Физико-химические свойства мембран зародышевой оси семян пшеницы

Рууге, Андрес Эннович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физико-химические свойства мембран зародышевой оси семян пшеницы
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические свойства мембран зародышевой оси семян пшеницы"

На правах рукописи

РУУГЕ Андрее Эннович

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕМБРАН ЗАРОДЫШЕВОЙ ОСИ СЕМЯН ПШЕНИЦЫ

Специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2000

абота выполнена в Институте биохимическом физики им. Н.М. Эмануэля РАН.

1аучные руководители:

доктор химических наук, профессор Л.А.Блюменфельд доктор физико-математических наук, профессор А.Н.Тихонов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Г.Г.Комиссаров доктор биологических наук Е.М.Миль

ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится « 2000 г. в /у часов

т заседании диссертационного совета Д 2(Ю.53.01 в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: г. Москва, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н.Н.Семенова РАН.

Автореферат разослан «

2000 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 200.53.01, кандидат химических наук

// N *

М.А.Смотряева

■/-Я б 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ,-

Актуальность темы. Нарушение целостности плазматических мембран является одной из причин потери всхожести семян, происходящей при хранении семян. Исследование физико-химических свойств клеточных мембран семян традиционными методами, такими как ИК спектроскопия, затруднено из-за присутствия в них значительного количества липидных телец, поскольку ИК спектры мембранных липидов перекрываются с ИК спектрами липидных телец. Поэтому разработка новых методических подходов к изучению клеточных мембран семян, которые позволяют следить за динамикой изменения физико-химических свойств клеточных мембран семян, представляет актуальную научную задачу, имеющую важное практическое значение. В диссертации проведено обширное исследование, в котором впервые использована техника ЭПР-спектроскопии с переносом насыщения для изучения взаимодействия липидорастворимых спиновых меток с мембранами клеток зародышевой оси семян. Доказана практическая возможность использования метода ЭПР переноса насыщения (ЭПР-ИН) для изучения клеточных мембран в таких сложных биологических системах, как клетки зародышевой оси семян.

Цель работы. Диссертационная работа посвящена исследованию физико-химических характеристик цитоплазматических мембран зародышевой оси семян пшеницы.

Научная новизна. Основные результаты и положения, которые составляют предмет диссертации, являются новыми.

Установлено, что термоиндуцированные структурные перестройки в липидных областях клеточных мембран зародышевой оси семян пшеницы имеют кооперативный характер. Показано, что мембраны дегидратированных

1 ' I 1

клеток зародышевой оси семян пшеницы в широком диапазоне температур (вплоть до 60°С) находятся в твердом состоя1пш. Гидратация клеток зародышевой оси приводит к разжижению мембран - при температурах выше Гщг = -7°С большая часть липидов находится в жидкокристаллическом состоянии, при уменьшении температуры ниже 7*т1 = -30°С большинство мембранных липидов переходит в твердокристаллическое состояние.

Показано, что хранение семян пшеницы в естественных условиях сопровождается нарушением целостности мембран клеток зародышевой оси. При этом происходят структурные изменения мембран клеток зародышевой оси, сопровождающиеся разрыхлением липидного бислоя, которое проявляется в заметном уменьшении времени корреляции вращательной диффузии нитроксильных радикалов, локализованных в мембранах зародышевой оси. С увеличением времени хранения семян наблюдается уменьшение числа интактных клеток; при этом, однако, индекс всхожести семян не коррелирует однозначно с общим количеством клеток зародышевой оси, сохраняющих неразрушенные мембраны.

Научно-практическое значение работы. Представленные в диссертации экспериментальные данные могут быть использованы для выяснения молекулярных механизмов процессов, влияющих на изменения физико-химического состояния мембран при длительном хранении, и влияния условий обезвоживания на жизнеспособность клеток зародыша семян зерновых культур.

Апробация работы. Основной материал диссертации был представлен на следующих конференциях: 9-я конференция «Магнитный резонанс в химии и биологии» (Звенигород, 1996), Всероссийская научная конференция «Физические проблемы экологии (физическая экология)» (Москва, 1997), 10-я международная конференция «Магнитный резонанс в химии и биологии» (Суздаль, 1998), 2-й съезд биофизиков России (Москва, 1999).

Публикаций. Основные результаты представлены в 7 публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), методической части (глава 2), описания собственных экспериментальных результатов и их обсуждения (глава 3), заключения,

выводов. и, списка цитированной литературы. Объем работы составляет 129 страниц, включая 40 рисунков и библиографию из 144 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы. Обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава содержит подробный обзор литературы, посвященный строению и физиологическим характеристикам семян и их способности к произрастанию под влиянием различных внешних факторов, таких как температура, водоснабжение и состав окружающей среды. Рассмотрены различные механизмы поддержания жизнеспособности семян и их биохимической адаптации в состоянии ангидробиоза. Большое внимание уделено рассмотрению механизма стабилизации высушенных мембран и белков клеток семян с помощью трегалозы. Отдельные разделы посвящены методам оценки качества семян и применению метода ЭПР-спектроскопии спиновых меток для исследования физико-химических свойств семян.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования. Исследования проводились на семенах пшеницы Тгшсит асяуйит [,. сортов Лльбидум, Приокская, Мироновская и Заря урожая различных годов. Для оценки структурно-динамических характеристик мембран зародышевой оси использовались липофильные спиновые метки - производные стеариновой кислота 1(т,п) и метилыгого эфира стеариновой кислоты 1(т,п)-СНз. Отделенные от семян зародышевые оси замачивали в водном растворе спиновой метки при комнатной температуре. Дегидратированные образцы приготавливались двумя способами: быстрым высушиванием гидратированных спин-меченых образцов под горячим воздухом и инкубированием зародышевой оси в растворе спиновой метки в гептане с последующим испарением гептана из образца. В качестве модели для сравнения поведения спиновой метки в клеточных мембранах и в жировых тельцах использовали дисперсию жировых

капель, полученную путем многократного проталкивания смеси масла из семени и воды (1/1) сквозь мембрану с порами ~8 нм.

Для оценки целостности клеточных мембран в зародыше использовали спиновую метку TEMPONE и не проникающий в клетку парамагнитный уширитель (феррицианид). При повреждении клеточных мембран ионы Fe(CN)63' проникают внутрь клетки и уширяют благодаря магнитному диполь-диполыюму взаимодействию сигнал TEMPONE в водном окружении. Это позволило использовать отношение величин сигналов TEMPONE, принадлежащих метке в водном и липидном окружении (параметр R = Р/Н, см. рис. 1), для определения относительного числа клеток зародыша с неповрежденными мембранами.

Спектры ЭПР записывали на спектрометрах Е-4 и Е-109Е фирмы "Varían" (США), оснащенных температурной приставкой Е-254. Для записи спектров и их обработки использовали программу, созданную на кафедре биофизики физического факультета МГУ Б.В. Трубициным.

Для описания анизотропии вращательной диффузии спиновых меток мы определяли из обычных спектров ЭПР (VО диагональный элемент тензора параметра порядка S (Szz). Согласно (Marsh and Schorn, 1998), этот параметр вычисляли по формуле:

\(Т;1+2 TJ

-О.ЩТ„-TJ+0.6 , (1)

где Тн' и Тх' — экспериментально полученные расстояния между внутренними и -внешними экстремумами спектра' (см: рис. 2). В случае спектров ЭПР с неразрешенными экстремумами мы вычисляли кажущийся параметр порядка

Т -Т

5'арр = ~ . (2)

или

Т -Т

s —i±- (3)

арр гр rj> ' /

где Т0 — константа изотропного сверхтонкого взаимодействия, Тц и Тх — главные величины тензора сверхтонкого взаимодействия Т для аксиально симметричной системы.

Для спектров ЭПР, соответствующих почти изотропному вращению парамагнитного фрагмента метки в наносекундном диапазоне (8 < 0,4), 'мы определяли эмпирические времена корреляции вращательной диффузии тс' и

Тс":- - ■•■■■■•

^ = 0.665-Ю^ДЯ,^^-!] (с), (4)

■ г;=О.673-Ю-,0АЯ0[^/|-1] (с), (5)

где AI Jj и АН0 - ширины низкополевой и среднеполевой линий спектра, а Г (, 10 и I.] - величины (амплитуды) низкополевой, среднеполевой и высокополевой линий спекчра (см. рис. 2). В случае быстрого изотропного вращения, обе формулы дают одинаковые значения для времен корреляции, поэтому их отношение = тс7тс" было использовано для оценки степени анизотропии вращательного движения метки.

Подвижность спиновой метки в еубмиллисекундном интервале времени анализировалась но параметрам спектров ЭПР переноса насыщения (ЭПР-ПН, Vj ). Для вычисления времен корреляции вращательной диффузии Т|, и тс мы определяли отношения величин низкополевых пиков L'YL и средиеполевых пиков С'/С в спектрах V2' (см. рис. 3), которые сравнивались с соответствующими калибровочными кривыми, полученными (Hovarth and Marsh, 1983) для спин-меченого гемоглобина. Для калибровочных кривых были найдены следующие аналитические выражения:

ll J99

(мкс), (6)

г, = 103.72-

(/."/I)-0.134

2.48 -(£"//,)

= 3.564-

(С/С) +1.041

1.104-(С'/С)

(мкс).

(7)

Для оценки степени анизотропии вращения парамагнигаого фрагмента радикала использовали отношение = т^то

Количество молекул спиновой метки N. встроенных в липиды зародыша, определяли путем двойного интегрирования обычного спектра ЭПР (У\), записашюго при ненасыщающей СВЧ мощности.

Спектры ЭПР-ПН (У2') были нормированы по количеству нитроксильных радикалов в образце путем деления спектра Г2'(Н) на значение

для обычного спектра ЭПР (КО. Нормированная интенсивность 1а спектра ЭПР-ПН вычисляли по формуле:

Третья глава посвящена изложению экспериментальных результатов диссертационной работы и их обсуждению.

