Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез и исследование физико-химических свойств неканонических структур ДНК, содержащих параллельно ориентированные цепи

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Синтез и исследование физико-химических свойств неканонических структур ДНК, содержащих параллельно ориентированные цепи"

п г - '

п Ь. он

Российски Академия Наук Институт молекулярной биологии им. В-А-Энгсльгардта.

г

УДК 577.113.6 № правах рукописи

Тимофеев Эдуард Николаевич Синтез и исследование фгаихо-химических свойств неканонических структур ДНК. содержащих параллельно ориентированные цепи.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации 'на соискание ученой степени кандидата химических наук 03.00.03. - Молекулярная биология

Научные руководители: Л.Х.Н., проф. ВЛ.Флорентьев к.ф.-м.н. А.К.Щслхина

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории химии белкового синтеза Института молекулярной биологии им. В.А-Энгсльгардта Российской Академии Наук, зав. лаб. д.х.п., проф. ВЛ.Флоретъсв

Научные рукопошгтели: -' д.х.п.. проф. ВЛ.Флореитъев к.ф.-м.н. А.К.1Дслкина

Официальные оппоненты: д.ф.-к.н., проф. В.И.Иванов, ИМБ РАН.

ЕХ.И. Г-ЕЛозмогова, иекгр "Биоитксцсрка" РАН.

Всдушая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерсхого. МГУ.

Диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологин им. В.А.Эигсльгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова. д32.

Зашита состоится

.1994

на заседании

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Эшгсльгграта РАН.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических нау^.

Актуальность пробпгмм. В настоя шее время известны тр» различные нсгэноиическис структуры ДНК, содержащие пграгт.слыю ориентированные цпли: параллельная ДНК. трех- и чстирехцел очечные комплексы (триилсксы и квадруплексы соответа аеино). Если исследовательский irtrrcpec к параллельной ДНК аспястся скорее теоретическим, то изучение четырех- и. особенно, трехцепочечньи комплексов стимулируется xzx ::х биологической ролью, так и перспективами их использования в качестве генных регуляторов. Что xacacrai триплекса», содер:5ли:нх sns пграллсльные одинаковые цепи (параллельные или рскомбинантннс трнплексы), то их участие в обмене цепей в ходе обшей генетической рекомбинации делает их сбгектгми особого шикания исследователей.

Возможная биологическая значимость четарехцепочечных и анпшараллсльных трехаепочечиых комплексов ДНК, а такзее исключительно вххнзя биологическая роль параллельных триплексов определяют необходимость детального изучения ;тих объектов. В связи с этим исследование структурных и физихо-химвческих свойств трех- и четырехцепочечных комплексов приобретает первостепенное зваясние.

Цель pafxrn.i- В настоящей работе осуществлен скстез и «¡яеаго-хкмическое исследование олигокуклестшшх моделей комплексов трех различи1.» типов,- каждая из которых содержлтт параллельно ориентированные односменные или комплементарные (в уотсон-г.риховсхом смысле) цепи. Это чси*кхцепочсчныс комплексы. из олигонуклеотидос с чередующейся посчмгаватслиюстыо (GT)», внутримолекулярный триплекс Aio-Tio-Tio с АТТ страиванием оснований и внутримолекулярный триплекс рехомбипгмпюго типа со случайной последовательностью оснований. При исследовании этих моделей был использовал синтетический подход, разработанный ранее для исследования другой необычной стру^яуры ДКК - параллельной ДНК. Суть этого подхода, которм мы назвали методом "принудительной ориентации цепей", заключается в тем. что зтдельные куклеоткдные цепи св231.шз»ттся мехму собой по концам гибким гесс»чстиленовым кяи трчэтилотглихсяьным спейсором.

пре.-тгаЕлсни доказательства существования четарехпепочечиых юмплсхсоа с пар^тпгхию - о,-!ГС1гтнроЕак:1Ыми пенями из слкгоиуклсстилсв с "згредующимися остатками • G и Т. Иссл-хсъ'мы фгагсо-хн: шч:схне хграктсрнсти^.-! аггяпараллельчою триплекса с АТТ страиванием осионзни.ч и впершк рассчитаны

термодинамические параметры образования триплекса в зависимости от концентрации NaCL В работа. представлено исследование физико-химических характеристик синтетической модели триплекса рскомбинактного типа (R форма ДНК) из короткого олигонуклеопт. образование которой нам впервые удалось осуществить без участия белка RecA. Пшучсшшс дааные позволили дать количественную оценку преимуществ использование» синтетического подхода, а также впервые охарактеризовать R форму ДНК.

