Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конформационный анализ структур ДНК с параллельной ориентацией цепей

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конформационный анализ структур ДНК с параллельной ориентацией цепей"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им В.А. Энгельгардтз

На правах рукописи

УДК 577.323

лысов

Юрий Петрович

КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУР ДНК С ПАРАЛЛЕЛЬНОЙ ОРИЕНТАЦИЕЙ ЦЕПЕЙ

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук в виде научного доклада

Москва - 1992

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. ВЛ. Энгсльгардта РАН

ОФяаиальнмс оппоненты:

Н.С. Андреева, дохтор физико-математических наук, профессор, Э.И. Будооссий, доктор химических наук, профессор, В.И. Лалтее, доктор физико-математических наук.

Ведущая пдганизапия:

Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится -ж- 1992 г. > ш час ва заседании

Специализированного совета Д 002.79.01 по защите докторских диссертаций при Институте молекулярной биологии им. ВЛ. Энгсльгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В Л. Энгсльгардта РАН

Автореферат разослан

& • 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

/ А.М. Кридьга

Актуальность проблемы. Вопрос о том, могут ли образовываться структуры ДНК: с-; {гараллельной ориентацией сахарофосфатных цепей, возник сразу после ; сообщения Уотсона и Крика о строении ДНК. Вначале споры велись о том, какая верной - с параллельными или антипараллелышмк нитями. Однозначное доказательство аятипараллельности нитей было получено в 1961 г. Джоссе и соавт. Затем всесторонне изучали "канонические" А- и В-формы ДНК. Со временем нарастал интерес к иным формам, которые, отличаясь от канонических, могли бы играть роль в биохимических процессах.

После того как было показано, что химически модифицированные олиго-нуклеотиды (либо природные, но в условиях, далеких от физиологических) могут образовывать дуплексы с параллельным направлением цепей (параллельные дуплексы), возник вопрос, существуют ли в условиях, близких к физиологическим, природные олигодезоксирнбонуклеотиды, образующие дуплексы с параллельной ориентацией цепей. Немалую роль в увеличении интереса к этому вопросу сыграла работа Паттабирамана, который предложил непротиворечивую пространственную структуру двойной спирали с параллельными нитями.

Начав наше исследование с доказательства существования параллельной спирали с АТ-спариванием оснований, мы перешли к более детальному изучению параллельных спиралей, сосредоточив основные усилия на конформацнонном анализе. Такое исследование позволяет выявить структурные и термодинамические различия параллельных и антипараллельных спиралей. С другой стороны, появляется основа для понимания особенностей строения как тройных спиралей, так и других комплексов с более чем двумя нитями, среди которых обязательно присутствуют две нлтн с параллельной ориентацией.

Цель работы состояла а решении следующих задач:

1. Разработка алгоритмов, позволяющих производить поиск оптимальных конформаций ДНК для различных вариантов спаривания оснований с произвольной ориентацией цепей.

2. Конформационный анализ параллельных спиралей ДНК с учетом различных вариантов регулярности последовательности оснований.

3. Изучение участия параллельных спиралей в образовании четырехцепочеч-ных структур.

4. Конформационный анализ четырехцепочечных спиральных комплексов ДНК.

5. Выбор моделей и подготовка программ для расчета термодинамики образования структур ДНК с параллельной и антипараллельной ориентацией сахарофосфатных остовов.

6. Сопоставление результатов информационного анализа с полученными ранее экспериментальными данными о влиянии связывания лигандов на образование структур ДНК с параллельной ориентацией сахарофосфатных остовов.

7. Анализ частоты встречаемости в банке природных нуклеотидиых последовательностей регулярных участков, склонных к образованию различных неканонических структур.'

Научная новизна и практическая ценность. Проведенное всестороннее изучение образования параллельных спиралей существенно расширило представления о конформационных возможностях ДНК. При этом было выяснено, что существенно различаются основные геометрические и термодинамические особенности образования антипараллельных и параллельных структур.

Проведенный конформационный анализ структур с параллельной ориентацией цепей является основой для постановки последующих экспериментов и их интерпретации.

Полученные данные о ДНК с параллельной ориентацией цепей оказываются важной составной частью понимания структурных особенностей комплексов ДНК. Это в первую очередь относится как к активно изучаемым в настоящее время во многих лабораториях мира тройным спиралям, так и х четверным спиралям, интерес к которым в последнее время все возрастает. Настоящая работа предоставляет уникальную информацию о состоянии параллельных нитей, входящих в эти комплексы.

Данное исследование показывает, что большего внимания заслуживают структуры, отличающиеся от канонических, так как они могут исполнять существенные функции, обеспечивающие ряд специфических особенностей различных участков ДНК. Полученные результаты указывают на то, что следует внимательнее и с разных точек зрения посмотреть на те участки генома, которые способны образовывать неканонические структуры.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались иа ряде семинаров ИМБ и ИМГ РАН, на Всесоюзном рабочем совещании по органической химии дуплексов нуклеиновых кислот (Киев, 1989 г.>, ва Расширенной научной сессии "Конформации и функции биологических молекул" (Рига, 1989 г.), на Советско-итальянском симпозиуме "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Катания, 1990 г.), на Всесоюзной конференции по конформациям биополимеров в растворе (Тбилиси, 1990 г.), на Всесоюзных Эигельгардговских чтениях (Москва, 1990 г), на советско-индийском симпозиуме (Дели, 1990 г.), на симпозиуме по проблемам синтетических олигонуклеотидов (Москва, 1991 г. ).

Структура работы. Диссертация изложена в настоящей работе в форме научного доклада, содержит 7 таблиц и 14 рисунков. По материалам диссертации >пуйликоваиа 21 работа.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конформационный анализ олигонуклеотидов и одноцепочечных спиралей

Для изучения конформационных возможностей олигонуклеотидов в настоя-цее время используется широкий набор экспериментальных методик, каждая из соторых в отдельности дает не вполне однозначно интерпретируемую информа-дею, и только их разумное сочетание позволяет получить общее описание допустимых конформаций. Даже рентгеноструктурный анализ, являющийся наиболее трямым методом, требует сопоставления различных моделей, предоставляя при этом лишь данные о геометрии в кристалле, которая может существенно отли-1атьса от оптимальной геометрии в растворе.

Уникальную информацию о поведении полинуклеотидов позволяют полечить динуклеотидмонофосфаты. Именно они обладают максимальными конфор-иационными возможностями в ряду олигонуклеотидов, именно в динуклеотидах ?етко проявляется зависимость конформационных свойств от нуклеотидной по-¡ледовательности, именно динуклеотиды являются наиболее удобным объектом щя создания подходов к исследованию, объединяющему различные методики.

Мы предприняли попытку определить геометрию всех закрытых конформе-?ов, которые реализуются в растворе динуклеозидмонофосфатов. Закрытыми мы называем кокформеры, отличающиеся сгэкинг-взаимодействием нуклеиновых ос-кований. Именно такие состояния являются основным элементом, формирующим различные варианты двойных спиралей. В качестве объектов исследования были выбраны АрА, АрС, СрА и СрС. Эти четыре димера моделируют пурин-пурино-вый, пурин-пиримидиновый, пиримидин-пуриновый и пиримидин-пиримидино-зый контакты одноцепочечных полинуклеотидон. Экспериментальной основой идя анализа послужили скорости спин-решеточной релаксации протоков и кон-гганты скалярного спин-спинового взаимодействия 3./нн и Эти параметры

были выбраны из богатого арсенала ЯМР, поскольку и скорости спин-решеточной релаксации и константы спин-спинового взаимодействия поддаются количественному теоретическому расчету. Первые - на основе хорошо разработанной, изящ-

ной теории релаксационных процессов, вторые - на основе обширной эмпирики в рамках классического или модифицированного уравнения Карплюса. Очень важен и тот факт, что эти два параметра совершенно по-разному "видят" геометрию молехулы. Если вицинальиые константы спин-спинового взаимодействия зависят в основном от величины двугранного угла между взаимодействующими спинами, то скорости релаксации определяются расстояниями от исследуемого спина до всех остальных. Такая "независимость" экспериментальных параметров, безусловно повышает достоверность проведенного анализа.

Для достижения поставленной цели необходимо было последовательно решить ряд задач:

1) экспериментальное определение параметров ЯМР (в данном случае это константы спин-спинового взаимодействия и скорости релаксации) в зависимости от температуры;

2> определение независимым методом термодинамических параметров равновесия открытое сотояние "—• закрытое состояние;

3) "приведение" экспериментально определенных параметров ЯМР к закрытому состоянию (расчет параметров закрытых к он фермеров в соответствии с моделью двух состояний);

4) определение геометрии всех стерически разрешенных закрытых конфор-меров;

5) расчет теоретически ожидаемых параметров ЯМР для всех возможных закрытых конформеров;

. б) определение компонентов закрытого состояния и их относительного веса путем сравнения приведенных экспериментальных параметров с теоретически ожидаемыми.

Используя экспериментальные результаты, о которых идет речь в пунктах 1) и 2), мы провели детальный конформационный анализ динуклеозидмонофос-фатов. В этом расчете в качестве параметров, определяющих геометрию, были выбраны двугранные углы, а в силу высокой подвижности фосфатной группы, мы рассмотрели лишь два равновесных состояния фуранозных циклов - С2'-эндо и СЪ'-эндо. Для полученных конформеров в соответствии с ранее описанными подходами были рассчитаны теоретические значения скоростей релаксации и константы спин-спинового взаимодействия. Определенный таким образом набор параметров использовали в процедуре оптимизации, позволившей найти набор конформеров, наилучшим образом описывающих экспериментальные данные.

В табл. 1 приведены результаты исследования, позволившие дать описание конформационной ситуации в водном растворе дияуклеозидмонофосфатов. Здесь и дх!ее при определении параметров спиралей нуклеиновых кислот и сахарофос-

Таблица 1

Состав закрытого состояния СрС, СрЛ, ЛрС в ЛрЛ в водном растворе при рН 7 *.

Дкнукле-отад Относ, вес, % ДО", ккал/ моль ДЕ~. ккал/ моль Тип ста книга Саха-ра Двугранныые углы, гоал

XI е 1 а Р У хг

СрС 76 0,0 1.9 рьа 3-3 198 223 298 288 178 57 192

14 1,0 2.9 м"> 3-3 209 187 57 77 193 74 225

10 1.2 0,0 мы> 3-2 219 193 58 152 152 53 112

СрА 60 0,0 0,4 рЬ» 3-3 203 215 299 283 180 59 198

16 0.8 0,3 рЬа 3-2 214 195 285 286 188 71 252

3 1.8 и рЬ» 3-2 204 201 293 156 224 180 206

12 1,0 1,2 м№ 3-2 219 193 57 155 152 53 225

9 1.1 1.7 мьь 3-3 217 193 62 75 196 71 185

75 0,0 0.0 рЬа 3-3 182 224 298 288 179 55 194

АрС 7 1.4 0.7 рЬа 3-2 180 218 298 291 180 75 215

'7 1.4 1.6 мЬЬ 3-3 223 179 46 92 187 66 186

6 и 0,6 мьь 3-2 226 189 56 153 152 54 211

5 1.6 1.2 м»ь 3-2 36 192 65 150 153 58 226

50 0,0 0,0 рЬ» 3-3 189 212 298 283 181 61 198

6 1,3 0,6 рЬа 3-2 183 213 298 289 181 77 218

АрА 5 1,4 1,2 рЬ* 3-2 188 192 285 168 221 172 200

6 1.3 0,6 М1* 3-3 . 278 188 276 279 176 57 275

8 1,1 1.1 МаЬ 3-3 33 187 60 85 195 70 216

* В таблице представлены лишь основные конформеры АрА, присутствующие в растворе.

