Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЛИПАЗА ЗАРОДЫШ ЕЙ СЕМЯН ПШЕНИЦЫ: ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА, РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ЛИПАЗА ЗАРОДЫШ ЕЙ СЕМЯН ПШЕНИЦЫ: ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА, РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ"

Л-д^ЗЬЗ

На правах рукописи

Цс"

Капрзнчнков ВикторСергеевмч

ЛИПАЗА ЗАРОДЫШЕЙ СЕМЯН ПШЕНИЦЫ: ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА, РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ

Специальность: 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степей» кандидата биологических наук

Воронеж,2003

и -I ' '■ >

1 '

Работа выполнена в Воронежской государствен нон технологической академии, Воронежском государственном университете

Научные руководители: доктор биологических наук,

заслуженный деятель науки РФ профессор

ЖЕРЕБЦОВ НИКОЛАЙ АКИМОВИЧ

доктор биологических наук, профессор ПОПОВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, профессор

БУЗЛАМА ВИТАЛИЙ СОЛОМОНОВИЧ

- кандидат биологических наук, доцент

НАКВАСИНА МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА Ведущая организации: Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Защита состоится 24 декабря 2003 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете, 394006 г. Воронеж, Университетская площадь, К конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомится в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан "¿/ноября 2003 г.

-у

Ученый секретарь диссертационного совета _/''

кандидат биологических наук, доцент / , Грабович М. Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Среди гидролитических ферментов, участвующих в метаболизме липидов, важное место занимает липаза (триацнлглицерол эфиргидролаза, К.Ф. 3.1.1,3), которая расщепляет сложноэфирные связи глицерина и жирных кислот в молекулах триа-цилглицеролов (ТАГ)* Исследованию и использованию липаз посвящены многочисленные работы отечественных и зарубежных авторов (Аг-рщпу е! а!., 1999; Ра1к1еу А. е( а1., 1999; Неклюдов А,Д. и др.. 2002). Имеются некоторые данные о негативном действии липаз в процессах хранения и переработки семян масличных растений: подсолнечника, рапса, хлопчатника (Ананьева О.Н. и др., 1978; Корчагина Л.Н. и др., 1979; Ве1з50п Р. е1 а1., 2000). Однако исследования в этом плане немногочисленны, что связано с методическими трудностями, возникающими при выделении и изучении растительных ферментов, по сравнению с ферментами из других организмов. Среди особенностей тканей растений, обуславливающих экспериментальные затруднения, следует отметить: освобождение и выход из клеточных компартментов при гомогенизации материала вакуолярного сока с низким значением рН, а также таннинов, полифенолоксидаз, протеаз, снижающих активность ферментов (Гильманов М.К., 1981).

В настоящее время, в качестве источника новых натуральных компонентов, применяемых в различных отраслях промышленности особое внимание привлекает пшеничный зародыш (ЗП) - побочный продукт мукомольного производства, являющийся биологически ценным продуктом, содержащим целый спектр витаминов, белки с незаменимыми аминокислотами, эсенциальные жирные кислоты (Семе-нкж В.Ф. и др., 1981). Однако широкое использование пшеничного зародыша ограничено ввиду нестойкости его при хранении. Основными причинами порчи зародышей пшеницы является сопряженное действие гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов: липаза гидролизует ТАГ ненасыщенных жирных кислот, а липоксигеназа, при непосредственном участии кислорода воздуха, осуществляет их окисление, а также процесс автоокислення. Образующиеся при этом пероксиды, гидропероксиды и другие продукты распада резко снижают качество зародышей пшеницы. Если изучению действия липоксигеназы уделялось значительное внимание (РгакаэЬ

Фона НЙГ^НОЛ ч^***

R.B, et al., 1993; Зяблова T.B., 2000) , то исследованию липазы зародышей пшеницы посвящены лишь некоторые работы (Stauffer С.Е. et al., 1966; Sauhders С.М. et al., 1998).

В этой связи вызывает значительный интерес выделение и исследование каталитических и регуляторных свойств липазы. Это имеет существенное значение для понимания путей сопряжения и регуляции липидного обмена в клетке, а также решения задач по лимитированию активности липазы и разработке рациональных методов стабилизации биохимического состава зародышей пшеницы при хранении: Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось получение липазы зародышей семян пшеницы в гомогенном состоянии, исследование ее физико-химических характеристик, регуляции активности, а также разработка и обоснование рациональных режимов хранения и использования пшеничных зародышей в пищевой промышленности с учётом каталитических свойств липазы. Исходя из поставленной цели решались следующие задачи:

> разработка эффективного метода выделения и очистки липазы зародышей пшеницы; ^ ! s

> характеристика кинетических параметров каталитического действия и некоторых физико-химических свойств лийазы зародышей пшеницы;

> изучение влияния рН среды и температуры на активность и стабильность липазы зародышей пшеницы, определение основных термодинамических параметров;

> исследование регуляции активности липазы под действием ингибиторов и активаторов;

> исследование субстратной специфичности фермента по отношению к синтетическим и природным субстратам;

> идентификация функциональных групп активного центра фермента, исследование механизма действия липазы зародышей пшеницы;

> разработка рациональных методов стабилизации биохимического состава зародышей пшеницы при хранении с учётом каталитических свойств липазы, апробация их в лабораторных и производственных условиях; изыскание путей и способов использования зародышей пшеницы в пищевой промышленности;

Научная новизна. Разработана схема очистки и впервые получен гомогенный ферментный препарат липазы зародышей пшеницы. Исследовано влияние различных факторов на активность фермента: действие ингибиторов и активаторов, рН и температуры. Исследованы кинетическое поведение и регуляция активности липазы зародышей пшеницы, в том числе, субстратная специфичность по отношению к природным и синтетическим субстратам. Впервые получена информация о кинетике процесса термолиза зародышей пшеницы, определены формы связи влаги в них. С "учётом каталитических свойств фермента разработаны способы стабилизации биохимического состава зародышей пшеницы при хранении, основанные на применении аскорбиновой кислоты, обладающей антиокнслительной способностью, а также тепловой обработки с использованием осциллирующих режимов. Доказана эффективность предложенных способов стабилизации в лабораторных и производственных условиях. Показана целесообразность использования стабилизированных зародышей пшеницы в пищевой промышленности.