Апрпбатпя работы. Материалы диссертации докладывались на международной конференции TSght Conversation ш Biomolecular Stercodynamic", Albany, June 22-26. 1993.

Пуйпиувпт Пп теме диссертации опубликовано 5 статей и тезисы доклада.

Гтругтура я ofiw.M pafinrn.i. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуагаааия результатов, экспериментальной части, вхдюдов, списка литературы.

Работа ссасржиг ^т^страниц машинописного текста, £ таблиц. s^/рисунков. Ьйшюграфия включассЛ^аименований.

Основные результаты работы.

1. Синят модель них олагонуклеотидов.

Метод "прпгудителыюй ориентации цепей", использованный в данной работе для исследования фзшко-химичсских характеристик комплексов с параллельными цепями, требует введаня в сяигонуклеотидный синтез как 5'-димегохситр!ггил-3'-фосфорамидитов иуклеоыдов. так и 3'-димстохситритил-5'-фосфорамидитов нуклеозкдов, иезеоляющих осуществлять наращивание цепей в направлении 5'—>3". Синтез К-аша-З'-дпмстокситршпл-З'-фосфорамидитов нуклеозидов проводился по следующей схас

к

,асу!

,асу1

ОШиМс^СЛ/Ьп/Ру

2)ОМГ1а/Ру

З^щЛИ/ТНР

НО—

¡РггЦ

асу!

,эсу!

ясснгсп2о

СРгзЮгРОСНгСНзС»! / ТеИ / МсСК

Для временной защиты для З'-гидрогсила мы кспсжь-лсгли трст-бутялдимстилхлорсилан, который избирательно и с высоким выгод™ силилируст первичную пцроксильнуга группу.

Синтез мономера, оСссп^чинаюшсго введение гексаяшюльиого спей сора, был выполнен обычным образом исходя из 1,6-гсг.сандиола в две спаин: чрБтилировапие диметокситритилхлоридом в пирндине и фосфитилирование в аисгонитриле в присутствии тегразола.

Исследования олипя-гуклеотидиых моделей с гексамсгилсисгы:« спсйсором выявили некоторые недостатки линкера на основе гсксаидисла. Во-лервых ю-за гидрофобного характера Св углеводородного спейсора при повышенной концентрации соли наблюдается нежелательная ассоцнат-л атггонуЕгеотгцов по гскегмететсновым фрагментам,' и,'' во-вторых, как показали " проведенные растсп», длина гсхсамегилснового спейсора недостаточна. Необходимость увеличат длины и значительного повышения гидрофктыюго характера иохкн прицель нас к идее использовать триэтиленгаикольный фрагмент. Опггеэ соответствующего фосфэрамидкта был выполнен исходя из триэгаленгликоля аналогично синтезу фосфорамидита на основс гександиолг.

Как и ожигалось, нежелательной ассоциации олигэнуклеотняшх шпилек, содержащих триэтиленгпккольнын спейсор, мы не наблюдали.

2. Исследования чгтирехцепочечних комплсхсос ДИК.

С помощью ряда оптических методов была исследована ггортзвя структура олигоиукпеаггидов З'-^ССТ^зрСКСКйбОрагСрТ)!-? (пар^СГГ)]; и

З'-сСС^рОССНЙбОрйСОр^-УСаитиГаССТ)]).

\

Профили термической денатурации указывают на температурную область существования устойчивой вторичной структуры тр(<1(ОТ)1 и анги[£1(СТ)]: 0-10°С. Эти игокоташгратурные комплексы способны связывать бромистый этидин, причем квантовый выход флуоресценции ЕШг, интеркалированного во вторичную структуру парСсКСГ)] и анти[с1(СТ)]. приблизительно равен квантовому выходу бромистого этих, связанного тимусной ДНК.

