Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование трехцепочечных ДНК с различной ориентацией цепей

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование трехцепочечных ДНК с различной ориентацией цепей"

На правах рукописи

Цыбенко Сергей Юрьевич

,< / / 114!

различной ориентацией цепей

Исследование трехцепомечных ДНК с

03.00.03. - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1997 год

1250ЬЧ

Работа выполнена в лаборатории химии белкового синтеза Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардга РАН

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Флорентьев В. Л. (ИМБ)

кандидат физико-математических наук Ильичева И. А. (ИМБ)

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, проф.

Туманян В. Г. (ИМБ)

доктор химических наук, профессор Маленков Г. Г. (ИФХ)

Ведущая организация: Московский Государственный Университет

им. М. В. Ломосова, химический факультет, кафедра химии природных соединений

Защита состоится ¿¿¿¿/¿¿О" 1997 года в /¿¿-часов на заседании

диссертационного совета Д 002.79.01. при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардга РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардга РАН.

Автореферат разосланс .¿¿¿У 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Крицын А. М.

Актуальность проблемы

Образование трехцепочечных спиралей впервые было обнаружено Фельзен-фельдом и соавт. 40 лет назад. Позже были описаны две различные формы трех-нитчатой ДНК, отличающиеся направлением сахарофосфатного остова хугстинов-ской цепи и идентичной ей цепи уотсон-криковского дуплекса: ангапараллельные и параллельные тригогексьг.

Особое внимание триплексные формы нуклеиновых кислот привлекли к себе в связи с поисками агентов для геннаправленных воздействий на ДНК: создание адресуемых редкощепящих рестриктаз, специфического подавления экспрессии генома, направленного введения меток, выделения конкретных молекул ДНК из смеси и т.д. Прогресс в применении триплексов во многом может стимулироваться исследованием детального строения этих структур с помощью расчетных методов.

Цель и задачи исследования

Данная работа посвящена исследованию строения гексамерных фрагментов триплексов следующего состава: dA-dT:dT с ангипараллельной и параллельной ориентацией тиминовых цепей и dA-dT:dC с антипараллельной и параллельной ориентацией пиримидиновых цепей.

Первой стоящей перед нами задачей было построение стартовых моделей и выбор стратегии процесса оптимизации конформационной энергии молекул. Далее велись молекулярно-динамические расчеты на наносекундных траекториях исследуемых фрагментов триплексов с целью исследовать поверхность потенциальной энергии вышеперечисленных гексамерных фпагменгов.

Научная новизна и практическая ценность работы

Известно, что трехцепочечные ДНК могут существовать в живых клетках. Гомопурин-гомопиримидиновые последовательности широко распространены в эукариотических геномах. Исследования in vitro показали, что искусственно созданные олигонуклеотиды образуют с ними антипараллельные триплексы с высоким уровнем специфического узнавания, что позволяет проводить эксперименты с целью создания агентов, узнающих заданные последовательности двойной спирали ДНК.

Прогресс в применении триплексов во многом зависит от детального знания их структуры и влияния на нее внешних условий. Длительное время представления о структуре триплексов основывались исключительно на первых рентгеноструктур-ных работах Арнотта, которым была предложена конформационная модель, напоминающая по своим характеристикам А-форму ДНК. Вплоть до начала 90-х годов никаких новых результатов в этом направлении получено не было, хотя старая модель противоречила множеству накопленных экспериментальных данных.

Сравнительно недавно, на основе расчетных данных, была предложена новая модель, информация всех трех цепей которой одинакова и близка к конформации В-формы ДНК. Другие работы продемонстрировали существенную гетерогенность

конформации триплексов и возможность сосуществования СУ-эндо- и С2'-эндо-форм Сахаров в разных цепях. Значительный успех в разрешении структуры триплексов, достигнутый за последние время, связан с применением расчетных методов, а также комбинации их с ЯМР.

В данной работе с помощью молекулярно-динамических расчетов на наносе-кундных траекториях исследована поверхность потенциальной энергии различных гексамерных фрагментов триплексов. Определены доминирующие в равновесной смеси популяции ДНК, пределы допустимых изменений внутренних параметров и отвечающие им характеристики спиральных преобразований. Определены закономерности, управляющие взаимно скоррелированными движениями атомов. Приведены параметры структуры с низкой энергией, отвечающие как регулярным, так и нерегулярным спиралям. Описаны характерные межцепные взаимодействия, способные вызывать локальные N<->S переходы в отдельных участках спирали, и влияние на эти взаимодействия эффективных зарядов на фосфатных группах. На основании полученных данных высказано предположение о характере зависимости конформационных параметров триплексов от степени экранирования фосфатов в растворе.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Международном Симпозиуме (Thirty-fourth Sanibel Symposium, Florida, 1994), на конкурсе научных работ ИМБ РАН в 1995 году (П-я премия). По материалам диссертации опубликовано четыре работы и одна принята в печать.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 88 страницах машинописного текста, иллюстрирована 29-ю рисунками и содержит 6 таблиц. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание метода, результаты и их обсуждение, выводы, расчетную часть и список цитируемой литературы (всего 117 источников).

Методы расчета

Расчеты проведены с помощью программного пакета HyperChem™ в рамках Amber 3.0. Потенциалы электростатических взаимодействий и водородных связей были нами модифицированы. В расчетах использовались атомные заряды, определенные с помощью метода AMI.

Расчеты проведены без введения молекул воды и ионов в явном виде. Экспериментально установлено, что эффективный заряд* на фосфатной группе, вследствие его частичной экранизации катионами растворителя, варьирует от -0.3 до -0.5.

