Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Триплексы бис-ПНК/ДНК

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Триплексы бис-ПНК/ДНК"

На правах рукописи УДК 533.9

Крупник Ольга Владимировна

ТРИПЛЕКСЫ БИС-ПНК/ДНК: СТАБИЛЬНОСТЬ И ПОЛИМОРФИЗМ.

Специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной биофизики Института молекулярной генетики РАН.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук

профессор Лазуркин Юрий Семенович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

профессор Заседателев Александр Сергеевич

доктор биологических наук член-корреспондент РАН Рысков Алексей Петрович

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 17 июня 2004 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте по адресу: 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., 9, в аудитории 204 НК.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ. Автореферат разослан « 43 » мая 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук,

В.Е. Братин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Усилия исследователей в течение последних десятилетий были направлены на поиск агентов, способных связываться с определенными участками молекул ДНК и РНК и управлять их функциями. Конечной целью подобных исследований является создание диагностических и генно-терапевтических средств, направленных против бактериальных и вирусных инфекций, наследственных болезней, онкологических заболеваний. ПНК1 превосходит другие подобные средства как по прочности комплексов, которые она образует на комплементарных сайтах ДНК и РНК, так и по специфичности связывания. В настоящее время ПНК применяется в различных областях молекулярной биологии, биотехнологии и диагностики. Поэтому исследование стабильности её комплексов не только представляет интерес с точки зрения фундаментальной науки, но и является весьма актуальным для выбора оптимальных условий практического применения. Среди комплексов ПНК с нуклеиновыми кислотами особое место занимают триплексы ПНК2/ДНК, образующиеся при взаимодействии гомопиримидиновой ПНК с комплементарным сайтом однонитевой и двунитевой ДНК. Благодаря двустадийному механизму образования, триплексы ПНК2/ДНК могут обладать уникальным сочетанием очень высокой стабильности и сильной специфичности.

В качестве характеристики стабильности комплексов нуклеиновых кислот чаще всего используется температура их плавления Т^ Однако при плавлении триплексов ПНК2/ДНК наблюдается сильный гистерезис, что делает невозможным получение равновесных кривых плавления. В связи с этим точные количественные характеристики плавления триплексов ПНК/ДНК долгое время оставались не измеренными.

Стабильность триплексов существенно зависит от ряда факторов, таких как состав ПНК и последовательность оснований, особенности строения

Список сокращений I IHK - пси пиная щклеинова« кислота: он ДНК - фнрДОаНХЦИОДААЬНАЯЛш ДНК.

БИБЛИОТЕКА

СЛстср ОЭ

hHAAIL; I {

основной цепи ПНК, а также линкера в случае бис-ПНК, температура, ионная сила и рН раствора. Варьирование этих факторов дает возможность получать как более, так и менее стабильные комплексы в зависимости от конкретных практических целей. В свете постоянно растущих возможностей применения ПНК исследование зависимости стабильности триплексов от этих факторов является весьма актуальным.

Ранее малоизученное явление полиморфизма комплексов гомопиримидиновой бис-ПНК с ДНК заключается в том, что при определенных условиях на одной и той же мишени ДНК молекулы бис-ПНК одновременно образуют несколько типов структурно-изомерных комплексов. Это явление ранее отмечалось в нескольких работах, однако на момент начала наших исследований не было опубликовано ни одной работы, посвященной его изучению. Между тем, совершенно очевидно, что явление полиморфизма не только вносит новый уровень сложности во все задачи, связанные с ПНК, но и может оказать существенное влияние на потенциальное применение ПНК, особенно в терапевтических целях. Таким образом, поставленная задача изучения полиморфизма комплексов бис-ПНК с ДНК является актуальной, а все полученные результаты - новыми.

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было исследовать стабильность и явление полиморфизма триплексов, образованных молекулами гомопиримидиновой ПНК с ДНК. В работе решались следующие задачи:

1. Исследовать стабильность триплексов ПНК2/ДНК методом равновесного плавления. Найти термодинамические параметры стабильности триплексов ПНК2/ДНК.

2. Исследовать путем измерения эффективного времени жизни влияние электростатических взаимодействий на стабильность триплексов ПНК2/ДНК.

3. Исследовать полиморфизм комплексов бис-ПНК/ДНК.

Научная новизна работы. В данной работе впервые проведено систематическое исследование стабильности триплексов ПНК2/ДНК методом равновесного плавления. Найдены термодинамические параметры плавления. Показано, что значение свободной энергии стабилизации триплексов превышает соответствующее значение для дуплексов ПНК/ДНК в 2-3 раза. Путем измерения эффективного времени жизни изучено влияние на стабильность триплексов бис-ПНК/ДНК величины и локализации на молекуле бис-ПНК положительных зарядов. Изучено явление полиморфизма комплексов, образуемых молекулами гомопиримидиновых бис-ПНК на однонитевой и двунитевой ДНК. Исследованы образование, стабильность и превращения всех структурных изомеров. Построена кинетическая модель диссоциации изомеров, позволяющая определить параметры распада. Обнаружено явление стабилизации структурно-стехиометрическо го изомера S1 в присутствии комплементарного к бис-ПНК однонитевого олигонуклеотида. Предложена структура стабилизированного изомера S1. Исследована зависимость выхода изомеров S1 и S2 на онДНК от концентрации бис-ПНК и сформулирована кинетическая модель их образования.

Публикации. Основные результаты проведенных исследований отражены в пяти печатных работах, в том числе в трех статьях в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературных данных, методического раздела, двух разделов, посвященных изложению и обсуждению результатов, и Выводов. Работа изложена на 118 страницах, включает 4 таблицы и 33 иллюстрации. Библиография включает 87 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Введение. Рассмотрена актуальность выбранной темы, обоснованы теоретическая и практическая значимость, сформулирована цель работы и определены задачи исследования.

2. Обзор литературных данных. В разделе описаны строение ПНК, свойства дуплексов и триплексов, образуемых ПНК с нуклеиновыми кислотами, рассмотрено биологическое действие и различные аспекты практического применения ПНК. Особое внимание уделено уникальному свойству триплексов ПНК2/ДНК - сочетанию высокой стабильности со специфичностью; рассмотрены факторы, оказывающие влияние на стабильность и специфичность. Приведены сведения о полиморфизме комплексов, образуемых бис-ПНК. В конце раздела обосновываются задачи настоящей работы, в свете литературных данных определяется место работы среди имеющихся исследований.

3. Материалы и методы. В разделе подробно описаны использованные препараты ПНК и ДНК, процедура получения комплексов ПНК с ДНК. Приведены методики изучения плавления триплексов и кинетики их диссоциации. Описаны экспериментальные процедуры, использованные при изучении полиморфизма комплексов бис-ПНК с ДНК.

4. Исследование стабильности триплексов ПНК2/ДНК: термодинамические параметры стабильности: Факторы, влияющие на стабильность.

4.1. Плавление триплексов ПНК2/ДНК. Термодинамические параметры стабильности.

Равновесное плавление триплексов ПНКг/ДНК, образованных молекулой он ДНК с двумя молекулами моно-ПНК, существенно затруднено из-за очень низкой скорости реассоциации таких систем. Используя бис-ПНК, нам удалось подобрать условия, при которых равновесные кривые плавления наблюдались при всех использованных концентрациях компонентов.

Спектрофотометрическим методом были проведены систематические измерения температуры плавления ^ триплексов, образованных бис-ПНК 1743 на онДНК, в зависимости от концентрации триплексов и ионной силы.

На рис. 1 изображены зависимости температуры плавления Т, от концентрации компонентов при различных значениях ионной силы. Следует отметить, что сильная зависимость ^ от концентрации накладывает достаточно строгие ограничения на использование величины ^ в качестве меры стабильности комплексов ДНК с ГОЖ.

90

Рис. 1. Зависимость до

температуры плавления Тт от 86

концентрации компонентов 84

Г? 82

при различных значениях и ^

ионной силы. 78

Квадраты —|№+]=50 шМ, 76

треугольники - [N8+1=200 шМ, 74 круги - (N8+1=600 шМ.

0 10 20 30

С (М X 10е)

Температура плавления триплексов падает примерно на 8-9°С при увеличении [№+] на порядок. Эффект имеет обратный знак по сравнению с тем, что известно для комплексов ДНК/ДНК; это обусловлено электронейтральностью остова молекулы ПНК. Также эффект согласуется с литературными данными для плавления дуплексов ДНК/ПНК, однако для дуплексов ДНК/ПНК он составлял всего 3-5°С (Egholm & ак, 1993; Тотас & ак, 1996). Наиболее вероятно, что это явление обусловлено тем, что при образовании триплексов в раствор выходит большее количество противоионов, чем в случае дуплексов. Частично в этот эффект может давать вклад также прямое электростатическое взаимодействие положительных зарядов, локализованных в средней части одной из ветвей использованной бис-ПНК, с основной цепью ДНК; при высокой ионной силе оно экранируется.