-- Практическая значимость работы. Предложенная схема очистки ферментного препарата дает возможность широко использовать его в научно-исследовательских работах, связанных с моделированием ферментных систем, в том числе и сопряженных, in vitro. Полученные в работе данные способствуют созданию более глубоких ; представлений о механизмах ферментативной регуляции липндного .обмена, что расширяет возможности поиска оптимальных путей интенсификации технологии растениеводства в сельском хозяйстве.

Разработанные способы стабилизации и предложенные режимы хранения зародышей пшеницы апробированы в производственных условиях на экспериментальной базе ООО «Воронежмельсервпс» г. Воронежа, ОАО «Бутурлиневекий мелькомбинат» г. Бутурлиновка. На способы стабилизации зародышей пшеницы получены приоритеты на изобретения №2002133774/13 (приоритет от 15.12.02) и №2003101790/13 (приоритет от 7.02.2003). Стабилизированный пшеничный зародышевый продукт апробирован в качестве обогатителя при производстве мучных кондитерских изделий на ОАО "Зам не кий хлебозавод" г. Заинек. За разработку «Способ производства пищевых

добавок на основе пшеничных зародышевых хлопьев» получен диплом выставки «Современное хлебопечение. Сладкоежка»,

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 6-ой и 7-ой Путинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002-2003 гг.), международной конференции молодых учёных «От фундаментальной науки - к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии" (Тверь, 2002 г.), между народной научно-практической конференции "Актуальные направления развития экологически безопасных технологий производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции (Воронеж, 2002 г.), ежегодных научных сессиях Воронежской государственной технологической академии (2001-2003 гг.)

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 15 публикациях - 6 статьях, 9 тезисах докладов конференций.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Впервые разработан способ очистки липазы зародышей пшеницы до гомогенного состояния, включающий следующие стадии очистки: экстракция, кислотное осаждение, гель-фильтрация на сефадексе G-25, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-хроматография на сефадексе G-I50,

2. Исследование, проведенное на высокоочшценных препаратах липазы из зародышей пшеницы показали, что в регуляции активности фермента могут принимать участие ионы Саг+, соли желчных кислот (в концентрации до 20 мМ), стимулирующие ферментативную активность, а также продукты реакции - жирные кислоты, дитлицердцы, соли желчных кислот (в концентрации выше 20 мМ), подавляющие активность липазы.

3. На основе идентификации функцногальных групп активного центра липазы зародышей семян пшеницы: имщдаольной группы гисщгщна, щпроксипь-ной группы серина, карбоксильной группы глютаминовой'асшрагишвой кислот, предложена гипотетическая модель механизма действия фермента, согласно которой акт катализа обеспечивается "системой с переносом заряда".

4. Исследования кинетических и термодинамических параметров термической и кислотной инактивации фермента показало относительно низкую термо - и кислотную стабильность липазы. С учётом этих свойств липазы, разработаны рациональные режимы хранения зароды-

шей семян пшеницы, позволяющие сохранить качество продукта и расширить возможности его использования в промышленности.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 202 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов {3 главы), заключения, списка литературы (292 источника) и приложения. Иллюстрированный материал включает 47 рисунков и 31 таблицу; в приложении - 9 рисунков и 7 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

- Обзор литературы. Дана общая характеристика липаз. Рассмотрены современные представления о локализации фермента, способы получения препаратов липаз. Проведен анализ физико-химических и каталитических свойств липаз из различных источникоа Обобщен накопленный опыт исследований функциональных групп активного центра, а также возможных механизмов действия фермента. Представлены сведения о субстратной специфичности липаз. Обобщен опыт отечественных и зарубежных исследователей относительно способов стабилизации биохимического состава зародышей семян пшеницы при хранении, а также возможных направлениях его использования в различных отраслях промышленности.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объект исследований, В соответствии с целью и задачами работы объектом исследования служили зародыши пшеницы {Triticwn austeviwn), отобранные на ОАО «Бутурлиновский мелькомбинат» г. Бутурлнновка Воронежской области при сортовом помоле пшеницы IV типа.

Определение активности ферментов, Для определения активности липазы использовали метод рН-статирования (Tietz N.W. et al., 1989). За единицу липазной активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ жирной кислоты за 1 мин в стандартных условиях. Активность липоксигеназы определяли методом, который основан на определении перекисного числа, изменяющегося в процессе поглощения молекулярного кислорода субстратом и образовании при этом гидроперекисей под действием фермента (Зяблова Т.В., 2000).

Определение количества белка. Определение общего количества белка проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1951), а также по поглощению при 280 и 260 нм (Мешкова, Северин, 1979).

Выделение и очистка фермента. Препарат липазы выделяли из экстракта обезжиренных ацетоном зародышей пшеницы, используя кислотное осаждение, гель-фильтрацию на сефадексе G-25, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-хроматографию на сефадексе G-150.