Исследование структурной целостности цитоплазматических мембран клеток зародышевой оси семян. В настоящем разделе приведены результаты опытов по исследованию структурной целостности цитоплазматических мембран : клеток зародышевой оси семян пшеницы с помощью спиновой метки TEMPONE, растворимой как в полярной, так и в гидрофобной среде. Характерный спектр ЭПР этой метки в препарате зародыша пшеницы представлен на рис. 1. По полученным спектрам ЭПР определяли величину параметра R = Р/Н (см. рис. 1), пропорционального, в первом приближении, количеству клеток с ненарушенной мембраной. По результатам измерений для нескольких таких определяли среднее значение этого параметра <R>. Для получения усредненного параметра R в капилляр помещали сразу несколько препарированных зародышей (п = 5), а затем проводили измерения. Кроме этого, для каждой популяции семян определяли параметр G, представляющий собой процент прорастающих семян данной популяции и характеризующий способность данной популяции к произрастанию. Для популяций семян, хранившихся не более шести лет, индекс жизнеспособности G пропорционален количеству клеток с неповрежденными мембранами. В то же

(8)

\V2(U)-dH.

(9).

магнитное поле, Гс

Рис 1. Спектр ЭПР спиновой метки ТЕМРСЖЕ в клетках гидратированной зародышевой оси. Линия Н относится к молекулам метки в гидрофобной области, линия Р - к метке в полярной (водной) среде.

время, для семян, хранившихся более длительное время, линейная зависимость между параметрами <К> и в отсутствует. Из полученных результатов можно сделать вывод, что общее количество клеток зародыша с неповрежденными мембранами не является единственным критерием, определяющим всхожесть семян. В этой связи нам представлялось интересным проанализировать другие возможные изменения в физико-химических характеристиках мембран клеток зародышевой оси, происходящие по мере старения семян пшеницы.

Встраивание спиновых меток в клетки зародышевой оси. Использованные в нашей работе липофильные спиновые метки - производные стеариновой кислоты 1(т,п) и ее метального эфира 1(т,п)-СНз - были помечены

парамагнитными доксильными группами с различным расположением на углеводородной цепи (у атомов. углерода С}, С12 и С16). Спектральные параметры ориентированных доксилстеаратов, являясь функцией расположения парамагнитных доксильных групп, были использованы нами для анализа молекулярной подвижности алкилыюй цепи в липидах мембраны. На рис. 2 показаны спектры ЭПР гидраТированного влажного зародыша, спин-меченого различными производными доксилстеарата 1(т,п). Спектральные параметры, которые использовались для анализа расположения спиновых меток в зародыше, показаны на рис. 2. Метилированные доксилстеараты с разным расположением парамагнитных фрагментов также дают отличающиеся спектры ЭПР, однако, для 1(т,п)-СН3 зависимость спектральных параметров от расположения доксильной группы незначительно по сравнению со спин-мечеными стеариновыми кислотами. Липофильные молекулы 1(т,п)-СНз могут встраиваться в липидные области мембран, проникая в глубину мембраны, однако, практически не связываются с мембранными белками. Глубина расположения радикала в мембране может флуктуировать, а величина флуктуации является функцией физико-химического состояния мембраны, которое, в свою очередь, определяется составом мембранных липидов и белков, а также температурой.

Позиционный профиль спектров ЭПР. Зародышевая ось представляет собой сложную гетерогенную систему с различными гидрофобными областями (клеточные мембраны, жировые капли), в которых могут накапливаться амфифильные и липофильные спиновые метки. Для идентификации мест локализации доксилстеаратов в клетках зародышевой оси мы рассматривали позиционные профили спектров ЭПР спиновых меток в зародыше и сравнивали их с более простыми модельными системами - маслом и суспензией капель масла семян. Позиционные профили - зависимость спектральных параметров от расположения доксильной группы вдоль алкильной цепи - измеряли при различных температурах. Варьирование температуры помогало нам различить сигналы ЭПР от молекул спиновой метки, локализованных в различных областях клеток зародышевой оси.

3220 3240 3260 3280 3300 магнитное поле (Гс)

Рис. 2. Спектры ЭПР спиновых меток 1(12.3), 1(5.10) и 1(1.14) в гидратированных клетках зародышевой оси семян пшеницы, записанные при 20°С. !..•■■•■•

С понижением температуры, когда основная часть липидов затвердевает (переходит в гслевое состояние) обычный метод ЭПР теряет чувствительность к более медленным (субмиллисекундным) вращениям нитроксильных радикалов. В этом случае для изучения вращательного движения спиновых меток в диссертационной работе был использован метод ЭПР-спсюроскопии с переносом насыщения.

Спектры ЭПР-ПН от 1(т,п) и 1(т,п)-СН3 в гидратированном зародыше представлены на рис. 3. Эти спектры, записанные при температуре -50°С, нормализованы по величине интегральной интенсивности соответствующих обычных спектров ЭПР. Отношения величин трех пар пиков, Ь'УЬ (низкое поле), С'/С (центральное поле) и Н'УН (высокое поле) могут быть использованы для оценки более медленных (субмиллисекундных) времен корреляции вращательного движения спиновых меток. В нашей работе, для анализа низкотемпературной подвижности нитроксильных радикалов в клетках зародышевой оси, определяли отношения Ь'ТЬ и С'/С для низкополевых и центральных пар пиков, так как точность определения отношения сравнительно слабых высокополевых пиков была затруднена низким отношением сигнал/шум.

Для амфифильных производных стеариновой кислоты 1(т,п), форма линии спектра Кг' заметно меняется с проникновением доксильной группы в глубь мембраны (см. рис. 3). Спектр ЭПР-ПН для 1(12,3) имеет более высокое значение параметра Ь'УЬ по сравнению со спектрами 1(5,10) или 1(1,14) (рис. 4). Однако, отношение параметров Ь"/Ь изменяется немонотонно с проникновением доксильной группы внутрь мембраны и имеет минимум для положения (5,10). Метилированные спиновые метки 1(т,п)-СНз характеризуются позиционным профилем, который отличается от остальных. Ь'УЬ имеет одно и тоже значение для (12,3) и (5,10), но увеличивается в случае (1,14) (рис. 4А). Метальные эфиры доксилстеаратов дают спектры ЭПР-ПН с меньшим значением параметра Ь'УЬ по сравнению с соответствующими производными стеариновой кислоты. Это означает, что парамагнитные фрагменты липофильных спиновых меток (включая 1(12,3)-СН3) имеют большую вращательную степень свободы, чем амфифильные спиновые метки

магнитное поле (Гс)

Рис. 3. Спектры ПН-ЭПР (Г2') спиновых меток 1(т,п) и 1(т,п)-СН3 в гидратированных зародышевых осях, записанные при -50°С. Спектры нормализованы но относительному числу нитроксильных радикалов в образце.

ш о о.

ге о.

а.

03 .

с о

го 1=

11 8. I

ш ^ ш о. о.

о ^

а а.

Ё ф с о

с №

1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0

100

20 10

60 40 20

I Кгл.п)

11(т,п)-СН, 5......—И=°

С'/С

г еидратированный зародыш

. i '_i, i .i_i_i_|_i_,_i_,_i . i

1(т,п) г 1(т,п)-СН3 в-

ГЛ.

-1_I I I

J_I_I_I_1_

1(т,п)

1(т,п)-СН, о-

_и

- 1(т,п)

Цт^-СН^

' I I I I I I ■ I I I I I I > И I I ■ » 1 г I I I I ■ I I ■ I I I I ■ I ■

О 2 4 6 8 10 12 14 16 положение доксильной группы (Сл+2)

Рис. 4. Зависимости отношений параметров Ь"/Ь и С'/С спектров ПН-ЭПР спин-меченых зародышевых осей (А), соответствующих времен корреляции Ть и хс (Б), параметра анизотропии \ - (В) и интегральной интенсивности 151 спектра (Г) от расположения доксильной группы.

I(m,n). Что касается отношения С'/С, то нет существенного отличия между спин-мечеными стеариновыми кислотами и их метилированными аналогами.;,,,

На рис. 4Б показаны позиционные профили времен корреляции вращательной диффузии tL и тс, определенных по соотношениям параметров спектров ЭПР-ПН L"/L и С'/С, соответственно. Позиционный профиль xL указывает на то, что при низких температурах подвижность нитроксильных радикалов в средней части мембраны в несколько раз выше, чем в поверхностном слое мембраны (см. зависимость для 1(12,3)). Необходимо отметить, что значения кажущегося времени корреляции tL существенно отличаются от значений для тс. Величина времени корреляции xL выходит за пределы интервала 10-100 мке, тогда как величина тс на порядок меньше.

Разница во временах корреляции xL и Тс отражает анизотропный характер движения спиновой метки. Согласно (Marsh, 1980; Hemminga, 1989), отношение С'/С должно быть более чувствительно к вращению спиновых меток вокруг длинной оси молекулы стеариновой кислоты, а отношение L"/L - к непосредственному движению самой длинной оси. Таким образом, степень анизотропии вращения радикала можно охарактеризовать параметром % = х[/тс. Чтобы вычислить значения tl и Тс из отношений L'VL и С'/С, мы использовали калибрирующие кривые, полученные ранее (Hovarth and Marsh, 1983) для спектров ЭПР-ПН спиновой метки, прочно связанной с гемоглобином. Существенное отклонение параметра £ = tiAc от величины i; = 1 (изотропное вращение) свидетельствует об анизотропном характере вращения нитроксильного радикала в липидном слое мембраны. Для спиновой метки 1(12,3), доксильная группа которой находится в области поверхностного слоя мембраны, мы получили значение кажущегося параметра анизотропии £ ~ 18 (рис. 4В). Эта величина заметно выше параметра анизотропии определенного для спиновых меток 1(5,10) (£, ~ 5) и 1(1,14) (с, ~ 10), парамагнитные фрагменты которых погружены в глубину мембраны. Полученный результат показывает, что четко выраженный профиль подвижности вдоль липидной углеводородной цепи существует даже при низких температурах, когда подавляющее

большинство липидов клетки находится в твердом состоянии (гелевой фазе). При этом степень упорядоченности молекул доксилстеаратов в поверхностном слое мембраны заметно выше, чем в глубине мембраны.

