Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальное доказательство существованиятрех необычных способов укладки полинуклеотиднойцепи: SLS, ЛРС и параллельный триплекс

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное доказательство существованиятрех необычных способов укладки полинуклеотиднойцепи: SLS, ЛРС и параллельный триплекс"

Институт Молекулярной Бпологви им. В.А.Энгельгардта Российской Академии Наук

На правах рукописи

Хомякова Елена Борисовна

Экспериментальное доказательство существования трех необычных способов укладки полинуклеотидной

цепи: 5Ь8, АРС и параллельный триплекс.

03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации иа сонскапие ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996г.

' У

IV

Работа выполнена в лаборатории физики биополимеров Института Молекулярной Бпалопш им. В.А.Энгсльгардта РАН

Научные руководнтелв:

доктор физико-математических наук В.И.Иванов

кандидат биологических наук Э.Е.Минят

Официальные одповеаты:

Ведущая организация:

доктор химических наук Г.А.Яковлев

доктор биологических наук Г.Б-Завильгельский

Научно-исследовательский Институт Физико-Химической Биологии им. А.Н Белозерского, МГУ

Защита состоится « 1996г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 002.79.01. при Институте Молекулярной Биологии им. В А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова., д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Молекулярной Биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Актуальность проблемы.

Структурный полиморфизм ДНК изБестен давно. Кроме "классических В- и А-дуплсксов, участки ДНК, содержащие специфические последовательности, способны прп определенных условиях принимать неканоннческне втор!гчные и третичные структуры.

Как правило, неканонические конформацни ДНК не являются энергетически наиболее выгодными, и их образованию могут благоприятствовать такие факторы, как высокая ионная сила или низкое значение рН. Кроме того, образованию ряда неканошгческих структур способствует энергия сверхсгшралнзацш! в плазмндах. Изучаются требования к нуклеотндной последовательности, необходимые для образования каждой га структур, исследуются факторы, способствующие стабилизации таких структур. Но первой задачей при исследовании любой необычной структуры ДНК является доказательство принципиальной возможности образования такой структуры.

Цель и задачи исследования.

Данная работа посвящена исследованию трех необычных структур ДНК.

Одной из них является предложенная а нашей лаборатории структура, представляющая собой антнпараллельный дуплекс, в составе которого находится праллельная спираль с осью, перпендикулярной оси основной спирали.

Другой структурой является конформашш, предположительно возшшашщая в областях с короткими прямыми повторами в сверхспирализованных плазмндах и детектируемая по чувствотельностн к нуклеазе. Было выдвинуто предположение, что при локальном расплетании ДНК образуются сдвинутые одношггевые участки с взанмнокомплементарными последовательностями, образующие дополнительный мшшдуплекс.

Третья часть работы посвящена исследованию возможности незнзяматического

образования параллельных трнплексов как с регулярной, так и со случайной последовательностью оснований (т.н. рекомбинантные триплексы)

Основной стоящей перед нами задачей являлось экспериментальное доказательство существования указанных необычных структур на синтетических ДНК олигоиуклеотидах с использованием ряда физико-химических методов.

Научная новизна »; • оактнческая ценность работы.

Существование параллельной ДНК неоднократно было продемонстрировано на искусственных олнгонуклеотидах, Поэтому особый

интерес представляет исследование возможности образоваши параллельного дуплекса в составе В-формы ДНК. На примере предложенной нами модели впервые экспериментально была показана возможность образования параллельной спирали в составе антипараллельного дуплекса как ' в присутствии лнганда, стабилизирующего параллельную спираль, так и на свободной ДНК.

В данной работе на примере нескольких олнгонуклеотидов доказана возможность образования структуры со сдвинутыми петлями (т.н. Siipped Loop Structure, SLS), предположительно принимающей участие в регуляции экспрессии некоторых эукарнотнческих прсдр<а:ннх генов.

Впервые была показана возможность неэнзнматнческого образования параллельного тр1шлекса со случайной последовательностью осиовашш (т.н. R-, или рекомбинантньш, тнрплекс), являющегося возможным ннтермедиатом в процессе гомологичной рекомбинации. Этот факт имеет и прикладное значение, поскольку использование параллельных триплексов при антигенной стратегии более удобно, чем классических. В данном случае отсутствует требование кислых рН или высоких концентраций двухвалентных ионов и не накладываются ограничения на последовательность оснований, образующих трехцепочечный комплекс. Более того, исходя из факта существования параллельного триплекса, можно предположить, что такой триплекс участвует и в других биологических процессах, не связанных с гомологической рекомбинацией.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на Международной конференции "Молекулярная биология на рубеже XXI века" (1994г., Россия), на Международной молодежной школе " A World of RNA: Structure and Functions" (1994г., Греция). На Конкурсах научных работ ИМБ РАН работам, содержащим представленные в диссертации результаты, были присуждены (1993г. - 1-ая премия, 1995г. - 1-ая и II-ая премии). По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем н структура диссертация.