** Энергия, рассчитанная в соответствия с Больцмановским распределением. *** Получена из конформационного расчета энергий.

"" 2 - С2'-эндо-, 3 - СЗ'-змдо-конформации Сахаров (конформационныб расчет динуклеотидов проведен в модели двух жестких конформаций сахара).

фатного остова мы используем обозначения, предложенные Ди-керсоном на конференция в Кем- . бридже в 1988 г.

Учитывая стереохимическую неэквивалентность сторон нуклеинового основание, необходимо качественно описать направление нормали к основанию по отношению к оси спирали. Такое описание основано на предложенной нами "¿¡¿"-номенклатуре. Стороны нуклеиновых оснований мы обозначаем V и "Ь", при этом стороной "а" называется та, при взгляде на которую обход атомов N1, Сб и С2 в случае пиримиди-нов и N9, С8 к С4 в случае пуринов осуществляется против часовой стрелки (рис. 1). Используя предложенную номенклатуру, мы можем указать стороны оснований, находящиеся в стэкинг-взаимодействии, а также правую (Я), либо левую (М) закрученность рассматриваемого участка, что в целом дает тип сгэкинг-вза-имодействия.

- Остановимся на основных результатах данного этапа исследования, которые необходимы при изучении спиралей с параллельной ориентацией цепей.

Согласно табл. 1, в растворе всех динуклеозидмояофосфатов преобладает "канонический" правозакрученный Р^-конформер, геометрия которого очень сходна с геометрией фрагмента В-формы ДНК. Обе нуклеотидные единицы этого коиформера имеют ак/яи-конформацюо нуклеинового основания и СЗ'-эндо-хон-формащпо рибозяого цикла, /ош'-коиформация относительно Р-05'- и Р-ОЗ'-связи (углы а, ?) определяет геометрию фосфатной группы. Величина угла с (СЗ'-ОЗ'-связь) лежит в пределах 212-224*. И, наконец, связи 05'-С5' и С5'-С4* находятся в транс- и гош+-конформации, соответственно. Угол спирального закручивания (О) изменяется от 46 для АрА до 54* для АрС. Угол спирального закручивания для наблюдаемых одноцепочечных закрытых хонформеров заметно выше, чем для двухцепочечных (обычно 30-40"), что обеспечивает лучшее перекрывание оснований и большую энергию сгэкинг-взаимодействия.

Второй особенностью, общей для всех изученных динуклеозидмояофосфатов, является наличие в равновесной смеси неканонических закрытых конформе-ров. Этн минорные компоненты равновесия представляют особый интерес.

поскольку позволяют оцепить конформационные возможности полинуклеотидов. Среди свойств таких неканонических конформеров следует отметить следующие: а) возможность образовывать как лево-, так и правозакруяенные структуры; б) реализуемость в растворе структур с различными типами стэкинг-взаимодействия оснований; в) присутствие в равновесной смеси конформеров с различными комбинациями С2'-зндо- и С3'-з«до-конформаций Сахаров; г) наличие в растворе структур с различной геометрией сахарофосфагного остова, среди которых особо отметим тракс-конформацию С4'-С5'-связи, предложенную еще в первых работах Уотсона и Крика.

Естественным продолжением предыдущего этапа работы был конформаци-ошшй анализ одноцепочечных регулярных спиралей, который выявил широкий набор как регулярных, так и бирегуляряых структур (единица повторяемости -динуклеотнд) с низкой энергией. Отметим, что и для таких спиралей не всегда оптимальными являются углы В-формы ДНК, хотя многие из таких нетрадиционных наборов возможны только в одноцепочечных структурах, а образование на их основе двойных спиралей невозможно по стерическим причинам. Примечательно, что для одноцепочечных структур (в силу малых ограничений на расположение оснований) обнаруживается широкое разнообразие форм даже в случае использованных нами жестких хонформаций сахара. В дальнейшем после уточнения соответствующих параметров, проведенного совместно с Журкиным, все конформационные расчеты проводились нами в модели гибкой конформации фуранозных циклов, так как в случае двойных спиралей напряжения фосфатного остова требуют большей подвижности Сахаров.

Анализ полученных результатов позволяет высказать очень важное предположение. С одной стороны, каноническая правозакрученная форма реализуется для любой нуклеотидной последовательности и конформационные параметры этой структуры слабо зависят от нуклеотидной последовательности, с другой - возможность реализации неканонических конформаций в значительной степени определяется нуклеотидной последовательностью.

Таким образом, различные специфические последовательности нуклеиновых кислот будут иметь близкие по геометрии канонические структуры, но принципиально различающиеся неканонические конформации. Такое различие может быть основой белково-нуклеинового узнавания. И хотя в растворе неканонические конформации энергетически менее выгодны, они могут стабилизироваться за ■ счет взаимодействия с белковой молекулой.

Описанный подход позволяет выделить роль и место конформационных расчетов. Как я любой другой .метод исследования, конформационные расчеты имеют свою предсказательную силу и свои ограничения. Надежно определяются стерически противоречивые структуры. Также высока точность расчета геометрии

Х-4

молекулы, соответствующей локальному минимуму энергии, но относительная глубина энергетических ям, соответствующих различным конформерам, несколько меняется в зависимости от параметризации (в данной работе а расчетах использовали классический вариант силовых функций с параметрами, описанными в 1980 г. в работе Журкииа и соавт., расчет водородных связей в спаренных основаниях производили в соответствии с рекомендациями, данными в 1984 г. Полтевым и Шулюпииой. Проведенные нами исследования флуктуационной подвижности динуклеотидов и параллельных спиралей указывают на высокую точность предсказываемой геометрии. В то же время рассчитанные значения энергии могут быть лишь критерием для отбора конформеров, т.к. взаимодействие с растворителем может изменять их относительную стабильность. Только с помощью предварительного хонформациоиного анализа мы получаем достаточную информацию для того, чтобы с привлечением различных экспериментальных методик перейти к описанию конформационной ситуации в растворе. При этом следует различать полный конформационный анализ, дающий исчерпывающее описание возможных конформеров, я поиск отдельной структуры, которая оказывается примером одного из интересующих пространственных расположений частей молекулы. О необходимости полного описания конформеров говорит и приведенное нами выше исследование, я накопленный опыт изучения множества антипараллельных структур, в результате которого мы сейчас говорим об А-, В-, С-, Ъ-, Н-формах ДНК и о существовании ансамбля этих форм в растворе.

. 2. Конформационный анализ спиралей с параллельной ориентацией цепей

Исследование структур ДНК с параллельной ориентацией цепей должно учитывать большой объем сведений о геометрии обычных антилараллельных спиралей ДНК. В то же время следует с осторожностью и критичностью отнестись к этим данным, правильно используя результаты, полученные при изучении олигонуклеотидов, одноцепочечных и двухцепочечяых полимеров. Наше внимание в первую очередь было направлено на выделение возможного разнообразия ' и возможных ограничений в следующих составных частях, формирующих геометрию спирали:

а) варианты образования вар нуклеиновых оснований;

б) варианты геометрии сахарофосфатного остова;

в) варианты взаимного расположения оснований по отношению к сахаро-фосфатному остову.

Выбор типа спаривания нуклеиновых оснований. Поскольку параллельные структуры являются образованием, существенно отличающимся от канонических спиралей, при теоретическом исследовании их возможностей мы не можем исхо-

дить из того, что и в этом случае основным элементом является стандартная комплементарная пара азотистых оснований с уотсон-криковским вариантом спаривания. Спорным является как положение о варианте спаривания, так и об обязательности сохранения комплементарное!».

Большая работа по исследованию нестандартных пар оснований была проведена Донахью и Полтевым. На основе их данных после некоторой дополнительной обработки, включающей, в частности, симметризацию пар, для каждого этапа работы нами был произведен отбор пар, соединенных водородными связями, и создано соответствующее математическое обеспечение, позволяющее учитывать изменение энергии при относительных перемещениях оснований в процессе формирования двойной спирали. В ходе исследования параллельных структур мы рассматривали 42 различных варианта спаривания.

Геометрия са ха оофосфатного остова. Описанный выше этап исследования дииуклеозндмонофосфатсз и однотяжевых спиралей позволил получить не только исчерпывающую информацию о возможной геометрии сахарофосфатного остова, но также сделать однозначное заключение о том, что основой описания геометрии параллельных спиралей ДНК должны служить параметры взаимного расположения пар оснований и геометрия фуранозного цикла, а двугранные углы в этом случае оказываются вторичными, рассчитываемыми на основе разработанных нами алгоритмов и соответствующих программ, позволяющих по расположению оснований в пространстве рассчитывать конечный набор вариантов расположения атомов сахарофосфатного остова.

Рзаимнос расположена геноран^ по оттошетегс к.сз^аррфосфзтнрму остову. Предложенная нами "аУ-номенклатура учета стереохимической неэквивалентности сторон нуклеиновых оснований позволяет ввести также определение взаимного расположения оснований в регулярной спирали по отношению к саха-рофосфатному остову. Если при взгляде вдоль оси спирали со стороны 3'-конца с смотрящему обращены а-сгороны оснований, та в случае правой закрученности мы имеем дело с Р"-, а в случае левой - с Метилом спирали. Если же основание обращено к смотрящему стороной Ь, то мы имеем дело соответственно с Я». и А/4-тапами спирали.

В случае двухцепочечных шшшуклеотидов тип спирали определяется отдельно для каждой нити, при этом направление закрученности двух нитей одинаково, а направления а и Ь зависят от расположения остовов и рассматриваемого варианта спаривания оснований. Отметим, что обычная В-форма ДНК в соответствии с описанной номенклатурой принадлежит по каждой нити к />*-типу.

В зависимости от того, какагт пара оснований берется за основу построения параллельной двухцепочечной спирали, мы обязаны допускать существование любого варианта спиралей. У параллельных структур с уотсоя-криковской парой

одна из нитей обязательно относится к а-типу, а другая - к ¿-типу, при этом направления закрученное™ у обеих нитей (Р ели АО естественно одинаковы.