Для определения энтальпии и энтропии плавления мы использовали методы обработки результатов измерений, изложенные в (Маг/су & Б^1анег, 1987) и справедливые в рамках модели двух состояний. Полученные с помощью трех расчетных методов данные приведены в таблице 1.

Таблица 1. Энтальпия и энтропия плавления триплекса оцДНК/бис-ПНК

Ионная сила [N8+] 50 тМ 200 шМ 600 шМ

ДНуи. кса1/шо1, из ширины перехода -134±6 -134+10 -134+15

ДНун, кса!Лпо1, из полуширины перехода -142+14 -135+20 -140±26

ДН*, кса1/шо1. из концентрационной зависимости -135+10 -146+10 -135+10

Среднее значение <ДН>, кса1/то1 -137±10 -138+13 -136+17

Дв", са1/тоЫС -352±30 -389±30 -362+30

Из данных таблицы 1 видно, что оба метода определения энтальпии плавления дают практически одинаковые результаты в пределах погрешности опытов. Не наблюдается и зависимости величины ДН° и AS0 от ионной силы, что на первый взгляд противоречит влиянию ионной силы на Тт. Однако, как указано выше, изменение ионной силы на порядок изменяет Тт на 8-9°С, т.е. на 2-2.5%. Это значительно меньше, чем погрешность измерения АН0 и AS0 (~ 10

Таблица 2. Термодинамические параметры плавления комплексов ПНК/ДНК.

ДН°, kcal/mol AS°, cal/mol-K AG°29g, kcal/mol Kî98. M"'

PNA/DNA duplexes -63" -168" -13" 2xI07* 4,5x10"

-71" -190* -12"

-41 -s- -66r -104 +-168e -10 -î- -16e

-66 *-60"' -176 -=--157'' -13.7*-13.2'

PNA/DNA triplexes' -137 -368 -28 10"

" Из (Тотас et al.. ¡996). PNA: GTAGATCACT, 10 mM Na+.

6 Из (Egholm et al., 1993). PNA: TGTACGTCACAACTA, 100 raM Na+. Данные для 15-членного димера пересчитаны на 10-членный в предположении аддитивности ДН и AS. с Из (Schwarz et al.. 1999). PNA различного состава и последовательности, 100 mM Na+. ä Из (Rutilainen et., 1998). PNAs: CATCTAGTGA и GTAGATCACT соответственно, 10 шМ Na+.

* Данные настоящей работы. Приведены средние значения ДН, AS и AG, полученные при 50,200 и 600 шМ Na+.

В таблице 2 приведены округлённые значения ДН°, AS°, AG°298 и

равновесной константы связывания К298 = exp (-AG^s/RT) для дуплексов ДНК/ПНК. Видно, что значения ДН°, AS° и AG°298 для триплексов превышают соответствующие значения для дуплексов в 2-3 раза. Эти значения соответствуют очень стабильным комплексам, о чем свидетельствует значение константы равновесия

Резкое увеличение стабильности триплекса обусловлено увеличением в триплексе по сравнению с дуплексом примерно в два раза числа водородных связей и в полтора раза - числа стекинг-взаимодействий. Кроме того, что наиболее важно, по рентгеноструктурным данным (Betts et al, 1995) триплекс дополнительно стабилизируется водородными связями между кислородами фосфатных групп основной цепи ДНК и амидными группами хугстиновской цепи ПНК.

В заключение этой части работы показана справедливость применения модели двух состояний к плавлению триплексов бис-ПНК/онДНК. 4.2. Влияние электростатических взаимодействий на стабильность триплексов ПНКс он- и днДНК.

В предыдущем разделе было описано изучение стабильности триплексов бис-ПНК/ДНК с помощью метода плавления. Следующие разделы работы посвящены изучению некоторых факторов, влияющих на стабильность триплексов бис-ПНК/ДНК. В качестве меры стабильности в дальнейшем будет использоваться время жизни триплекса т. Времена жизни различных триплексов измерялись путем изучения кинетики их диссоциации. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с методом плавления, в частности, измерения проводятся при температурах, при которых еще заведомо не плавится днДНК-мишень.

В молекулы ПНК, в целях улучшения их растворимости и для повышения сродства к ДНК, вводят положительные заряды. Это NH3+-группа или лизин на концах молекулы, а также лизины в том или ином положении основной цепи. Очевидно, что такие заряды входят в число факторов, влияющих на

стабильность и специфичность комплексов ПНК с ДНК. Задачей работы было охарактеризовать влияние величины и локализации положительных зарядов

ПНК на стабильность триплексов бис-ПНК/ДНК. Схемы триплекс ов,

образованных моно-ПНК Т10 и бис-ПНК 1743 на он- и днДНК-мишени, приведены на рис. 2.

На рис. 3 изображена зависимость времени жизни исследуемых триплексов от ионной силы раствора. Результаты, полученные для ПНК Т10 (Kosaganov et а1, 2000), показывают, что в пределах точности эксперимента времена жизни триплексов, образованных этой ПНК он- и днДНК, одинаковы и сравнительно слабо зависят от ионной силы. Иная картина наблюдается нами для триплексов, образованных бис-ПНК 1743 на онДНК. С понижением ионной силы наблюдается заметная стабилизация триплексов бис-ПНК 1743/онДНК. Еще

Рис. 3. Влияние ионной силы на время жизни триплексов. Т = 67,5'С.

Черные точки - моно-JIHK Тщ на он- и днДНК; белые квадраты -бис-ПНК 1743 на онДНК; черные 1реугольники - бис-ПНК 1743 на днДНК.

PNA Т10 PNA1743

Рис 2. Схемы триплексов, образованных моно-ПНК Т10 и бис-ПНК 1743.

более сильный эффект стабилизации наблюдается для триплексов бис-ПНК 1743, образованных на днДНК.

Как показано в (Kosaganov & а1, 2000), влияние ионной силы рас/вора на время жизни триплексов, образованных моно-ПНК Т10 на он- и днДНК, имеет энтропийную природу. Поскольку при распаде триплексов бис-ПНК 1743 также происходит связывание противоионов из раствора, ясно, что энтропийный фактор играет заметную роль и в стабильности триплексов бис-ПНК 1743. В то же время, при невысоких значениях ионной силы, положительные заряды в центре одной из цепей бис-ПНК 1743 могут заметно стабилизировать триплекс бис-ПНК/онДНК за счет прямого электростатического взаимодействия с отрицательно заряженным остовом ДНК. Таким образом, влияние ионной силы на время жизни триплекса приобретает в данном случае существенную энтальпийную составляющую. Стабильность комплексов с днДНК еще выше, что объясняется наличием дополнительных электростатических взаимодействий между положительными зарядами в середине одной из ветвей бис-ПНК 1743 и отрицательно заряженной вытесненной нитью ДНК. При [№+] = 1 М заряды экранируются и стабильность всех комплексов одинакова.

Таким- образом, введение в ПНК положительно заряженных при

Рис. 4. Схемы триплексов, образованных на онДНК

молекулами бис-

ПНК с

различной

локализацией

положительных

зарядов.

нейтральных рН остатков лизина позволяет целенаправленно изменять стабильность триплексов ПНК2/ДНК.

Для исследования; влияния на стабильность триплексов локализации зарядов на молекуле бис-ПНК были использованы 5 бис-ПНК, имеющих одну и ту же последовательность оснований, но отличающихся расположением положительных зарядов (рис. 4).

Приведенные в диссертации графики зависимости времени жизни от ионной силы схожи для всех пяти бис-ПНК. Во всех случаях наблюдается увеличение стабильности триплексов; характерное время жизни увеличивается в условиях опыта от нескольких минут при [№+]= 1 M до нескольких сотен минут при [№+]= 50 mM.

Полученные данные не позволили сделать выводов о влиянии на стабильность триплексов локализации зарядов на. уотсон-криковской или хугстиновской цепи ПНК, либо на конце молекулы. Более того, ход зависимости времени жизни от ионной силы в пределах точности измерений практически одинаков для бис-ПНК 2196, 2197, 2199 и 522, последняя из которых не содержит дополнительных зарядов, кроме двух концевых. Наибольшей стабильностью при всех ионных силах обладают триплексы, образованные бис-ПНК 554 с локализацией зарядов в линкере. Несмотря на существенный разброс данных, этот факт хорошо виден на рис. 5. Полученный

жизни триплексов бис- Ц

ПНК/онДНК от ионной

Рис. 5. Зависимость времени

х

700.0 1 600.0 5_ 500,0

силы. Т = 80°С. Квадратики « - бис-ПНК 554. Результаты ^ для бис-ПНК 522,2196,2197 |

£ 400.0

О

р 300.0 200.0 100.0 т 0.0

и 2199 попадают в заштрихованную область.