Работа, наложена на страницах машинописного текста, !1ллгострироваиа

Г5"рисункамн н содерл!1Гг ^таблиц. Диссертация включает обзор литературы, результаты к их обсуждение, выводы, экспериментальную часть и список цитируемо» литературы ( всег^^еЛкточшгка).

Результаты и обсуждение.

ЬИсследсзгнпе структуры, представляющей собой комбинацию антиларалдельнон и параллельной ДНК (АРС).

Возможность существования ДНК в виде параллельной спирали была неоднократно продемонстрирована на примере коротких алигонуклеотидов и в настоящий момент не вызывает сомнений [Rippe,K. & Jovin,T.M. (1992) Methods Enzymol.,211,199-220]. Факт существования параллельного дуплекса ДНК поднимает вопрос о механизмах образования параллельной спирали в составе азшшараллелыюй ДНК и конформашш полинуклеотидной цепи в местах соединения параллельного п антипараллельного дуплексов.

Нашей группой независимо была предложена атомная модель одного из возможных типов таких соединений, когда в составе антипараллельнон спирали находится вставка, потенциально способная образовывать параллельный дуплекс длиной полвитка спирали и с осью, перпендикулярной оси антипараллелъной спирали (antiparallel -parallel combination, АРС). Конформационные расчеты продемонстрировали, что стернческих ограничений для образования такой структуры нет (рис.1).

Для экспериментального доказательства образования АРС нами были синтезировали олигонуклеотиды Ml, М2 и МЗ. Последовательности алигонуклеотидов были выбраны так, что межмолекулярная структура, образуемая нитями М1/М2, представляет собой либо АРС в случае образования параллельного дуплекса с последовательностью 5'-АААТТ/5'-ТТТАА, либо альтернативную структуру, в которой вместо параллельного образуется антипараллельный дуплекс длиной 3 п.о. с выпетливанием двух тиминов нити Ml и двух аденинов нити М2 (рис.2). Нами была предпринята попытка стабилизации пшотетического параллельного дуплекса, состоящего из пяти AT пар, путем образования комплекса с антибиотиком DstA, который, как известно, связывается с AT- парами в малую

Ъ

Рис.1. Изображение APC в виде стереопары, полученное на основании конфсрмациоиых расчетов.

Ml 54ÎCGCGAMTTGGCCG

Ш S'-CGGCCTTTAACGCGC

Ш 5'-CGGCCAATTTCGCGC

М1+Ш - - в^ммрда .

CGGGCTTTAACCGGG-5' М1+М2 --rÇÇÇÇÇ-5'

О)

ЮТ

GGGGC А——-Т GGCCG

„_ 5'-ССССв—ААдГ'вбССб

ai) ШЛН-ШЬ

АД

Рис.2. Схема вторичной структуры, образуемой шггямн М1 и МЗ (антипараллслъный дуплекс) и шггями М1 и М2: (I) - АРС кснформация с параллельной спиралью 5'-АААТТ/5'-ТТТАА; (II) - альтериатшшая структура, представляющая собой анткпараллельный дуплекс с выпетлкванием двух нуклеотидов на каждой шгт. .

бороздку В-ДНК. Сайт с такой же последовательностью для связывания содержит идеальный антипараллельньш дуплекс, образокшный олетонухлестпдами М1/МЗ. Поскольку известно, что обе бороздки параллельной ДНК геомстршески аквивалектны, логично предположить, »сто если 0э1А булет связываться с параллельной спиралью, то стехиометрия связывания будет в 2 раза больше, чем в случае связывания этого лиганда с актнпараллельным В-дуахексом, т.е. вместо Одной молекулы лнганда ожидается связывание двух молекул на 4 пары основами! в виде комплекса одного типа.

Изменение спектра КД антипараллельного дуплекса М1/МЗ при увеличении концентрации дисгамицина представлено на рис.3. Действительно, наблюдается два типа спгунфкческих комплексов при увеличении концентрации антибиотика от

Рис;3. Спектры КД дуплекса М1/МЗ при различных концентрациях 051А.

