов, направленных на метаболическую терапию ишемического процесса путем регуляции функционального состояния тиолзависимых ферментов и мембранных рецепторных комплексов.

3. Исследование содержания в плазме крови окисленного и восстановленного глутатионов при ишемическом и реперфузионном повреждении перспективно ^ля отработки новых чувствительных лабораторных показателей тяжести повреждения сердечной мышцы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние острой ишемии на активность ферментов циклазной системы // Биохимия - медицине.- Л., 1988,- С. 108.

2. Роль ферментов метаболизма эндогенных тиолов и каталазы в патогенезе острого кислородного голодания // Материалы XI научн. конференции молодых ученых и специалистов академии/ Воен. мед. академия им. С.М. Кирова.- Л., 1990.- С. 8. (Совместно с Р.Б. Галиахметовым).

3. Са2+- АТФаза и проаритмогенный эффект острой ишемии // Актуальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний.

С.- Петерб., 1993,- С. 153.

4. Перспективные направления экспресс- диагностики ишемичес-ких и токсических повреждений миокарда // Современные медицинские технологии в совершенствовании лечебно- эвакуационного обеспечения.- С. Петерб., 1993.- С. 85- 36.

Подписано к печати Формат бумаги л.

Тираж -/¿С экз. Заказ ГППП-3. 191104, Санкт-Петербург, Литейный пр., 55