1.0

1.5 2.0

2.5

3.0

3.5

1д [Ыа+, тМ]

результат коррелирует с данными работы (Кики & ш, ]998), в которой показано, что большой заряд на линкере бис-ПНК значительно увеличивает скорость связывания ПИК с мишенью днДНК при низких ионных силах, что приводит к снижению специфичности образовавшихся триплексов. 4.3. Влияние структурных модификаций ПНК на стабильность триплексов бис-ПНК/днДНК

Описанные ниже эксперименты по изучению влияния структурных модификаций ПНК на стабильность триплексов были проведены по просьбе профессора Нильсена, предоставившего нам использованные в работе препараты ПНК. Результаты этих опытов достаточно интересны, хотя эта работа и не имела для нас прямого продолжения. Однако, именно в этих опытах мы впервые столкнулись с явлением полиморфизма комплексов бис-ПНК с ДНК и с взаимными превращениями структурных изомеров; этой теме посвящен следующий раздел.

В рамках изучения влияния структурных модификаций была поставлена задача исследовать времена жизни триплексов, образуемых пятью т.н. аланиновыми бис-ПНК с днДНК.В этих бис-ПНК одна глициновая единица основной цепи заменена на т.е. в этих местах остов ПНК

удлиняется на одну С-С связь.

Оказалось, что как реперная, так и все бис-ПНК проявляют

полиморфизм: при связывании; бис-ПНК с днДНК. во всех случаях мы наблюдали одновременное образование трех типов комплексов. В порядке увеличения электрофоретической подвижности мы обозначили эти структурные изомеры 81, 82 и 83. При обработке результатов опытов по диссоциации при повышенной температуре мы обнаружили четкий максимум на кривых распада изомера 83. Было сделано предположение о происхождении максимума за счет вклада в 83 продуктов диссоциации других изомеров. Мы провели препаративное электрофоретическое разделение комплексов и выделили из фрагментов геля отдельные типы, изомеров. Оказалось, что

продуктами распада изомеров S1 и S2 действительно являются свободная ДНК и комплекс S3, который в свою очередь распадается на свободную ДНК и ПНК. Для задач этого раздела важным является тот факт, что изомер S3 обладает максимальной среди всех изомеров стабильностью. Поэтому мы ограничились измерением времен жизни комплексов именно этого типа. Результаты измерений представлены в таблице 3.

Таблица 3. Влияние структурных модификаций на свойства комплексов бис-ПНК/днДНК.

бис-ПНК время жизни комплекса S3 (мин) при 72,5'С, 200шМ Na+

554 2000

1152 800

1149 400

1151 350

1150 200

904 150

905 20

Как и следовало ожидать, все исследуемые структурные модификации приводят к дестабилизации. Комплекс, образованный контрольной бис-ПНК 554 обладает максимальным временем жизни. Затем по убыванию т следуют комплексы бис-ПНК, имеющие модификацию в хугстиновской ветви. Чем ближе к середине хугстиновской цепи находится сбой в структуре ПНК, тем сильнее снижается стабильность триплекса. Наконец, самый значительный результат: стабильность триплекса, образованного бис-ПНК 905 оказалась на два порядка меньше стабильности контрольного комплекса. Бис-ПНК 905 -единственная бис-ПНК с модификацией в уотсон-криковской ветви. 5. Исследование полиморфизма комплексов бис-ПНК с ДНК 5.1. Полиморфизм комплексов; образованных на днДНК. Стабильность и превращения структурных изомеров: Стабилизация изомера S1.

На рис. 6 приведена электрофоретическая картина комплексов, образованных бис-ПНК 554 с комплементарной днДНК. Помимо свободной

ДНК мы наблюдали три полосы, отвечающие трем структурным изомерам, которые обозначены SI, S2 и S3. Полоса D - свободная ДНК. Исходя из сравнительных данных комиграции в геле, можно предположить, что полоса S3 соответствует «традиционному» триплексу, д1 ^

образование которого наблюдается в отсутствие полиморфизма. ^ ^^

При диссоциации мы наблюдали

следующую общую картину: структурный изомер

S1 оставался стабильным, структурный изомер S2 Рис. 6.

диссоциировал со временем по закону, близкому к Электрофорсграмма

экспоненциальному, а на начальном участке комплексов бис-ПНК 554

сдцЦНК-мишенью

кривой распада комплекса S3 наблюдался

отчетливый максимум. Кинетика диссоциации изучалась в присутствии т.н. «холодной» ДНК т.е. немеченого однонитевого олигонуклеотида, комплементарного последовательности бис-ГТНК Он служил ловушкой для предотвращения обратной реакции.

Мы предположили, что максимум на кривой диссоциации комплекса S3 обусловлен вкладом в общее количество S3 продуктов распада структурного изомера S2. Для проверки этого предположения все три комплекса были выделены путем электроэлюции из соответствующих фрагментов препаративного геля, и кинетика диссоциации была исследована для каждого комплекса отдельно. В отсутствие структурных изомеров S1 и S2 комплекс S3 распадался по простому экспоненциальному закону, без какого-либо максимума. Что касается S1 и S2, продуктами их распада в отсутствие немеченого комплементарного олигонуклеотида, являлись свободная ДНК и изомер S3. Это подтвердило предположение о происхождении максимума на кривой диссоциации S3, за счет структурного изомера S2.

В таблице 4 приведены данные о времени жизни трех структурных изомеров, образуемых бис-ПНК 554 на днДНК-мишени. В условиях

эксперимента стабильность структурных изомеров 81 и 82 существенно ниже стабильности комплекса 83. Разница в стабильности структурных изомеров позволяет в случае необходимости избавиться от комплексов 81 и 82 путем отжига. Наличие или отсутствие комплементарного однокитевого олигонуклеотида в пределах точности опытов не влияет на времена жизни изомеров 82 и 83, поэтому в таблице для них приводятся средние значения времени жизни по всем измерениям. В отличие от 82 и 83, время жизни изомера 81 резко возрастает в присутствии "холодной" ДНК. Таким образом, нами обнаружено явление стабилизации структурного изомера 81 комплементарным бис-ПНК олигонуклеотидом.

Таблица 4. Время жизни структурных изомеров, образуемых бис-ПНК 554 с днДНК при различных условиях. |Na+|=200mM.

т.°с Наличие "холодной" ДНК Время жизни $1. мин Время жизни 82, мин Время жизни ЯЗ, мин

60 + »1000 385±60 »2000

— 140±15

72.5 + 500±50 75±7 2000-4000

— 38±4

Модель распада структурных изомеров S1 и S2

Распад каждого из структурных изомеров 81 и 82 с учетом того, что освобождающаяся ПНК удаляется из зоны реакции (Kosaganov et al, 2000), может быть описан системой дифференциальных уравнений:

Л

3

= - Я <Й7

■ а

- *.чз -53

(1)

Л л

Я 3+5/ + О = 1,

где Si, S3 и D - удельные количества структурного изомера 81 или 82, комплекса 83 и свободной ДНК соответственно, - получаемые из опыта

константы скорости распада структурного изомера 81 или 82 и изомера 83. Неизвестный параметр а - доля 83 при распаде 81 или 82. Решение этой

О 200 400 600 800 1000 Время, мин

Рис 7. Диссоциация структурного изомера 81. Условия опыта: бис-ПНК 554,60'С, 200 тМ без добавления «холодной» онДНК. Черные точки - относительное количество 81, белые на панели (а) — 83, на панели (б) - днДНК. Точки соответствуют экспериментальным данным, линии сетки -данным математической модели. Справа от линий сетки указано значение параметра а. Жирным выделена линия сетки, наилучшим образом соответствующая экспериментальным данным

системы уравнений дает набор кривых, различающихся значением параметра а. На рис. 7 представлено сравнение экспериментальных данных для бис-ПНК 554 с соответствующими данными модели. Совпадение экспериментальных точек с одной из кривых в обоих случаях свидетельствует об адекватности построенной модели и позволяет оценить параметр а. В данном случае оказалось, что а = 0,5.

Строение изомеров S1 и S2

В работе (Hansen et al, 2001) для трех наблюдаемых на днДНК структурно-изомерных комплексов бис-ПНК H-Lys-TTCCTCTCT F-(eg)3-TTCTCTCCTT-LysNH2 авторы предложили наиболее вероятную структуру. Было показано, что все структурные изомеры образуются на одной и той же мишени днДНК. Предложенные в (Hansen et al, 2001) схемы структурных изомеров изображены на рис. 8. Предположительно, несмотря на различия в последовательности оснований и в строении линкера бис-ПНК, структурные изомеры, изучаемые в нашей работе, имеют аналогичное строение.

Как и авторы работы (Hansen et al, 2001), на электрофоретической картине мы наблюдали- незначительную ретардацию изомера S1 при

взаимодействии его с комплементарным бис-ПНК однонитевым

олигонуклеотидом. Вместе с данными о стабилизации изомера S1 при добавлении избытка онДНК, это свидетельствует о наличии в составе S1 мишеней для комплементарного бис-ПНК однонитевого

олигонуклеотида. Одной из

таких мишеней может являться вытесненная гомопиримидиновая нить

Рис. 8. Схемы структурных изомеров, предложенные авторами работы (Hansen etal., 2001). Авторы предполагают, что второй по электрофоретической подвижности полосе могут соответствовать две днДНК. Если бы неразрешимых при электрофорезе, но все же

«холодная» различных структуры.