Отношение концентраций дистамицин/дуплекс меняется (А) от 0 до 1,

(В) от 1 до 3,5

О до стехиометрии 1:1 (1-ый тип) н в дальнейшем до суммарной стехиометрии 2:1 (2-ой тип). Логично связать первый тип комплекса со свободной ДНК и мономерным связыванием Ог)А с ДНК (307шп, 242ша), а второй - с комплексами ДНК с дистамиштом соответственно в виде мономера и днмера (313,288 242 и 213 пт). Как видно из рис.3,а, связывание Оз1А в виде мономера слабо влияет ва спектр КД ДНК в коротковолновой области. Образование комплекса со стехиометрией 2:1 увеличивает амплитуду спектра в районе 27Опт почта в два раза и сдвигает максимум пика, характерного для комплекса ДНК

(320-330 з длинноволновую область (рнс.З,Ь). Таким обра»о.-, димсрное связывание д.лта&шцина может быть идентифицировано по характерны! чертам в спектре кругового дихроизма.

Рассмотрим теперь спектры КД структуры М1/М2, в составе которой возможн образование параллельного дуплекса. На рис.4 представлены спектры комплекс ДНК с дистамищшом при соотношении концентраций дистамицпн/ДНК от 0 до4 Кривая титрования (не приведена) имеет одну точку излома, соответствующу). стехиометрии 2:1, и при увеличении концентрации дистамнцшга амплитуда К^ монотонно растет. При увеличении концентрации ЫаС1 выше 0,2М наблюдаегс. понижение амплшуды КД до значения, соответствующего стехиометрия 2:1. Эт доказывает образование специфичного комплекса одного типа со стехеомэтрпей 2:1 Более того, из сравнения рис.4 и 3,а видно, что спектры КД комплекс о: днетампцнна со структурой М1/М2 при стехиомгтрш! 2:1 и коктрольпоп аитипараллелыгаго дуплекса М1/МЗ при стехиометрии 1:1 идентичны. Эг-свидетельствует о связывании Оэ1А в виде мономера со структурой М1/М2 пр] стехиометрии 2:1.

Рис.4.Спекты КД структуры М1/М2 при соотношении концентрацш дистамнцин/ДНК от 0 до2.

Выявленные разлитая в механизмах связывашю ОыА с аятипаралелыюй ДН*; и предполагаемым параллельным дуплексом подтолкнул» нас к проведеник исследований связыгалпя лиганда с обс-'мн типами ацсснуклсотндных шт:ле£ одинаковой последовательности: раг-АТ (3'-с1(АТ)5рО(СНз)сОрс!(АТ):>-3') I апи-АТ(5'-с1(АТ)5рО(СНз)бОрс1(АТ)5-3'). В обоих случалх наблюдалось

V. G С С С G Т Т A Ä А G С G CG

! • б

i

С, С С G G Т Т A A A G С G CG

Рнс.5.

образование монсг»арш i комплекса DstA с олигонуклеотидн&ши шпильками, а стехиометрия связывания лиганда с параллельным дуплексом оказалась приблизительно в два раза выше, чем с антипараллельным. Эти результаты согласуются с результатам!!, полученными для образца М1/М2.

Исследование дуплексоа М1/М2 и М1/МЗ и ех комплексов с Dst А методом химаческвх модификаций.

Как угке отмечалось, олитонуклеотиды М1/М2 способны образовывать альтернативную структуру максимум с тремя обычными АТ-парами. Из исследовании, проведенных Веммером, следует, что дистамицин не способен связываться с сайтом, содержащим три AT пары. Однако, чтобы окончательно исключить эту возможность в нашем случае, мы исследовали структуру MÎ/MZ методом химических модификаций. Как видно из рис.5, в случае свободных нитей М1 и М2 тимишя в центральной части обоих олэтоггуклеотидов подвергаются модификации (рис.5 ,е шпъ М2), в то время как »к чувствительность к действию модификатора в составе MÎ/M2 существенно меньше (нить М1-рнс.5,в; нить М2-рис.5,д). Степень модификации тиминов нитей М1 и М2 в составе структуры М1/М2 в присутствии двух молекул дистамиаива (рис.5,6 и г соответственно) и тиминов нити М1 з составе контрольного антипараллельнаго дуплекса М1/МЗ (рис.5,а) одинаково мала.

Таким образом, результаты экспериментов по химической модификации 'структуры МЗ/М2 не подтверждают образование антипараллельного дуплекса с выпетливаниями и находятся в полном соответствии с образованием АРС.