Выбор модели учета периодичности структуры. Уотсон-криховские пары обладают двумя замечательными особенностями: а) при наложении АТ- и ОС-пар их гликозидные связи практически совпадают; б) каждая из этих пар имеет ось симметрии второго порядха, переводящую одну из гликозидяых связей пары з другую. Эта особенность позволила в большинстве исследований считать, что все нухлеотиды в ДНК имеют одинаковую геометрию. В ваших исследованиях динуклеозидмонофосфатов [Лысов я соавт., 1979] мы уже ставали под сомнение этот постулат, который был окончательно устранен после открытия Z-фopмы. Наш последующий анализ динуклеозидмонофосфатов и одноцепочечных спиралей показал, что выбор модели регулярности, неадекватно отражающей хиыиче-

„ а

У* I

Хгт-\ ГТ-\1

1 2

Рис. 2. Схематическое изображение различных вариантов конформацион-ной периодичности структуры: регулярные (а), гетерономные (б), бирегу-лярные или альтернирующие (в) и бирегулярные по каждой цепи (г).

скую периодичность соединенна, в результате расчета может дать структуру, существенно отличающуюся от оптимальной.

В нашей работе мы изучали информационные закономерности, зависящие от чередования оснований. Эти закономерности можно проследить только при последовательном рассмотрении различных вариантов периодичности структуры.

На рис. 2 представлены различные варианты конформационной периодичности в зависимости от химического строения рассматриваемого соединения. Попытка провести расчеты в регулярной модели (рис. 2а) для всех рассматриваемых нами вариантов спаривания оснований могла бы привести во многих случаях не только к заметным отклонениям от оптимальной структуры, но даже к отсутствию стернческн разрешенных конформаций. Поэтому на разных этапах исследования мы рассматривали в случае неальтернирующях негомогенных структур гетерономную модель (рис. 26), либо бирегулярную модель по одной (рис. 2в) или по двум цепям (рис. 2г). Использование модели, представленной на рис. 2г, диктуется структурами, в которых соседние пары оснований аналогично антипараллельным спиралям имеют разную ориентацию относительно оси, но в случае параллельных структур такое расположение приводит к существенному повышению энергии.

Анализ регулярных спиралей, имеющих ось симметрии второго порядка. В качестве начального объекта исследования нами был выбран класс гомогенных пар оснований, которые образуют симметричную структуру. В этом случае естественно ожидать и совпадения конформаций двух сахарофосфатных остовов. К множеству таких пар мы добавили еще несколько таких, в которых при сохранении водородных связей ча счет небольшого поворота можно добиться параллельности гликозндных связей, а тем самым на их основе также построить параллельные спирали, обладающие осью симметрии второго порядка, совпадающей с осью спирали. Оказалось 17 пар, обладающих описанным свойством.

На основе разработанной нами ранее методики расчета геометрии с помощью процедуры замыкания сахарофосфатного остова с сохранением валентных углов мы провели поиск оптимальных структур по всему пространству конформацион-ных параметров, определяющих взаимное расположение оснований в пространстве и конформацию сахара.

Изложим кратко основные результаты этого этапа работы. Для параллельных спиралей возможны оба типа закрутки цепей - правый н левый, хотя кон-•формеры, отвечающие правым спиралям, представляются по расчетам, в среднем, более устойчивыми.

Конформационные углы сахарофосфатных цепей в параллельных спиралях допускают, согласно нашим расчетам, более широкие пределы изменений, чем в антипараллелышх. Помимо конформацкй, обычных для антипараллельной ДНК

с анти-ориентацией основания, гош*-областью значений у и обычными для В-формы пределами значений углов /3, а, £ в е, мы часто обнаруживаем в параллельных цепях устойчивые формы с /гцкгнс-значениями угла у и коррелирующее с этим понижение значений угла а (до 110-160*), вместо близких к 280*, характерных для оптимальных хонформеров В-формы. Это два основных типа энергетически устойчивых конформаций, которые отвечают спиралям с привычными пределами значений угла спирального вращения Q <± 30 + ±40*) я шага спирали (Dz — 3 + 4А), хотя возможны и более раскрученные и растянутые спирали с (Q — 20*, a Dz »- 5 А). Форма сахарного цикла .у хонформеров, относящихся к первому типу, может варьировать в пределах от Cl'-экзо- до С2'-э«Л>-структур (Р изменяется от 120 до 180°). У хонформеров второго типа форма сахара либо Cl'-эндо- в СУ-экзо- (Р - 160-190*), либо СЗ'-зндо (Р - -10-5°).

Также допустимы структуры с гош'-областъю значений угла у (х при этом в анты-области) в структуры с син-, транс- или син-, гош+-областями углов х и у.

Конформациоиный спектр параллельных структур достаточно широк. Отметим, что электростатические взаимодействия сахарофосфатных групп противоположных цепей, сближенных в пространстве спиральной закруткой, т.е. расположенных на расстояния половины шага спирали, оказывают в параллельных спиралях дестабилизирующее влияние ва структуру не большее, чем в антипараллельной В-форме. В обоих случаях оио составляет около 40 кхал/ыоль. В антипараллельвой А-форме отталкивание сахарофосфатов на 10 + 15 ккал/моль сильнее. Объясняется это тем, что один из желобков А-формы антипараллельной спирали заметно уже, чем желобки в параллельной спирали. Эффект усиливается еще я тем, что в антипараллельной спирали (в отличие от рассмотренных вами симметричных параллельных спиралей) атомы кислорода фосфатных групп направлены навстречу друг другу.

Конформапионный анализ регулярных polvfdA) ■poivfdT)-спиралей. Были изучены возможная геометрия и относительная стабильность двойных гомополи-мерных параллельных спиралей ДНК poly (dA) • poly (dT) с различными вариантами спаривания оснований.

Учитывая химическую структуру рассматриваемого соединения, мы проводили расчеты в рамках следующей модели:

1) каждая из цепей двойной спирали является регулярной;

2) гликозидные связи Cl'-N в паре оснований не связаны друг с другом никакими элементами симметрии (асимметричны).

Таким образом, сахярофосфатные остовы разноименных цепей могут иметь, в отличие от канонических антипараллельных спиралей, разные конформации в рамках одной двойной спирали (гетерономные структуры, рис. 26).

Для всех четырех возможных АТ-пар оснований, представленных на рис. 3, нами были рассмотрены оба направления закрутки спирали и обе ориентации сахлрофосфатньис остовов относительно пар оснований.

а) уотсон-крикоаасий в) обратный уотсон-криховский

•) хугатшовский О обратный хугетимовекий

Рис. 3. Возможные АТ-пары оснований

Сканирование пространства параметров спирали позволило нам охватить все возможные области существования спиралей, что необходимо, так как a priori нельзя сказать, насколько структура гетерономных спиралей может отличаться от рассмотренных ранее монорегулярных структур. Была разработана последовательность шагов сканирования, использующая предварительный расчет области существования одяоцепочечных структур, что позволяло на поредок сократить объем проводимых вычислений.

В результате оптимизации энергии структур, найденных в ходе сканирования, для каждого варианта спаривания оснований мы получили спирали с достаточно низкими энергиями. Часть этих структур приведена в табл. 2. Из них в

Таблица 2.

Конформационные параметры и потенциальная энергия гетерономных poly (A)-poly (Т) -спиралей*

Тип спирали Конформационные параметры" Энергия, ккал/ моль Подвижность

п, град Dz, А п< град (о, град «i ..ГРМ.- 0, град Р, град Х< град е, град 1. град а, гряд * град У, град

Уотсон-коиковский тип Спаривания

МаЬ -31,0 3,6 -31,4 11,9 -5,2 -29,7 183 32 173 263 226 195 207 273 95 275 177 165 199 58 7,4 0,4

Обратный уотсон-коиковский тип спаривания

рЬЬ 40,1 3,2 -3,8 . -9,9 0,3 1,2 169 143 255 245 192 187 234 255 289 290 169 172 68 65 1,0 1.0

Хугстинооский тип спаривания

" рЬЬ " 33,2 2,9 -17,0 -0,1 5.6 -1.7 157 30 223 201 188 206 260 287 145 274 173 180 188 70 5,8 0,3

Обратный хугстиновский тип спаривания

раЬ 45,6 3,5 -8,7 -10,4 1,4 -0,9 160 152 54 244 187 187 264 248 151 294 180 168 181 70 4,2 0,6

Уотсон-криковский тип спаривания (антипараллельная гетерономная спираль)

рЬЬ " 38,3 3,2 3,9 -9,2 4,2 -1,2 154 145 253 242 188 183 248 255 288 290 176 178 63 64 0,0 1.0

Во всех строках таблицы, за исключением последней, представлены структуры с параллельной ориентацией цепей. В первой строке для каждой формы приведены параметры адениновой цепи, во второй - тиминовой цепи.

первую очередь следует обратить внимание на структуры с обратными уотсон-криковскими и хугстиновскими парами.

Потенциальная энергия параллельных спиралей (1,0 ккал/моль для оптимальной конформации) имеет примерно ту же величину, что и энергия антипараллельных спиралей (0,0 ккал/моль). Кроме того, параллельные спирали, в состав которых входят пары оснований с трансоидным расположением гликозид-ных связей (1,0 ккал/моль для обратной уотсон-криковской и 4,2 ккал/моль для обратной хугстиновской пары), существенно более устойчивы, чем спирали с уотсон-криковской (7,4 ккал/моль) и хугстиновской (5,8 ккал/моль) парами оснований. Напомним, что, как и в случае динуклеозидмонофосфатов, рассчитанная энергия является лишь критерием отбора заслуживающих внимания конфор-меров для дальнейшего исследования, а сами относительные значения энергии могут несколько изменяться под влиянием растворителя.

В спиралях с обратным уотсон-криковским и обратным хугстиновскям типами спаривания оснований оба желобка имеют почти одинаковые размеры. С энергетической точки зрения наиболее устойчивой является форма с обратным уотсон-криковским типом спаривания оснований (рис. 4а). Потенциальная энергия и параметры спирали такого конформера почти не отличаются от соответствующих величин для антипараллельной В-формы ДНК с уотсон-криковским спариванием оснований, что хорошо согласуется и с соображениями о расположении сахарофосфатных остовов относительно оснований. И в том и в другом случае мы имеем дело с правыми спиралями 4-гипа по каждой цепи.

Среди рассчитанных конформеров присутствуют такие, у которых информация фуранозного цикла описывается значениями угла псевдовращения - 30°, что близко к соответствующему значению для сахара А-формы ДНК.

Параметры и энергия спирали, рассчитанной Паттабираманом в модели монорегулярности, несколько отличаются от полученной нами, что и следовало ожидать, так как требование монорегулярности создает излишнее дополнительное напряжение остова.

Отметим также, что может существовать довольно низкоэнергетичная (6,0 ккал/моль) левозакрученная спираль с обратным хугстиновским типом спаривания оснований (рис. 46).