действительно связывалась

онДНК

с Р-петлей, при ее избытке мы наблюдали бы также сдвиг в сторону меньшей подвижности других структурных изомеров, в том числе 83. Поскольку мы такого сдвига не видим, можно предположить, что «холодная» ДНК с Р-петлей не связывается. Также об этом свидетельствует тот факт, что присутствие олигонуклеотида практически не влияет на устойчивость структурных изомеров 82 и 83. Таким образом, наблюдаемая стабилизация указывает на наличие в составе 81 свободных нитей ПНК. Аналогично, можно заключить, что в составе структурных изомеров 82 и 83 свободных нитей ПНК нет.

Зависимость количества структурных изомеров от концентрации ПНК подтвердила наличие в структурном изомере 81 более чем одной молекулы бис-ПНК. С увеличением концентрации бис-ПНК доля структурного изомера 81 в общем объеме существенно возрастает. Вместе с обнаруженным нами новым явлением стабилизации изомера 81 с помощью немеченого комплементарного олигонуклеотида это является убедительным свидетельством справедливости предложенной структуры. Мы предполагаем,

что схема стабилизации изомера 81 выглядит так, как изображено на рис. 9. Свободные ветви двух молекул бис-ПНК образуют с «холодной» онДНК еще один триплекс. Такая структура обладает значительно большей

стабильностью, чем структура, содержащая свободные ветви бис-ПНК.

Варианты полиморфизма на днДНК

Электрофоретическая картина комплексов, образованных бис-ПНК 2199, 2196 и 2197 с комплементарной двунитевой ДНК отличается от аналогичной картины для бис-ПНК 554 бис-ПНК. В данном, случае

Рис. 9. Схема изомера 81 на днДНК, стабилизированного комплементарным он- олигонуклеотидом.

наблюдается образование лишь двух типов структурных изомеров. Описанные в диссертационной работе эксперименты свидетельствуют о том, что это структуры S1 и S3.

Подводя итоги этой части работы, можно отметить, что образование структурных изомеров S1 и S3 на днДНК-мишенях, по-видимому, характерно для большинства типов цитозин-содержащих бис-ПНК. Относительное количество S1 и S3 зависит от концентрации бис-ПНК: чем она выше, тем больше доля S1. Образование структурного изомера S2 носит более специфический характер. Для некоторых типов бис-ПНК оно вообще не происходит. Можно предположить, что влияние на образование структурного изомера S2 оказывает либо локализация дополнительных зарядов на бис-ПНК, либо конструкция линкера.

5.2. Полиморфизмкомплексов, образованныхна онДНК.

Структурно-изомерные комплексы бис-ПНК/онДНК

В этой части работы нами были исследованы комплексы пяти бис-ПНК (522, 554, 2196, 2197, 2199) с онДНК-мишенью длиной 10 нуклеотидов в составе двадцатизвенного олигонуклеотида. Во всех случаях мы впервые наблюдали образование двух структурно-изомерных комплексов. Мы обозначили их S1 и S2 по аналогии со случаем днДНК. Сразу заметим, что образование структуры типа S3 возможно лишь на двунитевой ДНК, поскольку

1,00

Рис. 10. Относительный выход структурных

ПНК 522

0,80 -

0,60 -

изомеров S1 ч S2 в зависимости от

0,40 -

концентрации бис-ПНК 522. Белые ромбы

0,00

0,20 -

-1,5

-0.5 0,5

1д [РЫЛ], пМ

1.5

соответствуют изомеру S1; черные кружки - S2; черные треугольники -свободной онДНК.

в случае онДНК в комплексах заведомо отсутствует Р-петля.

Как и в предыдущей части работы, мы исследовали зависимость относительного выхода комплексов S1 и S2 в зависимости от концентрации бис-ПНК. Результаты для бис-ПНК 522 приведены на рис. 10. В диссертации приведены аналогичные зависимости для нескольких бис-ПНК. Во всех случаях с ростом концентрации бис-ПНК убывает количество свободной ДНК. Одновременно увеличивается доля комплекса S1 по сравнению с S2. Как и для днДНК, такая зависимость указывает на тот факт, что в состав изомера S1 входит более одной молекулы бис-ПНК.

Кинетическаямодель образования структурныхизомеров.

Для анализа полученных результатов рассмотрим наиболее вероятную кинетическую модель образования S1 и S2 (рис. 11). Подобная модель, но без учета образования комплекса S1, является основой теории двухстадийного образования триплексов ПНК с ДНК и объясняет уникальное свойство

триплексов ПНК с ДНК -возможность сочетания высокой стабильности с высокой сайт-специфичностью. С учетом того, что применительно к условиям проведенных экспериментов

= 0, справедливы уравнения:

(2)

Рис. 11. Кинетическая модель образования структурных изомеров S1 и S2 на онДНК.

где 52, 81 и Р - концентрации комплексов S2, S1 и бис-ПНК соответственно, / - концентрация промежуточного продукта реакции. Бис-ПНК всегда находится в большом

избытке, так что Р ~ const.

Из первых двух уравнений системы непосредственно следует простой результат, который может быть сопоставлен с опытными данными:

S1

S 2

(3)

имея в виду, что при t= 0 81 = 82 = 0.

Экспериментальная зависимость 81/82 от Р для бис-ПНК 522 представлена на рис. 12. В диссертации приведены аналогичные зависимости и для других бис-ПНК. На графике видно, что линейная зависимость, отвечающая последней формуле, хорошо

соблюдается на опыте, по крайней мере, при концентрации ПИК ДО 5 Рис. 12. Зависимость отношения 81/82 от нМ. На рис. 10 эта область концентрации бис-ПНК 522 поданным рис. 10.

отделена пунктирной линией. В пределах погрешности опытов к1/к2 = 0.31± 0.02 нМ-1 для всех исследованных комплексов бис-ПНК с онДНК. Сравнительная стабильность структурныхизомеров. Стабилизация изомера S1.

Стабильность комплексов 81 и 82 существенно различается. Об этом свидетельствует тот факт, что при повышении температуры образования комплексов с 37°С до 47°С, относительный выход изомера 81 снижается, а 82 -повышается, соответственно.

Как и в случае днДНК, последующее добавление к уже образовавшимся комплексам бис-ПНК/онДНК избытка «холодного» олигонуклеотида не оказывает заметного влияния на комплекс 82. Однако, оно приводит к изменениям в структуре и стабильности изомера 81. Полоса, соответствующая

бис-ПНК 522 2196 2197 2199 554 комплементарный

олигонуклеотид - + - + -+ - +- +

Рис. 13. Электрофореграмма изомеров S1 и S2 на онДНК для пяти различных бис-ПНК. Связывание изомера S1 с комплементарным олигонуклеотидом.

изомеру 81, ускоряется при электрофорезе, если после образования комплексов в раствор добавлена «холодная» онДНК (рис 13) Наблюдаемое увеличение подвижности, в основном, обусловлено существенным изменением общего заряда при связывании изомера 81 с олигонуклеотидом Отметим также, что исходная полоса, соответствующая изомеру 81, имеет достаточно размытые очертания, в то время как полоса 81 в присутствии «холодной» он ДНК - более четкая. Это свидетельствует, вероятно, о более жесткой пространственной структуре результирующего комплекса.

Подобно эффекту стабилизации изомера 81, образованного на днДНК, добавление избытка «холодного» олигонуклеотида приводит к стабилизации изомерного комплекса 81 и на онДНК. В диссертации подробно приведены соответствующие экспериментальные данные. Структура стабилизирс ванного изомера 81 на онДНК аналогична случаю днДНК и состоит в данном случае из двух одинаковых триплексов.

5.3. Закономерности полиморфизма комплексов бис-ПНК/ДНК

В разделе выявлены общие закономерности полиморфизма комплексов бис-ПНК/ДНК. Все структурные изомеры образуются на одной и той же мишени в ДНК (Hansen et al, 2001). Структурный изомер S3 представляет собой триплекс и образуется молекулами бис-ПНК только на днДНК. Линкер в этом случае охватывает вытесненную нить днДНК. На онДНК изомер S3 образоваться не может. Изомер S3 является наиболее стабильным, и продуктами диссоциации изомеров S1 и S2, происходящей при повышенной температуре, является свободная ДНК и изомер S3.

Структурный изомер S2, также являющийся триплексом, образуется как на дн-, так и на онДНК. Не исключено, что существуют два вида изомеров S2, обладающих одинаковой электрофоретической подвижностью и не разрешаемых при электрофорезе в геле. В них линкер может проходить по разным сторонам нити ДНК, включенной в триплекс.

Наиболее подробно в работе изучен структурно-стехиометряческий изомер S1, наблюдаемый как в случае днДНК, так и в случае онДНК. В его состав входит триплекс, состоящий из гомопуриновой нити ДНК и двух бис-ПНК, каждая из которых участвует в образовании триплекса лишь одной ветвью; вторая ветвь каждой бис-ПНК свободна. Детальная структура изомера S1 на он- и днДНК может различаться. Однако основные свойства изомера S1 на он- и днДНК одинаковы, а именно: увеличение относительного выхода S1 с ростом концентрации бис-ПНК; согласие пути образования S1 с общепринятой моделью образования триплексов бис-ПНК с ДНК; диссоциация при повышенных температурах с образованием свободной ДНК и наиболее стабильного для данного случая изомера; изменение электрофоретической подвижности при взаимодействии с олигонуклеотидом, комплементарным бис-ПНК; значительное увеличение времени жизни S1 при таком взаимодействии за счет образования структуры, состоящей из двух триплексов.

По возрастанию стабильности изомерные комплексы располагаются в

следующем порядке: 81 < 82 < 83. В случае необходимости от комплекса 81 на днДНК можно избавиться путем прогревания при температуре, при которой комплексы 82 и 83 еще достаточно стабильны. Так же можно перевести комплекс 82 частично в 83 на днДНК. Аналогично, в случае онДНК можно избавиться от 81 путем отжига с образованием 82. Сложнее обстоит дело в случае стабилизированного изомера 81, прочность которого на онДНК близка к прочности 82. Между тем, этот изомер является сайт-специфичным, подобно триплексам 82 и 83. 6. Выводы.

1. Впервые измерены термодинамические параметры плавления триплексов бис-ПНК/ДНК. Показано, что константа равновесия образования триплексов бис-ПНК/ДНК исключительно высока и составляет 1020 М-1, а соответствующее значение свободной энергии стабилизации триплексов превышает аналогичное значение для дуплексов ПНК/ДНК в 2-3 раза.

2. Изучено влияние на стабильность триплексов бис-ПНК/ДНК локализованных на молекуле бис-ПНК положительных зарядов. Показано, что время жизни триплексов существенно возрастает при понижении ионной силы от 1 М до физиологических и низких значений, что объясняется взаимодействием положительно заряженных бис-ПНК с отрицательно заряженной основной цепью ДНК.

3. Обнаружено, что при низких и физиологических значениях ионной силы время жизни триплексов бис-ПНК, несущей положительные заряды в одной из ветвей, с двунитевой ДНК, существенно превышает время жизни триплексов той же ПНК с однонитевой ДНК. Вероятно, что эффект обусловлен дополнительным взаимодействием положительных зарядов с вытесненной нитью ДНК.

4. Показано, что положительные заряды в линкере бис-ПНК стабилизируют триплекс с однонитевой ДНК значительно сильнее, чем заряды в ветвях и на концах молекулы бис-ПНК.

5. Обнаружено явление полиморфизма комплексов гомопиримидиновых бис-ПНК с однонитевой ДНК.

6. Выявлены закономерности стабильности и взаимных превращений структурных изомеров, образованных бис-ПНК на однонитевой и двунитевой ДНК.

7. Предложена и экспериментально подтверждена структура изомера S1 на однонитевой ДНК. Построена кинетическая модель образования изомеров S1 и S2 на однонитевой ДНК. Выводы, полученные в рамках модели, согласуются с данными опытов.

8. Обнаружено явление стабилизации изомера S1 на однонитевой и двунитевой ДНК при взаимодействии с комплементарным олигонуклеотидом. Предложена структура стабилизированного изомера S1, состоящая из двух триплексов. Публикации по теме диссертационной работы.

1. Krupnik O.V., Guscho Yu.A., Sluchanko KA, Nielsen P.E., Lazurkin Yu.S. Thermodynamics of the Melting of PNA/DNA Triple Helices. J. Biomol. Struct. Dyn., 2001,19,535-542.

2. K.A. Случанко, О.В. Крупник и Ю.С. Лазуркин. Определение термодинамических параметров плавления триплексов ПНК2/ДНК. Тезисы докладов XLIV научной конференции Московского физико-технического института, посвященной 50-летию создания МФТИ, часть IV, стр. 30, 2001.

3. Н.В. Фадеева, О.В. Крупник и Ю.С. Лазуркин. Полиморфизм комплексов, образуемых цитозинсодержащей бис-ПНК с двунитевой ДНК. Тезисы докладов XLIV научной конференции Московского физико-технического института, посвященной 50-летию создания МФТИ, часть IV, стр. 31,2001.

4. Крупник О.В., Фадеева Н.В., Лазуркин Ю.С. Полиморфизм комплексов ПНК с ДНК. Мол. Биол., 2002,36,312-314.

5. Krupnik O.V., Fadeeva N.V., Kvitko N.P., Shepelev V.A., Nielsen P.E., Lazurkin Yu.S. Stability and Transformations of bisPNA/DNA Triplex Structural Isomers. J. Biomol. Struct. Dyn., 2004, 21,503-512.

Отпечатано в копицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 529 тираж 100 экз. Подписано в печать 11.05.2004 г.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Крупник, Ольга Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ

Оглавление

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.;

2.1. Строение ПНК

2.2. Строение и свойства дуплексов ПНК/ДНК и ПНКУРНК

2.3. Строение и свойства триплексов ПНК2/ДНК.

2.4. бис-ПНК

2.5. Биологические действия ПНК 23 ингибирование и инициация транскрипции 25 ингибирование трансляции 25 защита от действия метилаз и рестриктаз 26 Использование ПНК in vivo - f"

2.6. Применение ПНК

2.7. Специфичность триплексов ПНК2/ДНК

2.8. Стабильность триплексов ПНК2/ДНК

2.9. полиморфизм комплексов, образуемых бис-ПНК с ДНК.

2.10. Задачи данной работы

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Препараты ПНК

3.2. Препараты ДНК

3.3. Образование комплексов ПНК/ДНК

3.4. Плавление

3.5. Кинетика диссоциации

3.6. Изучение полиморфизма комплексов ПНК с ДНК

4. ИССЛЕДОВАНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ТРИПЛЕКСОВ ПНК,/ДНК: ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ СТАБИЛЬНОСТИ; ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА СТАБИЛЬНОСТЬ.

4.1. Плавление триплексов ПНК2/ДНК. Термодинамические параметры стабильности.

4.2. Влияние электростатических взаимодействий на стабильность триплексов ПНК с однонитевой и двунитевой ДНК

4.3. Влияние структурных модификаций ПНК на стабильность триплексов бис-ПНК/ДНДНК

5. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА КОМПЛЕКСОВ БИС-ПНК С ДНК

5.1. полиморфизм комплексов, образованных на двунитевой ДНК.

Стабильность и превращения структурных изомеров. стабилизация изомера s1.

Модель распада структурных изомеров S1 и S

Строение изомеров S1 и S

Варианты полиморфизма на днДНК.

5.2. полиморфизм комплексов, образованных на однонитевой ДНК. 92 Структурно-изомерные комплексы бис-ПНК/онДНК. 92 Кинетическая модель образования структурных изомеров. 93 Сравнительная стабильность структурных изомеров. Стабилизация изомера S1.

5.3. закономерности полиморфизма комплексов бис-ПНК/ДНК

6. ВЫВОДЫ

7. БЛАГОДАРНОСТИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Триплексы бис-ПНК/ДНК"

Усилия исследователей в течение последних десятилетий были направлены на поиск агентов, способных связываться со строго определенными участками молекул ДНК или РНК и управлять их важнейшими функциями: включать и выключать действие строго определенных генов, контролировать экспрессию, влиять на синтез тех или иных определенных белков. Конечной целью подобных исследований является создание диагностических и генно-терапевтических средств, направленных против бактериальных и вирусных инфекций, наследственных болезней, онкологических заболеваний. Агенты такого рода находят также широкое применение в различных областях молекулярной биологии и технологии, например, в дальнейшем исследовании генома человека, в определении роли тех или иных генов.

Синтезированная в 1991 году в лаборатории профессора П.Е. Нильсена в Дании пептидная нуклеиновая кислота (ПНК) превосходит все другие подобные средства как по прочности комплексов, которые она образует на комплементарных сайтах ДНК и РНК, так и по специфичности связывания с этими сайтами. В связи с этим за последние несколько лет появилось уже около тысячи научных работ, так или иначе связанных с ПНК1, что свидетельствует об огромном интересе ученых к этому объекту. В настоящее время пептидная нуклеиновая кислота применяется в различных областях молекулярной биологии, биотехнологии и диагностики; ведется разработка лекарственных препаратов на основе ПНК. Подробно о применениях ПНК будет написано ниже.

1 Список сокращений: ПНК - пептидная нуклеиновая кислота, онДНК - однонитевая ДНК, днДНК -двунитевая ДНК, н. - нуклеотидов, п.н. - пар нуклеотидов.

В зависимости от ряда факторов, комплексы, образуемые ПНК с нуклеиновыми кислотами, имеют различное строение и свойства. Эти комплексы представляют собой дуплексы и триплексы. Дуплексы - это соединения, в состав которых входят две полностью или. частично комплементарных полимерных цепей, одной цепи ПНК и одной цепи ДНК или РНК. Триплексы состоят из трех полимерных цепей, чаще всего это две цепи ПНК и одна цепь ДНК. Однако, как дуплексы, так и триплексы могут иметь различные особенности строения, определяемые строением и составом ПНК и мишени, а также внешними условиями. Исследование стабильности подобных комплексов не только представляет интерес с точки зрения фундаментальной науки, но и является весьма актуальным для выбора оптимальных условий их практического применения. Среди комплексов ПНК с нуклеиновыми кислотами особое место занимают триплексы ПНК2/ДНК, образующиеся при взаимодействии гомопиримидиновой ПНК с комплементарным сайтом однонитевой и двунитевой ДНК. Благодаря двустадийному механизму образования, такие триплексы обладают уникальным сочетанием очень высокой стабильности и сильной специфичности.

В качестве характеристики стабильности комплексов нуклеиновых кислот чаще всего используется температура их плавления Тт. Однако при плавлении триплексов ПНК2/ДНК наблюдается сильный гистерезис, что делает невозможным получение равновесных кривых плавления. В связи с этим точные количественные характеристики плавления триплексов ПНК2/ДНК оставались не измеренными. В данной диссертационной работе предложен способ преодоления указанного затруднения путем использования бис-ПНК. Была поставлена задача получить равновесные кривые плавления триплексов ПНК2/ДНК указанным способом и определить термодинамические параметры стабильности: энтальпию плавления, энтропию плавления и свободную энергию стабилизации триплексов ПНК2/ДНК.

Стабильность триплексов, образованных гомопиримидиновой ПНК на комплементарной однонитевой или двунитевой ДНК-мишени, существенно зависит от ряда факторов. К этим факторам относятся состав ПНК и последовательность оснований, особенности строения основной цепи ПНК, а также линкера в случае бис-ПНК, температура, ионная сила и рН раствора. Изучение подобных закономерностей дает возможность получения как более, так и менее стабильных комплексов, т.е. позволяет варьировать стабильность комплексов в зависимости от конкретных практических целей. В частности, такое варьирование может происходить за счет дополнительных электростатических взаимодействий, возникающих при введении в молекулу ПНК различного числа положительных зарядов. Существенное влияние на стабильность могут оказать и незначительные структурные модификации основной цепи ПНК. Поэтому второй задачей данной диссертационной работы стало изучение влияния некоторых из описанных факторов на стабильность триплексов, образуемых бис-ПНК на однонитевой и двунитевой ДНК-мишени. В свете постоянно растущих возможностей применения ПНК такое исследование является актуальным.

В качестве меры стабильности, в этой и последующих частях данной диссертационной работы использовано время жизни триплекса т при повышенной температуре, не превышающей, однако, температуры плавления. Дело в том, что использование температуры плавления в качестве характеристики стабильности триплексов Г1НК2/ДНК имеет ряд ограничений. В частности, измерение температуры плавления не всегда возможно возможно для триплексов, образованных на двунитевой ДНК-мишени. Триплексы ПНК2/ДНК часто оказываются настолько стабильны, что сама двунитевая ДНК-мишень начинает плавиться раньше, чем триплекс. Кроме того, этот метод требует строгой стандартизации условий опыта, поскольку температура плавления комплекса зависит от концентрации этого комплекса.

При изучении влияния структурных модификаций на стабильность триплексов ПНК2/ДНК мы столкнулись с проявлениями полиморфизма комплексов гомопиримидиновой бис-ПНК с двунитевой ДНК. Сам по себе полиморфизм в данном случае заключается в том, что при определенных условиях на одной и той же мишени ДНК молекулы бис-ПНК одновременно образуют несколько типов комплексов. Эти комплексы называются структурными изомерами. Существование структурных изомеров ранее отмечалось в нескольких работах, однако на момент начала наших исследований не было опубликовано ни одной работы, посвященной изучению этого явления. Между тем, совершенно очевидно, что явление полиморфизма не только вносит новый уровень сложности во все задачи, связанные с ПНК, но и может оказать существенное влияние на потенциальное применение ПНК, особенно в терапевтических целях. Таким образом, поставленная задача изучения явления полиморфизма комплексов бис-ПНК с ДНК является актуальной, а все полученные результаты - новыми.

Изучая стабильность всех образовавшихся комплексов, мы обнаружили максимум на кривой диссоциации самого стабильного из структурных изомеров. Это свидетельствовало о превращении менее стабильных изомеров в более стабильный тип. Был разработан метод выделения отдельных типов изомеров путем электроэлюции из препаративного геля. Тем самым, мы получили возможность изучить стабильность и превращения каждого структурного изомера. Когда мы готовили к публикации полученные результаты и выводы, в печати появилась статья датских ученых (Hansen et al., 2001), также посвященная изучению явления полиморфизма. Наши результаты и результаты, полученные датскими коллегами, удачно дополнили друг друга: в работе (Hansen et al, 2001) предложена структура изомеров, в нашей работе (Крупник и др., 2002) — изучены их стабильность и превращения. Б дальнейшем нами было исследовано также явление полиморфизма комплексов бис-ПНК с однонитевой ДНК и обнаружено важное явление стабилизации одного из структурных изомеров при взаимодействии с однонитевой ДНК (Krupnik et al, 2004).

Итак, сформулируем задачи данной диссертационной работы:

1. Исследовать стабильность триплексов ПНК2/ДНК методом равновесного плавления. Найти термодинамические параметры стабильности триплексов ПНК2/ДНК.

2. Исследовать путем измерения эффективного времени жизни влияние электростатических взаимодействий на стабильность триплексов ПНК2/ДНК.

3. Исследовать полиморфизм триплексов бис-ПНК/ДНК.

Из сказанного выше следует, что все задачи данного диссертационного исследования являются актуальными, а полученные результаты - новыми.

Диссертационная работа включает в себя шесть разделов.

Первый раздел - вводный.

Второй раздел посвящен обзору литературных данных. В нем подробно описаны химическое строение ПНК и бис-ПНК, строение и свойства дуплексов ПНК/ДНК, ПНК/РНК и ПНК/ПНК и триплексов ПНК2/ДНК. В отдельные параграфы вынесены такие важные темы как биологические эффекты взаимодействия ПНК с нуклеиновыми кислотами и практическое применение ПНК. Особое внимание уделено материалам по стабильности и специфичности триплексов, образованных гомопиримидиновой ПНК с комплементарными сайтами однонитевой и двунитевой ДНК. Рассказано о природе, методах измерения и факторах, оказывающих влияние на стабильность и специфичность таких триплексов. В этом разделе будет дано обоснование постановки задач данной диссертационной работы, определено место диссертационной работы среди имеющихся исследований.

Третий раздел содержит описание материалов и методов, использованных при выполнении работы. В разделе описаны препараты ПНК и ДНК, экспериментальные процедуры получения комплексов ПНК с ДНК, плавления и диссоциации этих комплексов.

Основные материалы диссертационной работы представлены в четвертом и пятом разделах. Четвертый раздел посвящен исследованию стабильности триплексов ПНК2/ДНК, т.е. отвечает на первые две поставленных задачи. Первая часть раздела содержит результаты и обсуждение экспериментов по плавлению триплексов ПНК2/ДНК. На основании экспериментальных данных определены энтальпия и энтропия плавления таких триплексов, найдена свободная энергия их стабилизации. Проведено сравнение полученных данных с аналогичными термодинамическими параметрами дуплексов ПНК/ДНК. Вторая часть раздела содержит результаты исследования влияния электростатических взаимодействий на стабильность триплексов ПНК2/ДНК. Исследован эффект стабилизации триплексов в зависимости от количества и локализации дополнительных положительных зарядов на молекуле бис-ПНК. В третьей части раздела приведены некоторые данные о влиянии структурных модификаций основной цепи бис-ПНК на стабильность триплексов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Крупник, Ольга Владимировна

6. Выводы

В данной диссертационной работе получены следующие основные результаты и выводы:

1. Впервые измерены термодинамические параметры плавления триплексов бис-ГШК/ДНК. Показано, что константа равновесия образования триплексов бис-ПНК/ДНК исключительно высока и

20 I составляет а соответствующее значение свободной энергии стабилизации триплексов превышает аналогичное значение для дуплексов ПНК/ДНК в 2-3 раза.

2. Изучено влияние на стабильность триплексов бис-ПНК/ДНК локализованных на молекулах различных бис-ПНК положительных зарядов. Показано, что времена жизни триплексов существенно возрастают при понижении ионной силы от 1 М до физиологических и более низких значений, что объясняется взаимодействием положительно заряженных бис-ПНК с отрицательно заряженной основной цепью ДНК.

3. Обнаружено, что при низких и физиологических значениях ионной силы время жизни триплексов бис-ПНК, несущей положительные заряды в одной из ветвей, с двунитевой ДНК, существенно превышает время жизни триплексов той же ПНК с однонитевой ДНК. Вероятно, что эффект обусловлен дополнительным взаимодействием положительных зарядов с вытесненной нитью ДНК.

4. Показано, что положительные заряды в линкере бис-ПНК стабилизируют триплекс с однонитевой ДНК значительно сильнее, чем заряды в ветвях и на концах молекулы бис-ПНК.

5. Обнаружено явление полиморфизма комплексов гомопиримидиновых бис-ПНК с однонитевой ДНК.

6. Выявлены закономерности стабильности и взаимных превращений структурных изомеров, образованных бис-ПНК на однонитевой и двунитевой ДНК.

7. Предложена и экспериментально подтверждена структура изомера S1 на однонитевой ДНК. Построена кинетическая модель образования изомеров S1 и S2 на однонитевой ДНК. Выводы, полученные в рамках модели, согласуются с данными опытов.

8. Обнаружено явление стабилизации изомера S1 на однонитевой и двунитевой ДНК при взаимодействии с комплементарным олигонуклеотидом. Предложена структура стабилизированного изомера S1, состоящая из двух триплексов.

7. Благодарности

Автор выражает сердечную благодарность своему научному руководителю профессору, доктору физико-математических наук Юрию Семеновичу Лазуркину, без грамотного руководства и чуткого отношения которого выполнение работы было бы невозможно.

Также хотелось бы поблагодарить Юрия Александровича Гущо за ценные обсуждения и методические рекомендации, Нину Павловну Квитко за помощь в проведении экспериментов, Леонида Владимировича Генинга за полезные советы, всех сотрудников Лаборатории молекулярной биофизики ИМГ за постоянную поддержку.

Отдельную благодарность автор выражает члену-корреспонденту РАН Александру Алексеевичу Веденову, регулярные дискуссии с которым, безусловно, способствовали продвижению работы.

Все препараты ПНК были любезно предоставлены нам профессором П.Е. Нильсеном (Дания).

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№№ грантов: 00-04-48198, 02-04-48499, 02-04-06401, 03-04-06324).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Крупник, Ольга Владимировна, Москва

1. Красилъникова М.М., Веселков А.Г. Повышение специфичности связывания пептидно-нуклеиновой кислоты с ДНК // Мол. Биол. -1996. -30. -С. 379-386.

2. Красилъникова М.М., Извольский К.И., Крупник О.В., Лазуркин Ю.С. Применение пептидно-нуклеиновой кислоты в методе «Ахиллесовой пяты» // Мол. Биол. -1996. -Т. 30. -С. 470-474.

3. Красшьникова М.М., Извольский К.И, Крупник О.В., Лазуркин Ю.С. Использование специфического связывания пептидно-нуклеиновой кислоты с ДНК в методе «Ахиллесовой пяты» // Докл. Акад. Наук. -1995. —№ 344. -С. 552-555.

4. Крупник О.В., Фадеева Н.В., Лазуркин Ю.С. Полиморфизм комплексов ПНК с ДНК // Мол. Биол. -2002. -Т. 36. -С. 312-314.

5. Лазуркин Ю.С. Стабильность и специфичность триплексов, образуемых пептидно-нуклеиновой кислотой с ДНК // Мол. Биол. -1999. -Т. 33.-С. 94-99.

6. Лазуркин Ю.С. и Крупник О.В. Триплексы, образуемые ДНК с пептидно-нуклеиновой кислотой (ПНК)// Сборник трудов ИМГ РАН. -2004. Принято в печать.

7. Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование / Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукДж. М.: Мир. - 1984. - 480 с.

8. Anshelevich V. V., Vologodskii А. V., А. V. Lukashin А. V., Frank-Kamenetskii M.D. Slow relaxational processes in melting of biopolymers: atheory and its application to nucleic acids // Biopolymers. -1984. -V. 23. -P. 39-58.

9. Bentin Т., Nielsen P.E. Enhanced peptide nucleic acid binding to supercoiled DNA: possible implications for DNA "breathing" dynamics // Biochemistry. -1996. -V. 35. -P. 8863-8869.

10. Belts L., Josey J.A., Veal J.M., Jordan S.R. Crystal structure of a nucleic acid triplex at 2.5 A: a peptide nucleic acid-DNA complex // Science. -1995. -V. 270.-P. 1838-1841.

11. Bukanov N.O., Demidov V. V.t Nielsen P.E., Frank-Kamenetskii M.D. PD-loop: a complex of duplex DNA with an oligonucleotide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998. -V. 95. -P. 5516-5520.

12. Chakrabarti M. C. and Schwarz F. P. Thermal stability of PNA/DNA and DNA/DNA duplexes by differential scanning calorimetry // Nucl. Acids Res. -1999. -V. 27. -P. 4801-4806.

13. Dawson et al. Data for Biochemical Research / Dawson R. M. C., Elliott D. C., Elliott W. H., Jones К. M. 3rd ed. -Oxford: Oxford University Press. -1989.

14. Demidov V.V., Frank-Kamenetskii M.D., Egholm M., Buchardt O., Nielsen P.E. Sequence selective double strand DNA cleavage by PNA targeting using nuclese SI //Nucl. Acids Res. -1993. -V. 21. -P. 2103-2107.

15. Demidov V. V., Potaman V.N., Frank-Kamenetskii M.D., Egholm M., Buchardt O., Sonnichsen S.H., Nielsen P.E. Stability of peptide nucleic acids in human serum and cellular extracts 11 Biochem. Pharmacology. -1994b. -V. 48. -P. 1310-1313.

16. Demidov V.V., Yavnilovich M.V., Belotserkovskii B.P., Frank-Kamenetskii M.D., Nielsen P.E. Kinetics and mechanism of polyamide ("peptide") nucleic acid binding to duplex DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. -V. 92. -P. 2637-2641.

17. Demidov V.V., Yavnilovich M.V., Frank-Kamenetskii M.D. Kinetic analysis of specificity of duplex DNA targeting by homopyrimidine peptide nucleic acids // Biophys. J. -1997. -V.72. -P. 2763-2769.

18. Demidov V. V., Frank-Kamenetskii M.D. PNA directed genome rare cutting I I Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications / Nielsen P.E., Egholm M. eds. -Wymondham: Horizon Scientific Press. -1999. -P. 163-174.

19. Demidov V.V., Bukanov N.O., Frank-Kamenetskii M.D. Duplex DNA capture 11 Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications / Nielsen P.E., Egholm M. eds. -Wymondham: Horizon Scientific Press. -1999. -P. 175-184.

20. Demidov V.V., Bukanov N.O., Frank-Kamenetskii M.D. Duplex DNA capture // Curr. Issues Mol. Biol. -2000. -V. 2. -P. 31-35.

21. Demidov V. V., Kuhn H., Lavrentyeva-Smolina I. V., Frank-Kamenetskii M.D. Peptide nucleic acid-assisted sequence-specific topological labeling of duplex DNA // Methods. -2001a. -V.23. -P. 123-131.

22. Demidov V. V., Broude N.E., Lavrentyeva-Smolina I. V., Kuhn H., Frank-Kamenetskii M.D. An artificial primosome: design, function and applications // ChemBioChem. -2001b. -V. 2. -P. 133-139.

23. Demidov V. V., Frank-Kamenetskii M.D. PNA openers and their applications // In Methods in Molecular Biology. -Totowa: Humana Press Inc. -2002.-V. 208.-P. 119-130.

24. Dueholm, K.L., Nielsen, P.E. Chemistry, properties and applications of PNA // New J. Chem. -1997. -V. 21. -P. 19-31.

25. Egholm M., Christensen L., Dueholm K.L., Buchardt O., Coull J., Nielsen P.E. Efficient pH-independent sequence-specific DNA binding by pseudo-isocytosine containing bis-PNA // Nucl. Acids Res. -1995. -V. 23. -P. 217-222.

26. Eriksson M., Nielsen P.E. PNA nucleic acid complexes structure, stability and dynamics // Quarterly Rev. Biophys. -1996. -V. 29. -P. 369-394.

27. Good L., Nielsen P.E. Antisense inhibition of gene expression in bacteria by PNA targeted to mRNA // Nature Biotechnology. -1998. -V. 16. -P. 355358.

28. Griffin T.J., Smith L.M. An Approach to Predicting the Stabilities of Peptide Nucleic Acid:DNA Duplexes // Analitical Biochemistry. -1998. -V. 260.-P. 56-63.