Заряды приведены в долях заряда электрона, взятого с противоположным знаком, так что заряд электрона в наших обозначениях равен -1, а заряд протона — 1

Расчет электростатической составляющей конформациошюй энергии проводили с диэлектрической константой, пропорциональной расстоянию, с коэффициентом равным единице (e=kRij, где к=1 ), для учета полярности водного окружения. Электростатические и ван-дер-ваальсовы взшшодействия учитывали для всех расстояний. Для взаимодействий типа 1-4 эти составляющие энергии учитывали с коэффициентом 0.5.

Построение стартовых моделей для оптимизации конформаци-онной энергии

Успех конформациотшых расчетов в огромной степени зависит от выбора стартовых конформаций молекулы, используемых для оптимизации потенциальной энергии. Очень важно, чтобы начальная структура находилась как можно ближе к глобальному минимуму. В этом случае вероятность определения конформациошюй поверхности вблизи глобального минимума при ограниченном времени счета заметно выше.

Для молекул, состоящих из слабо связанных между собой подсистем, весьма эффективным может оказаться перебор всех комбинаций, соответствующих разным локальным минимумам каждой из подсистем. Учитывая это, мы выбрали такую стратегию определения оптимальной конформации макромолекулы, когда стартовые точки для минимизации потенциальной энергии были построены из энергетически оптимальных фрагментов. После чего проводили многоступенчатую оптимизацию энергии всей структуры в целом.

Единственным ограничением на конформацию, которое мы приняли a 'priori, была аип'-ориентация оснований относительно сахарных циклов не только в уотсон-криковских, но и в третьей цепи. Это ограничение объясняется тем, что syn-ориентация энергетически очень невыгодна для пиримидиновых нуклеотидов.

В качестве первого шага — определения наиболее выгодной геометрии водородных связей в триплете — мы исследовали подсистему, состоящую из плоских троек водородно-связанных оснований. Для этой цели была написана специальная программа, позволяющая определить потенциальную поверхность в плоском триплете в зависимости от расположения уотсон-криковской пары

, _ _ и третьего основания. Изменяли три обоб-

Рис. 1. Обобщенные координаты ЩСШ1Ые коордшшъ1 систеш>1 _ положеШе

выбранной точки хугстиновского основания в средней плоскости пары и его поворот вокруг этой точки (рис. 1). Шаг сканирования по обобщенным координатам был выбран из анализа изменения потенциальной энергии в используемой нами системе потенциальных функций и параметров таким, что ни один локальный минимум глубже 0.6 ккал/моль не мог быть пропущен. Из узлов полученной после сканирования решетки была произведена оптимизация потенциальной энергии с помощью программы, реализующей алгоритм градиентного спуска в тех же координатах, что и при сканирован™.

б) "Н-вМЛ" 8.52'

в) 'КН" т 9.01 ' т

П ®

д) "ЯН" 8.44

е) "Н-БЫй" 8.72

Рис. 2. Триплеты, обладавшие оптимальней энергией связи после оптимизации в плоскости. Для каждого триплета приведено значение энергии связи третьего

основания с дуплексам

На рис. 2 приведены наиболее низкоэнергегаческие варианты плоских водо-родно-связашшх триплетов АТТ и АТС. Выигрыш в потенциальной энергии показанных триплетов по отношению к ближайшему конкуренту не менее 3 ккал/моль. Для гомополимеров такой разницы в энергии достаточно, чтобы относительный вес структур с другими вариантами водородных связей был пренебрежимо мал.

Потенциальная поверхность фуранозного цикла достаточно хорошо изучена. Поэтому на первом этапе построения трехспиральных структур мы использовали наименее напряжешше формы цикла — С2'- и СЗ'-эидо-конформации, Поскольку мы рассчитывали гомонуклеотидные последовательности, конформации сахара в каждой цепи дня всех остатков считали одинаковым!, а конформации сахара для двух разных цепей могли быть различными. В этом случае для каждой спиральной гомотриплелюи структуры существует 23=8 начальных варишгтов конформацион-

ного состоя пи нуклеотидов. Каждая из трех цепей может находиться в одном из двух состояний: А-состоянии с СЗ'-эмдо-формой сахара или В-состоянием с С2'-эн<)о-формой сахара. Количество структур удваивается, если хугстинов-ская нить пуриновая, так как в этом случае рассматривается возможность .туи-ориентации в третьей цепи.

При построении стартовых конформаций фрагментов трехцепочечечных спиралей было использовано предположение о том, что ось спирали перпендикулярна плоскости оснований и, следовательно, параллельна оси OZ (рис. 3), начальное расстояние между плоскостями соседних триплетов 3.38 А. Угол спирального закручивания а вокруг OZw положение самой оси OZ получали аналитически для каждого типа триплетов таким образом, чтобы расстояшм между С Г атомами вдоль одной цепи в зависимости от выбранной начальной конформации этой цепи были равны расстояниям между этими атомами в классических В-(4.96 А) и А- (5.36 А) формах. Если решений два, то выбирается то, для которого угол а больше, так как его физический смысл соответствует спирали с осью, лежащей ближе к центру триплета. Физический смысл второго решения — сдвиг с маленьким углом а, при котором ось закручивания удалена от триплета.

Стратегии процесса оптимизации энергии

Для всех триплетов (рис. 2) таким методом было сконструировано 8 начальных структур гексамерных фрагментов триплексов, отличающихся конформациями сахарофосфатного остова. Длина фрагментов была выбрана из соображений разумности времени счетов. Оптимизацию энергии проводили с помощью программы

Рис. 3. Ориентация соседних по цепи триплетов друг относительно друга при построении структур для дальнейшей оптимизации их геометрии

НурсгСЬет™. Каждую из структур оптимизировали двумя способами. Первый заключался в том, что на начальном этапе на изменения конформации сахарофосфа-тов и водородные связи накладывали ограничения с помощью параболических потенциалов. Во втором сначала оптимизировали только конформацию сахарофосфа-тов в поле фиксированных триплетов, а затем оптимизировали только структуру триплетов в поле полученных конформаций сахарофосфатов. В обоих случаях на конечном этапе все ограничения убирали. В результате было получено от 16 до 32 вариантов конформаций трехцепочечных спиралей для каждого из триплетов. В каждой группе конформеры сортировали в порядке возрастания энергии и анализировали структуры пофрагменгно. Если же удавалось обнаружить конформационную закономерность, приводящую к понижению потенциальной энергии какого-либо фрагмента в гексамере, то делали попытку распространить ее на всю структуру, и из полученной таким образом новой стартовой точки опять проводили оптимизацию энергии.