Изучение (Ьлуктузштанной подвижности регулярных по1уМА) -по1у((1Т). Лля определения стабильности найденных конформеров в конформационных исследованиях используется рассчитанная потенциальная энергия. В большинстве случаев этим расчетом и ограничиваются т.к. отсутствуют надежные подходы к оценке энтропии столь сложных систем. В наших конформационных исследованиях параллельных спиралей мы сочли возможным провести скорее качественную, чем четкую количественную оценку такого стабилизирующего фактора. Эта оценка

Рис. 4. Оптимальный конформер на основе обратной уотсон-криковской пары (а) и левая спираль на основе обратной хутстиновсхой пары оснований (б)

основана на рассмотрении таких отклонений различных спиральных параметров от равновесии, при которых потенциальная энергии отличается не более чем на 0,6 к кал/моль.

Для подобного расчета возможны два пути. В первом случае каждый из исследуемых параметров отклоняется от равновесия, и для нового набора параметров рассчитывается потенциальная энергия. Во втором подходе, которому мы и следовали, после отклонения одного из параметров спирали производится минимизация по всем остальным и в дальнейшем учитывается энергия, полученная в результате минимизации. Проведенная описанным способом оптимизация энергии позволяет сравнивать подвижность двух произвольных конформеров. Если у первого из них соответствующие спиральные параметры при подобном моделирования тепловых флуктуаций могут изменяться в более широких пределах, чем у второго, то можно говорить о большей стабильности первого конформера при равенстве их потенциальных энергий.

Описанное исследование показало, что наибольшей подвижностью обладает структура на основе обратной уотсон-криковской АТ-пары. Для нее в пределах тепловых флуктуаций возможно перемещение оснований от равновесного положения в их плоскости приблизительно на 1А.. Больше напряжений возникает при смещении в направлении, параллельном линии, соединяющей гликозидные связи, что связано с тем, что расстояния гликозидных связей двух цепей от оси спирали оказываются различающимися при одинаковом угле спирального вращения, а этот угол имеет свое оптимальное значение для каждого расстояния от оси. Угол псевдовращения фуранозных циклов может изменяться на 15°, а угол спирального вращения (П) приблизительно на 3', при этом большее напряжение возникает при увеличении угла спирального вращения. В качестве полуколичественной оценки относительной стабильности двух конформеров мы выбрали усредненное значение отношения интервалов изменения соответствующих параметров. Отметим, что такая флуктуационная подвижность оптимальных параллельных спиралей практически совпадает (и даже немного выше) с подвижностью В-формы ДНК. Полученные нами численные значения, характеризующие описанную флук-туационную подвижность некоторых конформеров, приведены в табл. 2.

Изменение энергии при отклонении от равновесия в разные стороны может оказаться несимметричным. Это легко объясняется несимметричностью возника- . ющих стерических ограничений. На рис. 5 представлены линии уровня энергии, показывающие напряжение оптимального конформера при смещении оснований в плоскости Эх-Оу, а также зависимость энергии при одновременном изменении Ьх и й. Этот рисунок указывает на связь между углом спирального вращения и смещением пары оснований от оси.

Рис. Линии уровня энергии при изменении параметров спирали Их-Оу (а) и Ш-О (б).

' Подчеркнем также то, что мы изучали допустимые изменения спиральных параметров при сохранении соответствующей модели регулярности, т.е. этот спиральный параметр изменялся во всех парах одинаково. Локальные изменения в одной паре могут происходить в существенно более широких пределах, и примером таких опгклоаенений может быть вперкаляция красителей. Соответствующие модели интеркаляции в антипараллельной структуре ДНК рассчитывались ранее рядом авторов.

Согласно вашим расчетам, существенно большей жесткостью обладают параллельные спирали, в которых фуранозные циклы содержат гидроксильную группу. Соединения рибо-ряда не были основным предметом нашего исследования, но все же отметим, что для этих соединений, хотя в возможны хонформеры с различными вариантами АТ-пар, но все же сгеричеосие ограничения в еще большей степени выделяют обратный уотсон-криховский тип пар. Впрочем, ограничения, создаваемые гндроксильной группой, оказываются не столь жесткими, как например для исследованных нами гетерономных ДНК, метилированных по одной из цепей в различных положениях.

Структуры с чередующимися АТ-пярами оснований. При изучении геометрии чередующихся спиралей мы, следуя химической периодичности, проводили расчет ■ бирегулярной модели (рис. 2в), согласно которой могут различаться информационные параметры химически различных нуклеотидов (аденозинмоно-фосфата н тимидинмонофосфата), но совпадает геометрия одноименных нуклеотидов.

Расчет геометрии в этой модели из-за изменения набора независимых параметров потребовал модификации алгоритма и соответствующих процедур. В связи с этим в процедуре замыкания цепи мы рассматривали также отклонения валентных углов и учитывали эти отклонения с помощью предложенных ранее эмпирических силовых функций.

Стабильность чередующихся структур, построенных на основе различных вариантов спаривания оснований, падает по мере отклонения угла между глико-зидными связями пары о г 180*. Это связано с тем, что при сохранении перекрывания оснований такое отклонение создает фактически разную степень закрученности при переходе от аденина к тимину и от тимина к аденину при движении вдоль сахарофосфатного остова. В иных моделях построения чередующихся структур (рис. 2г) мы сталкиваемся со сменой ориентации пар оснований в спирали, что неминуемо заметно повышает энергию в связи с переходом гликозидного угла в скн-конформацию.

Приведенные соображения помогают понять, почему формы с низкой энергией получаются только для обратного уотсон-криковского и обратного хугсти-новского вариантов спаривания. Заметный интерес представляют лишь спирали с обратными уотсон-криковскими АТ-парами.

В отличие от гетерономных, чередующиеся структуры обладают существенно меньшим разнообразием. Низкой энергией характеризуются лишь две структуры, тяжпяа из которых имеет углы сахарофосфатного остова, близкие к углам в В-форме. В каждой из этих структур фуранозные циклы при аденине имеют С2'-эч&>-конформгцяю, а сахара при тимине принимают соответственно С2'-эн-до- в СЗ'-энйо-конформацию. Флуктуационная подвижность этих форм равна приблизительно 0,7 +■ 0,8.

Кон(Ьормациониий анализ параллельных спиралей с CG-парами. По сравнению с АТ-парой CG-napa является более консервативной. Если АТ-пара, состоящая из немодифицированных оснований, может быть организована четырьмя различными способами (уотсон-криковский, обратный уотсон-криковский, хуг-стиновский и обратный хугстиновсквй типы спаривания оснований), то CG-napa менее вариабельна, и среди возможных кандидатов на участие в параллельной спирали интерес представляют лишь обратная уотсон-криковская (рис. 6а) и уотсон-криковская пары (рис. 66).

- 20 -

а б

Рис. 6. Обратный уотсон-криховсхий (а) ■ уотсон-криховсхий варианты образованна СО-пар оснований.

Необходимо оггметнтъ, что три водородные связи между основаниями пары возможны только в уотсон-криковсхой СО-паре, что делает ее существенно более устойчивой, чем пары со всеми другими возможными вариантами спаривания. ' Кроме того, обратная уотсон-криховская СО-пара имеет строение, наиболее подходящее для параллельной спирали, имеющей ось симметрии второго порядка, совпадающую с осью спирали - гликозидные связи в такой паре находятся в транс-ориентации, что позволяет сахарофосфагным остовам спирали принимать конформацию более удачную для параллельной спирали.

Для конформационного анализа, так же как и в случае спиралей ро1у(<1А) -ро1у(с1Т), была выбрана гетерономная регулярная модель ДНК, и поиск также проводился в широком диапазоне параметров спирали. Результаты расчетов приведены в табл. 3.

Для обратного уотсов-криковсхого типа спаривания оснований наиболее стабильными являются правозакрученяые формы спиралей ЬЬ-типа. Потенциальная энергия таких спиралей составляет 418,7 ккал/моль, а параметры спирали и структура сахарофосфатных остовов близки к соответствующим величинам, характерным для В-формы: Ог - 3,5 - 3,бА, углы в, со, к, г/ около 0*, основания в анти- и высокой ан/пи-ориентации, сахара в С2'-э«<Эо-конформации, угол у - в гош*-области. Наряду с данным конформером имеется несхолько менее устойчивая форма (Е ~ +19,2 ккал/моль) со следующими параметрами: йх - 3,4А, в -16-20°, <о - -6°, к - 0-4", 7 « -12% основания в анти- и высокой ак/пи-орнентации, сахара в С2'-экЛ>конформации, угол у - в гош+-области.

Несколько менее стабильными (Е » +18,9 ккал/моль) оказались левые спирали аа-ттт с большим углом спирального вращения (£2 около -48°), увели-

Конформациошше параметры и потенциальная энергия гетерономных ро1у (С) -ро1у (О) -спиралей*

Таблица 3.

Тип Конформациошше параметры Энергия,

спирали Оъ, Ъ в, Р, х. е, г. а, Р, У, ккал/

град к град грал град глад град град град град град град град моль

Уотсон-криковский тип спаривания

М1* -28,5 3,2 -14,4 4,9 0.9 17,7 110 319 188 251 280 168 56 12,5

170 170 186 251 141 153 185

рЬа 32,7 2,2 30,7 "6,1 7,9 8,8 35 210 203 287 274 184 64 7,3

150 51 188 263 144 173 187

МаЬ -35,8 3,7 3,1 1,7 -8,2 -18,1 180 174 198 230 112 173 192 7,9

20 288 192 284 129 183 188

раЬ 33,6 3,0 17,7 -3,9 4,7 -7,8 137 49 191 269 133 180 198 12.1

169 220 196 263 136 166 190

Обратный у 'отсон-криковский тип спаривания

рЫ> 35,0 3,5 0,5 -0,6 0,6 3,6 154 240 186 249 282 184 65 18,7

171 293 268 170 284 146 41

М*> -48,4 3,4 16,5 -5,2 7,6 -4,1 189 174 271 239 54 206 158 18,9

178 163 197 239 111 174 180

Уотсон-криковский тип спа ривания (антапараллельная гетерономная спираль)

рЬЬ 38,8 3.2 0,1 -5,0 -1,3 -1,1 154 245 185 250 291 178 63 0,0

158 246 186 24.7 288 178 65

Во всех строках таблицы, за исключением последней, представлены структуры с параллельной ориентацией цепей. ** В первой строке для каждой формы приведены параметры цитозиновой цепи, во второй - гуаниновой цепи.

ченными углами наклона и взлома шры (в т 16-20*, к ~ 7-10*), основаниями в анти-ориентации, сахарами в СТ-эндо- ■ СЗ'-экзо-конформациях и углом у в транс-области.

Самыми стабильными спиралями с уотсов-криковским типом спаривания являются правозакрученные спирали Ьа-типа СЕ ■ 7,3 ккал/моль, £2 около 4-33*) с сильно наклоненными (7 « 31*) парами оснований и малым 2,1А с

основаниями по цитозиновой цепи я анти-ориентации, по гуаииновой - в син-ориентации; сахара в цитозиновой цепи в СЗ'-экдо-конформации, в гуаииновой - в С2'-энд»конформации, угол у в цитозиновой цепи в гош'-области, в гуаииновой - в отрамс-области. Левые спирали ба-типа (С »-28 + -32*, £>г -2,9-3,2А) менее стабильны (Е « 12,5 ккал/моль), пары оснований в них также наклонены (7 - -11 + -15*) и накренены (9 ~ -17,7*); цитозины в син-, гуанины - в анти-ориентации, сахара по обеим цепям в С2'-зкдо-конформации; угол у в цитозиновой цепи в гош*-, в гуаииновой - в транс-области.