II. Исследование триплексов рекомбннавтного типа.

Трехцепочечные комплексы ДНК исследуются давно. Отличительной чертой таких триплексов яаляется гомопур1Ш-гомопиримвдиновый нуклеотидиый состав. Третья нить может быть как гомопуриновой (Py-Pu-Pu триплекс), так и гомопиримидшювой (Ру-Ри-Ру триплс.чс), но в обоих случаях она ориентирована антипараллсльио относительно идентичной нити дуплекса. Трехцепочечиые структуры ДНК, обладающие такими свойствами, принято называть антипараллельнымн, или "классичесызщ", триплексами.

В ряде работ было показано, что другой пш трехцепочечньк структур ДНК с

г 8

параллельной ориентацией идентичных нитей и случайной последовательностью оснований, вероятно, )-частзуст я качестве мгермедната в- процессе гомологично» рекомбинации, осуществляемом RecA или некоторым» другими рекомбинантнымн - 6e.vr-:rr [S»8sis>k,A et.al - (1У84)_СоЫ^Spring НаЬог Symp.Qiiant.Biol.,49,561-570].

I {рея:(алагается, что в пхом триплексе третья шггь расположена в главной бороздке-------

дуплекса и, в отличие ст классического антипараллелыюго триилеиса, связана яодородныдш связями с основаниями обеих нитей дуплекса. 1акая структура получила название R-формы ДНК [Zhurkin et.al (1991) JBSD 8, о268]. До настоящего времени R-триплексы были получены только после депротеинизации комплексов ДНК-RecA белок, а наследование их свойств в основном ограничивалось теоретическим конформаццонным анализом.

Задача настоящей рзботм - продемонстрировать возможность образования рекомбинантных гргшлексов в отсутствие белков. Первым шагом к этому является исследование возможности неэнзиматического образования параллельных триплексов с регулярной последовательностью оснований и сравнение свойств таких трютлексов со свойствами хорошо изученных антипараллельных триплексов, и впоследствии, используя аналогичные подходы, попытаться получ1Ггь параллельный триплекс со

случайной последовательностью оснований. ^_.

Исследования проводились на олигонуклеотидах отдельные цепи которых связывались методу собой по концам гибким фрагментом Это позволяет исследовать внутримолекулярные трнплекеы, которые, прежде всего, являются существенно стабильнее межмолекулярных. Кроме того, во внутримолекулярных трнплексах ориента:н!Я нитей определяется только последовательностью из'клестндов н является, таким образом, изначально заданной, а использование гибкого спенсера позволяет исключать влияние петли, которое наблюдается при использовашш петель нуклеотэднен природы.

Исследгланье трелцеиочечного комплекса Т-А-Т.

Изучение параллельного триплекса Т-А-Т и сравнение его свойств с хорошо изученным антипзрзлелькьм триплексом ТТА проводтось соответственно на c-ujroHjr-iecTttAax 5'-d(T):u-d(A)lO-d(T)lO-3' (рагТА'Г) и 5'-d(A)lO-cl(T)lO-d(T)lO-3' (antiTTA). Все эксперименты проводились в условиях, при которых в растворе присутствуют только внутримолекулярные комплексы.

К-гшые плавления олигонуклеотидов рагТАТ и antiATT в 0,01 М Na-фосфатном буфере (рН /,0). содержащем 0,25 NaC!, как н выполненные в тех же условиях при температур; 0- 4°С рс-акцга химических модификаций оснований

зу ЭТ-'ААААААААА АА-ТТТТТ Т Т Т. ттптттт

зу уТТ-ААААААААА АА-ТТТТТ Т Т Т| тггпттт

Рнс.6.Результаты реакций химических модификаций тстро.чсвдом осмия (OsCM) оллгоиуклеотндов antiATT (а) п рагТАТ (6) и S1 нукле?з:юго расщепления олигоиуклеотида рагТАТ(ц).

•. .. ~.-c.»icTnjT"T-o&-.oCp»u.Cj5a«:!H треягслочеч-тл*: ксмялаксоа з rAo.cc случаях (,л>с.г.). Таким обраЖ/М, на-мТГ'прояемонстрироваио обраэоаание пара,дельного -ptт:-"-хса с TAT c^psimannen основа?«1«. ~ _____________

*-.-л.касх\.»ельвого Pu-Py-Pu триплекса.