Для липофильных метальных эфиров стеариновой кислоты 1(т,п)-СНз, времена корреляций xL и тс (рис. 4Б) и параметр анизотропии В, (рис. 4В) слабо зависят от положения доксильной группы относительно углеводородной цепи. Полностью липофильный нитроксильный радикал 1(12,3)-СНз менее упорядочен в мембране по сравнению с его амфифильным аналогом 1(12,3). Парамагнитные фрагменты обеих пар аналогичных спиновых меток (стеариновые кислоты и их метилыше эфиры), соответствующие одинаковому расположению доксильной группы' (1(5,10) и 1(5,10)-СН3, или 1(1,14) и 1(1,14)-СН3), характеризуются одинаковой подвижностью и анизотропией вращения. Таким образом, можно сделать вывод, что нитроксильные радикалы всех метальных эфиров спиновых меток остаются неупорядоченными даже при низких температурах, когда липиды мембран находятся в твердом состоянии.

Интегральная интенсивность Ist спектров ЭПР-ПН является еще одним параметром, который чувствителен к вращению нитроксильных радикалов в субмиллисскундной временной шкале. Согласно (Marsh and Horvath, 1989; Hemminga and de Jager, 1989), величина Isl возрастает по мере замедления вращения спиновой метки. На рис. 4Г показано, что метилированные производные характеризуются меньшими значениями Ist по сравнению со спин-меченой стеариновой кислотой. Для обоих видов спиновых меток параметр Ist слабо зависит от расположения доксильной группы, немного увеличиваясь с проникновением парамагнитного фрагмента внутрь сердцевины мембраны. Для липофильных спиновых меток 1(т,п)-СНз, тенденция повышения Ist в случае 1(1,14)-СН3 коррелирует с увеличением времени корреляции вращательного движения tl и параметра анизотропии вращения % = TlAc-

С другой стороны, нет корреляции между величиной Ist, определенной из ЭПР-ПН спектров I(m,n), и величинами tl и b¡. Время вращательной корреляции tl и параметр анизотропии \ заметно уменьшаются с углублением доксильной группы I(m,n) от положения (12,3) до положения (5,10), в то время как Ist не

меняется. Как и время корреляции Тс, интегральная интенсивность Ist слабо зависит от расположения доксильной группы у I(m,n). Как мы отмечали выше, время корреляции Тс должно быть наиболее чувствительным к вращению спиновой метки вокруг длинной углеводородной цепи стеариновой кислоты. Относительно слабая зависимость Тс и от позиции нитроксильного радикала показывает, что различные спин-меченые производные стеариновой кислоты совершают осевые вращения с близкими скоростями. Таким образом, мы можем заключить, что большое время корреляции вращательного движения tl, определенное; для 1(12,3), скорее отражает степень подвижности углеводородной цепи, чем замедление вращения нитроксильного радикала вокруг длинной цепи 1(12,3).

Спиновые метки в модельных системах. На рис. 5 изображены позиционные профили параметров спектров ЭПР-ПН при -50°С для I(m,n) и 1(ш,п)-СНз, растворенных в объемной фазе растительного масла. Видно, что не существует значимого различия между поведением спектральных параметров для стеариновых кислот и их метилированных производных, меченых в одинаковых позициях вдоль углеводородной цепи стеариновой кислоты (рис. 5А). Спин-меченые стеариновые кислоты и их метальные производные характеризуются похожими профилями для времен корреляций tl и тс (рис. 5Б). С другой стороны, расположение доксильной группы заметно влияет на форму спектра ЭПР-ПН, показывая, что нитроксильные радикалы 1(1,14) и Т(1,14)-СНз вращаются медленнее (рис. 5Б) и более изотропно (рис. 5В) по сравнению с 1(12,3), 1(12,3)-СН3,1(5,10), 1(5,10)-СН3. Увеличение времен корреляций tl и тс (рис. 5Б) соответствует увеличению интегральной интенсивности Ist спектра ЭПР-ПН (рис. 5Г). Такая явная зависимость подвижности нитроксильного радикала от расположения доксильной группы может быть следствием различных конформаций молекул спиновых меток. Сравнивая позиционные профили подвижности спиновых меток в масле (рис. 5) с соответствующими профилями для зародыша (см. рис. 4), можно заметить, что при низких температурах обе спиновые метки 1(1,14) и 1(1,14)-СН3 вращаются медленней и

0 Q. H ш Е ш

та с

Ф s

-3. о

■

i I

cq ^ <D Q. EL О иг

UlP

b. ra o.

н ^

d) с о

с; го о. ,— О) IX 5

1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0

100

25 20 15 10 5

60 40 20 0

Г .-I:;-. L7L 'УА

г .......-о---''' '' / * * 'у

: , 1 , i , i С'/С , 1,1,1, 1,1,

\ №

Г ^ - л '' f

,1,1,1 хс ........К , 1 , "Г"-:--*-"' 1 , 1 г

j l(m,n)-CH, .............

Г ^ Г" Г l(rn,n) чо ж 1.1,

; l(m.n) —

- l(m,n)-CH3 /

" , 1 , 1 , 1

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 положение доксильной группы (Сп+2)

Рис. 5. Зависимости отношений параметров L"/L и С'/С спектров ПН-ЭПР (У2'0 спиновых меток I(m,n) и I(m,n)-CH3 в масле (А), соответствующих времен корреляции xL и тс (Б), параметра анизотропии = tl/tc (В) и интегральной интенсивности. Isl сгшкпра (F2') (Г) от положения доксильной группы. Температура измерения -50°С.

более изотропно в масляном окружении, чем в клетках зародышевой оси. Разные позиционные профили для зародыша и масляных капель могут указывать на то, что липидорастворимые спиновые метки, встроенные в клетки зародыша, локализуются в основном в мембранах клеток, нежели в масляных частицах.

Температурные зависимости подвижности спиновой метки.

Исследование температурных зависимостей параметра порядка Я для трех разных спиновых меток, у которых парамагнитный фрагмент локализован на разной глубине относительно поверхности мембраны, показало, что все три температурные зависимости обладают особенностями (перегибы на графиках) при одинаковых температурах. Это обстоятельство указывает на кооперативный характер термоиндуцированных структурных перестроек в липидной области мембран клеток зародышевой оси семян пшеницы.

Термоиндуцированные структурные изменения в клеточных мембранах зародышей, определенные из обычного спектра ЭПР липидорастворимых спиновых меток, особенно четко выявляются при измерениях спектров ЭПР переноса насыщения (РУ). На рис. 6 показаны спектры ру метки 1(1,14) в клеточных мембранах гидратированных зародышей, записанные при различных температурах. Из этого рисунка видно, что спектральные параметры для изменяются с температурой, а уменьшите отношений высот пиков Ь'7Ь и С/С показывает, что скорость вращательного движения шпроксильных радикалов увеличивается с повышением температуры. В отличие от обычных спектров ЭПР, вызванные варьированием температуры изменения подвижности по параметрам спектров ЭПР-ПН наблюдались даже при достаточно низких температурах - в интервале от -80° до -30°С. Даже в этом интервале температур, когда основная часть липидов мембраны находится в твердом состоянии (гелевой фазе), спектры ЭПР-ПН шпроксильных радикалов свидетельствуют о существовании молекулярной подвижности их парамагнитных фрагментов. Проведенные эксперименты показали, что нитроксильные радикалы, парамагнитные фрагменты которых расположены по-разному относительно поверхности мембраны, отражают структурные изменения в одном и том же

I. ■■ "I' "

магнитное поле (Гс)

Рис 6. Спектры ЭПР-ПН (К2') для спиновой метки 1(1,14) в гидратированном зародыше. Измеряемые спектральные параметры и температура измерений показаны на рисунке.

узком интервале температур (от -35° до -30°С), свидетельствуя о переходе основной части липидов мембраны из твердого состояния (гелевой фазы) в жидкокристаллическое состояние.

С дальнейшим увеличением температуры (в области температур, выше -15° -г- -10°С) в спектрах ЭГГР-ПН появляются линии от слабо иммобилизованных спиновых меток, которые накладываются на компоненты спектра, даваемые медленно вращающимися метками. Из-за появления этих, хотя и менее интенсивных компонентов, которые значимо проявляются при температурах выше -10°С, при более высоких температурах использование спектров ЭПР переноса насыщения для оценки подвижности спиновой метки становится не вполне корректным.

Отношения величин пиков в спектрах ЭПР-ПН Ь'ТЬ и С'/С использовались нами для вычисления эффективных времен корреляций вращательной диффузии т^ и Тс по соответствующим калибровочным кривым, как описано выше. Напомним, что время корреляции Тс характеризует вращение парамагнитного фрагмента относительно длинной углеводородной цепи молекулы метки, а время корреляции ^ - вращение самой углеводородной цепи. На рис. 7 показано, что нитроксильный радикал 1(12,3) вращается медленнее по сравнению с 1(12,3)-СН3 и 1(1,14). Однако температурные зависимости времен корреляций Т1 и Тс для трех видов спиновых меток имеют характерные точки излома при одинаковой температуре -30°С (рис. 7А, 7Б). Отметим, что оба способа регистрации спектров ЭПР, обычный и с переносом насыщения, отражают изменение характера температурной зависимости спектральных параметров в одном и том же интервале температур.