Сравнение времся вращательной корреляции р для олигонуклеотиаов парМ(СГО] и а!гти[с1(ОТ)] с р для самокомплсментарнэго дуплекса СХ^ССАХСССС и исследованного ранее четырехцепочечного комплекса, образуемого олигоиуклеотидом 3'-<1(А)1о рО(СНз)вОр<КТ)1(г5'. позволяет сделать вывод о том, что пар[с1(С>Т)] и антаВДиТ)] образует квадруплексы в выбранных экспериментальных условиях.

Значения гидродинамического объема, вычисленные для исследованных олигонуклеогиаов исходх из модели цилиндра, подтверждают чегырехцепочечную природу низкотемпературных комплексов пар[с!(СГГ)] и анти[<1(0Т)].

Сходство спсктров КД парУССГГ)] и аити^СТ)] при 3°С указывает на структурное рсоство обоих комплексов. Для того, чтобы дифференцировать полностью параллсльиую и попарно антипараллсльнуга ориентацию цепей в исследуемых олигонукяеотидах их спектры КД были сопоставлены со спектром КД полностью параллельной <34 ДНК из олигонуклеотида ¿(СдТЧСм) и спектром попарно антипараллсльвой структуры, образуемой теломерной последовательностью - СЛАбСО)*. С4 ДНК -хардггсртуется увеличением положительной полосы при -260 им. С другой стороны шпилечный квадруплекс из теломера, содержащий две параллельные а две ангипараллельиые цепи, обнаруживает положительный максимум при 293 ни. Увепичеиее КД полосы в 260 нм и отсутствие эффекта Колона при 293 ни однозначно указывает на параллельную ориентацию цепей в пар[с!(С|Т)] и анти[с1(СТ)]. Учитывая гибкость гексаметиленового линкера для квадруплекса на

основе пар[<1(<ГГ)] могут бить предложены две возможные структуры (В и С).

А

л

/ У /

/ -¿V

/ у

Г

б

С использованием димеризацни акридинового оранжевого на песпаренных нуклеопцах xiLi определили долю нсспареиных нуклеопмных звеньев. Для исследованных шпилек она оказалась равной -50Sb. Эта величина соогктсгвуст доле ■пшиков и свидетельствует, по видимому, о выпетливанни атих оснований, что лоетвг.рждаегса некоторыми литературными данными.

Исследование связывания бромистого зтидия с нкзкогсезпературными структурами napfd(GT)] и акги[й(СГГ)] обнаруживает коопералиггый хграктср шгтеркаляшш и необычно большое число мест евзыванаа (по ьве молекулы крас!гтеля между соседними G4 плоскостями).

J. Исследоеские аитгтараллелтого триплекса с АТТ страиванисл оснований.

В настоящем исследовании изучен олигонуклеотид 3'-(dA);o -р0(СН:СН20)зр-(dT)io-pO(CH2CH;0)3p-(dT)io-5' [трипл(АТТ)], который внуфимолетупярно может образовывать тройную спираль. В дальнейшем такой игугримолскулл^ый триплекс мы будем называть "трехцепочечной скрепкой" (или просто "скрепкой"). Для сравнения были изучены также олигонуклеотиды 3'-(dA)m -pG(CH2CH;0)3p-(dT)io-5' [анти(ДТ)] и 3'-(dA)i0-pO(CH:CH2O)3p-(dT)i0-3' [пар(АТ)]. которые moot существовать в виде двухцепочечных шпилек с параллельной и анптараллельнэй ориентацией цепей.

' Приведенные ниже результаты получена при концентрации целя 10"4 M (2-]0° моль нуклсатидоЕ- в литре). В этих условиях в рамках модели "все или ничего* -равновесие в растворе трипл(АТТ) можно описать схемой:

исТ.СнМ соответствуют внутримолекулярной "скрепке", шпильке н развернутой цепи.

На основе экспериментально измеренных профилей тепловой девхгурации были рассчитаны термодинамические параметры всех трех переходов. Полученные данные свидетельствуют о .том, что знтальпийные стабилизирующие кзаимодсйствия приблизительно одинаковы в устсои-криковском сЗА^Т дуплексе и хугстиновском ¿А-сГГ дуплексе б составе триплекса.