Аналитический электрофорез. Гомогенность полученных фракций определяли с помощью электрофореза 8 7,5% полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Девиса (Davis, 1964).

Определение молекулярной массы осуществляли методом гель-хроматографии на сефадексе G-I50. В качестве маркеров использовали ферритин из селезенки лошади (450 кДа), альдолаза из мышц кролика (160 кДа), яичный альбумин (45 кДа), цитохром С (12,5 кДа) ("Sigma4, США).

Определение жирно-кислотного состава проводили методом газожидкостной хроматографии в лаборатории ООО «Финист-парфюмер» г. Воронеж.

Определение аминокислотного состава осуществляли на аминокислотном анализаторе в лаборатории массовых анализов ВГАУ им. КД. Глинки.

Определение качественного состава продуктов гидролиза проводили методом тонкослойной хроматографии (Кирхнер Ю., 1981)

Оценку интенсивности свободно-радикальных процессов осуществляли методом индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) (Кузьмина Е. И. и др„ 1983).

Определение состояния влаги в зародышах пшеницы проводили дифференциально-термическим и термогравиметрическим анализами на дериватографе "Паулик - Паулик - Эрдей" (Котова Д.Л. и др., 2002)

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента. Кинетические и регуляторные свойства липазы изучали на электрофоретически гомогенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, констант ингибирования, констант активации осуществляли по Диксону и Уэббу (Диксон, Уэбб, 1982).

Статистическая обработка материалов. Опыты проводились в 3-4 ^-кратной повторности. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизводимы в каждом опыте. Полученные данные обрабатывали с использованием статистических критериев (Ивантер Э.В. и др., 1992). Для построения графиков использовали данные, обработанные с помощью программ линейной и параболической аппроксимации. В исследованиях бьшо применено центральное композиционное рота-табельное униформ планирование (Грачев Ю.П., 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка метода получения высокоочищенного препарата липазы. Анализ литературных данных и проведенные исследования показали необходимость использования стадии обезжиривания зародышей семян пшеницы при выделении липазы. В зависимости от условий экстракции фермента, рН и температуры наблюдалось 1,5-2* -кратное увеличение его активности по сравнению с ферментным препаратом из необезжиренных зародышей. Большое влияние на экстракцию липазы из гомогената оказывал вид экстрагирующего агента, а также условия выделения. Так, кратность увеличения активности при использовании дистиллированной воды составила 1,8 раз (изменение активности с 4,72-10"3 до 8,50*10'3 мкМ/мин • мг), 50 мМ трис/НС1-буфере с 8 мМ меркаптоэтанолом - 2,1 раза (изменение активности с 6,75*10"3 до 14,18'Ю'3 мкМ/мин-мг), 0,25 М раствора сахарозы - 1,4 раза (изменение активности с 9,19-Ю"3 до 12,87-Ю"3 мкМ/мин-мг). Ферментный препарат с наиболее высокой липолитической активностью был получен в результате настаивания ацетонового порошка с экстрагирующим агентом в соотношении 1:10 при температуре 4-5 °С.

Исследование показало, что использование гель-фильтрации более предпочтительно, по сравнению с очисткой активированным углём, поскольку позволяет наиболее эффективно удалить низкомолекулярные примеси, что значительно улучшает сорбцию фермента на носителе при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - целлюлозе.

Установили, что подкисление растительного экстракта до значения рН 5,5 способствует выделению фермента с активностью 0,1 мкМ/мин. Максимальная степень очистки при использовании метода кислотного осаждения составила 3,4 раза. Степень очистки в 3,3 раза была достигнута при использовании метода фракционирования сульфатом аммония (в пределах насыщения 40-80%) в присутствии ПЭГ (мол. масса 6000 Д), Удельная активность полученного препарата составила 0,05 мкМ/мин-мг,

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе с использованием ступенчатого градиента КС1 (от 250 до 300 мМ) в трис/НС1 буфере (рН=8.0), позволила получить ферментный препарат с удельной активностью 0,13 мкМ/мин-мг. Заключительной стадией очистки стала гель-хроматография насефадексе С-150.

Изучение и оптимизация методов экстракции, а также анализ эффективности различных методов осаждения позволили разработать схему очистки, которая включала в себя следующие стадии: экстракция обезжиренных зародышей пшеницы, подкисление кислотой до рН 5,5, гель-фильтрация на сефадексе С-25, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-хромагография на С-150 (табл.1). С ломощью разработанной схемы получен ферментный препарат с удельной активностью 0,62 мкМ/мин-мг в состоянии близком к гомогенному (рис.1). Молекулярная масса, определенная методом гель-хроматографии, составила 143±2 кД (рис.2). ИЭТ, р1,5,4 ± 0,1 ед.

Определение кинетических параметров каталитического дей~ ствия липазы. Установлено, что максимальную активность фермент проявляет при температуре 37 °С и рН 8,0. ■ . : •

Изучение кислотной и термической инактивации исследовали в интервале рН 4-8,5 и температу р 20-60 °С. Показано, что при 20 °С и рН 4 за 12 ч инкубации остаточная активность составила 33,62 %, при рН 6,0 - 47,5 %, при 8,0 - 61,35 %. Повышение температуры до 60 приводило к более резкой инактивации фермента: за 1 ч инкубации при рН 4,5, 6,0, 8,0 остаточная активность составила соответственно 32,9 %, 46,5%,57%. ..

Исследование кинетики кислотной инактивации позволило; рассчитать константы скорости инактивации в исследуемом диапазоне рН и температур (табл. 2). Высокие константы скорости инактивации свидетельствуют о низкой кислотной и термической устойчивости фермента. Данные свидетельствуют, что наибольшую стабильность фермент проявляет в зоне рН 8 - 8,5 и температуре 20°С.