Пораллел-зиьз'г триплекс с последовательностью d(GA)n-d(TC)n-d(LiA)n был выбран в качестве объекта исследований, поскольку известно, что d(TC)n-d(AG)n с высокой частотой встречаются а зукарпотическом --«оме. исс.'.г~"*го времени были изучены только

антипараллельные тршглексы d(TC)n-(AG)n-iAG)s, и шигГ; "задачей явилось доказательство возможности образования аналогичного параллельного триплекса.

Экспериментальные исследования проводились на олигонуклеотпдах У -d(GA)5-d(AG)5-d(TC)5 (antiAG) и 5'-d(GA)5-d(TC)j-d(GA)s (parAG) способных образовывать соответственно внутримолекулярный янтипараллельный и параллельный тр:шлексы в условиях, когда в растворе присутствуют только внутримолекулярные структуры.

Крхиые плазления олигонутслеотидов antiAG и parAG имеют двуфазный характер, что при отсутствии межмолекулярных комплексов может свидетельсвовать только об образовании трехцепочечных структур. Для подтверждения этого был применен метод химических модификаций оснований. Реакци проводились при температуре 0-4°С. Как видно из рисунка 7,а,б, все три сегмента каждого из олигонуклеотэтов parAG и antiAG защищены от модификаций DEPC. Результаты расщеплении образцов parAG п antiAG нуклеазой S1 представлены на рнс.7,в,г. В случае aafiÄG все три сегмента защищены от расщепления Si иуклеавой, при этом У гомопуршювьш сегмент проявляет чуть большую чувствительность, чем два других. Основания на кс:щах З'-гомопурнновой нити повергаются как модификации DEPC, так и расщеплению нуклеазой. Эти результаты полностью соответствуют образованию аятнпараллельного триплекса.

Картина расщепламя куклеаэой S1 образца parAG принципиально отличается от случал с antiAG (Рис.7 ,в,г). Во-первых, олигопуриновые сегменты у parAG более чувствительны к действию S1, чем у aatiAG. Во-вторых, степень расщепления увеличивается от концов к центру (AG) 5 . В-третьих, наблюдается большая чувствительность к действию иуклеазы связей 5'GpA, чем связей 5*ApG. Последний эффект был продемонстрирован ргпьам при исследовании расщепления нуклеазой S1 одноцепочечных участков с последовательностью (AG)n. Как видно из

iW

Vv vv

3 1 -AGAGAGAGAG-CT CTCTCT С T _ A G

aga

G A G

w

K\ v\ J

3 ' -AGAGAGAGA G* GAG A G A G A G A-T CT С T С Т С Т

В

UL

/'Jow;;

3'-AGAGAGAGAG-CT CT CT CT CT—A G A G A G A G A G a G'

ÜU

-AGAGAGAGA-G GAGAGA G A G A - T С V

С T С T

Рпс.7.

12

с

ис.7,г, об,- олнгопуриноных сегмигга-практпчески одинаково чувствительны к ейстщио 51, а олигоппримиднновый сегмент полностью защищен- от__расщсплення. 1э этого Следует, что п растворе присугстпугат оба изо.-.iepa рагАС. Поскольку езультаты реакций химических модификации демонстрируют защиту обоях ■.нгопурнноиых сегментов от модификаций, можно заключить, что наблюдается браэоианиг обоих изомеров паоалле.\ь:юго триплекса AC-CT-AG. Возможный путь ерехода одного изомера в другой такой: гирпмпднновыс ссноианпя W-C дуплекса п у^гттые осноплнпя третьей юпя оборачиваются друг вокруг друга и образуют оаын w -С дуплекс; друга," nvo.uicsrr' "нть попадает в малую бороздку к ьггалкнзастся из тр1шлекса, а после се дгегопиац,;:« г. большую бороздку дуплекса бразуются новые водородные связи н триплекс восстанавлмасгс-.. ! обра"""*

бе пуриновые шггн в течение "перекидывания" находятся в неспаренном состоянии, ; то время как пирнмидиновая шггь - всегда в составе дуплекса. Это, во-первых, оответствует результатам расщепления олигонуклеотида S1 нуклеаэон. Кроме того, [рнведенное объяснение результатов нуклеазного расщеплеши вполне может иметь ■rtzcü!« ме;:а:п!_=»»у обмена гштямн при гомологической рекомбинации.

Исследи!«.те .мсгллилгиого .-¡.->ллгк1« :«» глу-»япа->й рпллсдовательвостыо

'СЧОН-ГП.ЧГ! • ' . - -: , Í - ' - ;

аиггглироазм олш оиуклеотид '-:;{СА . ' . ¡ Í АСС'Ч i С<-!..-

iv V •v 1 T А/-\иТ)-3' (parAlíB), способный ■ ч ' . 1 .