При низких концентрациях На* (0.01 и 0.11 М) и в отсутстае ионов Г^2'1' экспериментальные кривые плавления имеют четко выпаженниЭ двухфазной

I характер. Однако при более высокой концентрации Ка* или г присутствии Мв1* кривые выглядят внешне хах однофазные. Причиной кажущейся однофазности является сближение температур плавления переходов М-й и М-Т и отнсситслхю малое ьзмснеикг поглощения при отщеплении хугсгиновсхой цепи. Повышение коицетрации Ма* увеличивает стабильность шпильки и скрепки, но стабильность триплекса растет быстрее. Зависимость Гш от ^[Ыа*] удовлетворительно описывается прямой линией с наклоном 113 (переход М-Э), 14.8 (переход Е>-Т) и ПЗ°С (переход М-Т).

Если судить по величинам Тт и А С. ионы мапшя в концентрации 0.01 М стабилизируют спиральные структуры приблизительно также, как и 0.51 М Ыа*. Од11ако, механизм стабилизирующего действия этих ионов принципиачьцо различен. Ионы М^* усиливают эктальпийные взаимодействия, вероятно, за счсг образования специфических стабильных комплексов с двух- и, особенно, трехцепочечньош спиралями. Ионы №* действуют а противоположном направлен!», ослабляя экталыпшные взаимодействия. Общее повышение стабильности шпильки и • скрепки (понижение АС° и увеличение; Гщ) определяемся энтропийным членом. Другими словами, увеличение концентрации повышает конформационную

подвижность К2К дуплекса, так и триплсхса. Полученные данные согласуются с представлением о нсспсцифичсском дейстган ионов Иа+ ("ионная шуба").

Проведенное исследование позволило дать количественную оценку преимуществ триял(АТТ) при изучении физико-химических свойств триплексов по сравнению с системой из трех отдельных цепей.

Рассмотренные выше свойства трипл(АТТ) позволили корректно соотнести спектры КД со структурными компонентами равновесия. Некоторые особенности КД спектра исследованной скрепки позволяют предположить В-подобную конформацию уотсон-крикоЕского дуплекса в составе триплекса.

Связывание бромистого этидия с трипл(АТТ) свидетельствует о том, что триплекс из коротких олигонуклеотидов способен связывать молекулы ЕШг по антикооперативпому типу, как и ДНК. Кажущаяся константа связывания ЕШг с триплексом ^И-Ю6 М"1 практически совпадает с константой, рассчитанной для ДНК (&и-10* М'1). Максимальное число мест связывания ЕШг на триплексе (гмахс^О-!) оказалось почти вдвое меньше, чем для ДНК (гикс=0-18). Таким образом, для посадки одной молекулы £(Вг на триплекс требуется 9 нуклсстадоа (или 3 тройки иуклеотидов). Это число не меняется при добавлении к фосфатному буферу 0.01 М ионов Ме2+.

Квантовый выход флуоресценции ЕШг. сорбированного на триплексе в 0.01 М фосфатном буфере. рН 7, в 0.1 М ИаС! оказала близким по величине к характеристикам ЕШг в комплексе с тимусной ДНК при одних и тех же экспериментальных условиях.

4. Исследование триплекса рехамбинантиого топа (Я форма ДНК).

Триплексы рекомбинаитного типа резко отличаются от триплсксов классического типа, описанных впервые Фспьзснфельдом. Если классические триплексы содержат в каждой цепи только пиримшшны или только пурины, причем одноименные цепи ориентированы антипараллсльно, то в Я-ДНК в каждой цепи присутствует полный набор нуклеиновых оснований и третья цепь ориентирована параллельно гомологичной цепи дуплекса. До настоящего времени параллельные триплексы (Я-ДНК) были получены лишь при дспротсишсации объединенных белком ЯесА трехцепочечных комплексов. Исследования свойств таких триплсхсов ограничивались теоретическими расчетами конформации молекул, демонстрируя принципиальную возможность образования подобных структур.

В настоящей работе исследованы свойства параллельного триплекса из олигонуклеотида 5'-£)(САТССТААСТ)-р0(а12СН20)зр-()(А0ТГАССАТС) р0(СН2СН20)зрч)(САТССТААСГ)-3' (парАЯВ). Гибкие триэтиленпшхолышс сеязки обеспечивают для одноцепочечного олигонуклеотида возможность складываться дважды, образуя внутримолекулярный триплекс. Существует два способа - А" (в главную бороздку уотсои-крикоЕского дуплекса укладывается З'-ссгмент) и В (в главную бороздку уотсон-криковского дуплекса укладывается 5'-се™епт) - укладки сегментов в триплекс. Полученные нами результаты однозначно указывают на то, что при низких температурах и рН 7 парАЛВ образует относительно стабильный триплекс (Тт находится в пределах от 26 до 34"С в зависимости от условий) с параллельно ориентированными идентичными цеплми. причем конформер А превалирует в равновесной смеси.