На рис. 3 представлены графики Аррениуса, свидетельствующие о термической инактивации липазы. В нашем случае зависимость к=/(1/Т) представляют собой ломаную линию с различными углами наклона к оси абсцисс, с отчётливым изломом в точке, соответствующей 40 "С. Судя по форме кривых, можно предположить существование двух параллельных процессов, с различными термическими коэффициентами.

Для определения термодинамических характеристик процесса кислотной и термической инактивации мы воспользовались теорией переходного комплекса и определили Еакпн энтальпию АН, свободную энергиюЛО и энтропию ¿15 этого комплекса.

Таблица 1

Очистка липазы зародышей семян пшеницы

Стадии очистки Объем франшиз см Количество белка, мг Активность Окпоъ CHilbTm Выход %

общая, мкМ-'мин удельная, мкМ/мим-мг

Экстракция 70 945,00±4,2 9,63±0.42 0,01±0,0005 1,00 100

Кислотное осаждение 6 100.50±0,5 2,03±0,09 0,02±0,0009 2,00 21,10

Гель фильтрация на сефадексе 6-25 12 95,0fa0,43 1,79±0,08 0,019*0,0009 1.90 18,60

Ионообменная хроматография наДЭАЭ-целлюлоэе 2 4,J5±0,005 0.54±0,01 0.13±0,0060 13.00 5,60

Гель—хрома-тофафня на сефадексе в-150 6 0,70*0,003 0,42±0,02 0,62±0,0300 61,10 4.40

Рис. 1. Электрофореграммы ферментных препаратов липазы зародышей пшенииы, полученных на различных стадиях очистки: а - после кислотного под-кнсления, б - после гель-фильтрации на сефа-дексе G-25, в - после гель-хроматографии на сефадексе G-150; f- фронт красителя; направление движения белка \казано стоелкой.

80 I00 I20 Объем I.HOIillH. ч.ч

Рис. 2. Определение молекулярной массы липазы зародышей пшеницы гель-хром атографическим методом на сефадексе G- 150. Маркерные белки: 1 - ферритин из селезенки лошади (450 кДа), 2 - альдолаза из мышц кролика (160 кДа), 3 - яичный альбумин (45 кДа). 4 - цитохром С (12,5 кДа).

Таблица 2

Влияние температуры и рН на константу скорости инактивации липазы зародышей пшеницы

Температура, "С К(ч")при рН

4.5 5.0 6,0 7,0 8,0 8,5

20 6,98 6.85 5,87 4,91 3,68 3,61, .

30 10,76 9.91 8,84 7,69 6,25 5,33: '

40 17,34 15,10 14,49 12,82 11,59 8.47

50 45.5 38,73 36.31 33,65 28,44 20,51 ''

60 И 7.8 99,31 89,54 82.04 65,31 47,21

Результаты расчётов представленных в табл. 3 свидетельствуют, что действие высоких температур сопровождается увеличением представленных' параметров, что свидетельствует о сложном характере инактивации. При рИ 8,0-8,5 и невысоких температурах происходит разрушение электростатических : взаимодействий, которые играют незначительную роль в формировании белковой глобулы. При более высокой температуре разрушение глобулы происходит, вероятнее всего, вследствие ослабления гидрофобных взаимодействий, и

как следствие, имеет место инактивация фермента.

В ходе исследований установлено,- что при повышении концентрации ферментного препарата скорость процесс^ липопиза возрастает.

Результаты проведенных нами опытов показали, что для описания реакции липолиза трибутирина, триолеина применимо уравнение Михаелиса-Ментен. Линерализация полученных -данных в координатах Лай-нуивера-Берка позволила определить кажущиеся константы Михаэдиса, К^ и максимальные скорости

1ЛЧ0\к

Рис. 3, График» Аррениуса для липазы зародышей пшеницы при различных значениях рН: 1 —4,5; 2 — 5,0; 3 - 6,0; 4 - 7,0; 5 - 8,0; б - 8,5.

гидролиза У1пт которые оказались равными 17 мМ и 25 мМ, 1,40 и 1,47 мкМ/мин-мг белка для триопеина и трибутирнна соответственно.

Таблица 3

Термодинамические характеристика активированного комплекса процесса термической инактивации липазы зародышей пшеницы

т,°с рН ДО* Дж • град ■ моль

кДж * моль"'

2 (МО 4,5 144,02 141,50 68,29 241,63

40-60 4,5 355,02 352,50 69,09 877.43

20-40 5,0 125.43 122,91 68,49 179.60

40-60 ' 5.0 344,64 342,12 69.52 843,96

20-40 6,0 146,33 143,81 68,27 249.32

40-60 6.0 339,30 336,78 69,70 826,87

20-40 7,0 153,30 150,78 69,13 269,50

40-60 7.0 343,60 31.08 69,90 839.57

20-40 8,0 181,16 178.64 69,66 359.70

40-60 8.0 323,20 320,78 70,35 778,33

20-40 8,5 134,80 132,28 70.06 205,35

40-60 8,5 318.04 315,52 71,23 756,32

Обнаружено, что наблюдается падение ферментативной активности за счёт субстратного ингибирования: при концентрации триопеина свыше 15,00 мМ (Кя=28,50 мМ), при концентрациях трибугирина свыше 20,00 мМ (Кй=20,50 мМ). Динамика гидролиза ТАГ оливкового масла, синтетических ТАГ показала, что интенсивность накопления жирных кислот достаточно высока в интервале 600-650 мин протекания ферментативной реакции. Уменьшение скорости реакции наблюдается при достижении их уровня до 240 мМ, что обусловлено нестабильностью фермента, ингибирующим действием жирных кислот. По всей видимости, абсорбируясь на субстрате, жирные кислоты пространственно и электростатически препятствуют доступу фермента к его поверхности. Исследование степени ингибирования липазы жирными кислотами показало, что жирные кислоты являются неконкурентными ингибиторами. Степень ингибирования возрастала с увеличением концентрации последних в реакционной среде (табл. 4).