гркплехс с rup.xiiru.:!'>¡'' огиапаиш-,", AHvmecsh ugcurmuttx :::irsñ.

Кривые плавления pafAílB а 0,01 ¡Vi Na-^oc^n.vM буфере (pH 7,0), ■:,{ í),M.~C!, в присутствии двухвалентна: ионов (Ü.01 М Mg( -Z) íau 0,i :v{ спермидниа име«'г характер, что при отсутста:^:

чегкмолекулярных комплексов 1.ви;;ст"-.ьстз>"г об обршоюшш трехцепонечиых структур в области низких температур. Часть кривой ^-.делет:.', соотвегсчгутц«я триплекса, сама обладает двуфазным характером (за исключением •лапления и присутствии снсомй.-яя»Ъ.

Для аа'ягмеиня состоят»; отдел* .'мк ну «леотидсг Яки применен метод »!?шч?скж модификаций основаннй и .¡'еомектатнннсго раснетилит иуклеазон S!

•'-■♦'С.. Гчдк видно и? рис.Ь, степень медифнкарш тимшчш (рис.8,з) и хдетшов (рпс.8,6), иахододи.\с<' ..' середим- cumuítcbs существ.кну меньше, чем у гнминов и адешшов, расположенных на концах сегмектоз и граничащих с линкером.

То же самое можно сказать про степень нуклеазного расщеплешш отдельных основании олигонуклеотида (рис.8,г). Таким образом, полученные результаты подтверждают образование трехцепочечного комплекса. Однако, 3'-концевой сегмент олигонуклеотида оказался чувствительнее к действию модификаторов и нуклеазы, чем два другие. Это дает основания предположить, что указанный сегмент является"трегьсй" нитью трштлекса. Кроме того, особый интерес представляют результаты нуклеазного расщепления 3*- сегмента. Обнаружено, что ппрнмвдины легче подвергаются выщепленшо, чем пурины, а цнгиднны - легче, чем тимины. Эти данные согласуются с данными по тепловой денатурации рагАКВ, СЕтаетельствующих, что выплавление третьей нити идет через ряд промежуточных стадий. При этом в первую очередь разрушаются

У

З1-^ Св Т АС-й Т 'АсеАТТСА—Т С А А Т С й Т А С •

1ТСАА . ".

З'-ТСААТ СС Т АС-С ТАС С А Т I' С А~Т СА А- ТССТАС',

иЛ-Л;Л

3 'ТСААТС1Т:А С— О Т АС С А

т 5Д-тс А А т I Рис.8.

Т А

водородные связи з дппнртящин-пуриновых, а затем - в днпурин-пнримидиновых

трк^летах. С поа««?кнмаш .»ксп^оимситалъньши данными хорошо согласуются результат!:' г.снфср^гнпонных расчетов. показывающие стереохимическую дохГТ-г.'сггь -формы— ллв —исследуемого _ образца.___Согласно получерным

pa-'-.-L-'-j.--hrr.-.-car-zivrz-'bm наблюдаемая отаб'иьпость триплетов опнсьтает-гя следующим рядом:

С:С-С=Л:Т-А»Т:А-Т>С:С-С

ГО.Нсел1»ловг;.-1',е структуры ея едвяиутыми петлями

(Cbpf Loop Structure, илзI SL^).

Iwuui«»«¡w ■ пягппостоанены в эукариотическом н

прокариогичсским гсьылах. Occf"*;'? и» яспжчаемость ь

участках генома. Показано, что некоторые из таких последовательностей в условиях сверхсгшрализашш проявляют чувствительность к действщо нуклеаз, специфичных к одноцепочечной ДНК, что свидетельствует о присутствии некоторой отличной от В-формы конформацни ДНК. Ранее 'была предложена модель, согласно которой комплементарные шггн ДНК сдвигаются одна относительно другой, образуя дзе петли по одной на каждой нити. Высказано предположение, что вследствие г«*-«<• яокатслы.сстей петля '«гут взаимодействовать друг с

ill

№ ^

U

сдвинутыми петлями (Slipped Loop Structure, или SLS).

Впервые трехмерная модель такой структуры, учитывающая образован™ дополнительного межпетлевого дуплекса, была предложена в нашей лаборатории Конформационные расчеты подтвердили стерическую возможность существование комплементарных межпетлевых взаимодействий для структуры с расстоянием межд; петлями н длиной дополшгтельного дуплекса, равными 6 пар оснований. Как вндне на двумерной схемы образования SLS, допустимо существование у структуры 2-з изомеров, различить которые физико-химическими методами невозможно. Выбо{ между изомерами можно сделать, отталкиваясь от структурных различий id конформаций. Согласно результатам конформационных расчетов, комплементарны« межпетлевые взаимодействия возможны только для изомера I.