Отношение эффективных времен корреляции = т[/тс (рис. 7В) можно использовать для измерения анизотропии вращения в субмиллисекундной временной шкале. При низких температурах (ниже -30°С) параметр анизотропии вращения с,, определенный для 1(12,3), заметно выше, чем § Для 1(12,3)-СН3 и 1(1,14). В мембранах клеток зародышевой оси происходят структурные изменения, когда температура становится выше -30°С, что, в свою очередь,

температура (°С)

Рис 7. Температурные зависимости видимых времен корреляции xL (Л) и Тс (Б) и параметра анизотропии £ = TL/tc (В), определенных по спектрам (V2') для спиновых меток 1(12,3), 1(12,3)-СН3 и 1(1,14) в гидратированных зародышевых осях (жизнеспособные семена пшеницы урожая 1996 г.).

сопровождается уменьшением степени анизотропии вращения радикала 1(12,3). Однако при дальнейшем увеличении температуры наблюдалось весьма резкое увеличение параметра что объясняется замораживанием вращательной степени свободы вдоль длинной цепи молекулы спиновой метки. Увеличение параметра анизотропии Е, коррелирует с появлением компонент спектра ЭПР-ПН от слабо иммобилизованных меток. Для 1(12,3) эти компоненты проявляются при более высоких температурах (выше -10° ч- 0°С), чем в случае более подвижных спиновых меток 1(12,3)-СНз и 1(1,14) (выше -30° -25°С).

Влияние высушивания зародышей на спектр ЭПР 1(12,3). Высушивание регидратированных спин-меченых зародышей семян пшеницы приводит к изменению спектра ЭПР липидорастворимых спиновых меток 1(12,3) и 1(1,14). Эти изменения вызваны затвердеванием липидов мембраны в связи с потерей воды. Для спиновой метки 1(12,3) в клетках зародышевой оси жизнеспособных и нежизнеспособных семян пшеницы, мы наблюдали увеличение значений спектральных параметров 2Тп' и АТ (см. рис. 2). Из этого результата следует, что высушивание спин-меченых зародышей ведет к существенной иммобилизации молекул 1(12,3) в мембране.

На рис. 8А изображены графики эффективных времен корреляций т^ и Тс, определенных из отношений Ь'УЬ и С'/С (см. рис. 6), соответственно. Значение Ть для 1(12,3) в сухом образце линейно уменьшается с увеличением температуры (от -75° до 20°С), без излома при -30°С, характерного для гидратированных образцов. Температурная зависимость для тс в случае высушенных образцов также линейна в широком интервале температур, однако, изгибается при -30°С в случае гидратированных образцов.

На рис. 8Б показано, что при низких температурах (ниже -30°С), параметр анизотропии = ть/тс практически одинаков для гидратированных и высушенных образцов. Для гидратированных образцов величина анизотропии вращения уменьшается при достижении температурой значения выше -35°С (I; = 5-10). В высушенных образцах вращение нитроксильного радикала остается анизотропным даже при температурах выше чем -30°С (£, ~ 30). С дальнейшем

Рис 8. Сравнение температурных зависимостей видимых времен корреляции Т1 и тс (А) и параметра анизотропии Ъ, = Ть/хс (Б), определенных по спектру У2' Для спиновой метки 1(12,3) в высушенных (пустые символы) и гидратированных (сплошные символы) зародышевых осях (жизнеспособные семена пшеницы урожая 1996 года).

увеличением температуры до 20°С анизотропия вращения увеличивается благодаря доминированию вращения вдоль углеводородной цени стеариновой кислоты. В случае гидратированных образцов такое размораживание изотропных вращений появляется при более низких температурах (около -10°С) по сравнению с высушенными образцами (154-20°С).

Для дегидратированных спин-меченых зародышей (внедрение спиновой метки 1(12,3) в клетки зародыша из раствора гептана), мы также не наблюдали низкотемпературных структурных изменений, которые типичны для гидратированных образцов (см. рис. 8А). Как и для высушенных образцов (см. рис. 8Б), анизотропия вращения нитроксильного радикала увеличивается с повышением температуры. Этот эффект коррелирует с уменьшением значения параметра ДТ, определенного из обычного спектра ЭПР (К]).

Структурные изменепия мембран зародышевой оси, происходящие в условиях естественного хранения семян. Выше было показано, что при естественном хранении семян пшеницы происходит уменьшение числа клеток, сохраняющих неразрушенные мембраны. . Очевидно, что с нарушением барьерных функций клеточных мембран может быть определенным образом связана потеря всхожести семян при их достаточно длительном хранении. В этой связи нам представлялось актуальным провести сравнительное исследование физико-химических свойств мембран зародышевой оси семян пшеницы, хранившихся различное время в естественных условиях. В нашем распоряжении были семена пшеницы различного возраста (урожаи пшеницы 1976, 1981, 1985, 1986, 1987, 1996 и 1997 годов). Для выявления возможных структурных перестроек липидного бислоя мембран мы изучили спектры ЭПР-ПН спиновой метки 1(12.3), которые, как было показано выше, являются чувствительными шщикаторами структурных перестроек, происходящих в липидной области мембран. Дегидратированные образцы были получены путем быстрого высушивания зародышевых осей, инкубированных в течение 45 минут в водном растворе спиновой метки. Анализ спектров ЭПР-ПН, полученных нами, показал, что во всех случаях движение нитроксильного радикала в дегидратированных образцах сильно заторможено. При этом по мере старения семян происходят изменения характеристик спектров ЭПР-ПН (уменьшение параметров Ь"/Ъ и С'/С), свидетельствующие о существенном увеличении молекулярной подвижности нитроксильных радикалов в мембранах клеток зародышевой оси.

Аналогичные изменение наблюдались нами также для гидратированных образцов зародышевой оси— см: зависимость параметров Ь"Я., С'/С и Н"/Н от возраста образца, рис; 9. Заметное,-уменьшение величин С'/С и Н"/Н,

наблюдающееся по мере старения семян, соответствует' уменьшению кажущихся времен корреляции вращательной диффузии т^ и тс почти на порядок. Этот результат свидетельствует том, что в ходе естественного старения семян в мембранах клеток зародышевой оси. происходят структурные изменения, сопровождающиеся разрыхлением лицидиого бислоя. . ,

тс (мке)

1000

гид ратирова иные

-45°С

Н"/Н О

Н"/Н I "II С'/С 1,5

хс О

1,0

100

0,5

0,0

' 1 1 1 ■ ' ' » 1 ' ' 1 ■ ' » ' * ■ 1970 1975 1980 1985

. ..........

1990 1995 2000

год урожая

Рис. 9. Зависимость параметров спектров ЭПР-ПН гидратированных образцов Ь"/Ь, С'/С, Н' '/Н и Тс от возраста образца. Температура -45°С.

■ В заключении подведены основные итоги диссертационной работы и сформулированы выводы.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ формы спектров ЭПР (обычные спектры ЭПР и спектры ЭПР с переносом насыщения) и профилей полярности амфифильных спиновых меток (производные стеариновой кислоты) показал, что подавляющее число молекул спиновых меток, использованных в данной работе, локализуется в мембранах клеток зародышевой оси, а не в объемной фазе масляных частиц, что служит основанием для применения метода ЭПР спектроскопии спиновых меток для изучения структурных характеристик мембран клеток семян in situ.

2. Исследова1ше температурных зависимостей спектров ЭПР спиновых меток с различной локализацией нитроксилышго радикала относительно поверхности мембраны показало, что термонндуцированные структурные перестройки1' в липидных областях имеют кооперативный характер. Установлено, что температурные зависимости параметра порядка и времени вращательной корреляции нитроксильных радикалов амфифильных спиновых меток 1(12.3), 1(5,10) и 1(1,14) и их метилированных производных проявляют характерные особенности при одних н тех же температурах.

3. Показано, что мембраны дегидратированных клеток зародышевой оси семян пшеницы в широком диапазоне температур (плоть до 60°С) находятся в твердом состоянии. Гидратация клеток зародышевой оси приводит к разжижению мембран: при температурах выше Тт2 ~ -7°С большая часть мембранных липидов находится в жидкокристаллическое состояние, при уменьшении температуры ниже Tm\ ~ -30°С большинство мембранных липидов переходит в твердокристашнгческое состояние.

4. Показано, что хранение семян пшеницы в естественных условиях сопровождается нарушением целостности мембран клеток зародышевой оси. С увеличением времени хранения семян наблюдается уменьшение числа интактных клеток; при этом, однако, индекс всхожести семян не коррелирует

однозначно с общим количеством клеток зародышевой оси, сохраняющих неразрушенные мембраны.

5. Исследование спектров ЭПР с переносом насыщения спиновых меток показано, что в ходе естественного старения семян происходят структурные изменения мембран клеток зародышевой оси, сопровождающиеся разрыхлением липидного бислоя, которое проявляется в заметном уменьшении времени вращательной корреляции нитроксильных радикалов, локализованных в мембранах зародышевой оси. - •

Основные результаты диссертации представлены в следующих публикациях:

1. Vishnyakova Е.А., Ruuge А.Е., Golovina Е.А., Hoekstra F.A., Tikhonov À.îsf. Spin-labeling study of membranes in wheat embryo axes. Partitioning of doxyl stéarates inio the lipid domains // Biochim. Biophys. Acta. - 2000. - V.1467. - P. 380-394.

2. Вишнякова E.A., Рууге А.Э., Головина E.A., Хукстра Ф., Тихонов А.Н. Исследование мембран зародышевой оси пшеницы методом спиновых меток: встраивание доксил стеаратОв в липидные области мембран // Препринт физическою факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. - 2000. - № 6/2000.

3. Вишнякова Е.А., Рууге А.Э., Головина Е.А., Хукстра Ф., Тихонов А.Н. Исследование мембран зародышевой оси пшеницы методом спиновых меток: термоиндуцирусмые структурные переходы в мембранах зародышевой оси // Препринт физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. - 2000. - № ' 11/2000.