Среди спиралей аЬ-типа самыми низкоэнергетичными (Е — 7,9 ккал/моль) оказались лево закрученные (О около -35*) спирали аЬ-тяпа со следующими характерными особенностями: угол крена $ от -18 до -20*; сахара в цитидиновой цепи в С2'-эндо-конформации, в гуаииновой - в СЗ'знЗо-конформации; по обеим цепям основания - в сити-ориентации, угол у - в транс-области. Правозакрученные спирали этого типа имеют более высокую энергию (Ет 12,1 ккал/моль) и следующие парамеры: С — 31", Ог - 1,7-3.1А, ц - 14-32*, ш до -9*, к - 5-10*, б до -12*; цитозины в син-, гуанины - в окоти-ориентации, по обеим цепям сахара в С2'-э;иЪ-конфорыации, угол у - в транс-области.

Отметим, что геометрия обратной уотсон-криковской пары оснований, как. и в случае спиралей ро1у(<1А) -ро1уМТ), является оптимальной для формирования сахарофосфагных остовов с параллельной ориентацией: потенциальная энергия спирали без учета взаимодействии оснований внутри пары на 0,5 - 2,5 ккал/моль меньше, чем энергия спирали с уотсон-криковскими парами. Однако, решающую роль в выборе между уотсон-криховским и обратным уотсон-криковскхм типом спаривания оснований играет наличие в уотсон-криковской СО-паре третьей водородной связи, которая стабилизирует спираль значительно сильнее, чем оптимальная геометрия обратной уотсон-криковской пары - потенциальная энергия взаимодействия оснований пары составляет соответственно -30,7 и -18,9 ккал/моль для уотсон-криковской и обратной уотсон-криковской пар оснований. Таким образом, энергетический выигрыш остается за канонической уотсон-криковской СС-парой с существенным перевесом примерно в 9-11 ккал/моль.

Чередующиеся параллельные ОС-структуры, образованные на основе обратной уотсон-криковской пары, как и в случае АТ-пар, по энергии и информационным параметрам практически не отличаются от аналогичных гетерономных

структур, но в случае GC-nap следует учитывать, что их энергия заметно выше, чем энергия антипараллельных спиралей. Сильнее отличаются гетерономные и бирегулярные спирали, построенные на основе уотсон-криковской пары. В силу существенного отклонения гликозидных связей от трансоидного расположения, структура претерпевает дополнительную дестабилизацию из-за напряжения саха-рофосфатного остова. Это напряжение может быть ослаблено только за счет смещения пар, уменьшающего перекрывание оснований, что приводит к повышению энергии. Перекрывание оснований можно также увеличить, рассматривая спирали, у которых различается ориентация двух соседних пар. Такая структура предполагает независимую бирегулярность по каждой цепи (рис.2 г), и эта геометрия также в силу переходов в сик-конформацию оказывается более напряженной, чем соответствующая гетерономная.

Из проведенных расчетов мы видим, что параллельные спирали, содержащие только АТ-пары, близки по энергии с аятипараллельным структурам, при этом чередование AT приводит к некоторой дестабилизации. Наиболее стабильная параллельная гетерономная спираль на основе GC-nap существенно напряженнее антипараллельной, а любые чередования еще больше увеличивают энергию структуры. Наличие отдельных ОС-пар в AT-спирали также приводит к ее напряжению, при этом повышение энергии зависит от числа таких GC-nap и от чередования как гуанинов и тиминов в одной цепи, так и от чередования AT-GC-nap. Более детальное рассмотрение каких-либо параллельных гетерополимеров уместно, на наш взгляд,.только в случае изучения конкретного олигонуклеотида.

3. Многоцепочечные комплексы нуклеиновых кислот.

Основным объектом нашего исследования являлись спирали с параллельной ориентацией цепей, и проведенные расчеты дают основу как для интерпретации ряда полученных экспериментальнах результатов, гак и для планирования последующих экспериментальных работ. Однако нам хотелось также рассмотреть и другие направления развития нашего исследования. В последние годы все большее внимание привлекают различные структуры, содержащие более двух нитей. В любом из таких комплексов заведомо присутствуют по крайней мере две параллельные нити. Хотя в данный момент крайне модным объектом являются различные варианты тройных спиралей, к которым приложимы многие из изложенных •выше результатов, нам были более интересны четверные спирали, представленные к настоящему ¡времени в виде G4-crpyKTyp. Первые попытки анализа таких форм были предприняты более 20 леч тому назад ([McGavin, 1966, 1971; Morgan, 1970]).

I-12

Мы провела информационный анализ четырехцепочечных спиралей poly(dA) • poly (dT) • poly (dA) • poly (dT) с различными вариантами связывания оснований. Исследование проводилось на основе следующей модели:

- двойные спирали, образуют четырехцепочечную спиральную структуру за счет образования дополнительных водородных связей между нуклеиновыми основаниями;

- четырехцепочечная спираль обладает осью симметрии второго порядка, совпадающей с осью спирали.

Выбранная модель диктует следующие свойства структуры четырехцепочеч-ной спирали.

1. Параллельная ориентация и геометрическая идентичность одноименных цепей.

2. Разноименные цепи могут быть как сона правлеными, так и разнонаправленными.

3. Симметричное строение относительно оси спирали комплекса из четырех оснований, образующих слой четырехцепочечной спирали.

Нами были рассмотрены различные варианты соединения водородными свя-" зями двух аденинов и двух тиминов. Найдены шесть симметричных комплексов, способных образовывать регулярную четырехцепочечную структуру, в которых каждое основание комплекса образует не менее двух водородных связей (рис. 7). Комплексы "а* и "б" имеют соответственно обратный уотсон-криковский тип связывания АА и хутстиновский и обратный хугстиновский тип связывания AT. Комплексы 'в" и "г' - имеют обратный хутстиновский тип связывания АА н обратный уотсон-криковский и уотсон-криковский тип связывания AT. В комплексах "д" (был рассмотрен Морганом в 1970 г.) и "е" АТ-пары формируются ва основе уотсон-криковского и обратного уотсон-криховского связывания AT соответственно и образования бифуркационных водородных связей между атомами тиминов и незанятыми протонами аминогрупп аденинов, таким образом, что каждый из тиминов одновременно связан с двумя аденинами, а каждый из аденинов - с двумя тиминами. В отличие от вариантов "а" - "г", аденины в комплексах "д" и "е" не образуют водородных связей непосредственно между собой. Эти комплексы имеют наиболее "однородную" структуру - в них расстояния между гликозидными связями разноименных оснований различается не более, чем на 0,5 А, что существенно меньше чем в комплексах "а"-"г". Это обеспечивает низкую энергию сгэкинг-взаимодейсгвия и понижает напряжение сахарофосфатных цепей.

4. Из соображений симметрии следует невозможность сдвигов всего комплекса из четырех оснований относительно оси спирали, наклона и крена плоскости комплекса. В комплексах возможны утлы пропеллера и излома в АА-паре, однако.

Д

Рис. 7. Симметричные комплексы из четырех водородносвязанных оснований, способные образовывать регулярные четырехцепочечные спирали.

эти углы эквивалентны соответственно углам крена и наклона в АТ-паре оснований.

В силу симметрии, для полного описания четырехцепочечяой спирали достаточно определить строение комплекса из двух водородносвязанных пар оснований АТ, представляющего собой один слой четырехцепочечной спирали, указать

направления сахарофосфатных цепей в определить строение ее половины - двух-цепочечной спирали.

Учитывая два возможных направления закрученносга спирали и по два варианта ориентации сахарофосфатных остовов тиминовых и адениновых цепей дла каждого из 6 возможных способов образования слоя, было проведено изучение 48 различных четырехцепочечных структур. В результате детального сканирования в пространстве параметров спирали и последующей оптимизации были найдены хонформеры с достаточно низкой энергией для большинства из этих 48 вариантов. Часть полученных конформеров представлена в табл. 4.

Для рассчитанных структур мы обнаружили большой набор различных особенностей, которые могут быть использованы в случае последующего более подробного их исследования, в частности с использованием методик ЯМР. Здесь мы остановимся на некоторых из них, позволяющих дать качественное описание четырехцепочечных спиралей. Наиболее устойчивыми (как по полученной в итоге оптимизации энергии, так и по результатам исследованной подвижности) оказываются структуры, образованные на основе "д*- и "е"-слоев. Оптимальные четверные спирали с соналравленными и разнонаправленными А- а Т-цепями изображены на рис. 8. Заметные напряжения для других вариантов четверных слоев создаются в основном из-за различий расстояний гликозидных связей от оси спирали. Дело в том, что каждому расстоянию гликозидной связи от оси соответствует свой оптимальный угол закрученности спирали.

Расчет указывает на существование как левозакрученных, так и право закрученных структур. Возможна любая взаимная ориентация адениновых к гимн-новых нитей, хотя антипараллельные структуры оказываются более стабильными.

Проведенное нами сопоставление энергий двойных и четверных спиралей при исключении электростатического взаимодействия соседних цепей показало, что переход двух двойных спиралей в четверную сопровождается понижением потенциальной энергии при некотором увеличении жесткости структуры. Этот переход мог бы выглядеть так, как представлено на рис. 9. Описанное сопоставление моделирует полную нейтрализацию фосфатов противоионами, что, конечно, невозможно, но проведенная оценка позволяет говорить о небольшом отличии энергий двух рассматриваемых состояний. Образование четверной спирали связано также с некоторой компактизацией: если диаметр двойной спирали равен — 20 А, то диаметр четверной спирали ~ 25 А. Чегырехцепочечные спирали с чередующейся АТ-последовательностью оказываются существенно более напряженными.

Конформациониые параметры и потенциальная энергия четырехцепочечкых спиралей

Таблица 4.