На всех стадиях минимизации энергии использовали метод сходимости Поллака—Рибъерре. Предварительные этапы минимизации энергии проводили до градиента 0.01 ккал/А, конечный — до 0.00001 ккал/А. Во всех расчетах использовали явное представление всех атомов водорода.

Молекулярная динамика

Для наиболее удачных структур были проведены молекулярно-динамические расчеты. Для величины шага интегрирования использовали значение 0.0005 пс. Именно такая величина считается удовлетворительной для молекулярно-динамических расчетов структур с явными водородами при комнатной температуре. Выбор шага интегрирования чрезвычайно важен для правильной статистики кон-формационных состояний молекулы. В том случае, когда шаг интегрирования недостаточно мал, в первую очередь нарушается статистика водородно-связанных состояний. Необходимо заметить, что даже при незначительных увеличениях шага интегрирования происходит катастрофическое уменьшение времени, на протяжении которого структура помнит свое начальное состояние. В частности, при увеличении шага интегрирования в четыре раза, динамические расчеты систем с явными водородами теряют смысл.

Структуры нагревали от абсолютного нуля до 25°С в течение 100-300 пс с шагом в 0.1 °С. После нагревания молекулы предоставляли самим себе и наблюдали за их поведением. Поскольку с изменением потенциальной энергии изменяется и температура системы, на каждом шаге производили частичную ее коррекцию. Время затухания температурных флуктуации было выбрано специально большим (10 пс). Таким способом мы накапливали достаточное количество данных для статистического анализа исследуемых структур при температуре 25 °С. На следующем этале мы произвели отжиг, стартуя из нескольких конформаций, полученных при 25 °С, в течение от 120 пс до 300 пс способом, аналогичным нагреванию. После того, как температура структур была доведена до абсолютного нуля, их оптимизировали, конечную структуру добавляли к списку конформационных минимумов, полученных ранее методом молекулярной механики, и использовали для анализа конформационных закономерностей.

Анализ полученных результатов

Табл. 1. Компоненты энергии в ккал/моль/триплет, полученные для оптимальных триплексов каждого триплета (рис. 2)

Триплет Полная Вален, Вален. Двугр. В-д-В н- Электр

(рис. 2) связей углов углов связей остат.

АГГ Т! а) -57 $1 11ШГ1 ШФШШ 29,20 ШШЙШ ШШШж.

АТТ Т4 0) iJfili 1,10 ilillll 29.15 Ш0Я -3.52 lillii

ATT ТТ в) -53.68 1.08 9.76 29.40 -37.50 -3.84 -52.57

АТТ ТТ г) -55.35 1.16 10.65 28.39 -38.15 -3.73 -53.67

АТС ТТ д) ШШШк ШШШ- II1SI ШШШ1 -4,34 1I1I11II

АТС ТТ е) -49.62 1.06 10.32 27.78 -34.37 -3.95 -50.45

Антипараллельный А ТТ

После проведения оптимизации энергии трехцепочечных спиралей из начальных 32 стартовых конформаций мы пришли к выводу, что антипараллельные формы триплексов имеют наиболее низкую внутримолекулярную энергию в том случае, когда стартовая структура образована триплетом "Н" (рис. 2, "а"). Полная потенциальная энергия, приходящаяся на одну мономерную единицу "Н" триплекса, на 5.73 ккал/моль ниже энергии триплекса, образованного триплетами "Н-$ЫЛ" (табл. 1). Преимущества хугстиновской схемы водородного связывания тиминов третьей цепи с дуплексом проявляется только в составе спирали. Для изолированных триплетов "Н" и различие в энергиях составляет лишь 0.06 ккал/моль (рис. 2).

Глобальный минимум антипараллельной формы триплекса — это конформа-ция, отвечающая А-семейству ДНК, в которой все три нуклеогидные цепи включают СЗ'-эндо-форму сахарного цикла. Она очень близка хонформации трехцепочеч-ной спирали, предложенной Арноттом и соавт..

Из анализа всех полученных структур достаточно явственно следует, что переход тиминовых цепей в В-форму невыгоден, в то время как адениновая цепь возможно способна переходить в В-форму. Наименее напряженная структура, в которой намечается тенденция к переходу сахара в Б-область в тиминовой, причем только в третьей цепи (Р = 110°), проигрывает глобальному минимуму в энергии мономерного звена уже 4.0 ккал/моль.

В мономерных звеньях, составляющих гексамеры, нет полной идентичности за счет эффекта концов. Однако конформации четырех внутренних мономерных звеньев указывают на достаточно высокую регулярность спиралей. Наиболее вероятны монорегулярные спирали, реже встречаются бирегулярные спирали.

В наилучших формах антипараллельных триплексов средний угол спирального вращения изменяется от 29 до 35°, а средний шаг спирали соответственно от 3.3 до 2.8 А. Расположение оснований существенно неплоское и заметно отличается от исходных плоских триплетов, однако картина водородного связывания не меняется.

Величина, которая приближенно характеризует наклон средней плоскости триплета но отношению к длинной оси спирали (аналог утла ТШ, принятого для характеристики двухцепочных ДНК), составляет около 22°.