4. Головина Е.А., Рууге А.Э., Тихонов. А.Н. Исследование структурных изменений мембран клеток зародыша семян пшеницы методом спиновых меток. // В сб.: 9-я Конференция «Магнитный резонанс в химии и биологии» (Звенигород) - 1996. - С. 29-30.

5. Вишнякова Е.Л., Головина Е.А., Рууге А.Э., Тихонов А.Н. Структурные изменения клеточных мембран в процессе естественного старения семян пшещщы // В сб.: Всероссийская научная конференция «Физические проблемы экологии (физическая экология)», т.2 (Москва). - 1997. - С.16.

6. Вишнякова Е.А., Головина Е.А., Хукстра Ф., Рууге А.Э., Тихонов А.Н. Исследование структурных изменений в мембранах клеток зародыша в ходе естественного старения семян пшеницы. // В сб.: 10-я Международная конференция «Магнитный резонанс в химии и биологии» (Суздаль).- 1998. - С. 89-90.

7. Вишнякова Е.А., Головина Е.А., Рууге А.Э., Хукстра Ф., Тихонов А.Н. Структурные изменения мембран клеток зародыша в ходе естественного старения семян пшеницы. // В сб.: 2-й съезд биофизиков России (Москва) -1999.-С. 490-491.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рууге, Андрес Эннович

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Анатомия и физиология семян

1.1.1. Фазы развития плода и семени

1.1.2. Способность семян к прорастанию в зависимости от степени зрелости

1.1.3. Покой семян И

1.1.4. Зависимость прорастания семян от внешних факторов

1.1.4.1. Температура

1.1.4.2. Вода

1.1.4.3. Свет

1.1.4.4. Биологические факторы

1.1.5. Жизнеспособность семян

1.2. Высушивание, старение и потеря всхожести

1.2.1. Введение

1.2.2. Биохимические адаптации при ангидробиозе

1.2.3. Стабилизация высушенных мембран и белков с помощью трегалозы

1.2.3.1. Стабилизация высушенных мембран

1.2.3.2. Механизм стабилизации высушенного бислоя

1.2.3.3. Влияние дегидратации на фософолипиды

1.2.3.4. Механизм взаимодействия с фосфолипидами

1.2.3.5. Стабилизация высушенных белков

1.2.3.6. Одинаково ли влияние замораживания и дегидратации?

1.2.4. Применение гипотезы фазового перехода к неповрежденным клеткам

1.2.4.1. Повреждения из-за впитывания

1.2.4.2. Избежание повреждения из-за впитывания

1.3. Методы оценки качества семян

1.4. Применение метода ЭПР-спектроскопии спиновых меток для исследования физико-химических свойств семян

1.4.1. Влияние подвижности парамагнитного фрагмента на спектры ЭПР спиновых меток: область медленных вращений

1.4.2. ЭПР-спектроскопия спиновых меток в исследованиях зародышей семян

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Исследуемый материал. Тестирование семян на всхожесть

2.2. Спин-мечение подготовка образцов к измерениям 44 2.2.1. Гидратированные образцы зародышевой оси 44 2.2.2 Дегидратированные образцы зародышевой оси

2.2.3. Подготовка спин-меченых жировых капель

2.3. Оценка целостности клеточных мембран

2.4. Регистрация спектров ЭПР

2.5. Анализ спектров ЭПР

2.5.1. Обычные спектры ЭПР (Fj)

2.5.2. Спектры ЭПР переноса насыщения (V2')

2.5.3. Интегрирование и вычитание спектров ЭПР

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Исследование структурной целостности цитоплазматических мембран клеток зародыша семян пшеницы.

3.2. Встраивание спиновых меток в клетки зародышевой оси

3.3. Кинетика встраивания спиновой метки в зародышевую ось

3.4. Позиционный профиль спектров ЭПР 66 3.4.1. Обычные спектры ЭПР (ГО 68 3.4.1.1. Профиль упорядоченности нитроксильных радикалов

3.4.1.2. Профили полярности

3.4.2. Спектры ЭПР переноса насыщения (F2')

3.4.2.1. Исследования спин-меченых зародышеых осей

3.4.2.2. Спиновые метки в модельных системах

3.5. Температурные зависимости подвижности спиновой метки

3.5.1. Обычные спектры ЭПР (V\)

3.5.2. Спектры ЭПР переноса насыщения. (F2')

3.6. Влияние высушивания зародышей на спектр ЭПР 1(12,3)

3.6.1. Кинетика "быстрого" высушивания регидратированных зародышей

3.6.2. Влияние высушивания на термоиндуцированные структурные изменения клеточных мембран зародыша

3.6.2.1. Обычные спектры ЭПР (F

3.6.2.2. Спектры ЭПР переноса насыщения (F2')

3.7. Структурные изменения мембран зародышевой оси, происходящие в условиях естественного хранения зародышевой оси

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химические свойства мембран зародышевой оси семян пшеницы"

Диссертационная работа посвящена исследованию физико-химических характеристик цитоплазматических мембран зародышевой оси семян пшеницы.

Нарушение целостности плазматических мембран является одной из причин потери всхожести семян, происходящей при хранении семян. Исследование физико-химических свойств клеточных мембран семян традиционными методами, такими как ИК спектроскопия, затруднено из-за присутствия в них значительного количества липидных телец. В клетках зародышевой оси ИК спектры мембранных липидов перекрываются с ИК спектрами липидных телец. Поэтому разработка новых методических подходов к изучению клеточных мембран семян, которые позволяют следить за динамикой изменения физико-химических свойств клеточных мембран семян, представляет актуальную научную задачу, имеющую важное практическое значение.

Метод спиновых меток является одним из наиболее распространенных методов изучения структурно-функциональных характеристик искусственных и биологических мембран. В последнее время этот метод начал все чаще применяться в биофизике и физиологии растений в частности, для исследования жизнеспособности семян различных растений и для выяснения факторов, определяющих их устойчивость к высушиванию и сохранению всхожести в зависимости от условий хранения семян. Однако, несмотря на многолетнюю научную традицию использования метода спиновых меток для изучения липидных мембран, этот метод не получил еще столь широкого распространения при исследовании мембран семян, по сравнению с другими областями биофизики, биохимии и физиологии, где применение спиновых меток давно стало рутинным методом изучения биологических мембран. Практика этого заключается в том, что растительные клетки представляют собой сравнительно сложные системы, в состав которых наряду с мембранами входят липидные тельца, крахмальные гранулы и другие структурные образования.

Использование традиционного метода ЭПР (регистрация первой производной сигнала поглощения СВЧ) не всегда позволяет разделить сигналы ЭПР от спиновых меток, локализованных в мембранах различного происхождения, особенно в тех случаях, когда движение спиновых меток заторможено. Последнее обстоятельство имеет место при изучении сухих (обезвоженных) биологических структур, какими являются зрелые семена различных растений. В этой связи становится особенно актуальным использование методов регистрации спектров ЭПР, чувствительных к сравнительно медленным вращениям спиновых меток. К числу этих методов относится спектроскопия ЭПР с переносом насыщения.

В диссертационной работе проведено обширное исследование, в котором впервые использована техника ЭПР спектроскопии с переносом насыщения для изучения взаимодействия липидорастворимых спиновых меток с мембранами клеток зародышевой оси и доказана практическая возможность использования этого метода для изучения клеточных мембран в таких сложных биологических системах, как клетки зародышевой оси семян пшеницы.

Впервые показано, что подавляющее число молекул спиновых меток, использованных в данной работе, локализуется в мембранах клеток зародышевой оси, а не в объемной фазе масляных частиц, что служит основанием для применения метода ЭПР спектроскопии спиновых меток для изучения структурных характеристик мембран клеток семян in situ. Установлено, что термоиндуцированные структурные перестройки в липидных областях клеточных мембран зародышевой оси семян пшеницы имеют кооперативный характер. Показано, что мембраны дегидратированных клеток зародышевой оси семян пшеницы в широком диапазоне температур (плоть до 60°С) находятся в твердом состоянии. Гидратация клеток зародышевой оси приводит к разжижению мембран: при температурах выше Ттг ~ -7°С большая часть мембранных липидов находится в жидкокристаллическое состояние, при уменьшении температуры ниже Гт1 ~ -30°С большинство мембранных липидов переходит в твердокристаллическое состояние.

Показано, что хранение семян пшеницы в естественных условиях сопровождается нарушением целостности мембран клеток зародышевой оси. При этом происходят структурные изменения мембран клеток зародышевой оси, сопровождающиеся разрыхлением липидного бислоя, которое проявляется в заметном уменьшении времени вращательной корреляции нитроксильных радикалов, локализованных в мембранах зародышевой оси. С увеличением времени хранения семян наблюдается уменьшение числа интактных клеток; при этом, однако, индекс всхожести семян не коррелирует однозначно с общим количеством клеток зародышевой оси, сохраняющих неразрушенные мембраны.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Рууге, Андрес Эннович

выводы.

2. Исследование температурных зависимостей спектров ЭПР спиновых меток с различной локализацией нитроксильного радикала относительно поверхности мембраны показало, что термоиндуцированные структурные перестройки в липидных областях имеют кооперативный характер. Установлено, что температурные зависимости параметра порядка и времени вращательной корреляции нитроксильных радикалов амфифильных спиновых меток 1(12,3), 1(5,10) и 1(1,14) и их метилированных производных проявляют характерные особенности при одних и тех же температурах.