Спи раль Конформациониые параметры Эне ргия

Комп- Тип П. Ъъ, 7. а>, к, в, Р, X, е, а. Р> У, ЕП" р *" ЕВВ

лекс град X град град град град град град град град град град град

Спиали с антипараллельной ориентацией разноименных цепей

а Маа -35,6 3,5 1,2 -0,3 -5,3 -7,0 140 170 190 239 266 171 56 26,9 -15,9

160 179 294 212 225 117 40

в раЬ 34,1 3.9 -4.1 -2,5 1,0 1,6 110 50 192 268 299 172 58 24,8 -13,7

177 266 199 219 285 171 73

Д рЬЬ 30,0 3,5 -1,2 -2,1 -3,0 -3,1 30 195 201 288 281 174 71 12,5 -21,0

110 223 190 268 292 177 58

е рЬл 33,7 3.3 2,5 1.3 -2,7 -0,5 126 202 193 264 153 188 180 14,7 -20,8

177 56 195 230 96 184 234

Спирали с параллельной ориентацией разноименных цепей

б рЬЬ 32.1 3,3 2,9 -20,9 9,1 -2,3 105 224 19$ 258 300 159 64 21,5 -14,1

176 243 204 253 151 168 172

д рЬа 34,0 3,5 -2,3 -0,6 -2,4 8,9 163 213 193 262 146 169 186 20,9 -14,6

148 41 192 272 128 172 204

е рЬЬ 34,4 3,4 3.3 -0,5 1,5 2,6 163 216 189 267 145 165 189 15,6 -21,8

152 211 192 267 141 172 190

В первой строке для каждой формы приведены параметры адениновой цепи, во второй - тиминовой цепи. Приведена полная потенциальная энергия структуры.

Приведена энергия без учета электростатического взаимодействия сахарофосфатных остовов.

Рис. 8. Четырехцепочечные спирали с анпшараллелъной ориентацией разноименных цепей типа "д" (а) и с параллельной ориентацией разноименных цепей типа "е" (б).

Рис. 9. Образование четырсхцепочечяой шпильки из двух двутяжевых оли-

гопурин-олигопиримиднновых участков.

4. Сопоставление полученных результатов с экспериментальными данными

К концу 80-х годов было известно, что метилированный по фосфату <1(Т)6 и (ОТАСйС) с сг-сКСАТССО образуют в растворе дуплекс с параллельным направлением цепей (параллельный дуплекс). Кроме того, в кристалле с) (СО, полученном из кислого раствора, динуклеозидфосфат образует параллельный дуплекс сС-О- и С-СН+-парами.

Однако во всех этих случаях изучали либо химически модифицированные олигонуклеотиды, либо природный димер, но в условиях, далеких от физиологических. С точки зрения возможной биологической функции параллельных дуплексов, чрезвычайно важно ответить на вопрос: могут ли олигодезоксирвбояуклеотиды, состоящие из природных мономерных единиц, об-

разовывагь двойную спираль с параллельным расположением цепей в условиях, близких к физиологическим. Понятно, что этот вопрос был ключевым для начала изложенного в данной работе исследования.

Практически одновременно на основе сходных соображений доказательство существования параллельных спиралей было получено в 1988 г. в группах Ваи де Санде и Иовина, Нечияуренко и Чуриковым, а также нами.

Для выяснения этого вопроса нами был исследован олнгонуклеоткд 3'-d (АрТрАрТрАрТрАрТрАрТр) -О (CH2)60-5'-d (рАрТрАрТрАрТрАрТрАрТ), (в дальнейшем будем называть эйкозамером), который может образовывать параллельный дуплекс лишь внутримолекулярно (шпилька), что позволяло надеяться на получение легко интерпретируемых и достаточно однозначных результатов.

Эйкозамер может существовать в растворе в виде а) параллельной шпильки, б) антипараллельного дилера (в высоких концентрациях - тримера, тетрамера и т.д.) и в) двойной антипараллельной шпильки, у которой образуются две двойные спирали из каждого из двух десятичленников, разделенных гехсаметиленовым мостиком.

Рассмотрим теоретическую базу, необходимую для планирования и интерпретации соответствующего эксперимента. Если ограничиться рассмотрением лишь открытой цепи (М), параллельной шпильки (Н) и антипараллельного димера (D), что вполне разумно при достаточно низких концентрациях олигонуклеотида, то

К, Кч

M —l- H 2М D

IH] „ ^ _ JDJ

[MJ " [М]-1

Исходная концентрация олигонуклеотида

С0- [M] + [H] + 2[D] - [Ml (1 + К,+ 2К2[М]) и мольные доли компонентов равновесия

с0 " 4К2с0

Хн = -УД =

о

_ ^ ÇP1 _ov2 V п

D--ET ~ M 2 0 •

Со

и если экспериментально доступен экстенсивный параметр а(Т) (в нашем случае

гиперхромизм), то эффективная константа равновесия, рассчитанная в предположении, что процесс протекает внутримолекулярно

„ дша» ~ "С7) [Н]+2[Р] „ . (1+К1)2+8Х2С'о

АэФФ" а(Г) - ат[а " [М] "А»+ 2

Здесь авах и ат|п - предельные значения параметра, при наивысшей и наинизшей температуре соответственно. Эти соотношения верны при условии, что ааа% и сгЫп нс зависят от температуры.

Таким образом, при концентрации олигонуклеотида, удовлетворяющей условию 8К}С0 « (1+К,), экспериментальные данные с высокой степенью точности

г.ч

Рис. 10. Кривые плавления зйкозамера в зависимости от концентрации: 1 - 0,5• 10"®, 2 - 0^5-Ю"6, 3 - 0,9-Ю-4, 4 - 3,2-Ю"6, 5 - 1,9-Ю"5, 6 - 0,85-1 О*4 моль цепи в 1 л.

отражают внутримолекулярный процесс (образование параллельной шпильки).

Экспериментальным критерием достижения достаточно низких концентраций оли-гонуклеотида может служить неизменность в пределах экспериментальной ошибки кривых плавления при дальнейшем разбавлении образца.

Действительно, как видно из рис. 10, кривые плавления эйкозамера при концентрациях 0,9 10"6, 0,55-КГ4 и 0,5-10"6 М совпадают в пределах экспериментальной ошибки и существенно отличаются от кривых плавления при более высоких концентрациях олигонуклеотида.

Выбор между параллельной и двойной антипараллельной шпильками был сделан на основе явного отличия кривых плавления декамера (КАТ);, который по внутримолекулярному механизму может образовывать лишь актипараллельную шпильку.

Изучение термодинамики образования параллельных и антипараллельных шпилек. Нами была изучена термическая денатурация четырех олигонуклеотидов:

Кривые плавления всех изученных олкгомеров имеют двухфазный характер (рис. 11). Первый переход, который наблюдается при относительно низких температурах (от 10 до ЗО'С), мы будем в дальнейшем называть "низкотемпературным'*, а структуры, преобладающие при температурах ниже этого перехода, -"низкотемпературным комплексом". Второй переход происходит при более высоких температурах (30 - 70"С), Этот переход мы будем называть "высокотемпературным", а отвечающие ему структуры - "высокотемпературным комплексом".

Вообще говоря, двухфазность кривых плавления олигонуклеотидов, которые могут существовать и в виде "нормального" дуплекса и в виде шпильки, представляет собой обычное явление и связана с наличием двух равновесных процессов, описанных нами в предыдущем разделе.

Основываясь на приведенных в предыдущем разделе соотношениях, с помощью подготовленных нами программ мы рассчитали методом нелинейной регрессии изменение мольных долей компонентов равновесия в зависимости от температуры (рис. 11), а также термодинамические параметры низко- и высокотемпературного переходов.

Из общих соображений очевидно, что в случае олигонуклеотидов, которые могут существовать как в виде дуплекса, так и в виде шпильки, повышение температуры должно сдвигать равновесие в сторону шпильки. Убедительным до-

З'чКАрТ^рО^Н^ОрсКАрТ^З' З'-^АрТ^рО^Нз^ОрсКАрТ)^* З'-й (А) 10рО (СН2) ¿Ор<1 (Т) 10-3' 3'-с1(А)10рО(СН2)6Ор<1(Т)10-5'

(парАТ), (антиАТ), (парА-Т), (антиА-Т).

мольнм дола

Рве. 11. Экспериментальные данные по термической денатурации в сравнении с теоретической зависимостью, рассчитанной методом нелинейной регрессии (I) в рассчитанные мольные доли "низкотемпературного комплекса" (2), шпильки (3) и отдельной цепи (4) парАТ (а), антиАТ (б), парА-Т (в) и анти А-Т (г) при концентрации олигонуклеотидов ~10~6 моль цепи в 1 литре

казательством того, что рассматриваемый переход является переходом "шпильки —•* отдельные цепи" (т.е. мономолекулярным процессом), слухит отсутствие зависимости Тш от концентрации слигонуклеотида. Для изученных нами олиго-меров величина Тц, высокотемпературного перехода не выходит за пределы экспериментальной ошибки при изменении концентрации олигонухлеотида в 100 раз.

В табл. 5 приведены термодинамические параметры образования шпилек из отдельных цепей. Видно, что параллельные спирали менее стабильны, чем соответствующие антипараллельные. В то же время шпильки, в которых одна цепь состоит из аденинов, а вторая - из тиминов (парА-Т и антиА-Т), стабильнее соответствующих шпилек с чередованием тиминов и аденинов (парАТ и антиАТ). Однако, если в случае нечередующихся последовательностей оснований (парА-Т и антиА-Т) при переходе от антипараллельной к параллельной шпильке Т^ снижается лишь на —4°С, то параллельная шпилька с чередующейся последовательностью оснований (парАТ) плавится при температуре на -16*С ниже соответствующей антипараллельной (антиАТ). Таким образом, чередование в цепи тиминов и аденинов сильнее дестабилизирует параллельные спирали, чем антипараллельные. Для всех изученных шпилек Тщ, повышается с увеличением концентрации NaCI, причем угол наклона зависимости Т^ от Ig[NaCl] определяется лишь типом нуклеотидной последовательности, но не взаимной ориентацией цепей (параллельная или антипараллельная) .

Таблица 5.

Термодинамические параметры образования шпилек из отдельных цепей и дуплексов из шпилек.

Олигонук- ДН°, AS0, ^пл* Гиперхро- Да

леотид ккал/моль кал/(моль-Ю °С мизм. "L

Высокотемпературные комплексы (шпильки)

парАТ -24,5 -78,8 37,9 17 0,022

антиАТ -41,6 -127,4 53,5 26 0,035

парА-Т -30,4 -93,3 52,8 22 0,046

антиА-Т -47.1 -142,9 56,6 32 0.081

Низкотемпературные комплексы От лиексы)

парАТ -25,4 -58,9 20,6 10

антиАТ -31,1 -76,9 24,5 12

парА-Т -25,5 -57,8 36,1 8

антиА-Т -22,7 -44.7 41,9 9

В последней колонке табл. 5 приведены величины Ал, отражающие изменение степени ассоциации противоионов при термической денатурации шпилек, которые были рассчитаны по следующей формуле [Record, 1978]:

вТпл 1 ' МГ '

d!g[NaCl] 2.3Л7*,

где ДН' - энтальпия денатурации шпильки в расчете на 1 моль фосфатов.

в

Рис. 12. Рассчитанные четырехцепочечные вТ-структуры с параллельными цепями и выпетленными тиминовыми основаниями с 04-слоями находящимися в ста кинг-взаимодействии (а), с раздвинутыми С4-слоями, доступными для кнтеркаляции бромистого зтидия (б), тиминовые основания ннтеркалированы между С4-слоями (в).