Изучено также влияние ионов металлов (табл. 5) и солей желчных кислот на активность липазы. Активирующее действие при всех исследованных концентрациях отмечено лишь для ионов Са2\ причем с повышением концентрации ионов в растворе активирующее действие усиливалось, константа активации составила 5,1 мМ. Внесение солей

желчных кислот (холат натрия и дехоксихолат натрия) в реакционную смесь в концентрациях выше 20 мМ тормозило процесс липолиза. Вероятно, данные концентрации достаточно велики для раствора липазы, превышают критическую концентрацию мицеллообразования.

Таблица 4.

Кинетические характеристики гидролиза триолеина липазой зародышей пшеницы в присутствии олеиновой кислоты

Субстрат К^мМ К5;, мМ У,,,,,, МКМ/МНН'МГ

трнолейн 17,05*0,82 28,55±Г,40 1,43 ±0,04 5 ■

триолеин+0.1 мМ олеиновая кислота 8.00±0,38 32,97±),60 0,70±0,018

триолеин+0,2 мМ олеиновая кислота 5,00±0,23 37,03±2,50 0,50±0,015

Таблица 5

Влияние ионов некоторых металлов на активность липазы

Ферментативная активность (% от контроля) при различных концентрациях ионов металлов

Ионы

Ю'1 М

Си К+ Мп1*

мг*

о?*

СЯ1* г<

Са

5п4+

Ва1'

Ре^

Ш2*

РЬН

93,60

75,50

126,90

119,10

94,60

89.10

84,80

104,95

100,00

69.02

84.00

92,02

93.60

87,07 79,70 84,90 108,8 92,54 89.00 89,60 107,10

98.11 67,50 80,00

87.12 78,70

34.25 91,44

78.18 91,44 87,00 89,00 89,10 121,38

96.19 62,02

76.20 87,00 63,00

Специфичность действия липазы, В ходе нашей работы исследована кинетика действия и субстратная специфичность липазы по отношению к природным и синтетическим субстратам. Интенсивность липолиза природных субстратов уменьшается в ряду; ТАГ рыбьего жира> ТАГ масла из зародышей семян пшеницы>ТАГ подсолнечного маслят А Г оливкового масла> ТАГ льняного масла > ТАГ кукурузного

■ масла>ТАГ касторового масла. Определены К™ и гидролиза иссле-'Йуемых субстратов с помощью метода двойных обратных координат '' (табл:;б); ^ -

'' ■' Таблица 6

' -Кинетические характеристики гидролиза природных субстратов липазой зародышей пшеницы

Триглицериды КтмМ V™,,,, мкМ/мин-мг

оливкового масла 14±0.65 0,83±0,04

подсолнечного масла 13 ±0,60 1,16*0,05

кукурузного масла 50±2,20 2,00±0,08

льнянбгй масла- №0,77 0,67±0,03

горчичного масла 9±0.41 0,51 ±0,02

касторового масла М3±5,55 2,50±0,12

1 рыбьего жира 6±0.24 0,80±0,03

масла'зародышей семян пшеницы 11 ±0,50 0,48±0.02

у Исследование активного центра липазы. Нами была предпринята попытка.изучить активный центр фермента н представить в виде рабочей ги-, лотезы элементарный акт реакции, ведущий к разрыву сложноэфнрноп связи. Дад решения поставленной задачи использовали методы идентификации диссоциирующих групп активного цекгра фермента, а также методы модифика-циц:аминокислотных остатков в присутствии специфических реагентов.

... Предварительный анализ зависимости У~/(рН) показал, чторК, и . рК<, оказались равными 6,69 и 8,20 соответственно, что, предположительно, соответствует рК имидазольной группы гистидина и рК гидро-ксильной группы серина. Рассчитанные теплоты ионизации этих групп подтвердили это предположение (табл.7).

■ ■ Таблица 7.

, ЗависимостьрК=/(Т) восходящей и нисходящей ветвей кривой У=/(рН)

т,к Восходящая ветвь кривой Нисходящая ветвь кривой

рК, ДН, кДж'Моль"1 рКг ДН, кДж-моль'1

278 6,60 8,60

293 6,90 31.18 8,00 5,80

303 6,95 8,10

310 6,50 40,92 8.10 6,90

313 6,50 8.10

Ср: значение 6,69 36,05 8.20 6.40

Рис. 4. Динамика фотоинактивации липазы зародышей семян пшеницы (рН 8,0; 37 °С): 1 - без нетиленового синего на свету, 2-е метиле новым синим в темноте. 3 — с метиленовым синим на свету.

0,3

0,25 - ■

0,008 0,012

0,0 ¡6 о [ЭДТА), мМ

!0 20 (Са'*1. мМ

Рис. 5. Влияние концентрации ЭДТА на скорость гидролиза ТАГ оливкового масла липазой зародышей семян пшеницы. Стрелкой указан момент начала реактивации при

ПР.ЙГТВНИ ипнпв Слг*.