Особенности конформационного поведения трехцепочечной спирали (с1А-сЛ":с1Т)б с антипараллельно ориентированными пиримидиновыми цепями в процессе молекулярно-динамического моделирования

Молекулярно-динамическое моделировшие конформационного поведешга антипараллельного триплекса было нами проведено несколько раз. Мы варьировали температуру, время затухания температурных флуктуации, проверяли независимость получаемых данных от стартовых точек. Длина основной непрерывной траектории антипарашшпьного триплекса составила 1.05 не и получена при температуре 25°С. Стартовой точкой этой траектории была конформация, отвечающая наиболее глубокому локальному минимуму ангипараллелъного гексамера, построенного на базе триплета "Н" (рис. 2, "а"). Характерной особенностью этой конформации, как было сказано выше, является Ы-фор.ма фуранозных циклов во всех трех цепях.

Распределение углов псевдовращения дезоксирибозы в двух центральных нуклео-тидных фрагментах триплекса, полученное в процессе молекулярно-динамического моделирования на этой траектории, представлено на рис. 4. Подавляющую часть времени сахарные циклы всех трех цепей проводят в пределах И-конформаций — фазовый угол псевдовращения варьирует ог 15 до 50°. Наиболее часто М—>5-1 штенциальный барьер пересекает пуриновая нить поли-А. Для нее наблюдается небольшой пик с максимумом около 135°, в пределах которого система находится около 6% общего времени. Молекулярная механика также подтверждает эти выводы. По данным большого количества оптимизированных структур видно, что в среднем переход одного фу-ранозного кольца из А-подобной конформации в В-подобную приводит к повышению потенциальной энергии на 0.85 ккал/моль/григшет для цепи поли-А и к заметно большим значениям для пиримидиновых цепей.

Угол псевдовращения фурамозы, *

Рис. 4. Распределение угла псевдовращения в фуранозных циклах для двух центральных остатков гексамера (обозначены одинаково) каждой цепи

Для того, чтобы

Рис. 5. Пример поведения двух фуранозных циклов при нагревании для каждой уотсон-криковской цепи, поли-А и поли-Т.

ю

20

30

40 50 60 70

ВрЛкЧ пс

90

100

выяснить, насколько стартовая конформа-ция триплекса, выбранная для молеку-лярно-динамического моделирования, влияет га получаемую статистику хонформа-ционных превращений фуранозных циклов, мы провели дополнительный эксперимент по динамике, стартуя го точки, отвечающей локальному минимуму с более высокой энергией. В нем все сахар-

ные циклы пуриновой цепи находились в Б-формах. На рис. 5 показано изменение углов псевдовращения в двух центральных нуклеотадах уотсон-криковскнх цепей, которое мы регистрировали в течение 100 пс, нагревая структуру от абсолютного нуля до 25°С. На 65 пс нагревания сахара в обеих уотсон-криковских цепях окончательно перешли в Ы-область.

Для описания динамических изменений конформации сахарофосфатного остова мы регистрировали изменения торсионных углов фосфодиэфирных связей сх и ц в двух центральных мономерных звеньях. Значения, полученные для этих углов, типичны для обычной уотсон-криковской ДНК.

Межцепные взаимодействия, которые могут внести дополнительную стабильность в структру трехцепочечной спирали (с1АсГГ:сГГ)б с антипарал-лельно ориентированными пиримидиновыми цепями.

При сравнешш оптимальных антипараллельных триплексов, построенных на основе триплетов "Н" и "Н-зЫИ", мы обратили внимание на очень большое различие в их полных потенциальных энергиях (табл. 1). Чтобы понять причину столь заметных отличий в потенциальной энергии этих двух форм, необходимо было сравнить вклады различных внутрицепных и межцепных взаимодействий в гекса-мерном фрагменте. Таким способом мы определили, что основной выигрыш происходит от взаимодействия уотсон-криковскога и хугспшовсхого пиримидиновых нуклеотадов, расположенных на противоположных концах гексамера: 5'-концевой нуклеотид хугстиновской цепи способен сблизиться с нуклеотидом уотсон-криковской цепи, удаленным от него на четыре с половиной мономерных звена*. Именно в триплете "Н" ориентация гликозидных связей предоставляет сахарофос-фатным цепям триплекса необходимую для такого взаимодействия свободу. Возни-

Вдоль любой из поли-Т цепей, так как они антипараллельны.

какмцее при этом ван-дер-ваатьсовское притяжение может дать выигрыш в потенциальной энергии всей структуры на величину до 5 кк&т/моль/триплет.

Смещение, выраженное нецелым числом, приводит к чередованию зарядов в сближенных сахарах. Дополнительный сдвиг на Уг нуклеотида при таких расстояниях приводит к выигрышу за счет заряд-зарядовых взаимодействий до

1.2 ккал/моль/триплет. Сближение сахарофос-фатных групп приводит к стабилизирующим структуру ван-дер-ваальсовым взаимодействиям между кислородами фосфатной группы, уотсон-

криковской тишшовой цепи и атомами хугсги-новской цепи (водородами Н2' и НЗ', а также с метальной группой соседнего по цепи тимина). Не исключена возможность возникновения слабой водородной связи с участием групп СН-0 (рис. 6). Для формирования таких структур необходима согласованность между целым рядом параметров: подходящий шаг и угол закрутки спирали, соответствующее расположение гликозидных связей, удобная ориентация сахарофосфатов. Еще раз подчеркнем, что атомы, взаимодействие которых стабилизирует структуру, разделены тремя триплетами.

Очень важным конформационным итогом этих взаимодействий являются N-»8 переходы фуранозного цикла, особенно характерные для хутстиновского нук-леотида. При сближении сахарофосфатов двух тиминовых нитей фуранозные циклы хугстиновской цепи около 90% времени проводят в Б-форме. В уотсон-криковской тиминовой цепи переходы Сахаров в Э-форму, спровоцированные взаимодействиями сближенных мономеров, также происходят (примерно 20%), причем, как правило, в противофазе с сахарами хугстиновской цепи.