Для экспериментального подтверждения существования структуры сс сдвннутымн петлями нами были синтезированы несколько олигонуклеотндов потенциально способных образовывать SLS. Последовательности были выбрань таким образом, чтобы основной и межпетлевой дуплексы имели длину 6 п.о., г одноцепочечные участки, соединяющие вти дуплексы, содержали 5 нуклеотидов.

Исследование структуры, образуемой олигонуклеотпдом SLS-56.

Последойательыость олигонуклеотида способна складываться в SL структур) (рис.10). Возможные альтернативные вторичные структуры для олигонуклеотида SLS-56 были вычислены по программе GCG.

Рис.10.

Плавление SLS-56 в буфере, содержащем 0,25М NaCl, начинается при температуре 10°С и происходит с гмсской степенью кооператнзностн, что

свидетельствует об определенней вторичной структуре. Эти разульгаты позволяют использовать при температуре 0-4°С метод химических модификаций. ¡чак вэдно из денентограммы, представленной па рнс.11,6, 0s04 атакует три группы тилшиоь: Т (12-16), Т (27,23), Т (41,44,45). В меньшей степени мсдифнппруется Т (7), а тпмины Т (13,19), Т (24) и Т (37) практически защищены от модификация. К ' дгйствшо DEPL оказались чувствительны только аденины А(9) и А(29)(рнс.11,а). Ни одна гз альтернативных структур не соответствует результатам оеакнии химических моди&рхадмЛ. в то время как модель образования SL структуры, стабилизованной дополнительным межпетлевым дуплексом не противоречит эпи.1 Одпаго, «т^тт!*!.'.'» мол>"5Я1Кятм тммчня ТС7) н. особенно, адешша .*.('*) и; сравнению соотзстстстяго с nnmnavn ! (27.28) и а? литом А(9) тоеоуег дополнительного обсуждения. Оно есть в диссертации, и здесь не представлено. Кроме того, в следующем разделе приведено безусловное доказательство существования SLS на других последовательностях.

39

33 29

'Г. ( • '

■ елгг rci'-CGoTTG тт

jTAQCAACGCTTCCTG ЛСТС';>

с с т ас;

ь

45 44 41

23 П

15 15 14 13 12

I ! (! 37 JJ 24 19 18 и ,, ,,

\ j v"| h Jij\ , , Jl!',|ljl }\ , jI л

CATTGCTCGCGTrO TTTTTCCAQT С CTACG CGTAGCAACGCTTCCTGACTGG5AGC

Pncli.

Исследования коыформацнн бимолекулярных структур 5ЬБ-25 (51-5251)

БЬБЗ!

В дальней™ гх исследованиях мы перешли к изучению бимолекулярных структу] образованных двумя короткими ДНК олигонуклеотидами. Это позволж существенно уменьшить количество альтернативных БЬЭ конформацин и исключа! несимметричность структуры, вызванную влиянием концевой петли. Нами бы/ спроектированы два дополнительных образца 5Ц531 и БЬ525 и синтезирован соответствующие олнгонуклеотидные последовательности (Рис.12). представляет собой симметричную структуру, образованную двумя идентичным

Рис.12.

Основной (I) н межпетлевой (II) дуплексы потенциально образующихся БЬБ в обоих случаях имеют одинаковые нуклеотвдные последовательности. В отличие от 51.5-23, концевые дуплекса III и IV' г, образце 5Ц5-31 содержат сайты

связывания антибиотика дистамиции А. Кроме тога, был синтезирован "опомштельный образец каждая из образующих нитей которого содержит

::а конце дополнительную последовательность 5'- 1 1 Л 1 !. ¿¡тот \ovucisOii участок остается неспаренным с случае образования как 5ЬЗ, та:; и ли-5оп другой межмолекулярной альтернативной структуры. Таким образом, степень модификации ЭТ1К !1укл"отндов может быть испольчокана в качестве контроля чувствительности сеагснгс.н /; иесявратым основаниям. К."; гдеду™ т^гг'сленич, выполненных по 1;р!>гг~чмч<е ССС, дл.; обг.^'.'^а 51_.ЪЗ: иторнч^ь'«: альтернативные структуры отсутствуют.