Фотоинактивация в присутствие метапеновой сини, а также модификация ди-этилпирокарбонаггом подтвердила наличие имвдазола гас-тидина в активном центре фермента (рис, 4). Модификация с помощью фенилметил-сульфонилфгорида подтвердила наличие ОН-группы се-рина в активном центре фермента, Парахлормеркурибен-зоат натрня не влиял на ферментативную активность что, по-видимому, указывает на то, что SH-группы не принимают непосредственного участия в акте катализа, Ингибирование ферментативной реакции при использовании модификатора дециклогексилкарбодии-мида послужило основанием для утверждения о присутствии карбоксильной группы в активном центре фермента.

Исследование воздействия ЭДТА говорит об участии ионов двухвалентных металлов в катализе. Используя ТАГ оливкового масла, рассчитаны некоторые кинетические параметры: V^ и Кщ для фермента в отсутствии ЭДГА равна 0,77 мМ/мин-мг и 11,77 мМ, VireK и Кпв присутствии ЭДГА 0,278 мМ/мин-мг и 10,00 мМ, соот-

ветственно. При внесении раствора СаСЬ отмечали реактивацию, частичное восстановление активности, что позволило предположить, что в активном центре, либо в непосредственной близости от него, по всей видимости, присутствуют ионы этого металла (рис.5).

Анализируя полученные данные, нами было сделано заключение, что в обеспечении каталитической активности липазы зародышей пшеницы активное участие принимают следующие группы: имидазольная группа гистидина, гцдроксильная труппа серина, карбоксильная группа аспараги-новой либо глютаминовой кислот. Показано участие ионов Са2*в катализе.

В представлениях о механизме разрыва сложноэфирных связей между глицерином и жирными кислотами мы исходили из принципа ориентированной сопряженной атаки нуклеофилъной и элеетрофильной групп находящихся в активном центре. По всей вероятности, в каталитически активной паре гидроксшьимидазол гидроксильная группа выполняет роль нуклеофила, а имидазольная группа выполняет функцию электрофильной, прогондонор-ноЙ группы. Мы предполагаем, что механизм разрыва сложнозфирной связи в молекуле триглицерида происходит лотрёхстадшшой схеме: ацелнрование, которому предшествуют адсорбция фермента на поверхности субстрата и образование фермент субстратного комплекса, стадия образования ацилфер-мента и стадия деацилирования, проходящая с участием "системы с переносом заряда" (рис.6). Выделившиеся жирные кислоты, по всей видимости, связывается ионами Са2+, тем самым ускоряется каталитический оборот, л Разработка рационального метода хранения зародышей семян пшеницы. На основании изученных свойств фермента нами были разработаны и оптимизированы способы стабилизации биохимического состава зародышей пшеницы при хранении. В качестве стабилизирующих факторов использовали антиокислителъкую способность аскорбиновой кислоты и тепловую обработку с использованием осциллирующих режимов. При разработке режимов хранения в качестве основных факторов, влияющих на качество продукта, были выбраны: влажность зародышей семян пшеницы, относительная влажность окружающего воздуха, температура окружающей среды.

При использовании аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта было исследовано её влияние, при различных концентрациях, на стабильность зародышей при хранении. В результате обработки экспериментальных данных бьшо получено уравнение регрессии, которое позволяет с достаточной точностью для инженерных расчётов получать значения концентрации аскорбиновой кислоты в зависимости от конкретных условий хранения.

А»р«31ц X "О

1 ' '■ч/

1П5

О II

И—С—О-1

К

О '!

в

о и

в —с—о

.V0

г

I

гР

♦ н»0

с-о —| ° сн,-он

Рис. 6. Гипотетический механизм каталитического действия липазы зародышей пшеницы: а-стадия адсорбции фермента на субстрате; .

б - стадия образования фермент-субстратного комплекса, ацилирования (1 тетраэдри ч е с к и й комплекс); в - стадия образования ацйлфермента; ;

г - стадия деацилирования (2 тетраэдр нч ее кий комплекс).

Основными критериями оценки при исследовании эффективности представленных способов были выбраны кислотное и пероксидное число. Эффективность метода была доказана также методом индуцированной хемилюминесценции, позволившей оценить общую интенсивность свободно-радикальных процессов протекающих в зародышах семян пшеницы в процессе хранения при различных условиях (табл.8). Снижение темпов СРО было сопряжено со снижением активностей липазы и липокснгеназы.

Таблица 8

Определение интенсивности свободно-радикальных процессов в зародышах пшеницы при хранении

Вариант продукта Показатели хемилюминесценции при хранении зародышей пшенииы

Светосумма вспышки (Я мВ-с) Интенсивность максимальной вспышки (]ти. мВ) Тангенс угла наклона кинетической кривой (1»а, мВ'с)

1 мес. | 2 мес. I мес. | 2 мес. 1 мес. | 2 мес.

Саежевыработанный ЗП" 2.09 0,16 0,09

условия холодильной камеры

ЗП (контроль) 4,41 16,59 0.29 0,30 0.11 0.20

ЗП+ 5% аскорб. кислоты 3,16 7.70 0,22 0,25 0,12 0.31

ЗП+ 13% аскорб. кислоты 1,04 3,67 0,16 1 0,16 0.13 0,34

условия термостата

ЗП (контроль) 7,87 27,41 1,01 1.10 0,16 0,16

ЗП+ 5% аскорб. кислоты 4,70 10,28 0,72 0.86 0,20 0.28

ЗП+ 13% аскорб. кислоты 2,60 4,88 0.59 0,71 0,31 0.30

условия склада

ЗП (контроль) 5.08 19,79 0,31 0,48 0.19 0.17

ЗП+ 5% аскорб. кислоты 3,89 4.82 0.26 0,40 0.22 0.20

ЗП+ 13% аскорб. кислоты 2,58 3,99 0,16 0.20 0,33 0,30

* - показатели ХЛ при закладке на хранение

Проведенные исследования, а также анализ литературных данных показали, что пшеничные зародыши сохраняют своё качество в течение длительного времени, если их влажность сохраняется на уровне 2,5 - 3 %. В связи с этим, нами были проведены исследования по изучению кинетики термолиза зародышей пшеницы для подбора рациональных режимов термообработки. С помощью дифференциально-термического и термогравиметрического методов анализа было установлено, что большая часть воды в зародышах пшеницы приходится на физнко-механически связанную влагу (50 - 55 %), фи-