3. Показано, что мембраны дегидратированных клеток зародышевой оси семян пшеницы в широком диапазоне температур (плоть до 60°С) находятся в твердом состоянии. Гидратация клеток зародышевой оси приводит к разжижению мембран: при температурах выше Тт2 ~ -7°С большая часть мембранных липидов находится в жидкокристаллическое состояние, при уменьшении температуры ниже Тт\ ~ -30°С большинство мембранных липидов переходит в твердокристаллическое состояние.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенное нами исследование четко продемонстрировало возможности использования ЭПР-спектроскопии спиновых меток как удобного и чувствительного метода изучения физико-химических свойств липидо-содержащих компонентов клеток зародышевой оси семян пшеницы. Для исследования динамических характеристик и структурной организации клеточных мембран были использованы липофильные спиновые метки -доксильные производные стеариновой кислоты и ее метального эфира. Для анализа упорядоченности и молекулярной подвижности нитроксильных радикалов, локализованных в мембранах клеток зародышевой оси, мы регистрировали как обычные спектры ЭПР (Vx), так и спектры ЭПР переноса насыщения (V2) в широком диапазоне температур (от -70°С до 60°С). Полученные спектры сравнивали со спектрами соответствующих спиновых меток, растворенных в каплях масла из семян пшеницы.

В работе показано, что подавляющее число молекул спиновых меток, использованных нами, локализуется в мембранах клеток зародышевой оси, а не в объемной фазе масляных частиц. Это служит основанием для применения метода ЭПР спектроскопии спиновых меток для изучения структурных характеристик мембран клеток семян в условиях in situ. Нами было установлено, что термоиндуцированные структурные перестройки в липидных областях клеточных мембран зародышевой оси семян пшеницы имеют кооперативный характер. Оказалось, что мембраны дегидратированных клеток зародышевой оси семян пшеницы в широком диапазоне температур (плоть до 60°С) находятся в твердом состоянии. Гидратация клеток зародышевой оси приводит к разжижению мембран: при температурах выше Тт2 ~ -7°С большая часть мембранных липидов находится в жидкокристаллическом состоянии, при уменьшении температуры ниже rmi ~ -30°С большинство мембранных липидов переходит в твердокристаллическое состояние.

В работе показано, что продолжительное хранение семян пшеницы в естественных условиях сопровождается нарушением целостности мембран клеток зародышевой оси. При этом происходят структурные изменения мембран клеток зародышевой оси, сопровождающиеся разрыхлением липидного бислоя, которое проявляется в заметном уменьшении времени вращательной корреляции нитроксильных радикалов, локализованных в мембранах зародышевой оси. С увеличением времени хранения семян наблюдается уменьшение числа клеток, имеющих неразрушенные цитоплазматические мембраны. При этом, однако, индекс всхожести семян не коррелирует однозначно с общим количеством клеток зародышевой оси, сохраняющих интактные мембраны.

Полученные результаты позволяют заключить, что структурно-функциональные изменения, происходящие в клетках зародышевой оси в ходе естественного старения семян пшеницы, могут быть вызваны процессами, приводящими к изменению упорядоченности и молекулярной подвижности липидов в мембранах зародышевой оси.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рууге, Андрес Эннович, Москва

1. Берлинер JI.M. Метод спиновых меток. Теория и применение. М.: Мир. -1979.

2. Блюменфельд JI.A. Проблемы биологической физики. М.: Наука.1977.

3. Генкель П.А. Методические указания по предпосевному закаливанию растений против засухи. М.: Колос. - 1968.

4. Иванов В.Б. Клеточные основы растений. М.: Наука. - 1974.

5. Илли И.Э. Жизнеспособность семян // В сб.: Физиология семян (под ред. А.А. Прокофьева). М.: Наука. - 1982. - С. 102-124.

6. Калинин Ф.Л. Эмбриональное развитие растений. Киев: Укр. Акад. сельхоз. наук. - 1959.

7. Каменский К.В. Основы сельскохозяйственного семеноведения. М.: Сельхозгиз. - 1931.

8. Крокер В. Рост растений. М.: Иностр. литература. - 1950.

9. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. М.: Наука. - 1978.

10. Кулешов Н.Н. Процесс зернообразования у пшеницы // Тр. Укр. ин-та растениеводства, селекции и генетики. 1960. - Т. 6. - С. 41-66.

11. Кулиева Л.К., Обручева Н.В., Прокофьев А.А. О физиологической зрелости созревающих семян тонковолокнистого хлопчатника // Физиол. раст. -1984.-Т. 31.-С. 928-933.

12. Лихачев Б.С. Морфологическая оценка проростков и сила роста семян // Селекция и семеноводство. 1977. - № 3. - С. 67-68.

13. Лихачев Б.С. Связь силы роста семян с ростом, развитием и продуктивностью формирующихся растений // Селекция и генетика культурных растений на Кубани. 1984. - Т. 89. - С. 81-88.

14. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. -М.: Наука, 1974.

15. Молодкин В.Ю. Значение влажности семян некоторых зерновых и зерно-бобовых культур при криоконсервации в жидком азоте // Бюлл. ВИР. -1986. № 165.-С. 22-24.

16. Мур Р.П. Влияние механических повреждений на жизнеспособность семян // Жизнеспособность семян. М.: Колос. - 1978. - С. 94-110.

17. Навашин С.Г. Результаты пересмотра процессов оплодотворения у Lilium Martagon и Fritillaria tenella // В сб.: Избраннные труды. М.-Л. 1951. - С. 188-192.

18. Николаева М.Г. Покой семян и способы его преодоления // Онтогенез. 1993.-Т. 24.-С 75-86.

19. Николаева М.Г. Ускоренное проращивание покоящихся семян древесных растений. Л.: Наука. - 1979.

20. Обручева Н.В. Прорастание семян // В сб.: Физиология семян (под ред. А.А. Прокофьева). -М.: Наука. 1982. - С. 223-274.

21. Попов А.С. Сохранение семян и меристем высших растений с помощью глубокого замораживания. В сб.: Консервация генетических ресурсов. -Пущино.- 1982.-С. 14.

22. Попцов А.В. Биология твердосемянности. М.: Наука. - 1976.

23. Роберте Е.Х. Влияние условий хранения семян на их жизнеспособность // В сб.: Жизнеспособность семян. М.: Колос. - 1978. - С. 22-62.

24. Роберте Е.Х., Роберте Д.Л. Номограммы жизнеспособности // В сб.: Жизнеспособность семян. М.: Колос. - 1978. - С. 392-398.

25. Розанцев Э.Г. Свободные иминоксильные радикалы. М.: Химия.1970.

26. Твердислов В.А., Тихонов А.Н., Яковенко Л.В. Физические механизмы функционирования биологических мембран. М.: Издательство Московского Университета. - 1987.

27. Федосенко В.А. Консервация семян культурных и диких видов картофеля при сверхнизкой температуре // Бюлл. ВИР. 1980. - № 105. - С. 8082.

28. Фирсова М.К. Методы определения качества семян. М.: Сельхозлитература. - 1959.

29. Хайдекер У. Сила семян // В сб.: Жизнеспособность семян. М.: Колос.- 1978.-С. 202-243.

30. Bewley, J.D., Black М. Physiology and biochemistry of seeds. 2. Viability, Dormancy and Environmental Control. Berlin, Heidelberg, N.Y.: Spring Verlag. -1982.

31. Bhandal, I.S., Hauptmann, R.M., Widholm, J.M. 1985. Trehalose as cryoprotectant for the freeze preservation of carrot and tobacco cells // Plant Physiol. -V. 78.-P. 430-432.

32. Blackman, S., Leopold, A.C. Chemical and physical factors in seed deterioration. Ithaca, N.Y.: Boyce Thompson Inst. - 1983.

33. Blok, M.C., van der Neut-Kok, E.C. M., Van Deenen, L.L.M., De Gier, J. The effect of chain length and lipid phase transitions on the selective permeability properties of liposomes // Biochim. Biophys. Acta 1975. - V. 406. - P. 187-196.

34. Borelli, M.I., Semino, M.C., Hernandez, R.E. Cryopreservation of islets of Langerhans: the use of trhalose as ciyoprotective agent // Med. Sci. Res. 1987. - V. 15.-P. 299-300.

35. Bramlage W. J., Leopold, A.C., Parrish, D. J. Chilling stress to soybeans during imbibition // Plant Physiol. 1978. - V. 61. - P. 525-529.

36. Buitnik, J., Hemminga, M.A., Hoekstra F.A. Characterization of molecular mobility in seed tissues: an electron paramagnetic resonance spin probe study // Biophys. J. 1999. -V. 76. - P. 3315-3322.

37. Buitnik, J., Hemminga, M.A., Hoekstra F.A. Influence of water content and temperature on molecular mobility and intracellular glasses in seeds and pollen // Plant Physiol. 1998.-V. 118.-P. 531-541.

38. Caffrey, M. In: Membranes, Metabolism and Dry Organisms (Ed. Leopold, A.C.) Ithaca, N.Y.: Cornell University Press. - 1986. - P. 248-258.

39. Caffrey, M., Fonseca, V., Leopold C. Lipid-sugar ineractions // Plant Physiol. 1988. - V. 86. - P. 754-758.

40. Caffrey, M. A lyotrope gradient method for liquid crystal temperature-composition-mesomorph diagram construction using time-resolved x-ray diffraction // Biophys. J. 1989. - V. 55. - P. 47-52.

41. Carpenter, J.F., Crowe, J.H. The mechanisms of cryoprotection of proteins by solutes // Cryobiology. 1988. - V. 25. - P. 244-255.

42. Carpenter, J.F., Crowe, J.H. An infrared spectroscopic study of the interactions of carbohydrates with dried proteins // Biochemistry. 1989. - V. 28. - P. 3916-3922.

43. Carpenter, J.F., Crowe, L.M., Crowe, J.H. Stabilization of phosphokinase with sugars during freeze-drying: characterization of enhanced protection in the presence of divalent cations // Biochim. Biophys. Acta. 1987. - V. 923. - P. 109115.

44. Carpenter, J.F., Hand, S.C., Crowe, L.M., Crowe J.H. Cryoprotection of phosphofruktokinaze with organic solutes: characterization of enhanced protection in the presence of divalent cations // Arch. Biochem. Biophys. 1986. - V. 250. - P. 505-512.