Кривые плавления обладают ярко выраженным двухфазным характером и свидетельствуют об образовании в области низких температур многоцепочечных комплексов. Верхний температурный переход является кооперативным, как и следовало ожидать при плавлении дуплекса. Низкотемпературный переход характеризуется низкой кооператива зстью. Более того, та часть кривой плавления, которой соответствует область существования триплекса (за исключением плавления в присутствии спсрмадина). проявляет слабый лвухфазный характер, указывающий на

многоступенчатость перехода. Мерок стабильности низкотемпературных комплексов дожег служить эффективная температура плавления. Ках моно-, так и двухвалентные катионы увеличивают стабильность триплексов. Ионы натрия не оказывают влияния на кооперзхивнссть первого перехода, тогда как двухвалеэтные катионы и, в сше большей степени, спсрмидин делают низкотемпературный психоз более кооперативным. Кажущиеся значения Дй° и А5°, полученные из кривой плавления триплекса в присутствии спермидина сосгавля'от длл низкотемпературного перехода Л Н°=32-2±4 скал/моль, ДЛ"=104.6±12 кал/моль-К, а для высокэтемнерзтурного перехода ДН°=49.9±4 гкал/моль, А5°=141.б±6 кал/моль-К. Таким образом, судя по формальным термодинамическим параметрам образования триплекса, его стабильность ниже стабильности триплексов классического типа. Дахх с присутствии спермидина изменение энтальпии, сопровождающее образование триплекса, почти в 1 раза ниже соответствующего изменения энтальпии для уотсон-хриковского дуплекса. Как было показано, при исследовании тркпл(АТП. переход от мгжмолекулярной модели к внутримолекулярной сопровождается повышением температуры плавления приблизительно на 30°С Следовательно, иежмолекулярный параллельный триплекс должен был бк иметь температуру плавления около 0°С. Это обменяет отрицательные результаты, полученные другими авторами при попытке зафиксировать образование межмолскулярпого Ь-триплекса.

Соотношение значений времени вращательной корреляции и гидродинамических объемов для гсарАЯВ и дуплекса ¿(СССОАТССОСЪ- позволяющее оценить относительную молекулярную массу триплекса составило пря 3°С 1.45, что однозначно указывает на образование трехцепочечного комплекса.

Реакция модификации тиминов 0:04 и ферментативное расщепление 31 нуклеазой пар(АЮЗ) при 0-3°С свидетельствуют о том, что все три цепи защищены от химической модификации и нуклеазного расщепления. Концевые основания во всех цепях подвергаются намного более сильной модификации по сравнению с центральными. Это свидетельствует, в свою очередь, об образовании внутримолекулярного трехцепочечного комплекса с экранированными пиримиднновыми основаниями и не содержащего одиоцепечтя участков. Однако, 3'-коиасвой сегмент олигонуглестида защищен в метшей степени по сравнению с двумя другими. Последнее обстоятельство дает основание полагать, что образование триплекса из олигонуклеотида парАКВ протекает 'преимущественно по схеме' А. Обнаружено, что пиримтшиы легче подвергаете; выщеплению, чеи пурины, а

цитшишы легче, чем тимины. Экспериментально наблюдаемая стабильность ' триплетов описывается следующим рядом: 0:С-0 = А:Т-<Х » Т:А-Т > С:0-С

Оптимизация геометрии структуры позволила предложить схемы водородного связывания для всех четырех триплетов оснований. Характерной особенностью водородного связывания в параллельном триплексе является то, что основания третьей цепи связаны с основаниями обеих цепей уотсон^криковского дуплекса в каждом, триплете.

Выводы.

1. Получены защищенные фосфорамндиты нуклеозидов, позволяющие наращивать олигоиуклеогиднуга цепь как в направлении 3*-»5", так и направлении 5'-»3\ Синтезированы фосфорамндиты на основе гександиола и триэгиленгпиколя -мономерные предшественники гибких спейсорок.