Мы провели контрольные расчеты с различными эффективными зарядами на фосфатной группе. Оказалось, что начиная с эффективного заряда -0.6 структуры с характерным контактом между сахарами разных пшиновых нитей не образуются.

СЗ'-конеи

Рис. 6. Схема возможного механизма образования донорно-ащепторных взаимодействий между саха-рофосфатными остовами нитей поли-Т антипрал-лельногоАТТ

Параллельный АТГ

После проведения оптимизации энергии трехцепочечных спиралей из начальных 32 стартовых конформаций мы пришли к выводу, что параллельные формы триплексов имеют наиболее низкую внутримолекулярную энергию в том случае, когда стартовая структура образована триплетом "КН^ЫЛ" (рис. 2, "г"). На выбор такой структуры триплета определяющее значение оказывают законы формирования спирали. Действительно, для отдельных триплетов предпочтительнее схема водородного связывания "ЮН" (выигрыш в 0,91 ккал/моль — см. рис. 2).

Глобальный минимум параллельной формы триплекса имеет А-тип конформации в обеих цепях уагсон-криковского дуплекса, в то время как в третьей (тиминовой) цепи наблюдается плавный переход от нуклеотидов с конформацией В-типа (на 5'-конце гек-самерного отрезка) к нуклеотиду с конформацией А-типа (на З'-конце). Поэтому два центральных нуклеощда, за которыми велось наблюдение в процессе моделирования динамики, имеют конформации сахарных цшиов в Е-обласш круга псевдовращения (1^=46° иР=КЮ° для двух центральных мономерных звеньях). В данном случае, в отличие от антипараллельной трехцепочечдой спирали, мы не можем говорить о бирегуляр-ной спират Получена апериодическая структура, отвечающая гексамерному фрагменту. Объяснением этому может являться наличие свободных концов, тяготеющих к различным конформациям сахара. Вследствие этого наблюдаемый переход от С2'- к СУ-эндо-форме при движении вдсль цепи от 5'- к З'-концу необходим. Подобный переход локально дестабилизирует структуру, поэтому он размазан вдоль цепи. Фуранозные циклы вначале плавно переходят из С2'-эндо в СУ-экзо, а затем перескакивают в С4'-зооферму, после чего уже гшавно переходят в С3'-эж)о-форму. Блуждание этой границы находит свое отражение в приводимых ниже результатах динамики.

Несмотря на наблюдаемую конформационую неоднородность, параметры, отвечающие локальным преобразованиям соседних мономерных единиц, практически постоянны 1а всем протяжении оптимальной формы гексамера, вопреки обсуждаемой кон-формационной неоднородности. Более того, для всех конформационных минимумов параллельной спирали значения локальных спиральных преобразований заметно не меняются. По-видимому, это явление связано с ограничениями, накладываемыми на взаимное расположение триплетов оснований. Средний угол спирального вращения параллельных спиралей 34.7±2.0° и средний шаг 3.09±0.04 А.

Нам так и не удалось найти удовлетворительной регулярной структуры для описания параллельного сЗАсГЫТ. Анализ серии локальных минимумов показывает, что опю-сигельно монорегулярная параллельная трехцепочечечная спираль имеет энергию мономерного звена более чем на 3.0 ккал/моль выше, чем средняя энергия мономерного звена глобального минимума гексамера. Эта структура также не является строго регулярной, однако, в отличие от более низкоэнергегических конформеров, в ней нет закономерного информационного изменения следующих друг за другом мономерных звеньев. Поэтому из двух центральных мономеров этой структуры теоретически можно построить спираль любой протяженности, характерной чертой которой будет В-тип конформации уогсон-криковского дуплекса. Особенностью третьей, тиминовой цепи, будет СГ-эюо-форма фуранозных циклов. Однако, данные наших мслекулярно-динамических расчётов не подтверждают существование такой структуры.

В параллельном гексамере наклон средней плоскости триплета по отношению к оси спирали несколько меньше, чем в агаипараллеяьном. Он составляет 15°. Это, по-

А, уотсон-криковская -Т, уотсон-криковсая

~Т, ХуТСТЙНОВСКЗЯ

Л'

видимому, отражает более плоское, чем в ангапараллельных триплексах, строение самих триплетов.

Особенности конформационного поведения трехцепочечной спирали (с)А-с1Т:с1Т)бС параллельно-ориентированными пиримидиновыми цепями при молекулярно-динамическом моделировании

Молекулярно-динамическое моделирование конформационного поведения параллельной трехцепочечной спирали было проведено из стартовой конформации, отвечающей минимуму, полученному после оптимизации энерпш триплекса "1Ш-«ЫЙ". Длина траектории при 25°С составила 1.23 не.

Распределение углов псевдовращения в двух центральных нук-леогидах каждой из цепей показано на рис. 7. Наиболее консервативна в своем поведении уотсон-криковская шпъ поли-А. Пуриновая цепь имеет ярко выраженную СЗ'-энЭо-конформацию, в пределах которой проводит приблизительно 95% всего времени. Положение вершины пика

17-Я 8° совпадает с классическим значением для С3'-эн<3о-конформации. Существует очень небольшой пик, относящийся к С2'-э«до-конформации (145-^160°), в пределах

которого структура проводит около 3% времени. Такое поведение объясняется эн-тальпийным фактором. Средняя потенциальная энергия тригшексов, в которых дезоксирибозы полиадениловой цепи имеют СУ-эндо-конформации, приблизительно на 4 ккал/моль/триплет ниже, чем в случае, когда они имеют С2'-экЭо-конформации.

Поведение обеих нитей поли-Т более

Угол псевдовращения фуранозы, °

Рис. 7. Распределение угла псевдовращения в фуранозных циклах для двух центральных остатков в каждой цепи гексамера при 25°С.