45. Carpenter, J.F., Martin, В., Crowe, L.M., Crowe, J.H. Stabilization phosphofructokinase during air-drying with sugars and sugar/transition metal mixtures // Cryobiology. 1987. - V. 24. - P. 455-464.

46. Chapman, D., Williams, R.M., Ladbrooke, B.D. Physical studies of phospholipids. VI. Thermotropic and lyotropic mesomorphism of some 1,2-diacyl-phosphatidylcholines // Biochim. Biophys. Acta. 1967. - V. 1:- P. 445-75.

47. Coolbear, P., Francis, A., Grierson, D. The effect of low temperature presowing treatment on the germination perfomance and membrane integrity of artificially aged tomato seeds // J. Exp. Bot. 1984. - V. 35. - P. 1609-1617.

48. Crowe, J.H., Carpenter, J.F., Crowe, L.M., Anchordoguy, T.J. Are freezing and dehydration similar stress vectors? A comparison of modes of interaction of stabilizing solutes with biomolecules // Cryobiology 1990. - V. 27. - P. 219-231.

49. Crowe, J.H., Hoekstra, F.A., Crowe, L.M. Anhydrobiosis // Ann. Rev. Physiol. 1992. - V. 54. - P. 579-599.

50. Crowe, J.H., Crowe, L.M. Factors affecting the stability of dry lyposomes // Biochim. Biophys. Acta. 1988. - V. 939. - P. 327-334.

51. Crowe, J.H., Crowe, L.M. Preservation of lyposomes by freeze drying. In: Lyposome Technology (Ed. Gregoriadis, G., Boca Raton, F.L.) -N.Y.: CRC. -1991.

52. Crowe, J.H., Crowe, L.M. Lyotropic effects of water on phospholipids. In: Water Science Rewiews (Ed. Franks, F.). Cambridge: Cambridge Univ Press. -1990.-V. 5.-P. 1-23.

53. Crowe, J.H., Crowe, L.M., Carpenter, J.F., Aurell Wistrom, C. Stabilization of dry phospholipid bilayers and proteins by sugars // Biochem. J. 1987. - V. 242. -P. 1-10.

54. Crowe, J.H., Crowe, L.M., Carpenter, J.F., Rudolph, A.S., Aurell Wistrom, C. Interactions of sugars with membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1988. - V. 947.-P. 367-384.

55. Crowe, J.H., Crowe, L.M., Hoekstra, F.A. Phase transitions and permeability changes in dry membranes during rehydration // J. Bioenerg. Biomembr. 1989.-V. 21.-P. 77-91.

56. Crowe, J.H., Crowe, L.M., Jackson, S.A. Preservation of structural and functional activity in lyophilized sarcoplasmic reticulum // Arch. Biochem. Biophys. -1983.-V. 220.-P. 477-484.

57. Crowe, J.H., Crowe, L.M., Mouradian, R. Stabilization of biological membranes at low water activities // Cryobiology. 1983. - V. 20. - P. 346-356.

58. Crowe, J.H., McKersie, B.B., Crowe, L.M. Effects of free fatty acids and transition temperature on the stability of dry liposomes // Biochim. Biophys. Acta. -1989.-V. 979.-P. 7-10.

59. Crowe, J.H., Spargo, B.J., Crowe, L.M. Preservation of dry lyposomes does not require retention of residual water // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84. -P. 1537-1540.

60. Crowe, L.M., Crowe, J.H. Trehalose and dry dipalmitoylphosphatidyl-choline revisited // Biochim. Biophys. Acta. 1988. - V. 946. - P. 193-201.

61. Crowe, J.H., Crowe, L.M., Chapman, D. Interaction of carbohydrates with dry dipalmitoylphosphatidylcholine // Arch. Biochim. Biophys. 1985. - V. 236. - P. 289-96.

62. Crowe, L.M., Crowe, J.H., Rudolph, A., Womersley, C., Appel, L. Preservation of freeze-dried lipsomes by trehalose // Arch. Biochem. Biophys. 1985. -V. 242.-P. 240-247.

63. Crowe, L.M., Womersley, C., Crowe, J.H., Reid, D., Appel, L., Rudolph, A. Prevention of fusion and leakage in freeze-dried liposomes by cabohydrates // Biochem. Biophys. Acta. 1986.-V. 861.-P. 131-40

64. De Antoni, G.L., Perez, P., Abracham, A., Anon, M.C. Trehalose, a cryoprotectant for Lactobacillus bulgaricus // Cryobiology. 1989. - V. 26 - P. 149153.

65. Di Nola, L., Mayer, A.M. Effect of tempeature of inhibition on phospholipid metabolism in pea embryonic axes // Phytochemistry. 1985. - V. 24. -P. 2549-2554.

66. Ewart A.J. On the longevity of seeds // Proc. Roy. Soc. Victoria. 1908. -Vol. 21.-P. 1-210.

67. Floris C. Ageing in Triticum durum seeds: behavior of embryos and endosperms from aged seeds as revealed by embiyo transplantation technique // J. Exp. Bot. - 1970. - V. 21. - P. 462-468.

68. Gadd, G.M., Chalmers, K., Reed, R.H. The role of trehalose in dehydration resistance of Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiol. Letts. 1987. - V. 48. -P. 249-254.

69. Gaffney, B.J., McNamee, C.M. Spin-label measurements in membranes. With appendix a use of computers in EPR spectroscopy // Methods Enzymol. 1974. -V. 32 (Part B). - P. 161-198.

70. Green, J.L., Angell, C.A. Phase relations and nitrification in sacharidewater solutions and the trehalose anomaly // J. Phys. Chem. 1989. - V. 93. - P. 28802882.

71. Golovina, E.A., Tikhonov, A.N. The structural differences between the embryos of viable and nonviable wheat seeds as studied with the EPR spectroscopy of lipid-soluble spin labels // Biochim. Biophys. Acta 1994. - V. 1190. - P. 385-392.

72. Golovina, E.A., Tikhonov, A.N., Hoekstra, F.A. An electron paramagnetic resonance spin probe study of membrane permeability changes with seed aging // Plant Physiol. 1997. - V. 114. - P. 383-389.

73. Harrigan, P.R., Madden, T.D., Cullis, P.R. Protection of liposomes during dehydration or freezing // Chem. Phys. Lipids. 1990. - V. 52. - P. 139-149.

74. Hemberg, T. Biogenous inhibitors // Handbuch Pflanzenphysiol. 1961. -V. 14. — P. 1162-1184.

75. Hemminga, M.A. Interpretation of ESR and saturation transfer ESR spectra of spin labeled lipids and membranes // Chem. Phys. Liquids. 1983. - V. 32. - P 323-383.

76. Hendricks, S.B., Taylorson, R.B. Variation in germination and amino acid leakage of seeds with temperature related to membrane phase change // Plant Physiol. 1976.-V. 58.-P. 7-11.

77. Hendricks, S.B., Taylorson, R.B. Dependence of thermal responses of seeds on membrane transitions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979. - V. 76. - P. 778-781.

78. Hoekstra, F.A. Imbibitional chilling injury in pollen. Involvement of the respiratory chain // Plant Physiol. 1984. - V. 74. - P. 815-825.

79. Hoekstra, F.A., Crowe, J.H., Crowe, L.M. Effects of sucrose on phase behavior of membranes in intact pollen of Typha latifolia as measured with Fourier Transform infrared spectroscopy// Plant Physiol. 1991. - V. 97. - P. 1073-1079.

80. Hoekstra, F.A., Crowe, J.H., Crowe, L.M. Germenation and ion leakage are linked with phase transitions of membrane lipids during imbibition of Typha latifolia pollen // Plant Physiol. 1991.

81. Hoekstra, F.A., Crowe, J.H., Crowe, L.M., van Roekel, T. Differential phase transition temperatures of membranes in pollen species increased by desiccation // Plant Cell Environ. 1991.

82. Hoekstra, F.A., Haigh AM, Tetteroo FAA, van Roekel, T. Changes in soluble sugars in relation to desiccation tolerance in cauliflower seeds // Seed Sci. Res. 1994.-V. 4.-P. 143-147.

83. Hoekstra, F.A., Crowe, L.M., Crowe, J.H. Differential desiccation sensitivity of corn and Pennisetum pollen linked to their sucrose contents // Plant Cell Environ. 1989. - V. 12. - P. 83-92.

84. Hoekstra, F.A., and Mckersie, B.D. Differential longevity of pollen linked to lipid composition // Physiol. Plant. 1990. - V. 79. - P. A106.

85. Hoekstra, F.A., Van Der Wal, E.W. Initial moisture content and temperature of imbibition determine extent of imbibitional injury in pollen // J. Plant Physiol. 1988. - V. 133 - P. 257-262.

86. Hoekstra, F.A., van Roekel, T. Desiccation resistance of Papaver dubium L. pollen during its development in the anther. Possible roles of phospholipid composition and sucrose content // Plant Physiol. 1988. - V. 88. - P. 4-6.

87. Hoekstra, F.A., Van Roekel, Т., Ten-Pas, N. Pollen maturation and desiccation tolerance. // In: Sexual Reproduction in Higher Plants (Ed. Esti, M., Gori, P., Pacini, E.). Berlin: Springer Verlag. - 1988. -P. 291-296.

88. Hottiger, Т., Boiler, Т., Wiemken, A. Rapid changes of heat and desiccation tolerance correlated with changes of trehalose content in Saccharomyces cerevisiae cells subjected to temperature shifts // FEBS Lett. 1987. - V. 220. - P. 113-115.

89. Hovarth, L.I., Marsh, D. Analysis of multicomponetnt saturation transfer EPR spectra, using the integral method. Application to membrane systems // J. Magn. Res. 1983. - V. 54. - P. 363-373.