2. С помощью набора спектральных методов изучена вторичная структура повторяющейся последовательности с1(СГ)0. Показано, что при низких температурах олигонуклеотады 3'-4(.СТ)5 рО(а8г)бОр<1(ОрТ)5 -У и 3'-<1(С!Т)5рО(СНз}4-Ор<1(СрТ)з-5'

образуют мехмалекуяярные чстарехиепочсчные комплексы с пграллслыю ориентированными йенами. Установлено, что остатки тимипов в этих комплексах иеспарсич и шлеглсиы наружу. Исслсаогаиие г.нтсриииции бромистого зг.ши в квадруплексы показало кооперативный характер еявывлнкя комплексов с красителем и наличие большого числа мест связывания (в случае 3'-d(GDj-p0(CHi)60pd(GpTb -3' - по две молекулы красителя между соседними 04 плоскостями).

3. Подробно исследована олигонуклеотидигя erpenra 3'-(dA.)iopO-(CH2C.H;0)jp-(dT)io-pO(CHjCHjO)3p-(<îT)io-5' способная к образованно виутримолекупярноги триплекса с А-Т-Т страиванием оснований. По!^зп.чо, что елнгонуклеотнд существует а трех взаимопревращаюшихся формах: трехцепочечной скрепки, двухцепочечной шпильки и развернутой цепи. Впервые рассчитаны термодинамические параметры образования триплсксов из дезоксиолигонуклеотцлоз с А-Т-Т триплетами оснований в зависимости от концентрации Nad. Проведено отнесение спектров КД к одпо-, двух-и трехцепочечным формам. Изучено связывание бромистого этидия с трехцепочечной скрепкой. Показано, что предложенная сшггетическая модель является наиболее удобной для изучения физико-химических свойств триплсксов.

4. Впервые, с использованием разработанного синтстического подхода, исследована внутримолекулярная модель триплсксов рехомбинангного типа. Экспериментальные ьохгзэтельства образования триплекса получены из профилей тепловой денатурации, исследования поляризации флуоресценции, а также данных химической модификации и нуклеазного расшеплсния. Установлено стабилизирующее влияние ионов магния и спермядина. Показано, что относительная стабильность триплетов оснований уменьшается в ряду. G:C-G=A:T-A»T:A-T>C:G-C. Ка основгпии информационных расчетов предложены схемы страивания оснований.

Содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Борисова О.Ф., Щелкина А.К., Мамаева O.K., Лчсов Ю.П., Черный АЛ., Гория A.A., Тимофеев Э.Н.. Флоренгьсв ВЛ. - Молскулярн. биол., 1992, т. 26. N 2. С.452-464.

' 2. Borisova O.F., Shchyolkina А.К.. Timofccv E.N., Florcnüev V.L. - FEBS Leu., ' 1992. V. 306, N U, Р.140-142.

3. Щслхина А.К., Мамаева O.K.. Борисова О.Ф.. Лысог Ю.П.. Тимофеев Э.Н.. Ильичева И.А.. Гопггих Б-iL, Флореитьев ВЛ. - Молекуляри. биол.. 1992, т. 26. N б. CI314-1326.

4. Shchyolkina А.К., Maraaeva O.K.. Borsova O.F.. Lysov Yu.P.. Tiraofeev EJi.. nicheva I A., Gottikh B.P., Florentiev V.L. - Antiscncc Res. & Dev., в печати.

5. Shchyolkina A.K, Timofeev EN.. Borisova O.F.. H'icheva LA.. Minyat E.E., Khorayaiova E.B., Ftorcntfev V.L. - FEBS Lett. 1994, V. 339. N 1.2, P. 113-118.

6. Borisova O.F., Shchyolkina A.K., Timofeev EJN., Florentiev V.L. - J. Biomol. Srucl. Dyn., 1993, V. 10, N б, P. a017 (тезисы дослала на конференции "Eight Conversation on Slcrcodynanvc". Albany, June 22-26, 1993).

Подписано к печати ОН 1994 Г.

Отпечатано на ротапринте в Формат бумаги 30x42/4

Производственном комбинате Объем n.i.

Литературного фонда России Згк.^Д,Тир. 100