.......... ,

Рис. 8. Распределение значений угла псевдоврещения в двух соседних по цепи фуранозных циклах для уотсон-криковской нити поли-Т при 25°С. Полный интеграл под поверхностью равен 100%

^3 ё"

— оЗ

-у

210 240

Торсионный УГОЛ, °

сложное: они проводят в пределах СУ-ждо- и С2'-эн<Зо-конформаций приблизительно одинаковое время. Заметных отличий в средней потенциальной энергии между этими конформерами не наблюдается. Рис. 8 иллюстрирует корреляцию между изменениями конформаций Сахаров уогсон-криковской цепи поли-Т. Выделяются два центральных пика, соответствующих одинаковым конформациям соседних Сахаров. Интеграл по более близкому из этих двух пиков составляет 31%, а его вершина расположена около 21° по обеим осям (СЗ'-эндо-форма). Второй пик, составляющий приблизительно 34%, ближе к С2'-эядо-форме, значение углов псевдовращения дня его вершины составляет 124°-И32°, что соответствует СГ-экзо-форме.

Величины правого и левого пиков, соответствующих смешашгым состояниям Сахаров вдоль цепи, существенно различаются. Объем левого пика, отвечающего состоянию 5'-С2 '-эн<Эо-(3 '-5' )-СЗ эндо-У, составляет приблизительно 11%, в то время как объем правого пика, описывающего ситуацию 5'-СЗ'-энс)о-(3'-5')-С2'-эндо-У, составляет около 24%. Объяснение предпочтительности смешанного мотива второго типа заключается в том, что это состояние допускает большую конформационнуго свободу фосфатной группы.

Угол а фосфатной группы для уотсон-криковской гшрими-диновой цепи кроме

е классических значе-

ний вблизи 280° имеет еще один пик в районе 170° (рис. 9), в пределах которого система проводит около 20% времаш. Конформа-ции нуклеотидов с величиной утла а в /гаиз-области, и коррелирующим с ней значением угла у в ?гй?м-области, известны для неканониче-

Рис. 9. Распределение величин торсионных углов а и £ сахарофосфатного остова в каждой цепи гексамера при 25°С. Площадь под каждой кривой равна 100%.

Рис. 10. Распределение значений угла псевдоврещения в двух соседних по цепи фуранозных циклах для третьей цепи поли-Т при 25°С. Полный интеграл под поверхностью равен 100%.

ских параллельных двухцепочных нуклеиновых кислот уже давно. Если при построении распределения по углам псевдовращения исключить все структуры с неклассическим значением угла а доя фосфатной группы, расположенной между двумя рассматриваемыми фуранозными циклами, то мы получим практически симметричную картину: два центральных пика приблизительно по 38% и два боковых по 10% (левый) и 13% (правый).

Следует отметить, что неравноценность прямого и обратного переходов можно наблюдать только изучая конечные фрагменты. В полимерных структурах количество обоих переходов всегда одинаково и неравноценность может проявляться только в неравномерном распределении потенциальной энергии вдоль цепи.

Для третьей цепи (рис. 10) два центральных пика, определяющие состояния с одинаковыми конформациями Сахаров, составляют 37% для пика с вершиной около 40+50° (С4'-эгао-формы) и 23% доя пика с вершиной 118+127° (С 1 '-экзо-формы). Объем левого пика, соответствующего смешанной конформации 5'-СГ-эюо-(3'-5')-С4,-экзо-3\ составляет приблизительно 39%, а объем правого, соответствующего состоянию 5 '-С4 '-эюо-(3 '-5' )-С Г-экзо-3' — всего 4%. Объяснение этому мы видим в динамических блужданиях границы перехода между двумя концами гексамера с разной конформацией Сахаров, о которых мы писали выше. Так как переход между С2'- и СЗ'-эндо-формами происходит не скачкообразно, мы регистрируем смещение вершин пиков в сторону С Г- и С4'-экзо-форм при наблюдении центральных триплетов (рис. 7, 10), связанное с небольшой длиной исследуемых фрагментов. Подчеркнем, что из существования небольшого правого пика следует, что в бесконечном полимере не может быть ярко выраженного доминирования ни одной из классических форм сахара.

Итак, в полипуриновой нити гексамера преобладают Ы-формы сахара, а в обеих пиримидиновых нитях происходят кооперативные N->8 переходы. Кроме корреляции между конформациями фуранозных циклов в пределах каждой из цепей, заметна определенная синхронность поведения сахарофосфатных остовов различных цепей.

АТС

Триплет "ГШ" (рис. 2, "д") (энергия связи А-Т-гары с цитозином 8.44 ккал/моль), который может явиться основой для формирования трехцепочеч-ной спирали с параллельной ориентацией пиримидиновых цепей, оказывается менее выгодным, чем триплет "Н-$ЫЙ" (рис. 2, "е") (энергия связи А-Т-пары с цитозином 8.72 ккал/моль) из-за отталкивания сближенных кислородов пиримидиновых оснований.

После проведения оптимизации энергии трехцепочечечных спиралей из начальных конформаций мы пришли к выводу, что параллельная форма триплекса АТС имеет заметно более низкую энергию (Д=2.85 ккал/моль/триплет) по сравнению с антипараллельной. По данным табл. 1 более высокая стабильность параллельной структуры определяется электростатическими взаимодействиями и энергией водородных связей. Основной вклад в увеличение стабильности параллельной формы вносит дополнительная водородная связь (см. рис. 11), возникающая между

одним из водородов №12-группы цигозина, и кислородом 5'-концевой фосфатной группы цепи аденина, формирующего данный триплет. Эта водородная связь приводит к увеличению взаимодействия адениловой и цитозиловой цепей в среднем на 3-^3.5 ккал/моль/триплет. Среднее расстояние между участвующими в связи кислородом и водородом составляет 1.86 А, а среднее расстояние между этими атомами в отсутствие водородной связи — 5.5 А.