90. Hyncha, D.K. Low concentrations of trehalose protect isolated thylakoids against mechanical freeze-thaw damage // Biochim. Biophys. Acta. 1989. - V. 987. -P. 231-234.

91. Hyde, J.S., Thomas, D.D. New EPR methods for the study of very slow motion. Application to spin-labeled hemoglobin // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1973. - V. 222.-P. 680-692.

92. Hyde, J.S., Dalton, L.R. Saturation-transfer spectroscopy // In: Spin Labeling II. Theory and Applications. (Ed. Berliner, L.J.). N.Y.: Academic Press. -1982.-P. 1-70.

93. Kocherginsky, N., Swartz, H.M. Nitroxide Spin Lables, Reactions in Biology and Chemistry. -N.Y.: CRC Press. 1995.

94. Koster, K.L., Leopold, A.C. Sugars and desiccation tolerance in seeds // Plant Physiol. 1988. - V.88. - P. 829-832.

95. Krag, K.T., Koehler, I.-M., Wright, R.W., Jr. Trehalose-A nonpermeable cryoprotectant for direct freezing of early stage murine embryos // Cryobiology. -1985.-V. 22.-P. 636-636.

96. Lee, C.W.B., Das Gupta, S.K., Mattai, J., Shipley, G.G., Abdel-Mageed, O.H. Characterization of the Lambda phase in trehalose-stabilized dry membranes by solid-state NMR and X-ray diffraction // Biochemistry. 1989. - V. 28. - P. 50005009.

97. Lee, C.W.B., Waugh, J.S., Griffin, R.G. Solid-state NMR study of trehalose/ 1,2-dipalmitoyl-sn-phosphatidylcholine interactions // Biochemistry. 1986. -V. 25.-P. 3737-3742.

98. Leopold, A.C. Temperature effects on soybean imbibition and leakage // Plant Physiol. 1980. - V. 65. - P. 1096-1098.

99. Leopold, A.C. Membranes, Metabolism, and Dry Organisms. Ithaca: Cornell Univ. Press. - 1986.

100. Lynch, D.V., Steponkus, P.L. 1989. Lyotropic phase behavior of unsaturated phosphatidylcholine species: Relevance to the mechanism of plasma membrane destabilization and freezing injury // Biochim. Biophys. Acta. 1989. - V. 984.-P. 267-272.

101. MacDonald, R.C., MacDonald, R.I., Menco, B.P., Takeshita, K., Subbarao, N.K., Hu, L.R. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles II Biochim. Biophys. Acta. 1991. - V. 1061. - P. 297-303.

102. Madden, T.D., Bally, M.B., Hope, M.J., Cullis, P.R., Schieren, H.P., Janoff, A.S. Protection of large unilamellar vesicles by trehalose during dehydration: retention of vesicle contents // Biochim. Biophys. Acta. -1985. V. 817. - P. 67-74.

103. Madin, K.A.C., Crowe, J.H. Anhydrobiosis in nematodes: carbohydrate and lipid metabolism during dehydration // J. Exp. Zool. 1975. - V. 193. - P. 335342.

104. Marbach, I., Mayer, A.M. The effect of temperature change on leakage from pea seeds // J. Exp. Bot. 1985. - V. 36. - P. 353-358.

105. Marsh, D. Molecular motion in phospholipid bilayers in the gel phase: long axis rotation // Biochemistry. 1980. - V. 19. - P. 1632-1637.

106. Marsh, D., Schorn K. In: Biological Magnetic Resonance, V. 14. Spin Labelling: the Next Millenium (Ed. Berliner, L.). N.Y.: Plenum Press. - 1998. - P. 405-410.

107. Marsh, D., Horvath, L.I. In: Advanced EPR. Applications in Biology and Biochemistry (Ed. Hoff, A.J.). Amsterdam: Elsevier. - 1989. - P. 707.

108. Mayer, A.M., Poljakoff-Mayber, A. The germination of seeds. Oxford, N.Y.: Pergamon Press. - 1989.

109. McConnell, H.M., McFarland, B.G. // Quart. Rev. Biophys. 1970. - V. 3.-P. 91-154.

110. Mouradian, R., Womersley, C., Crowe, L.M., Crowe, J.H. Preservation of functional integrity during long term storage of a biological membrane // Biochim. Biophys. Acta. 1984. - V. 778. - P. 615-617.

111. Murphy, J.B., Noland, T.L. Temperature effects on seed imbibition and leakage mediated by viscosity and membranes // Plant Physiol. 1982. - V. 69. - P. 428-431.

112. Nicolaus, В., Gambacorta, A., Basso, A.L., Riccio, R., De Rosa, M., Grant, W.D. Trehalose in Archaebacteria. System // Appl. Microbiol. 1988. - V. 10. P. 215-217.

113. Piatt-Aloia, K.A., Thomson, W.W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy // J. Electron Microsc. Tech. 1989. -V. 13.-P. 288-299.

114. Quinn, P.J. A lipid-phase separation model of low-temperature damage to biological membranes // Cryobiology. -1985. V. 22. - P. 128-146.

115. Quinn, P.J. Effect of sugars on the phase behaviour of phospholipid model membranes // Biochem. Soc. Trans. 1989. - V. 17. - P. 953-957.

116. Reshkin, S.J., Cassano, G., Womersley, C., Ahearn, G.A. Preservation of glucose transport and enzyme activity in fish intestinal brush border and basolateral membrane vesicles //J. Exp. Biol. 1990. -V. 140. - P. 123-136.

117. Rudolph, A.S. The freeze-dried preservation of liposome encapsulated hemoglobin: a potential blood substitute // Cryobiology. 1988. - V. 25. - P. 1-8.

118. Rudolph, A.S., Cliff, R.O. Dry storage of liposome-encapsulated hemoglobin: A blood substitute // Cryobiology. 1990. - V. 27. - P. 585-590.

119. Rudolph, B.R., Chandrasekhar, E., Gaber, B.P., Nagumo, M. Molecular modelling of saccharide-lipid interactions // Chem. Phys. Lipids. 1990. - V. 53. - P. 243-261.

120. Simon, E.W. Phospholipids and plant membrane permeability // New Phytol. 1974. - V. 73. - P. 377-420.

121. Simon, E.W. Plant membranes under dry conditions // Pestic. Sci. -1978. -V. 9.-P. 169-172.

122. Simon, E.W., Harun, R.M.R. Leakage during seed imbibition // J. Exp. Bot. 1972. - V. 23. - P. 1076-1085.

123. Simon, E.W., Minchin, A., Mcmenamin, M.M., Smith, J.M. The low temperature limit for seed germination // New Phytol. 1976. - V. 77. - P. 301-311.

124. Smirnov, A.I., Golovina, E.A., Yakimchenko, O.E., Aksyonov, S.I., Lebedev, Ya. S. J. Plant Physiol. 1992. - V. 140. - P. 447-452.

125. Spaeth, S.C. Pressure-driven extrusion of intracellular substances from bean and pea cotyledons during imbibition // Plant Physiol. 1987. - V. 85. - P. 217223.

126. Strauss, G., Hauser, H. Stabilization of lipid bilayer vesicles by sucrose during freezing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - P. 2422-2426.

127. Strauss, G., Schurtenberger, P., Hauser, H. The interaction of saccharides with lipid bilayer vesicles: stabilization during freeze-thawing and freeze-drying // Biochim. Biophys. Acta. 1986. -V. 858. - P. 169-180.

128. Strzalka, К., Hara-Nishimura, I., Nishimura, M. Changes in physical properties of vacuolar membrane during transformation of protein bodies unto vacuoles in germinating pumpkin seeds // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V. 1239. -P. 103-110.

129. Tsvetkov, T.D., Tsonev, L.I., Tsvetkova, N.M., Koynova, R.D., Tenchov, B.G. Effect of trehalose on the phase properties of hydrated and lyophilized DPPC multilayers // Cryobiology. 1989. - V. 26. - P. 162-69.

130. Thomas, D.D., Dalton, J.S., Hyde. Rotational diffusion studied by passage saturation transferelectron paramagnetic resonance // J. Chem. Phys. 1976. - V. 65. -P. 3006-3024.

131. Van den Dries, I.J., de Jager, P.A., Hemminga, M.A. Sensitivity of saturation transfer electron spin resonance extended to extremely slow mobility in glassy materials // J. Magn. Reson. 1998. - V. 131. - P. 241-247.

132. Vishnyakova, E.A., Ruuge, A.E., Golovina, E.A., Hoekstra, F.A., Tikhonov, A.N. Spin-labeling study of membranes in wheat embryo axes. Partioning of doxyl stearates into the lipid domains // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - V. 1467.-P. 380-394.

133. Williams, R.J., Leopold, A.C. The gassy state in corn embryos // Plant Physiol. 1989. - V. 89. - P. 977-981.

134. Womersley, C. Biochemical and physiological aspects of anhydrobiosis // Сотр. Biochem. Physiol. -1981. V. 70B. - P. 669-678.

135. Womersley, C., Smith, L. Anhydrobiosis in nematodes I: The role of glycerol, mio-inostinol and trehalose during desiccation // Сотр. Biochem. Physiol. -1981.-V. 70B.-P. 579-586.

136. Womersley, C., Thompson, S.N., Smith, L. Anhydrobiosis in nematodes -II: Carbohydrate and lipid analysis in undesiccated and desiccated nematodes // J. Nematol. 1982. - V. 14.-P. 145-153.

137. Womersley, C., Uster, P.S., Rudolph, A.S., Crowe, J.H. Inhibition of dehydration-induced fusion between liposomal membranes by carbohydrates as measured by fluorescence energy transfer // Ciyobiology 1986. - V. 23 - P. 245255.

Информация о работе

Рууге, Андрес Эннович
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.02

Диссертация

Физико-химические свойства мембран зародышевой оси семян пшеницы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы