Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние межнуклеотидной вставки, содержащейинтеркалирующий краситель, на стабильность и структуру дуплексов и триплексов ДНК

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние межнуклеотидной вставки, содержащейинтеркалирующий краситель, на стабильность и структуру дуплексов и триплексов ДНК"

; ГГо ОД

Московский физико-технический институт ^ 2000

(Государственный университет)

На правах рукописи УДК 577.3

ТИЩЕНКО Екатерина Ивановна

Влияние межнуклеотидной вставки, содержащей интеркалирующий краситель, на стабильность и структуру дуплексов и триплексов ДНК

Специальность 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА 2000

Работа выполнена в Российской Академии Наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта и на кафедре молекулярной биофизики Московского физико-химического института

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор В.Л. Флорентьев

Официальные оппоненты: доктор физ.-мат. наук,

профессор В.И. Иванов

доктор химических наук, М.Б. Готтих

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики

Российской Академии Наук

Защита состоится ^ ^ИАХ^^Л 2000 г. в У¿Гчасов на заседании Диссертационного совета К.063.91.10 в МФТИ по адресу: г. Долгопрудный, Институтский пер., 9, аудитория 115 Главного корпуса института.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института или в Диссертационном совете К.063.91.10 при МФТИ.

Автореферат разослан 0 О/С-ТлЛ2000 г. Ученый секретарь

Диссертационного совета К.063.91.10

кандидат физ.-мат. наук В.Б. Киреев

ОЧЦ^НЛ^) О

Г) ил УУ/О л

Актуальность темы

Фундаментальной проблемой молекулярной биологии является разработка методов направленного регулирования синтеза белка и репликации генов. Эта задача кроме общебиологического имеет чрезвычайно важное практическое медицинское значение. Одними из наиболее перспективных путей решения этой проблемы считаются «антисенс»- и «антиген»-технологии. Первая заключается в образовании «адресуемыми» оли-гонуклеотидами дуплексов с РНК. Вторая - в образовании трехцепочечных комплексов (триплексов) с дуплексами ДНК. На сегодняшний день наиболее интенсивно разрабатывается «антигенная» технология. «Антигенная» технология может найти широкое применение при решении многих задач биохимии и молекулярной биологии, а так же в практической медицине («антигенная» терапия вирусных и онкологических заболеваний).

Она может быть реализована в двух вариантах - с образованием «антипараллельных» (третья цепь ориентирована антипараллельно идентичной цепи уотсон-криковского дуплекса ДНК) и «параллельных» (с параллельными идентичными цепями) триплексов. Первый вариант предполагает наличие в дуплексе достаточно продолжительных полипуриновых (полипирик. идиновых) последовательностей, что существенно ограничивает область его практического использования. Второй вариант, предложенный в нашей Лаборатории, лишен этого недостатка. Однако стабильность параллельных триплексов недостаточна для их практического использования. Поэтому весьма важным и актуальным является разработка подходов к повышению стабильности как «антисенс»-дуплексов, так и, в особенности, параллельных триплексов.

Мель диссертации

Целью данной диссертации являлось изучение влияния интеркалирующего красителя метидия, связанного с межнуклеотидной связью линкером соответствующей длины на стабильность и свойства ДНК-дуплексов и параллельных триплексов. Предполагалось, что интеркаляция метидия в спиральные структуры может существенно повысить их стабильность. Кроме того, представлялось интересным и важным установить, насколько интеркаляция связанного красителя возмущает пространственную структу ру нативных дуплексов и триплексов.

Научная новизна

Сконструированы модельные соединения с заранее определенным местом интер-каляции лиганда между нуклеотидами. Эти соединения представляют собой олигонук-леотиды, в межнуклеотидную связь которых введена вставка, содержащая интеркаля-тор, присоединенный через линкер подходящей длины. Разработаны методы синтеза такой вставки и использования ее в стандартном олигонуклеотидном синтезе. Изучение физико-химических свойств модифицированных олигонуклеотидов позволило доказать, что ковалентно присоединенный краситель интеркалирует в нуклеотидную последовательность как ДНК-дуплексов, так и параллельных триплексов. Показана стабилизация двойной и тройной спиралей ковалентно присоединенным метидием. С использованием метода молекулярной механики показано, что:

• интеркаляция метидия между основаниями дуплекса происходит только в тот сте-кинг-контакт, к межнуклеотидной связи которого присоединена вставка;

• модифицированный дуплекс имеет наиболее стабильную структуру, когда ковалентно присоединенный метидий интеркалирует между основаниями дуплекса со стороны большой бороздки.

Вопросы, выносимые на защиту

1. Исследование спектральных свойств и определение термодинамических параметров образования межмолекулярного дуплекса с межнуклеотидной вставкой, содержащей интеркалирующий краситель метидий.

2. Доказательство интеркаляцни ковалентно присоединенного лиганда метидия в двойную спираль короткого олигонуклеотидного дуплекса.

3. Описание модели олигонуклеотидного дуплекса с ковалентно присоединенным ин-теркалятором (метидием).

4. Исследование спектральных свойств и определение термодинамических параметров внутримолекулярного параллельного триплекса с межнуклеотидной вставкой, содержащей интеркалирующий краситель метидий.

Апробация работы и публикации

Материалы, изложенные в диссертации, были представлены в виде стендового доклада на IV Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии ( Июль 1999 г. ) и на конференции XIII International Round, Table Nucleosides, Nucleotides, and their Biological Applications ( Сентябрь, 1998 г.).

Основные результаты диссертации опубликованы в работах [1, 2, 3].

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, трех основных частей, заключения. Объем диссертации - tytj страниц, включая таблиц и ^^"рисунков. Список цитируемой литературы содержит наименований.

Содержание диссертации

Во введении описывается актуальность проблемы, формулируется тема и цель исследования материала.

Далее представлен литературный обзор, в котором обсуждаются ранее изученные двух- и трехцепочечные олигонуклеотидные комплексы с ковалентно присоединенными интеркаляторами. Описана первая нуклеотидная модель с ковалентно присоединенным интеркалятором метидием (Letsinger et al, 1981), которая открыла новое направление в исследовании нуклеиновых кислот. Подробно рассмотрены конкретные модели модифицированных дуплексов и триплексов с ковалентно присоединенными интеркаляторами. Обсуждаются исследования по использованию олигонуклеотидов с ковалентно присоединенным интеркалятором для сайт-направленного расщепления нуклеиновых кислот. Отмечена исключительная важность разработки и исследования олигонуклеотидов с ковалентно присоединенными интеркаляторами для дальнейшего биологического применения.

Далее следует изложение полученных результатов и их обсуждение. Рассмотрены аргументы в пользу использованной для изучения синтетической модели, результаты изучения влияния межнуклеотидной вставки на стабильность и свойства ДНК-дуплексов и параллельных триплексов. Представлены результаты конформационного расчета интеркаляции связанного метидия в ДНК-дуплекс. В экспериментальной час-

ти описан синтез модифицированных олигонуклеотидов и условия проведения физико-химических исследований. Диссертацию заключают краткие выводы и список литературы.

Выбор модельных соединений

Выбор модельных соединений определялся целью данной работы. Необходимо было сконструировать такие соединения, которые содержали бы интеркалятор, кова-лентно присоединенный к межнуклеотидной связи олигонуклеотида. Причем на способ включения интеркалятора в межнуклеотидную связь накладывались следующие жесткие ограничения.

1. Строение красителя должно быть таким, чтобы обеспечить высокую вероятность его интеркаляции в спиральные олигонуклеотиды.

2. Метод должен быть универсальным (не должен зависеть от нуклеотидной последовательности олигонуклеотида) и легко используемым в стандартном олигонукле-отидном синтезе на автоматическом синтезаторе.

3. Длина линкера, соединяющего краситель с межнуклеотидной связью должна быть оптимальной для его интеркаляции красителя в стекинг-контакт, к межнуклеотидной связи которого он присоединен, и короткой для интеркаляции его в соседние стекинг-контакты.

В качестве интеркалятора был выбран метидий (Рис. 1), поскольку известно, что основным типом связывания всего ряда фенантридиновых гомологов (метидий, этидий. пропидий) с ДНК-дуплексами и триплексами является именно иптеркаляция. Модификация коснулась лишь фенильного остатка, в который была введена карбоксильная группа, необходимая для связывания с линкером.

Вторая проблема была решена использованием короткой дигидроксиалкильной вставки (Рис. 1). Защита одного из гидроксилов диметокситритильной группой и введение по второму гидроксилу фосфорамидитного остатка позволяет использовать такую вставку в автоматическом синтезе олигонуклеотидов.

Наконец, оптимальная длина линкера была определена с помощью досинтетиче-ского компьютерного моделирования.

Ри 51-ССАТввСТАТ-З1 3'-СОТАСССАТА-Б'

Стандартный дуплекс

5 ' -САТвСТААСТ~ч|_Цепь 1

ССТАССАТТСТ^ Цепь 2 уи

с

Спс

Ме1

ь =

От 51-ССАТС»вСТАТ-3' 3' - СвТ АС - С(ЗАТА- 51

Модифицированный дуплекс

О н

—О—Р—О. I

'САТвСТААСТ-З' Цепь 3 Стандартный триплекс

5'-САТвС•ТААСТ ^ СТАСв-АТТСТ * Тт САТвС-ТААСА-3'

Модифицированный триплекс

О п

О—Р—О-

о9

МеИ = Н21М-

МеШ = н2

С-ГМН2

О

Рис.1. Нуклеотидная последовательность стандартных и модифицированных дуплексов и трип-лексов и химическое строение линкера (1_>. соединяющего отдельные олигонуклеотидные блоки в параллельных триплексах, метидия с присоединенной межнуклеотидной вставкой и линкером (МеМ.) и метидиумамида (МеШ).

Были разработаны методы синтеза этой вставки и получены модельные олигонуклеотиды, представленные на Рис. 1.

Влияние межнуклеотидной вставки на стабильность и свойства дуплексов

Спектр поглощения модифицированного дуплекса (не показан) имеет две характерные полосы поглощения: в ультрафиолетовой области (поглощение ДНК и метидия) и в видимой области (поглощение метидия). При температуре 20°С, где дуплекс стабилен, в области видимого света наблюдается полоса поглощения ковалентно присоединенного метидия с максимумом при длине волны = 526 нм, характерной для ин-

теркалированного красителя. С повышением температуры спектр поглощения ковалентно присоединенного метидия сдвигается в коротковолновую область и при температурах выше 60°С становится аналогичным спектру свободного красителя с максимумом поглощения при длине ВОЛНЫ Яшах = 495 нм.

Были получены кривые плавления стандартного и модифицированного дуплексов (Рис. 2).

'5°

.о X I

ш 0 о о. з:

5о о. о X

10 20 30 40 50 60 70 80

Температура, °С

Рис. 2. Кривые тепловой денатурации модифицированного (1) и стандартного (2) дуплексов. Кружки — экспериментальные данные, сплошные кривые теоретически рассчитаны в модели двух состояний. Сняты при 260 нм в 0.01 М фосфатном буфере, рН 7, 0.1 М №С1

Экспериментальные кривые были проанализированы в модели двух состояний:

JS

Si + S2 « * D

где Б) и 82 — одноцепочечные олигонуклеотиды, а Э — дуплекс. Равновесная константа образования дуплекса К равна:

* = (2)

Экспериментально измеряемый экстенсивный параметр связан с параметрами модели следующим соотношением:

А(Т)-А5на0-АУ + к-с-2^ (3)

где А(Т) — экспериментальный параметр, As — предельный параметр для одноцепо-чечного состояния, А о — предельный параметр дуплекса, а с — суммарная концентрация одноцепочечных олигонуклеотидов. Расчет проводили как в предположении независимости предельных параметров от температуры, так и с учетом этой зависимости.

Результаты фитирования кривых плавления с помощью уравнения (3) приведены в Табл. 1.

Таблица 1: Термодинамические параметры образования дуплекса, вычисленные из кривых плавления

Дуплекс Du D„

Концентрация, М 2,4-1 (Г6 4,3-10"6

ДН°, ккал/моль -59,3±2,4 -48,7±1,9

AS°, кал-молтГ'-К-1 -162,3±7,6 -125,8±5,8

ЭКСП С £ 40,2±0,3 48,3±0,3

приведенная 4 0q 42,5±0,3 48,9±0,3

д^ приведенная 6,4

Поскольку в случае тепловой денатурации дуплексов коротких олигонуклеотидов температура плавления зависит от концентрации (уравнение (4)), этот параметр не может непосредственно служить мерой относительной стабильности дуплексов.

т

дм-

(4)

Д8° + Я ■ 1п(с/4)

Поэтому в Таблице 1 также приведены температуры плавления (Тпч"р"веденная *) стандартного и модифицированного дуплексов, пересчитанные к одинаковой концентрации (5-Ю-6 М).

Так как относительная энтальпия растет (ДДН° = 10,6 ккал/моль), можно было бы ожидать дестабилизацию дуплекса, однако относительное увеличение энтропии (ДД8° = 36,4 кал-моль"1 К"') не только компенсирует этот эффект, но и приводит к относительному повышению стабильности. Порядок изменения термодинамических параметров свидетельствуют о меньшей упорядоченности структуры модифицированного дуплекса по сравнению со стандартным.

Хотя данные спектров поглощения косвенно свидетельствуют о том, что ковалентно

присоединенный метидий интер-калирует в ДНК-дуплекс, однако, учитывая существенное отличие электронной конфигурации ме-тидиумамида от этидия (сопряжение с фенильным заместителем карбоксамидной группы, обладающей сильными электроноак-цепторными свойствами), необходимо было получш ь более убедительные доказательства факта интеркаляции.

Были изучеиы флуоресцентные свойства метидиумамида в сравнении со свойствами этидия (Е1Вг), интеркаляция которого в ДНК-дуплексы не вызывает сомнений.

0.0

2.0x10 4.0x10

<М)

Рис. 3. Изотермы связывания метидиумамида (1) и этидиум бромида (2) со стандартным дуплексом. Кружками обозначены экспериментальные данные. Сплошные кривые рассчитаны в модели двух мест связывания. Условия: 0.01 фосфатный буфер рН 7, 0.1 М №С1 при температуре 20°С

Так же как и в случае бромистого этидия, квантовый выход флуоресценции метидиумамида, сорбированного на немодифицированном дуплексе (</м«н) в М Фос" фатном буфере, рН7 в 0.1 М ЫаС1 при 20°С оказался близким по величине к квантовому выходу флуоресценции метидиумамида в комплексе с тимусной ДНК (9™,*,) при тех же экспериментальных условиях:

о,

= 0,98 ±0,05;

9вТ

в.

1,04 ±0,07.

Я Мс1Н

Кривая связывания МеМ с немодифицированным дуплексом в сравнении с кривой связывания бромистого этидия приведена на Рис. 3.

Эти кривые были проанализированы в модели двух мест связывания (сильное и слабое связывание). Результаты фитирования представлены в Табл. 2. И константы сильного связывания, и число мест сильного связывания в пределах экпериментальной ошибки оказались одинаковыми.

Таблица 2: Параметры связывания метидиумамида и этидия с немодифицированным дуплексом Ри

Краситель Параметры сильного связывания

Асильн, М Ясилъм

Метидиумамид (2,4±0,4)-106 2,7±0,2

Этидий (2,1±0,5)106 3,0±0,2

Совокупность приведенных выше экспериментальных данных позволяет с высокой степенью достоверности утверждать, что метидиумамид подобно бромистому этидию интеркапирует в двойную спираль немодифицированного дуплекса. Сравнение поведения ковалентно присоединенного метидия с поведением метидиумамида указывает на то, что и ковалентно присоединенный метидий так же интеркапирует в спираль ДНК-дуплекса.

Были изучены спектры кругового дихроизма модифицированных олигонуклеоти-дов, содержащих ковалентно присоединенный краситель. Прежде, чем рассматривать полученные данные, необходимо сделать предварительные замечания. Если КД в коротковолновой полосе преимущественно определяется дихроизмом нуклеотидов и отражает в основном изменение конформации спирали, то дихроизм в длинноволновой полосе поглощения красителя имеет более сложный характер. Его условно можно разбить на два компонента: «собственный» дихроизм, обусловленный ковалентной связью

красителя с хираль-ным олигонуклеоти-дом, и «наведенный» дихроизм, определяемый ближайшим окружением красителя, интеркалирован-ного в спираль, и, в частности, влиянием нуклеотидов второй цепи спирали, с которой краситель ковалентно не связан. Именно благодаря «собственному» дихроизму красителя КД присущ одноцепо-чечному модифицированному олигонуклеотиду (Рис. 4) и не исчезает при полном расхождении цепей модифицированного дуплекса.

Спектр кругового дихроизма одноцепочечного модифицированного олигонуклео-тида (Рис. 4, пунктир) при температуре 20°С в коротковолновой полосе имеет стандартный вид, а в видимой области показывает отрицательную полосу.

Добавление комплементарной последовательности к модифицированному олиго-нуклеотиду, приводящее к образованию модифицированного дуплекса, сопровождается существенным изменением спектра КД. Изменения в коротковолновой полосе указывают на образование В-подобного дуплекса, при этом длинноволновый дихроизм меняет знак и становится положительным. Наиболее вероятной причиной такого изменения является интеркаляция красителя в образовавшуюся двойную спираль.

При повышении температуры спектр КД модифицированного дуплекса изменяется не тривиально (Рис. 5). В интервале температур от 20°С до 35°С изменения спектра КД в видимой области относительно невелики (некоторое понижение интенсивности). При приближении к температуре плавления дуплекса (спектр при 40°С) наблюдается драматическое изменение КД — спектр меняет знак и становится похожим на спектр одноцепочечного олигонук-леотида (ср. с Рис. 4).

При температуре плавления дуплекса КД-спектр

вновь становится положительным, однако его интенсивность чрезвычайно мала (кривая при 45°С). При дальнейшем повышении температуры интенсивность спектра существенно возрастает и при температурах выше 50°С (полное расхождение цепей дуплекса) практически перестает изменяться.

700

Рис. 5. КД модифицированного дуплекса в видимой области спектра при различных температурах в 0.01 фосфатном буфере, рН 7, 0.1 М №С1

В настоящее время у нас недостаточно экспериментальных данных, чтобы объяснить столь необычное поведение спектра КД в полосе поглощения ковалентно присоединенного красителя. Можно лишь утверждать, что, по-видимому, такое поведение характерно для модифицированных дуплексов и не зависит от их нуклеотидной последовательности, на что указывает зависимость от температуры КД-спектров дуплексной части параллельного триплекса (см. ниже).

Влияние межнуклеотидной вставки на стабильность и свойства параллельных триплексов

Ранее нашей группой было экспериментально доказано существование параллельных триплексов. Эти триплексы, которые могут образовываться при любой нуклеотидной последовательности «адресного» дуплекса, могли бы быть идеальным инструментом «антигенной» технологии, если бы не их чрезвычайно низкая стабильность. Неудивительно поэтому, что в нашей группе уже несколько лет ведутся исследования по поиску путей повышения стабильности параллельных триплексов. В частности ранее было показано, что пропидиум бромид селективно стабилизирует именно параллельные триплексы. Интересно было попробовать использовать для этой цели и разрабатываемый в данной работе подход.

Как видно из сравнения кривых плавления немодифи-цированного и модифицированного триплексов (Рис. 6). ковалентное присоединение интеркалирующей вставки к одному из олигонуклетидных блоков повышает стабильность как трехцепочечной «скрепки», так и двухцепочечной «шпильки». Термодинами-

Температура, "С

Рис. 6. Кривые тепловой денатурации модифицированного (1) и стандартного (2) триплексов. Кружки — экспериментальные данные, сплошные кривые рассчитаны в модели трех состояний. Кривые сняты при 260 нм в 0.01 М фосфатном буфере, рН 7, 0.1 М №С1

ческие параметры образования триплекса и дуплекса были определены в модели трех состояний, описывающей два последовательных перехода олигонуклеотида из развернутой нити (Б) в уотсон-криковский дуплекс + несвязанная нить (В), а затем в триплекс (Т):

Ко Ку

Б - Р -т

=' (5)

Для внутримолекулярных переходов температура плавления не зависит от концентрации, и кривая плавления описывается уравнением:

л(т)= А + А>"+ Л-^р " АЛг (6ч

\ + Кв + К0-К7

где А(Т) — экспериментально измеряемый спектральный параметр, Аа, Ат — его предельные значения для каждого из трех состояний, по предположению, не зависящие от температуры. Уравнение (6) можно выразить как функцию семи независимых параметров — энтальпии, энтропии двух переходов и трех предельных значений, и определить эти параметры подгонкой теоретических кривых к экспериментально полученным значениям. Результаты фитирования приведены в Табл. 3.

Таблица 3: Термодинамические параметры структурных переходов внутримолекулярных трип-лексов (0,1 М №С1, 0,01 М №-фосфатный буфер, рН7)

Олигонуклеотид Дуплекс-» триплекс Отдельные нити—»дуплекс

ДН°, ккал/моль ДБ", кал-М~'-Ю' Тт, °с ДН°, ккал/моль ДБ", кал-М~'-К~' Тт,°С

Немодифициро-ванный триплекс -34,4 ±3,5 -120,1 ±12,1 13,4 -57,8 ±1,0 -168,4±2,8 70,2

Модифицированный триплекс -30,7 ±2,0 -104,6 ±6,6 20,5 -66,1 ±1,8 -189,0 ±5,1 76,7

Поскольку температура плавления при внутримолекулярных конформационных переходах не зависит от концентрации, она может непосредственно служить мерой относительной стабильности.

Из данных, приведенных в Табл. 3 следует, что триплекс с межнуклеотидной ин-теркалирующей вставкой значительно стабильнее, чем немодифицированный триплекс (ДГт составляет 7,1°С). Двухцепочечная шпилька, образующаяся при распаде триплекса, также более стабильна в случае модифицированного олигонуклеотида. Этот факт позволяет сделать вывод о том, что при плавлении триплекса первой отходит немо-дифицированная нить.

Зависимость интенсивности излучения флуоресценции модифицированного триплекса Тт от температуры (Рис. 7) говорит в пользу этого вывода. В области температур 3-60°С интенсивность флуоресценции меняется слабо и монотонно, что обусловлено падением квантового выхода интеркали-рованного метидия при повышении температуры (Кузнецова, 1988). Резкое падение интенсивности флуоресценции в области температур 60-90°С соответствует расхождению цепей, при этом краситель становится доступным гасящему действию растворителя.

8-

I

ф

И 5

2

1

О 20 40 60 80

Температура, °С

Рис. 7. Зависимость интенсивности флуоресценции модифицированного триплекса от температуры

9

О о

О о

7

о о

£ с =Г 6

о

о

Температура,°С

Рис. 8. КД модифицированного триплекса в видимой области спектра при различных температурах в 0.01 фосфатном буфере, рН 7, 0.1 М №С1

Получены также спектры КД модифицированного триплекса (Рис. 8).

Вновь так же, как это наблюдалось в случае модифицированного триплекса, спектр КД положительный при низких температурах, при приближении к температуре плавления дуплекса меняет знак. При дальнейшем повышении температуры спектр КД вновь становится положительным и перестает меняться после полного расхождения цепей.

Компьютерное моделирование строения модифицированного дуплекса

Оптимизацию геометрии дуплекса проводили методом молекулярной механики. Были рассмотрены два варианта интеркаляции — со стороны большого и малого желобка двойной спирали. Причем рассчитывали интеркаляцию красителя как в стекинг-контакт, к межнуклеотидной связи которого присоединен метидий, так и в два соседние стекинг-контакта. Кроме того, поскольку стороны плоской фенантридиновой системы стереохимически неэквивалентны (диастереотопны), для каждого из вариантов интеркаляции рассматривали два варианта положения интеркалятора в стекинг-контакте: когда метальная группа при азоте «смотрит» в сторону противоположную линкеру, соединяющему краситель с межнуклеотидной связью, и в сторону линкера (поворот фенантридина на 180°).

Расчеты показали, что интеркаляция в соседние контакты настолько менее выгодна энергетически по сравнению с интеркаляцией в тот же самый стекинг-контакт, что ей

можно пренебречь. При

Рис. 9. Пространственное строение наиболее стабильного конформера модифицированного дуплекса по данным кон-формационного расчета Показан вид перпедикулярно оси спирали (слева) и вдоль оси спирали (справа). В этом случае для удобства рассмотрения показаны лишь две соседних к интеркапятору пары оснований

интеркаляции в тот же самый стекинг-контакт предпочтительным является вхождение красителя со стороны большого желобка. Наконец более прочный комплекс образуется при таком положении красителя в стекинг-контакте, когда метиль-ная группа «смотрит» в сторону, противоположную линкеру. Перечисленные особенности строения наиболее стабильного конформера хорошо видны на Рис. 9.

Основные выводы

1. Разработан метод синтеза межнуклеотидной вставки, к которой присоединен ме-тидий через линкер соответствующей длины, и использование этой вставки в стандартном синтезе олигонуклеотидов для получения модифицированных цепей.

2. С помощью спектров поглощения, флуоресценции и кругового дихроизма, подробно исследованы физико-химические свойства модифицированного олигонуклеоти-

да. Показано, что:

• ковалентно присоединенный метидий интеркалирует в двойную спираль олиго-нуклеотида;

• интеркаляция метидия в двойную спираль значительно стабилизирует структуру модифицированного дуплекса (ДТт = 6,4°С );

• на основании конформационных расчетов предложена модель олигонуклеотидно-го дуплекса с ковалентно присоединенным метидием.

3. Исследованы физико-химические свойства параллельного триплекса с межнук-леотидной вставкой, содержащей интеркалирующий краситель. Установлено, что:

• ковалентно присоединенный метидий интеркалирует в тройную спираль параллельного триплекса;

• интеркаляция метидия стабилизирует как триплекс (ДТт = 7,1°С ), так и дуплекс, остающийся после плавления триплекса ( ДТт = 6,5°С ), при этом отходит немо-дифицированная нить.

Список статей, в которых опубликованы основные результаты диссертации

[1| Timofeev E.N., Smirnov I.P., Lawrence A.H., Tishchenko E I., Mirzabekov A.D., Floren-tievV.L., Methidium Jntercalalor Inserted into Synthetic Oligonucleotides, Tetrahedrron Letters, v.37, №.47 (1996) 8467.

|2] Kochetkova S.V., Tishchenko E.I., Timofeev E.N., Shchaveleva I.L., Florentiev V.L., Intercalating Insert into lnternucleotide Linkages as Way for Stabilization and Detection of Short DNA Duplexes, v.18, №.6,7 (1999) 1495.

|3] Kochetkova S.V., Tishchenko E.I., Timofeev E.N., Shchaveleva I.L., Florentiev V.L, тезисы конференции XIII International Round, Table Nucleosides, Nucleotides, and their Biological Application, Montpellier, France, poster 325, Sept. 6-10, 1998.