псевдовращения дезоксирибозы при О в Т равны соответственно 112* и 124*, а гликозидные углы равны 105* и 90*.

Ранее было отмечено [Morden, 1983], что места расположения миии-петель имеют повышенную константу связывания янтеркаляторов. Это, по-видимому, связано с тем, что с помощью мини-петли и практически без изменения двугранных углов удается реализовать структуру, содержащую участок интеркалядии (существенно изменяются только углы псевдовращения Сахаров и гликозидные углы). На рис. 126 приведено изображение рассчитанного вами квадруплекса, а котором при £>-22* гуанииовые четверки раздвинуты иа 7,1 к. Двугранные углы этой структуры следущие: y¡-o¡¡ (шаг 3-GT-5') - 193*, 96*. 73% 97", 199*, а у2-<и2 (шаг 3'-ТО-5') - 294*, 149% 281*,198*. 235*, Р0, Рт, х0.Хт " 35\ 120*. 104*, 90*.

Интеркаляровать в дуплекс могут также в сами тимнны. Стэкинг между гуаниновымн четверками при этом заменяется на стэкинг между основаниями О k Т, а конформация цепей тетраплекса очень близка к конформации В-формы (рис. 12в).

5. Анализ частоты встречаемости а природных нуклеотидных последовательностях протяженных участков из повторяющихся динуклеоткдов

В отличие от канонических форм, нестандартные структуры проявляют склонность к специфическим повторяющимся последовательностям иуклеотидов. При этом в каждом случае повторяющаяся единица состоит аз одного-двух иуклеотидов. Учитывая имеющийся к настоящему времени богатый экспериментальный материал в виде банков нуклеотидных последовательностей, мы сочли необходимым провести оценку частоты встречаемости таких повторов в различных организмах.

Нами рассмотрены все возможные повторы из двух нуклеотидов, которые с учетом комплементарносги цепей разбиваются на 6 классов:

I АА, TT

II AG, ТС

III AT

IV GC

V GG. CC

VI GT. AC.

Для каждого класса производился поиск всех фрагментов с длиной не меньше М (N — 10, 20, 30, 40) нуклеотидов, образованных повторением одной из пар рассматриваемого класса. При этом комплементарная цепь оказывается повтором второй пары этого класса. Учитывая то, что для образования каждой структуры

существует своя характерная минимальная длина повторяющегося участка, мы рассмотрели соответствующие частоты при различных значениях N.

С помощью составленных нами программ анализировались все нуклеотидные последовательности, включенные в 29-й выпуск ЕМВКинка (состояние на декабрь 1991 г.) .

Мы использовали принятое в ЕМВЬ-банках объединение последовательностей в подбазы в соответствии с видовой принадлежностью (табл. 6).

Таблица 6.

Принятое в EMBL-банке разбиение расшифрованных последовательностей на подбазы

ODraH«3M Название подбазы

Bacteriophage PHG

Prokaryotes PRO

Viruses VRL

Organells ORG

Fungi FUN

Plants PLN

Invertebrates INV

Other vertebrates VRT

Other Mammab MAM

Rodents ROD

Primates PRI

Исследователям, занимающимся анализом первичных последовательностей, хорошо известно, что высока частота встречаемости чередующихся "АС"-участхов и олигоаденивовых блоков. Результаты проведенного нами анализа для повторов с длиной не меньше 20 нуклеотидов (табл. 7) позволяют говорить о большем - о том, что распределение протяженных повторов не только далеко от случайного, но и существенно зависит как от набора повторяющихся динухлеотидов, так и от происхождения последовательностей. Для каждого из 6 классов, за исключением IV (ОС), соответствующие фрагменты многократно присутствуют во многих организмах, хотя участки такой длины должны быть уникальными в случайных последовательностях с длиной, соизмеримой с длиной всего генома человека.

В первую очередь отметим, что повторы почти не встречаются в вуклеотид-ных последовательностях фагов, прокариот, чуть чаще присутствуют в последовательностях вирусов и органелл. Последовательности позвоночных, и в особенности млекопитающих, (в т.ч. грызунов и приматов), проявляют ярко

Таблица 7.

Частота встречаемости и максимальная протяженность участков вз повторяющихся данухлеотидов с длиной не меньше 20

Подбаза Раз- АА, АТ АО, ТС АТ ОС со. СС вт, АС

мер, МБ

МД* чв" МД ЧВ МД ЧВ МД ЧВ МД ЧВ МД ЧВ

РНО 0,9 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0

РЙО 12,0 41 0,3 0 0 23 0,1 0 0,0 0 0,0 0 0,0

УЫ. 9,3 68 2,5 76 0,2 56 0,8 0 0,0 144 . 0,6 58 1.0

ояо 3,1 51 2,9 0 0,0 64 154 0 0,0 26 1.0 0 0,0

гии 4,6 58 14,8 38 0,4 38 12,0 0 0,0 28 2,6 55 0,9

РШ 3,9 100 17,9 46 5,1 76 13,3 0 0,0 22 03 47 0,8

ШУ 6,7 65 50,4 124 3,0 58 26,6 0 0,0 23 1.6 102 9,0

УИТ 3,3 102 20,3 47 3,6 78 8,8 0 0,0 25 3.0 66 6,7

МАМ 2,8 73 17,1 46 5,4 40 2,1 0 0,0 25 0,4 61 17,5

1кго 11,9 72 19,3 120 18,4 62 3,5 24 0.2 38 0,7 69 39,3

РМ 13,7 76 26.2 52 4,7 56 2.2 25 0,1 33 0,4 59 22,7

Длина максимального повторяющегося фрагмента (нукл.)

Число повторов, длина которых не меньше 20 вуклеотидов, приходящихся на 1 млн. нуклеотндов.

Рис. 13. Частота встречаемости в геноме различных организмов повторов динуклеотндов каждого из б классов с минимальной учитываемой длиной повтора 10 (а), 20 (б), 30 (в), 40 (г). Высота прямоугольника каждого цвета соответствует числу повторов в 1 млн. оснований подбазы.

выраженную склонность к включению фрагментов I (АА, ТТ), II (АО, СТ) и VI (АС, СТ) классов, при этом фрагменты III класса (АТ) встречаются на порядок реже. В то же время фрагменты III класса часты в последовательностях оргаиелл, грибов, растений и беспозвоночных.

На рис. 13 представлены относительные количества повторов каждого класса в 1 миллионе оснований известных нуклеотидных последовательностей. Неудивительно, что для малых длин (рнс. 13а) картина оказывается слабо упорядоченной. Это связано с высокой частотой встречаемости я случайных последовательностях каждого участка с длиной около 10 иуклеотидов.

Для длин повторов, не меньших 20 (рис. 136), хорошо просматривается целый ряд закономерностей. Так, последовательности млекопитающих часто содержат повторы VI класса при крайне малом числе фрагментов III класса, а для организмов, расположенных на рисунке левее беспозвоночных, много повторов III класса при малом числе фрагментов VI класса.

Беспозвоночные и позвоночные, отличные от млекопитающих, оказались на границе, что возможно связало с широким видовым составом и необходимостью в узком приспособлении к различным условиям обитания. При более детальном рассмотрении видов подбазы УЙТ оказалось, что склонность к фрагментам III типа проявляют земноводные, а к фрагментам VI класса - куры. Однако, отметим, что в настоящее время невелико число видов, представленных в этой подбазе.

Как и следовало ожидать, практически все повторы находятся в некодиру-ющих участках генома. Около 90% всех найденных нами регулярных фрагментов не пересекаются с участками, помеченными в ЕМВЬ-банке в качестве кодирующих. Это лишний раз заставляет обратить внимание на значимость рассматриваемых фрагментов в процессах функционирования.

Для проверки гипотезы о высокой частоте повторов у высших животных 1 связи с большей долей некодирующей части генома мы подсчитали для каждой подбазы долю участков, помеченных в банке в качестве кодирующих (рис. 14) Этот рисунок показывает, что в каждой подбазе доля кодирующих участков малс отличается от 50%. Эта проверка позволяет с большей уверенностью говорить с том, что при продвижении по эволюционному дереву в рассматриваемых подбаза) увеличивается значимость повторов , а не относительное количество кодирующш участков.

Попробуем провести параллели между протяженными повторами и тем) пространственными структурами, которые они могли бы образовывать. Протяжен ные повторы II класса являются важным элементом Н-формы ДНК. Доля таки повторов оказалась существенной в последовательностях растений и эукариот.

Участки I в VI классов нам представляются интересными в связи с рассмот ренной выше стерической возможностью образования из них четырехцепочечны

МЛН

Рис. 14. Число расшифрованных нуклеотидов, содержащихся в каждой подбазе EMBL-банха (общая высота прямоугольника) и доля кодирующих нук-леогидов (светлые прямоугольники).

спиралей. Подчеркнем, что высока частота встречаемости длинных GT-повторов (рис. 13г),,что говорит о том, что существовали механизмы, которые их закрепляли. Одной из возможных причин такого закрепления может быть рассмотренная вами ранее способность таких участков образовывать четверные спирали с вылет-леннымя гвмивамв.

Образование четверных структур могло бы относиться и к несколько более редким и более коротким АА-повторам. Конечно, большую роль может играть легкоплавкость таких участков, но, учитывая легкоплавкость также и фрагментов III класса, следует обратить внимание на специфичность частоты встречаемости фрагментов I в III классов для последовательностей органелл и грызунов (рис. 136).

Повторы гуанинов, образующих обнаруженные С4-структуры, встречаются реже, чем повторы I, II, III и VI классов. Мы полагаем, что это может объясняться тем, что С4-сгруктуры обладают высокой термостабильностью, которая в какой-то степени может приводить к "консервации". Возможно, это свойство и приводит к несколько большей частоте GG-повторов для грибов в беспозвоночных. Отдель-

ные длинные вхождении таких повторов в геном вирусов также могут быть связаны с необходимостью выживании вирусов в экстремальных условиях.

Экспериментально показано, что ¿-форма образуется на участках ДНК с чередующейся пурин-пиримвдиновой последовательностью оснований. Наиболее устойчивыми оказываются участки с чередующейся ОС-последовательностью, при этом для кооперативное™ перехода нужны участки с длиной около 40 нуклеотидов. Таких участков нет в известных к данному моменту последовательностях. Это заставляет либо более критично отнестись к биологической роли г-формы, либо считать, что по каким-то причинам важна некоторая ее дестабилизация за счет включения чередующихся ЛТ-участков, доля которых в геноме, как следует из представленных вами результатов, велика.

Конечно, подобное сравнение будет более существенным после того, как окажутся полностью расшифрованными геномы каких-то высших животных, но и в данный момент анализ известных последовательностей позволяет однозначно сделать вывод о неслучайности включения изученных повторов, об их эволюционной специфичности и, как следствие, о функциональной значимости таких участков.

В любом случае приведенные данные о частоте повторов в сочетании с исследованием информационных возможностей соответствующих структур показывают, что рассмотренные в данной работе объекты заслуживают дальнейшего исследования.