зико-химически связанная влага составляет 26 - 36 % и лишь только 14-15 % является химотески связанной, В связи с этим, подобраны методы тепловой обработки зародышей пшеницы: подсушка при температуре сушильного агента (горячего воздуха) 55 - 65 "С (продолжительность 8 -10 мин, промежуточное охлаждение до температуры 0 - 5 °С (продолжительность 7-10 мин) и досушка нагретым воздухом с температурой 145- 150 °С (продолжительность 5 -6 мин). При использовании такой термической обработки сохранение биохимического состава, пищевой ценности продукта достигается за счёт более щадящих температурных воздействий (температура внутренних слоёв продукта на любой стадии не превышает 60 °С) в течение коротких интервалов времени. Изменения показателей химического состава на различных стадиях тепловой обработки представлены в табл. 9, Остаточная активность липазы и липокси-геназы на различных стадиях тепловой обработки следующая: 1 -65 и 50 %, 245 и 30 %, 3 -10 и 3 %, соответственно. Эффективность способа стабилизации доказана в лабораторных и производственных условиях (табл. 10).

Таблица 9

Изменение химического состава зародышей семян пшеницы на различных стадиях термической обработки

Показатели Сырые ЗП Химический состав на каждом этапе термической обработки

нагрев охлаждение нагрев

Общ. белок, % на сух. вв. 35,30Ы,7 34,50±1.68 34,50*1,68 34,00*1,51

Жггр, % на сух. вв. 9,30±0,40 9,80±9.80 9,8СВД,43

Общие сахара, % на сух. вв. 12,80±0.62 13,10*0.62 13,10*0,62 14,30±0,67

Витамины гр. Е, мг% 16,48±0,80 16,46±0,80 16.46±0.80 15,90±0,78

Таблица 10

Оценка качества зародышей пшеницы при хранении

Покататель Вариант Время хранения, сут

0 20 40 60 80 100

Влажность, % контроль ОПЬГГ 14.10 4,10 14,12 4,П 14,15 4,13 14,35 4,25 14,50 4,35 14.50 4,40

Пероксидное число, мМ/кг контроль опыт зио зио 67,56 31,80 98,41 32.60 145,80 32,80 1Ш0 34,20 164.50 35,00

Кислотное число, мг КОН контроль опыт 5.30 5,30 8,68 5.50 11.92 5,65 15,60 5.80 18,38 6,00 19,7 6.10

' Применение стабилизированных зародышей пшеницы. Ценность полученного стабилизированного зародыша пшеницы доказана при производстве мучного кондитерского изделия. Разработана рецептура и выработано мучное кондитерское изделие с использованием стабилизированных зародышей пшеницы.. А пробирование предложенной технологии в лабораторных и производственных испытаниях показало целесообразность её промышленного внедрения.

Общие выводы

1. Разработана схема очистки и получен гомогенный препарат липазы зародышей семян пшеницы с удельной активностью 0,62 мкМ/мин'мг и 61-кратной степенью очистки. Выход ферментного препарата составил 4,4 %.

2. Молекулярная масса фермента 143 кД, ИЭТ=5,4, рН и температурный оптимумы составили 8,0 и 37 °С, соответственно.

3. Исследования специфичности действия липазы показали, что интенсивность липолиза природных и синтетических субстратов уменьшается в ряду: ТАГ рыбьего жира> ТАГ масла из зародышей семян пшеницы >ТАГ подсолнечного маслайТАГ оливкового маслам триолеин >ТАГ льняного масла>трибутирин >ТАГ касторового масла. Определены К^ и У(па, гидролиза исследуемых субстратов.

4. По-видимому, фермент проявляет большее сродство к субстратам, жирно-кислотный состав которых представлен приемущественно ненасыщенными жирными кислотами: олеиновой, линолевой, линоле-новой. Данные качественного анализа тонкослойной хроматографии показали, что основными продуктами 60 мин гидролиза были жирные кислоты, а также диглицериды.

5. Ионы Са2* оказывают активирующее действие. Ингибиторами ферментативной активности являются продукты реакции - жирные кислоты, глицерин, а также холат и дезоксихолат натрия (в концентрациях выше 20 мМ), ионы К\ Мп1+, Си21".

;6, Идентифицированы функциональные группы активного центра липазы зародышей пшеницы: имидазольная группа гистидина, гидро-ксильная группа серина, карбоксильная группа аспарагнновой, либо глютаминовой кислот. Показано участие ионов Саг+ в катализе.

7. Предложен гипотетический механизм действия фермента, согласно которому каталитический акт липолиза происходит по трёхстадийной схеме с участием "системы с переносом заряда".

8. С учётом каталитических свойств фермента разработаны способы стабилизации биохимического состава зародышей пшеницы при хранении, основанные на применении обладающей антиокислительной способностью аскорбиновой кислоты, а также тепловой обработки с использованием осциллирующих режимов.