29. Griffith M.C., Risen L.M., GreigM.J., LesnikE.A., Sprankle KG., Griffey R.H., Kiely J.S., Freier S.M. Single and Bis Peptide Nucleic Acids as Triplexing Agents: Binding and Stoichiometry // J. Amer. Chem. Soc. -1995. -V. 117.-P. 831-832

30. Haaima G., LohseA., Buchardt O., Nielsen P.E. Peptide Nucleic Acids (PNA) Containing Thymine Monomers Derived from Chiral Amino Acids: Hybridization and Solubility Properties of D-lysine PNA // Angewandte Chemie. -1996. -V. 35. -P. 1939-1941.

31. Hansen G.I., Bentin Т., Larsen HJ., Nielsen P.E. Structural isomers of bis-PNA bound to a target in duplex DNA // J. Mol. Biol. -2001. -V. 307. -P. 67-74.

32. Holmen, A., Nor den, B. Thermodynamics of PNA-nucleic acid interactions // Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications / Nielsen P.E., Egholm M. eds. -Wymondham: Horizon Scientific Press. -1999. -P. 87-97.

33. Just Т., Andersen Т., Mathiassen M.A., Nielsen К. V. Detection of human telomere sequences with fluorescein- and СуЗ-labelled peptide nucleic acid (PNA) probes // American Association for Cancer Research. -1998. -V. 39. -P. 2389.

34. Knight R.D., Landweber L.F. The early evolution of the genetic code // Cell. -2000. -V. 101. -P. 569-572.

35. Knudsen H., Nielsen P.E. Application of Peptide Nucleic Acid in Cancer Therapy // Anti-Cancer Drugs. -1997. -V. 8. -P. 113-118.

36. Kosaganov Yu.N., Stetsenko D.A., Lubyako E.N., Kvitko N.P., Lazurkin Yu.S., Nielsen P.E. Effect of temperature and ionic strength on the dissociation kinetics and lifetime of PNA-DNA triplexes // Biochemistry. -2000. -V. 39. -V. 11742-11747.

37. Krasilnikov A.S., Podtelezhnikov A., Vologodskii A., MirkinS.M. Large-scale effects of transcriptional DNA supercoiling in vivo // J. Mol. Biol. -1999. -V. 292.-P. 1149-1160.

38. Krupnik О. V., Guscho Yu.A., Sluchanko K.A., Nielsen P.E., Lazurkin Yu.S. Thermodynamics of the Melting of PNA2/DNA Triple Helices // J. Biomol. Struct. Dyn. -2001. -V.19. -P. 535-542.

39. Krupnik О. V., Fadeeva N. V., Kvitko N.P., Shepelev V.A., Nielsen P.E., Lazurkin Yu.S. Stability and Transformations of bis-PNA/DNA Triplex Structural Isomers // J. Biomol. Struct. Dyn. -2004. -V. 21. -P. 503-5\2.

40. KuhnH., Demidov V.V., Frank-Kamenetskii M.D., Nielsen P.E. Kinetic Sequence Discrimination of Cationic bis-PNAs upon Targeting of Double-Stranded DNA // Nucleic Acids Res. -1998. -V. 26. -P. 582-587.

41. Kuhn H., Demidov V. V., Nielsen P.E., Frank-Kamenetskii M.D. An experimental study of mechanism and specificity of peptide nucleic acid (PNA) binding to duplex DNA // J. Mol. Biol. -999a. -V. 286. -P. 1337-1345.

42. KuhnH., Demidov V.V., Frank-Kamenetskii M.D. Topological links between duplex DNA and a circular DNA single strand // Angew. Chem. Int. Ed. -1999b. -V.38. -P. 1446-1449.

43. Kuhn H., Demidov V. V., Frank-Kamenetskii M.D. An earring for the double helix: assembly of topological links comprisingduplex DNA and a circular oligodeoxynucleotide // J. Biomol. Struct. Dyn. -2000. -V. 11. -P. 221-225.

44. Marky L. A. and Breslaner K. J. Calculating thermodynamic data for transitions of any molecularity from equilibrium melting curves // Biopolymers. -1987. -V. 26. -P. 1601-1620.

45. Mollegaard N.E., Buchardt O., Egholm M., Nielsen P.E. Peptide nucleic acid DNA strand displacement loops as artificial transcription promoters // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994. -V. 91. -P. 3892-3895. .

46. Nelson K.E., Levy M, Miller S.L. Peptide nucleic acids rather than RNA may have been the first genetic molecule // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. -V. 97.-P. 3868-3871.

47. Nielsen P.E., Egholm M., BergR.H., Buchardt O. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide//Science.-1991.-V. 254.-P. 1497-1500.

48. Nielsen P.E., Egholm M., BergR.H., Buchardt O. Sequence specific inhibition of DNA restriction enzyme cleavage by PNA // Nucl. Acids Res. -1993a.-V. 21.-P. 197-200.

49. Nielsen P.E., Egholm M., BergR.H., Buchardt O. Peptide nucleic acids (PNAs): potential anti-sense and anti-gene agents // Anti-Cancer Drug Design. -1993b.-V. 8.-P. 53-63.

50. Nielsen P.E., Egholm M. An introduction to PNA. // Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications / Nielsen P.E., Egholm M. eds. -Wymondham: Horizon Scientific Press. —1999. -P. 1-20.

51. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications / Nielsen P.E., Egholm M., Eds. Wymondham:Horizon Scientific Press. -1999. - 266 p.

52. Peffer N J., Hanvey J.C., BisiJ.E., Thomson S. A., Hassman F.C., Noble S.A., Babiss L.E. Strand-invasion of Duplex DNA by Peptide Nucleic Acid Oligomers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1993. -V. 90. -P. 10648-10652.

53. Protazanova E., Demidov V. V., Soldatenkov V., Chasovskikh S., Frank-Kamenetskii M.D. Tailoring the activity of restriction endonuclease Pie 1 by PNA-induced DNA-looping // EMBO reports. 2002. -V. 3. -P. 956-961.

54. Ratilainen Т., HolmenA., Tuite E., Haaima G., Christensen L., Nielsen P. E., Norden B. Hybridization of Peptide Nucleic Acid // Biochemistry. -1998. -V. 37.-P. 12331-12342.

55. Senior K. Pseudocomplementary strategy strengthens PNA therapeutic potential // Drug Discov Today. -2000. -V. 5. -P. 538-540.

56. Stender H., Oliveira K., RigbyS., Bargoot F., Coull J. Rapid detection, identification, and enumeration of Escherichia coli by fluorescence in situ hybridization using an array scanner // J. Microbiol. Methods. 2001c. -V. 45(1).-P. 31-39.

57. Stender H., Fiandaca M., Hyldig-Nielsen J. J., Coull J. PNA for rapid microbiology //J. Microbiol. Methods. -2002. -V. 48(1). -P. 1-17.

58. Schwarz F. P., Robinson S., Butler J. M. Thermodynamic comparison of PNA/DNA and DNA/DNA hybridization reactions at ambient temperature // Nucl. Acids Res. -1999. -V. 27. -P. 4792-4800.

59. Thisted M, Just Т., PluzekK.-J., Hyldig-Nielsen J. J., Godtfredsen S.E. Detection of immunoglobulin kappa light chain mRNA in paraffin sections by in situ hybridization using peptide nucleic acid probes // Cell Vision. -1996. -V. 3.-P. 358-363.

60. Tomac S., Sarkar M., Ratilainen Т., Wittung P., Nielsen P.E., Norden В., Graslund A. Ionic effects on the stability and conformation of peptide nucleic acid complexes // J. Am. Chem. Soc. -1996. -V. 118. -P. 5544-5552.

61. Tyler B.M., McCormich D.J., Hoshall С. V., Douglas C.L., Jansen K, Lacy B. W., Cusack В., Richelson E. Specific gene blockade shows that peptide nucleic acids readily enter neuronal cells in vivo IIFEBS Lett. -1998. -V. 421. -P. 280-284.

62. Uhlmann E., Peyman A., Breipohl G., Will D. W. PNA: synthetic polyamide nucleic acids with unusual binding properties // Angew. Chem. Int. Ed. -1998. -V. 37. -P. 2796-2823.

63. Veselkov A.G., Demidov V.V., Frank-Kamenetskii M.D., Nielsen P.E. PNA as a rare genome cutter // Nature. -1996a. -V. 379. -P. 214.

64. Veselkov A. G., Demidov V.V., Nielsen P.E., Frank-Kamenetskii M.D. A new class of genome rare cutters // Nucl. Acids Res. -1996b. -V. 24. -P. 24832487.

65. Wittung P., Nielsen P.E., Norden B. Direct observation of strand invasion by peptide nucleic acid (PNA) into double-stranded DNA // J. Amer. Chem. Soc. -1996. -V. 118. -P. 7049-7054.

66. Zeng Y., Montrichok A., Zocchi G. Length and statistical weight of bubbles in DNA melting // Phys. Rev. Let. -2003. -V. 91(14). -P. 148101-1-4.