I

^ 1. \ ^

У'

Г

V'

I

j

г _L

Структура, обладавшая минимальной энергией после оптимизации, имела характерную особенность. Ее оптимальная геометрия достигалась за счет искажения двух концевых триплетов с 5'-конца пиримидиновых цепей. Два крайних цигозина разворачиваются перпендикулярно остальным. Схема образования водородных связей между цитозинами и уотсон-криковской парой при этом меняется. Кроме нерегулярных структур, мы исследовали целое множество регулярных, характерных дня АТС. Угол спиральной закрутки на триплет в таких структурах составляет около 34.5±2°,

Рис. 11. Стереоизображение характерного фрагмента параллельного триплекса с дополнительной водородной связью

а шаг спирали 3.3±0.2 А. Ось спирали искажена очень незначительно триплет.

1-6° на

Особенности конфюрмационного поведения трехцепочечной спирали (dAdT:dC)e с параллельно ориентированными пиримидиновыми цепями в процессе молекулярно-динамического моделирования

Молекулярно-динамическое моделирование конформа-ционного поведения параллельной трехцепочечной спирали было проведено из двух стартовых кон-формаций. Длина непрерывной траектории при 25 С° составила 1.2 и 2.05 нс соответственно. Во втором случае триплекс не обладал описанным выше конце-

Угол псевдовратенмя фураказы, *

Рис. 12. Распределение значений угла псевдоврещения для всех цепей при 25°С

вым эффектом. Поэтому при статистическом анализе данных динамики мы пользовались второй траекторией, а первую рассматривает лишь как вспомогательную.

Распределение углов псевдовратценш фуранозы в двух центральных нуклео-тидах каждой из цепей показано на рис. 12. Наиболее консервативна в своём поведении уотсон-криковская нить поли-с1А. Фуранозный цикл в этой цепи 99% всего времени проводит в в пределах СЗ'-экЭо-конформаций. Положение вершины пика

3

(Р = 15°) приходится на СЗ'-эндоформы типа конверт ( Е). Существует, правда, крошечный пик, относящийся к С2'-эидо-конформации (Р = 157°). Такое поведение можно объяснил» энтальпийным фактором. Средняя потенциальная энергия трип-лексов, в которых дезоксирибозы полиадениловой цепи имеют СУ-эндо-конформации, приблизительно на 8 ккая/моль/триплег ниже, чем в случае, когда они имеют С2'-эн(Зо-конформации.

Для нити поли-сГГ также предпочтителен К-тип конформации Сахаров. Однако для нее изменчивость формы цикла значительнее, и она, возможно, легко может быть спровоцирована на изменение конформации в зависимости от условий среды.

3

Положите максимума вероятности смещено в сторону твистовых форм ( 4Т), но область 04'-эндо форм также допустима. В пределах форм Б-типа (СГ-экзо-конформации, Р=140°) структура проводит 5-12% общего времени, причем переходы соседних по цепи Сахаров в Б-форму коррелируют между собой. Вероятность перехода второго фуранозного цикла в Б-форму возрастает до 50%, если в этой форме находится его сосед.

Поведение нити поли-С носит гораздо более сложный характер. Вероятность существования Ы- и Б-форм сахара практически одинакова. Максимум вероятности форм Ы-типа (Р = 58°) приходится на С4'-экзо-формы, но существует и еще один небольшой пик в пределах 1\Г-форм (Р = 14°), а максимум вероятности форм липа (Р = 134.6°) близок к твистовым формам (~]Т). Переход Сахаров из Б- в И-формы как правило сопровождается разрывом дополнительной водородной связи. Поэтому такие переходы достаточно редки. Нами замечено, что соседние по цепи нуклеотиды предпочитают одновременно не участвовать в дополнительной водородной связи и, соответственно, имеют разные конформации фуранозных циклов в цитозиновой цепи. При этом допустимы неканонические конформации фосфатной группы. В случае, когда

~о1 ~о2 — оЗ

а

д

Торсионный угол, •

Рис. 13. Распределение величин торсионных углов а и С сахарофосфатного остова в каждой цепи гексамера при 25°С

соседние звенья имеют 5у-С2,-эндо-{Ъ'-5''уСУ-эндо-3'' мотав, угол а может находится в двух областях: 267° и 78°, а поведение угла ц в этом случае еще более сложное (рис. 13). Если угол а = 267°, го есть близок каногшческим значениям, утол £ = 286°. Если же а = 78°, утол С с равной вероятностью может находится в двух областях: 102° и 180°. Мы уже отмечали корреляции между значениями углов а, С, и мотивом конформации Сахаров в соседних мономерах.

На рис. 14 проиллюстрирован процесс образования дополнительной водородной связи. По данным молекулярной динамики вероятность образования связи равна 36% с вершиной пика 1.84 А. В отсутствие водородной связи наиболее вероятное раетошше 4.18 А, но существует и еще один пик с вероятностью около 2% и вершиной при 7 А.

Сравнительный анализ стабильности структур

Табл. 2. Экспериментальные данные по плавлению триплексов (из 10 триплетов) в присутствии 0.25МN<3С1 в сравнении с теоретически рассчитанными

Олиго- АН, Тт', и, Я или <U>,

нуклеотид (ккал/моль) (°С) (ккал/моль) (ккал/моль)

ATTti -3.42 34.0 -57.91 -(-8.65) = -49.26 30.48- 15.25 = 15.23

ATT tf -1.44 20.9 -55.35 - (-8.65) = -46.70 32.83 - 15.25 = 17.58

АТС tt -2.55 22.6 -52.47 - (-6.22) = -46.25 29.34-14.20= 15.14

АТС 14 -49.62 - (-6.22) = -43.40

В табл. 2 мы приводим экспериментальную температуру плавления, и полученную из данных по плавлешпо энтальпию параллельных триплексов, а также расчетную внутримолекулярную потенциальную энергию и ее среднее значение в ходе молекудярно-динамического моделирования. Для более корректной оценки разности энергий трехцепочечных спиралей с!А-с1Т:с1Т и <1А-<1Т:с1С мы ввели поправку на разность энергий одноцепочечных спиралей (1С6 и с1Тб. Проблема заключается в том, что нас интересуют не абсолютные значения энергий, а лишь их изменения при образовании структур, и нельзя сравнивать между собой абсолютные значения энергии для структур, образованных из различных начальных компонентов. Подоб-

Температура плавления является критерием стабильности и не зависит от концентраций, так как реакции мономолекулярные.