9. Уменьшение пероксидного числа и изменения параметров био-хемилюминесценции при хранении зародышей пшеницы с помощью разработанных методов в сравнении с контролем: снижение светосум-мы (S) и интенсивности максимальной вспышки (Imaii), возрастание тангенса угла наклона (tga) кинетической кривой, свидетельствуют об эффективности предложенных способов стабилизации. Торможение процессов свободнорадикального окисления было сопряжено со снижением активностей липазы и липоксигеназы,

10. Разработана рецептура и выработано мучное кондитерское изделие с использованием стабилизированных зародышей пшеницы. Апробирование предложенной технологии в лабораторных и производственных испытаниях показало целесообразность её промышленного внедрения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Капранчиков B.C. Некоторые физико-химические свойства растительных липаз (обзор) / B.C. Капранчиков, H.A. Жеребцов // Материалы XXXIX научной отчётной конференции за 2000 год. - Воронеж.-2001.-Т. 1. - С.72-73

2. Жеребцов H.A. Получение препарата липазы зародышей пшеницы / H.A. Жеребцов, B.C. Капранчиков // Материалы XL научной отчётной конференции ВГТА за2001 год. - Воронеж.-Т. 1.-С.129

3. Капранчиков B.C. Липаза зародышей пшеницы: выделение и очистка / B.C. Капранчиков, Т.Н. Попова, H.A. Жеребцов // 6 - я Пу-щинская школа-конференция молодых учёных "Биология - наука

• XXI века", г. Пущино, 20-24 мая 2002 г. - Пущино. - 2002. - Т.1. ~ С.251

4. Жеребцов H.A. Обоснование выбора режимов обработки и хранения зародышей пшеницы / H.A. Жеребцов, Т.Н. Зяблова, B.C. Кап-

ранчижов // Международная конференция молодых учёных "От фундаментальной науки - к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии" г. Тверь, 15 ноября 2002 г. "Тверь. - 2002. -Вып,2. - С.105-106

5. Корнеева О,С. Пшеничный зародыш: первопричины порчи i О.С. Корнеева, Т.В. Зяблова, B.C. Капранчиков // Хлебопродукты. -2003. -№i. - С.24-25

6. Капранчиков B.C. Некоторые физико-химические свойства липазы зародышей семян пшеницы / B.C. Капранчиков //7-я Пущинская школа-конференция молодых учёных "Биология - наука XXI века", г. Пущино, 14-18 апреля 2003 г. - Пущино. - 2003.-С.337-338

7. Капранчиков B.C. Идентификация каталитически активных групп липазы зародышей пшеницы / B.C. Капранчиков, Т.Н. Попова II Материалы ХИ научной отчётной конференции ВГТА за 2002 год. - Воронеж. - 2003. - Т. 1. - С. 106

8. Капранчиков B.C. Влияние pH и температуры на активность и устойчивость липазы зародышей пшеницы / B.C. Капранчиков, H.A. Жеребцов, Т.Н. Попова Н Хранение и переработка сельхозсыръя. -2003. - №4. - С.56-58

9. Шевцов A.A. О возможности использования зародышевых хлопьев пшеницы в промышленности / A.A. Шевцов, Т.Н. Попова, A.C. Шамшин, B.C. Капранчиков /I Инф. бюллетень Агробизнес и пищевая промышленность. - 2003. - №5, - С,51

10. Шевцов A.A. Использование д ифференциапь но-тер м ичес ко го и гер-могравиметрического анализов при оценке состояния воды в зародышевых хлопьях / A.A. Шевцов, ИВ. Кузнецова, A.C. Шамшин, B.C. Капранчиков, J1.H. Толстихина // Хранение и переработка сельхозсыръя. - 2003. - №9. ~ С.49-51

11. Шевцов A.A. Оптимальный выбор скорости сушильного агента при изотермической сушке в сушилках с тепловым насосом / A.A. Шевцов, A.C. Шамшин, B.C. Капранчиков // Международная научно-практическая конференция «Актуальные направления развития экологически безопасных технологий производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции», Воронеж: ВГАУ. -Воронеж. - 2003. -Т.2. - С. 148-151

s 2 о 1 9 z

12. Зяблова Т,В. К вопросу- о стабилизации качества зародышевых хлопьев пшеницы при хранении / Т.В. Зяблова, B.C. Капранчиков, A.C. Шамшин //Международная научно-практическая конференция «Актуальные направления развития экологически безопасных технологий производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции», Воронеж: ВГАУ. - Воронеж. - 2003. - Т.2., 4.2. -С 79-82

13. Шевцов A.A. Осциллирующий режим сушки - как способ стабилизации качества зародышевых хлопьев пшеницы при хранении / A.A. Шевцов, A.C. Шамшин, B.C. Капранчиков // Сб. науч. трудов "Технология и техника пищевых производств: итоги и перспективы развития на рубеже XX и XXI веков " посвященный 300-летию Санкт-Петербурга. - Санкт-Петербург, - 2003. - С.92-95

14. Капранчиков B.C. Некоторые физико-химические свойства липазы зародышей семян пшеницы ( B.C. Капранчиков, Т.Н. Попова, H.A. Жеребцов // Биотехнология. - 2003. -№5. - С.44-52

15. Капранчиков B.C. Препаративное получение и характеристика липазы зародышей пшеницы (Trhicum aestevum)! B.C. Капранчиков. H.A. Жеребцов, Т.Н. Попова // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - №1. - С.98-103

Подписано в печать 19.! [.2003 Формат бум. 60x90 1/!6 Бум. для ^ш. im. Усл. П л. 1.0 Тираж 100 заказ

394055. Воронеж, пр. Революции 19, ВГТА ОПиТС