г»с.« акаттменты приаСшШи&и «> .уишкых, ^.сры^ 2 рЗСТГСр" только бимолекулярные структуры. Кривые плавления образца Б1_.5~25 в буфере, содержащем 10 л)М МдСЬ, свидетельствуют о присутствзш вторичной структуры, по крайней мере, до 20°С. Для исследования схемы спаривания оснований нами был применен метод химических модификаций оснований при температуре 0-4°С. Как видно из рнс.13,а, модификации КМ11О4 подвергаются тямины Т (10-14) олпго!1уклеотидсв 325, образующих БЬ325, и соответственно Т(14-20) нитей 5251 (образец БЬ525?). Креме -чтоп, ткчины Т(1,2,4,5) в образце SLS25t тащке

ед!шстье;.;_п >

I ' I аким о'." .-.ожно за к.

"> •• Я! .57

-ПИ; СТруК^УрМ

петлям;: и „ополиительныл: л . ■■>,. " -л" :иг.-.и.

Аналогичные данные получены при изучении образна SLS-31 (рис.12).

сайты ААТТ для связывания дисгамицина А. Поэтому первым шагом при исследовании данного образца явилось изучение связывания Об(А со структурой и. тем самым, доказательство образования дуплексов Ш н ¡V. Эффект

3* GTGTTTTT G G T А С С CT С G

/ \ CGAGCAC

16

■ I

4

5

2 1

3' TTTTTGGTACC С T С G T T A CGAGCACGTG

T T

3' GTGTTTTTGGTA С С С T С G T T A T T

CGAGCAC

w

3' GTGTTTTTGGTA С С G G T T AAC

CAATTGCCAC

Рис.13.

L

S3Î днстамишшом А в буфере, содержащем ЮмМ MgCh выявило образование

цифичного - комплекса DstA____с ДНК. Полученные результаты однозначно

детельствутот о прнсутствш! в образце SLS-31 дуплексов Ш н IV. Таким азом, для доказательства образования SLS необходимо продемонстрировать чествование дуплексов I и II.

Результаты реакций химических модификаций КМпС)4 тиминов нетей S31(t) j31(2) в составе структуры SLS3I в присутствии DstA (рис.13,г) совпадают с логичными результатами для SLS25 (SLS25t). Таким образом, в совокупности »езультатами экспериментов по связыванию дистамицина А с образцом SLS-3Í «но одно siguió заллгс'гггь, "что единственный в исследуемой структуре юцепочечный участок Т(10-14) соединяет дуплексы I и II и, следовательно, эта |уктура" является структурой со сдвинутыми петлями, или SLS.

|Шоды.

Показана возможность образования параллельной спирали в составе гипараллельного дуплекса.

Экспериментально дс-азано существование структуры со сдвинутыми петлями,

i SLS.

Продемонстрирована возможность пезнз^матпческого образования параллельных лопурин-гомопиримидшювых триплексов (Т-А-Т и GA-TC-GA). Впервые эдемонстрирсаэио неэнэиматическое образование параллельного триплекса со тайной последовательностью оснований.

ублнкашш.

Anna К. Sbchyolkina, Edward N. Timofeev, Olga F. Borisova, Irina A. il'idieva,

vira E. Minyat, Elena B.Khomyakova, Vladimir L. Florentiev (1994) The R-form of MA does exist. FEBS Leiters 339,113-118

Anna K. Shchyolkma, Olga F. Borisova, Elvira E. Minyat, Edward N. Timofeev na A. Il'icheva, E. B.Kbomyakova, Vladimir L. Florentiev (1995) Parallel purine-

rimiüir.e-puiine triplex: expàrocutJ evidence of existence. FEBS Letters 367,81-84

3. E.Minyat, E.KLomyakova, M-Pelrova, E. Zdobnov and V.Ivanov (199 Experimental evidence for Slipped Loop DNA, a novel folding type for polynucleoti

chain. JBSD 13, 2

4. Anna K. Shchyolkina, Olga F. Borisova, Edward N. Timofeev, Irina A. H'icLe-Elena B.Khomyakova, Vladimir L. Florcntiev (1995) Intramolecular para] (recombinant) triplex formed by oligonucleotides with non-nucleotide linkers. JBSD 1

6a,a214

5. Elvira E. Minyat, E. B.Khomyakova, Anna K. Shchyolkina, Vladimir L. Florenti and Valery I. Ivanov (1995) Unusual DNA structures: APC, Triplexes SLS. chemical modification study. JBSD 12, 6, al65