выводы

1. Предложено описание различных типов параллельных регулярных структур ДНК. Разработаны алгоритмы и соответствующее математическое обеспечение поиска всех оптимальных структур с различной взаимной ориентацией оснований и сахарофосфатных остовов.

2. Впервые проведен информационный анализ симметричных параллельных структур ДНК, построенных на основе пар оснований с симметричной геометрией.

3. Впервые для всех возможных вариантов образования АТ-пар проведен информационный анализ гетерономных параллельных спиралей ро1у(с1А) • ро1уМТ), выявивший их отличие от антияараллельных структур ДНК при столь же широком многообразии их форм. Обнаружены структуры с низкой энергией как для прямых и обратных уотсон-криковских пар, так в для пар с хугстиновским вариантом связывания. Показано, что оптимальной является структура на основе обратного уотсон-криковского варианта спаривания с величинами углов, близкими к величинам углов В-формы ДНК. Оптимальной является С2'-эн&>-коифор-мация сахара.

4. Впервые исследована возможная подвижность различных конформеров, показавшая, что параллельная спираль с обратными уотсон-криховскимн парами и хонформационнымв углами, близкими к углам в В-форме ДНК, обладает наибольшей флуктуационной свободой.

5. Впервые рассчитаны параллельные спирали ДНК с АТ-па рами и чередующейся последовательностью оснований. Показано, что я в этом случае оптимальной является форма с обратным уотсон-криковским вариантом спаривания оснований в хонформацией сахарофосфатвого остова, сходной с информацией остова В-формы ДНК. Подвижность спиралей с чередующейся последовательностью оказалась несколько ниже подвижности гетерономных структур.

6. Расчет параллельных спиралей с ОС-парами показал, что в этом случае более устойчивыми являются структуры, образованные на основе прямого уотсон-криковского варианта спаривания. Показано, что включение ОС-пар в параллельную спираль с АТ-парами приводит к дестабилизация, зависящей от числа таких включений и от порядка их чередования с АТ-парами.

7. Проведен информационный анализ комплексов нуклеиновых кислот, составленных из Четырех нитей. Расчет показал, что существует несколько сте-рически допустимых структур с различающимися вариантами организации слоя из четырех оснований.

8. Проведенное сопоставление информационных расчетов параллельных спиралей с экспериментальными результатами по изучению термодинамики об-

разоваиия параллельных спиралей обнаружило, что оня хорошо согласуются и дополняют друг друга .

9. Предложенная вами модель образования четверных спиралей находится в хорошем согласии с полученными в ряде работ экспериментальными данными.

10. Результаты анализа банка нуклеотидных последовательностей указывают на высокую частоту встречаемости протяженных фрагментов, способных образовывать структуры ДНК с параллельной ориентацией цепей.

СПИСОК

работ, опубликованных по теме диссертации

1. И.Д.Бобрускнн, Б.П.Готгих, А.М.Крицын, Ю.ПЛысов, М.Ю.Покровская, Л.Ю.Тычииская, ВЛ.Флорентьев "Изучение информационной ситуации в водном растворе дянуклеозидфосфатов методом ядерного магнитного резонанса" Биофизика, 1980. т. 25. с. 745-760.

2. Л.Ю.Тычинская, Б.П.Готгих, А.М.Крицын, Ю.ПЛысов, А.К.Щелкнка, ВЛ.Флорентьев "Изучение конформационной ситуации в водном растворе аде-нил-(3'-5')-аденозина и его конформацяоняо подвижных аналогов методом кругового дихроизма" Молекулярная биология, 1980. т. 14. с. 1159-1172

3. М.Ю.Покровская, Ю.ПЛысов, Л.Ю.Тычинская, ВЛ.Флорентьев "Изучение конформационной ситуации в водном растворе динуклеозидфосфатов при помощи спин-решеточной релаксации протонов" Молекулярная биология, 1980. т. 14. с.1413-1419.

4. Ю.ПЛысов, В.Б.Журкин, В.И.Иванов, ВЛ.Флорентьев "О конформаци-онных возможностях регулярных одноцепочечных полирибонуклеотидов" Молекулярная биология, 1982. т. 16. с. 1063-1074.

5. V.B.Zhurkin, Yu.P.Lysov, V.L.Florentiev, V.I.Ivanov "Torsional Flexibility of B-DNA as Revealed by Conformational Analysis" Nucleic Acids Res., 1982. V. 5. P. 1811-1830

6. М.Ю.Покровская, Ю.ПЛысов, Н.В.Гнучев, ВЛ.Флорентьев "Конформа-ционные возможности Полинуклеотидов. Изучение конформационной ситуации в водном растворе АрА, АрС, СрА и СрС с помощью скоростей спин-решеточной релаксации протонов* Бкоорганическая химия, 1984. т. 10. с. 1508-1524.

7. М.Ю.Покровская, Ю.ПЛысов, ВЛ.Флорентьев "Конформация динуклеозидфосфатов: гипотеза информационного кодирования" Молекулярная биология, 1985. т. 19. с. 98-109.

8. A.K.Shchyolklna, Yu.P.Lyiov, I.A.Il'ichova, A.A.Chernyl, Yu.B.Golova, B.K.Chernov, B.P.Gottikh, V.LFIorentlev "Parallel stranded DNA with AT base pairing" FEBS Letters. 1989. V. 244. P. 39-41.

9. А.К.Щелкина, Ю.ПЛысов, A.A.Черный, И.А.Ильичева, Ю.Б.Голова, Б.К.Чернов, Б.П.Готгих, ВЛ.Флорентьев "Экспериментальное доказательство существования параллельной двойной спирали ДНК" Доклады АН СССР, 1989. т. 304. с. 476-480.

10. А.К.Щелкина, Ю.ПЛысов, И.А.Ильичева, А.А.Черкый, Ю.Б.Голова, Б.К.Чернов, Б.П.Готтих, ВЛ.Флорентьев "Параллельные двойные спирали ДНК. Доказательство существования параллельной спирали с АТ-спариванием оснований" Молекулярная биология, 1989. т. 23. с. 295-305.

11. И.А.Ильичева, Ю.ПЛысов, А,А.Черный, А.К.Щелкина, Б.П.Готгих, ВЛ.Флорентьев "Параллельные двойные спирали ДНК. И. Конформационный анализ регулярных спиралей, имеющих ось симметрии второго порядка" Молекулярная биология, 1989. т. 23. с. 1145-1162.

12. С.Н.Михайлов, С.В.Мешков, Д.А.Кузнедов, Ю.ПЛысов, Е.Ш.-Б.Горе-лик, М.В.Фомичева, Л.Н.Бейгельман, Н.Ш.Падюкова "Конформациониые особенности 5'-С-метилнуклеозидов" Биоорганическая химия, 1989. т. 15, с. 969-978.

13. О.Ф.Борисова, Ю.Б.Голова, Б.П.Готгих, А.С.Зибров, И.А.Ильичева, Ю.ПЛысов, О.К.Мамаева, Б.К.Черноз, А.А.Черный, А.К.Щелкина, ВЛ.Флорентьев "Параллельные двойные спирали я третичная структура нуклеиновых кислот" Молекулярная биология, 1989. т. 23. с. 1535-1553.

14. Л.П.Савочкина, Т.В.Свиряева, Л.Н.Бейгельман, Н.Ш.Падюкова, Д.А.Кузнецов, Ю.ПЛысов, С.Н.Михайлов, Р.Ш.Бибилашвили "Субстратные свойства С'-метилнуклеозндфосфатов в реакция синтеза РНК, катализируемой РНК-полимеразой Escherichia со1Г Молекулярная биология, 1989. т. 23. с. 17001710.

15. I.A.U'ychova, Yu.P.Lysov, A.A.Chernyi, A.K.Shchyolkina, B.P.Gottikh, V.L-Floreiitiev "Parallel Double Helices of DNA. Conformational Analysis of Regular Helices with the Second Order Symmetry Axis" I. of Biomolec. Struct, and Dynamics, 1990. V. 7, P. 879-897.

16. S.N.Mikhailov, N.Sh.Padyukova, Yu.P.Lysov, L.P.Savochkina, Z.G.Chidgeavadze, R.Sh.Beabealashvilli "Substrate Properties of C'-Methylnucleoside and C'-Methyl-2'-Deoxynudeoside 5*-Triphosphates in RNA and DNA Synthesis Reactions Catalysed by RNA and DNA Polymerases" Nucleosides & Nucleotides, 1991. V. 10 (1-3). P. 339-343.

17. A.A.Chernyi, Yu.P.Lysov, IA.Il'ychova, A-S.Zibrov, A.K.Shchyolkina, O.F.Borisova, O.K.Mamaeva, V.L.Florentiev "Four-Stranded DNA Helices: Conformational Analysis of Regular PolyCdT) Poly(dA) Poly(dA) Poly(dT) Helices

with Various Types of Base Binding" J. of Biomotec. Struct, and Dynamics, 1991. V. 8. P. 513-527.

IS. А.А.Черный, Ю.ПЛысов, И .А.Ильичева, А.К.Щелкина, ВЛ.Флорентьев 'Параллельные двойные спирали ДНК. Конформациокный анализ регулярных спиралей поли (dA) • поли (dT) с различными вариантами связывания оснований" Молекулярная биологии, 1991. т. 25. с. 264-272.

19. O.F.Borisova, Yu.B.Golova, B.P.Oottikh, A.S.Zibrov, I.A.Il'icheva, Yu.P.Lysov, O.K.Mamayeva, B.K.Chernov, A.A.Chernyi, A.K.Shchyolkina, V.LFlorentiev "Parallel Double Stranded Helices and the Tetriaiy Structure of Nucleic Acids" J. of Biomotec. Struct, and Dynamics, 1991. V. 8. P. 1187-1210.

20. А.А. Черный, Ю.ПЛысов, И-А.Илыпева, А.С.Зибров, А.К.Щелкина, О.Ф.Борисова, О.К.Мамаева, ВЛ.Флорентьев "Четырехцепочечные спирали ДНК. Конформациокный анализ регулярных спиралей поли (dT)* поли (dA)- поли (dT)- поли (dA) с различными вариантами связывания оснований" Молекулярная биология, 1991. т. 25. с 264-272.

21. О.Ф.Борисова, А.К.Щелкина, О.К.Мамаева, Ю.ПЛысов, А.А.Черный, АЛ.Горин, Э.Н.Тимофеев, ВЛ.Флорентьев "Структуры повторяющихся последовательностей d(OT)s с антипараллельными цепями" Молекулярная биология, 1992. т. 26. с. 452-464.

Подписано в печать 08.04.92 Сдано в набор 08.04.92 Формат 60x90 1/16 Бум.офс. Печать офсетная

Усл.печ.л.3,0 Усл.-г1ф.отт. 3,12 Уч.-гизд.л. 3,13

Тир. 100 экз. Заказ «¡091

Производственногиздательский комбинат ВИНИТИ 140010, Люберцы 10, Московской обл.. Октябрьский проспект, 403