1.5 2.5 3,5 4 5 5 5 6,5 7.5 8,5

Р1ССТОЙНИ*

Рис. 14. Распределение величины расстояния между центрами атомов кислорода и водорода, участвующих в образовании дополнительной водородной связи

ные сложности не возникали, когда мы сравнивали параллельный и антипараллельный с1А'с1Т:сГГ в предыдущих работах.

При сравнении потенщ1альной энергии оптимальных структур мы учли разницу в энергиях оснований: Т (-8.647 ккал/молъ) и С (-6.222 ккал/моль). Мы также были вынуждены провести молекулярно-динамические расчеты для шестерки полиТ и поли-С, чтобы иметь возможность сравнить средние потенциальные энергии при температуре 25 °С. Средние потенциальные энергии в пересчете на одно мономерное звено составили 15.25 и 14.2 ккал/моль для <1Т- и сЮ-цепей, соответственно. Для того, чтобы значения потенциальных энергий триплексов dA-dT.dC и с1А-с1Т:с1Т можно было сравнивать между собой, необходимо вычесть из значений энергий для конечных структур соответствующие значения для составляющих их подсистем и(<1А-Л1-ЛС)=и0(АА-<Л-ЛС)-и(<1С) и и(дА-ЛТЛ1)=ио(Лк-ЛТАТ)-и(йТ). Скорректированные таким образом расчетные энергии и приведены в табл. 2.

Если за критерий стабильности триплекса принять температуру плавления, как наиболее воспроизводимый показатель, то мы видам, что температуры плавления и потенциальные энергии для параллельных триплексов с!А-с1Т:с1Т и М-сГЫС почти совпадают. Тем не менее экспериментальное значение изменения энтальпии для с1А-с1Т:с1С лежит между значениями для параллельного и аипшараллельного с1А <ЗТ:с1Т. С другой стороны значение расчетной средней потенциальной энергии для dA-dT.dC совпадает со значением для антипараллельного (¡А-сПМТ. Рассматривая рассчитанные значения энергий, можно сделать вывод, что параллельный dA-dT.dC по своей стабильности не должен заметно отличаться от триплексов <1А^Т:сГГ. Стабильность же антипараллельного с1А^Т:йС, напротив, должна быть заметно ниже. Таким образом качественная оценка стабильности параллельного и антипараллельного сЗА^МС, которую можно сделать с помощью конформацион-ных расчетов, хорошо согласуется с данными УФ-спектроскопических исследований плавления связанных олигонуклеогидов.

Выводы

1. Впервые проведены молекулярно-динамические расчеты параллельных триплексов с!А^Т dT и с1А:ёТ dC, а также антипараллельного (1А:<1Т dT на на-носекундной траектории.

2. Получено теоретическое подтверждение стабилизации дуплексных форм с!А'Ж за счет водородного связывания третьей, олиготиминовой цепи, локализующейся в широкой бороздке дуплекса.

3. Впервые найден ряд характерных внутримолекулярных взаимодействий, стабилизирующих структуры с1Ах1Т dT и ¿А:<1Т dC-тpиroIeкcoв, определяющих их стабильность.

4. Продемонстрирована конформационная лабильность всех исследованных триплексов, при которой существует равновесие между различными конформера-ми. Этот результат объясняет противоречия в существующих экспериментальных данных, предсказывающих разные конформации. Продемонстриро-

вано, что многие цепи могут легко менять свою конформацию в зависимости от условий среды. Также показано, что некоторые цепи, напротив, являются конформационно ограниченными. В допустимом для них конформационном пространстве ряд конформаций вообще не реализуется.

5. В работе показано, что молекулярно-динамические расчеты на наносекундных траекториях позволяют делать количественные выводы об относительной энтальпии структур одинакового начального состава и качественные для разного. Поскольку все структуры трехнитчатой ДНК рассчитывались совершенно одинаковыми методами, их можно сравнивать между собой и с различными экспериментальными данными.

Публикации

1. I. А. ü'icheva, Е. V. TereMiova, S. Yu. Tsybenko, A. G. Kunitzin, V. L. Florentiev, PNA complex of polyamides: structure of two- and three-stranded chimeric helices revealed by conformational analysis, Int. J. of Quantum Chem., 1994,21, 157-172

2. O. F. Borisova, A. K. Shchyolkina, E. N. Timofeev, S. Yu. Tsybenko, A. D. Miizabekov, V. L. Florentiev, Stabilization of parallel (recombinant) triplex with propidium iodide, J. ofBiomol. struct. &Dynam., 1995, 13,015-027

3. С. Ю. Цыбенко, И. А. Ильичева, В. Л. Флоренгьев, Структура и конформаци-онная динамика (dA dT:dT)e с ангипараллельно ориентированными тилшно-выми цепями, Молекуляр. биология, 1997, т. 31, №2, 300-314

4. С. Ю. Цыбенко, И. А. Ильичева, В. Л. Флоренгьев, Структура и конформаци-онная динамика (dA dT:dT)6 с параллельно ориентированными тиминовыми цепями, Молекуляр. биология, 1997, т. 31, №2, 315-323

5. С. Ю. Цыбенко, И. А. Ильичева, В. Л. Флорентьев, Структура и конформаци-онная динамика трехцепочечных спиралей dA-dT:dC состава с различной взаимной ориентацией пиримидиновых цепей, Молекуляр. биология, 1997, принято в печать